JPH03117489A - リボフラビン過剰生産性細菌株 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 リボフラビン（ビタミンＢ２）はすべての植物および多
くの微生物によって合成されるが、高等動物によっては
産生されない。リボフラビンはフラビンアデニンジヌク
レオチドおよびフラビンモノヌクレオチドのような炭水
化物の酵素的酸化に要求される補酵素の前駆体であるた
め、基礎的な代謝に必須である。高等動物におけるリボ
フラビン不足は脱毛、皮膚の炎症、視覚劣化、および発
育不全を引き起こす。

リボフラビンはリボースから出発する完全な化学合成、
または真菌類のＩＥｒｅｍｏｔｈｅｅｉｕｉ＋　Ａｓｈ
ｂｙｉｉまたはＡｓｈｂｙａ　ｇｏｓｓｙｐｉｉを用い
た発酵のいずれかによって商業的に生産することができ
る（Ｔｈｅ　ＭｅｒｅｋＩｎｄｅｘ、　　Ｗｉｎｄｈｏ
ｌＺら編、　Ｍｅｒｃｋ　　＆　　Ｃｏ、、ｐ、１８３
．１９８３）。

プリン類似体であるアザグアニンおよびアザギサンチン
に曝すことによって選択されたバチルス・サブチリス（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）の突然変異体か
回収可能な量のりボフラビンを生産することか報告され
ている（米国特許第３．９００．３６８号、Ｅｎｅｉら
、ｔ９７５）。一般に、プリンおよびリボフラビンの類
似体に曝すことによってリボフラビン生合成の増加を示
す調節解除変異株が選択されるが、これはその突然変異
により微生物が生産増大によってその類似体を拮抗的に
排除できるようになるからである（Ｍａｔｓｕｉら、Ａ
ｇｒｉｅ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ。４６：２００３゜
１９８２）　。リボフラビンを生産するＳａｅｃｈａｒ
ｏｍｙｅｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのプリン要求変異株
も報告されている（米国特許第４．７９４．０８１号、
Ｋａｗａｉら、１９８８）。

Ｒａｂｉｎｏｖｉｅｈら（Ｇｅｎｅｔｉｋａ　１４：１
６９６　（１９７８））は、バチルス・サブチリス（以
下Ｂ、サブチリスとする）、リボフラビンオペロン（ｒ
ｉｂオペロン）が７メガダルトン（Ｍｄ）　ＥｃｏＲＩ
フラグメントに含まれることを報告している（Ｃｈｉｋ
ｉｎｄａｓら、Ｍｏ１．　Ｇｅｎｅｔ、　Ｍｉｋ、Ｖｉ
ｒｕｓｏｌ、　Ｎｏ、　２　：２０　（１９８７）にお
いて６．３Ｍｄフラグメントとして後に言及される）。

アンピシリン耐性を付与するプラスミドにｒｉｂオペロ
ンをクローニングしそしてそのプラスミドを含む細菌を
漸増量のアンピシリンに曝すことによって大腸菌（Ｅ。

ｅｏｌｉＸ以下Ｅ、コリとする）でそのオペロンの増幅
が達成されたことが報告されている。ｒｉｂ増幅の唯一
の証拠は、培地中に存在する緑色蛍光物質か同時に増加
することである。著者は観察された現象を説明するため
にオペロンの実際の増幅以外にも多くの他の可能性を提
起している。

５ｔｅｐａｎＯＶらによる仏国特許出願第２．５４６，
９０７号（１９８＝１年１２月７日公告）は、アザグア
ニンおよびロセオフラビンに曝され、ｒｉｂオペロンの
コピーを含有するプラスミドで形質転換されたＢ、サブ
チリス変異株を利用したリボフラビンの生産方法を開示
している。

Ｍｏｒｏｚｏｖら（Ｍｏ１．　Ｇｅｎｅｔ、　Ｍｉｋ、
　Ｖｉｒｕｓｏｌ、ｎｏ、７：４２　（１９８４））は
、クローンされたＢ、サブチリスｒｉｂフラグメントが
Ｅ、コリリボフラビン要求株を相補する能力、またはＢ
、サブチリスリボフラビン要求株をマーカーレスキュー
する能力をアッセイすることによるＢ、サブチリスｒｉ
ｂオペロンのマツピングを記述している。Ｅ。コリｒｉ
ｂ遺伝子の既知の機能に基づいて、Ｂ、サブチリスにつ
いて以下のモデルか提案された、すなわちｒｉｂＧ　（
デアミナーゼをコードする）−ｒｉｂｏ　（制御エレメ
ント）−ｒｉｂＢ　（シンセターゼ）−ｒｉｂＦ−ｒｉ
ｂＡ　（ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼ）ｒｉｂＴ／Ｄ　
（それぞれレダクターゼおよびイソメラーゼ）＝ｒｉｈ
Ｈ（シンセターゼ）。

Ｍｏｒｏｚｏｖら（Ｍｏｌ、　Ｇｅｎｅｔ、　Ｍｉｋ、
　Ｖｉｒｕｓｏｌ、　ｎｏ。

１１：１１　（１９８４））は、Ｂ、サブチリスリボフ
ラビン要求株を相補する能力をアッセイするために、野
生Ｗ（ｒｉｂｏ”）または構成的（ｒｉｂ０３３５）オ
ペレーター領域を有するＢ、サブチリスｒｉｂオペロン
を含有するプラスミドの使用を記述している。その結果
から、ｒｉｂオペロンの修正モデルが提案され、それに
よればｒｉｂＯはｒｉｌ）Ｇを含むすべての構造遺伝子
の−に流にあり、そして仮説上の付加的なオペレーター
かおそら（ｒｉｂＡのすぐ上流に位置する。

Ｍｏｒｏｚｏｖ　　ら　（Ｍｏ１．　　Ｇｅｎｅｔ、　
　Ｍｉｋ、　　Ｖｉｒｕｓｏｌ、　　ｎｏ。

１２：１４　（１９８５））は、Ｂ。サブチリスｒｉｂ
オペロンか全部で三個のそれぞれ異なったプロモーター
を含有することを報告している（Ｅ、コリにおいてのみ
活性な第４の［プロモーターＪの他に）。オペロンの一
次プロモーターはｒｉｂＯ領域内に存在することが報告
されており、二つの二次プロモーターは、それぞれ、ｒ
ｉｂＢとｒｉｂＦ遺伝子の間およびｒｉｂＴＤとｒｉｂ
Ｈ遺伝子領域内にあることが報告されている。

Ｃｈｉｋｉｎｄａｓら（Ｍｏ１．　Ｇｅｎｅｔ、　Ｍｉ
ｋ、　Ｖｉｒｕｓｏｌ、　ｎｏ。

２：２０　（１９８７））はＢ。サブチリスのｒｉｂオ
ペロンを含有する６、３ＭｄＤＮＡフラグメントの制限
酵素地図を提案している。制限酵素ＥｃｏＲ１，ＰＳｔ
ｌ、　５ａｌｌ、ＥｃｏＲＶ、Ｐｖｕ　ＩＩおよびＨｉ
ｎｄｌｌＩの部位か示されている。

Ｃｈｉｋｉｎｄａｓ　　ら　（Ｍｏ１．　　Ｇｅｎｅｔ
、　　Ｍｉｋ、　　Ｖｉｒｕｓｏｌ、　　ｎｏ。

４：２２　（１９８７））はＢ、サブチリスｒｉｂオペ
ロンのすべての構造遺伝子が２．８Ｍｄ　Ｂｇｌ　ｌｌ
−Ｈ１ｎｄｌＩＩフラグメントにあり、ＢｇｌＩＩ部位
はオペロンの一次プロモーターと最初の構造遺伝子のリ
ポソーム結合部位との間にあることを報告している。以
下に記すように本出願人らはこのＢｇｌＩＩ部位が実際
にはｒｉｂオペロンの最も５′側の読み取り枠内にあり
、したがって上記の２．８Ｍｄフラグメントはすべての
ｒｉｂ構造遺伝子を含むわけではないことを示している
。したかって、Ｃｈｉｋｉｎｄａｓらの報告とは対照的
に、１．３ＭｄＢｇｌＩＩフラグメントは最初の構造遺
伝子のリポソーム結合部位を含まない。この部位での挿
入はりボフラビンー陰性の表現型を生じる。その結果、
例えば５゛調節領域をもっと強力なプロモーターで置き
換えることによって発現を増加させるために、このＢｇ
１ｍ部位を使ってｒｉｂオペロンを工学的につくり出す
あらゆる試みは、実際には最初の構造遺伝子の、従って
同様にオペロンの完全性を破壊する。

Ｃｈｉｋｉｎｄａｓ　　ら　（Ｄｏｋｌ、　　Ａｋａｄ
、　　Ｎａｕｋ、　　５　５ＳＳＲ２９８：９９７　（
１９８８））は、−次プロモーターＰ、および二つのマ
イナープロモーターＰ２およびＰ、を含有するＢ。

サブチリスｒｉｂオペロンの別のモデル：　ｒｉｂｏ（
Ｐ＋）ｒｉｈＧ−ｒｉｂＢ−Ｐ２−ｒｉｂＦ−ｒｉｂＡ
−ｒｉｂＴ−ｒｉｂＤ−Ｐａ−ｒｉｂＨを開示している
。前記したように１゜３ＭｄＢｇｌＩＩフラグメントが
オペロンの最初の構造遺伝子全部を含有しておりかつこ
の近位のＢｇ１１１部位が一次調節領域内にマツプされ
るという誤った報告がなされている。

本発明はリボフラビンを過剰生産する細菌に関する。本
発明はｒｉｂオペロンおよびその読み取り枠のヌクレオ
チド配列およびｒｉｂオペロンを含有する絹換え細菌に
関する。詳細には、本発明はそのリボフラビンおよび／
またはプリンの生産か調節解除されるような突然変異を
受けた細菌、および染色体ＤＮＡ内に挿入され増幅され
たｒｉｂオペロンコピーを有する細菌に関する。ある実
施態様に於ては、構成的な発現または調節を受けない発
現を起こさせる配列を用いてその制御領域を置き換える
ことによって、ｒｉｂオペロン自体を調節解除すること
ができる。本発明の細菌、オペロンおよび配列を発酵す
るリボフラビン大量生産に使用することができる。

本発明を以下の詳述された特定の実施例、例えばリボフ
ラビンおよびプリン生産に関して調節解除され、その染
色体内に増幅されたｒｉｂオペロンを有するＢ、サブチ
リスｌＡ３８２の変異株、ＲＢ５０：：［ｐＲＦ８］ｓ
。（Ａｄｅつを作製する例により説明する。

この突然変異株は１４ｊ？容器中４８時間の発酵後で５
ｇ／１以上のリボフラビンを生産することができる。

リボフラビン生産か同様の条件下でｌＯｇ／　ｌ以−に
に増加した他の細菌が記述される。

本発明は一般に、様々な細菌株を作製しその細菌株をリ
ボフラビン生産に適した条件下培地中で増殖させること
による、リボフラビンの大量生産（１０ｇ＃？以上）を
特徴とする。第１の観点においては、本発明は、染色体
内に外因的に導入された核酸の少なくともｌコピーを包
含する組換え細菌を特徴とする。この核酸は１またはそ
れ以上のリボフラビン生合成タンパク質をコードし、遺
伝することかでき、細菌によって発現され得る。その結
果、そのような配列を欠く細菌に比較して細菌によるリ
ボフラビン生合成が増加する。

「組換え細菌」とは、同種のまたは別の生物に由来する
ｌまたはそれ以上の核酸配列を、そのような配列が自然
には起こらない部位で、そして／または、自然には生じ
ないコピー数で含有する細菌を意味する。したがって、
この用語には、正常にはｌコピーのみの配列を包含する
部位に、２コピーのヌクレオチド配列、例えば遺伝子ま
たはオペロンか付与された細菌が包含される。それには
また、１またはそれ以」二のヌクレオチド配列コピーが
正常にはその配列を包含しない部位に導入された細菌も
包含される。かかる組換え細菌は標準的な組換えＤＮＡ
技法によって作製される。

「外因的に導入された」とは、組換えＤＮＡ技法、形質
転換、およびトランスフェクションを包含するなんらか
の標準的な方法によって染色体の外の起源から核酸がそ
の染色体に導入されたことを意味する。それにはまた、
かかる細菌の子孫、例えば始めに作製され、形質転換さ
れまたはトランスフェクションされた細菌の細胞分裂に
よって生じた細菌も包含される。

［リボフラビン生合成タンパク質」とは、グアノシン三
リン酸からのりボフラビン合成に直接間わるペプチド、
ポリペプチド、またはタンパク質が包含されることを意
味する。これらのタンパク質は、細菌内に天然に存在し
、その細菌内でリボフラビン生合成に関わるタンパク質
と同一であってもよい。あるいはまた、そのタンパク質
の修飾物であってもよく、たとえば、タンパク質の生物
学的活性に有意には影響しない修飾を含むこともできる
。例として、１またはそれ以上のアミノ酸を導入するか
または置換することによって天然型のタンパク質を修飾
することかでき、それは保存的なアミノ酸置換またはタ
ンパク質の非必須領域の除去によるのか好ましい。かか
る修飾は標準的方法により容易に行える。

いくつかの実施態様に於て、細菌は２コピーまたはそれ
以、］−の核酸配列を含有する。そしてｌまたはそれ以
」二のリボフラビン生合成タンパク質をコードする核酸
か細菌染色体内の少なくとも２箇所の部位に存在する。

「部位」とは、野生型細菌に関する、生合成タンパク質
をコードする核酸が存在する明確な染色体上の位置を意
味する。例えば、このような核酸はそのようなタンパク
質をコードする遺伝子の天然に存在する部位（すなわち
ｒｉｂ遺伝子座）に存在してもよいし、またはこの位置
から離れた部位に存在してもよい。このような離れた部
位はリボフラビン生産にとって必須ではないタンパク質
をコードする領域のような、組換え細菌に必須ではない
染色体核酸領域から選択されるのか好ましい。

このような領域の例には、プロテアーゼのようなある種
の細胞外酵素をコードする領域か包含される。このよう
な部位での挿入は求める性質や特性を損なわない。リボ
フラビン生産に関する細菌の機能か実質的に影響を受け
ない限り、あらゆる部位か好適である。

他の実施態様に於て、核酸ｌまたはそれ以」二の部位で
複数コピー状態で存在する。そして核酸は染色体内の少
なくとも３箇所の部位で存在する。

異なった部位に核酸を導入することによって、染色体内
の核酸の総コピー数を増加させることができる。フビー
数の増加によりリボフラビン生産量か増加する。

概して、リボフラビン生合成タンパク質は１またはそれ
以」二のｒｉｂ遺伝子（例えば、その不活性化はりポフ
ラビン要求株を生成する）、好ましくは第３図に示され
るヌクレオチド配列から同定できる少なくども５個の異
なったｒｉｂ遺伝子によりコードされる。少なくとも５
コピーのかかる遺伝子が存在するのが好ましい。ｒｒｉ
ｂ遺伝子」とは、生物内で天然に存在するタンパク質、
またはかかるタンパク質と同様の機能をするタンパク質
をコードする遺伝子または遺伝子の部分を意味し、５−
こでかかるタンパク質は細菌内でのグアノシン三リン酸
のりボフラビンへの生合成的変換に関わっているものを
指す。

関連する観点に於ては本発明は、ｌまたはそれ以上のリ
ボフラビン生合成タンパク質例えば第４図でＯＲＦ　１
およびＯＲＦ　６と同定された遺伝子産物をコードする
核酸を包含する組換え細菌を特徴とし、その少なくとも
一つの発現はその核酸と天然には関連しない転写エレメ
ントによって制御される。

あるいはまた、この組換え細菌には、その発現か「１１
）遺伝子と天然には関連しない転写エレメントによって
制御される１またはそれ以上の「１１）遺伝子または転
写単位か包含される。

「転写エレメント」とは、その転写エレメントから下流
への核酸の転写を実行させる（すなわち作動させる）あ
らゆる核酸を包含することを意味する。このようなエレ
メントの例にはプロモーターおよびオペレーターか包含
される。かかる転写エレメントはその核酸と天然には関
連かなく、たとえば非相同の転写エレメントであること
ができる。すなわち、それは他の種や属の細菌または他
の生物から単離されてもよい。あるいはまた、転写エレ
メントはその細菌に天然に存在するか今それか転写的に
連結されようとしているｒｉｔ］遺伝子と通常は関連の
ない工１ノメントであってもよい。

かかるエレメントにはｒｉｂ遺伝子と天然に関連がある
ものは包含されない。

別の実施態様に於ては、組換え細菌は少なくとも３個の
（または少なくとも５個の）　　ｒｉｂ遺伝子を包含し
、３個のｒｉｂ遺伝子すべての発現がこれらｒｉｂ遺伝
子と天然には関連がない転写エレメントによって制御さ
れ、少なくとも２個の転写エレメントか付与され、ｒｉ
ｂ遺伝子は組換え細菌の染色体内に付与され、組換え細
菌はリボフラビン遺伝子発現について調節解除され、そ
してその転写エレメントはプロモーターである。たとえ
ば、そのプロモーターは、５ＰＯＩフアージに関連した
もの、および／またはｖｅｇ、　ａｍｙ、および５ａｅ
Ｑ−感受性プロモーター、例えばａｐｒ、といった構成
的プロモーター、増殖により調節されるプロモーター、
または誘導しうるプロモーターである。

「調節解除される」とは、天然型のリボフラビン調節シ
ステムを持つ細菌（すなわち野生型細菌）で観察される
よりもリボフラビン生産レベルか高いことを意味する。

かかる調節解除された細菌には、様々なプリン類似体ま
たは拮抗体に対して耐性を存する細菌か包含され、ここ
で、かかる類似体または拮抗体は例えば８−アザグアニ
ン、ブシコフラニン、デコイニン、８−アザキサンチン
、スルファグアニン、６−チオグアニン、およびメチオ
ニンスルホキシドからなる群および／またはロゼオフラ
ビンのようなりボフラビン類似体から選択できる。調節
解除された好ましい細菌は、以下のプリン類似体または
拮抗体すなわち８−アザグアニンまたはデコイニン、お
よびロゼオフラビンの少な（とも一つに対して耐性であ
る。

他の詳細な実施態様に於ては、少なくとも一つのｒｉｂ
遺伝子にそのｒｉｂ遺伝子と天然には関連がないリポソ
ーム結合部位が包含され、ｒｉｂ遺伝子は染色体内の２
つの部位で存在し、モしてｒｉｂ遺伝子は染色体内で複
数のコピーで存在する。もっと望ましい実施態様に於て
は、ｒｉｂ遺伝子はバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）　ｒ
ｉｂ遺伝子例えば第４図に示されるＯＲＦ　３及びＯＲ
Ｆ　４であり、転写エレメントＯＲＦ　３またはＯＲＦ
　５の５′上流域に存在し、そしてｒｉｂ遺伝子はβ−
リボフラビンシンターゼをコードする遺伝子、０ＲＦ２
．０ＲＦ３．０ＲＦ４．およびＯＲＦ　５から選択され
、そして細菌はエシェリヒア（Ｅｓｈｅｒｉｅｈｉａ）
例えばＥ、コリ、バチルス例えば、Ｂ、サブチリス、り
１ノブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、またはコリネ
バクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｅｔｅｒｉｕｍ）種に
属する。

もう一つの関連する観点では、本発明は５またはそれ以
−トのｒｉｂ遺伝子を包含し、その発現かそのｒｉｂ遺
伝子とは天然には関連がない転写エレメントによって制
御される核酸を特徴とする。

さらに別の観点ては、本発明は、第一に、細菌特にバチ
ルス好ましくはＢ、サブチリス、またはＥ、コリあるい
は酵母起源の、■またはそれ以」二の（少なくとも５が
望ましい）リボフラビン生合成タンパク質をコードする
核酸配列を、そして第二に、この核酸配列と天然には関
連かないｌまたはそれ以」−の（１または２か望ましい
）転写エレメントを含んでなるベクターに関する。転写
エレメントか」１記のようにすてに特定されたベクター
か望ましい。実施例で詳記するベクター、例えばｐＲＦ
５０．　ｐＲＦ６９．　ｐＲＦ７０．　ｐＲＦ７１．　
ｐＲＦ７８．　ｐＲＦ８１および／またはｐＲＦ８９が
さらに好ましい。

本発明のもう一つの観点では、上記で特定されたベクタ
ーによって形質転換された細菌を含んでなる組換え細菌
に関する。このものは上述の転写エレメントを含む前記
核酸配列の少なくとも１コピー、好ましくは多コピーを
染色体内の１またはそれ以上の部位に導入され、そして
該転写エレメントを含む該核酸配列は遺伝性で、その細
菌による発現能を有する。その結果、その細菌によるリ
ボフラビン生合成は該転写エレメントを含む核酸配列を
もたない細菌に比較して増加する。１または２箇所のか
かる部位への導入が望ましい。さらに形質転換される細
菌がりボフラビン遺伝子発現に関してすでに調節解除さ
れているような組換え細菌か好ましい。かかる調節解除
された細菌のうちＥ、コリまたはバチルス特にＢ、サブ
チリス株か好圭しく、Ｂ、サブチリス株ＲＢ５０および
ＲＢ５８か特に好ましい。

本発明はまた、組換え細菌の調製方法にも関する。その
方法は１またはそれ以上のリボフラビン生合成タンパク
質をコードする細菌または酵母起源の核酸配列を含んで
なるベクター、または上記で既に特定されたベクターに
より、細菌特に上記で既に特定された細菌を形質転換す
るものである。

それによって任意に該転写エレメントを包含する該核酸
配列少なくとも１コピー、望ましくは多コピーが染色体
内の１またはそれ以上、好ましくは１または２箇所の部
位に導入され、そして任意に該転写１１ノメントを包含
する該核酸配列は遺伝性で、細菌による発現可能である
。その結果その細菌によるリボフラビン生合成は該転写
ニレメン（・を任意に包含する核酸配列をもたない細菌
と比べて高められる。

本発明はまた、そのような細菌の染色体内のｒｉｂ生合
成遺伝了・と天然に関連する１またはそれ以上の転写ニ
レメン１へか前記特定の転写ニレメン１−によって置き
換えられたここに特定される細菌にも関する１１、−の
ような置換は本発明の記載に基ついて当業者に知られた
方法により行われうる。

