ES2318590T3 - Proteasa fungica acida en la fermentacion de sustratos de almidon insolubles. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para disminuir la cantidad de almidón residual producido de la fermentación de sustratos que contienen almidón granular, dicho procedimiento comprende: La fermentación de un sustrato que contiene almidón granular con una proteasa NSP24, enzima hidrolizante del almidón granular y un microorganismo de fermentación, en donde el sustrato que contenía el almidón granular no se cuece; y la obtención de un caldo fermentado en donde el % de almidón residual en el caldo ha disminuido en comparación con la cantidad de almidón residual de un procedimiento esencialmente similar sin la proteasa, en donde dicha proteasa NSP24 es: (i) una proteasa que tiene al menos un 85% de identidad de secuencia con la secuencia aminoacídica de Nº ID SEC:2; o (i) un fragmento activo biológicamente de (i) que tiene al menos 250 residuos aminoacídicos.
Description
Proteasa fúngica ácida en la fermentación de
sustratos de almidón insolubles.
La presente invención se refiere a los
procedimientos para la producción de alcohol, como el etanol
durante la fermentación de sustratos que contienen gránulos de
almidón. La invención hace referencia en particular a la inclusión
de una proteasa fúngica ácida, NSP24, en la fermentación, que
produce como resultado un aumento en la producción de etanol y una
disminución en la cantidad de almidón residual producido durante la
fermentación comparada con la fermentación sin la proteasa.
Los procesos de fermentación industrial utilizan
predominantemente glucosa como materia prima para la producción de
numerosos productos finales, como proteínas, enzimas, aminoácidos,
ácidos orgánicos, alcoholes, productos bioquímicos, farmacéuticos y
similares. En muchas de estas aplicaciones, la glucosa se produce a
partir de la conversión enzimática de sustratos que contienen
almidón. El almidón se acumula como gránulos microscópicos en el
material vegetal y es insoluble en agua fría gracias a su naturaleza
parcialmente cristalina. Por ello, se han descrito muchos
procedimientos para la solubilización de los gránulos de almidón. En
particular, se han descrito muchos procedimientos para convertir
los sustratos que contienen almidón en alcohol, como por ejemplo el
etanol. Estos procedimientos incluyen el calentamiento directo o
indirecto antes de las fermentaciones (STARCH CHEMISTRY AND
TECHNOLOGY, Eds. R.L. Whistlert y col., 2ªEd., (1984) Academic Press
Inc,; STARCH CONVERSION TECHNOLOGY Eds., G.M.A. Van Beynumy col.,
Food Science and Technology Series, Marcel Dekker Inc, NY; y THE
ALCOHOL TEXTBOOK, 3ª Ed., Eds.K. Jacquesy col., (1999), Nottingham
University Press). Debido a los requisitos de temperatura, los
procedimientos directos e indirectos requieren un gasto energético.
En consecuencia, en la fermentación industrial y especialmente en
la fermentación alcohólica se ha prestado más atención a los
procesos de bajo coste energético para la hidrolización del almidón
granular. Los procesos de bajo coste energético reducen la
necesidad de utilizar etapas de energía intensa para cocción de
licuefacción (USP 4.514.496; Ueda y col., (1980) J. Ferment. Tech.,
25 58:237 - 242; Hany col., (1987) Biotechnol and Bioeng., 30:225
-232; patente internacional WO 03/066826; WO 03/068976; WO
04/106533; WO 04/081193; WO 05/052148; y patente americana US
2005/0266543). En los últimos años, se han introducido en el mercado
una serie de composiciones de enzimas nuevas capaces de hidrolizar
el almidón granular (no cocido) para producir glucosa fermentable en
procesos de fermentación de alcoholes, por ejemplo STARGEN
(Genencor International Inc.). Sin embargo, todavía son necesarios
más procedimientos y más eficaces para la conversión del almidón,
procedimientos que produzcan alcoholes y productos de desecho de
fermentación utilizables como los piensos de destilería.
La utilización de proteasas en las
fermentaciones de levadura han demostrado un aumento en el
rendimiento y la tasa de producción alcohólica de los sustratos de
almidón licuados (USP 5.231.017). Las proteasas NSP24 descritas
aquí no son únicamente proteasas nuevas sino también pueden
utilizarse para aumentar la producción de etanol a partir de
sustratos de almidón insolubles. Véase también la patente
internacional WO 2006/073839.
La presente invención hace referencia a las
utilizaciones de las proteasas NSP24 que tienen al menos un 85% de
identidad de secuencia con la ID SEC Nº:2 y de los fragmentos
biológicamente activos de lo mismo con al menos 250 residuos
aminoacídicos, en los procedimientos tal como se define en las
reivindicaciones.
En un aspecto, la invención hace referencia a la
utilización de composiciones de la mencionada proteasa NSP24 en la
hidrólisis de sustratos que contienen almidón insoluble, como granos
y/o componentes fraccionados de lo
mismo.
mismo.
En otro aspecto, la invención hace referencia a
la utilización de composiciones de dicha proteasa NSP24 en la
producción de etanol a partir de fermentaciones de levaduras.
En otro aspecto, la invención hace referencia a
un procedimiento para la producción de etanol que comprende la
sacarificación de un sustrato de almidón insoluble molido con una
composición de una enzima hidrolizante del almidón granular y dicha
proteasa NSP24 a una temperatura por debajo de la temperatura de
gelatinización del almidón del sustrato y de la fermentación del
sustrato de almidón sacarificado en condiciones de fermentación
adecuadas para producir al menos un 8% de etanol v/v.
En otro aspecto, la invención hace referencia a
un procedimiento para aumentar la producción de etanol en una
fermentación sin cocción que comprende el contacto de un sustrato de
almidón insoluble y molido con una enzima hidrolizante de almidón
granular, la proteasa NSP24, y un microorganismo fermentador en
condiciones de fermentación adecuadas a una temperatura por debajo
de la temperatura de gelatinización del almidón del sustrato para
producir etanol, en donde la tasa de producción de etanol está
aumentada en comparación con un procedimiento esencialmente similar
al producido sin la proteasa NSP24.
En otro aspecto, la invención hace referencia a
un procedimiento para la producción de etanol en una sacarificación
y fermentación simultáneas sin cocción, que incluye sustratos de
granos molidos con adición de la proteasa mencionada NSP24 para la
sacarificación y fermentación simultáneas.
En otro aspecto, la invención hace referencia a
un procedimiento para disminuir la cantidad de almidón residual
producido por la fermentación de sustratos que contienen almidón
granular, dicho procedimiento comprende la fermentación del
sustrato que contiene almidón granular con la proteasa NSP24
mencionada, una enzima hidrolizante del almidón granular y un
microorganismo fermentador, en donde el sustrato que contiene el
almidón granular no se cuece y como resultado se obtiene un caldo
fermentado en donde el % de almidón residual en el caldo se ha
reducido en comparación con la cantidad residual de almidón obtenida
a partir de un procedimiento esencialmente similar sin la proteasa.
En algunas realizaciones, el almidón residual será inferior al
15%.
En otro aspecto, la invención hace referencia a
un procedimiento para la producción de etanol que comprende el
pretratamiento de un lodo de almidón a una temperatura de
aproximadamente 68ºC a 35ºC durante un periodo de aproximadamente
30 minutos a 5 horas, la fermentación del lodo con una composición
con levaduras, las enzimas hidrolizantes del almidón granular y la
proteasa mencionada NSP24 durante un periodo de 12 a 96 horas a una
temperatura de entre 10ºC y 50ºC para producir etanol. En algunas
realizaciones, el etanol se recupera de la fermentación. En otras
realizaciones, el pretratamiento incluye enzimas adicionales, como
la glucoamilasa, las alfa-amilasas, las proteasas o
combinaciones de lo mismo.
La Fig.1 ilustra la secuencia nucleotídica de
NSP24 (NºID SEC:1) (Fig. 1A) y la secuencia aminoacídica predicha
(NSP24, Nº ID SEC:2) codificada por nsp24 (Fig. 1B), en donde
la secuencia intrónica del gen putativo se identifica en negrita en
la Fig. 1B, la secuencia líder está en negrita, la preprosecuencia
está subrayada y la secuencia de proteína madura NSP24, que se
representa por el Nº ID SEC:3 se inicia con KYGAPIS.
Las Figs. 2A-D ilustran la
secuencia nucleotídica (NºID SEC:4) del clon de ADNc pTrex3g_NSP24
obtenido de Trichoderma reesei. La secuencia génica NSP24
está subrayada y la secuencia del intrón del gen putativo se
identifica en negrita.
La Fig.3 ilustra el vector pTrex3g_NSP24 y las
localizaciones de las dianas de restricción a lo largo de la
secuencia nucleotídica de la Fig. 2.
La Fig. 4 ilustra el efecto de los niveles
distintos de proteasa NSP24 sobre la producción de etanol en %
(v/v) en condiciones de fermentación sin cocción con maíz triturado
y desgerminado.
La Fig.5 ilustra el efecto de NSP24 sobre la
producción el de alcohol en % (v/v) a las 72 horas en fermentaciones
de levaduras sin cocción con endospermo de maíz fraccionado y
diversos niveles de vinazas recicladas en referencia al ejemplo
5.
La Fig. 6 ilustra el efecto de NSP24 (0,7 SAPU/g
ds) sobre la producción de alcohol en % (v/v) a las 72horas en las
fermentaciones de levaduras sin cocción con niveles distintos de
(%DS) de endospermo de maíz fraccionado en referencia al ejemplo
6.
La invención se describe a continuación con
detalle mediante las siguientes definiciones y ejemplos.
La práctica de la presente invención utilizará,
salvo que se indique lo contrario, técnicas convencionales de
biología celular, cultivo celular, biología molecular, biología
transgénica, microbiología, ADN recombinante e inmunología, que se
hallan dentro de las competencias de la materia. Dichas técnicas se
describen en la literatura. Véase, por ejemplo, Molecular Cloning A
Laboratory Manual, 2ª Ed., ed. por Sambrook, Fritsch y Maniatis
(Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); Kriegler, Gene
Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); B. Perbal, A
Practical Guide To Molecular Cloning (1984); el tratado, Methods In
Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Methods In Enzymology,
Vols. 154 y 155 (Wuy col. eds.). También, la información
correspondiente a los procedimientos de preparación, expresión,
aislamiento y utilización de proteasas puede obtenerse de la
revisión de la patente americana U.S. 6.768.001.
Otras características y ventajas de la invención
serán evidentes a partir de la descripción detallada siguiente, y
de las reivindicaciones. Aunque pueden utilizarse procedimientos y
materiales similares a los descritos aquí en la práctica o análisis
de la presente invención, se describen aquí los procedimientos y
materiales preferidos.
Salvo que se indique lo contrario, todos los
términos científicos y técnicos utilizados aquí tienen el mismo
significado que el comúnmente conocido por un experto en la materia
a quien pertenece dicha invención. Singleton y col., DICTIONARY OF
MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2ª ED., John Wiley and Sons, New
York (1994), y Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF
BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991) proporcionan una herramienta
\hbox{valiosa con diccionarios generales de muchos de los
términos utilizados en la presente invención.}
Los encabezamientos proporcionados aquí no son
limitaciones de los diversos aspectos o realizaciones de la
invención, los cuales pueden hacer referencia a la especificación
como un todo. Según ello, los términos definidos inmediatamente más
abajo están más completamente definidos por referencia a la
especificación como un todo.
Los intervalos numéricos incluyen los números de
definición del intervalo.
Salvo que se especifique lo contrario, los
ácidos nucleicos se escriben de izquierda a derecha en orientación
5' a 3'; las secuencias aminoacídicas se escriben de izquierda a
derecha en la orientación amino a carboxi, respectivamente.
Debería remarcarse que, tal como se utiliza en
esta especificación y las reivindicaciones anexadas, las formas
singulares "un", y "el" incluyen las referencias plurales
salvo que específicamente se indique lo contrario. Así, por
ejemplo, la referencia a una composición que comprende "un
compuesto" incluye una mezcla de dos o más compuestos. Debería
remarcarse que el término "o" se utiliza generalmente en el
sentido que incluye "y/o" salvo que se especifique lo
contrario.
"Proteasa" hace referencia una proteína o
dominio polipeptídico de una proteína o polipéptido derivado de un
microorganismo, por ejemplo, un hongo, una bacteria, o de una planta
o animal, que tiene la capacidad para catalizar la hidrólisis de
los enlaces peptídicos en una o más posiciones de un esqueleto
proteico (por ejemplo, E.C. 3.4).
Una "proteasa ácida" hace referencia a una
proteasa que tiene la capacidad para hidrolizar proteínas en
condiciones ácidas.
Tal como se utilizó aquí, "una proteasa
NSP24" significa una enzima que tiene actividad proteasa y que
tiene al menos un 85% de identidad de secuencia con la secuencia Nº
ID SEC:2 o fragmentos de lo mismo activos biológicamente que tienen
al menos 250 residuos aminoacídicos. El término "NSP24"
significa la proteasa que tiene el Nº ID SEC:2 o Nº ID SEC:3.
Un "fragmento activo biológicamente" (es
decir, un fragmento activo biológicamente de NSP24) significa un
fragmento de polipéptido que tiene actividad proteasa y uno o más
residuos aminoacídicos delecionados del extremo amino y/o carboxilo
de una secuencia de proteasa NSP24.
El término "aislado" o "purificado"
hace referencia a una proteasa que se ha alterado de su estado
natural en virtud de la separación de la proteasa de uno o más
constituyentes naturales con los que se halla asociada en la
naturaleza.
Los términos "péptidos", "proteínas",
y "polipéptidos" se utilizan aquí de forma intercambiable.
Tal como se utiliza aquí, "porcentaje de
identidad de secuencia (%)" respecto a las secuencias
aminoacídicas o nucleotídicas identificadas se definen como el
porcentaje de los residuos aminoacídicos o los nucleótidos en una
secuencia candidata que son idénticos con los residuos aminoacídicos
o los nucleótidos en una secuencia de interés, después del
alineamiento de las secuencias y de la introducción de huecos, si
fuera necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de
secuencia, y no se considera cualquier sustitución conservada como
parte de la identidad de secuencia.
Tal como se utiliza aquí, el término
"composición enzimática hidrolizante de almidón granular" o
"enzima hidrolizante de almidón granular" significa una
composición enzimática capaz de hidrolizar el almidón en la forma
granular. Las composiciones pueden consistir en una enzima o una
combinación de enzimas.
Tal como se utiliza aquí el término
"alfa-amilasa (por ejemplo, E.C. clase
3.2.1.1)" hace referencia a enzimas que catalizan la hidrólisis
de las uniones alfa-1,
4-glucosídicas. También se ha descrito que estas
enzimas afectan la hidrólisis de forma exógena o endógena de los
enlaces
1,4-\alpha-D-glucosídicas
en los polisacáridos que contienen unidades de
D-glucosa unidas por 1,4-\alpha.
Otro término utilizado para describir estas enzimas es la
"glicogenasa". Ejemplos de enzimas incluyen la
alfa-1,4-glucan
4-glucanohidrasa glucanohidrolasa.
Tal como se utiliza aquí, el término
"glucoamilasa" hace referencia a la clase de enzimas de
aminoglucosidass (por ejemplo, E.C. 3.2.1.3, glucoamilasa, 1,
4-alfa-D-glucan
glucohidrolasa). Estas son exoenzimas, o enzimas que actúan
exógenamente a su producción, que liberan los residuos glucosil de
los extremos no reductores de moléculas de amilosa y amilopectina.
La enzima también hidroliza los enlaces alfa-1, 6 y
alfa-1,3 aunque a una velocidad mucho menor que
enlaces alfa-1,4.
Tal como se utiliza aquí "GAU" hace
referencia a una unidad de glucoamilasa, que es la cantidad de
enzima que producirá 1 g de azúcar reductor calculado como la
glucosa por hora a partir de un sustrato de almidón soluble a pH
4,2 y a 60ºC.
Tal como se utiliza aquí, "SAPU" hace
referencia a una unidad espectrofotométrica de proteasa ácida, en
donde 1 SAPU es la cantidad de actividad enzimática de proteasa que
libera un micromol de tirosina por minuto de un sustrato de caseína
en las condiciones del ensayo.
Tal como se utiliza aquí, "SSU" hace
referencia a una unidad de almidón soluble, 1 SSU equivale al polvo
reductor de 1 mg de glucosa liberada por minuto en las condiciones
de incubación especificadas.
Tal como se utiliza aquí "almidón" hace
referencia a cualquier material compuesto de carbohidratos de
polisacáridos complejos de plantas compuestos de amilosa y
amilopectina con la fórmula (C_{6}H_{10}O5)X, en donde X
puede ser cualquier número.
El término "almidón insoluble" y "almidón
granular" se utilizan de forma intercambiable y hacen referencia
a almidón no cocido (crudo) (por ejemplo, almidón que no se ha
sometido a gelatinización).
Tal como se utiliza aquí el término
"gelatinización" quiere decir solubilización de una molécula de
almidón mediante cocción para formar una suspensión viscosa.
El término "almidón residual" hace
referencia al almidón restante (soluble o insoluble) que queda en
el caldo de fermentación de un sustrato que contiene almidón.
El término "temperatura de gelatinización"
hace referencia a la temperatura a la cual se inicia la
gelatinización. La temperatura exacta de gelatinización depende del
sustrato y puede variar dependiendo de factores como la especie
vegetal y del entorno y de los factores de crecimiento.
