JP2007043947A - コリネ型細菌を用いる還元条件でのアミノ酸の製造方法 - Google Patents
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
【解決手段】好気性コリネ型細菌を好気条件下で増殖培養し、回収した菌体またはその菌体処理物を用いて還元条件下の反応培地中に生成するアミノ酸を採取することからなるアミノ酸の製造方法において、該好気性コリネ型細菌として、乳酸デヒドロゲナーゼが不活性化されているか、もしくは、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が破壊されている形質転換体を用いることを特徴とするアミノ酸の製造方法。
【選択図】なし
Description
形質転換されたコリネ型細菌を用いる物質生産に関しては、特許文献2に、L−アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子が組換えられたコリネ型細菌がアラニンの生成蓄積量を増大させることができると記載されている。
また、特許文献3では、相同組換え法による乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株によるアミノ酸や有機酸の製造を行えば乳酸の副生が抑えられると開示している。しかしながら、アミノ酸や有機酸(但し、乳酸を除く)の生成そのものが促進されることは示されておらず、単に該破壊株を好気培養し、ついで粉砕した菌体粉砕物から得られる乳酸デヒドロゲナーゼ酵素はその発現量が低下していると開示されているのみである。
特許文献4では、本発明者等により、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が破壊され、かつ、ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子が高発現すべく組換えられた好気性コリネ型細菌形質転換体を用いるコハク酸等のジカルボン酸の製造技術が開示されている。しかしながら、特許文献4には、アミノ酸の製造については何も記載されていない。本発明のアミノ酸製造技術は、特許文献4で開示されているコリネ型細菌形質転換体を使用することを実施態様の一つとするものであるが、これは、特許文献4に記載の形質転換体がジカルボン酸の製造のみならず、アミノ酸の製造にも優れた能力があることを、本発明により思いもかけず見出したことによる。
さらに、醗酵法によるアミノ酸生産技術においては、好気性コリネ型細菌に与えられた栄養源は増殖にも消費されることになり、目的アミノ酸生産物の生産性の低下、すなわち、栄養源からの目的生産物への変換率が低下することに対する改良も求められている。
(1)好気性コリネ型細菌を好気条件下で増殖培養し、回収した菌体またはその菌体処理物を用いて還元条件下の反応培地中に生成するアミノ酸を採取することからなるアミノ酸の製造方法において、該好気性コリネ型細菌として、乳酸デヒドロゲナーゼが不活性化、もしくは、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が破壊されている形質転換体を用いることを特徴とするアミノ酸の製造方法、
(2)形質転換体が、さらに、ピルビン酸カルボシキラーゼ遺伝子が高発現すべく組換えられた形質転換体であることを特徴とする(1)記載のアミノ酸の製造方法、
(3)好気性コリネ型細菌形質転換体が、コリネバクテリウム・グルタミカム R/△ldh(FERM P−20532)であることを特徴とする(1)記載のアミノ酸の製造方法、
(4)好気性コリネ型細菌形質転換体が、コリネバクテリウム・グルタミカム R ldh−/pCRB1−PC(FERM BP−10060)であることを特徴とする(2)記載のアミノ酸の製造方法、
(5)還元条件下の反応培地の酸化還元電位が−200ミリボルト乃至−500ミリボルトであることを特徴とする(1)記載のアミノ酸の製造方法、
(6)還元条件下の反応培地に存在する好気性コリネ型細菌の形質転換体が実質的な増殖を伴わないことを特徴とする(1)記載のアミノ酸の製造方法、
(7)アミノ酸が、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、グリシン、アスパラギン酸、スレオニン、セリン、グルタミン酸、システィン、メチオニン、チロシン、フェニルアラニン、リジン、ヒスチジン、アルギニン、トリプトファンおよびプロリンから選ばれることを特徴とする(1)記載のアミノ酸の製造方法、
である。
相同性組換え法によるコリネ型細菌の乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株作製は、通常、以下の操作方法、手順で行なうことができる。
コリネ型細菌からのゲノムDNA抽出法は、4mg/ml濃度のリゾチームで37℃、30分間菌体を事前に処理する以外は、Sambrookらの方法(Sambrook,J.,E.F.Fritsch,and T. Maniatis.1989.Molecular cloning:a laboratory manual,2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.)により行うことができる。
乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のクローニングは、既知乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子間の保存アミノ酸配列からデザインしたプライマーを用いたPCR法や、既知乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を用いたハイブリダイゼーションにより行うことができるが、最も効率的な方法としては、ゲノム配列[コリネバクテリウム グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)R株の場合、全ゲノム配列(野中 寛、中田 かおり、岡井 直子、和田 真利子、佐藤 由美子、Kos Peter、乾 将行、湯川 英明「Corynebacterium glutamicum R ゲノム解析」日本農芸化学会、2003年4月、横浜、日本農芸化学会2003年度大会講演要旨集、p.20参照)が決定されているので、利用できる。]からプライマーをデザインし、コリネ型細菌のゲノムDNAを鋳型として、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の全長を含む遺伝子をPCRにより増幅・取得することができる。一方、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊株の作成は、コリネ型細菌内で複製不可能なpHSG398等の大腸菌ベクター等に、PCRで増幅した乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子をクローニング後、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のほぼ中央に位置するユニークな制限酵素サイトに、カナマイシン等の薬剤耐性遺伝子(遺伝子破壊する際のマーカー遺伝子として利用)を挿入した、遺伝子破壊用プラスミドを作製する。
乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株の作成は、上記遺伝子破壊用プラスミドを、コリネ型細菌への高効率遺伝子導入法[電気パルス法(Y. Kurusu,et al., Agric.Biol.Chem.54:443−447,1990、およびA.A.Vertes,et al.,Res.Microbiol.144:181−185,1993)の方法]により細胞内に導入し、染色体への相同性組換えにより、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を破壊することにより行うことができる。
乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊の確認は、遺伝子レベルではPCRやサザンハイブリダイゼーション法により、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子断片に加えて、カナマイシン耐性遺伝子などのマーカー遺伝子断片が染色体に挿入されていることで、また、蛋白質レベルでは、乳酸デヒドロゲナーゼの酵素活性が消失していることにより確認できる。
かくして得られる乳酸デヒドロゲナーゼが不活性化されているか、もしくは、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が破壊されているコリネ型細菌株としては、例えばコリネバクテリウム グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)R/△ldhが挙げられ、この菌株は独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号FERM P−20532(受託日:平成17年5月10日)として寄託されている。なお、本明細書および特許請求の範囲に記載の「△ldh」は、
本発明においては、好気性コリネ型細菌の乳酸デヒドロゲナーゼが不活性化されているか、もしくは、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が破壊されている限り、アミノ酸の生成に好ましい他の形質転換技術を付加的に用いることができるが、そのような例の一つに、上記の形質転換体にさらにピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子が高発現すべく組換えられているものが挙げられ、具体的には、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum) R ldh−/pCRB1−PCが挙げられる。この菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに国際寄託番号FERM BP−10060として寄託されている(FERM P−19446より移管)。その形質転換方法は国際公開第05/010182号パンフレット(WO2005/010182 A1)に詳細に記載されている。なお、この形質転換株はコハク酸等のジカルボン酸の製造を目的として本発明者等により創製されたものであるが、思いもかけず、本発明のアミノ酸製造技術にも優れた能力を発揮することが見出されたものである。