別の観点に於ては本発明はリボフラビン生産方法を特徴
とする。その方法には細胞特にここで詳細に言及される
組換え細菌を適当な増殖条件下に増殖させることが包含
される。この適当な増殖条件は、数組換え細菌の増殖の
ための好気的条件か維持されるような様式で増殖培地お
よび／または供給培地の成分の利用可能性を限定するこ
とを特徴とする。このような条件はまた例えば溶存酸素
レベルを約５９６から３００６までの間の濃度に維持す
ることによっても特徴付けることかできる。当業者は、
かかる溶存酸素１、・ベルが数組換え細菌の増殖におよ
び該溶存酸素濃度の測定に用いられる特定の技術的装置
の如何により変化する可能性かあるということを熟知し
ている。嫌気的条件下ではリボフラビン合成は減少する
。いくつかの実施態様に於ては、限定性成分は炭素源、
窒素源、まｔ、−は細胞か要求する成分（例えば、供給
培地に於て）から選択される。例えば、細胞か例えばメ
チオニン要求株であるならば、増殖培地にはメヂオニン
供！４１．ベルか限定される。別の例に於ては、そのよ
うな成分はグルコースまたはカルボン酸、例えばクエン
酸やコハク酸のようなりエン酸回路の酸、またはアミノ
酸であろう。

関連する観点に於ては本発明は細菌によるリボフラビン
生産を増加させるためのもう−っの方法を特徴どする３
、この方法に於ては、用いられる細菌株はりボフラビン
生産について調節解除されている４、ｌまたはイ、第１
以上のリボフラビン生合成タンパク質をコードする核酸
配列の１コピ一以上を−の細菌の染色体ＤＮＡに導入す
る。この方法で用いる細菌は前記の・）ちの一つから選
ばれるのが好ましい。本発明はまた、上記で特定された
方法により、これもまた」上記で特定された条件下で得
られた組換え細菌を増殖させることによるリボフラビン
生産力法にも関する。

本発明の他の観点に於ては、精製された核酸およびかか
る核酸の絹換えポリペプチド産物か提供される。一般に
、精製核酸は本質的にｒｉｂオペロンの全体または・部
分、例えば第３図に示す特定の読みとり枠からなる。か
かる精製核酸は、ブー〉スミド、ファージ、またはコス
ミドのようなベクター内にイ」与されてもよいし、また
は細菌の染色体中に組み込まれてもよい。、二の核酸は
ぞれか天然に連結されている核酸から分離される。例え
ば、全ｒ１１〕オペロンをコードする６、　５　ｋｂ核
酸を、その６゜５１ｔｂＤＮＡか通常存在する部位から
離第１た部位てＢ７勺ブチリス染色体内に挿入すること
かできる１゜組換えポリペプチドどは、無関係ポリペプ
チドを存しない（すなわち非相同のボリベブヂ」り゛に
巖合し７ていない）生物学的に活性なタンパク質を、ｅ
：味し、天然で生産されるそのポリペプチドと同等の酵
素活性を有する。

本発明の他の特徴および利点は、それに関Ｊ−ろ好まし
い実施態様についての以下の記載および請求の範囲から
明らかであろう。

（図面の簡単な説明） 第１図：　Ｋｅｌｌｅ＋−ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　２７
：１１１７　（１９８８）から改変されたリボフラビン
生合成経路を示す。

示されている対応する中間体はＥ、コリによ−）て生産
されるものである（それらはおそら＜Ｂ、サブチリスに
より生産されるものと同一である）：構造ｌニゲアノシ
ン三リン酸（ＧＴＰ）　；構造２：２．５−ジアミノ−
６−（リボシルアミノ’）　−４（３Ｈ）　−ピリミジ
ノン−５゛−リン酸；構造３：５−アミノ６−（リボシ
ルアミノ）　−２，４（ＩＨ，３Ｈ）−ピリミジンジオ
ン−５゛−リン酸：構造４：５−アミノ−６−（リボシ
ルアミノ）−２，４（ＩＨ，３Ｈ）　−ピリミジンジオ
ン−５°−リン酸；構造５：６，７−シメチルー８−リ
ビヂ゛ルルマジン；構造６：リボフラビン。指示された
生合成酵素はＢ。サブチリスによってコードされるもの
（ＧＴＰシクロヒドロラーゼ、リボフラビンシンターゼ
のαおよびβザブユニット）であるが、またはＢ、サブ
チリスによってコードされると提案されたもの（ｒｉｂ
−特異的デアミナーゼ、およびｒｉｂ−特異的ｌ／ダク
ター・ゼ）である。

第２図ニブリン生合成の図式的表示である。リボフラビ
ン生合成に関わる部分を包含するプリン生合成経路を図
示する。遺伝子記号（Ｅ、コリ命名法）によってその経
路のそれぞれの酵素か明示される。略号は以下の通りで
ある、すなわちＰＲＰＰ　：ホスホリシボシルビロリン
酸；ＧＡＲニゲリシンアミドリボヌクレオチド；　　ｐ
ｕｒ　：　ＧＡＲホルミルト・ランスフェラーゼ；ＰＲ
Ａ：ホスホリボシルアミン；ｐｕｒＡ　：アデニロコハ
ク酸シンセターゼ；　ｐｕｒＢ　：アデニロコハク酸シ
ンセターゼ、　ＦＧＡＲ：ホルミルグリシンアミドリボ
ヌクレオチド：　５ＡＩＣＡＲ：アミノイミダゾールス
クシノカルポキザミドリポヌクレオチド；　ｐｕｒＣ：
　５ＡＩＣＡＲシンセターゼ：　ＦＣＡＭ　、ホルミル
グリシンアミジンリボヌクレオチド；　ｐｕｒＤ　：Ｇ
ＡＲシンセターゼ：ＡＩＲニアミノイミダゾールリボヌ
クレオチド；　ｐｕｒＥ　：　ＡＩＲカルボキシラーゼ
ＣＡＩＲ：カルボキシアミノイミダブールリポヌクレオ
チド：　ｐｕｒＦ　：　ＰＲＰＰアミドｌ−ランスフェ
ラーゼ；Ａ、ＩＣＡＲ：アミノイミダゾール力ルポキザ
ミドリボヌクレオチド；　ｐｕｒｌ　：　ＡＩＣＡＲホ
ルミルトランスフェラーゼ；　ｐｕｒＪ　：イノシンー
リン酸（ｌλ＋Ｐ）シクロヒドラーゼ、　ＦＡＩＣＡＲ
：ホルムアミドイミダゾールカルボキザミドリボヌクレ
オチド：　ｐｕｒｌ、　：　ＦＧＡＲアミドトランスフ
ェラーゼ＋　ｇｕａＡ・グアノシン−リン・酸（ＧＭＰ
）シンセターゼ：　ｐｕｒＭ　：　ＡＩＲシンセターゼ
：　ｇｕａＢ　：　ＩＭＦデヒドロゲナーゼ。

第３図：Ｂ、サブチリスｒｉｂオペロンの完全なヌクレ
オチド配列および推定アミノ酸配列を示す。

ヌクレオチド配列はＭ１３クローンのジデオキシ配列決
定法により決定された。推定アミノ酸配列はＩ文字表記
（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、　Ｂｉｏｃｈｃｍｉｃｔｒｙ、
　２ｄ　Ｅｄ、。

Ｗｏｒｔｈ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、　　ｌｎｅ、、Ｎ
ｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ｐ、７２）で示される。

第４図：　　ｒｉｂ遺伝子クラスターの図式的表示であ
る。上の図は、プラスミドｐＲＦ　２に於てクローニン
グされたＢ、ザブチリスｒｉｂ遺伝子を含有する１０ｋ
ｂ　ＥｅｏＲＩＤ　Ｎ　Ａフラグメントの制限エンドヌ
クレアーゼ地図である。リボフラビンシンターゼ遺伝ｒ
に特異的な５４−量体プローブに対する相同領域を太い
黒線で示す。網掛けの四角はＲｉｂ”クローン化ＤＮＡ
を示し、一方細い黒線はｐＢＲ３２２Ｄ　Ｎ　Ａを表す
。下の図はｒｉｂオペロンが局在する６、Ｏｋｂフラグ
メン（・の完全なヌクし・オチド配列に基づく。

読みとり枠は白ぬきの長方形で表され、それに付されて
いる矢印は転写方向を示す。黒の長方形は推定リポソー
ム結合部位を示す。ありうるσ９プロモーター領域を示
す。試みに同定されたｒｈｏ−１ｔ依存性転写終止部位
を「ヘアピン」記号で示す。

すべての制限部位が示されているわけではない。

第５図：　ＲＢ５０の菌株由来を示す。リボフラビン過
剰生産株Ｂ。サブチリスＩ？Ｂ５０の由来を示す。様々
な親株をリボフラビンおよびプリン類似体に曝して適当
な突然変異を選択した。

第６図：　　ｒｉｂ＋組換えプラスミドの起源を示す。

ｒｉｂオペロン含有組換えプラスミドｐＲＦ　ｌ、ｐＲ
Ｆ２．。

ｐＲＦ　３、ｐＲＦ　６およびｐＲＦ　７作製の模式図
を示す。

」法で選択されたＢ、サブチリスＤＮＡのｑ−ｔｘｈｂ
フラグメントのライブラリーを用いてＥ、コリプラスミ
ドベクターに於ける遺伝子ライブラリーを作製した。ク
ローンはりボフラビンシンターゼ遺伝子のβザブユニッ
トに特異的な５４−縫体ブローブにハイブリッド形成さ
せることによって選択した。

第７図：８４ブチリスＲＢ５３　：　：　［［）Ｉ？Ｆ
　８　）−６の菌株由来を示す。プラスミドｐＲＦ　８
を中間菌株ＲＢ５２の染色体に組み込み、増殖した。そ
の結果上じた菌株をプリン類似体アザグアニンに曝した
。

第８図：挿入および欠失を用いたリボフラビン生合成に
必須な領域の同定を示す。図はりボフラビン生合成に必
須の示される領域を含む１０ｋｈクローン化ＥｃｏＲＩ
　ＤＮＡフラグメントを示す。指示された制限部位に於
ける挿入および欠失によってｒｉｂオペロンの位置を決
定することができた。すべての制限部位か示されている
わけではない。

第９図：ありうるｒｈｏ−非依存性転写終止部位のヘア
ピンループ構造を示す。第３図のヌクレオチド配列に於
ける位置を各構造の下部に示す。Ｔｉｎｏｅ。

ら（Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）　Ｎｅｗ　Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ　２４６：４０　（１９７３））に従って決定
されたそれらの形成自由エネルギーも示す。

第１Ｏ図：　５−３０インビトロ共役転写／翻訳反応に
使用した様々なプラスミド誘導体の構造を示す。

模式図は、５−３０反応に用いられたプラスミド誘導体
に含まれるｒ　ｉ　ｌ）オペロン領域、ならびに発現が
予想される読みとり枠を示す。

第ｔｉ図：リボフラビン生産曲線の比較を示す。

様々な発酵プロトコールについてのりボフラビン生産曲
線を示す。自四角：　ＲＢ５０　：　：　［ｐＲＦ　８
　］　ｌａｏ　（Ａｄｅ−）を使用したＲＢＰ−１４゜
黒四角：　ＲＢ５０：：［ｐＲＦ８　Ｉ＠。

（Ａｄｅ−）を使用したＲＢＦ−２２，白丸：　ＲＢ５
０：：［ｐＲＦ８　ｌａ。

（Ａｄｅ−）を使用したＲＢＦ−２３，黒丸：　ＲＢ５
０：：［ｐＲＦ８　ｌａ。

（Ａｄｅつを使用したＲＢＦ−２９゜ 第１２図：　ｆｌＲＦ４０の作製を示す。

第１３図：　ｐＲＦ５０の作製を示す。

第１４図、１５図および１６図：種々のベクターの構造
を示す。

第１７図ニブラスミド作製に使用される５５−量体を示
す。

第１８図：ベクター作製に用いられる様々なオリゴヌク
レオチドを示す。

本発明の実施に際してはリボフラビン生合成経路の遺伝
子にまたは様々なプリン生合成経路にリボフラビン過剰
生産を招来するｌまたはそれ以上の突然変異を含有する
宿主細菌株が誘導される。

−一一つの実施態様に於ては、このような突然変異によ
りリボフラビン生合成経路に於ける調節解除スデップに
よって、リボフラビンが過剰に生産される。別の実施態
様に於ては、かかる突然変異によりリボフラビン生合成
の前駆体が代替代謝経路で用いられるのか阻害されるこ
とによってリボフラビン生産が増加する。

詳細な実施態様に於ては、宿主の代謝経路において真正
対応物と拮抗するプリンまたはリボフラビンの類似体に
曝すことによって、宿主細菌の遺伝的バックグラウンド
に於ける望ましい突然変異を誘導することかできる。こ
のような暴露を生き残−）だ細菌が、類似体に対応する
真正物質を過剰生産させうる突然変異を有していて、排
除しなければ致死的であるプリンまたはリボフラビン類
似体を拮抗的に排除する。Ｂ、サブチリス中に於けるリ
ボフラビン生合成はグアノシン三リン酸から始まる（第
１図、構造ｌ）。グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）は、グ
アノシン−リン酸（ＧＭＰ）を経由したプリン生合成経
路の産物である（第２図）。好ましい実施態様に於ては
、リボフラビンを過剰生産する宿主菌株を得るのに、細
胞が生産するＧＴＰ　Ｊｔを増加させ、かつリボフラビ
ン経路の調節を解除するために古典的な遺伝学を用いる
ことができる。

Ｂ、サブチリスに於けるプリン過剰生産はプリン類似体
または拮抗体に対して耐性を有する変異株を得ることに
より達成できる。使用できるプリン類似体のいくつかの
例には８−アザグアニン（Ｉｓｈｉｉおよび５ｂｉｉｏ
、　Ａｂｒｉｅ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　３６：１５１
１，１９７２；Ｋｏｎｉｓｈｉおよび５ｈｉｒｏ、　Ａ
ｇｒｉｅ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　３２：３９６、
１９６８）、ブシコフラニンおよびデコイニン（Ｍａｔ
ｓｕｉら、Ａｇｒｉｅ、　　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　
　４３：１７３９．　１９７９：Ｍａｔｓｕｉら、Ａｇ
ｒｉｃ、　　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　　４３：３９３
．　１９７９）、８−アザキサンチン、スルファグアニ
ン、６−チオグアニン（Ｄｅｂａｂｏｖ、　Ｖ、Ｇ、、
Ｔｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙｏｆ　ｔ
ｈｅ　Ｂａｃｉｌｌｉ第１巻Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂ
ｔｉｌｉｓ、　Ｄ。

Ａ、　Ｄｕｂｎａｕ編（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｅｒｓｓ
、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）中の３３１−３７０ページ、１
９８２）およびその他、および／または拮抗体メチオニ
ンスルフオキシド（Ｍａｔｓｕｉら、Ａｐｐ、　Ｅｎｖ
、　Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌ、　３４：３３７．１９７７）
、およびそれらの任意の組合せか包含されるがそれらに
限定されるわけではない。

リボフラビン経路はりボフラビン類似体に対Ｉ７耐性を
有する突然変異株を得ることによって調節解除されつる
。利用できるリボフラビン類似体の例はロゼオフラビン
（Ｍａｔｓｕｉら、Ａｇｒｉｅ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　４６：２００３．１９８２）である。

本発明の詳細な実施態様に於ては、突然変異により類似
体アザグアニン、デコイニンおよびロゼオフラビンに対
して耐性とな、った細菌を使用することかできる。これ
らの化合物のそれぞれに対して耐性を有する詳細な突然
変異株を以下に記述する。その細菌を他の類似体に対し
て耐性をなす突然変異を有する細菌も用いることができ
る。上記と同じ類似体に対して耐性となすような種々の
突然変異を有するが、または他の類似体に対する様々な
突然変異と組合せるかまたは組み合せずしてこれらの突
然変異の種々の組合せを有する細菌の利用もまた本発明
の範囲にあると見なされる。

類似体単独に曝すことによっては十分高い頻度て耐性変
異株を生じない場合は一般には突然変異の頻度を上げる
ために、従って類似体耐性変異株の数を増やすために、
様々な変異原物質を使用することができる。−例として
はエチルメチルスルホネ−１−を使用することができ、
またニトロソグアニジンまたはＵＶ照射を含む他の変異
原物質も使用できるかそれらに限定されるわけではない
。

好適な細菌宿主には、すべてのバチルス種（好ましい実
施態様としてＢ、サブチリスを含む）、Ｅ。

コリおよび多くの他のゲノム陽性およびダラム陰性細菌
か包含される。ゲノムに挿入すべきクローン化ｒｉｂオ
ペロンのプロモーター配列を認識できる種が使用に適す
る。標準的な操作（例えば形質転換）によってｒｉｂ遺
伝子を他の細菌に導入するために、後記のプラスミドを
用いることかできる。

挿入されたｒ　ｉ　ｂ遺伝子の発現は、以下に記載され
る分光法によるかまたは後記ＵＶ先光下の細菌の観察に
より測定できる。

プリンやリボフラビン類似体に曝すことによって突然変
異を生じさせる他に、それらのプリンやリボフラビン生
合成経路に影響を与えることか知られている突然変異を
既に含有する細菌株を利用することができる。例えば本
発明はその菌株に限定されるわけてはないがＢ、ザブチ
リス株［Ａ３８２を利用するもので、その菌株は突然変
異ｐｕｒ−６０を含有しておりそのせいでアデニン要求
株となっている。この突然変異によりリボフラビン前駆
体イノシン−リン酸（ＩＭＰ）がりボフラビン生産以外
の代謝経路で利用されるのか遮断されるため、増加量の
Ｉに（Ｐをリボフラビン生合成に利用でき、従ってＪボ
フラビン生産が増加する。リボフラビン生産を増加させ
る可能性のある利用可能な多くの他の突然変異が存在し
ており、それらにはＧｕａＣ３、ｈｉｓ、および本発明
の範囲に包含されるその他の変異が包含されるかそれら
に限定されるわけではない。

ＧｕａＣ３変異は、ＧＭＰかＩＭＰに戻る変換を阻止し
く第２図参照）、従って利用可能なリボフラビン生合成
前駆体の量を増加させる。

当業者に知られた様々な方法によってリボフラビン過剰
生産に影響を及ぼす好適な変異をマツプする事かできる
。詳細な実施態様に於ては、栄養要求性変異株の相補性
によって、突然変異をマ・ツブする事ができる。

様々な細菌に由来するリボフラビン生合成遺伝子をクロ
ーンして本発明に使用することができる。

バチルス属、Ｅ、コリおよび多くの他のゲノム陽性およ
びダラム陰性細菌を包含するがそれらに限定されない種
からの細菌、または酵母細菌は、ｒｉｂオペロンの分子
クローニングのための核酸源として使用可能である。当
業者に周知の標準的な操作によって、例えば、所望の細
菌細胞から精製された染色体ＤＮＡまたはそのフラグメ
ントを遺伝子増幅のために適当なベクターにクローニン
グすることによって調製されたＤＮＡライブラリーから
、ｒｉｂオペロンを含有するＤＮＡを得ることができる
。　（例として、ＭａｎｉａｔｉＳら、１９８２．　Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、　　Ａ　　Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ　　Ｍａｎｕａｌ、　　Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐ
ｒｉｎｇｌｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃ
ｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮｅｗＹｏｒ
ｋ；　Ｇｌｏｖｅｒ、　Ｄ、Ｍ。（編）、　　１９８２
．　ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ。

Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ、　ＭＲＬ
　Ｐｒｅｓｓ、　Ｉ、ｔｄ、　、　０ｘｆｏｒｄ。

Ｕ、に、Ｖｏｌ、　Ｉ、　　ＩＩ参照）。

染色体ＤＮＡからの遺伝子の分子クローニングに於て、
フラグメントが生成し、そのうちのいくつかは所望のｒ
ｉｂオペロンをコードしていよう。

このＤＮＡは様々な制限酵素を用いて特異的な部位で切
断できる。あるいはまた、ＤＮＡを断片化するためにマ
ンガン存在下でＤＮＡアーゼを使用してもよく、またＤ
ＮＡを、例えば音波処理により物理的に切断することも
できる。つぎに線状ＤＮＡフラグメントを標準的な技術
によって寸法にしたかって分離することかできる。この
技術にはアガロースおよびポリアクリルアミドゲル電気
泳動および密度勾配遠心分離か包含されるがそれらに限
定されるわけではない。

ひとたびＤＮＡフラグメントか生成されると、適当なり
ローニングおよび／または発現ベクターを用いてＤＮＡ
ライブラリーを調製する。当業上周知の多数のベクター
−宿主系を使用できる。使用可能なベクターには、プラ
スミドまたは修飾されたウィルスが包含するがそれらに
限定されるわけではない。しかしベクター系は使用する
宿主細胞と適合しなければならない。Ｅ。コリに関して
は、かかるベクターにはλ誘導体のようなバクテリオフ
ァージ、ｐＢＲ３２２またはｐＵＣプラスミドのような
高コピープラスミド、またはシコ、−トモナス（Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ）プラスミドＲＫ２から誘導される低
コピープラスミドが包含されるがそれらに限定されるわ
けではない。バチルスに関しては、かかるベクターには
、／）１１　（Ｄｅａｎら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　２０：
３３９゜１９７６　：　Ｋａｗａｍｕｒａら、Ｇｅｎｅ
　５：８７．　１９７９）または△１０５誘導体（Ｉｉ
ｊｉｍａら、Ｇｅｎｅ　９：１１５．１９８０　；　Ｅ
ｒｒｉｎｇｔｏｎ。

、ＬＧｅｎ、　Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　１３０：２
６１５．　１９８４　：　Ｄｈａｅｓｅら、Ｇｅｎｅ　
３２：１８１．１９８４；　Ｅｒｒｉｎｇｔｏｎ、　Ｊ
、、ＢａｃｉｌｌｕｓＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ａｐｐｌ
ｉｃａｔｉｏｎｓ。

Ａ、　Ｔ、　ＧｅｎｅｓａｎおよびＪ、　Ａ、　ｆ（ｏ
ｅｈ、編（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）、　Ｐ、２１７．１９８６）のよう
なバクテリオファージ、　ｐＵＢｌｌｏ　（Ｅｈｒｌｉ
ｃｈ、　Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｅｉ、（ＵＳＡ）　７４：１６８０．１９７７）また
はｐＢＤ６４のような高コピープラスミド、またはｐＥ
１９４誘導体（Ｇｒｙｃｚａｎ。

Ｔ、、１．Ｔｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｂａｃｉｌｌｉ、　Ｄ。

Ａ、　　Ｄｕｂｎａｕ　　編　（Ａｃａｄｅｍｉｃ　　
Ｐｒｅｓｓ、　　Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ）、　　りｐ。

３０７−３２９．１９８２　；　Ｈｏｒｉｎｏｕｅｈｉ
およびＷｅｉｓｂｌｕｍ、　Ｊ。

Ｂａｅｔｅｒｉｏｌ、　１５０：８０４．１９８２）の
ような低コピープラスミドか包含されるがそれらに限定
されるわけてはない。組換え分子を形質転換、トランス
フェクシヨン、プロトプラスト形成、感染、エレクトロ
ポレーション、などにより宿主細胞に導入することがで
きる。