El término "por debajo de la temperatura de
gelatinización" hace referencia a una temperatura que es
inferior a la temperatura a la cual se inicia la gelatinización.
Tal como se utiliza aquí el término
"licuefacción" hace referencia al estadio de conversión del
almidón en el cual se hidroliza el almidón para proporcionar
dextrinas solubles de bajo peso molecular.
Tal como se utiliza aquí el término
"sacarificación" hace referencia a la conversión enzimática de
almidón a glucosa.
Tal como se utiliza aquí el término "almidón
soluble" o "hidrolizado de almidón soluble" hace referencia
a productos solubles que resultan de la hidrólisis del almidón, que
pueden comprender mono-, di- y oligo-sacáridos (por
ejemplo, glucosa, maltosa y azúcares superiores).
El término "molienda" hace referencia a la
rotura de sustratos que comprenden almidón (por ejemplo, granos de
cereales) para generar partículas más pequeñas. En algunas
realizaciones, el término se utiliza de forma intercambiable con
trituración.
El término "grano fraccionado" hace
referencia a granos de la planta, de modo que sólo se incluye una
porción del grano.
El término producto final hace referencia a
cualquier fuente de carbono derivada del producto molecular que se
convierte enzimáticamente a partir de un sustrato de almidón.
El término "conversión enzimática" hace
referencia a la modificación de un substrato por la acción de la
enzima.
El término "polisacárido" hace referencia a
un compuesto que tiene múltiples unidades de monosacáridos unidas
en una cadena lineal o ramificada. En algunas realizaciones, el
término hace referencia a cadenas largas con cientos o miles de
unidades de monosacáridos. Ejemplos típicos de polisacáridos son el
almidón, la celulosa y el glicógeno.
El término "monosacárido" hace referencia a
una unidad monomérica de un polímero como un almidón donde el grado
de polimerización (DP) es 1 (por ejemplo, glucosa, manosa, fructosa
y galactosa).
El término "disacárido" hace referencia a
un compuesto que comprende dos unidades de monosacáridos unidas
covalentemente (DP2) (por ejemplo, sacarosa, lactosa y maltosa).
El término "DP3+" hace referencia a
polímeros con un grado polimerización superior a 3.
El término "oligosacárido" hace referencia
a un compuesto que tiene de 2 a 10 unidades de monosacárido unidas
por enlaces glicosídicos.
El término "contenido en sólido seco" (SS o
ss) hace referencia a los sólidos totales de una pasta en % sobre
la base en peso seco.
Los términos "residuos desecados de destilería
con solubles" (DDGS, por sus siglas en inglés) hacen referencia
a la utilidad de subproductos de los procesos de fermentación del
grano.
El término "promotor" hace referencia a una
secuencia reguladora implicada en la unión de la RNA polimerasa
para iniciar la transcripción de un gen.
Un "promotor heterólogo", tal como se
utiliza aquí es un promotor que no está asociado de forma natural
con un gen o un ácido nucleico purificado.
Una "preparación purificada" o una
"preparación esencialmente pura" de un polipéptido, tal como se
utiliza aquí, hace referencia a un polipéptido que se ha separado
de otras proteínas, lípidos y ácidos nucleicos con los que se halla
de forma natural.
Una "preparación purificada de células",
tal como se utiliza aquí, hace referencia a, en el caso de células
vegetales o animales, a una preparación in vitro de células y
no a una planta o animal entero. En el caso de células en cultivo o
de células microbianas, consiste en una preparación de al menos el
10% y más preferentemente el 50% de las células en cuestión.
Un "ácido nucleico esencialmente puro", por
ejemplo, un ADN esencialmente puro, es un ácido nucleico que es uno
o ambos de los siguientes: no inmediatamente contiguo con una o
ambas de las secuencias, por ejemplo, secuencias codificantes, con
las que es inmediatamente contiguo (por ejemplo, uno en el extremo
5' y otro en el extremo 3') en el genoma natural del organismo del
cual deriva el ácido nucleico; o que está esencialmente libre de
una secuencia de ácido nucleico del organismo del cual se deriva
dicho ácido nucleico. El término incluye, por ejemplo, un ADN
recombinante que se incorpora en un vector, por ejemplo, en un
plásmido de replicación autónoma o un virus, o en el ADN genómico
de un procariota o eucariota, o que existe como una molécula
separada (por ejemplo, un ADNc o un fragmento de ADN producido por
PCR o un tratamiento con una endonucleasa de restricción) e
independiente de otras secuencias de ADN. ADN esencialmente puro
también incluye un ADN recombinante que es parte de un gen híbrido
que codifica una secuencia de proteasa NSP24 adicional.
"Homólogo", tal como se utiliza aquí, hace
referencia a la similitud de secuencia entre dos moléculas de
polipéptidos o entre las dos moléculas de ADN. Si una posición en
ambas secuencias comparadas está ocupada por la misma base o
subunidad monomérica de aminoácido, por ejemplo, si una posición en
cada unas de las dos moléculas se ocupa por adenina, entonces las
moléculas son homólogas en dicha posición. El porcentaje de
homología entre las dos secuencias es una función del número de
concordancia o de posiciones homólogas compartidas por las dos
secuencias divididas por el número de posiciones x 100. Por
ejemplo, si 6 de 10, de las posiciones en las dos secuencias
concuerdan o son homólogas con las dos secuencias, entonces existe
un 60% de homología. A modo de ejemplo, las secuencias de ADN
ATTGCC y TATGGC comparten el 50% de homología. Por lo general, una
comparación se genera cuando las dos secuencias se alinean para
proporcionar la máxima homología.
Tal como se utiliza aquí, el término
"vector" hace referencia a una secuencia polinucleotídica
diseñada para introducir ácidos nucleicos en uno o más tipos
celulares. Los vectores incluyen los vectores de clonaje, los
vectores de expresión, los vectores lanzadera, los plásmidos, las
partículas fágicas, los casetes y similares.
Tal como se utiliza aquí, los "vectores de
expresión" se refieren a una construcción de ADN que incluye una
secuencia de ADN que está operativamente unida a una secuencia
control capaz de influir en la expresión del ADN en un huésped
adecuado.
El término "expresión" hace referencia al
proceso por el cual se produce un polipéptido según la secuencia
del ácido nucleico de un gen.
Tal como se utiliza aquí, "unido
operativamente" significa que una región reguladora, como un
promotor, un terminador, una secuencia señal de secreción o una
región intensificadora de la transcripción se une a o se engarza
con un gen estructural y controla la expresión de dicho gen.
Tal como se utiliza aquí, una sustancia (por
ejemplo, un polinucleótido o una proteína) "derivado de "un
microorganismo quiere decir que la sustancia es nativa para el
microorganismo.
Tal como se utiliza aquí, "microorganismo"
hace referencia a una bacteria, un hongo, un virus, un protozoo, y
otros microbios u organismos microscópicos.
Tal como se utiliza aquí, "cepa huésped" o
"célula huésped" significa un huésped adecuado para un vector
de expresión que incluye un ADN de acuerdo con la presente invención
e incluye la progenie de dichas células.
El término "hongo filamentoso" hace
referencia a todas las formas filamentosas de la subdivisión
Eumicotina (véase, Alexopoulos, C. J. (1962), INTRODUCTORY
MYCOLOGY, Wiley, New York y AINSWORTH AND BISBY DICTIONARY OF THE
FUNGI, 9th Ed. (2001) Kirky col., Eds., CAB International University
Press, Cambridge UK). Estos hongos se caracterizan por tener un
micelio vegetativo con una pared celular compuesta de quitina,
celulosa y otros polisacáridos complejos. Los hongos filamentosos
de la presente invención son morfológica, fisiológica y
genéticamente distintos a las levaduras. El crecimiento vegetativo
de los hongos filamentosos se produce por la elongación de las
hifas y el metabolismo del carbono es obligatoriamente aeróbico.
Tal como se utiliza aquí, el término
"Trichoderma" o "Trichoderma sp." hacen
referencia a cualquier género fúngico clasificado con anterioridad
o en la actualidad como Tricoderma.
La frase "sacarificación y fermentación
simultánea (SSF)" hace referencia a un proceso en la producción
de alcoholes en los que un organismo microbiano, como los
microorganismos productores de etanol y por lo menos una enzima
como la enzima hidrolizante del almidón granular se hallan en la
misma etapa del proceso.
Tal como se utiliza aquí, "microorganismo
productor de etanol" hace referencia a un microorganismo o
célula con la capacidad para convertir un azúcar u oligosacárido en
etanol. Ejemplos de microorganismos productores de etanol incluyen
los microorganismos fúngicos como la levadura. Una levadura
preferida incluye las cepas de Saccharomyces, en particular
S. cerevisiae.
Tal como se utiliza aquí, el término
"cultivo" hace referencia al crecimiento de una población de
células microbianas en condiciones adecuadas en un medio líquido o
sólido. En una realización, el cultivo hace referencia a la
bioconversión fermentativa de un sustrato de almidón, por ejemplo la
conversión de un sustrato que contiene almidón granular en un
producto final (generalmente en un recipiente o reactor). La
fermentación es la descomposición enzimática y anaeróbica de
sustancias orgánicas por microorganismos para producir compuestos
orgánicos más simples. Aunque la fermentación tiene lugar en
condiciones anaeróbicas no se debe considerar que el término se
limite únicamente a condiciones anaeróbicas, ya que la fermentación
también puede tener lugar en presencia de oxígeno.
Tal como se utiliza aquí, el término
"contacto" hace referencia a la colocación de la
enzima(s) respectiva(s) a la suficiente proximidad
del sustrato respectivo para permitir que la enzima(s)
convierta el sustrato en el producto final. Los expertos en la
materia, reconocerán que el mezclado de las soluciones de enzimas
con los sustratos respectivos puede facilitar el contacto.
El término "introducido" en el contexto de
inserción de una secuencia de ácido nucleico en una célula,
significa "transfección", o "transformación" o
"transducción" e incluye la referencia a la incorporación de
una secuencia de ácido nucleico en una célula eucariota o procariota
en donde la secuencia de ácido nucleico puede incorporarse en el
genoma de la célula (por ejemplo, ADN cromosómico, plasmídico,
plastídico, o mitocondrial), convertido en un replicón autónomo, o
expresado de forma transitoria (por ejemplo, ARNm transfectado).
Tal como se utiliza aquí, los términos
"transformados", "transformado establemente" y
"transgénico" utilizados en referencia a una célula significa
que la célula tiene una secuencia de ácido nucleico no nativa (por
ejemplo, heteróloga) integrada en su genoma o como un plásmido
episomal que se mantiene a través de múltiples generaciones.
Tal como se utiliza aquí, el término
"heterológo" en referencia a un polipéptido o polinucleótido
significa un polipéptido o polinucleótido que no ocurre de forma
natural en una célula huésped.
El término "sobreexpresión" significa el
proceso de expresión de un polipéptido en una célula huésped en
donde un polinucleótido se ha introducido en la célula huésped.
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Se describen aquí las proteasas NSP24 que en
algunas realizaciones son proteasas ácidas, como las proteasas
fúngicas y que son útiles en los procedimientos de la invención, tal
como se define en las reivindicaciones. La proteasa NSP24 tiene por
lo menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%,
al menos un 97%, al menos un 98% y al menos un 99% de identidad de
secuencia con la secuencia aminoacídica de Nº ID SEC:2 y los
fragmentos activos biológicamente de los mismo, que tienen al menos
25 residuos aminoacídicos.
En algunas realizaciones, la proteasa NSP24 es
una proteasa que tiene por lo menos un 95% de identidad de
secuencia con Nº ID SEC:2 y los fragmentos activos biológicamente
tienen al menos 250 residuos aminoacídicos. En algunas
realizaciones, la proteasa NSP24 se denomina NSP24 y tiene la
secuencia de Nº ID SEC:2 o NºISD SEC:3, la cual es un fragmento
activo biológicamente de Nº ID SEC:2.
En algunas realizaciones, la proteasa NSP24 es
un fragmento biológicamente activo de una proteasa que tiene al
menos un 90% de identidad de secuencia con el NºID SEC:2, que tiene
al menos 250 residuos aminoacídicos, al menos 300 residuos
aminoacídicos, al menos 350 residuos aminoacídicos, al menos 375
residuos aminoacídicos, y también al menos 400 residuos
aminoacídicos.
En otra realización, los fragmentos
biológicamente activos incluyen al menos un 70%, al menos un 80%,
al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 93%,al menos un 95%,
al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% de una secuencia
polipeptídica con al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un
93%,al menos un 95%, al menos un 97, al menos un 98, al menos un
99% de identidad de secuencia con la secuencia proteica del Nº ID
SEC:2. En algunas realizaciones, la proteasa NSP24 comprenderá al
menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al
menos un 95%, al menos un 98% de una secuencia polipeptídica con al
menos un 95% de identidad de secuencia con el Nº ID SEC:2.
En algunas realizaciones, los fragmentos activos
biológicamente son fragmentos que existen in vivo, por
ejemplo, fragmentos que proceden del procesamiento transcripcional o
que derivan de la traducción de ARNs ayustados alternativamente.
Los fragmentos incluyen aquellos expresados en células endógenas o
nativas, por ejemplo, como resultado de un procesamiento
post-traduccional, por ejemplo, como resultado de la
eliminación de una secuencia señal amino-terminal,
así como los producidos en sistemas de expresión, por ejemplo, en
células CHO. Los fragmentos activos biológicamente pueden generarse
mediante corte proteolítico o sucesos de ayuste alternativo.
En algunas realizaciones, un fragmento activo
biológicamente comprenderá al menos un 20%, al menos un 30%, al
menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al
menos un 80%, al menos un 90%, al menos un 95% y al menos un 100%
de la actividad proteasa de la proteasa NSP24 con el Nº ID SEC:2. En
algunas realizaciones preferidas, un fragmento posee al menos un
40% o al menos un 90% de la actividad proteasa de la proteasa NSP24
del Nº ID SEC:2 en cualquier ensayo de la proteasa in vivo o
in vitro.
Los fragmentos NSP24 pueden generarse mediante
procedimientos conocidos por los expertos en la materia. La
capacidad de un candidato para presentar una actividad biológica de
una proteasa puede valorarse mediante procedimientos conocidos por
los expertos en la materia tal como se describe aquí.
También se describen los análogos de proteasas.
Los análogos son aquellas modificaciones que aumentan la
estabilidad peptídica; dichos análogos pueden contener, por ejemplo,
uno o más enlaces no-peptídicos (que reemplazan los
enlaces peptídicos) en las secuencias peptídicas. También se
incluyen: los análogos que incluyen residuos distintos a los
L-aminoácidos naturales, por ejemplo, los
D-aminoácidos o los aminoácidos no naturales o
sintéticos, por ejemplo, b o aminoácidos; y análogos cíclicos. Los
análogos pueden diferir de las proteasas que ocurren de forma
natural, como la NSP24 con el Nº ID SEC:2 o el Nº ID SEC:3, en la
secuencia aminoacídica o de forma que no implique la secuencia, o
en ambas. Las modificaciones incluyen la derivatización química
in vivo e in vitro de las proteasas abarcadas por la
invención. Las modificaciones que no implican la secuencia incluyen
cambios en la acetilación, la metilación, la fosforilación, la
carboxilación o la glicosilación. Las proteasas NSP24 aquí
descritas pueden incluir sustituciones de aminoácidos conservados
que utilicen L-aminoácidos, en donde un aminoácido
se reemplaza por otro aminoácido biológicamente similar. Ejemplos no
limitantes de reemplazamientos conservados incluyen Gly/Ala;
Val/Ile/Leu; Lys/Arg; Asn/Gln; Glu/Asp; Ser/Cys/Thr; y
Phe/Trp/Tyr.
También se describen aquí las secuencias
polinucleotídicas que codifican las proteasas NSP24 de utilidad en
los procedimientos de la invención. Algunos de los polinucleótidos
incluyen: a) polinucleótidos que codifican una proteasa NSP24 que
tiene al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 93%, al menos un
95%, al menos un 97%, al menos un 98%, y al menos un 99% de
identidad de secuencia con el Nº ID SEC:2 o el Nº ID SEC:3; b) los
polinucleótidos que codifican la secuencia de NºID SEC:2; c) un
polinucleótido que tiene la secuencia 30 de Nº ID SEC:1; d)
polinucleótidos que codifican un fragmento activo biológicamente de
una proteasa NSP24; e) polinucleótidos que tienen al menos un 80%,
al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 97%,
al menos un 98% y al menos un 99% de identidad de secuencia con Nº
ID SEC:1; y f) polinucleótidos que hibridan con una sonda de ácido
nucleico correspondiente con la secuencia de ADN de NºID SEC:1 o un
fragmento de Nº ID SEC:1, dicho fragmento tiene al menos 10, 15,
20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o 150 nucleótidos
conservados.
Debido a la degeneración del código genético,
puede utilizarse más de un codón para codificar un aminoácido
determinado. En consecuencia, secuencias de ADN distintas pueden
codificar un polipéptido que tenga la misma secuencia aminoacídica
que el polipéptido de, por ejemplo, el NºID SEC:2. Se describen aquí
polinucleótidos que codifican el mismo polipéptido.
Un ácido nucleico se hibrida con otra secuencia
de ácido nucleico cuando una forma de cadena sencilla del ácido
nucleico puede hibridarse con otro ácido nucleico en las condiciones
adecuadas de temperatura y fuerza iónica. Las condiciones de
hibridación y lavado son bien conocidas en la materia para la
hibridación a bajas, media y alta astringencia (véase, por ejemplo,
Sambrook (1989) supra, en particular los capítulos 9 y
11).