また、回収された培養菌体に対して、例えば、アクリルアミドまたはカラギーナン等で固定化する等の固定化菌体処理を加えてもよい。
還元状態下の反応培地の調製方法は、公知の方法を用いてよい。例えば、反応培地用水溶液の調整方法は、例えば硫酸還元微生物などの絶対嫌気性微生物用の培養液調製方法(Pfennig, N et. al.(1981): The dissimilatory sulfate-reducing bacteria, In The Prokaryotes, A Handbook on Habitats, Isolation and Identification of Bacteria, Ed. by Starr, M. P. et. al. p.926-940, Berlin, Springer Verlag.や「農芸化学実験書 第三巻、京都大学農学部 農芸化学教室編、1990年第26刷、産業図書株式会社出版」)などが参考となり、所望する還元状態の水溶液を得ることができる。
本発明の目的生産物であるアミノ酸はコリネ型細菌形質転換体の代謝機能に基づく生化学反応により産生される化合物である。微生物細胞内の生化学反応には各種の酸化還元反応が関与しており、電子の授受移動が行われている。酸化還元電位は反応系での電子の受容性、供与性の難易度を示す尺度の一つであるが、この電位は微生物細胞内で起こっている代謝経路を構成する各種反応(酸化還元反応)の状態や細胞内外との電子授受の状態を反映している。電位差計により直接測定される酸化還元電位は反応溶液と電極との電位であるが反応溶液の電位は細胞膜を介してある電位勾配を持って細胞内で生じている反応と相関している。即ち、酸化還元電位は細胞内外を含む反応系全体の酸化還元反応の総和を反映(各種反応の内容やその頻度等も含めて)したものである。
なお、上記以外の糖類を有機炭素源として利用するために、本発明の好気性コリネ型細菌形質転換体へ、さらに付加的にそれら糖類を資化すべく新たな組換え技術を施すこともできる。
アミノ酸の生成反応に用いられる反応培地組成は、好気性コリネ型細菌形質転換体またはその処理物がその代謝機能を維持するために必要な成分、即ち、各種糖類等の炭素源、蛋白質合成に必要な窒素源、その他リン、カリウムまたはナトリウム等の塩類、さらに鉄、マンガンまたはカルシウム等の微量金属塩を含むことが好ましい。これらの添加量は所要反応時間、アミノ酸生産物の種類または用いられる好気性コリネ型細菌形質転換体の種類等により適宜定めることができる。用いる好気性コリネ型細菌形質転換体によっては特定のビタミン類の添加が好ましい場合もある。また、前記の反応系の炭酸ガス封入法にも関連して、反応培地に二酸化炭素または各種の炭酸塩もしくは炭酸水素塩等の無機炭酸塩を糖類などの有機炭素源に加えて注入することが目的アミノ酸によっては有効な場合もある。
好気性コリネ型細菌形質転換体またはその菌体処理物と糖類との反応は、好気性コリネ型細菌形質転換体またはその菌体処理物が活動できる温度条件下で行われることが好ましく、好気性コリネ型細菌形質転換体またはその菌体処理物の種類などにより適宜選択することができる。
(1)好気性コリネ型細菌(Corynebacterium glutamicum R;FERM P−18976)の乳酸デヒドロゲナーゼ破壊株(FERM P−20532)の好気培養増殖。
冷凍庫に−80℃で保存してある乳酸デヒドロゲナーゼ活性が消失された好気性コリネ型細菌の形質転換体(国際公開番号WO2005/010182 A1号公報の実施例1記載の方法に従って作成し、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号FERM P−20532として寄託されている株と同一株)を、プレート培養用培地であるA寒天培地(組成:尿素2g、酵母エキス2g、カザミノ酸7g、硫安7g、第一リン酸カリウム(KH2PO4)0.5g、第二リン酸カリウム(K2HPO4)5g、硫酸マグネシウム・7水和物0.5g、硫酸鉄・7水和物6mg、硫酸マンガン・1水和物4.2mg、ビオチン0.2mg、チアミン0.2mg、グルコース20g、寒天1.5%(W/V)そして蒸留水1L)に塗布し、33℃、12時間(hr)暗所に静置した。
上記のプレート上で生育した好気性コリネ型細菌形質転換株を、試験管培養用培地であるA培地(組成:寒天が含まれていないことを除けば上記A寒天培地と同一成分組成)10mlに白金耳でもって植菌し、33℃、12時間(hr)、200rpmで振盪培養した。
このようにして生育した好気性コリネ型細菌形質転換株を、好気培養増殖用培地であるA−U培地(組成:尿素が含まれていないことを除けば上記A培地と同一成分組成)の500mlが入っている容量1Lのジャーファーメンターに移し、33℃、1000rpm、滅菌空気を1vvmで通気して、13時間(hr)好気培養増殖を行なった。
この間、5N(規定)濃度のNaOH(水酸化ナトリウム)水溶液を使用してジャーファーメンター槽内のpHを7.5に常時維持した。
このようにして培養増殖された菌体は、遠心分離(4℃、10分、5000xG)によって回収し、次の還元条件下のアミノ酸製造反応に供した。