一旦ＤＮＡライブラリーか生成すると、多くの方法（例
えば、ｈｌａｎｉａｔｉｓら、上記に記載のような）に
よってｒｉｂオペロンを含有する組換えＤＮＡを含む特
定のクローンの同定を行いうる。例えば、もし一定量の
オペロンまたはそのフラグメンｌ−が別の細菌源から（
例えばＥ、コリから）入手でき、かつそれかバチルスの
リボフラビン生合成遺伝子とハイブリッド形成しつるに
充分に相同であるならば、そのＤＮＡを精製および標識
することができ、そして生成したＤＮＡフラグメントの
バンクを標識化プローブに対する核酸ハイブリッド形成
によって選別することかできる（Ｂｅｎｔｏｎ、　Ｗ、
およびＤａｖｉｓ、　Ｒ，，１９７７、５ｃｉｅｎｃｅ
　１９６：１８０；　Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ。

Ｍ、およびｌ（ｏｇｎｅｓｓ、　Ｄ、、１９７５．　Ｐ
ｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　７２：３９６Ｎ）。あるいは
また、内因性ｒｉｂオペロンの読みとり枠を含んでなる
配列、または約ｌＯ１好ましくは１５またはそれ以上の
ヌクレオチドを含んでなるその配列をハイブリッド形成
プローブとして使用することができる。このようなプロ
ーブは、オペロンがコードしていることか知られている
遺伝子産物の核酸またはアミノ酸配列の一部分（その例
が以下に与えられる）に基づいて合成的に作られつる（
「逆向き遺伝学」）。

もし精製されたｒｉｂオペロン特異的プローブが利用で
きないならば、制限フラグメント（例えば部分的な５ａ
ｕ３Ａ消化物からの）のクローン化遺伝子ライブラリー
を細菌、特にＢ、サブチリスまたはＥ。

コリ内につくることができ、ｒｉｂオペロン含有組換え
クローンはマーカーレスキューまたは既知のｒｉｂ変異
についての相補性のいずれかによって確認することがで
きる。

好ましい実施態様に於ては、Ｂ。サブチリスＤＮＡのＥ
、コリプラスミドライブラリーからＢ、サブチリスのｒ
ｉｂオペロンを単離して使用することができる。特に、
そして下記のように、Ｂ、サブチリスｒｉｂオペロンは
、Ｂ、サブチリスのオペロンがコードすることが知られ
ている遺伝子産物の内部の領域から誘導された放射性標
識合成ヌクレオチドプローブに対するその相同性により
単離できる。β−リボフラビンシンターゼ（Ｌｕｄｗｉ
ｇら、Ｊ、　Ｒｉａｌ。

Ｃｈｅｍ、　２６２：１０１６．１９８７）のアミノ酸
配列の一部分がかかるプローブの基礎でありうるが、コ
ドン使用の頻度からそれぞれのコドンの３番目のヌク１
ノオチドを推定し、このタンパク質の別の領域、または
ｒｉｂオペロンに由来する別のタンパク質に基づく同様
のプローブを利用することができ、それらは本発明の範
囲にある。本発明によりさらに、第３図に示すヌクレオ
チド配列から誘導された合成プローブを使用することに
よるスクリーニングか可能となる。

ここで詳述した方法と類似の方法を用いて、他の細菌、
特に他のバチルスまたはＥ、コリのｒｉｂオペロンを単
離することかできる。詳細な実施態様に於ては、かかる
クローンは標識化Ｂ、サブチリスｒｉｂオペロンまたは
そのハイブリッド形成可能な部分とのハイブリッド形成
能をアッセイすることによって選択できる。適当なｍＲ
ＮＡ調製物から出発してｃＤＮＡを調製できることは半
梁上よく知られている。かかるｅＤＮＡを本発明により
用いて、適当な細菌をリボフラビン過剰生産用に形質転
換させるためのベクターを調製することもできる。

単離されたｒｉｂオペロンまたはその一部分を包含する
組換えＤＮＡ分子を有する宿主細胞がひとたび同定され
ると、そのＤＮＡを大量に得ることができる。次に、こ
れによってｒｉｂオペロンが操作できそしてそのヌクレ
オチド配列が当業者によく知られた様々なりローニング
及び配列決定技術を用いて決定できる。

例えば、挿入変異原物質を用いて、クローン化ＤＮＡ断
片内に於けるｒｉｂオペロン及びその遺伝子の位置を決
定し特性決定することかできる。詳細な実施態様に於て
はｒｉｂ生合成含有領域は、小さなｅａｔ（クロラムフ
ェニコールアセチルトランスフェラーゼ）含有制限フラ
グメントをクローン化ＤＮＡの数個の異なる制限酵素部
位に挿入しそして適当な宿主（下記参照）に於けるリボ
フラビン生合成の挿入による不活性化についてそれぞれ
の誘導体を検査することにより確認できる。

ｒｉｂオペロンに相当するクローン化ＤＮＡは、ザザン
ハイブリッド形成（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｅ、Ｍ、、１
９７５゜Ｊ、Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　９８＋５０３−５
１７）、ノーザンハイブリッド形成（例えばＦｒｅｅｍ
ａｎら、１９８３．　Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ。

Ａｅａｄ、　Ｓｅｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ。８０　：　４０９
４−４０９８参照）、制限エンドヌクレアーゼマツピン
グ（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２゜Ｍｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ　　Ａ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
　　Ｍａｎｕａｌ、　　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　　Ｈａ
ｒｂｏｒ　Ｌａｈｏｒａｔｏｒｙ、　　Ｃｏ１ｄ　　Ｓ
ｐｒｉｎｇ　　［（ａｒｂｏｒ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）　、およびＤＮＡ配列分析を包含す
るがそれに限定されない方法により分析できる。制限エ
ンドヌクレアーゼマツピングはｒｉｂオペロンの遺伝子
構造をおおまかに決定するのに用いられうる。制限エン
ドヌクレアーゼ切断により誘導された制限地図はＤＮＡ
配列分析によって確認できろ。

ＤＮＡ配列分析は５業上知られた任意の技法によって行
うことかできる。それら技法にはＭａｘａｍおよびＧ１
１ｂｅｒｔの方法（１９８０，Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍ
ｏｌ、６５：４９９−５６０）、Ｓａｎｇｅｒジデオキ
シ法（Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、ら、１９７７、　Ｐｒｏｅ
、　Ｎａｔｌ、　Ａｅ、ａｄ、　Ｓｅｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ
、７４：５４３６）、または自動化ＤＮＡシークエネー
ター（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍａ
、　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　ＣＡ）が包含されるか
それに限定されるわけではない。−例として、Ｂ、サブ
チリスｒｉｂオペロンのＤＮＡ配列を第３図に示す。

ｒｉｂオペロンのヌクレオチド配列か決定されると、つ
ぎにそれらにコードされる産物の予想アミノ酸配列にし
たがって、推定読みとり枠（ＯＲＦ類）を同定すること
ができる。例えば様々なＯＲＦ類を鋳型として用いて５
−３０共役インビトロ転写／翻訳反応を行うことによっ
て、コードされた産物を実際に同定することかできる。

ＯＲＦ類の様々な突然変異誘導体も、コードされた産物
の機能を試験するために、５−３０反応産物の機能アッ
セイにおいて活性を試験することができる。

Ｂ、サブチリスｒｉｂオペロンに関する、そして以下の
実施例で詳述される本発明の詳細な実施態様に於ては、
」二足方法を用いてＢ、サブチリスリボフラビン生合成
が５個の生合成遺伝子すなわちリボフラビンシンターゼ
のβサブユニットおよび２゜３．４．及び５と称される
ＯＲＦ類（第４図参照）を含有する約４．２　ｋｈの単
一オペロンによって制御されることを確認した。次に、
ＯＲＦ類２，３．４゜および′５が、それぞれ分子量約
１５ｋｄ、　４７ｋｄ、　２６ｋｄ。

および４４ｋｄのタンパク質をコードすることが示され
た。以下に記述するように、ＯＲＦ　５は、リボフラビ
ン生合成の初期の段階で、脱アミノ化されたピリミジン
のリビチルアミノー結合への還元を触媒するものである
、推定ｒｉｂ特異的デアミナーゼをコードすることが示
された。本発明らのデータはまた、ＯＲＦ　４がリボフ
ラビンシンターゼのαタブユニットをコードし、ＯＲＦ
　３はＧＴＰシクロヒドロラーゼをコードし、一方ＯＲ
Ｆ　２はおそら（ｒｉｂ特異的レダクターゼをコードす
ることも示している。

ＯＲＦ　１およびＯＲＦ　６は、ｒｉｂオペロンの一次
転写ユニットの外側にあることが判明した。ｒｉｂオペ
ロン転写開始のための最初の部位は、おそらくオペロン
の最初の遺伝子、ＯＲＦ　５から２９０ｂｐ　ｌ流のあ
る見かけのσ６プロモーターであると判定された（第４
図、ＰＩ）。Ｂ、サブチリスｒｉｂオペロンのコード領
域、プロモーターおよび転写終止部位を下記の第■表に
示す。

本発明はｒｉｂオペロン遺伝子のヌクＩノオチドおよび
アミノ酸配列、並びに機能的に活性なペプチドをコード
するその部分配列、およびかかる配列と実質的に同じ配
列を包含する。ここで用いられる機能的に活性なペプチ
ドは、リボフラビン生合成を招来する反応を触媒する能
力を持つタンパク質またはペプチドを意味する。機能的
には活性な核酸配列はリボフラビン生合成を調節しうる
配列を意味する。別の配列と実質的に同じ配列とは、そ
の相補的な配列に対してハイブリッド形成できる配列を
意味する。さらに、天然には第２の核酸配列の発現を制
御しない核酸配列とは、第２の配列か単離された細菌に
於て第２の配列の発現を制御しない配列を意味する。

ｒｉｂオペロンの遺伝子構造が明らかになると、本発明
に於て最適に使用するためにその構造を操作することが
可能である。例えば、リボフラビン生産を最大限に高め
るためにｒｉｂオペロンを遺伝子工学的に作製すること
ができる。

用いられた宿主−ベクター系の如何に応じ、多くの適当
な転写および翻訳エレメントのうちの任意の一つを使用
することができる。組換えＤＮＡまたは合成技法によっ
て作られたプロモーターも挿入配列を転写するために使
用することかできる。

細菌内で増殖させる場合、ｒｉｂオペロンそれ自身の調
節配列を用いることができる。全ｒｉｂオペロン、また
はその１遺伝子より多い遺伝子がポリジストロニックメ
ツセージとして発現されることが所望される実施態様に
於ては、原核生物の宿主か必要とされる。真核生物宿主
を使用する実施態様に於ては、発現が所望されるそれぞ
れの遺伝子１０ＲＦの上流の組換えＤＮＡ中に適当な調
節配列（例えばプロモーター）を置く必要がある。

挿入されたタンパク質コード配列の効率的な翻訳のため
には、特定の開始シグナルも必要である。

これらのシグナルには、開始コドン（ＡＴＧ、　ＧＴＧ
。

またはＴＴＧ）およびリポソーム結合部位（ＲＢＳ）の
ような隣接配列が包含される。翻訳レベルでそのコード
配列をより効率的に発現させるには、与えられたコード
配列のＲＢＳを操作できることに注意すべきである。そ
れ自身の開始コドンおよび隣接する調節配列を含むｒｉ
ｂオペロンの全読みとり枠が適当な発現ベクターに挿入
される場合には、何らそれ以上の翻訳制御シグナルは必
要あるまい。しかしながら、コード配列の一部分のみが
挿入される場合または生来の調節シグナルが宿主細胞に
よって認識されない場合には、開始コドンを含む外因性
翻訳制御シグナルが付与されなければならない。開始コ
ドンはさらに、全挿入物の翻訳を保証するためにタンパ
ク質コード配列と読み枠が一致しなければならない。こ
れらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは天然
および合成両者の様々な起源からなっていることができ
る。

さらに、ｒｉｂオペロン遺伝子の発現を調節するかまた
は望ましい特定の方法でその遺伝子産物を修飾しプロセ
シングする宿主細胞株を選択できる。

ある種のプロモーターからの発現をある種のインデユー
ザーの存在下で増加させることができる。

従って、遺伝子工学的に作られたｒｉｂオペロンタンパ
ク質の発現を制御することができる。ある実施態様に於
ては、ｒｉｂオペロンを調節解除しそれによってリボフ
ラビン生産を増加させるために、プロモーターおよび転
写終止／抗転写終止調節配列のようなオペロンの調節領
域を操作するかまたは構成的または増殖により調節され
るプロモーターで置き換えることができる。さらに、発
現されたタンパク質の望ましい修飾およびプロセシング
を保証するために、適当な細胞系列または宿主系を選択
することができる。多くの操作が可能であり、本発明の
範囲内にある。

発明のある詳細な実施態様に於ては、Ｂ、サブチリスｒ
ｉｈオペロンの　調節配列を除去していくつかのＢ、サ
ブチリスプロモーターの１またはそれ以上と置き換える
ことができる。かかる構築によりｒｉｂ生合成遺伝子が
高レベルに発現されよう。この手段は転写ターミネータ
−の末端とオペロン内の最初の遺伝子ＯＲＦ　５のＲＢ
Ｓ配列との間の２Ｏ−３０ｂｐ領域への新たな制限部位
の導入を包含しよう。かかる制限部位は特定部位の突然
変異誘発によるが、またはＯＲＦ　５の最初の３０ｂｐ
内にあるもっとも右側のＢｇｌ　ＩＩ　（Ｂｇｌ　ＩＩ
−）部位から上流のすべての調節配列を欠失させ（第３
図および第４図参照）、合成オリゴヌクレオチドをこの
部位に挿入することによって導入することができる。こ
の合成ヌクレオチドは（リポソーム結合部位を含む）　
　０ＲＦ５の末端を完了させ、新たな上流の制限部位を
含有するものである。−旦これらの構築かなされると、
新たな制限部位と適合する末端を優するプロモーター含
有制限フラグメントを導入することができ、それにより
新たなプロモーターの制御下でｒｉｂ遺伝子を発現させ
ることができる。構成的で、かつ増殖により調節される
Ｂ。サブチリスプロモーターを用いることができ、それ
らには溶菌バクテリオファージ５ＰＯＩ遺伝子からの強
力なプロモーターｖｅｇＳａｒｎｙ（アミラーゼ）、お
よびａｐｒ（ズブチリシン）が包含されるがそれらに限
定されるわけではない。

本発明の別の観点に於ては、非相同遺伝子産物の発現を
調節するために、転写調節活性（例えばプロモーター）
を有するｒｉｂオペロンＤＮＡフラグメントを用いるこ
とができる。

本発明によれば、発現が行われる場所であり、かつ例え
ばバチルスおよびＥ、コリを含む細菌中にｒｉｂオペロ
ンを導入することができる。好ましい実施態様に於ては
、細菌宿主は上記の突然変異宿主の一つである。詳細な
実施態様に於ては、クローン化されたｒｉｂオペロンを
宿主染色体ＤＮＡ中に組み込み、そこで宿主ゲノムＤＮ
Ａとともに複製し発現させる。最も好ましい実施態様に
於ては、多コピーのｒｉｂオペロンを宿主染色体ＤＮＡ
中に組み込み、それによって調節解除された宿主内での
ｒｉｂオペロン発現を増幅させる。これを実行する一つ
の方法は、下記の実施例の項で詳述するように、ｅａｔ
含有ｒｉｂオペロンの染色体挿入に続くそのオペロンの
クロラムフェニコール増幅である。

同じ技法を用いてｔｅｔ’遺伝子、またはバチルス内で
発現されるある種の他の薬剤耐性遺伝子を使用すること
もできる。

詳細な実施態様に於ては、宿主染色体内でベクターのも
っと大きな増幅を得る試みとして、できる限り小さなり
ＮＡフラグメント」二にｒｉｂオペロンを含むように、
ｒｉｂオペロンフラグメントを含有する組み込みベクタ
ーを遺伝子工学的に作製することができる。例えば、ベ
クターＤＮＡ配列を欠失させ、および／またはｒｉｂオ
ペロンの側面にある非必須ＤＮＡを欠失させることがで
きる。

−数的に、リボフラビン原栄養性細菌は最小培地上でリ
ボフラビン無して増殖できる。リボフラビン生産を様々
な方法によって検出および定量できる。好ましい実施態
様に於ては、リボフラビン過剰生産性菌を下記のように
３６６ｎｍのＵＶ光に曝すと、観察可能な黄色の蛍光を
発し、リボフラビン過剰生産が容易に観察される。例え
ば、本発明の遺伝子工学的に作製されたプラスミドの多
くはＥ、コリ内で作られる。これらのプラスミドの一部
について、リボフラビンの過剰生産がこの方法により確
認されている。例えば、生産されたりボフラビン量は逆
相高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて
定量できる。細菌の無細胞」−清をＨＰＬＣカラムで後
記のように分画し、２５４ｎｍでリボフラビンを監視す
ることかできる。標準曲線からの外挿により、リボフラ
ビン濃度をクロマトグラフィーのピーク面積によって測
定できる。

蛍光光度法によってリボフラビンを定量することもでき
る。例えば、発光波長５２５ｎｍおよび励起波長４５０
ｎｍにセットした蛍光光度計で、リボフラビンを含有す
る試料の測定値を読むことができる。

さらに、当業上知られた他の方法を、その物理的および
生物学的性質に基づくりボフラビンの検出及び定量に利
用できる。

リボフラビン過剰生産性細胞は振盪フラスコから大規模
な「バッチ」発酵器に至るまでの容器内で、当業上知ら
れた方法により（下記参照）増殖させることかできる。

望ましい実施態様に於ては、培地中の栄養素を変化させ
ることによって最小のコストでリボフラビン生産を最大
にするように栄養供給物を操作することができる。

詳細な実施態様に於ては、増幅されｌ、ゴｉｂ−含有遺
伝子は接種用種菌株に約６０μｇ／ｍｌのクロラムフェ
ニコールを包含させることによって（発酵器内では必ず
しもそうではない）細菌染色体内で高コピー数に維持す
ることかできる。シェマップ（Ｃｈｅｍａｐ）　１４ｆ
ｆ発酵器を１０００ｒｐｎ＋でヘッド圧０．６気圧で用
いることができる。高い細胞濃度を得るためには、例え
ばグルコース、スクロース、クエン酸回路の酸、マルト
ースまたは澱粉のような様々な炭素源、および酵母エキ
ス、コーンステイブリカー、アンモニア、および／また
はタンパク質加水分解物のような様々な窒素源を用いる
ことかできる。しかしながら、リボフラビン生産に好ま
しくない限定（例えば、高すぎる炭素源濃度か原因で起
こる酸素涸渇）を避けるような方法でこれらの培地成分
の部分を添加することか重要である。

使用に適した発酵培地および条件を以下に詳述する。

実施例 実施例１ リボフラビン−過剰生産性Ｂ、サブチリス変異体本発明
者はここでリボフラビンを過剰生産するＢ、サブチリス
株の生成について記載する。これを行うために古典的な
遺伝学、遺伝子工学及び発酵を用いた。プリン及びリボ
フラビン類似体を使用する選択による古典的遺伝学を用
いてプリン（リボフラビン前駆体）及びリボフラビン生
合成経路を調節解除した。リボフラビン生合成経路の遺
伝ｆ　（ｒｉｂオペロン）をクローン化および遺伝子操
作により作製することによりリボフラビン生産かさらに
高まり、律速性生合成酵素の本質的な高レベルの生産か
できるようになった。

Ｂ、サブチリスにおけるリボフラビン生合成はＧＴＰで
始まる（第１図）。リボフラビンを過剰生産する宿主を
得るために我々は古典的な遺伝学を使用して、細胞か生
産するＧＴＰ　ｉを増大させかつリボフラビン経路を調
節解除した。Ｂ、サブチリスにおけるプリン過剰生産は
アザグアニンやデコイニンのようなプリン類似体及びメ
チオニンスルホキシドのような他の拮抗体に耐性を有す
る突然変異体を得ることにより達成できる（例えば、ｌ
５ｈｉ　ｉ及び５ｈｉｉｏ、　Ａｇｒｉｅ、Ｂｉｏｌ、
Ｃｈｅｍ。３６（９）　：１５１１−１５２２゜１９７
２　ＨＭａｔｓｕｉら、Ａｇｒｉｅ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃ
ｈｅｍ。４３（８）　：１７３９１７４４、１９７９）
。リボフラビン経路はりボフラビン類似体ロゼオフラビ
ンに耐性である突然変異体を得ることにより調節解除で
きる（Ｍａｔｓｕｉら、Ａｇｒｉｅ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ。４６（８）：２００３−２００
８．１９８２）　、ロゼオフラビン耐性株は予め突然変
異誘発させそして幾つかのプリン類似体に耐性である株
から選択された。

以下に、リボフラビンを過剰生産する株（ＲＢ５０）の
生成に使用される方法が記載される。

８−アザグアニン耐性突然変異体 Ｂ、サブチリスはプリン類似体８−アザグアニン（Ｓｉ
ｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、Ｓｔ、　Ｌｏｕｉ
ｓ　ＭＯ）により５００μｇ／ｙｎｌの濃度で効果的に
殺され、そして、耐性を有する突然変異体は自然発生的
に１０６分の１以下の頻度で現われる。３０ｕｇ／ｍｌ
のエチルメチルスルポネ−１−（ＥＭＳ　：　Ｓｉｇｍ
ａ）がアザグアニン耐性（Ａｇ’）突然変異の頻度を増
大させるための変異原物質として使用された。突然変異
誘発は標準操作（Ｊｌｉｌｌｅｒ。

１９７２、　　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　　ｉｎ　　Ｍ
ｏ１ｅｃｕｌａｒ　　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ。

Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　ｔ（ａｒｂｏｒ　　Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ、　　Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇｌｌ
ａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）によりＢ、サブチリ
ス株１６８からの細胞に対して実施した。５００１１ｇ
／ｍｌのアザグアニンを含有する最小培地（Ｓｌｏｍａ
、　Ｊ、Ｂａｃｔ、１７０：５５５７、１９８８）に４
Ｘ１０＠個の突然変異誘発された細胞を塗布し、単一の
コロニーを再画線すると、３５個のＡｇ′コロニーか生
成した。１つの突然変異体ＲＢ１１（１〜ｇ”−１１）
をＲＢ５０の作製に用いた。

デコイニン耐性突然変異体 デコイニン耐性は（Ｄｅ　゛）突然変異は１０’分の１
の頻度で自然発生的に、又は１０５分の１の頻度でＥＭ
Ｓ突然変異誘発の後１００μｇ／ｍｌのデコイニン（Ｌ
ｌｉ）ｊｏｈｎ　Ｃｏ。、Ｋａｌａｍａｚｏｏ、　ＭＩ
）を含有する最小培地に細胞を塗布することにより得ら
れた。ＲＢＩＩのＤｅ’突然変異体は上述のようにして
ＥＭＳによる突然変異誘発により得られた。、１つのＤ
ｃ’コロニであるＲＢ１５　（Ａｇ’−１１，Ｄｃ’−
１５）を用いてＲＢ５０を作製した。