La homología o el porcentaje de identidad de
secuencias pueden determinarse mediante programas informáticos. Los
procedimientos para el alineamiento de secuencias y la determinación
de identidad de secuencias son conocidos por el artesano en la
materia y pueden realizarse sin demasiada experimentación. Véase,
por ejemplo, Ausubely col., (1995) Current Protocols in Molecular
Biology, capítulo. 19 (Greene Publishing and Wiley- Interscience,
NY) el programa ALIGN (Dayhoff (1978) en Atlas of Protein Sequence
and Structure 5: Supl. 3 (National Biomedical Research Foundation,
Washington DC). Están disponibles diversos algoritmos para el
alineamiento de secuencias y la determinación de la identidad de
secuencias (véase, Needlemany col., (1970) J. Mol. Biol. 48:443;
Smithy col., (1981) Adv. Appl. Math 2:482; Pearsony col., 91988)
Proc. Natl. Acad. Sci 85:2444 y los algoritmos BLASTP, BLASTN y
BLASTX). Diversos programas informáticos son conocidos por los
expertos en la materia incluyendo pero sin limitarse a ALIGN o
Megalign (DNASTAR); WU-BLAST-2; GAP;
BLAST; BESTFIT (Altschul y col., (1996) Meth. Enzyme 266:460 -
480); FASTA and TFASTA (GCG Version B, Madison, WI) y CLUSTRAL
(Intelligenetics).
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Tal como se describe aquí los polinucleótidos
que codifican las proteasas NSP24 para utilizar en la invención
pueden introducirse en las células huésped. El polinucléotido puede
codificar una proteasa endógena que se sobreexpresa en la célula
huésped. Algunas células huésped preferidas de células huésped de
hongos filamentosos incluyen Trichoderma spp. (por ejemplo,
T. viride y T. reesei, la forma asexual de Hypocrea
jecorina, anteriormente clasificada como T.
longibrachiatum), Penicillium spp., Humicola spp.
(por ejemplo, H. insolens y H. grisea),
Aspergillus spp. (por ejemplo, A. niger, A. nidulans, A.
orzyae, y A. awamori), Fusarium spp. (F.
graminum), Neurospora spp., Hypocrea spp. Y
Mucor spp. Further, las células huésped pueden incluir
Bacillus spp (por ejemplo, B. subtilis, B. licheniformis,
B. lentus, B. stearothremophilus y B. brevis) y
Streptomyces spp. (por ejemplo, S. coelicolor y S.
lividans (TK23 and TK21)).
Los vectores y las construcciones de ADN que
comprenden polinucleótidos que codifican la proteasa NSP24
abarcadas por la invención comprenden las secuencias promotoras de
los genes, por ejemplo de hongos filamentosos que se clonan
típicamente en las células huésped, como Trichoderma reesei
para su replicación y/o su expresión. Estos vectores intermediarios
son típicamente vectores procariotas, por ejemplo, plásmidos, o
vectores lanzadera.
Para obtener un nivel elevado de expresión de un
gen clonado, el gen heterólogo se coloca preferentemente a la misma
distancia del promotor tal como ocurre de forma natural. Sin
embargo, tal como se conoce en la materia, es posible acomodar
cierta variación en esta distancia sin pérdida de función promotora.
Los expertos en la materia son conscientes de que un promotor
natural puede modificarse por reemplazamiento, sustitución, adición
o eliminación de uno o más nucleótidos sin alterar su función. La
práctica de la invención abarca y no está restringida por dichas
alteraciones en el promotor.
La construcción en un vector de expresión
contiene en general una unidad de transcripción o un casete de
transcripción que contiene todos los elementos adicionales
requeridos para la expresión de la secuencia heteróloga. Un casete
de expresión típico contiene por ello un promotor unido
operativamente a la secuencia de ácido nucleico y las señales
requeridas para una poliadenilación eficiente del tránscrito, para
los sitios de unión al ribosoma y para la finalización de la
traducción. Los elementos adicionales de la casete pueden incluir
intensificadores de la transcripción y, si se utiliza ADN genómico
como gen estructural, intrones con sitios funcionales donante y
aceptor de
ayuste.
ayuste.
La práctica no está restringida por la elección
de un promotor en la construcción genética. Sin embargo, ejemplos
de promotores son el de Trichoderma reesei cbh1, cbh2, eg1,
eg2, eg3, eg5, xln1 y xln2. También los promotores de los genes de
la glucoamilasa de A. awamori y A. niger glucoamylase
(glaA) (Nunberg y col., (1984) Mol. Cell Biol. 4:2306 - 2315) y el
promotor de A. nidulans acetamidase se utilizan en los
vectores. Un promotor preferido para vectores que se utiliza en
Bacillus subtilus es el promotor AprE; un promotor preferido
utilizado en E. coli es el promotor Lac, un promotor
preferido utilizado en Saccharomyces cerevisiae es PGK1, un
promotor preferido utilizado en Aspergillus niger es glaA, y
un promotor preferido para Trichoderma reesei es cbhI.
Además de una secuencia promotora, el casete de
expresión debería también contener una región de finalización de la
transcripción cadena abajo del gen estructural para proporcionar una
finalización eficiente. La región de finalización puede obtenerse a
partir del mismo gen al igual que la secuencia promotora o puede
obtenerse de genes distintos.
Aunque cualquier terminador fúngico es
seguramente funcional, algunos terminadores preferidos incluyen: el
terminador del gen trpC de Aspergillus nidulans (Yelton, M. y
col., (1984) PNAS USA 81:1470-1474, Mullaney, E.J.
y col. (1985) MGG 199:37-45), un terminador de genes
de Aspergillus awamori o Aspergillus niger
glucoamylase (Nunberg, J.H. y col. (1984) Mol. Cell Biol.
4:2306, Boel, E. y col.(1984) EMBO J. 3:1581-1585),
el terminador del gen de la amilasa TAKA de Aspergillus oryzae
amylase, y el terminador del gen de la
carboxil-proteasa de Mucor miehei (EPO No. 0
215 594).
El vector de expresión particular utilizado para
transportar la información genética en la célula no es
particularmente crítico. Puede utilizarse cualquiera de los vectores
convencionales utilizados para la expresión en células eucariotas o
procariotas. Los vectores de expresión bacteriana estándares
incluyen los bacteriófagos 1 y M13, así como los plásmidos
derivados de pBR322, pSKF, pET23D y los sistemas de expresión como
MBP, GST y LacZ. Las etiquetas epitópicas también pueden añadirse a
proteínas recombinantes para proporcionar procedimientos adecuados
de aislamiento, por ejemplo, c-myc. Ejemplos de
vectores de expresión adecuada y/o integración se proporcionan por
Sambrook y col., (1989) supra, Bennett y Lasure (Eds.) More
Gene Manipulations in Fungi, (1991) Academic Press pp. 70 - 76 and
pp. 396 - 428 y los artículos allí citados; USP 5.874.276 y Fungal
Genetic Stock Center Catalogue of Strains, (FGSC, www. fgsc.
net.).
Es posible obtener vectores de utilidad de
Promega e Invitrogen. Algunos vectores específicos incluyen pBR322,
pUC18, pUC100, pDON^{TM}201, pENTR^{TM}, pGEN®3Z y pGEN®4Z. Sin
embargo, la descripción pretende incluir otras formas de vectores
de expresión que sirvan funciones equivalentes y que son, o serán,
conocidos en la materia. Por ello, es posible utilizar una gran
variedad de combinaciones de huésped/vectores de expresión para la
expresión de las secuencias de ADN descritas aquí. Vectores de
expresión de utilidad pueden, por ejemplo, consistir en segmentos
de secuencias de ADN cromosómico, no cromosómico y sintéticas como
los derivados de SV40 y plásmidos de bacterias conocidos, por
ejemplo, plásmidos de E. coli incluyendo col E1, pCR1,
pBR322, pMb9, pUC19 y sus derivados, amplio abanico de plásmidos y
huéspedes, por ejemplo RP4, ADNs de fagos, por ejemplo, derivados
del fago lambda, por ejemplo NM989, y otros fagos de ADN, por
ejemplo M13 y fagos filamentosos de ADN de cadena sencilla,
plásmidos de levaduras como el plásmido 2 \mu o derivados de lo
mismo.
En algunos casos, un vector de expresión incluye
un marcador seleccionable. Ejemplos de marcadores seleccionables
incluyen aquellos que confieren resistencia antimicrobiana. Los
marcadores nutricionales también hallan una utilidad incluyendo
aquellos marcadores conocidos en la materia como amdS, argB y pyr4.
Los marcadores de utilidad para la transformación de
Trichoderma son conocidos en la materia (véase, por ejemplo,
Finkesltein, capítulo 6, en Biotechnology of Filamentous Fungi,
Finkelstein y col., EDS Butterworth-Heinemann,
Boston MA (1992) y Kinghorn y col., (1992) Applied Molecular
Genetics of Filamentous Fungi, Blackie Academic and Professional,
Chapman and Hall, London). En algunas realizaciones, los vectores de
expresión también incluirán un replicón, un gen que codifica la
resistencia a antibióticos para permitir la selección de bacterias
que portan plásmidos recombinantes, y dianas de restricción únicas
en regiones no esenciales del plásmido para permitir la inserción
de secuencias heterólogas. El gen de resistencia al antibiótico en
particular no es crítico, cualquiera de los muchos genes de
resistencia conocidos en la materia son adecuados. Las secuencias
procariotas se eligen preferentemente de modo que no interfieran
con la replicación o la integración del ADN en Trichoderma
reesei.
Los procedimientos de transformación descritos
aquí pueden resultar en la integración estable de toda o parte del
vector de transformación en el genoma de una célula huésped, como
una célula huésped de hongo filamentoso. Sin embargo, la
transformación que resulta en el mantenimiento de un vector de
transformación extracromosómico que se auto-replica
también se contempla.
Muchos de los procedimientos estándares pueden
utilizarse para producir líneas celulares de bacterias y hongos
filamentosos (por ejemplo, Aspergillus o Trichoderma)
que expresen grandes cantidades de la proteasa. Algunos de los
procedimientos publicados para la introducción de construcciones de
ADN en las cepas productoras de celulasa de Trichoderma
incluyen Lorito, Hayes, DiPietro and Harman, (1993) Curr. Genet. 24:
349-356; Goldman, VanMontagu y
Herrera-Estrella, (1990) Curr. Genet.
17:169-174; y Penttila, Nevalainen, Ratto, Salminen
and Knowles, (1987) Gene 6: 155-164, véase también
USP 6.022.725; USP 6.268.328 y Nevalaineny col., "The Molecular
Biology of Trichoderma and its Application to the Expression
of Both Homologous and Heterologous Genes" en Molecular
Industrial Mycology, Eds, Leong y Berka, Marcel Dekker Inc., NY
(1992) pp 129-148; para Aspergillus véase
Yelton, Hamer y Timberlake, (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:
1470-1474, para Fusarium include Bajar,
Podila and Kolattukudy, (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:
8202-8212, para Streptomyces véase Hopwood y
col., 1985, Genetic Manipulation of Streptomyces: Laboratory
Manual, The John Innes Foundation, Norwich, UK y
Fernandez-Abalosy col., Microbiol 149:1623 -1632
(2003) y para Bacillus véase Brigidi, DeRossi, Bertarini,
Riccardi y Matteuzzi, (1990) FEMS Microbiol. Lett.
55:135-138).
Sin embargo, puede utilizarse cualquiera de los
procedimientos bien conocidos para la introducción de secuencias
nucleotídicas foráneas en las células huésped. Estos incluyen la
utilización de transfección con fosfato cálcico, polibreno, fusión
de protoplastos, electroporación, biolísticos, liposomas,
microinyección, vectores plasmáticos, vectores virales y cualquiera
de los otros bien conocidos procedimientos para la introducción de
ADN genómico clonado, ADNc, ADN sintético u otro material genéticos
extraño en una célula huésped (véase, por ejemplo, S Sambrooky
col., supra). En la patente americana U.S. 6.255.115 se
describe también la utilización de un procedimiento de transfección
mediado por Agrobacterium. Únicamente es necesario que el
proceso de ingeniería genética particular utilizado sea capaz de
introducir satisfactoriamente al menos un gen en la célula huésped
capaz de expresar dicho gen. Se describe aquí un procedimiento para
la producción de una proteasa de utilidad en los procedimientos de
la invención (por ejemplo, una proteasa NSP24) que comprende la
introducción en una célula huésped de un polinucleótido que
contiene un promotor unido operativamente a un ácido nucleico que
codifica una proteasa NSP24, el cultivo de la célula huésped en
condiciones adecuadas de cultivo para la expresión y producción de
la proteasa, y la producción de dicha proteasa. La proteasa puede
ser una proteasa NSP24 que tenga al menos un 95% de identidad de
secuencia con Nº ID SEC:2 o un fragmento biológicamente activo de lo
mismo, tal como se definió
anteriormente.
anteriormente.
Después de introducir el vector de expresión en
las células, las células transfectadas o transformadas se cultivan
en condiciones que favorezcan la expresión de genes bajo el control
de secuencias del promotor del gen de la proteasa. Es posible
cultivar grandes lotes de células transformadas tal como se describe
aquí. Por último, el producto se recupera del cultivo utilizando
técnicas estándares. Las condiciones óptimas para la producción de
las proteínas variarán con la elección de la célula huésped, y con
la elección de la proteína proteasa a ser expresada. Dichas
condiciones se lograrán fácilmente por un experto en la materia
gracias a una experimentación de rutina u optimización. Los ensayos
para determinar la actividad proteásica que hallan una utilización
en la presente invención incluyen, pero no se limitan a los
descritos en la patente internacional WO 9934011 y USP
6.605.458.
La proteína proteasa de interés puede aislarse o
recuperarse y posteriormente puede purificarse después de la
expresión de muy diversas modos conocidos por los expertos en la
materia dependiendo de los otros componentes presentes en la
muestra. Los procedimientos convencionales para la recuperación de
una proteasa del medio de cultivo incluyen la separación mediante
centrifugación o filtración, o si fuera necesario, la rotura de
células y la separación del sobrenadante de la fracción celular y de
los restos celulares. En algunos casos, después de la
clarificación, los componentes proteináceos del sobrenadante o del
filtrado se precipitan mediante una sal, por ejemplo, sulfato
amónico. Las proteínas precipitadas se solubilizan a continuación y
pueden purificarse mediante diversos procedimientos
cromatográficos. Los procedimientos de purificación estándar
incluyen técnicas electroforéticas, moleculares, inmunológicas y
cromatográficas, incluyendo HPLC de intercambio iónico, hidrofóbica,
de afinidad y cromatografía de fase reversa y cromatoenfoque. Por
ejemplo, la proteína de interés puede purificarse utilizando una
columna estándar de anticuerpo anti-proteína de
interés. También son de utilidad, las técnicas de ultrafiltración y
diafiltración, en conjunto con la concentración de proteínas. Como
guía general de técnicas de purificación adecuadas, véase Scopes,
Protein Purification (1982).
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Las células huésped y las células transformadas
pueden cultivarse en medio nutritivo convencional. Las condiciones
de cultivo específicas, como la temperatura, pH y otras, pueden ser
las utilizadas para la célula huésped seleccionada para la
expresión, y serán evidentes a los expertos en la materia. Además,
las condiciones de cultivo preferidas pueden hallarse en la
literatura como Sambrook, (1982) supra; Kieser, T, MJ. Bibb,
MJ. Buttner, KF Chater, y D.A. Hopwood (2000) PRACTICAL STREPTOMYCES
GENETICS. John Innes Foundation, Norwich UK; Harwood, y col.,
(1990) MOLECULAR BIOLOGICAL METHODS FOR BACILLUS, John Wiley y/o a
partir del American Type Culture Collection (ATCC; www.atcc.org).
Se puede generar células huésped transformantes estables de hongos
como Trichoderma, células que se distinguirán de las
transformantes no estables por su tasa de crecimiento más rápido o
por la formación de colonias circulares con un contorno liso en
lugar de irregular en medio de cultivo sólido. Véase, por ejemplo,
Davis y col., (1970) Methods Enzymol. 17:79 - 143).
Las células de hongos que expresan una proteasa
NSP24 de utilidad en los procedimientos de la invención se crecen
en condiciones de fermentación continua o en lote. Una fermentación
clásica de lote es un sistema cerrado, en donde la composición del
medio se ajusta al inicio de la fermentación y no se somete a
alteraciones artificiales durante la fermentación. Por ello, al
inicio de la fermentación, el medio se inocula con el(los)
organismo(s) deseado(s).
En este procedimiento, la fermentación sucede sin la adición de ningún componente al sistema. Típicamente, una fermentación de lote se califica como un "lote" con respecto a la adición de la fuente de carbono y en la cual se intenta realizar controles continuos de factores como el pH y la concentración de oxígeno. Las composiciones de metabolito y biomasa del sistema de lote cambian constantemente hasta el momento en que se paraliza la fermentación. En los cultivos de lote, las células progresan a través de una fase de demora estática a una fase logarítmica de alto crecimiento y por último a una fase estacionaria en donde la tasa de crecimiento disminuye o se detiene, si las células no tratadas en la fase estacionaria mueren eventualmente. En general, las células en la fase logarítmica son responsables del volumen de producción del producto final.