硫安7g、第一リン酸カリウム(KH2PO4)0.5g、第二リン酸カリウム(K2HPO4)0.5g、硫酸マグネシウム・7水和物0.5g、硫酸鉄・7水和物6mg、硫酸マンガン(II)7水和物4.2mg、ビオチン(Biotin)200μg、塩酸チアミン200μg、蒸留水1000mlからなる反応原液を調製し、120℃で10分加熱後、ただちに減圧条件(〜3mmHg)にて20分間、溶解している酸素の除去を行った。反応原液の還元状態の確認は減圧開始時に反応原液に加えた還元状態指示薬レサズリンの色調変化(青色から無色への変化)にて行った。この反応原液500mlを容量1Lの窒素雰囲気下のガラス製反応容器に導入した。この反応容器はpH調整装置、温度維持装置、容器内反応液攪拌装置および還元電位測定装置を備えている。
(1)の好気培養増殖工程より回収された湿潤菌体150g(Dry Cell換算約30g)を、アミノ酸生成反応用溶液であるBT−U培地(組成:硫安7g、第一リン酸カリウム(KH2PO4)0.5g、第二リン酸カリウム(K2HPO4)0.5g、硫酸マグネシウム・7水和物0.5g、硫酸鉄・7水和物6mg、硫酸マンガン・1水和物4.2mg、ビオチン0.2mg、チアミン0.2mg、グルコース32.4g(180mM)、重炭酸ソーダ(NaHCO3)12.6g(150mM)、蒸留水1L)500mlの入っている容量1Lの反応槽に加え、33℃にて緩やかに攪拌し、還元条件下のアミノ酸生成反応を8時間実施した。反応時の培地の酸化還元電位は、反応開始後直ちに急激に低下し、その後が約−400mVに維持してアミノ酸生成反応が継続された。この間、5N(規定)濃度のNaOH(水酸化ナトリウム)水溶液を使用して反応槽内のpHを7.5に常時維持した。
反応終了後、反応液をサンプリングして、反応槽内に生成蓄積しているアミノ酸量を定量した。アミノ酸の定量は、島津製作所製アミノ酸分析計(C−R7A/LC−10A)を用いて行った。これらの結果を表1に記す。
アミノ酸生成に使用する好気性コリネ型細菌として、形質転換されていないコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum) R(FERM P−18976)を用いること以外は、好気増殖培養、反応用還元状態の反応培地溶液の調製および還元条件下のアミノ酸生成反応を実施例1と同様の方法、条件で行った。
これらの結果を表1に併記した。この結果から、本発明の好気性コリネ型細菌形質転換体を使用することの効果が明らかであり、特に、アラニン、バリン、ロイシン等のアミノ酸の著量の生成量の向上が図られている。
アミノ酸生成に使用する好気性コリネ型細菌形質転換体として、国際公開番号WO2005/010182 A1号公報の実施例2記載の方法に従って作成し、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号FERM P−19446(国際寄託番号 FERM BP−10060)として寄託されている「コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum) R ldh−/pCRB1−PC」株と同一株を用いること以外は、好気増殖培養、反応用還元状態の反応培地溶液の調製および還元条件下のアミノ酸生成反応を実施例1と同様の方法、条件で行った結果を表1に記す。
Claims (7)
- 好気性コリネ型細菌を好気条件下で増殖培養し、回収した菌体またはその菌体処理物を用いて還元条件下の反応培地中にアミノ酸を生成させ、次いで生成したアミノ酸を採取することからなるアミノ酸の製造方法において、該好気性コリネ型細菌として、乳酸デヒドロゲナーゼが不活性化されているか、もしくは、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が破壊されている形質転換体を用いることを特徴とするアミノ酸の製造方法。
- 形質転換体が、さらに、ピルビン酸カルボシキラーゼ遺伝子が高発現すべく組換えられた形質転換体であることを特徴とする請求項1記載のアミノ酸の製造方法。
- 好気性コリネ型細菌形質転換体が、コリネバクテリウム・グルタミカム R/△ldh(FERM P−20532)であることを特徴とする請求項1記載のアミノ酸の製造方法。
- 好気性コリネ型細菌形質転換体が、コリネバクテリウム・グルタミカム R ldh−/pCRB1−PC(FERM BP−10060)であることを特徴とする請求項1記載のアミノ酸の製造方法。
- 還元条件下の反応培地の酸化還元電位が−200ミリボルト乃至−500ミリボルトであることを特徴とする請求項1記載のアミノ酸の製造方法。
- 還元条件下の反応培地に存在する好気性コリネ型細菌の形質転換体が実質的な増殖を伴わないことを特徴とする請求項1記載のアミノ酸の製造方法。
- アミノ酸が、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、グリシン、アスパラギン酸、スレオニン、セリン、グルタミン酸、システィン、メチオニン、チロシン、フェニルアラニン、リジン、ヒスチジン、アルギニン、トリプトファンおよびプロリンから選ばれることを特徴とする請求項1記載のアミノ酸の製造方法。
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