Ａｇ及びＤｅ突然変異の転移 これらのプリン類似体耐性突然変異は、欲せざるＥＭＳ
−誘発突然変異からこれを分離するためにそして、Ａｇ
′及びＤｅ’突然変異が単一の座によるものであること
を証明するために、異なった株のバックグランドに転移
させた。リボフラビン前駆体イノシン−燐酸（ＩＭＦ）
からの“炭素流れ（ｃａｒｂｏｎｆｌｏｗ）“の一部は
又アデニンヌクレオチド生合成に使用されるので、突然
変異ｐｕｒ−６０を介してアデノシン−燐酸（ＡＭＰ）
経路が遮断され、より多くの炭素物質をＩＭＦからリボ
フラビンのグアニンヌクし７オチド前駆体に流れるよう
にさせる宿主株か選択された（第２図’）　、　Ｂ、サ
ブチリス株ｌＡ３８２（ｈｉｓ　Ｈ２゜ｔｒｐ　Ｃ２，
ｐｕｒ−６０）がコンピテントにされ（Ｓｌｏｍａら、
Ｊ、Ｂａｃｔ、　　１７０：５５５７　（１９８８））
そして、Ａｇ゛／Ｄｅ’突然変異体Ｒ突然変異体調Ｂ１
５全ＤＮＡを用いて形質転換された（Ｇｒｙｅｚａｎら
、Ｊ、Ｂａｅｔ、　１３４：３１８（１９７８）の方法
による）。Ｔｒｐ”（ｈリブトファン）復帰細胞コロニ
ーを選択し、それらの３．３　％　（１０／３００）は
Ｄｃ「であり、２．３　％　（７／３００）がＡｇ’で
あった。この結果は予期しないものではなかった。なぜ
なら、“会合（ｃｏｒｇｒｅｓｓ　１ｏｎ）”　（第２
の連結されてないマーカーの形質転換）ゆえに多数のＴ
ｒｐ“コロニーはまたデコイニン又はアザグアニンに耐
性でもあるはずだからである。

１つのＤｅ’コロニーＲＢ３６　（ｈｉｓ　Ｈ２，ｐｕ
ｔ−６０，Ｄｃ゛１５）、１つのＡｇ’コロニーＲＢ４
０　（ｈｉｓ　ｔ（２，ｐｕｒ−６０゜Ｄｃ゛−１１）
、及び１つのＤｃ’／Ａｇ’コロニー（これは旧Ｓ＋で
もあることが判明した）　、ＲＢ３９　（［）ｕｒ−６
０゜Ａｇ’−１１，Ｄｅ’−１５）をすべて選択してさ
らに研究した。

メヂオニンスルホキシド耐性突然変異体高レベルのメチ
オニンスルホキシド（ＭＳ　二Ｉｆ）ｕ＋ｇ／ｍ（！、
　Ｓｉｇｍａ）を使用する選択により、ＥＭＳでの突然
変異誘発が必要でない程十分に高頻度で現われる自然発
生的な突然変異体が生じた。Ａｇ’／Ｄｃ’変異体ＲＢ
３９をＭＳ　１０μｇ／ｍｌを含有する最小培地上に画
線した。耐性コロニーが得られ、単一の耐性コロニーを
得るために再び画線した。１つの株ＲＢ４６（ｐｕｔ−
６０，Ａｇ′−１１，Ｄｃ’−１５，ＭＳ゛−４６）を
選択してさらに研究した。

ロゼオフラビン耐性突然変異体 Ａｇ’、　Ｄｅ’及びＭＳ’の突然変異体の多くがＧＴ
濾過剰生産であるように思われるが、それらのいずれも
平板培地上で検出可能なレベルのリボフラビンを生産し
なかった。リボフラビン生合成経路を調節解除するため
には、リボフラビン類似体はロゼオフラビン（Ｔｏｒｏ
ｎｔｏ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ）に対す
る耐性に関して選択する条件が決定された。最大の殺細
胞は最小培地又は完全培地において１００１１ｇ／ｍｌ
のロゼオフラビンで生じた。濃度を増大しても付加的な
殺細胞は起こらなかった。ロゼオフラビン耐性への突然
変異（ＲｏＦ’）はＥＭＳ又は他の化学薬品による突然
変異誘発が必要でない程十分に高い率（約５　Ｘ　１０
−’）で自然発生的に生じた。

上述の株ｌＡ３８２．　ＲＢ３６．　ＲＢ３９．　ＲＢ
４０及びＲＢ４６の各々から約１０００個のＲｏＦ’コ
ロニーが得られた。これらの株すべてからのＲｏＦ’突
然変異体は長波長の紫外線（３６６ｎｍ）に曝露させた
場合最小培地のプレート上で低Ｉノベルの蛍光を示し、
このことはいくらかのリボフラビンの生成を示している
。ＲＢ４６゜ＲＢ４６Ｙ　（ｐｕｒ−６０，Ａｇ’−１
１，Ｄｅ’−１５，ＭＳ’−４６，ＲｏＦ’−４６）か
ら得られたＲｏｂ’コロニーの１つは最小培地上で増殖
させると、１（ＰＬＣで測定して（既述）　１４■／ｐ
のリボフラビンを生成した。

すべての処理された株の中で、わずかにＲＢ３９とＲＢ
４６のみがＲｏＦ・コロニーが選択された場合に有意に
異なった表現型を生成した。ＲＢ３９又はＲＢ４６のい
ずれかのＲｏＦ’コロニーの約０．５％〜１．０９６が
強い蛍光の黄色いコロニーを生成した。これらのコロニ
ーについて、ＲＢ３９から生じたＲＢＳＩ（ｐｕｒ−６
０，Ａｇ゛１１、　Ｄｅ’−１５，ＲｏＦ’−５１）、
及びＲＢ４６から生じたＲＢ５０（ｐｕｒ−６０，Ａｇ
’−１１，Ｄｃ’−１５，ＭＳ’−４６，ＲｏＦ’−５
０）がＨＰＬＣにより測定して比較的高レベルのリボフ
ラビン生産に関連する安定な蛍光−黄色の表現型を生成
した。最小培地で増殖させるどＲＢ５０とＲＢＳＩの双
方とも他のＲｏＦ’株よりも高レベルのリボフラビン、
すなわちそれぞれ、約４０ｍｇ／ｉ？及び３０■／ｌを
上清中に生成した。ＲＢ５０の系統を第５図に示す。

強い蛍光（従ってリボフラビン過剰生産性）を発するコ
ロニーはＲＢＳＩのような非−ＭＳ’株で得ることがで
きるので、一般にこの突然変異はより高い生産をする表
現型には存意には寄与しないかもしれないと思われる。

強い蛍光性Ｒｏｂ’コロニーはＡｇ’−１１（ＲＢ４０
からの）又はＤｅ’−１５（ＲＢ３６からの）突然変異
のみを含有する株には見出せなかったので、他の突然変
異であるＡｇｒ及びＤｅ’（ＲＢ３９中のＡｇ’−１１
及びＤｅ’−１５）の両方が高レベルのリボフラビン生
産に必要であると思われる。

ｇｕａＣ突然変異 ＧＴＰの過剰生産、ひいてはリボフラビンの過剰生産を
達成するためのもう一つの恐らくは重要な突然変異はｇ
ｕａＣ３であり、これはＧＭＰはＩＭＦに戻る変換を阻
止する（第２図を参照）。リボフラビンを過剰生産する
ｇｕａＣ３を含有する株を作製するためには、コンピテ
ントなり、サブチリス株６２１２１細胞（ｇｕａＣ３，
ｔｒｐｃ２．　ｍｅｔｃ７）（Ｅｎｄｏら、Ｊ、　Ｂａ
Ｃｔ。

１５：１６９．１９８３）をＲＢ５０　ＤＮＡで形質転
換しそしてデコイニン１００μｇ／ｌｎｌを含有するブ
１ノートにでＤｅ’を選択した。数予測のＤｅ’コロニ
ーが生成した。

Ｄｃ゛プレートに貼付された２００個のコロニーのうち
、リボフラビン過剰生産表現型（ＵＶ蛍光に基づく）を
示すもの１個が見出され、これはＲｏＦ’であった。

このコロニーをＲＢ５２　（ｇｕａＣ３，ｔｒｐＣ２，
ｍｅｔＣ７゜Ｄｃ’〜１５．　ＲｏＪ”−５０）と称し
、以後の研究のために保存した。

他の類似体耐性突然変異体 最後に、いくつかの付加的なプリン類似体に耐性を有す
る突然変異体もまたプリン代謝で変えられることが報告
されているので、リボフラビン過剰生産株に及ぼすその
作用を調べるためにかかる突然変異体をアッセイした。

８−アザキザンチン５００ｇ／ｍｌ、６−チオグアニン
１■／−１又はスルファグアニジン２　ｍｇ／ｍｌ（Ｓ
ｉｇｍａ）は、野生型Ｂ、ザブチリスを効果的に殺すこ
とか判定された。アザグアニン耐性リボフラビン過剰生
産株ＲＢ５０　：　：　［ｐＲＦ８１、。及びＲＢ５３
：：［［）ＲＦ８　Ｌ。（下記参照）はすてにアザギザ
ンチン耐性であることが判明している。

異なった特性をもつ別個のアザグアニン及びアザキザン
チンー耐性突然変異は前に記載されているが、この場合
Ａｇ’−１１及びＡｇ　’−５３突然変異はアザギサン
チン耐性をも伝達すると思われる。

Ｂ、サブチリスの粗製上清中のりボフラビンのＨＰｌ、
Ｃ分析 Ｂ、サブチリス培養物中にお１ノるリボフラビンの蓄積
を逆相ＨＰＬＣにより定量した。リボフラビン標準物（
Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　ＳＴ　Ｌｏ
ｕｉｓ、　ＭＯ）又は被験株の細胞不含上清を、１％酢
酸アンモニウム（１）８６．０）で平衡化した４、　６
　ｍｍ　Ｘ　２５０ｍｍ　Ｖｙｄａｅ　Ｃ＋　ａカラム
上で分別した。注入すると、カラムはメタノールの直線
グラジェントで展開し、２５４ｎｍてリボフラビンに関
して監視した。真正のりボフラビン（即ちリボフラビン
“標準物“）は、グラジェントの中央点で溶出する。

実施例２ Ｂ、サブチリスｒｉｂオペロンのクローニングｒｉｂオ
ペロンを含有する制限フラグメントを単離するための一
般的な方法は、リボフラビンシンターゼのβザブユニッ
トに関する公開されているアミノ酸配列から部分的に誘
導されたＤＮＡ配列（１，ｕｄｗｉｇら１．１Ｂｉｏ１
．　　Ｃｈｅｍ、　　２６２：１０１６．　１９８７）
である合成オリゴヌク１ノオチドプローブとのノ１イブ
リッド形成により、Ｂ、サブチリスＤＮＡのパミニＥ、
コリプラスミドライブラリーを選別することであった。

このプロトコールの要約を第６図に示す。

合成による、５４塩基“量体推定用（ｇｕｅｓｓ−ａ−
ｍｅｒ）”オリゴヌクレオチドプローブが、Ｌｕｄｗｉ
ｇら（Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　２６２：１０１６−１０２１．１９８７）
により配列決定された２４０個アミノ酸リボフラビンシ
ンターゼタンパク質のアミノ酸８４−１０２に基づいて
このスクリーニングに使用された。プローブ中の各コド
ンの第３番目のヌクレオチドは、例えばシーンバンク（
ＧｅｎＢａｎｋ＠）（１，ｏｓ　Ａｌａｍｏｓ　Ｎａｔ
、　ｌ、ａｂ、　Ｉ、ｏｓ　Ａｌａｍｏｓ、　ＮＭ）か
ら入手しうる幾つかの配列に基づき、最も高頻度に使用
されるＢ、サブチリスコドンについてなされた判断にし
たかって選択された。このプローブは次の配列から成っ
ていた： ５’　−ＧＧＡＧＣＴＡＣＡＡＣＡＣＡＴＴＡＴＧＡＴ
ＴＡＴＧＴＴＴＧＣＡＡＴＧＡＡＧＣＴＧＣＴＡＡＡＧ
ＧＡＡＴＴＧＣＴ−３ このプローブの特異性を試験するために、３２Ｐ標識５
４ｍ゛体ＤＮＡを野生型及び突然変異体Ｂ、ザブチリス
株から単離されたＥｃｏＲＩ消化染色体ＤＮＡ（Ｓｏｕ
ｔｈｅｒｎ、　Ｊ、　Ｍｏ１．　ＢｉｏＬ、　９８：５
０３．１９７５）を含有するナイロンフィルターにハイ
ブリダイズさせた。このプローブはＥｅｏＲＩ消化Ｂ。

サブチリス（ｒｉｂ”ｍｅｔ−）　ＤＮＡの単一の９−
１０ｋｂフラグメントに強力にハイブリダイズし、この
ことはｒｉｂ含有フラグメントの予測された寸法と良好
に一致する（Ｏｓｉｎａら、ＦＥＢＳ、　　Ｌｅｔｔ。

１９６：７５．　１９８６）　。同一の寸法の標識され
たフラグメントはプローブを２個の突然変異株、ＲＢ４
６（ｐｕｒ−６０，Ａｇ’−１１，Ｄｅ’−１５゜ＭＳ
’−４６）及びＲＢ５０（ｐｕｔ−６０，Ａｇ’−１１
，Ｄｅ゛−１５，ＭＳ’４６、　ＲｏＦ’−５０）、こ
のうち後者はリボフラビン過剰生産体である、にハイブ
リッド形成させた場合に検出された。これらのハイブリ
ッド形成実験をＨｉｎｄＩＩＩ切断染色体ＤＮＡを用い
て反復すると、プローブが約１．８ｋｂのより小さな単
一のフラグメントを同定した。この後者の結果はクロー
ン化されたＤＮＡ内におけるｒｉｂ生合成オペロンの一
般的位置を決定するのに有用であった。

Ｂ、サブチリス株１６８　（ｒｉｂ”　）　ＤＮＡから
の９１１ｋｂ　ＥｃｏＲＩフラグメントの”ミニ“遺伝
子ライブラリーを、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ）　１ノブリコンＲＫ２に由来する低コピーベク
ターであるｐＲＫ２９０を使用して調製した（Ｄｉｔｔ
ａら、Ｐｌａｓｍｉｄ　１３：１４９、１９８５）。Ｂ
、サブチリス（ｒｉｂ”　ｍｅｔ−）ＤＮＡのＥｃｏＲ
Ｉフラグメンｌ−（９−１１ｋｂ）をスクロース（１０
〜４０？６）レートゾーン遠心法により単離した。

４倍過剰のこれらフラグメント（０，２２μｇ）をウシ
腸アルカリポスフ了ターゼ（ＣＩＡＰ）で脱燐酸化した
ＩＥｅｏＲＩ＝切断１１１ＲＫ２９０　（０，２６μｇ
）にＬＯμｇ／ｍｌの全ＤＮＡ濃度において結合させた
。約１０ｎｇの連結されたＤＮＡをＥ、コリＤＨ５（Ｆ
−、ｅｎｄＡｌ、　ｈｓｄＲｌｌ［ｒｉ＝−。

ｍｋ”　］、５ＵｐＥ４４．　ｔｌｌｌ−１，λ−，ｒ
ｅｅＡｌ、　　ｇｙｒＡ９６゜ｒｅｌＡｌ）に形質転換
して、ＤＮＡの１８ｇ当り７．７×１０４の頻度でテト
ラサイクリン耐性（Ｔｅ’）コロニーを生じた。９−１
１ｋｂ挿入ＤＮＡを含有する形質転換体のフラクション
を決定するために、幾つかのＴｅ’形質転換体からプラ
スミドミニ溶解物を調製し、そしてそれらのＤＮＡを制
限酵素消化により分析した。約４０％のＴｅ’形質転換
体が、ＥｅｏＲＩにより生成された９　−１１ｋｂの挿
入物１個を含有することが見出された。

約１１４０個のＴｃ′コロニーをリボフラビンシンター
ゼ遺伝子に特異的な２２ｐ標識５４量体プローブを用い
て選別した。１個のコロニーが陽性のシグナルを生じた
。ｐＲＦ　１と命名されたプラスミドＤＮＡをこのクロ
ーンから単離し、そしてリボフラビン欠乏突然変異ｒｉ
ｂ−２を含有するＢ、サブチリス１Ａ２１０中に形質転
換してＲｉｂ’原栄養性コロニーを選択することにより
、Ｒｉｂ”−マーカーレスキュー奪還活性について検査
した。ｐＲＦ　１はｌＡ２１０を高頻度てＲｉｂ＋原栄
養性に形質転換した。無作為に選ばれたＴｃ’形質転換
体からのプラスミドＤＮＡはこのマーカーを奪還できな
かった。

制限酵素分析によればｐＲＦ　１が実際に１０ｋｂと１
１ｋｂの２個のＨｃｏＲＩフラグメント挿入物を含有す
ることが明らかになった。いずれのフラグメントかｒｉ
ｂオペロンを含有するかを判定するために、ＥｃｏＲＩ
消化ｐＲＦ　１を３２Ｐ標識５４量体リボフラビンシン
ターゼプローブを用いて調べた。その結果は１０ｋｂの
小さい方のフラグメントのみがこのプローブと交差反応
することが示された。さらに、１０ｋｂＥｃｏＲＩフラ
グメントをｐＢＲ３２２のＥｅｏＲＩ部位へ再クローン
化すると、組み換えプラスミドｐＲＦ　２及び［］ＲＦ
３が生成し、２つのありうる挿入方向を示した。

両方のプラスミドは高頻度でＢ。サブチリスｌＡ２１０
のｒｉｂ−２突然変異を原栄養株に戻すことが判明した
。

ＲＢ５０は上述のようにして生成された、リボフラビン
生合成が調節解除されているＢ、サブチリスＲｏＦ’突
然変異体の１つである。約８０％のＲｏＦ’突然変異が
ｒｉｂｏ座においてｒｉｂオペロン内に存することが報
告されている（Ｓｔｅｐａｎｏｖら、Ｇｅｎｅｔ　１ｋ
ａ（ＵＳＳＲ）１３：４９０．１９７７）　、野生型の
ｒｉｂオペロンと同様に、ＲＢ５０中のｒｉｂ遺伝子も
９−１０ｋｂ　ＥｅｏＲＩフラグメント上に含まれてい
た。従ってこのフラグメントはクローニングベクターと
してｐＢＲ３２２を用い、第６図に概要か示されるプロ
トコールを使用してクローンした。ＲＢ５０からのサイ
ズ選択された９　−１ｉｋｂＥｅｏＲＩフラグメント（
０，１μｇ）は前記のようにして調製し、２２μｇ／ｍ
ｌの全ＤＮＡ濃度でＢｅｏＲＩ切断、脱燐酸化ｐＢＲ３
２２Ｄ　Ｎ　Ａ　（０，３４μｇ）の末端の２倍過剰に
連結した。約９ｎｇの連結ＤＮＡをＥ、コリＤｔ（５に
形質転換すると、３．５Ｘ　１０’／μｇ　ＤＮＡの頻
度でアンピシリン耐性（Ａｐ’）コロニーを生じた。

１２個のＡｐ゛コロニーの試料採取から単離されたプラ
スミドＤＮＡを制限酵素分析すると、５ｏ９６が９−１
１ｋｂ　ＥｅｏＲ１挿入物を有するプラスミドを含有す
ることか判った。約１１４０個のＡｐ゛　コロニーをコ
ロニーハイブリッド形成によりリボフラビンシンターゼ
遺伝子に特異的なｌｌｐ標識５４量体プローブを用いて
選別した。６個のコロニーが陽性のシグナルを生じた。

これらの６個のコロニーの２個がら単離されたプラスミ
ドｐＲＦ　６とｐＲＦ　７が制限酵素分析によりそれぞ
れｐＲＦ　２及びｐＲＦ　３と同じ方向の挿入物を含有
することが確認された。加えて、両方のプラスミド共高
頻度でｒｉｂ−２突然変異をマーカーレスキューするこ
とができた。

実施例３ ｒｉｂ”　ＤＮＡのＢ、サブチリス中への導入−上述の
ようにして、Ｂ、サブチリスの野生型の株及びＲｏＦ’
突然変異体の両方のｒｉｂオペロンを同一の１０ｋｂ　
ＥｅｏＲＩフラグメントとして、Ｅ、コリのレプリコン
ｐＢＲ３２２のＥｅｏＲＩ部位にクローン化した。これ
ら組み換えプラスミドの誘導体形成の概要を第６図に示
す。ｒｉｂオペロンを含有する１０ｋｂ　ＥｅｏＲ［フ
ラグメントを多コピーでＢ、サブチリスに導入しそして
、リボフラビン生産を一層増大させるために、Ｂ、サブ
チリス染色体に組み込み可能なプラスミドベクターを作
製した。組み込まれたＤＮＡはクロラムフェニコールの
高濃度で増殖するコロニーを選択することにより増幅さ
せた。

びそれを用いる形質転換 組み込みベクターを作製するために、Ｂ、サブチリス中
で選択可能な薬剤を耐性遺伝子クロラムフェニコールア
セチルトランスフェラーゼを、それぞれ野生型またはＲ
ｏＦ’Ｂ、サブチリス株からの１ｏｋｂフラグメントを
有するｐＢＲ３２２ベクターであるｐＲＦ２及びｐＲＦ
　６に導入した。プラスミドｐＲＦ　２とｐＲＦ　６を
ｐＢＲ３２２配列内で特異的にプラスミドを切断するＢ
ａｍＨＩで消化し、そしてＣＩＡＰで脱燐酸した。切断
されたＤＮＡをｅａｔ遺伝子を含有する１、３ｋｂ　Ｂ
ａｍＨＩフラグメントに連結しくＹｏｕｎｇｍａｎら、
Ｐｌａｓｍｉｄ　１２：１−９．１９８４）、連結され
たＤＮＡを次にＥ、コリＤＨ５細胞に形質転換した（Ｉ
Ｉａｎａｈａｎｄ、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ。

１６６・５５７．１９８３）。約８０〜９０９イのＡｐ
’形質転換体かクロラムフェニコール耐性（Ｃｍ’　）
であった。単離されたプラスミドを制限分析すると（Ｍ
ａｎｉａｔｉｓら）、Ｃｍ’コロニーからのプラスミド
ＤＮＡは１．３ｋｂフラグメントを含有することか確認
された。野生型リボフラビンフラグメントにおよびｅａ
ｔ遺伝子を含有するプラスミドをｐＲＦ　４と称した。