En este procedimiento, la fermentación sucede sin la adición de ningún componente al sistema. Típicamente, una fermentación de lote se califica como un "lote" con respecto a la adición de la fuente de carbono y en la cual se intenta realizar controles continuos de factores como el pH y la concentración de oxígeno. Las composiciones de metabolito y biomasa del sistema de lote cambian constantemente hasta el momento en que se paraliza la fermentación. En los cultivos de lote, las células progresan a través de una fase de demora estática a una fase logarítmica de alto crecimiento y por último a una fase estacionaria en donde la tasa de crecimiento disminuye o se detiene, si las células no tratadas en la fase estacionaria mueren eventualmente. En general, las células en la fase logarítmica son responsables del volumen de producción del producto final.
Una variación del sistema de lote estándar es el
sistema de "fermentación de lote alimentador", que también
halla una utilidad en la presente invención. En esta variación de un
sistema de lote típico, el sustrato se añade de forma creciente a
medida que la fermentación progresa. Los sistemas de lote
alimentador son útiles cuando la represión del catabolismo es
adecuada para inhibir el metabolismo de las células y cuando se
desee limitar las cantidades de sustrato en el medio. La
cuantificación de la concentración de sustrato actual en los
sistemas de lote alimentador es difícil y en consecuencia se estima
según los cambios de los factores cuantificables como el pH, el
oxígeno disuelto y la presión parcial de gases de desecho como el
CO_{2}. Las fermentaciones de lote y de lote alimentador son
comunes y bien conocidas en la materia.
La fermentación continua es un sistema abierto
en donde un medio de fermentación definido se añade de forma
continua a un bioreactor y una cantidad igual de medio condicionado
se extrae simultáneamente para su procesamiento. La fermentación
continua mantiene generalmente los cultivos a una densidad alta y
constante en donde las células se hallan principalmente en fase de
crecimiento logarítmica.
La fermentación continua permite la modulación
de un factor o de cualquiera de los factores que afectan el
crecimiento celular y/o la concentración del producto. Por ejemplo,
un nutriente limitante como la fuente de carbono o de nitrógeno
puede mantenerse a una tasa fija y se permite la variación para el
resto de parámetros. En otros sistemas, se alteran factores que
afectan el crecimiento de forma continua mientras que la
concentración, cuantificada por la turbidez media, se mantiene
constante. Los sistemas continuos radican en mantener las
condiciones de crecimiento en un estado de equilibrio. Por ello, la
pérdida de células debida al drenaje de medio debe ser compensada
con la tasa de crecimiento celular en la fermentación. Los
procedimientos de nutrientes moduladores y de los factores de
crecimiento para los procesos de fermentación continua, así como las
técnicas para maximizar la tasa de formación de producto son bien
conocidas en la materia de microbiología industrial.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización, la invención comprende
procedimientos para la producción de etanol que incluyen la
sacarificación de un sustrato de almidón molido insoluble con una
composición de enzima hidrolizante del almidón granular y una
proteasa NSP24 tal como se define en las reivindicaciones a una
temperatura por debajo de la temperatura de gelatinización del
almidón en el sustrato. Mientras que en general las proteasas
ácidas, como las proteasas derivadas de cepas de hongos (por
ejemplo, Aspergillus, Mucor, Rhizopus, Trichoderma,
Penicillium, y Endothia) pueden ser de utilidad en los
procedimientos de la invención.
Un sustrato que contiene almidón insoluble puede
obtenerse de cualquier material vegetal incluyendo cualquier parte
de la planta que contenga almidón, como las semillas, granos, hojas,
tubérculos, raíces, tallos y otros. Fuentes vegetales
particularmente preferidas incluyen el maíz; el trigo; el centeno;
el sorgo; el arroz; el mijo; la mandioca; las legumbres, como las
judías y los guisantes; el azúcar de caña; las patatas; los
boniatos; las bananas; la tapioca y mezclas de lo mismo. Algunas
fuentes preferidas de sustratos de almidón insoluble incluyen el
maíz, el trigo, la cebada, el centeno y el sorgo.
\newpage
Diversas referencias indican la cantidad de
almidón hallado en los granos de cereal, cuyas citas se indican en
The Alcohol Textbook, 3rd Ed. K. Jacques y col., Eds. 1999,
Nottingham University Press. Por ejemplo, el almidón contiene
aproximadamente un 60-68% de almidón; la cebada
contiene un 55-65% de almidón; el mijo contiene un
75-80% de almidón; el trigo contiene un
60-65% de almidón; y el arroz pulido contiene un
70-72% de almidón.
El material vegetal puede tratarse de
subproductos, como la fibra del maíz, la fibra de la mazorca del
maíz, el rastrojo y otros residuos y materiales que contengan
celulosas o hemicelulosas. Además, los sustratos de almidón
insolubles incluyen material vegetal fraccionado. Ejemplos típicos
incluyen el maíz, sorgo, cebada y trigo fraccionado. Algunas
realizaciones preferidas incluyen el maíz fraccionado, como el
endospermo, germen o fibra (salvado) pero en particular el
endospermo para el maíz y el almidón del gluten para el trigo.
Aquellos expertos en la materia son conscientes de los
procedimientos disponibles para preparar granos fraccionados
(Véase, USP 6.254.914 USP 6.899.910; USP 6.936.294; USP 6.936.110 y
USP 6.408.105; Singh y Johnston (2004) Adv. Food and Nutr. Res.
48:151 - 171 y Singh y col., (1999) Cereal Chem
76:868-872).
El molido del sustrato de almidón insoluble
puede ser bien mediante molido húmedo o molido seco. En algunas
realizaciones preferidas, el sustrato insoluble está molido en seco.
Por lo general si el sustrato (por ejemplo el grano) no está
fraccionado, los componentes no fermentables del grano (por ejemplo,
la fibra, la proteína y el germen) se llevan a cabo a través del
proceso de fermentación y se recuperan como subproductos, residuos
desecados de destilería y residuos desecados de destilería con
solubles.
Los procesos de fraccionamiento del molido
húmedo o seco, el triturado mecánico seguido por la separación por
densidad se utiliza para las fracciones distintas o el germen, la
fibra y el endospermo de maíz (Ponnampalan y col., (2004) Appl.
Biochem. Biotech., 115: 837 - 842) y Simms L., (1985) "The
Technology of Corn Wet Milling" en Starch Conversion Technology,
Ed. G.M.A.van Beynnum y J.A. Roels Marcel Dekker Inc., NY).
El molido seco de granos de cereales completos
es conocido en la materia e incluye la utilización de molinillos de
martillos y molinillos de rodillos. También los procesos de
fraccionamiento de molido seco son conocidos (Brekk O.L. (1970)
"Corn Dry Milling Industry" pages 262 - 291 en Corn Culture
Products G.E. Inglett Ed., AVI Publishing, Westport CT). Un ejemplo
de una composición típica de maíz completamente triturado por
molido seco (WC) comparado con el maíz fraccionado (FC) es el
siguiente: humedad-13% (WC) y 12% (FC);
proteína-7,8% (WC) y 7,08% (FC);
grasa-3,5% (WC) y 0,7% (FC); fibra cruda- 1,5% (WC)
y 0,5% (FC); cenizas- 1,3% (WC) y 0,4% (FC) y carbohidratos -72,9%
(WC) y 79,4% (FC) (Duensing y col., Corn Dry Milling: Processes,
Products and Applications in Corn: Chemistry and technology ED.
White y col. Sin embargo, con la modernización y los avances en el
fraccionamiento seco del maíz triturado, la fracción del endosperma
puede contener más del 80% de
almidón.
almidón.
En algunas realizaciones, un sustrato molido se
preparará por ejemplo, mediante trituración en donde al menos un
50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65% y al menos un
70% de las partículas trituradas pasarán a través de una criba con
una abertura de aproximadamente 600 micras (entre 585 y 610)
denominado aquí como una criba de abertura de malla 30. También en
algunas realizaciones, entre el 30%-80% de las partículas molidas
pasarán a través de la abertura de malla 30. En otras realizaciones,
entre el 30-75%, también entre el
30-70%, también entre el 35-65% y
también entre el 40-60% de las partículas molidas
pasarán por un tamiz de abertura de malla
30.
30.
El sustrato de almidón insoluble en algunas
realizaciones se mezcla con el agua de mezcla para formar un lodo.
El agua de mezcla puede ser agua y agua de proceso, como vinaza
(vinaza reciclada o backset en inglés) o una mezcla de
ambos. La vinaza es el residuo de destilación de la fermentación y
puede incluir azúcares, nitrógeno y otros nutrientes y enzimas. En
lugar de agua, puede utilizarse la vinaza en proporción del 1% al
95%, también en el intervalo del 15% al 75% y aproximadamente del
30% al 60%.
El porcentaje de sólidos secos (DS) de un lodo
puede hallarse en el intervalo de aproximadamente el 10% al 55%, en
el intervalo de aproximadamente el 15% a aproximadamente el 50%, en
el intervalo de aproximadamente el 20% al 50%, en el intervalo de
aproximadamente el 20% a aproximadamente el 50%, en el intervalo de
aproximadamente el 25% a aproximadamente el 50%, en el intervalo de
aproximadamente el 30% a aproximadamente el 50%.
La sacarificación tiene lugar mediante contacto
con un sustrato con una composición enzimática hidrolizante del
almidón y una proteasa NSP24 de la invención, como la anteriormente
descrita con detalle más arriba.
La cantidad de proteasa NSP24 utilizada en los
procedimientos de la invención variará en el intervalo de 0,001 a
10 SAPU/g DS. En algunas realizaciones, la cantidad de una proteasa
NSP24 se hallará en el intervalo de 0,01 a 10,0 SAPU/g DS. En otras
realizaciones, la cantidad de proteasa NSP24 se hallará en el
intervalo de 0,05 a 5,0 SAPU/g DS. En otras realizaciones, la
cantidad de proteasa NSP24 se hallará entre el intervalo de 0,05 a
5 Kg/toneladas métricas (MT). Otras cantidades de utilidad incluirán
el intervalo de 0,1 a 1 Kg/MT de proteasa NSP24.
Las enzimas y las composiciones enzimáticas
hidrolizantes del almidón son conocidas en la materia e incluyen
composiciones que aportan glucoamilasas y alfa amilasas como enzimas
separadas o en combinaciones. Las enzimas pueden ser de tipo
silvestre o enzimas modificadas genéticamente incluyendo variantes e
híbridos.
Los ejemplos no limitantes de glucoamilasas con
actividad hidrolizante del almidón granular son las glucoamilasas
derivadas de Humicola (H. grisea) (WO 2005/052148; USP
4.618.579; Tosi y col., 91993) Can. J. Microbiol. 39:846 - 852;
Campos y col., (1995), App y Environ. Microbiol. 61:2436 - 2438; EP
171218; y Allison y col., (1992) Cur. Genet 21:225 -229);
Aspergillus (A. niger A, awamori, y A. kawachi)
(Ueda y col., (1981) Biotechnology. Bioeng 23: 291, Hayashida
(1973) Agr. Biol. Chem. 39:2093 - 2099 y Hayashida y col., (1980)
Agric. Biol. Chem. 53:923 - 929); Trichoderma (T.
reesei); and Rhizopus (R. niveus and R.
oryzae) (USP 4,514,496, USP 4.092.434, USP 4.863.864; Takahashi
y col., J. Biochem. (1985) 98: 663 - 671 y Ashikari y col., (1986)
Agric. Biol. Chem. 50:957 964). Ejemplos no limitantes de alfa
amilasas con actividad hidrolizante del almidón granular se derivan
de Aspergillus (A. kawachi) (véase, patente americana
US 2005/0266543 y Ueda y col., (1980) J. Fermentation Technol.
58:237 - 242). Recientemente se ha publicado un buen número de
patentes que están dirigidas a composiciones de diversas enzimas,
las cuales incluyen actividades hidrolizantes del almidón granular
y la utilización de estas composiciones en las fermentaciones
alcohólicas. Estas publicaciones incluyen por ejemplo la patente
internacional WO 03/066826; la patente internacional WO 04/113551;
la patente internacional WO 04/081193; las patentes internacionales
WO 05/052148 y WO 05/087938. Algunas de estas enzimas descritas con
actividad hidrolizante del almidón granular incluyen la enzima de
tipo silvestre y las variantes e híbridos de lo mismo.
Las composiciones hidrolizantes del almidón
granular disponibles comercialmente están disponibles en Genencor
International Inc. Danisco A/S), STARGEN001; Shin Nihon Chemical Co.
Japan, CU CONC; Bicon, India LTD., Bangalore, India M1 Amano and
Novozymes A/S.
Mientras que la etapa de sacarificación de la
invención incluye una enzima hidrolizante del almidón granular y
una proteasa NSP24, pueden añadirse enzimas adicionales a la mezcla,
dichas enzimas incluyen por ejemplo otras glucoamilasas y
amilasas.
La cantidad de glucoamilasa utilizada en la
presente proceso puede variar de acuerdo con la actividad
enzimática. En algunas realizaciones, las cantidades incluyen de
0,01 a 15 GAU/g DS y también de 0,01 a 10,0 GAU/g DS. También una
cantidad útil de glucoamilasa en una composición hidrolizante del
almidón granular es de aproximadamente 0,1 a 5 GU/g DS, también de
aproximadamente 0,1 a 1,5 GAU/g DS.
La temperatura de la sacarificación se hallará
por debajo de la temperatura de gelatinización del sustrato. La
temperatura exacta utilizada de acuerdo con los procedimientos de la
invención depende del sustrato de almidón específico utilizado. Por
lo general la temperatura de gelatinización del almidón se halla en
los intervalos descritos en Swinkels páginas 32 - 38 en STARCH
CONVERSION TECHNOLOGY, eds Van Beynum y col., (1985) Marcel Dekker
Inc., NY y THE ALCOHOL TEXTBOOK, A REFERENCE FOR THE BEVERAGE, FUEL
AND INDUSTRIAL ALCOHOL INDUSTRIES, 3rd Ed., eds Jacques y col.,
1999, Nottingham University Press, UK. En algunas realizaciones, los
procedimientos según la invención se llevarán a cabo a una
temperatura de al menos unos 10ºC, 15ºC, 20ºC, 25ºC, 30ºC, 35ºC,
40ºC, 45ºC, 50ºC, 55ºC, 60ºC, y 65ºC. En otras realizaciones, la
temperatura se hallará entre aproximadamente
10-65ºC, entre aproximadamente
20-60ºC, entre aproximadamente
30-65ºC, entre aproximadamente
35-65ºC, entre aproximadamente
40-65ºC, y entre aproximadamente
45-65ºC. En otras realizaciones, la temperatura se
hallará entre aproximadamente 10-45ºC, entre
aproximadamente 20-45ºC, entre aproximadamente
15-40ºC, entre aproximadamente 30 - 40ºC y entre
aproximadamente 30-35ºC. En algunas realizaciones
preferidas, el sustrato de almidón no se somete nunca a las
condiciones térmicas utilizadas para las licuefacciones y por lo
general estará por debajo de los 68ºC. La temperatura variará
durante el proceso de sacarificación, pero la temperatura se
mantendrá siempre a una temperatura por debajo de la temperatura de
gelatinización para el sustrato(s) utilizado en el
proceso.
proceso.
En algunas realizaciones, los procedimientos de
acuerdo con la invención se llevarán a cabo a un pH de
aproximadamente pH 3,0 a 6,5; aproximadamente a pH 3,0 a 6,0;
aproximadamente a pH 3,5 a 5,5; aproximadamente a pH 3,5 a 5,0; y
aproximadamente a pH 3,5 a 4,5. Además el pH durante esta etapa
puede variar. Por ejemplo, el pH puede aumentarse durante la
sacarificación. Por ejemplo, el pH puede aumentarse desde un pH de
aproximadamente 3 a 5,0 a un pH de aproximadamente 4 a 6.
En algunas realizaciones, el tiempo del
procedimiento es de unas 2 a 300 horas, pero más generalmente de 2
a 120 horas. En algunas realizaciones, el proceso se realiza en
aproximadamente unas 5 a 100 horas. En otras realizaciones, el
proceso se realiza en aproximadamente 5 a 80 horas. Y todavía en
otras realizaciones, el proceso se realiza durante al menos unas 5
horas pero menos de 100 horas.
En algunas realizaciones, se hidroliza al menos
un 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% y 99%
de los sólidos secos del almidón insoluble. En algunas
realizaciones, el sustrato de almidón insoluble se hidroliza
completamente. En algunas realizaciones, al menos el 90% del almidón
granular se hidroliza en 100 horas. En ciertas realizaciones, al
menos el 90% del sustrato de almidón granular se hidroliza en un
periodo de tiempo de 24 horas. En otras realizaciones, al menos el
95% del sustrato del almidón granular se hidroliza en un periodo de
tiempo de 24 horas.
En algunas realizaciones, la etapa de
sacarificación se prosigue con la fermentación. La masa de
maceración sacarificada se contacta con un organismo fermentador en
condiciones adecuadas de fermentación. En algunas realizaciones
preferidas, el organismo fermentador es una levadura disponible
comercialmente como una cepa de Saccharomyces cerevisiae
(patente americana US 4.316.956). Las fuentes comerciales de
levaduras incluyen FALI; RED STAR (Red Star); RED STAR RED (Red
Star); FERMIOL (DSM Specialties) y SUPERSTART (Alltech). La cantidad
de levadura iniciadora utilizada en los procedimientos es una
cantidad eficaz para producir una cantidad significativa
comercialmente de etanol en un tiempo adecuado, (por ejemplo, para
producir al menos un 15% de etanol de un sustrato de maíz insoluble
que tenga entre 25-45% DS en menos de 72 horas). La
utilización de levadura en la fermentación es bien conocida y una
referencia se cita en THE ALCOHOL TEXTBOOK, K. JACQUES ET
AL., EDS. 1999, NOTTINGHAM UNIVERSITY PRESS, UK.
La fermentación puede realizarse en las mismas
condiciones de temperatura, pH y otras que las descritas
anteriormente para la sacarificación.
En algunas realizaciones, el procedimiento
comprende una sacarificación y una fermentación simultáneas (SSF),
en donde la etapa de sacarificación y la etapa de fermentación se
llevan a cabo al mismo tiempo. El medio de cultivo, que incluye el
sustrato de almidón insoluble se contacta con una composición
hidrolizante de almidón granular de proteasa NSP24 bien
suplementada en un filtrado sin células o expresada a partir de una
célula huésped de hongo en el cultivo, que también incluirá el
organismo fermentador como una levadura.
En algunas realizaciones, el tiempo de
permanencia para la sacarificación y fermentación simultáneas será
de aproximadamente 2 a 300 horas, pero preferentemente de 2 a 20
horas. En algunas realizaciones, el tiempo es de aproximadamente 5
a 100 horas. En otras realizaciones, el tiempo es de aproximadamente
de 5 a 80 horas. En otras realizaciones, el tiempo es de al menos 5
horas pero inferior a 100 horas. En otras realizaciones, el tiempo
del proceso es de al menos 10 horas pero menos de 100 horas a una
temperatura de entre 20-50ºC y preferentemente
entre 25-40ºC y un pH de 3,5 a 6,0.
En algunas realizaciones al menos un 5% del
volumen, al menos un 8% del volumen, al menos un 10% del volumen,
al menos un 12% del volumen, al menos un 15% del volumen, al menos
un 18% del volumen y al menos un 20% del volumen de etanol se
producirá en el medio del fermentación. En otras realizaciones, la
cantidad de etanol producido en el medio de fermentación (caldo)
será de entre 5-30% (v/v), también entre
5-25% (v/v), y entre 5-20%/v/v). En
algunas realizaciones, la cantidad de etanol producido será de al
menos el 16% a las 72
horas.
horas.
En algunas realizaciones la cantidad de etanol
producido se incrementa en comparación con la cantidad de etanol
producido a partir de un procedimiento esencialmente similar, que no
incluye una proteasa NSP24. La producción de etanol de las
fermentaciones abarcada por los procedimientos de la invención
pueden estar aumentada en al menos un 0,5%, al menos un 0,75%, al
menos un 1,0%, al menos un 1,25%, al menos un 1,5%, al menos 1,75%
y al menos un 2,0% respecto a un procedimiento similar. Un
procedimiento esencialmente similar quiere decir un procedimiento
conducido en las mismas condiciones de temperatura, pH, tiempo de
permanencia, organismo de fermentación, enzimas hidrolizantes del
almidón granular y similares. La única diferencia radica en la
inclusión de la proteasa y específicamente la proteasa NSP24 en el
medio de sacarificación/fermentación.
Después de la fermentación, el alcohol (por
ejemplo, etanol) puede recuperarse del medio de fermentación
mediante medios bien conocidos en la materia. En algunas
realizaciones, el alcohol en el medio fermentado puede ser
destilado, por ejemplo, mediante calentamiento o destilación al
vacío. Véase la referencia THE ALCOHOL TEXTBOOK, A REFERENCE FOR
THE BEVERAGE, FUEL AND INDUSTRIAL ALCOHOL INDUSTRIES 3RD ED., K.
JACQUES ET AL., EDS. 1999, NOTTINGHAM UNIVERSITY PRESS,
UK.
El etanol puede a continuación utilizarse, por
ejemplo como etanol de combustión o etanol potable. El residuo
restante, conocido como vinaza también puede recuperarse y los
componentes de la vinaza pueden separarse en una fracción soluble o
una fracción insoluble.
Cuando se separa la vinaza por ejemplo mediante
centrifugación o cribado en una fracción soluble y una fracción
insoluble, estas fracciones pueden utilizarse para producir solubles
de destilería o solubles desecados de destilería o una mezcla de
ambos para producir residuos desecados de destilería con solubles
(DDGS). Un experto en la materia estará familiarizado con los
procesos para formar DDGS y residuos de destilería en general. En
algunas realizaciones de la invención, cuando el % de etanol aumenta
en el proceso de fermentación, la cantidad de DDGS puede disminuir
incluso sin un aumento significativo de la producción de etanol. En
una realización, una ventaja del procedimiento abarcado por la
invención puede ser un aumento en el % de proteína total en el
DDGS. El DDGS puede a continuación utilizarse por ejemplo en una
formulación de pienso animal.
Una ventaja de incluir NSP24 en los
procedimientos abarcados por la invención es una disminución en el
almidón residual en una fermentación de levaduras de sustratos que
contienen almidón granular como grano completo molido o
fraccionado. Unos niveles elevados de almidón residual en un medio
de fermentación (caldo) de fermentación de levaduras con sustratos
que contienen almidón granular pueden resultar potencialmente en
problemas en la etapa de destilación, que podrían causar una mayor
viscosidad. La adición de una proteasa (NSP24) durante la
fermentación de levaduras de un sustrato que contiene almidón
granular (por ejemplo, grano como el maíz fraccionado o completo)
resulta en una reducción del almidón residual en el caldo de
fermentación. Dicho caldo de fermentación puede ser una ventaja
para el posterior procesamiento.
\newpage
En algunas realizaciones, el proceso de
fermentación (por ejemplo, DDGS) que contiene menos del 30%, menos
del 15%, menos del 10%, menos del 9%, menos del 8%, menos del 7%,
menos del 6%, menos del 5%, menos del 4%, menos del 2% y menos del
1% de almidón residual. En algunas realizaciones, la cantidad de
almidón residual producido por procedimientos de la invención será
de al menos un 50%, de al menos un 40%, de al menos un 30%, de al
menos un 25%, de al menos un 20%, de al menos un 15%, de al menos un
10%, de al menos un 5%, de al menos un 3,0% y de al menos un 2,0%
menos que en un procedimiento esencialmente similar realizado sin
una proteasa y en particular sin una proteasa NSP24.
En otra realización, el sustrato de almidón
insoluble (granular) puede pretratarse antes de la sacarificación.
El pretratamiento puede incluir la exposición del sustrato de
almidón insoluble en una forma de lodo a una temperatura elevada,
en donde la temperatura es inferior a la temperatura de
gelatinización del sustrato de almidón.
En algunas realizaciones, el pretratamiento por
calor puede realizarse a una temperatura por debajo de lo 68ºC pero
por encima de 40º-65ºC, también entre 40-60ºC,
también entre 45-55ºC y entre
42-52ºC, a un pH de 3,0 a 6,0, también a un pH de
3,5 a 5,0 y también a pH entre 3,8 y 4,5. En algunas realizaciones,
cuando el maíz es el sustrato, el pretratamiento puede llevarse a
cabo a aproximadamente 55 a 65ºC y a un pH de aproximadamente 3,5 a
4,2. En otras realizaciones, si el sustrato es el centeno, el
pretratamiento se realizará a aproximadamente 40-
50ºC.
50ºC.
En algunas realizaciones, el pretratamiento se
realizará de 15 minutos a 24 horas, también de 30 minutos a 18
horas, también de 30 minutos a 12 horas, también de 30 minutos a 8
horas y también de 1 hora a menos de 4 horas.
Además del pretratamiento por calor, se pueden
incluir enzimas distintas en el pretratamiento. En algunas
realizaciones, el pretratamiento incluirá la utilización de una
alfa-amilasa, como una alfa-amilasa
bacteriana (por ejemplo, SPEZYME y EZYME 997 (Genencor
International, Inc.)) y opcionalmente una celulasa (por ejemplo,
Celulasa 2000). En otras realizaciones de pretratamiento, la enzima
puede incluir enzimas de hidrólisis del almidón granular (por
ejemplo la alfa amilasa derivada de Aspergillus Kawachi o la
glucoamilasa hidrolizante derivada de Humicola
grisea)).
En algunas realizaciones, el pretratamiento
puede incluir una proteasa ácida, como una proteasa NSP24 tal como
se define en las reivindicaciones. Sin embargo, otras proteasas
ácidas pueden utilizarse incluyendo GC106 (Genencor International).
En algunas realizaciones, la cantidad de una proteasa ácida
utilizada en un pretratamiento se hallará en el intervalo de 0,05 a
15 SAPU/g DS, también la dosificación de 0,1 a 10 SAPU/g DS; 0,1 a
5 SAPU/g DS; y 0,25 a 5 SAPU/g DS hallan utilización en la
invención. En algunas realizaciones preferidas, el pretratamiento
puede aumentar la cantidad de etanol que se produce por la
fermentación de los sustratos insolubles en comparación con la
cantidad de etanol producida por la fermentación del sustrato
insoluble sin un pretratamiento pero en condiciones similares. En
realizaciones preferidas, la cantidad de etanol aumentará al menos
un 0,3%, al menos un 0,5%, al menos un 0,75% o incluso al menos un
1,0%. En algunas realizaciones, la cantidad de almidón residual
disminuirá al menos un 1%, al menos un 2%, al menos un 3%, al menos
un 4%, al menos un 5%, al menos un 6%, al menos un 7%, al menos un
8%, al menos un 9%, al menos un 10% comparado con el % de almidón
residual en una fermentación esencialmente similar sin el
pretratamiento.
A las fermentaciones descritas anteriormente es
posible añadir enzimas adicionales. Estas enzimas pueden ser de
tipo silvestre, híbridas o variantes de enzimas de tipo silvestre
incluyendo las glucoamilasas; las hemicelulasas, como las manasas;
las lipasas (por ejemplo, E.C. 3.1.1.3); las glucosa oxidasas; las
pectinasas; las xilanasas; las cutinasas (por ejemplo, E.C.
3.1.1.74); las transglucosidasas; las transferasas y las alfa 1,6
glucosidasas (por ejemplo, E.C. 3.2.1.20). Algunas glucoamilasas
preferidas de utilidad en los procedimientos de la invención se
producen por diversas cepas de hongos filamentosos y levaduras. En
particular, las glucoamilasas secretadas por las cepas de
Aspergillus y Trichoderma son comercialmente
importantes. Las fuentes de estas glucoamilasas incluyen: G1 y G2
glucoamilasa de Aspergillus niger y sus variantes (Boel y
col., (1984) EMBO J 3:1097-1102; patente
internacional WO 92/00381; patente internacional WO 00/04136 y USP
6.352.851); glucoamilasas de Aspergillys awamori (patente
internacional WO 84/02921); glucoamilasas de Aspergillus
oryzae y variantes de lo mismo (Hata y col., (19911) Agric.
Biol. Chem. 55:941-949) y Aspergillus
shirousami (véase Chen y col., (1996) Prot Eng.
9:499-505; Chen y col., (1995) Prot. Eng.
8:575-582; and Cheny col., (1994) Biochem J.
302:275-281). Las glucoamilasas también se obtienen
de cepas de Talaromyces como las derivadas T.
emersonii, T. leycettanus, T. duponti y T.
thermophilus (patente internacional WO 99/28488; USP No.
RE:32.153; y USP 4.587.215); cepas de Rhizopus, como R.
niveus y R. oryzae; cepas de Mucor; cepas de
Trichoderma, como T. reesei y T. viridae,
cepas de Humicola, como H. grisea (véase, Boel y col.,
(1984) EMBO J3:1097-1102; patente internacional WO
92/00381; patente internacional WO 00/04136; Chen y col., (1996)
Prot. Eng. 9:499-505; Taylor Y col., (1978)
Carbohydrate Res. 61:301-308; patente americana US.
4.514.496; patente americana US. 4.092.434; y Jensen y col., (1988)
Can. J. Microbiol. 34:218 - 223), y la glucoamilasa obtenida de
Athelia rolfsii y variantes de lo mismo (WO 04/111218).
Otras enzimas adicionales, que hallan
utilización en la presente invención, incluyen las enzimas
desramificantes como las pululunasas (E.C. 3.2.1.41) y las
isoamilasas (E.C. 3.2.1.68). Dichas enzimas hidrolizan los enlaces
alfa-1,6-glucosídicos. Por ello,
durante la hidrólisis del almidón, las enzimas desramificantes
eliminan unidades de glucosa sucesivas de los extremos no
reductores del almidón. Otra enzima que puede utilizarse en los
procedimientos de la invención son las
beta-amilasas (E.C. 3.2.1.2). Estas son amilasas
maltogénicas exógenas que catalizan la hidrólisis de enlaces
1,4-alfa glucosídicos en la amilosa y la
amilopectina y polímeros de glucosa caracterizados. Algunas de
estas enzimas se caracterizan por tener un intervalo de pH óptimo
entre 4,5-7,0 a temperatura de
40ºC-65ºC. Beta-amilasas comerciales
están disponibles por ejemplo en SPEZYME BBA y OPTIMALT de Genencor
International
Inc.
Inc.
Enzimas adicionales pueden incluir las
alfa-amilasas, que pueden o no estar caracterizadas
por tener actividad hidrolizante del almidón granular. Ejemplos de
alfa amilasas incluyen tanto las alfa amilasas bacterianas como las
fúngicas y variantes de éstas, como las alfa amilasas de Bacillus
amyloliquefaciens, Bacillus stearothermophilus, B.
licheniformis y variantes o híbridos de la misma (USP 5.093.257;
USP 6.093.562; USP 5.736.499; USP 5.958.739; USP 6.436.888; USP
6.867.031; WO 96/39528; WO 96/23874 y WO 05/001064). Las alfa
amilasas disponibles comercialmente son ESPEZYME FRED y SPEZYME
ETHYL (Genencor International Inc.). Las ciclodextrin
glucanotransferasas (CGTasas) (E.C.2.4.1.19) y variantes de lo
mismo también pueden hallar una utilización en la invención (USP
5.278.059; USP 5.545.587 y WO 05/003337).
La cantidad efectiva de estas enzimas a
incluirse en los procedimientos de la invención puede determinarse
fácilmente por un experto en la materia.
En algunas realizaciones, es posible añadir un
antimicrobiano a las composiciones y al medio de fermentación de la
invención. Los antimicrobianos son compuestos que matan o inhiben el
crecimiento de los microorganismos.
\vskip1.000000\baselineskip
En la sección experimental que sigue, se
utilizan las abreviaciones siguientes: NSP24 (NSP24 que es la
sobreexpresada en Trichoderma reesei; AnGA (DISTILLASE que
comprende un Aspergillus niger GA (Genencor International
Inc.,)); GA (glucoamylase); TrGA (una GA obtenida de Trichoderma
reesei); STARGEN 001 (una composición de enzimas hidrolizantes
del almidón con actividad glucoamilasa y alfa amilasa (Genencor
International Inc.,)); AkAA (una alfa amilasa de Aspergillus
kawachi) GAU (unidad de glucoamilasa); SAPU (unidad
espectrofotométrica de proteasa ácida) %P (porcentaje en peso); ºC
(grados centígrados); rpm (revoluciones por minuto); H_{2}O
(agua); dH_{2}O (agua desionizada); dIH_{2}O (agua desionizada,
filtración Milli-Q); aa o AA (aminoácido); pb (par
de bases); kb (par de kilobases); kD or kDa (kilodaltons); g
(gramos); \mug (microgramos); mg (miligramos); \muL
(microlitros); ml and mL (mililitros); mm (milímetros); \mum
(micrómetros); M (molar); mM (milimolar); \muM (micromolar); U
(unidades); V (voltios); PM (peso molecular); s (segundos);
min(s) (minuto/minutos); h(s) (hora/horas); DO
(oxígeno disuelto); kg (kilogramo); TM (tonelada métrica) EtOH
(etanol).
Los siguientes ensayos y procedimientos se
utilizaron en los ejemplos que se proporcionan a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
La composición de etanol y carbohidrato de las
muestras se determinó utilizando el procedimiento HPLC tal como se
describe aquí:
a) se llenó un tubo ce centrífuga Eppendorf de
1,5 ml con cerveza de fermentación y se enfrió en hielo durante 10
min;
b) el tubo de la muestra se centrifugó durante 1
min en una centrífuga de mesa Eppendorf;
c) una muestra de 0,5 ml del sobrenadante se
transfirió a un tubo de muestra que contenía 0,05 ml de solución
Kill (H_{2}SO_{4} 1,11 N) y se dejó actuar durante 5
min;
d) se añadieron 5,0 ml de agua a la muestra y
se filtró en un vial HPLC a través de un filtro de jeringa de Nylon
de 0,45 Pm; y
e) se migró en la columna HPLC.
\vskip1.000000\baselineskip
a) Sistema de etanol: columna: Phenomenex Rezex
Organic Acid Column (RHM-Monosacarido) #00H
0132-KO (equivalente a Bio-Rad
87H); temperatura de la columna: 60ºC; Fase móvil: RI; y volumen de
inyección: 20 PL.
b) Sistema de carbohidrato: columna: Phenomenex
Rezex Carbohydrate (RCM-Monosaccharide)
#00H-0130-KO (Equivalente a
Bio-Rad 87H); temperatura de la columna: 70ºC; Fase
móvil: Nanopure DI H_{2}O; Tasa de flujo: 0,8 ml/min; Detector:
RI; volumen de inyección: 10 PL (3% DS material).