ＲｏＦ’株からのクローン化リボフラビンフラグメント
を含有するプラスミドはｐＲＦ　８と呼ばれた（ＲｏＦ
’変異はのちにｒｉｂオペロンの外にあることが示され
たので、これらのプラスミドは恐らく同一である。）プ
ラスミドｐＲＦ　４とｐＲＦ　８を４つの異なったＢ、
サブチリス株に形質転換した。リボフラビン過剰生産体
ＲＢ５０　（Ａｇ’−１１，Ｄｅ’−１５，ＭＳ’−４
６，ＲｏＦ’−５０）。

ＲＢ５０親ＲＢ４６　（Ａｇ’−１１，Ｄｃ’−１５，
ＭＳ’−４６，）、　ＲＢ５０親ｌＡ３８２．及びｌ５
７５は共通の実験室株である。

コンピテントなｌ５７５とｌＡ３８２細胞をｐＲＦ　４
又はｐＲＦ８で形質転換した。これらの同一のプラスミ
ドをプロトプラストの形質転換によりＲＢ４６及びＲＢ
５０に導入した（Ｃｈａｎｇ及びＣｏｈｅｎ、　Ｍｏ１
．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ１６８：１１１−１１５．１
９７９）。これらの４種の株のそれぞれに組み込まれた
ｐＲＦ　４又はｐＲＦ８ＤＮＡは比較的に高いクロラム
フェニコール濃度で増殖するコロニーを選択することに
よって増幅された。６株において、６Ｏａｇ／ｒｎｌま
でのクロラムフェニコール中で増殖するコロニーを得る
ことかできた。

加えて、ｇｕａＣ３Ｂ、サブチリス株６２１２１をＲＢ
５０からのＤＮＡで形質転換することにより生成させた
ＲＢ５２　（ｇｕａＣ３，ｔｒｐＣ２，ｍｅｔＣ７，Ｄ
ｅ’−１５、ＲｏＦ’５０）をコンピテントとなし、ｐ
ＲＦ　８で形質転換した。生じた多くのＣｍ’コロニー
の１つにおいて組み込まれたプラスミドを９０１Ｊｇ／
ｍｊ’のクロラムフェニコールを使用して増幅した。生
成した細胞ＲＢ５２：：［ｐＲＦ８］ｓ。を対数増殖期
中期まで増殖させ、５００μｇｅｍ（！のアザグアニン
を含有する最小培地上に塗布した。約２０個のＡｇ゛　
コロニーが生成した。かかるコロニーの一つかより強い
蛍光を生じるように見えた。この株、ＲＢ５２　：二［
＋）ＲＦ８］９゜の系統を第７図に示す。

実施例４ ｐＲＦ　４又はｐＲＦ　８を含有する菌株によるリボフ
ラビン過剰生産 ｐＲＦ　４またはｐＲＦ　８を含有するＲＢ５０はリボ
フラビン過剰生産表現型（黄色かつ１．１Ｖ−蛍光性コ
ロニー）を示した。ＲＢ５０の野生型株又は親株中のｒ
ｉｂ″′ＤＮＡの増幅では黄色またはＵ■−蛍光性コロ
ニを生じなかったが、このことはりボフラビンの過剰生
産を起こすにはＲｏＦ’突然変異（リボフラビンの生合
成を調節解除するもの）が野生型ＤＮＡの染色体増幅に
とって必要であることを示している。

一連の振盪フラスコ発酵を３０（７のバッフルフラスコ
（Ｂａｌｌｃｏ）中の２５ｍ１のりボフラビン最小培地
（Ｒ４４Ｍ、第１表）中で実施して組み込まれ増幅され
たｒｉｂオペロンを含有するＲＢ５０からのリボフラビ
ンの生産を測定した。

第　　工　　表 グルタミン酸すｌ・リウム カザミノ酸（Ｄｉｒｃｏ） 酵母エキス（Ｄｉｒｃｏ） ＫＨ，ＰＯ。

Ｋ２ＨＰＯ。

（ＮＨ，）、ＳＯ４ クエン酸ナトリウム Ｍｇ５Ｏａ　　・７Ｈ２０ アデノシン （ｐＨ７，ｏに調節しオー ２．０ ０．２ ０．２ ６．０ １４．０ ２．０ １．０ ０．２ ０．０５ トクレープ処理） マルトース　　　　　　　　　　１５゜０（オートクレ
ーブ処理後、滅菌２０％溶液として添加）発酵は菌株Ｒ
Ｂ４６．　ＲＢ５０および３Ｏａｇ／７のクロラムフェ
ニコール（ＲＢ５０　：　：　［ｐＲＦ　４　］　ｓ。

）と９Ｏａｇ／７７Ｉｌのクロラムフェニコール（ＲＢ
５０：：［ｐＲＦ４　］＋ｉｏ）に対する耐性を選択す
ることにより増幅されたｐＲＦ　４を含有するＲＢ５０
を用いて行った。２４及び４８時間で上清試料を取り出
して逆相ＨＰＬＣによりリボフラビン含量を測定した。

第■表に示されるように、ＲＢ５０　：　：　［ｐＲＦ
　４　］　ａ。は０、３ｇ／　ｌのリボフラビンを、そ
してＲＢ５０　：　：　［ｐＲＦ　４　］　＊。

は０．７ｇ／１７のりポフラビンを４８時間で生産し、
これはＲＢ４６およびＲＢ５０のようなｒｉｂ増幅がな
い株により生産された量より有意に多かった。

（本頁以下余白） 第■表 Ｂ、サブチリスからのりボフラビン ＲＢ４６　　　　　　　　２４　　　　　　　０．０９
ＲＢ５０　　　　　　　　２４　　　　　　　０．０２
ＲＢ５０：：［ｐＲＦ４　ｌｓｏ　　　２４　　　　　
　　０．　ＩＲＢ５０　：　：　［ｐＲＦ　４　］　ｓ
。　　２４　　　　　　　０．４ＲＢ・１６　　　　　
　　　４８　　　　　　　０．０７ＲＢ５０　　　　　
　　　４８　　　　　　　０．０５ＲＢ５０　：　：　
［ｐＲＦ　４　］　３゜　　４８０．３ＲＢ５０　：　
：　［ｐＲＦ　４　］　＝。　　４３　　　　　　　０
．７本リボフラビンはＨＰＩ、Ｃアッセイを使用して測
定した。

調節解除された宿主におけるｒｉｂ遺伝子の増幅から生
ずるリボフラビン生産の劇的な増加は、クローン化ＤＮ
Ａによりコードされる情ｔａがリボフラビン生合成にと
って律速的であることを示している。

実施例５ ＲＢ５０におけるＲｏＦ’−５０突然変異はリボフラビ
ン過剰生産表現型にとって決定的に重要であると思われ
る。突然変異を同定しそして場合により異なる株バック
グラウンドに移動させるには、Ｂ、サブチリス染色体上
のＲｏＦ’−５０突然変異の位置を地図にすることが必
要であった。ｐＲＦ　４と［）ＲＦ　８は全ての株バッ
クグラウンドにおいて非常に類似したリボフラビン生産
レベルを生ずるので、ＲｏＦ’−５０突然変異かクロー
ン化１０ｋｂ　ＥｅｏＲＩ　ｒｉｂ含有フラグメント上
に位置することはありえないように思われた。よりあり
そうなのは、ＲｏＦ’−５０突然変異かＢ。

サブチリス染色体の１ｙｓ−ａｒｏＤ領域においてマツ
プされることか報告されているリプレッサー突然変異で
ある（恐ら＜　ｒｉｂＣにおける）非連結リプレッサー
型突然変異であることである（Ｃｂｅｒｎｉｋら、Ｇｃ
ｎｅｔｉｋａ　（ＵＳＳＲ）　１５：１５６９．１９７
９）。Ｒｏｂ’−５０変異体かりボフラビンオペロンに
連結されているかまたは連結されていないかを判定する
ために、コンピテントなり３サブチリスｌＡ２１０（ｒ
ｉｂ−２）細胞をＲＢ５０ＤＮＡで形質転換し、ｒｉｂ
”を選択した。数予測のｒｉｂ＋クローンが生成し、２
００個のコロニーを１００μｇ／ｒｎＩのロゼオフラビ
ンを含有するトリプトース血液寒天ベース上に貼付した
。ＲｏＦ　’コロニは生成せず、コロニーのいずれもリ
ボフラビン過剰生産性表現型を示さなかった。そのこと
によりＲｏＦ’−５０突然変異がｒｉｂオペロン中に存
在しないことが確認された。

実施例６ 第４図は標準操作に従って調製された、ｐＲＦ　２のｒ
ｉｂ＝含有１０ｋｂ　ＥｅｏＲＩフラグメントの制限地
図を含有する。Ｘｂａｌ、　ＢｇｌＩｌ、　５ｓｔＬ　
Ｈｐａｌ及びＮｃｏＩに対する制限酵素部位は挿入ＤＮ
Ａに対して特有であり、一方５ａｉｌ及びＰｓｔｌは挿
入物中で一度そしてベクター中で一度切断される。挿入
物はいかなるＢａｍＨｌ、　Ｘｈｏ［またはＮｈｅ　Ｉ
制限部位も含まない。

制限酵素旧ｎｄｌＩＩは多数の部位で挿入物を切断する
。

リボフラビンシンターゼ遺伝子に特異的な５４−量体プ
ローブは約１．８　ｋｂの旧ｎｄｌｌＩフラグメントと
ハイブリッド形成し、このことはｒｉｂオペロンか５ａ
ｌＩ及び最も左のＢｇｌ　ＩＩ　（Ｂｇｌ　ＩＩ　Ｌ　
）部位を囲む一般領域にも存在しなければならないこと
を示唆している。

一般に、ｒｉｂオペロンの境界を決定するために、小さ
いｅａｔ含有含有制限フラグメント用いてｐＲＦ　２の
ｒｉｂ”クローン化ＤＮＡフラグメント中における挿入
および欠失を行った。Ｅ、コリプラスミドｐＥｃｃｌが
Ｅ。コリおよびＢ、サブチリスの両方にクロラムフェニ
コール耐性を付与するｅａｔ遺伝子を担持する制限フラ
グメントの主要源として用いられた。

標準的組換えＤＮＡ技術によりプラスミドの非必須領域
か除かれたｐＭＩＩＩＯＩ　（Ｙｏｕｎｇｍａｎら、Ｐ
ｌａｓｍｉｄ１２、１−９．１９８４）の誘導体である
このプラスミドは、Ｍ１３ｍｐ７の“ポリリンカー”に
より側面を挟まれた１、　３　ｋｂ　ｃａｔ含有含有フ
ラグメント台有しており、それゆえＳｍａｌ、　Ｂｅｏ
Ｒｌ、　５ａｉｌまたはＢａｍ旧のいずれかの末端を有
するｅａｔ力セッ１−を生成しつる。ｃａｔ遺伝子を含
有するＳｓｔ［又はＸｖａ　Ｉ−末端フラグメントを生
成させるために、ｐＥｃｃ　１の１．３　ｋｂ　ｅａｔ
含汀ＢａｍＨＩフラグメントを単離し、末端をＨｉｎｄ
１ｍリンカ−で修飾し、そしてこの修飾されたフラグメ
ントをｐｌｃ２ＯＲのポリリンカー領域内にあるＨｉｎ
ｄＩＩＩ部位にクローン化してプラスミドｐＥｅｃ　４
を生成させた。

組み込みプラスミド誘導体は最初にＥ、コリ中において
作製され、次いでＤＮＡ形質転換によりＢ７ザブチリス
のｒｉｂ染色染色体柱された。これは、クローン化され
たＤＮＡ挿入物の外側で切断する制限酵素によりプラス
ミドを直線状となし、この切断ＤＮＡでコンピテントな
り、サブチリス株ｌＡ３８２又はＰＹ７９　（βゞ、　
ｒｉｂゝ）細胞を形質転換しモしてＣｍ’を選択するこ
とにより行われた。ｐＲＢ３２２レプリコンはＢ、サブ
チリス内で複製できずそしてｃａｔ遺伝子はｒｉｂ＋座
に相同の配列により両側で結合されているので、ｅａｔ
含有挿入又は欠失のみか二重交叉組み換え事象により染
色体に挿入することができ、Ｃｍ’形質転換体を生成す
る。挿入又は欠失がリボフラビン合成を不活化したかど
うかを判定するために、Ｃｍ’コロニーをリボフラビン
（Ｒｉｂ表現型）の存在下または非存右下最小培地寒天
プレート上での増殖を評価した。

第８図に概略か示されているように、標準的操作により
ｅａｔ−含有制限フラグメントをｐＲＦ　２のＸｂａｌ
、　５ｓｔＩ及びＢｇｌｌＩに対する個々の制限部位に
連結するが、一対のＢｇｌＴＩ又はＮｅｏ　Ｉ部位間に
挿入（２，Ｏｋｂ　ＢｇＩＩＩフラグメントまたは０゜
８ｋｂ　Ｎｅｏｌフラグメントのいずれかを除去する欠
失を生ずる）するかまたはｒｉｂ−特異的ＤＮＡプロー
ブにハイブリッド形成する約１゜８ｋｂ　ＨｉｎｄＩＩ
Ｉフラグメントの１個のＨａｅｌｌＩ及びＥｅｏＲＶ部
位に挿入した。その結果を、第■表に示す。

（本頁以下余白） Ｃ（Ｓｓ　ｔ　１ｍ） Ｄ（ＢａｌＩＩｌ＋、） Ｅ（Ｓａｉｌ） 「 Ｆ（Ｂｇｌ　ＩＩ　、） ａ　“「“（右）及び“１”（左）は第８図の制限地図
に関して、挿入ｃａｔ遺伝子の転写方向を示す。

ｂ　　Ｂ、サブチリス株ｌＡ３８２　（ｒｉｂ”　、　
ｔｒｐＣ２，ｐｕｒ−６０、ｈｉｓ　Ｈ２）またはＰＹ
７９　（ＳＰβ’、ｒｉｂつ第８図及び第■表中に要約
されているように、５ａｌｔ、　　どちらかのＢｇｌｌ
Ｉ、又は“最も右”　Ｓｓｔ［（Ｓｓｔｌ＊　）部位へ
の挿入、又は２．ＯｋｂＢｇｌｌＩフラグメントの欠失
のすべてによりリボフラビンを生産できないＣｍ’コロ
ニー（Ｒｉｂ−）か生成し、このことはｒｉｂオペロン
がクローン化ＤＮＡ内の中心に位置していることを示す
。重要なことは、０．８ｋｂＮｃｏＩフラグメントの除
去は明らかにリボフラビン生産（Ｒｉｂ−）に何らの影
響も及ぼさず、このことはｒｉｂ遺伝子クラスターの一
方の末端が最も左の”ＮＣ０Ｉ（ＮＣＯＩＬ）部位の左
に存在することを示唆している。ｒｉｂオペロンの他の
末端は当初約１．８ｋｂｆｌｉｎｄＩ［Ｉフラグメント
内にあると判定された、というのはフラグメント内の２
つの部位ＥｅｏＲＶおよび１１ａｅｌｌＩての挿入、こ
のフラグメントと離れた部位Ｘｂａ　Ｉおよび５ｓｔＬ
、での挿入すべてがリボフラビンを生産するＣｍ’コロ
ニーを生成したからである。

実施例７ ｒｉｂオペロンのヌクレオチド配列 クローン化１０ｋｂＤ　Ｎ　Ａフラグメントのｅａｔ−
挿入突然変異誘発に基づいて、全ｒｉｂオペロンを５ｓ
ｔｌｔ及びＮＣｏＩＬ部位が境界にある６、Ｏｋｂ領域
内に位置か決定した。

ｒｉｂオペロンおよび側面領域を含有するｐＲＦ　２の
６．Ｏｋｂ領域をＳａｎｇｅｒらのジデオキシ法（Ｐ１
７０Ｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ、　Ｓｅｉ、　［ＪＳＡ　７４：
５４６３．１９７７）により配列決定した。手短にいえ
ば、特異的な制限フラグメントをＭ１３にサブクローン
するが、一連の重複欠失を起こさせるためにＴ４　ＤＮ
Ａポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性を用いるか（
Ｄａｌｅら、Ｐｌａｓｍｉｄ　１３：３１．１９８５）
、又は音波処理された制限フラグメントからの無作為フ
ラグメントをＭ１３中に“ショット−ガン“クローン化
することにより、配列決定のためのＭ１３クローンを調
製した。い（つかの場合には、隣接フラグメントの制限
部位接合部を横断するヌクレオチド配列もブライマーエ
クステンション配列決定法により決定された。約５５０
０ｈｐを両ストランドで配列決定し、ダラム陽性細菌リ
ポソーム結合部位、グラム陽性プロモーター及びｒｈｏ
−非依存性転写終止部位を有する典型的な読みとり枠に
似た配列が分析された。

この分析により、６個の完全な非重複読みとり枠が示さ
れた（第３図）：　０ＲＦ２（１２４アミノ酸）、リボ
フラビンシンターゼのβザブユニットをコードする遺伝
子（１５４アミノ酸）、　０ＲＦ３（３９８アミノ酸）
。

０ＲＦ４　（２１５アミノ酸）、　０ＲＦ５（３６１ア
ミノ酸）及びＯＲＦ　６　（１０５アミノ酸）。各０Ｒ
Ｆ６に先行して熱安定性計算値はΔＧ＝１６〜−−２２
ｋｃａ１１モルの範囲内にある強いバチルスリポソーム
結合部位（ＲＢＳ）が存在し、これらすべては同じ転写
方向に配向されていた。加えて、ＯＲＦ　５のコード領
域内には第２のＲＢＳ部位及びＡＴＧ開始コドンが確認
され、恐らく２４８アミノ酸の比較的小さいタンパク質
をコードしている。しかしながら、インビトロ５−３０
共役転写／翻訳反応（下記参照）に基づけば、ＯＲＦ　
５はわずかに３６１個アミノ酸タンパク質をコードして
いると思われる。終りに、タンパク質の最後の１７０個
のアミノ酸をコードしており、反対方向に配向している
もう一つのコード領域ＯＲＦ　１の一部分も確認された
。

以下の観察に基づけば、バチルス中にリボフラビン生合
成は５個の遺伝子を含有する単一のオペロンにより制御
される。５個の遺伝子とはβ−リボフラビンシンターゼ
遺伝子、ＯＲＦ　２、ＯＲＦ　３、ＯＲＦ　４及びＯＲ
Ｆ　５でありこのうちの少なくとも４個すなわちβ−リ
ボフラビンシンターゼ遺伝子、ＯＲＦ　３、ＯＲＦ　４
及びＯＲＦ　５は明白に生合成酵素をコードしており、
残りの１コードすなわちＯＲＦ　２は恐らく生合成酵素
をコードしている。

１、　０ＲＦ３、ＯＲＦ　４及びＯＲＦ　５は制限酵素
部位と重なっており、これら部位へのｅａｔ含有制限フ
ラグメントの挿入によりＢ、ザブチリスにお＋するリボ
フラビン生産が不活化される（第４図及び第８図）。

２、　０ＲＦＩは制限酵素部位と重なっており、そこで
はｃａｔ含有制限フラグメンＩ・の挿入によりｒｉｂ”
Ｂ、サブチリス株中でのリボフラビンの生産の不活化か
起こらず（第■表及び第８図）、または調節解除された
Ｒｏｂ’　Ｂ。ザブチリス株ＲＢ５２におけるリボフラ
ビン生産の低下も起こらなかった。

３、　０ＲＦ２も制限酵素部位ＥｃｏＲＶと重複してお
り、そこではｃａｔ含有制限フラグメントの挿入によっ
てｒｉｂ＋Ｂ、ザブチリス株中におけるリボフラビン生
産の不活化が起こらなかった（第■表及び第８図）。し
かしながらかかる挿入により、調節解除されたＲｏＦ’
　Ｂ。サブチリス株ＲＢ５２中におけるリボフラビン生
産を検出しうる程度に減少させ、これは突然変異した（
ＩＩＲＦ　２遺伝子産物がリボフラビン生産部分的に不
活化したことを示している。

４、ｒｈｏ−非依存性転写終止部位を示ず幹ループ構造
を形成しつる２個のＤＮＡ配列がＯＲＦ　１ど０ＲＦ２
の間、及びＯＲＦ　５とＯＲＦ　６の間のシストロン間
ギャップ内で確認された（第４及び９図）。０ＲＦ５と
ＯＲＦ　６との間の構造を除去するとリボフラビンの発
現が高まる。この構造は１ａｅＺ−融合構築物にリボフ
ラビン感受性を付与する。従って、これらはプロモータ
ーの　−末端上流でそれらか融合した場合に相手である
任意の他の遺伝子にかかる感受性を付与するのに使用す
ることかできる。

５、Ｂ、サブチリスＲＮＡポリメラーゼのσＡ　（栄養
型（ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ　ｆｏｒｍ）により認識され
るプロモーターに似たＤＮＡ配列ＴＴＧＣＧＴ−（１７
ｂｌ））−ＴＡＴＡＡＴがＯＲＦ　５から約２９０ｂｐ
上流で、ＯＲＦ　５と同じ転写方向に配列していること
が確認された（第４図）。このプロモーター（Ｐ＋、　
　１．１　ｋｂ　ＢｇｌｌＩＮｅｏ　Ｉ制限フラグメン
ト上）をプロモーターのないＥ、）リ　１ａｃＺ遺伝子
（Ｐ＋−１ａｅＺ）に転写融合させると、プロモーター
が第■表に示されるように、遺伝子と同じ転写方向に配
向している場合にのみ、ｒｉｂ”　Ｂ、サブチリス株（
６２１２１）においてリボフラビンにより調節されたβ
−ガラクトシダーゼ活性の発現、及びｒｉｂ”　、　Ｒ
ｏＦ’　Ｂ、サブチリス株（ＲＢ５２）において高レベ
ルの構成的（非調節）β−ガラクトシダーゼ活性の発現
を示した。ブライマーエクステンション分析により開始
部位か確認された。転写分析及びノーザン分析によれば
４．２ｋｂのポリジストロニックＲＮＡか全ｒｉｂオペ
ロンを包含することが示された。

第■表 リボフラビンにより調節された Ｂ、サブチリス Ｂ、サブチリス Ｂ、サブチリス Ｂ、サブチリス ６２１２１（Ｐ＋−１ａｃＺ　”　）　　　１．３　　
　　　４．２ＲＢ５２　（Ｐ、−１ａｅＺ　’　）　　
　３１　　　　　　３８６２１２１（ＰＩ−１ａｃＺ　
　”　　）　　　　＜Ｏ，ｌ　　　　　　　　　　＜０
．１６２１２１　　　　　　　　　　　　　　　　　＜
０．１　　　　　　　　　＜０．１Ｐｌ　と１ａｃＺは
同じ方向に配向されている。