La columna separa según el peso molecular de los
sacáridos, los cuales se denominan DP-1
(monosacáridos); DP-2 (disacáridos);
DP-3 (trisacáridos) y DP>3 (azúcares
oligosacáridos con un grado de polimerización superior a
3).
3).
Test del yodo del almidón residual: una
muestra de la cerveza (caldo de fermentación) se centrifuga en tubos
de centrífuga de 2 ml de plástico.
El sobrenadante se decanta y el tubo con el
sedimento se coloca en un baño con hielo. Se añaden varias gotas de
solución de yoduro 0,025 N (yoduro 0,1 N de VWR cat.
VW3207-1 diluido 4 veces) al sedimento y se mezclan.
Un resultado positivo (+) para el almidón muestra un rango de color
desde el azul al púrpura y la intensidad de color es directamente
proporcional a la concentración del almidón. Un resultado negativo
para el almidón (-) permanece amarillo.
Determinación del contenido total de
almidón: La licuefacción y sacarificación
enzima-enzima del almidón (procedimiento enzimático
dual) se utilizó para determinar el contenido de almidón total. En
un análisis característico, 2 g de la muestra seca se colocan en un
frasco Kohlrausch de 100 ml y se añaden 45 ml de tampón MOPS, pH
7,0. El lodo se agita durante 30 min. Se añade 1,0 ml de
SPEZYME^{TM} FRED (diluido 1:50 en agua), y se calienta a
ebullición durante 3-5 minutos. El frasco se coloca
en una autoclave y se mantiene a 121ºC durante 15 min. Después de
autoclavar, el frasco se coloca en un baño-maría a
95ºC y se añade 1,0 ml de SPEZYME FRED diluido 1:50 y se incuba
durante 45 min. El pH se ajusta a 4,2 y la temperatura se reduce a
60ºC. Ello se prosigue por la adición de 20 ml de tampón acetato,
pH 4,2. La sacarificación se lleva a cabo por adición de 1,0 ml de
OPTIDEX^{TM} L-400 diluido 1:100 (Glucoamilasa,
Genencor International Inc.) y la incubación se finaliza calentando
a 95ºC durante 10 min. La composición de azúcar total se determina
por HPLC con glucosa como estándar. El hidrolizado de almidón
soluble de la extracción acuosa de una muestra a temperatura
ambiente sin el tratamiento enzimático se sustrae del azúcar
total.
total.
Análisis de proteínas totales: el
nitrógeno total (N) en las preparaciones de las muestras se
determina por el procedimiento de Kjeldhal (American Assoc. Cereal
Chemists (AACC), (1983), Methods 22B60 8ª edición, St Paul, MN). Se
calcula el contenido proteico mediante 6,25 x N total.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se extrae el ADN genómico de la cepa de T.
reesei QM6a. Los cebadores de PCR se diseñaron según la
secuencia putativa de la proteasa hallada en el contigo
1-5500 del genoma de T. reesei (Joint Genome
Insitute (JGI) T. reesei genome v1.0). El cebador sentido 5'
contiene un motivo para el clonaje direccional en el vector
pENTR/D
(Incitrogen).
(Incitrogen).
La secuencia del cebador afp6f fue
CACCATGCAGACCTTTGGAGCT (Nº ID SEC: 5), y la secuencia del cebador
afp7r fue TTATTTCTGAGCCCAGCCCAG (Nº ID SEC:6). El producto de PCR de
1,3 Kb se purificó mediante extracción en gel (Gel Purification
Kit, Quiagen) y se clonó en pENTR/D, según el protocolo del sistema
Invitrogen Gateway.
El vector se transformó a continuación en
células competentes de E. coli Top10 (Invitrogen) con
selección por kanamicina. El ADN plasmídico, de varios clones
independientes se digirió con enzimas de restricción para confirmar
que el inserto tenía el tamaño correcto.
El inserto del gen de la proteasa se secuenció
(Sequentech, Mountain View, CA) a partir de varios clones. El ADN
plasmídico de un clon, pENTR/D_55.3, se añadió a la reacción de la
clonasa LR (Invitrogen Gateway system) con el vector de ADN de
destino pTrex3g/amdS. El vector pTrex3g deriva de pSL1180 de E.
coli (Pharmacia Inc., NJ), el cual es un vector fagémido
derivado de pUC118 y se describe en la patente internacional WO
05/001036. La recombinación, en la reacción de la clonasa LR,
reemplaza los genes CmR y ccdB genes del vector de destino con la
proteasa de T. reesei protease de pENTR/D_55.3. Esta
recombinación inserta direccionalmente la proteasa entre el
promotor de cbhI y el finalizador del vector de destino. Las
secuencias de los sitios de recombinación de 44 y 50 pb permanecen
cadena arriba y cadena abajo, respectivamente, del gen de la
proteasa. Una alícuota de la reacción de la clonasa LR se
transformó en células competentes de E. coli Top10 y se
crecieron durante la noche con selección con carbenicilina. El ADN
plasmídico de varios clones se digirió con enzimas de restricción
para confirmar el tamaño correcto del inserto. El ADN plasmídico del
clon pTrex3g_55.3. se digirió con XbaI para liberar el casete de
expresión incluyendo promotor cbhI:proteasa NSP24:finalizador:amdS.
Este casete de 5,8 Kb se purificó mediante extracción en gel de
agarosa, utilizando técnicas estándares, y se transformó en una
cepa de T. reesei derivada de la cepa QM6a disponible al público
(véase la patente europea WO 05/00036). Véanse las figuras 1, 2
y
3.
3.
Se inoculó un tapón de agar de 2 cm2 de una
placa de micelio esporulado en 50 ml de medio YEG en un frasco de
agitación con deflector y se incubó a 37ºC durante
16-20 horas a 200 rpm. El micelio se recuperó
mediante transferencia del volumen líquido a tubos cónicos de 50 ml
y se centrifugó a 2500 rpm durante 10 minutos. El sobrenadante se
aspiró. El sedimento del micelio se transfirió a una botella de 250
ml con filtro de 0,22 Pm CA Corning que contenía 40 ml de una
solución de \beta-D-glucanasa
(InterSpex Products, Inc.) esterilizada por filtración y se incubó
a 30ºC, 200 rpm durante 2 horas. El micelio se recuperó mediante un
Miracloth estéril (Calbiochem, LaJolla, CA) en un tubo de centrífuga
de 50 ml cónico, se centrifugó a 2000 rpm durante 5 minutos y se
aspiró. El sedimento se lavó una vez con 50 ml de sorbitol 1,2 M, se
centrifugó de nuevo, se aspiró y se lavó con 25 ml de
sorbitol/CaCl_{2}. Los protoplastos se contaron con un
hemocitómetro, se centrifugaron, se aspiraron y se resuspendieron
en un volumen de sorbitol/CaCl2 suficiente para generar una
concentración de protoplastos de 1,25 x 10^{8}/ml. Se utilizaron
alícuotas de 200 \mul para la reacción de transformación. Se
colocaron 20 \mug de ADN (\geq1 \mug/\mul) en tubos de 15 ml
cónicos en hielo. Se añadieron 200 \mul de protoplastos. Se
añadió una mezcla de 50 \mul de PEG y se mezcló suavemente e
incubó en hielo durante 20 minutos. Se añadieron 2 ml de una mezcla
de PEG a los tubos y se incubó a temperatura ambiente durante 5
minutos. Se añadieron 4 ml de sorbitol/Cl_{2}Ca (para un total de
6,25 ml) a los tubos. Esta mezcla de transformación se dividió en 3
alícuotas de \sim2 ml por cada recubrimiento. Los 2 ml se
añadieron a un tubo de agar superior con sorbitol acetamida fundido
y la mezcla de recubrimiento se vertió sobre las placas de sorbitol
acetamida para la selección de transformantes capaces de crecer con
acetamida como única fuente de nitrógeno. Las placas se incubaron a
28-30ºC hasta que aparecieron las colonias. Los
transformantes se purificaron mediante pasaje repetido de colonias
únicas sobre medio con acetamida (receta de acetamida sorbitol
sin
sorbitol).
sorbitol).
\vskip1.000000\baselineskip
40 ml de Solución de
\beta-D-glucanasa: 600 mg de
\beta-D-glucanasa; 400 mg de
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O y 40 ml de sorbitol 1,2 M.
200 ml de mezcla PEG: 50 g de PEG4000
(BDH Laboratory Supplies Poole, England) y 1,47 g de
Cl_{2}Ca\cdot2H_{2}O disuelto con H_{2}O MilliQ.
Sorbitol/Cl_{2}Ca: sorbitol 1,2 M y
Cl_{2}Ca 50 mM.
Para la selección de amdS, se utilizaron las
placas y los recubrimientos de sorbitol acetamida. Para la
purificación de esporas, se utilizaron las mismas placas, pero sin
sorbitol.
Sorbitol acetamida Agar (placas de agar
superior)
Acetamida (Aldrich 99% sublimado) -0,6 g/L; CsCl
- 1,68. g/L; Glucosa - 20 g/L; KH_{2}PO_{4} - 20 g/L;
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O - 0,6 g/L; CaCl_{2}\cdot2H_{2}O -
0,6 g/L; 1000X sales (véase más abajo) - 1 ml. pH ajustado a 5,5 y
el volumen llevado a 300 ml. Se filtró estérilmente con filtros de
0,22 micras y se calentó a 55ºC en una estufa. Se añadieron 20 g de
Noble Agar (bajo punto de fusión para agar superior) a 700 ml de
agua y 218 g de Sorbitoly luego se autoclavaron. Esta mezcla se
enfrió a 55ºC, se esterilizó por filtración, se añadió una mezcla
de acetamida y se vertió en los tubos o
placas.
placas.
Sales 1000X- FeSo_{4}\cdot7H_{2}O
(0,5 g/100 ml); MnSO_{4}\cdotH_{2}O (0,16 g/100 ml);
ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O (0,14 g/100 ml);
CoCl_{2}\cdot6H_{2}O (0,1 g/100 ml) y eterilizados por
filtración con un filtro de 0,22 \mum.
Agar de dextrosa y patata (PDA, Medio de
cultivo deshidratado de Difco)- Se mezclaron patatas, infusión de
patatas 200 g/L; Dextrosa, 20 g/L y agar, 15 g/L en un volumen final
de 50-80% de H_{2}O y luego se llevó al 100% de
volumen final. Esta mezcla se autoclavó, se enfrió a 55ºC y se
vertió.
Para producir un agar con leche descremada al 1%
para un pH de 3,5, se preparó medio PDA como antes y se añadió a
100 ml de medio PDA fundido, 1,8 ml de ácido tartárico al 10% y
12,5 ml de leche descremada al 8% y se vertió en las placas. Para
pre-esterilizar la leche descremada, se autoclavó
leche descremada al 8% (Difco) durante 10 minutos, a
122-123ºC, y a presión en la cámara de
32-35 psi. La mezcla se retiró, se enfrió y
almacenó a temperatura ambiente.
La expresión de proteasa se evaluó en
transformantes al cabo de 3 días de crecimiento en frascos de
agitación. El medio de cultivo de T. reesei (Davis y col.,
(1970) Methods Enzymol. 17:79 - 143) se inoculó con un tapón de
agar. Los cultivos se incubaron durante 3 días a 30ºC, con
agitación. El caldo de cultivo se pasó a través de un filtro de
0,22 micras, y el filtrado se esparcido en gotas sobre el agar con
leche descremada al 1%. Se observaron zonas de aclaramiento tras
una noche de incubación a temperatura ambiente.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Las raspas de maíz (#2 Yellow Dent), que se
utilizan típicamente en la industria del etanol se fraccionaron
para obtener una fracción de endosperma. Tanto el maíz como la
fracción de endosperma/gluten se trituraron para obtener una
muestra que pasara >95% a través de un tamiz de 1,5 mm (Perten
Laboratory Mill 3100, Suecia). El contenido de humedad y el
contenido total de almidón de las fracciones de raspas de maíz y de
endosperma se determinaron (cada frasco contenía cantidades iguales
de almidón (32% DS para raspas de maíz y 29,9% DS para la fracción
de endosperma). El pH se ajustó a 4,2 con H_{2}SO_{4} 6N. AnGA
(DISTILLASE L-400, Genencor International, Inc.) o
TrGA se añadieron a 1,0 GAU/g ds y la alfa amilasa estable en ácido
de Aspergillus kawachi (AkAA) obtenida de la expresión de
Trichoderma tal como se describe en USP 2005/0266543 se
añadió a 3 SSU/g DS. NSP24 se añadió a 0,5 SAPU/g DS junto con 400
ppm de urea. Se prepararon 5,0 g de levadura desecada Red Start
Ethanol Red (Lesaffre Yeast Corporation, Milwaukee, WI) en 45 ml de
DI H_{2}O y se mezclaron en un baño a 32ºC durante 1 hora antes
de la inoculación de los frascos de reacción con 0,5 ml de lodo de
levaduras. Los frascos se colocaron en un baño maría a 32ºC y la
masa (lodo) se mezcló suavemente durante el periodo de fermentación
completo. Se extrajeron muestras durante la fermentación para el
análisis por columna de HPLC: Phenomenex Rezex Organic Acid Column
(RHM-Monosaccaride) #00H 0132-KO
(Equivalente a la de Bio-Rad 87H); temperatura de
la Columna: 60C; Fase Móvil: H_{2}SO_{4} 0,01N; Velocidad de
flujo 0/6 mL/min; Detector: RI; y volumen de inyección: 20 uL. La
fermentación se finalizó al cabo de 72 horas. Los perfiles de HPLC
para los azúcares, ácidos lácticos, glicerol y etanol en diversos
intervalos de tiempo de las muestras se muestran en la Tabla 1. La
masa se secó a 60ºC para obtener el DDGS y el contenido de almidón
de DDGS se determinó mediante el procedimiento enzimático
dual.
dual.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La adición de NSP24 al medio de fermentación de
levaduras que contenía sustrato de almidón granular resultó en un
nivel elevado de alcohol y un nivel inferior de contenido de almidón
residual en el DDGS. El efecto es incluso más pronunciado con el
endospermo de maíz fraccionado comparado con el maíz completo
triturado.
\newpage
Ejemplo
3
Efecto de la proteasa sobre el rendimiento del
alcohol y el contenido de almidón residual de la DDGS durante la
fermentación de sustratos que contienen almidón granular, maíz
completo triturado y maíz fraccionado (maíz desgerminado) con
diferentes tamaños de partículas.
Maíz Yellow Dent #2 se trituró para obtener maíz
completo triturado con diferentes tamaños de partículas utilizando
un molinillo de martillos a escala de laboratorio (Perten Laboratory
Mill 3100, Suecia) y el maíz desgerminado se utilizó como un
ejemplo para maíz fraccionado. La distribución del tamaño de
partículas se cuantificó utilizando un tamiz estándar con poros de
tamaños distintos. En la Tabla 2 de más abajo, 95% significa que el
95% de las partículas pasaron a través de un tamiz de malla 30 (0,59
mm) y aproximadamente el 5% no pasó a través de un tamiz 10; fueron
retenidas en el tamiz; el 70% significa que el 70% de las partículas
pasaron a través de un tamiz de malla 30 (0,59 mm) y
aproximadamente el 30% no pasó a través del tamiz; fueron retenidas
en el tamiz; y el 50% significa que aproximadamente el 50% de las
partículas pasó a través de un tamiz de malla 30 (0,59 mm) y
aproximadamente el 50% no pasó a través del tamiz; fueron retenidas
en el tamiz. Se realizaron también determinaciones también del
contenido de humedad y del contenido de almidón en el maíz completo
triturado. Las fermentaciones se realizaron en frascos de 125 ml con
100 g de masa de maíz completo triturado (32% 15 ds) o maíz
fraccionado desgerminado (29,6& ds). Se añadió la urea (400 ppm)
a cada uno de los frascos de reacción y el pH se ajustó a 4,2 con
H_{2}SO_{4} 6N. STARGENTM 001, se añadió a 2,5 Kg/MT de maíz
DS. Se añadió NSP24 a 0,5 SAPU/g ds. Cinco gramos de maíz desecado
Red Star Ethanol Red (Lesaffre Yeast Corporation, Milwaukee, WI) en
45 ml de agua se prepararon y mezclaron en un baño maría a 32ºC
durante una hora antes de inocular el frasco; se añadieron 0,5 ml
de este lodo de levaduras a cada frasco. Los frascos se colocaron
en un baño maría a 32ºC y la masa se mezcló suavemente durante la
fermentación. Las muestras se tomaron durante la fermentación para
al análisis por HPLC con una columna HPLC Phenomenex Rezex Organic
Acid Column (RHM-Monosaccharide) #00H
0132-KO (Equivalente a Bio-Rad 87H);
temperatura de la columna: 60ºC; Fase móvil: H_{2}SO_{4} 0,01N;
velocidad de flujo: 0,6 ml/min; Detector: RI; volumen de inyección:
20 PL. Las fermentaciones se finalizaron a las 72 horas. Las
fermentaciones produjeron un número de compuestos incluyendo
azúcares, ácido láctico, glicerol y etanol a diversos intervalos de
muestreo y algunos de los niveles determinados por HPLC se muestran
más abajo. La masa se secó a 60ºC para obtener DDGS, y el contenido
de almidón de la DDGS a las 72h de fermentación del caldo se
determinó mediante el método enzimático
dual.
dual.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
De la tabla se observa que la adición de
proteasa durante la fermentación de los sustratos de almidón
granular (maíz completo triturado o maíz fraccionado) es un
rendimiento elevado de alcohol y un bajo rendimiento de almidón
residual en DDGS. El efecto es incluso más pronunciado con
partículas trituradas gruesas o maíz completo triturado o maíz
fraccionado. Estos resultados sugieren que la adición de proteasa
permite la utilización de un tamaño de partícula grueso de los
sustratos de granos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
100 g de una masa DS al 29,5% de endosperma
(maíz desgerminado, 75,8% de almidón, tamaño de partícula del 99,5%
<malla de 30) se transfirieron a un frasco de 125 ml, se
añadieron 400 ppm de urea y el pH se ajustó a 0pH 4,5. Se añadió
NSP24 (1,0 SAPU/g ds) y se prosiguió con la adición de STARGEN 001
(Genencor International) a 2,8 Kg/MT de almidón. Los frascos se
inocularon con 0,5 ml de levadura al 20% (Red Star Ethanol Red) y se
colocaron en un baño maría a 32ºC. Los contenidos de los frascos se
agitaron continuamente para su mezcla uniforme durante la
incubación. Se tomaron muestras a diferentes intervalos de tiempo
para el análisis HPLC. El contenido en almidón residual y proteína
de DDGS a las 72h se determinó y algunos resultados se muestran
más
abajo.
abajo.