Ｐｌ　と１ａｃＺは反対方向に配向されている。

これらの結果に基づけば、このσ１プロモーターＰ、は
ＯＲＦ　５、ＯＲＦ　４、ＯＲＦ　３、β−リボフラビ
ンシンターゼ遺伝子及びＯＲＦ　２の転写にとって主要
なプロモーターである。

６、第２のＤＮＡ配列ＴＴＧＡＡＧ−（１７ｂ［））−
ＴＡＣＴＡＴはＢ、サブチリスＲＮＡポリメラーゼのσ
Ａ（栄養型）により認識されるプロモーターに類似して
おり、このものはＯＲＦ　４の　−末端内で、ＯＲＦ　
３から約２９５ｂｐ上流においてＯＲＦ　３と同一の転
写方向に配向していることが確認された（第４図）。

０、７ｋｂ　ＳａｌＩ−Ｂｇｌ　Ｉ［制限フラグメント
上にこのプロモーター配列を含有するＥ、コリプラスミ
ドをキャンベル型組み換えによりＢ、サブチリス内に組
み込むと、Ｂ、サブチリス中におけるリボフラビン生産
か不活化されず、この結果はこの第２の配列（Ｐ２）は
プロモーター活性を有しており従って（σＡＰＩプロモ
ーターに加えて）　　０ＲＦ３、βサブユニツトリボフ
ラビンシンターゼ遺伝子及びＯＲＦ　２の転写を実際に
制御しうろことを示している。ＬａｅＺ融合およびノー
ザン分析により、このプロモーターの存在が確認された
。

７、Ｂ、サブチリスＲＮＡポリメラーゼのσＡ（栄養型
）により認識されるプロモーターに恐らく類似している
第三のＤＮＡ配列ＴＴＧＡＡＴ−（１８ｂｐ）−ＴＡＡ
ＡＡＡがリボフラビンシンターゼ遺伝子のβザブユニッ
トとＯＲＦ　２の間のシストロン間領域で、ＯＲＦ　２
の約８３ｂｐ上流で同じ転写方向に配向して存在するこ
とが確認された（第４図）。このσ４プロモーターＰ、
もＰ、およびＰ、に加え、ＯＲＦ　２の転写を制御しう
る。

８、クローン化ＤＮＡの５−３０反応のインビトロ共役
転写／翻訳分析によれば、ＯＲＦ　２、ＯＲＦ　３、Ｏ
ＲＦ　４およびＯＲＦ　５すべてがそれぞれの配列から
予想される大きさのタンパク質を実際にコードしている
ことが確認された。

９、リボフラビン生合成における５つの推定上の酵素的
工程のうちの３つが、予測されたアミノ酸配列又はその
産物の分子量をＧｅｎＢａｎｋ■又は既知のタンパク質
寸法を使用して、公開されたタンパク質の配列と比較す
ることにより特定のコード領域に割り当てられた。

ａ、　　０ＲＦ２とＯＲＦ　３の間の読み取り枠により
コードされる推定タンパク質はりボフラビンシンターゼ
酵素のβ−ザブユニットの公開された１５４個のアミノ
酸配列（Ｌｕｄｗｉｇら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ
。

２６２：１０１６．１９８７）とほとんど同一であった
。唯１個のアミノ酸の相異が認められた。グリシンに変
えてリジンが残基６５で存在していた。この酵素は５−
アミノ−６−リボシルアミノー２，４（ＩＨ，３Ｈ）−
ピリミジンジオン−−ホスフェート（第１図、それぞれ
構造５および４）及び３．４−ジヒドロキシブタノン−
４−ホスフェートからの６．７−シメチルー８−リビチ
ルルマジンの生成を触媒することが報告されている。

ｂ、０ＲＦ５の推定産物と、Ｅ、コリのバクテリオファ
ージＴ＊　（Ｍａｌａｙら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｎ
ｖ。２５８：８２９０、　１９８３）によりコードされ
る１８８個のアミノ酸タンパク質であるデオキシシチジ
レートデアミナーゼの間で、８８アミノ酸重複の３９％
の同一性が確認された。この結果に基づけば、０ＲＦ５
は２．５−ジアミノ−６−（リボシルアミノ）−４（３
１（）−ピリミジノン−５−ホスフェ−１・からの５−
アミノ−６−（リボシルアミノ）−２．４　（ＩＨ，３
）１）−ピリミジンジオン−−ホスフェートの形成を触
媒するｒｉｂ特異的デアミナーゼをコードしている可能
性が最も大きい（第１図、それぞれ構造３および２）。

Ｃ０ＯＲＦ　４遺伝子産物（２６，０００Ｄａ）の予想
された分子量はりボフラビンシンターゼのα−ザブユニ
ットの分子量と良く一致した（２３，０００　Ｄａ：Ｂ
ａｅｈｅｒら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ。２５５：６
３２．　１９８０）。この結果に基づけば、ＯＲＦ　４
は生合成経路の最終工程二６．７−シメチルー８−リビ
チルルマジンのリボフラビン（第１図、それぞれ構造５
及び６）および５−アミノ−６−リビチルアミノ２゜４
　　（ｌ）１．３Ｈ）−ピリミジンジオンへの不均化を
触媒するりボフラビンシンターゼα−ザブユニットをコ
ードする。

ｌＯ。リボフラビン合成における残りの酵素工程はＯＲ
Ｆ類の位置をオペロン中のｒｉｂ突然変異の物理的地図
に整列させることにより一時的にコード領域に割り当て
られた（Ｍｏｒｏｚｏｖら、Ｍｏｌ、　Ｇｅｎｅｔ。

Ｍｉｋ、　Ｖｉｒｕｓｏｌ、　ｎｏ。７　：　４２　（
１９８４））。欠陥ＧＴＰシクロヒドロラーゼに関する
突然変異が０．５ｋｂＨｉｎｄＩ［フラグメントにマツ
プされることが報告された。ＯＲＦ　３はこの制限フラ
グメントを包含するので、我々はＯＲＦ　３がＧＴＰか
らの２．５−ジ−ミノ−６−（リボシルアミノ）　−４
（３Ｈ）　−ピリミジノン−−ホスフェートの生産を触
媒する酵素機能を少なくとも部分的にコードすると結論
した（第１図、それぞれ構造２及びｌ）。

加えて、ｒｉｂ−特異的レダクターゼをコードする生合
成遺伝子は約１．８ｋｂ　Ｈｉｎｄｌ［フラグメント内
に完全に包まれることが報告された。このフラグメント
はわずか２個の完全なコード領域すなわちリボフラビン
シンターゼ遺伝子のβ−サブユニット及び０ＲＦ２Ｌか
含有していないので、ＯＲＦ　２は５−アミノ−６−（
リボシルアミノ）−２，４（ＩＨ，３Ｈ）−ピリミジン
ジオン−−ホスフェートからの５−アミノ−６−（リビ
チルアミノ）　−２，４（ＩＨ，３Ｈ）−ビリミジオン
ーーホスフェートの生成を触媒するレダクターゼをコー
ドすると推測する（第１図、構造４および３）。

加えて、類似のｒｈｏ−非存在性転写終止部位が推定σ
ＡＰ、プロモーターの下流でかつオペロンの最初のコー
ド領域ＯＲＦ　５のすぐ上流でオペロンの見かけのリー
ダー領域中に見出された（第４図及び第９図）。この機
能する可能性のあるターミネータ−構造は転写終止／抗
転写メカニズムによりｒｉｂオペロンの調節に関与しつ
る。

加えてロゼオフラビン耐性（ＲｏＦ”　）依存性の調節
領域がＯＲＦ　３の０．７ｋｂ　Ｓａｌ　Ｉ−Ｂｇｌ　
ＩＩ制限フラグメント上に存在する。

タンパク質産物へのｒｉｂ　ＯＲＦ類の割り当てｒｉｂ
特異的ＯＲＦ類がタンパク質をコードするか否かを確認
する１つの方法は、鋳型としてｐＲＦ　２およびその種
々の誘導体を使用して、５−３０インビトロ共役転写／
翻訳反応において、クローン化ＤＮＡから合成されたタ
ンパク質の寸法と数を［可視化する」ことである。５−
３０フラクシヨンキツト（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎ
ｕｅｌｅｓｒ　：製造業者の説明書に従って使用）が、
その強力なリポソーム結合部位の存在ゆえに特にＢ、ザ
ブチリス遺伝子を翻訳するのに効率的である。

鋳型としてｐＲＦ　２又はｐＲＦ　４のクローン化１０
ｋｂＥｃｏＲ（フラグメントを使用して、５つの推定ｒ
ｉｂ特異的タンパク質すなわちβリボフラビンシンター
ゼ、１４．７キロダルトン（ｋｄ）　（Ｌｕｄｗｉｇら
１．Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　２６２：１０１６．１９８７）　；及び０
ＲＦ２．１３．６ｋｄ：０ＲＦ３．４３．７ｋｄ；　０
ＲＦ４．２３ｋｄ、および０ＲＦ５゜３９、７ｋｄから
のタンパク質を検出できると予測した。

ＯＲＦ　６　（１１，６ｋｄ）および０ＲＦＩ（少なく
とも１８゜７ｋｄ）によりコードされる少なくとも２個
の他のタンパク質、ならびに１０ｋｂクローン化ＤＮＡ
フラグメントの配列未決定領域中に存在する遺伝子によ
りコードされる任意の付加的なタンパク質が検出される
ことも予想した。さらに、ｂｌａおよびｃａｔ抗生物質
耐性遺伝子産物を含むベクター関連タンパク質も予想さ
れた（ｔｅｔ遺伝子は５−３０反応においては強く発現
さねない）。

ｂｌａ−およびｅａｔ−特異的タンパク質（それぞれ３
２ｋｄおよび１８ｋｄ）及び他のベクター関連タンパク
質を別にして、６個の主要な［Ｓ−標識タンパク質全部
か検出され、これらはｐＲＦ　２又はｐＲＦ　４を用い
る５−３０反応の１５％〜ＳＤＳポリアクリルアミドゲ
ルにおいて、４７ｋｄ、　４４ｋｄ、　３８ｋｄ、　２
６ｋｄ、　２０ｋｄおよび１５ｋｄの分子量を有してい
た。これらのタンパク質産物を相当するｒｉｂ−特異的
ＯＲＦ類に割り当てるために、１０ｋｂ　ＥｃｏＲＩク
ローン化ＤＮＡの種々の利用しうる欠失誘導体、ｅａｔ
−挿入誘導体およびサブクローン化フラグメントを使用
して５−３０反応を反復した（第１０図）。その結果を
第７表に示す。

（本頁以下余白） 第７表 ５−３０反応で観察されるＲＩＢ−特異的タンノくり質
ｐＲＦ４　　　　　　＋ ｐＲＦ２１ ｐＲＦ５ ｐＲＦ２９ ｐＲＦ１２ ＲＦ１Ｏ ｐＲＦ３８ ｐＲＦ２４／ｐＲＦ２０ ｐＲＦ２３ ＋＋＋ ＋−＋＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ これらの結果に基づき、タンノくり質産物は０ＲＦ３（
４７ｋｄ）；　０ＲＦ５　（４４ｋｄ）　；　　０ＲＦ
４　（２６ｋｄ）　：および０ＲＦ２（１５ダルトン）
に割当てられ、分子量は予測された寸法とよく一致した
。

これら産物をＯＲＦ　２およびβ−リボフラビンシンタ
ーゼ遺伝子に割り当てることはこれ以外のＯＲＦ類に割
当てることにより簡単ではなかった。

ｐＲＦ　２の５−３０反応により、両方の遺伝子により
コードされるタンパク質の予測される寸法に近接した１
５ｋｄタンパク質が生成されたので、最初はこのタンパ
ク質バンドは実際には２種のタンパク質種を含有するも
のと考えられた。しかしながら、プラスミドｐＲＦ３８
の０ＲＦ２中にｅａｔを挿入するとこのタンパク質バン
ドが完全に除去され、はるかに小さい６ｋｄタンパク質
で置き代わり、この寸法は先端が切られたＯＲＦ　２の
予測寸法とよく一致している。これらの結果に基づけば
、前記１５ｋｄタンパク質はＯＲＦ　２によってのみ生
成されると思われる。

なぜβ−リボフラビンシンターゼタンパク質が５−３０
反応のゲルで可視化されないかは明らかでない。しかし
ながら全体的に見れば、これらの結果により５個の山特
異的なコーディング領域すなわち０ＲＰ５．０ＲＰ４．
０ＲＦ３．０ＲＦ２およびβリボフラビンシンターゼ遺
伝子の存在が確認された。

さらに、　ＯＲＦ　１は３８ｋｄタンパク質をコードし
ていると思われるが、ＯＲＦ　６に関しては何の産物も
確認されなかった。

ｒｉｂオペロンの調節メカニズム Ｂ、サブチリスにおいては、遺伝子構成の反復パターン
および生合成経路の調節が焼入かの研究者により観察さ
れている。Ｂ、サブチリスのトリプトファン生合成経路
ヌクレオチド配列（Ｈｅｎｎｅｍ等：Ｇｅｎｅ　３４：
１６９．１９８４）および新たなプリンヌクレオチド経
路（ＥｂｂｏｌｅおよびＺａＩｋｉｎ、　Ｊ、Ｂｉｏｌ
、　Ｃｈｅｍ。

２６２：８２７４．１９８７）の両方共、生合成オペロ
ンに連結していない遺伝子によりコードされうるリプレ
ッサータンパク質を含む新規転写終止／抗転写終止メカ
ニズムによりポリシストロンメツセージとして転写され
少なくとも部分的に調節される房状の、重複する遺伝子
を含有する（ＺａｌｋｉｎおよびＢｂｂｏｌｅ、　Ｊ、
Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６３：１５９５．１９８８）
。ｒｉｂ生合成遺伝子ならびに調節遺伝子の構成はＢ、
サブチリスｔｒｐおよびｐｕｔ経路のそれと非常に類似
していることを見出したので、ｒｉｂオペロンが少なく
とも部分的には同様の様式で調節される可能性があると
推定した。

簡単に言えば、転写終止／抗転写終止モデルの中心的特
徴には下記のことが包含される（Ｓｈｉｍｏｔｓｕ等、
Ｊ、Ｂａｅｔｅｒｉｏｌ、　１６６：４６１．１９８６
）　、すなわち、（ｉ）オペロンの第１番目の遺伝子に
先行する長いリーダー配列の存在；　（ｉｉ）一方の構
造がｒｈｏ−非依存性転写ターミネータ−として作用し
そして他方が［抗ターミネータ−Ｊ　（ｒｈｏ−非依存
性転写ターミネータ−形成阻止）として作用する相互に
排他的なＲＮＡ幹ループを形成しつるポテンシャルを有
する２またはそれ以上の重複２回回転軸対称の、ＲＮＡ
リーダー中における存在；　（ｉｉｉ）経路の最終産物
により活性化されたリプレッサータンパク質が、抑制条
件下に、新生ｍＲＮＡに抗ターミネータ−の形成を阻止
する部位で結合し、かくして転写を終止させるターミネ
ータ−が形成されること；　（ｉｖ）抑制解除的条件下
では、不活性化されたリプレッサーの結合が予め排除さ
れて、抗ターミネータ−の形成を来し、オペロンのコー
ド領域に至る読み通し転写を惹起する。

上記に論議したとおり、ｒｉｂオペロンの最も転写開始
のありそうな部位はオペロン中の第１番目の遺伝子から
約２９０ｂｐ上流に位置するσＡプロモーターＰ、であ
る。ＲＮＡリーダー配列を予め分析すると、このものは
転写終止／抗転写終止モデルによる調節に必要な構造部
分の全部でなくとも大部分を含有することが示された。

この領域内には、幹ループ構造に続＜　ｒｈｏ非依存性
転写ターミネータ−に似たチミジンの糸がＯＲＦ　５の
約５０ｂｐ上流に確認された。この配列はΔＧ−２６ｋ
ｃａ１１モルでヘアピンを形成する能力がある（第９図
）。さらに加えて、−１３〜−１６ｋｃａ１１モルの範
囲のΔＧを有するいくつかの幹ループ構造の可能性のあ
るものが抗ターミネーター配列としての適性を有しうる
ｒｉｂ　　−リーダー内に存在していた。

オペロン中の第１番目の遺伝子から通常上流にある転写
開始の最初の部位に加え、いくつかの生合成経路中にオ
ペロンの内部領域に位置する二次的なプロモータ一部位
が存在する。ｒｉｂ遺伝子座内に第２のプロモータ一部
位が存在する可能性は先のｒｉｂオペロンのＲ−ループ
へテロ２１重鎮研究によっても示唆されており（Ｏｓｉ
ｎａ等、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ１９６：７５−７８
．１９８６）、この研究ではｍＲＮＡ合成開始にとって
２またはそれ以上の部位が示されている。ｒｉｂオペロ
ンのシストロン間のギャップを先に分析したがかかる二
次的プロモータ一部位は検出されなかった。しかしなが
ら、この分析をオペロン内の全配列に拡大したら、５ａ
ｉｌ制限部位のすぐ下流で、ＯＲＦ　４の　末端内にも
う一つのっσ１プロモーターＰ、が確認された（第４図
参照）。すなわちＯＲＦ　２、ＯＲＦ　３、およびリボ
フラビンシンターゼのためのβ−サブユニットの発現も
この第２のプロモーターの制御下にある可能性がある。

その上、ありうる第３のσ６プロモーターＰ、がＯＲＦ
　２のすぐ上流で確認された。それゆえＯＲＦ　２はま
た恐らくこの付加的なプロモーターの制御下にもある。

５．５ｋｂ　Ｂ、サブチリスｒｉｂ特異的領域のＤＮＡ
配列上にある推定コード領域、プロモーターおよび転写
終止部位の位置を第■表に示す。

第■表 Ｂ、サブチリスｒｉｂオペロンのコード領域、プロモー
ター、および転写終止部位 ｂｐ番号６ コード領域　　　　ＯＲＦ　６　　　　　３６４−６７
８０ＲＦ　５　　　　　１１０１−２１８３０ＲＦ　４
　　　　　２１９７−２８４１０ＲＦ　３　　　　　２
８５９−４０５２ＯＲＦ　２　　　　　　　４６６５−
５０３６０ＲＦ　１　　　　　　　５５６７−５０５７
’σ１プロモーター　Ｐ、　　　　　　　　７７１−７
９９Ｐ　２　　　　　　　　　２５２８−２５５６Ｐｓ
　　　　　　　　　　４５４５−４５７４第３図参照 コード領域が反対方向に配向 実施例８ 改変されたｒｉｂオペロンを含有するベクターの作製ヌ
クレオチド配列における調節領域および読み取り枠を初
めて明解に記述するものである上記Ｂ。

サブチリスのｒｉｂオペロンに関する機能的分析により
、リボフラビン産生の収率を増大させるのに有用な新ベ
クターを作製できる。リボフラビン生合成に要する特定
の遺伝子の位置に関する知見、転写制御領域の位置に関
する知見、およびこれら遺伝子中における他の関連領域
（例えばＲＢＳ）により、作製すべきかかる領域を変え
ることができる。かかる操作の数例を以下に掲げる。

リボフラビン過剰生産性菌株ＲＢ５０　：　：　［１）
ＲＦ　８　］の作製に用いられる組み込みベクターはｒ
ｉｂオペロンを含むｌ０ｋｂ　８ｃｏＲＩフラグメント
を含有する。

ｒｉｂオペロンは６ｋｂ未満のＤＮＡ　Ｉ、か古めない
と考えられるので、より小さいＤＮＡフラグメント上に
ｒｉｂオペロンを含有する新組み込みベクターヲ作製し
た（１）ＲＦ４０）。このクローンの寸法がより小さい
のでｒｉｂ遺伝子をより大きく増巾でき、リボフラビン
の収率がより高くなる。

第１２図について言及すると、ｐＲＦ　２の０．８ｋｂ
　Ｎｅｏｌフラグメントがｃａｔ遺伝子で置換されたプ
ラスミドｐＲＦ３６からｐＲＦ４０を作製した。このｒ
ｉｂオペロンは６．５ｋｂ　Ｘｂａ［−ＥｃｏＲＩ　フ
ラグメント上に含有されている。このフラグメントを単
離しそしてＸｂａ　ＩおよびＥｃｏＲＩで消化されたｐ
ｌＪｃ１９　（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ等、Ｇｅ
ｎｅ　３３．１０３．１９８５；　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａ
ｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｏｓｔｏｎ。

ＭＡ、　ＵＳＡおよびＢｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒ
ｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。

Ｍａｒｙｌａｎｄ、　ＵＳＡから入手しうる）に連結し
た。この連結されたＤＮＡをＤＨ５αＥ、コリ中に形質
転換しそして４０μｇ／ｄ　Ｘ−ｇａｌおよび５０μｇ
／！のアンピシリンを含有するＬＢプレートに塗布した
。白色コロニーから調製されたミニ調製ＤＮＡを分析す
るとｐＲＦ３９が前記６．５ｋｂ　Ｘｂａｌ−ＥｅｏＲ
Ｉ７ラグメントを含有することが示された。

ｐｌ？Ｆ３９をＥｃｏＲ［で消化し、ＣＨＡＰで処理し
、次にｅａｔ遺伝子を含有する１、　６　ｋｂ　Ｂｃｏ
ＲＩフラグメントに連結した。この連結されたＤＮＡを
次にＤＨ５αＥ、コリに形質転換し、ＬＢ＋ＩＱμｇ／
ｍｌ！クロラムフェニコール上に塗布して適切なコロニ
ーを選択した。２つのコロニーがクロラムフェニコール
耐性であった。これらコロニーがら調製されたミニ調製
ＤＮＡを分析するとｅａｔ遺伝子の存在が確認された。

これらプラスミドの一つがｐＲＦ４０である（第１４図
）。

転写的に改変されたｒｉｂオペロンを含有するプラスミ
ドの作製 前記したとおり、リボフラビンオペロンのプロモーター
およびオペレーター領域を、リボフラビン生合成遺伝子
を構造的に発現させつるプロモーターで置換することが
有用である。次にかがる構築物を含有するプラスミドを
用いてリボフラビン生産レベルの高まった細菌菌株を生
成させることができる。少数例を以下に示すが本発明は
それらに限定されるものではない。

第１３図に関して説明すると、リボフラビンプロモータ
ーおよび調節領域を除去して５ＰＯＩプロモーターで置
き換えた。ＯＲＦ　３の初めにある１１３０位のＢａｌ
ＩＩ部位を利用した。オリゴヌクレオチドを合成しくＲ
Ｂ　５およびＲＢ６、第１８図参照）これらがＢａｌｌ
Ｉ部位の　側にある１０５８位までのＤＮＡ配列（ＯＲ
Ｆ　５の初めの数個のアミノ酸およびＳＤ配列）を再生
成した。オペロンの　−末端の再構成は任意の提案され
たＤＮＡ調節構造物（第１３図）の前で停止した。それ
らの　末端ではオリゴヌクレオチドはＢａｍＨＩ、Ｎ５
ｉｌ、およびＥｅｏＲＩ制限部位を有していて、それに
より種々のプロモーターをｒｉｂオペロンの　側に置く
ことができる。　ｒｉｂオペロン中に種々の制限部位が
あるゆえにこの新プロモーターを有するオペロンは以下
のとおり数段階で作製する必要があった。

１、４ｋｂ　Ｓａｌ　［−Ｂｇｌ　ＩＩフラグメントを
ｐＲＦ３６（第１３図）から単離した。このフラグメン
トを２個のオリゴヌクレオチドおよびＥｅｏＲ［−３ａ
ｔ　Ｉ−消化ｐ［Ｊｃ１９と連結した。次にこの連結さ
れた混合物をＥ。コリＤＨ５α細胞中に形質転換しそし
て５μｇ／ｍｌアンピシリンおよび４０μｇ／ｙｄ　Ｘ
−ｇａｌを含有するＬＢ上に塗布シタ。Ａｐ・白色コロ
ニーからミニ調製物を調製した。所望の構造を有するプ
ラスミドの一つがｐＲＦ４６（第１３図）である。

ｐＲＦ４６をＢａｍＨおよび５ａｔ（で消化してｌ。４
ｋ１１フラグメントを単離した。次にこのフラグメン）
−ｐＮＨ２０２の４００ｂｐ　ＥｅｏＲＩ−Ｂａｍ旧フ
ラグメント　（ＳＰＯＩ−１５プロモーター含有するｐ
Ｕｃ　８およびＰｅｒｏ、　、１゜Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、、１５２：２４７−２６５．１９８１）およ
び５ａｉｌおよびＥｅｏＲＩ切断ｐＵｃ１９と連結］ッ
た。この連結されたＤＮＡを次にＤＨ５αＥ。コリに形
質転換し、これをＬＢ＋アンピシリン十Ｘ−ｇａｌ上に
塗布した。白色コロニからミニ調製物ＤＮＡを調製した
。　ｐＲＦ４８が所望の構造を有していた（第１３図）
。

１）ＲＦ４８をＥｅｏＲＩおよび５ａｌｔで消化し、１
．８ｋｂフラグメントを単離した。このフラグメントを
ｐＲＦ　２からの４．Ｏｋｂ　Ｘｂａｌ−３ａｉｌフラ
グメンＩ□　（ｒｉｈオペロンの残分を含有）およびＸ
ｂａＩ、　ＥｃｏＲ１切断１）［ＪＣ１９と連結した。

次にこの連結混合物をＥ。コリＤ１４５α細胞中に形質
転換してこれをＬ　Ｂ＋アンピシリン＋Ｘ−ｇａｌ　、
Ｊ二に塗布した。白色コロニーからミニ調製物ＤＮＡを
調製した。ｐＲＦ４９が所望の構造を有しており、そし
てこのプラスミドを含有する培養物から得られる上清は
黄色であってこのことはリボフラビンが産生されている
ことを示している（第１３図）。

Ｂ。サブチリス中において選択できるようにするために
ｅａｔ遺伝子をｐＲＦ４９中に設置するには、このプラ
スミドをＸｂａ　Ｉで消化しそしてｐＥｅｅ　４からの
１、３　ｋｂ　ｅａｔ含有Ｘｂａ　Ｉフラグメントに連
結した。連結されたＤＮＡをＥ７コリＤＨ５細胞中に形
質転換した。数百例のＡｐ′　コロニーが生成し、これ
らコロニーをＬＢ＋１ｏμｇ／ｙｎｌクロラムフェニコ
ールを含有するプレートに貼付した。約１０％のコロニ
がクロラムフェニコールプレート上で増殖し、このこと
はｅａｔ遺伝子の存在を示している。ｃａｔ含有プラス
ミドの１つをｐＲＦ５０と呼ぶ（第１４図）。

前記実施例はＯＲＦ　５の上流への新プロモーターの設
置を示す。さらにリボフラビン産生を増大させるために
は一０ＲＦ　３をＯＲＦ　４の間のＰ、のあとにプロモ
ーターを設置することも有用であることを見出した。か
かる構築例を以下に示す。

第１４および１５図で説明すれば、ＯＲＦ　３の上流に
５ＰＯＩ−１５プロモーターの１コピーを設置するため
にＯＲＦ　４−０ＲＦ　３接合点に隣接した制限部位を
用いた。２７６７位のＣｌａｌ部位はＯＲＦ　４の末端
に位置しておりそしてｒｉｂオペロン中で特有である。

ＯＲＦ　３の始点付近のもう一つの有用な制限部位は２
８９２位のＤｒａ［部位である。オリゴヌクレオチドを
合成し、このものが前記叶ａＩ部位からＯＲＦ　３の開
始点を通る配列を再形成しそしてＯＲＦ　３の始点の前
に特有のＢａｍ旧部位を形成した（リンカ−Ｐ２−Ａお
よびＰ２Ｂ、第１８図）。もう−組のオリゴヌク１ノオ
チドはＣｌａｒ部位からＯＲＦ　４の末端を通る配列を
再形成し、その位置にＥｅｏＲ１部位を形成した（リン
カ−Ｐ２−Ｃ■およびＰ２−Ｄ　ＩＩ、第１８図）。次
（こＥｅｏＲＩ−Ｂａｍ旧フラグメント上に位置する５
ＰＯＩ−１５プロモーター・を前記オリゴヌクレオチド
により形成されたＢａｍＨＩおよびＥｅｏＲＩ部位の間
に入れた。オペロン全体は次のようにしてこの付加的な
５ＰＯＩ−１５プロモーターと結合させた。

第１５図で説明すれば、ＯＲＦ　４−０ＲＦ　３機能部
分を含有する７５０ｂｐ　Ｓａｉｌ−Ｂｇｌ　ＩＩフラ
グメントをｐＩＣ２ＯＲ巾にサブクローンした（Ｍａｒ
ｓｈ等、Ｇｅｎｅ　３２．４８１４８５、１９８４）。

生成するプラスミドｐＲＦ５７を次にＤｒａＩおよびＢ
ｇｌＩＩで消化して予測された２７０ｂｐ　Ｄｒａｌ−
８ｇｌｌｌフラグメントを単離した。このフラグメント
およびリンカ−Ｐ２−ＡおよびＰ２−Ｂを５ａｌＩおよ
びＢｇｌＩＩ切断ｐｌｃ２０Ｒに連結した。これらリン
カ−によりＯＲＦ　３の　末端の」二流にＢａｍＨＩお
よび５ａｌＩ部位が設置された。（この５ａｌＩ部位は
ＢａｔπおよびＢａｍＨ１部位が適合性でありかつ後程
除去されるので便宜上選択された。）連結物をｌコリＤ
Ｈ５α細胞中に形質転換した。Ｉ、Ｂ培地十Ａｍｐおよ
びＸ−ｇａｌに鼓布すると白色コロニーが生成した。ｐ
ＲＦ　５８が所望の構造を存していた。ｐＲＦ５８から
の３３０ｂｐ　Ｂａ１ｌＩ−３ａｉｌフラグメントをｐ
ＲＦ５８から単離しそしてｐＲＦ３６（第１２図）から
のｒｉｂオペロンの　末端を含有する３、　３　ｋｂＢ
ａｔＩＩ−ＸｂａＩフラグメントおよびＸｈａ　Ｉと５
ａｌＩで切断したｐＵｃ１９と連結した。この連結され
たＤＮＡを次にＥ、コリＤＨ５α細胞中に形質転換する
と白色コロニーが生成した。ｐＲＦ６２（第１５図）が
所望の構造を有していた。便宜上、３．６ｋｂ　Ｂａｍ
Ｈ［−ＸｂａＩフラグメントをｐＲＦ６２から単離して
ＢａｍＨＩ−。

Ｘｂａ　Ｉ−切断ｐＵｃ１９　（ｐＲＦ６４．第１５図
）にザブクローンした。今やこのプラスミドはＯＲＦ　
３に先行する遺伝子工学的に作製されたＢａｍ［部位を
存するｒ　ｉ　ｂオペロンの３゜６ｋｂ　　−末端を含
有していた。

最後の３個の読み取り枠を含有するｒｉｂオペロンの　
−半分の前に５ＰＯＩ−１５プロモーターを設置するた
めに、ｐＲＦ６４をＥｅｏＲ［およびＢａｍＨＩで消化
してこれを５ＰＯＩ−１５プロモーターを含有する４０
０ｂｐＥｅｏＲｌ−Ｂａ、ｍＨＩフラグメントに連結し
た。この連結されたＤＮＡをＥ、コリＤＨ５ｍ胸中に形
質転換してミニ調製物ＤＮＡを調製した。ｐＲＦ６５が
所望の構造を有していた。

次に５ＰＯＩ−１５プロモーターを遺伝子操作してプロ
モーターの上流にＣｌａＩ部位を設置してＯＲＰ　４の
末端を再構築した。ＳＰＯ１−１５プロモーターを含有
すｐＮＨ２０２からのＥｃｏＲＩ−Ｂａｍ旧フラグメン
トをリンカ−Ｐ２−ＣＩＩおよびＰ２−ＤＩＩ、および
ＢａｍＨＩ　とＣ１ａｒで消化したｌ）ＣＩ２ＯＲと連
結した。連結されたＤＮＡを次にＥ。コリＤＩ（５α細
胞中に形質転換した。白色コロニーが生成しそしてミニ
ｌｌ製物を分析するとｐＲＦ６３が所望の構造を有する
ことが示された。このｐＲＦ６３から４７０ｂｐ　Ｃ１
ａｉ−Ｂａｌ！ｌ旧フラグメントを単離して、５ＰＯＩ
−１５プロモーターおよびｒｉｂオペロンの　末端を含
有するｐＲＦ４９からの２　ｋｂ　ＢｅｏＲＩ−Ｃ１ａ
Ｉフラグメントおよび５ＰＯＩプロモーターおよびオペ
ロンの　末端を含有しＥｅｏＲＩおよびＢａｔｏＨＫで
消化されたｐＲＦ６４（第１５ｆｆｌ）に連結した。こ
の連結されたＤＮＡを次に日、コリＤＨ５α細胞中に形
質転換した。ミニ調製物ＤＮＡを調製した。ｐＲＦ６６
が所望の構造を有していた。さらに、ｐＲＦ６６を含有
するＥ、コリはＬＢ培地＋アンピシリンプレート上で少
量のリボフラビンを生成し、このことによりオペロンが
なお完全であることが確認された。

最後の段階はｅａｔ遺伝子を前記したｐＲＦ６６の特有
のＸｂａ　［部位に連結することであった。生成するプ
ラスミドｐＲＦ６９（第１６図）はｃａｔ遺伝子をｒｉ
ｂオペロンと同じ方向で含有していた。

天然または野生型ｙｉｈ　Ｐｉプロモータ・−および「
１Ｐ、のあとの５ＰＯＩ−１５プロモーターを有する完
全なオペロンを含有するプラスミドを作製するためには
、ｐＲＦ６４の６．３　ｋｂ　ＥｅｏＲ［−Ｂａｇａ！
（［フラグメント、ｐＲＦ３６（７）２゜７５ｋｂ　Ｅ
ｅｏＲＩ−Ｃ１ａＩフラグメント、およびｐＲＦ６３の
４７０ｂｐ　Ｃ１ａｎ−Ｂａｍ旧フラグメントを連結し
てＥ。コリＤ１１５α細胞中に形質転換した。Ａｐ・コ
ロニーの約５０９６が黄色であり、このことはりボフラ
ビン産生を示している。ミニ調製物ＤＮＡを黄色コロニ
ーから調製すると９ＲＦ６８が所望の構造を有していた
（第１６図）。先に論議したようにｅａｔ遺伝子をｐＲ
Ｆ６８のＸｂａ　１部位で加えてｐＲＦ７１　（第１６
図）を生成させた。このプラスミドはｅａｔ遺伝子をｒ
ｉｂオペロンと同じ方向で含有していた。

本発明で有用なプラスミドを作製するもう一〇の例とし
て、存在するＤＮＡ配列を予め除去することなくリボフ
ラビンオペロン内に１個またはそれ以上のプロモーター
を導入できる例を以下に示す。

例として、ｒｉｂ　Ｐ＋と推定ｒｈｏ−非依存性転写終
止部位の間に位置する３　０　ｂ　ｐ非必須領域内に挿
入された５Ｐ０１−１５プロモーターｌコピー、５ＰＯ
Ｉ−１５プロモーターのありうる転写妨害を阻止するだ
めの不活性化されたｒｉｂ　Ｐ＋プロモーター、活性な
ｒｉｂ　Ｐ、プロモーター　ｒｉｂ生合成酵素をコード
する５個の構造遺伝子、およびリボフラビンオペロンの
末端から下流にある、約１．５　ｋｂ側面ＤＮＡヌク１
／オチド配列、を含有する原型を改良したオペロンをｐ
ＲＦ７８（第１４図）中に構築した。

第１４図について言及すると、ｒｉｂオペロンのプロモ
ーター領域および側面の領域を含有するフラグメントで
ある、ｐＲＦ　２の１．７ｋｈ　Ｎｅｏｎ−ＰｓｔＩフ
ラグメントをはじめにＥ、コリバクテリオファージベク
ターＭ１３（Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｅｉ
ｅｍｉｅａｌ　Ｃａｔａｌｏｇ。

６０−６１．１９８７；　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂ
ｉｏｌａｂｓ、　Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ。

ＵＳＡから入手しうる）の誘導体であるｒｎｐｌＯ中に
サブクローンした。組換えファージの−っであるＭｌ、
７を回収してプロモーター領域を標準的ＤＮＡ配列分析
にかけると、ｒｉｂ　Ｐ＋プロモーターの一１０領域に
そのプロモーターを不活性化する可能性のある自然発生
的突然変異であるＴＡからＣＴへの変化が見出された。

１本鎖ＤＮＡを調製して、ｒｉｂ　Ｐ。

から上流にあるＤＮＡと相同の付加的な配列により側面
を挟まれた制限酵素部位の絹み合せ−ＥｅｏＲＩ−３ｍ
ａＩ−Ｂａｍ旧−を含有する合成的に生成させた５５＋
）ｌ）ＤＮＡオリゴマー（第１７図）に了ニーリングさ
せた。標準的な特定部位の突然変異誘発（ＳＤＭ）プロ
トコールを用いて２本１１　Ｄ　Ｎ　Ａ分子を合成した
。これらＤＮＡ分子を１３．−ｒり宿主ＴＧ−１（Ａｍ
ｅｒｓｈａｍ　Ｃｏｒｐ、、　［１ｌｉｎｏｉｓ、　Ｕ
ＳＡ）中にトランスフェクションにより導入して組換え
ファージプラークを生成させた。標準的なりＮＡ配列分
析により測定すると１つの組換えファージが所望の改変
されたＤＮＡ配列を含有することが判明した。

次にこの改変されたｒｉｂプロモーター領域を、ｒ＋ｂ
Ｐ＋領域および周囲配列から７５０ｂｐ離れた一対の特
有のＮ５ｉｌ制限酵素部位を用いてオペロンのｒｉｂ構
造遺伝子中に再結合させた。ファージ組換え体の２本鎖
ＤＮＡ分子を調製し、Ｎ５ｉｌで消化し、７５０ｂｐフ
ラグメントを単離し、そしてこのフラグメントをｐＲＦ
３９△Ｒ１（野生ｆｉｒｉｂオペロンを含有するｐＲＦ
３ｆ）から導かれたプラスミド、第１２図）の脱りん酸
化８．７ｋｂ　Ｎ５ｉｌフラグメントに連結した。この
連結されたＤＮＡ分子を形質転換によりＥ、コリＤＩ（
５α細胞に導入し、アンピシリン耐性を選択して所望の
組換えプラスミドｐＲＦ７５を含有するＡｐ′コロニー
を回収した。

次にｐＲＦ７５をＥｅｏＲＩとＢａｍＨＩ酵素の組み合
せを用いて消化し、切断ＤＮＡを精製４００ｂｐ　Ｂｅ
ｏＲＩ−ＢａｒｎＨＩＳＰＯＩ−１５含有制限フラグメ
ントに連結し、そして連結されたＤＮＡをＥ。コリＤＨ
５α細胞に形質転換により導入し、アンピシリン耐性を
選択することにより５ＰＯＩ−１５プロモーターをｒｉ
ｂ　Ｐ、の上流に挿入した。１つのＡｐ′コロニーが所
ｕ　（７）　ＳＰＯｌ−１５改変ｒｉｂオペロンを含有
する組換えプラスミドｐＲＦ７７を含有することが判明
した。次に１，６ｋｂ　ｘｂａｒ制限フラグメント上の
クロラムフェニコール耐性遺伝子ｃａｔを特有のＸｂａ
　１部位でｐＲＦ７７中に導入ｊ７てプラスミドｐＲＦ
７８（第１４図）を生成させた。

この原型オペロンをさらに前記したように改変して活性
ｒｉｂ　Ｐ、プロモーター、および／またはｒｉｂコー
ド領域ＯＲＦ　３およびＯＲＦ　４の間のシストロン間
領域内でｒｉｂ　Ｐ２から下流に導入された５ＰＯＩ−
１５プロモーターの第２のコピーを含有させた。例えば
、野生型ｒｉｂ　Ｐ＋プロモーターを含有する組換えフ
Ｔ−ジを用いて前記と同じ操作により、活性ｒｉｂＰ、
プロモーターを有するｐＲＦ７Ｂ（第１４図）中に改変
ｒｉｂオペロンの誘導体を含有するプラスミドｐＲＦ８
８を作製した。他の実施例においては、プラスミドｐＲ
Ｆ７８およびｐＲＦ８８両者のＤＮＡの７．　Ｏｋｂ　
Ｂｇｌ　ＩＩフラグメントをとり出してｐＲＦ６６の２
゜４ｋｂ　Ｂａ１ＩＩフラグメントに挿入してそれぞれ
プラスミドｐＲＦ８１およびｐＲＦ８９（第１４図）を
生成させることにより、存在する改変ｒｉｂオペロン含
有プラスミドＩ）ＲＦ７８およびｐＲＦ８８中にｒｉｂ
　Ｐ、の下流に位置する５ＰＯ１−１５プロモーターの
第２のコピーを挿入した。

Ａｄｅ　＋　ＲＢ５０菌株の作製 発酵培地に添加すべき成分ができるだけ少ない細菌菌株
を用いるのが重要である。かかる菌株はリボフラビンを
生成させるための発酵がより安価である。この目的に、
改変されたｒｉｂオペロンを増１−１ｔ、たものを含有
するアデニン復帰細胞を作製した。これら復帰細胞はｐ
ｕｒ−６０の真の復帰細胞ではなくむしろアデニン要求
を抑制する他の部位での突然変異を含有するものである
可能性がある。

以下に論議するようにこれらは非復帰株より約２５％多
いリボフラビンを産生ずる。かかる作製物の例を以下に
記載する。

プラスミドｐＲＦ　８　、　ｐＲＦ４０．　ｐＲＦ５０
．　ｐＲＦ６９．　ｐＲＦ７１、　ｐＲＦ７８．　ｐＲ
Ｆ８１．　ｐＲＦ８８およびＩ）ＲＦ８９をそれぞれＲ
Ｂ５０　（ａ　ＲＯＦ’調節解除されたＢ６サブチリス
株）中に形質転換してフロラｊ、フェニコール耐性（Ｃ
ｍ’）について選択した。各菌株について耐性コロニを
選択した。細菌を１０μｇ／ｍｌアデノシン含有ＲＭＭ
Ｉブロス中で増殖させそして培養物の試料を最小寒天プ
レートに塗布することにより各菌株のＡｄｅ”復帰細胞
を単離した。各Ａｄｅ＋菌株から１コロニーずつ選択し
、そして最高６０μｇ／ｍｌまでの漸増量のクロラムフ
ェニコールの存在下に増殖しうるコロニーを選択するこ
とによりベクターＤＮＡを増巾さぜた。

第２部位組み込み 前記したとおり、Ｂ、ザブチリス染色体中に作製された
ｒｉｂオペロンを増巾さぜることは高力価リボフラビン
を得るのに重要である。染色体内のｒｉｂオペロンのＤ
ＮＡコピー数がリボフラビン産生を限定しないように保
証することも重要である。

ｒｉｂオペロンをさらに増１］さぜるには、ｒｉｂオペ
ロンのコピーをＢ。ザブチリス染色体中の１個所を、−
える部位に組み込み増巾させることにより達成でき、リ
ボフラビン収率をさらに増大させることができる。以下
に第２の部位の組み込みを如何にして行うか例示する。

前記したベクターすべてはｒｉｂオペロン部位での組み
込みにｅａｔ遺伝子を利用している。ｒｉｂ遺伝子を第
２の部位に挿入するには、その第２の部位で用いるため
の異なる抗生物質耐性遺伝子を有することか好ましい。

例えば、Ｂ。サブチリスからのテトラサイクリン耐性（
ｔｅｌ）を用いることができ（ＰｅｒｋｉｎｓおよびＹ
ｏｕｎｇｍａｎ、　Ｊ、Ｂａｅｔｅｒｉｏｌ、、１５５
：６０７−６１５．１９８３）、かかるｔｅｔ遺伝子は
当業者にはよく知られており、かかる人物は容易に入手
しつる。

このような構築物の−・っ、例えばりＲＦ７８（第１４
図）は改変されたｒｉｂオペロンバージョンを含有して
おり、このプラスミドをＸｂａｌで切断してｔｅｔ遺伝
子を含有する２、４Ｘｂａ［フラグメントに連結できる
。

生成するプラスミドはＸｂａ　１部位にｔｅｔ遺伝子を
含有しており、ｐＲＦ８５と呼ばれる。

全ｒｉｂオペロンか欠失しか一つ第２の部位にｔｅｔ遺
伝子が組み込まれている菌株はその部位でのｐＲＦ８５
の組み込みを行うのに必要である。かかる部位の一つは
重要でない非必須細胞外プロテアーゼバチロベブチダー
ゼＦをコードするｂｐｒ遺伝子である。ｈｐｒ遺伝子を
含有するし、コリプラスミドｐＫＴ２゜（Ｓｌｏｍａ等
、Ｊ、Ｂａｅｔｅｒｉｏｌ、、Ｉ７２：１４７０−１４
７７、　１９９０）をＢｅｏＲＶで消化した。このＥｅ
ｏＲＶ部位はｂｐｒのコード領域中にある。次にＤＮＡ
をブラント末端化したｔｅｔ遺伝子含有２．４　ｋｂ　
ＥｅｏＲＩフラグメントに連結した。生成するプラスミ
ド（ｂｐｒのＥＣｏＲＶ部位にｔｅｔ遺伝子を含を）を
ｐＫＴ２−ｔｅｔと呼ぶ。このＤＮＡをＥｃｏＲＩを用
いて直線状となし、次にリボフラビン合成に関して調節
解除された菌株であるＲＢ５２中に形質転換した。　ｔ
ｒｔ”コロニーが生成し、かかるコロニーの一つをＲＢ
５４と呼ぶ。ｂｐｒで組み込まれたｔｅｔ遺伝子はｐＲ
Ｆ８５の組み込みに関し相同配列として作用しよう。