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Tal como se puede observar de los resultados
anteriores, la adición de NSP24 dio como resultado una reducción de
los niveles del contenido de almidón granular al término de la
fermentación. La adición de NSP24 al medio de fermentación que
contenía maíz fraccionado desgerminado no cocido también resultó en
una tasa de fermentación más rápida y un rendimiento de alcohol
superior.
\newpage
Ejemplo
5
Una masa ds al 30% en agua y diferentes
porcentajes de vinaza reciclada con agua, en donde la vinaza
reciclada se obtuvo de una fermentación convencional del molido seco
se preparó utilizando endosperma de maíz fraccionado (que contenía
78,15% de almidón DS y un contenido de humedad -%). Las
fermentaciones se realizaron en frascos de 125 ml que contenían 100
g de masa de endosperma. El pH se ajustó a 4,2 con H_{2}SO_{4}
6N. Se añadió GA de DISTILLASE L-400 (Genencor
International Inc) a 1,0 GAU/gds y se añadió una alfa amilasa
estable en ácido de Aspergillus kawachi (patente americana
US 2005/0266543) a 3 SSU/g ds. Se añadió NSP24 a 0,5 SAPU/g ds.
Cinco gramos de levadura desecada Red Star Ethanol Red (Lesaffre
Yeast Corporation, Milwaukee, WI) en 45 ml de agua se prepararon y
mezclaron en un baño maría a 32ºC durante una hora antes de inocular
el frasco; se añadieron 0,5 ml de lodo de levadura a cada frasco.
Durante la fermentación, se recogieron muestras para el análisis
por HPLC con una columna HPLC: Phenomenex Rezex Organic Acid Column
(RHM-Monosaccharide) #00H 0132-KO
(Equivalente a Bio-Rad 87H); temperatura de columna:
60ºC; fase móvil: H_{2}SO_{4} 0,01N; velocidad de flujo: 0,6
ml/min; detector: RI; volumen de inyección: 20 \mul. Las
fermentaciones se finalizaron al cabo de 72 h. El perfil de HPLC se
determinó para los compuestos producidos durante la fermentación
incluyendo azúcares, ácido láctico, glicerol y etanol a diversos
intervalos de tiempo. La masa se secó a 60ºC para obtener el DDGS,
y el contenido de almidón de DDGS de la fermentación del caldo de 72
h se determinó por el método enzimático dual. Algunos de los
resultados se presentan en la Tabla 4 de más abajo y la Figura
5.
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Ejemplo
6
Efecto de los sólidos secos (ds) del maíz
fraccionado sobre el rendimiento de alcohol y del almidón residual
en condiciones de fermentación de levaduras con proteasa
añadida.
\newpage
El %DS de maíz completo triturado utilizado fue
del 32%, 34%, 36%, 38% y 40% y el %DS de endospermo de maíz
fraccionado fue del 30%, 32%, 34% y 36%. Las fermentaciones se
realizaron en frascos de 125 ml que contenían 100 g de masa de
endospermo. El pH se ajustó a 4,2 con H_{2}SO_{4} 6N. Se
añadieron 400 ppm de urea y se añadió STARGEN^{TM} 001 (Genencor
International Inc.) a 1,39 GAU/g ds de NSP24 a 0,5 SAPU/g ds. Cinco
gramos de levadura desecada Red Star Ethanol Red (Lesaffre Yeast
Corporation, Milwaukee, WI) en 45 ml de agua se prepararon y
mezclaron en un baño maría de 32ºC durante una hora antes de la
inoculación del frasco. Se añadieron 0,5 ml de lodo de levadura a
cada frasco. Los frascos se colocaron a continuación en un baño
maría a 32ºC durante 36 horas con agitación continua y la
temperatura se disminuyó a 25ºC y se mantuvo durante 72 horas.
Durante la fermentación, se recogieron muestras para el análisis por
HPLC en las condiciones descritas en el ejemplo 5. Las
fermentaciones se finalizaron a las 72 horas. Se determinaron los
perfiles de HPLC para los compuestos producidos durante la
fermentación, incluyendo azúcares, ácido láctico, glicerol y etanol
a diversos intervalos de tiempo. La masa se secó a 60ºC para
obtener DDGS y el contenido de almidón de DDGS del caldo de
fermentación de 72 h se determinó mediante el método enzimático
dual. Algunos de los resultados se muestran en la Tabla 5 y la
Figura 6.
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Ejemplo
7
Se preparó un sustrato de maíz completo
triturado 29% ds (de-aceite) con agua corriente. El
contenido de humedad del maíz triturado fue del 15,77%. Para el
pretratamiento, la masa se ajustó a un pH de 4,5 o 3,7 a 60ºC en un
baño de agua y se mantuvo durante 60 min. El pretratamiento (PT)
incluyó la adición de STARGEN 001 (Genencor International, 0,75
GAU/g AnGA) con o sin NSP24 dosificado a 0,2 Kg/MT. Después del
pretratamiento se añadió agua para ajustar la evaporación. Las
muestras pretratadas (PT) y las muestras de un lodo de maíz molido
que no se pretrató (no PT) se transfirieron a un frasco para
fermentación de levadura. La fermentación de levadura se llevó a
cabo por adición de 400 ppm de urea y 0,75 GAU/g de STARGEN 001 en
presencia de 0,2 Kg/MT de NSP24 o en ausencia de NSP24 a pH 4,5 o
3,7 a 30ºC. Se recogieron muestras a diferentes intervalos de tiempo
para el análisis por HPLC de etanol tal como se describió
previamente. El almidón residual (RS) en el caldo de fermentación a
las 68h se cuantificó con el procedimiento de enzima dual, y los
resultados se muestran en la Tabla 6.
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Esta lista de referencias citadas por el
solicitante es sólo para la conveniencia del lector. Ésta no forma
parte del documento de la patente Europea. Aunque se ha tenido mucho
cuidado al compilar las referencias, no se pueden excluir errores u
omisiones, por lo que la EPO declina cualquier responsabilidad a
este respecto.
\bullet US P4514496 A [0002] [0122]
\bullet WO 03066826 A [0002] [0122]
\bullet WO 03068976 A [0002]
\bullet WO 04106533 A [0002] [0122]
\bullet WO 04081193 A [0002] [0122]
\bullet WO 05052148 A [0002] [0122]
\bullet US 20050266543 A [0002] [0122]
[0168]
\bullet US 5231017 A [0003]
\bullet WO 2006073839 A [0003]
\bullet US 6768001 B [0014]
\bullet EP 0215594 A [0095]
\bullet US P5874276 A [0096]
\bullet US P6022725 A [0100]
\bullet US P6268328 B [0100]
\bullet US 6255115 B [0101]
\bullet WO 9934011 A [0102]
\bullet US P6605458 B [0102]
\bullet US P6254914 B [0112]
\bullet US P6899910 B [0112]
\bullet US P6936294 B [0112]
\bullet US P6936110 B [0112]
\bullet US P6408105 B [0112]
\bullet WO 2005052148 A [0122]
\bullet US P4618579 A [0122]
\bullet EP 171218 A [0122]
\bullet US P4092434 A [0122]
\bullet US P4863864 A [0122]
\bullet WO 04113551 A [0122]
\bullet WO 05087938 A [0122]
\bullet US 4316956 A [0130]
\bullet WO 9200381 A [0146] [0146]
\bullet WO 0004136 A [0146] [0146]
\bullet US P6352851 B [0146]
\bullet WO 8402921 A [0146]
\bullet WO 9928488 A [0146]
\bullet US RE32153 E [0146]
\bullet US 4587215 A [0146]
\bullet US 4514496 A [0146]
\bullet US 4092434 A [0146]
\bullet WO 04111218 A [0146]
\bullet US P5093257 A [0148]
\bullet US P6093562 A [0148]
\bullet US P5736499 A [0148]
\bullet US P5958739 A [0148]
\bullet US P6436888 B [0148]
\bullet US P6867031 B [0148]
\bullet WO 9639528 A [0148]
\bullet WO 9623874 A [0148]
\bullet WO 05001064 A [0148]
\bullet US P5278059 A [0148]
\bullet US P5545587 A [0148]
\bullet WO 05003337 A [0148]
\bullet WO 05001036 A [0157] [0157]
\bullet US P20050266543 A [0161]
\bullet US 05857167 B [0172]
\bullet US 2005046474 W [0172]
\bullet US 60640399 B [0172]
\bullet US 60648233 B [0172]
\bullet STARCH CHEMISTRY AND TECHNOLOGY.
Academic Press Inc, 1984 [0002]
\bullet STARCH CONVERSION TECHNOLOGY
[0002]
\bullet Food Science and Technology Series.
Marcel Dekker Inc [0002]
\bullet THE ALCOHOL TEXTBOOK. Nottingham
University Press, 1999 [0002]
\bulletUEDA et al. J.
Ferment. Tech., 1980, vol. 58, 237-242
[0002]
\bulletHAN et al.
Biotechnol. and Bioeng., 1987, vol. 30,
225-232 [0002]
\bulletFRITSCH; MANIATIS.
Molecular Cloning A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1989 [0014]
\bulletKRIEGLER. Gene Transfer and
Expression: A Laboratory Manual, 1990 [0014]
\bullet B. PERBAL. A Practical Guide
To Molecular Cloning, 1984 [0014]
\bullet Methods In Enzymology. Academic
Press, Inc, [0014]
\bullet Methods In Enzymology. vol. 154, 155
[0014]
\bulletSINGLETON et al.
DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY. John Wiley and
Sons, 1994 [0016]
\bulletHALE; MARHAM. THE HARPER
COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY. Harper Perennial, 1991
[0016]
\bulletALEXOPOULOS, C. J. INTRODUCTORY
MYCOLOGY. Wiley, 1962 [0067]
\bullet AINSWORTH AND BISBY DICTIONARY OF THE
FUNGI. CAB International University Press, 2001
[0067]
\bulletAUSUBEL et al. Current
Protocols in Molecular Biology. Greene Publishing and
Wiley-Interscience, 1995 [0088]
\bulletNEEDLEMAN et al. J.
Mol. Biol., 1970, vol. 48, 443 [0088]
\bulletSMITH. Adv. Appl. Math,
1981, vol. 2, 482 [0088]
\bulletPEARSON et al. Proc.
Natl. Acad. Sci, vol. 85, 2444 [0088]
\bulletALTSCHUL et al. Meth.
Enzyme, 1996, vol. 266, 460-480
[0088]
\bulletNUNBERG et al. Mol.
Cell Biol., 1984, vol. 4, 2306-2315
[0093]
\bulletYELTON, M. et al.
PNAS USA, 1984, vol. 81, 1470-1474
[0095]
\bulletMULLANEY, E. J. et al.
MGG, 1985, vol. 199, 37-45 [0095]
\bulletNUNBERG, J. H. et al.
Mol. Cell Biol., 1984, vol. 4, 2306 [0095]
\bulletBOEL, E. et al. EMBO
J., 1984, vol. 3, 1581-1585 [0095]
\bullet More Gene Manipulations in Fungi.
Academic Press, 1991,
70-76396-428 [0096]
\bullet Biotechnology of Filamentous Fungi.
FINKELSTEIN et al.
Butterworth-Heinemann. 1992 [0098]
\bulletKINGHORN et al. Applied
Molecular Genetics of Filamentous Fungi. Blackie Academic and
Professional, Chapman and Hall, 1992 [0098]
\bulletLORITO; HAYES;
DIPIETRO; HARMAN. Curr. Genet., 1993,
vol. 24, 349-356 [0100]
\bulletGOLDMAN; VANMONTAGU;
HERRERA-ESTRELLA. Curr. Genet.,
1990, vol. 17, 169-174 [0100]
\bulletPENTTILA; NEVALAINEN;
RATTO; SALMINEN; KNOWLES. Gene,
1987, vol. 6, 155-164 [0100]
\bullet The Molecular Biology of
Trichoderma and its Application to the Expression of Both
Homologous and Heterologous Genes. NEVALAINEN et al.
Molecular Industrial Mycology. Marcel Dekker Inc,
1992, 129-148 [0100]
\bulletYELTON; HAMER;
TIMBERLAKE. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984,
vol. 81, 1470-1474 [0100]
\bulletPODILA; KOLATTUKUDY.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, vol. 88,
8202-8212 [0100]
\bulletHOPWOOD et al. Genetic
Manipulation of Streptomyces: Laboratory Manual. The John
Innes Foundation, 1985 [0100]
\bulletFERNANDEZ-ABALOS et al.
Microbiol, 2003, vol. 149, 1623-1632
[0100]
\bulletBRIGIDI; DEROSSI;
BERTARINI; RICCARDI; MATTEUZZI. FEMS
Microbiol. Lett., 1990, vol. 55, 135-138
[0010]
\bulletSCOPES. Protein
Purification, 1982 [0103]
\bulletKIESER, T; M J. BIBB; M
J. BUTTNER; K F CHATER; D. A. HOPWOOD.
PRACTICAL STREPTOMYCES GENETICS. John Innes
Foundation, 2000 [0104]
\bulletHARWOOD et al. MOLECULAR
BIOLOGICAL METHODS FOR BACILLUS. John Wiley,
1990 [0104]
\bulletDAVIS et al. Methods
Enzymol., 1970, vol. 17, 79-143 [0104]
[0160]
\bullet The Alcohol Textbook. Nottingham
University Press, 1999 [0111]
\bulletSINGH; JOHNSTON. Adv.
Food and Nutr. Res., 2004, vol. 48,
151-171 [0112]
\bulletSINGH et al. Cereal
Chem, 1999, vol. 76, 868-872 [0112]
\bulletPONNAMPALAN et al.
Appl. Biochem. Biotech., 2004, vol. 115,
837-842 [0114]
\bullet The Technology of Corn Wet Milling.
SIMMS L. Starch Conversion Technology. Marcel Dekker
Inc, 1985 [0014]
\bullet Corn Dry Milling Industry.
BREKK O. L. Corn Culture Products. AVI Publishing,
1970, 262-291 [0115]
\bulletDUENSING et al. Corn Dry
Milling: Processes, Products and Applications in Corn: Chemistry and
technology [0115]
\bulletTOSI et al. Can. J.
Microbiol., vol. 39, 846-852 [0122]
\bulletCAMPOS et al. App and
Environ. Microbiol., 1995, vol. 61,
2436-2438 [0122]
\bulletALLISON et al. Cur.
Genet, 1992, vol. 21, 225-229 [0122]
\bulletUEDA et al.
Biotechnology. Bioeng, 1981, vol. 23, 291 [0122]
\bulletHAYASHIDA. Agr. Biol.
Chem., 1973, vol. 39, 2093-2099
[0122]
\bulletHAYASHIDA et al.
Agric. Biol. Chem., 1980, vol. 53,
923-929 [0122]
\bulletTAKAHASHI et al. J.
Biochem., 1985, vol. 98, 663-671
[0122]
\bulletASHIKARI et al.
Agric. Biol. Chem., 1986, vol. 50,
957-964 [0122]
\bulletUEDA et al. J.
Fermentation Technol., 1980, vol. 58,
237-242 [0122]
\bulletSWINKELS et al. STARCH
CONVERSION TECHNOLOGY. Marcel Dekker Inc, 1985,
32-38 [0126]
\bullet THE ALCOHOL TEXTBOOK, A REFERENCE FOR
THE BEVERAGE, FUEL AND INDUSTRIAL ALCOHOL INDUSTRIES. Nottingham
University Press, 1999 [0126]
\bullet THE ALCOHOL TEXTBOOK. NOTTINGHAM
UNIVERSITY PRESS, 1999 [0130]
\bullet THE ALCOHOL TEXTBOOK, A REFERENCE FOR
THE BEVERAGE, FUEL AND INDUSTRIAL ALCOHOL INDUSTRIES. NOTTINGHAM
UNIVERSITY PRESS, 1999 [0136]
\bulletBOEL et al. EMBO
J., 1984, vol. 3, 1097-1102 [0146]
\bulletHATA et al. Agric.
Biol. Chem, 1991, vol. 55, 941-949
[0146]
\bulletCHEN et al. Prot.
Eng., 1996, vol. 9, 499-505 [0146]
\bulletCHEN et al. Prot.