ｐＲＰ８５のクローン化されたりポフラビンオベロンを
テトラサイクリン耐性遺伝子を含有する第２の染色体部
位で確実に挿入させるには、ｐＲＦ８５に含有されるも
のと等しい本来のりボフラビンオペロンならびに側面Ｄ
ＮＡを含有する領域をインビトロ法によりＲＢ５４の染
色体から欠失させた。要約すれば、これはＮｃｏ　Ｉと
Ｘｂａ　Ｉ制限部位間のクローン化リボフラビンオペロ
ンおよび側面領域が除去され、代りにＢ、サブチリス中
で発現されるクロラムフェニコール耐性遺伝子ｅａｔで
置換された口。コリ組換えプラスミドをはじめに生成さ
せることからなる。次にこのプラスミドを用いて、直線
化したプラスミド分子でＲＢ５４を形質転換しクロラム
フェニコール耐性（Ｃｍ’）細菌を選択することにより
染包体リボフラビンオペロンを欠失させた。野生型ｒｉ
ｂ遺伝子をｅａｔ遺伝子を含有する欠失コピーで置き換
える組換え事象（マーカー置換）によりＣｍ’細菌が生
成する。

詳細には、プラスミドｐＲＦ３４（実施例６参照）を用
いて、インビトロ生成されたりボフラビンオペロン欠失
を存するＥ、コリプラスミドを生成させた。

このプラスミドは、リボフラビンオペロンが両側を２個
の特有のＸｂａ　１部位（一方の部位は欠失された０、
　８　ｋｂ　ＮｅｏＩフラグメントの次のｒｉｂオペロ
ンの末端の上流に位置しそして第２の部位はそのオペロ
ンの末端から約１．６　ｋｂＴ流に位置する）により挟
まれておりモしてｅａｔ遺伝子がこの領域の外側に挿入
されているｐＲＦ　２から誘導される。ｐＲＦ３４をＸ
ｂａ　Ｉで消化しそして切断ＤＮＡ分子を希ＤＮＡ濃度
の下に連結することにより、リボフラビンオペロンを含
有する７、２ｋｂ領域が除去されそして実質的にｃａｔ
遺伝子により置換されている組換えプラスミドｐＲＦ８
２が回収された。プラスミドｐＲＦ８２を制限酵素消化
により直線状となしそして切断ＤＮＡを用い、ＤＮＡ形
質転換、Ｃｍ’細菌の選択によりマーカー置換させてｐ
ＲＦ５４の染色体リボフラビンオペロンを除去した。Ｃ
ｍ’　コロニーをリボフラビン栄養要求性に関して選択
しそしてＲｉｂ’−Ｃｍ’　コロニーの一つＲＢ５５を
回収してさらに調査した。

プラスミドｐＲＦ８５を菌株ＲＢ５５中に形質転換して
Ｒｉｂ＋に関して選択した。Ｒｉｂ”形質転換体の一つ
を選択してＲＢ５８と称した。この菌株はプラスミドお
よび染色体中のｔｅｔ　’遺伝子間の相同組換えにより
ｂｐｒで組み込まれたｒｉｂオペロンを有する。ＲＢ５
８からの染色体ＤＮＡを調製し、これを用いてＲＢ５０
：：［ｐＲＦ６９１を形質転換し、ｔｅｔ・に関して選
択することができる。そこでこれら耐性コロニーはｒｉ
ｂオペロンの部位およびｂｐｒで組み込まれた改変され
たｒｉｂオペロンを有していよう。ｒｉｂで組み込まれ
たｒｉｂオペロンは前記したように漸増量のクロラムフ
ェニコールの存在下で増殖するコロニーを選択すること
により増巾されようし、またｒｉｂオペロンの第２のコ
ピーは漸増量のテトラザイクリン上で増殖するコロニー
を選択することにＪ：り増巾されよう。

実施例９ 発酵によるリボフラビンの生産 リボフラビン過剰生産性菌株の評価は炭素供給限定され
たバッチ発酵によりＣｈｅｍａｐ　１４ｆｆｉ容器中で
実施し、リボフラビン含量をＨＰＬＣにより測定した。

リボフラビン合成に関する遺伝子によりコードされる酵
素が律速性であるので、増巾されたｒｉｂ遺伝子は発酵
器中にでなく接種用の種に６０ｕｇ／ｒｎｌのクロラム
フェニコールを含有されることにより高いコピー数に保
持された。

Ｂ、サブチリスＲＢ５０　：　：　［ｐＲＦ６９　］の
培養物を６０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール（ＣＡ
Ｍ）を含有するトリプトース血液寒天ベース（Ｔｒｙｐ
ｔｏｓｅ　Ｂｌｏｏｄ　ＡｇａｒＢａｓｅ　（ＴＢＡＢ
　Ｄｉｆｃｏ））中で増殖させた。コロニーｉ；ｔ：６
０μｇ／ｍｌのＣＡＭを含有するリボフラビン最小培地
（ＲＭＭ：グルタミン酸ナトリウム２．０ｇ／　Ｉ！　
、　　カザミノ酸（Ｄｉｒｃｏ）０．２ｇ／　ｌ　、酵
母エキス（Ｄｉｒｃｏ）０．２ｇ／　（！　。

ＫＨ２ＰＯ４６，Ｏｇ＃７．　Ｋ、ＨＰＯａ　１４．Ｏ
ｇ／Ｃ（ＮＨ４）２Ｓ０４２、　Ｏｇ／　１　、　　ク
エン酸す１−リウム１．Ｏｇ／ＣＭｇ５Ｏ，・７Ｈ，０
０，２ｇ＃、アデノシン０．０５ｇ／　Ｉ？　、　　グ
ルコース１５、０ｇ／　（！含有、ｐ［４７，０）　２
５−を含有する３００ｙｄバツフルフラスコに移した。

接種されたフラスコを２５０ｒｐｍおよび３７°Ｃで振
盪することによりインキュベートシた。８時間後、滅菌
グリセリンを最終濃度１５９６となるまで加えそして１
　ｍｌずつ一８０°Ｃで貯蔵した。

発酵を開始させるためにはＲＢ５０：　：　［ｐＲＦ６
９］の凍結バイアルを３７°Ｃで解凍しそして６０μｇ
７ｍｌのＣＡＭを有するＲＭＭ　２！５ｍｌを含有する
３００ｍｊ？バッフルフラスコに移して２５Ｏｒｐｍお
よび３７℃で振盪した。

８時間後、増殖中の培養物６ｍＮを用いて２１トランス
ファーフラスコ中の発酵培地（上記第■表参照）３００
ｍｌを接種した。このフラスコは１５％グルコースおよ
び３０％マルトースの混合物９０ｍ１を添加した発酵培
地３００−を含有した。クロラムフェニコールを最終濃
度６０μｇ／ｍｅとなるまで加えた。２直径軌道を有す
る振盪器」二３７°Ｃで２００ｒｐｎ＋で１２時間イン
キュベーションしたのち、かかるフラスコの内容物を１
１？発酵容器中の発酵培地７１に移した。

発酵期間中はプロスをｐＨおよび溶解酸素（ＤＯ□）に
つき連続的に監視した。排ガスを四極（ｑｕａｄｒａｐ
ｏｌｅ”。

マススペクトル測定により連続的に分析して二酸化炭素
の発生（ＣＵＲ）および酸素のとり込み速度を記録した
。

幾通りかの発酵を比較すると制御系の再現性か示される
。当初の炭水化物は増殖４時間後にＲＢ５０：［Ｉ）Ｒ
Ｆ８］、。を含有する発酵物から消費されつくしてｐＨ
１，ＷおよびＣＥＲ低下を来した。この時点で、炭水化
物の供給を開始しそしてＤＯ，か６時間で限界となるま
で対数増殖か再開された。炭水化物の供給速度をコンビ
コーター制御して残る発酵期間全体を通してＤＯ，をｌ
Ｏ〜２０９６飽和に維持した。

発酵器中の過剰の炭水化物は酸素個枯およびリボフラビ
ン産生低下を招来する。酸素ｌ・ランスファーの限定に
より対数増殖の持続時間、最終的な細胞密度およびリボ
フラビン生成速度か決定される。酸素ｌ・ランスファー
速度を高めるためには、Ｃｈｅｍａ［）発酵器をヘッド
圧０．６気圧で１１００Ｏｒｐで操作した。

培地炭水化物供給物に酵母エキスを補添するど補添なし
の培地に比較してリボフラビン産生が高まった（第ｘｉ
図、白色：　ＲＢＦ−１４、第■表）。しかしながらそ
の価格か高いので、より安価な無機成分て置きかえるこ
とにより酵母エキスの量を系統的に減少させた。ｐＨ制
御における水酸化すトリウムに代えて水酸化アンモニラ
ｌ、を用いると供給物中の酵母エキスを減少でき、細胞
マスおよびリボフラビン力価の両方が増大した（第１１
図、黒用、ＲＢＦ−２２、第■表）。発酵時間も低下し
７た１、さらに、他の発酵においては酵母エキスを供給
物から完全に排除してアンモニウム塩と燐酸塩の絹み合
せ物により置き代えるとさらにリボフラビン生成が高ま
りかつ工程時間が短縮された（第１１図、白丸、ＲＢＦ
−２３、第■表）。

もとのＲＢ５０：：［１）ＲＦ８］６０はそのｐｕｔ−
６０突然変異ゆえにアデニン要求性である。リボフラビ
ン前駆体ｌλＩＰ（第２図）を生成する経路に関与する
早期の生合成酵素の阻害を最小限に抑えるために、その
菌株か要求するアデノシンの最低量を測定する実験を行
−）と、ＲＢ５０：：（ｐＲＦ８］ａｏ（および一般に
、ぞ１１らの染色体内に増［１］されたｒｉｂオペロン
を有するＲ８５０株）はそのアデノシン要求が不安定で
あることか判明し、そして原栄養性復帰細胞（Ａｄｅ”
）かかなり高頻度で生成された。振盪フラスコでは１．
Ａｄｅ”復帰細胞は少くともＲＢ５０　：　：　［１）
ＲＦ８　］　ａ　ｏ親と同じ程度に増殖しそしてリボフ
ラビンを生成すると思われる。発酵器中で評価すると、
復帰細胞１？Ｂ５０　：　：　［ｐＲＦ８］５ｏ（Ａｄ
ｅ”）は培地処方にアデノシンを必要としなかった。よ
り重要なことは、この復帰細胞はその親株より速かに増
殖して２５０４多いリボフラビンをより短い時間で生成
した。５．４ｇ／　１リボフラビン力価か１１９時間で
生成された（第１１図、黒丸：　ＲＢＦ２９：第■表）
。その上、付加的な発酵においてはｆ（ｙ　Ｓｏｙ　Ｔ
か当初充填物または培地から除去されてコーンステイー
プリカーで置き代えると、４８時間内のりボフラビン生
成かさらに６．３ｇ／βまて増大した（ＲＢＦ−４２、
第■表）。

これらの発酵条件においては、遺伝子操作により作製さ
れたりボフラビンオベロンＤＮＡを含有する細菌菌株を
用いることにより、さらにそれ以上のりボフラビン産生
の任意な増大か例証された。

６．５ｋｂ　ＥｃｏＲＩ−Ｘｂａｌ制限フ制限フラグメ
ン計上型リボフラビンオペロンを含有する菌株ＲＢ５０
　：　：　Ｅｌ）ＲＦ４０］＠　０　（Ａｄｅつは４８
時間で７．４ｇ／　ｉ！のりポフラビンを生成した。さ
らに、ｒｉｂ　Ｐ、プロモーターおよび調節領域か構造
性の５ＰＯＩ−１５プロモーターで置き換えられている
転写的に改変されたｒｉｂオペロンを含有する菌株ＲＢ
５０：：［１）ＲＰ５０］６ｏ（Ａｄｅつは４８時間で
９゜Ｏｇ＃のリボフラビンを生成した。これらの結果は
調節領域の除去によるかおよび／またはより強力で構造
性の外因性プロモーターの導入によってリボフラビンオ
ペロンを改変させるとりボフラビン力価か高められるこ
とを示している。

（本頁以下余白） 朶 ◇ 種々の発酵におけるリボフラビン産生の力学をＬｕｅｄ
ｅｋｉｎｇ−Ｐｉｒｅｔモデルを用いて分析した。すべ
ての場合に、特異的な生産性は指数増殖期の終りから発
酵の終りまで低下した。また、リボフラビン生産は用い
られた発酵条件下で増殖と関連していることは明白であ
った。

リボフラビンの収率は発酵成分および条件を変化させる
ことにより増大させうることを見出した。

リボフラビンの収率は第■表に示される発酵成分および
条件を用いることにより前記した条件に比較して増大さ
せることができる。

（木瓜以下余白） 第 ■ 表 当初バッチ 酵母エキス グルコース ＫＨ，ＰＯ。

ＭｇＣ１ｔ、　）＋２０ ＣａＣ４２，２Ｈ２０ ｎ５Ｏａ ＦｅＣ１ｓ、　６Ｈ２０ Ｍａｚｕ　ＤＦ３７Ｃ コーンステイープリカー グルタミン酸ナトリウム 供給培地（全使用量３１＞ グルコース クエン酸ナトリウム ＫＨ，ｐｏ４ コハク酸 Ｍｇ５Ｏ，、７Ｈ２０ （ｇ／ｊ７） ７．５ １．５ １．０ ０．０５ ０、０２５ ２゜５ ５８３、３ ６．６７ １．６７ １．６７ 要約すれば、かかる発酵の一つにおいては出発物質はバ
ッチ培地６．６５　Ｆおよび細菌（ＲＢ５０　：　：［
ｐＲＦ５０］ｇｏＡｄｅつ接種物０．３５１である。酸
素レベルはＣｈｅｍａｐポーラログラフイー溶解酸素電
極を用いて監視する。溶解酸素レベルは供給培地をコン
ピューター調節により添加して１５％±５％に維持する
。添加された全供給量は４８〜５６時間で約３６０！で
ある。発酵ｐＨは６．５±０．１（ＩＮ　ＨｇＳＯ４お
よびＮＨ，ガス使用）に維持され、発酵器圧力は０．６
バールに、そして空気流は毎分１０．５１に維持される
。これらの条件下においてＲＢ５０：：［１）ＲＦ５０
］５ｏ（Ａｄｅ”）株は４８時間で１１．０ｇ／　（２
のリボフラビンを生成し、このことは先の発酵条件に比
較して約２０％の生産改善を示す。終りに、１個はｒｉ
ｂ　Ｐ、および調節配列に置き代るもの、そして第２の
ものはＯＲＦ　３および０ＲＦ４の間に挿入されたもの
である２個の５ＰＯｉ　１５プロモーターを含有する。

転写的に改変されたりボフラビンオペロンを含有する細
菌菌株ＲＢ５０　：　：［ｐＲＦ６９］ｓ。（Ａｄｅつ
を用いるとさらにリボフラビン生産か増大することか示
された。この菌株は４８時間で１３．０〜１４．０ｇ／
　ｌそして５６時間で１５ｇ／１２のリボフラビンを生
成し、このことは２個の強力な外国性プロモーターを用
いるリボフラビンオペロンの転写増大によりリボフラビ
ン生産レベルが高まることを示している。

微生物の寄託 プラスミドｐＲＦ６９はブタベスト条約に基づき、１９
９０年６月６日付でアメリカンタイプカルチャーコレク
シ３ンに寄託された受託番号ＡＴＣＣ６８３３８を交付
された。

プラスミドｐＲＦ５０を含む［Ｅ、ｃｏｌｉ株ＤＨ５は
、ブタベスト条約に基づき、１９９０年５月３０日付で
アメリカンタイプカルチャーコレクシ３ンに寄託され受
託番号ＡＴＣＣ６８３３２が交付された。

プラスミドｐＲＦ７８を含むＥ、ｃｏｌｉ株ＤＨ５アル
ファーはＡｒｎｅｒｉｅａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒ
ｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　　（アメリカンタイプカル
チャーコレクション）にブタベスト条約に基づき１９９
０年５月３０日付で寄託された受託番号ＡＴＣＣ６８３
３３を交付された。又、Ｂ、サブチリス株ＲＢ５８も同
様にアメリカンタイプカルチャーコレクションにブタベ
スト条約に基づき１９９０年５月３０日付で寄託され受
託番号ＡＴＣＣ５５０５３を交付された。

Ｂ、サブチリス株ＲＢ５０は１９８９年５月２３日に特
許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタベス
ト条約の下にＴｈｅ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｒｅ
５ｅａｒｃｈＣｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ（
ＮＲＲＬ）、　Ｐｅｏｒｉａ、　　ｌ１ｌｉｎｏｉｓに
１９８９年５月２３日に寄託され受託番号８１８５０２
を有する。

本発明の態様を要約して示せば以下のとおりである。

（１）　　細菌起源の前記核酸配列がバチルス特にＢ７
サブチリスまたはＥ、コリに由来する請求項１項記載の
ベクター （２）前記核酸配列が少なくとも５個のリボフラビン生
合成タンパク質を特徴とする請求項１または前記（１）
記載のベクター （３）１個または２個のかかる転写エレメントを含有す
る請求項１または前記（１）ないしく２）のいずれかに
記載のベクター （４）前記転写エレメントがプロモーターである請求項
（１）ないしく３）のいずれかに記載のベクター。

（５）前記プロモーターが５ＰＯＩバクテリオフアージ
からの遺伝子と天然に関連するプロモーターｖｅｇ、　
ａｎｙおよびａｐｒと天然に関連するプロモーター、お
よび５ａｅＱの遺伝子産物により活性化される他の転写
調節エレメントから選択されるプロモーターである前記
（５）記載のベクター（６）　　ｐＲＦ５０．　ｐＲＦ
６９．　ｐＲＦ７０．　ｐＲＦ７１．　ｐＲＦ７８．　
ｐＲＦ８１゜またはｐＲＦ８９である前記（５）記載の
ベクター（７）前記転写エレメントを含む前記核酸配列
が前記のような部位に複数のコピーで存在する請求項３
記載の組換え細菌。

（８）前記転写エレメントを含む前記核酸配列が染色体
内の１またはそれ以上の部位に導入されている請求項３
または前記（７）記載の組換え細菌。

（９）前記細菌がりボフラビン遺伝子発現に関して調節
解除されている請求項２または前記（力ないしく８）記
載の組換え細菌。

α０　前記細菌がＥ、コリまたはバチルス特にＢ。サブ
チリス株である請求項２または前記（７）ないしく９）
のいずれかに記載の組換え細菌。

αυ　前記Ｂ。サブチリス株がＲＢ５０またはＲＢ５８
である前記α０）項記載の組換え細菌。

０７Ｊ　　適当な増殖条件が、前記組換え細菌の増殖に
関して好気的条件が維持されるような様式で増殖培地の
成分の利用可能性を限定することを特徴とする請求項４
記載の方法。

０３　　前記成分が炭素源、窒素源または前記組換え細
菌に必要な成分から選択される前記Ｑ２記載の方法。

０４）前記成分がグルコースまたは炭酸である前記０３
記載の方法。

（１５前記限定性工程が前記成分の供給培地中への導入
を限定することを包含する前記ａカ記〔の方法。

（１ｃ３　　前記成分がグルコースまたは炭酸である前
記（Ｉｓ記載の方法。

【図面の簡単な説明】

第１図はリボフラビン生合成経路を示す。 第２図はプリン生合成経路を示す。 第３図はバチルス・サブチリスｒｉｂオペロンの完全な
ヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。 第４図はｒｉｂ遺伝子クラスターの構造を示す。 第５図はバチルス・サブチリスＲＢ５０の菌株由来を示
す。 第６図はｒｉｂオペロン含有組換えプラスミドｐＲＦ１
、ｐＲＦ２、ｐＲＦ　３、ｐＲＦ　６およびｐＲＦ　７
の作製を示す。 第７図はバチルス・サブチリスＲＢ５３　：　：　［ｐ
ＲＦ　８１９゜の菌株由来を示す。 第８図はリボフラビン生合成に必須な領域を含むＤＮＡ
フラグメントを示す。 第９図はｒｈｏ−非依存性転写終止部位のへ了ビンルー
プ構造を示す。 第１０図は５−３０インビトロ共役転写／翻訳反応に用
いられる様々なプラスミド誘導体の構造を示す。 第１１図はリボフラビン生産曲線の比較を示す。 第１２図はｐＲＦ４０の作製を示す。 第１３図はｐＲＦ５０の作製を示す。 第１４図は種々のベクターの構造を示す。 第１５図は種々のベクターの構造を示す。 第１６図は種々のベクターの構造を示す。 第１７図はプラスミド作製に使用される５５−量体を示
す。 第１８図はベクター作製に用いられる様々なオリゴヌク
レオチドを示す。 出願人　エフ、ホフマンーラ　ロシュ 代理人　弁理士　平　木　祐　輔 アーゲー ［’ＲＦＰ ［’ＲＡ Ａ（Ａ只 ＡＩＣＡＲ ＡＩＲ ｉ　、　０ １　彎　− 旨 ゛【　０

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、第一に、１種またはそれ以上のリボフラビン生合成
   タンパク質をコードする細菌または酵母起源の核酸配列
   、そして第二に、この核酸配列と天然には関連がない１
   種またはそれ以上の転写エレメントを含有するベクター
   。 ２、１個またはそれ以上のリボフラビン生合成タンパク
   質をコードしておりそして遺伝性かつ細菌による発現が
   可能な核酸配列の少なくとも１コピーを、その細菌によ
   るリボフラビン生合成がかかる核酸配列を有しない細菌
   に比較して増大するような様式で染色体内の１つまたは
   それ以上の部位に外から導入されて含有する組換え細菌
   。 ３、前記転写エレメントを含む前記核酸配列の少なくと
   も１コピーが、細菌によるリボフラビン生合成が該転写
   エレメントを含むかかる核酸配列を有しない細菌に比較
   して増大するような様式で染色体内の１つまたはそれ以
   上の部位に導入されており、そして該転写エレメントを
   含む該核酸配列が遺伝性かつ細菌による発現可能である
   、請求項１記載のベクターにより形質転換された細菌か
   らなる組換え細菌。 ４、請求項２または３記載の組換え細菌を適当な増殖条
   件下に増殖させることを特徴とするリボフラビンの製法
   。 ５、請求項４記載の方法により生成されたリボフラビン
   。