Eng., 1995, vol. 8, 575-582 [0146]
\bulletCHEN et al. Biochem
J., 1994, vol. 302, 275-281 [0146]
\bulletBOEL et al. EMBO
J., 1984, vol. 3, 1097-1102 [0146]
\bulletCHEN et al. Prot.
Eng., 1996, vol. 9, 499-505 [0146]
\bulletTAYLOR et al.
Carbohydrate Res., 1978, vol. 61,
301-308 [0146]
\bulletJENSEN et al. Can. J.
Microbiol., 1988, vol. 34, 218-223
[0146]
<110> Genencor International, Inc.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Proteasa fúngica ácida en la
fermentación de sustratos de almidón insolubles
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> GRF/FP6470231
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> 05857167.0
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2005-12-21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> PCT/US2005/046474
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2005-12-21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/640.399
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2004-12-30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/648.233
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2005-01-27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1302
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Trichoderma sp.
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 1
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 407
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Trichoderma sp.
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 2
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\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 355
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Trichoderma sp.
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 3
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\hskip0,8cm
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<210> 4
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<211> 9931
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pTrex3g_NSP24 plasmid
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<400> 4
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\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaccatgcag acctttggag ct
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttatttctga gcccagccca g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (24)
1. Procedimiento para disminuir la cantidad de
almidón residual producido de la fermentación de sustratos que
contienen almidón granular, dicho procedimiento comprende:
La fermentación de un sustrato que contiene
almidón granular con una proteasa NSP24, enzima hidrolizante del
almidón granular y un microorganismo de fermentación, en donde el
sustrato que contenía el almidón granular no se cuece; y la
obtención de un caldo fermentado en donde el % de almidón residual
en el caldo ha disminuido en comparación con la cantidad de almidón
residual de un procedimiento esencialmente similar sin la
proteasa,
en donde dicha proteasa NSP24 es:
- (i)
- una proteasa que tiene al menos un 85% de identidad de secuencia con la secuencia aminoacídica de Nº ID SEC:2; o (i) un fragmento activo biológicamente de (i) que tiene al menos 250 residuos aminoacídicos.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
donde el sustrato que contiene almidón granular es grano molido.
3. Procedimiento según la reivindicación 1, en
donde el caldo fermentado comprende menos de un 15% de almidón
residual.
4. Procedimiento según la reivindicación 2, en
donde el grano molido es grano de maíz fraccionado.
5. Procedimiento según la reivindicación 1, que
además comprende la recuperación de grano desecado de destilería
con solubles del caldo fermentado.
6. Procedimiento para la producción de etanol
que comprende:
- (a)
- la sacarificación de un sustrato de almidón insoluble molido con una composición de una enzima hidrolizante del almidón granular y una proteasa NSP24 a una temperatura por debajo de la temperatura de gelatinización del sustrato; y
- (b)
- la fermentación del sustrato de almidón sacarificado en condiciones de fermentación adecuadas para producir al menos un 80% de etanol v/v,
en donde dicha proteasa NSP24 es:
- (i)
- una proteasa que tiene por lo menos un 85% de identidad de secuencia con la secuencia aminoacídica NºID SEC:2; o
- (ii)
- un fragmento activo biológicamente de (i) que tiene por lo menos 250 residuos aminoacídicos.
7. Procedimiento según la reivindicación 6, en
donde al menos un 50% aproximadamente del sustrato de almidón
insoluble molido pasará a través de un tamiz de abertura de malla
30.
8. Procedimiento según la reivindicación 6, en
donde la composición de enzima hidrolizante de almidón granular
comprende la glucoamilasa.
9. Procedimiento según la reivindicación 8, en
donde la composición de enzima hidrolizante de almidón granular
comprende la alfa-amilasa.
10. Procedimiento según la reivindicación 6, en
donde el sustrato de almidón insoluble molido comprende granos
molidos.
11. Procedimiento según la reivindicación 6, en
donde el sustrato de almidón insoluble molido comprende granos
fraccionados.
12. Procedimiento según la reivindicación 11, en
donde el grano fraccionado es endospermo de maíz.
13. Procedimiento según la reivindicación 10, en
donde al menos se produce un 15% de etanol v/v de la fermentación
de un grano molido con un 25% a 35% DS.
14. Procedimiento según la reivindicación 6, en
donde las etapas de sacarificación y fermentación se llevan a cabo
simultáneamente.
15. Procedimiento según la reivindicación 6, en
donde la temperatura por debajo de la temperatura de gelatinización
se halla entre los 30ºC a 55ºC.
16. Procedimiento según la reivindicación 6, que
además comprende el pretratamiento de un sustrato de almidón
insoluble molido a una temperatura de aproximadamente 55ºC a 65ºC
durante aproximadamente 30 minutos a 3 horas.
17. Procedimiento según la reivindicación 6, en
donde el pretratamiento además comprende el contacto del sustrato
de almidón insoluble molido con una composición enzimática.
18. Procedimiento según la reivindicación 6, que
además comprende la recuperación del etanol producido.
19. Procedimiento de producción de etanol
aumentada en una fermentación sin cocción, que comprende el contacto
de un sustrato de almidón insoluble molido con una enzima
hidrolizante de almidón granular, una proteasa NSP24, y un
microorganismo fermentador en condiciones de fermentación adecuadas
y a una temperatura por debajo de la temperatura de gelatinización
del almidón para producir etanol en donde la producción de etanol
está aumentada en comparación con un procedimiento esencialmente
similar realizado sin proteasa NSP24, y en donde dicha proteasa
NSP24 es:
- (i)
- una proteasa que tiene al menos un 85% de identidad de secuencia con la secuencia aminoacídica de Nº ID SEC:2; o (ii) un fragmento biológicamente activo de (i) que tiene al menos 250 residuos aminoacídicos.
20. Procedimiento según la reivindicación 19, en
donde el aumento de etanol producido es de al menos un 0,5% v/v.
21. Procedimiento de producción de etanol en una
sacarificación y fermentación sin cocción simultáneas que incluye
sustratos de grano molidos que comprenden la adición de una proteasa
NSP24 con la sacarificación y fermentación simultáneas, en donde
dicha proteasa NSP24 es:
- (i)
- una proteasa que tiene al menos un 85% de identidad de secuencia con la secuencia aminoacídica de Nº ID SEC:2; o
- (ii)
- un fragmento biológicamente activo de (i) con 250 residuos aminoacídicos.
22. Procedimiento según la reivindicación 21, en
donde el sustrato de grano molido es endospermo de maíz
fraccionado.
23. Procedimiento según la reivindicación 21, en
donde los sustratos de grano molido tienen un tamaño de partícula
tal que al menos un 50% pasa a través de un tamiz de abertura de
malla 30.
24. Procedimiento según la reivindicación 22 que
además comprende el pretratamiento del sustrato de grano molido a
una temperatura de aproximadamente 55ºC a 65ºC durante desde 30
minutos hasta 4 horas.
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|---|---|---|---|---|
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| WO2006086792A2 (en) * | 2005-02-07 | 2006-08-17 | Novozymes North America, Inc. | Fermentation product production processes |
| AP2724A (en) | 2006-07-21 | 2013-08-31 | Xyleco Inc | Conversion systems for biomass |
| US7659098B2 (en) * | 2006-09-12 | 2010-02-09 | Masahiro Yamamoto | Method of treating waste from alcohol production |
| WO2008100837A2 (en) * | 2007-02-13 | 2008-08-21 | Renessen Llc | Fermentation process for the preparation of ethanol from a corn fraction having low oil content |
| DK2147104T3 (en) * | 2007-05-21 | 2015-12-14 | Danisco Us Inc | USING A ASPARAGINPROTEASE- (NSP24) SIGNAL SEQUENCE FOR heterologous protein EXPRESSION |
| EP2201127B1 (en) * | 2007-10-12 | 2015-03-18 | Archer-Daniels-Midland Company | Increased fiber hydrolysis by protease addition |
| PL2201108T3 (pl) | 2007-10-18 | 2015-03-31 | Danisco Us Inc | Mieszanki enzymów do fermentacji |
| CN101842479A (zh) * | 2007-11-01 | 2010-09-22 | 丹尼斯科美国公司 | 用于改良宿主细胞内蛋白质生产的信号序列和共表达的分子伴侣 |
| ES2527586T3 (es) | 2007-11-20 | 2015-01-27 | Danisco Us Inc. | Variantes de glucoamilasa con propiedades modificadas |
| MX2007016073A (es) * | 2007-12-14 | 2009-06-15 | Itesm | Proceso mejorado para obtener bioetanol a partir de grano de sorgo (sorghum bicolor l. moench) que integra las etapas de decorticación e hidrólisis con proteasas. |
| US8354256B2 (en) | 2008-03-11 | 2013-01-15 | Danisco Us Inc. | Glucoamylase and Buttiauxiella phytase during saccharification |
| EP2276848B9 (en) * | 2008-04-30 | 2015-02-25 | Danisco US Inc. | Enhanced fermentation process using molasses |
| US8252566B2 (en) * | 2008-05-20 | 2012-08-28 | Jj Florida Properties Llc | Ethanol production from citrus waste through limonene reduction |
| US9255280B2 (en) * | 2008-05-20 | 2016-02-09 | Jj Florida Properties Llc | Removal of fermentation inhibiting compounds from citrus waste using solvent extraction and production of ethanol from citrus waste |
| AU2009256456B2 (en) * | 2008-05-29 | 2012-11-08 | Danisco Us Inc. | Process for alcohol and co-product production from grain sorghum |
| CA2726688A1 (en) * | 2008-06-23 | 2010-01-21 | Novozymes A/S | Processes for producing fermentation products |
| FI121712B (fi) | 2009-04-30 | 2011-03-15 | Ab Enzymes Oy | Uusi sieniperäinen proteaasi ja sen käyttö |
| FI121711B (fi) | 2009-04-30 | 2011-03-15 | Ab Enzymes Oy | Sieniperäinen seriiniproteaasi ja sen käyttö |
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| CN102712915B (zh) | 2009-08-19 | 2014-12-10 | 丹尼斯科美国公司 | 具有改良比活和/或热稳定性的葡糖淀粉酶的组合变体 |
| PE20121504A1 (es) * | 2009-08-19 | 2012-11-05 | Dupont Nutrition Biosci Aps | Variantes de glucoamilasa |
| BR122019011255B1 (pt) | 2009-12-18 | 2020-12-01 | Novozymes, Inc | mutante de uma cepa de trichoderma reesei parental isolada, e, métodos para produzir um polipeptídeo e para obter um mutante de uma cepa de trichoderma reesei parental |
| UA114885C2 (uk) * | 2010-07-19 | 2017-08-28 | Ксілеко, Інк. | Спосіб переробки целюлозного або деревинноцелюлозного матеріалу |
| FI123942B (fi) | 2010-10-29 | 2013-12-31 | Ab Enzymes Oy | Sieniperäisen seriiniproteaasin variantteja |
| FI123425B (fi) | 2011-03-31 | 2013-04-30 | Ab Enzymes Oy | Proteaasientsyymi ja sen käytöt |
| US9175316B2 (en) * | 2012-12-12 | 2015-11-03 | Ebio, Llc | Efficient production of biofuels from cells carrying a metabolic-bypass gene cassette |
| ES2616917T3 (es) | 2011-12-22 | 2017-06-14 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Polipéptidos que tienen actividad de glucoamilasa y método para producirlos |
| US9567596B2 (en) | 2012-01-05 | 2017-02-14 | Glykos Finland Oy | Protease deficient filamentous fungal cells and methods of use thereof |
| DK2852610T3 (en) | 2012-05-23 | 2018-09-03 | Glykos Finland Oy | PRODUCTION OF FUCOSYLED GLYCOPROTEIN |
| WO2013181647A2 (en) | 2012-06-01 | 2013-12-05 | Danisco Us Inc. | Compositions and methods of producing isoprene and/or industrrial bio-products using anaerobic microorganisms |
| MX2015002099A (es) | 2012-08-22 | 2015-05-11 | Dupont Nutrition Biosci Aps | Variantes que tienen actividad glucoamilasa. |
| US20140134684A1 (en) * | 2012-11-09 | 2014-05-15 | The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture | Methods For Obtaining Oil From Maize Using Acid Protease and Cell-wall Polysaccharide-degrading Enzymes |
| CN105518130A (zh) | 2013-06-21 | 2016-04-20 | 丹尼斯科美国公司 | 用于梭菌转化的组合物和方法 |
| JP2016523552A (ja) | 2013-07-10 | 2016-08-12 | ノバルティス アーゲー | 多重プロテアーゼ欠損糸状菌細胞及びその使用方法 |
| WO2016012468A1 (en) | 2014-07-21 | 2016-01-28 | Novartis Ag | Production of glycoproteins with mammalian-like n-glycans in filamentous fungi |
| US9180463B1 (en) | 2014-08-29 | 2015-11-10 | Joseph R. Fitzgerald | Method for fractionation of dry material using accelerators |
| US11427839B2 (en) | 2014-08-29 | 2022-08-30 | Lee Tech Llc | Yeast stage tank incorporated fermentation system and method |
| US11680278B2 (en) | 2014-08-29 | 2023-06-20 | Lee Tech Llc | Yeast stage tank incorporated fermentation system and method |
| WO2016156077A1 (en) | 2015-03-30 | 2016-10-06 | Nestec S.A. | Milk-based protein hydrolysates and compositions made thereof |
| EP3353292A4 (en) * | 2015-09-25 | 2019-04-03 | Novozymes A/S | USE OF SERINE PROTEASE TO ENHANCE ETHANOL YIELD |
| US11166478B2 (en) | 2016-06-20 | 2021-11-09 | Lee Tech Llc | Method of making animal feeds from whole stillage |
| WO2018005229A1 (en) | 2016-06-30 | 2018-01-04 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | In feed assay of microbial proteases using peptide substrates |
| US11422911B2 (en) | 2019-03-14 | 2022-08-23 | International Business Machines Corporation | Assisted smart device context performance information retrieval |
| US11623966B2 (en) | 2021-01-22 | 2023-04-11 | Lee Tech Llc | System and method for improving the corn wet mill and dry mill process |
| WO2023244840A1 (en) | 2022-06-17 | 2023-12-21 | Lee Tech Llc | System for and method of producing pure starch slurry and alcohol by using a process combining wet corn milling and a dry corn milling processes |
Family Cites Families (65)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| USRE21604E (en) | 1940-10-22 | Harvester | ||
| JPS5519598B2 (es) | 1972-03-10 | 1980-05-27 | ||
| JPS5626396B2 (es) | 1974-03-11 | 1981-06-18 | ||
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| JPS5534046A (en) | 1978-09-01 | 1980-03-10 | Cpc International Inc | Novel glucoamyrase having excellent heat resistance and production |
| GB2089836B (en) | 1980-12-16 | 1984-06-20 | Suntory Ltd | Process for producing alcohol by fermentation without cooking |
| DE3132936A1 (de) | 1981-08-20 | 1983-03-03 | Henkel KGaA, 4000 Düsseldorf | "verfahren zur herstellung saurer protease und diese bildende mutanten der gattung rhizopus" |
| DE3149457A1 (de) | 1981-12-14 | 1983-06-23 | Henkel KGaA, 4000 Düsseldorf | Verfahren zur herstellung saurer protease und diese bildende mutanten von pilzen der gattung aspergillus |
| JPS58144105A (ja) | 1982-02-12 | 1983-08-27 | Kurabo Ind Ltd | スケ−ル除去獣毛繊維の製法 |
| NO840200L (no) | 1983-01-28 | 1984-07-30 | Cefus Corp | Glukoamylase cdna. |
| US4587215A (en) | 1984-06-25 | 1986-05-06 | Uop Inc. | Highly thermostable amyloglucosidase |
| EP0171218B1 (en) | 1984-08-06 | 1993-10-13 | Genencor, Inc. | Enzymatic hydrolysis of granular starch directly to glucose |
| JPH0630586B2 (ja) | 1984-12-15 | 1994-04-27 | サントリー株式会社 | グルコアミラ−ゼ遺伝子 |
| US4683195A (en) | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
| DE3688920D1 (de) | 1985-07-03 | 1993-09-30 | Genencor Int | Hybride Polypeptide und Verfahren zu deren Herstellung. |
| AU607398B2 (en) | 1985-08-29 | 1991-03-07 | Genencor Inc. | Heterologous polypeptides expressed in filamentous fungi, processes for making same, and vectors for making same |
| US5278059A (en) | 1985-12-04 | 1994-01-11 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaki Kenkyujo | Polypeptide possessing cyclomaltodextrin glucanotransferase activity |
| EP0344259A4 (en) | 1987-10-30 | 1991-04-24 | Lsi Logic Corporation | Method and means of fabricating a semiconductor device package |
| JPH01240184A (ja) | 1988-03-18 | 1989-09-25 | Ikeda Shiyokuken Kk | 耐熱性酸性プロテアーゼ |
| CA1333777C (en) * | 1988-07-01 | 1995-01-03 | Randy M. Berka | Aspartic proteinase deficient filamentous fungi |
| US5173403A (en) | 1989-02-24 | 1992-12-22 | Oklahoma Medical Research Foundation | Thermostable acid protease from sulfolobus acidocaldarius and gene |
| US5162210A (en) | 1990-06-29 | 1992-11-10 | Iowa State University Research Foundation | Process for enzymatic hydrolysis of starch to glucose |
| FR2666590A1 (fr) * | 1990-09-11 | 1992-03-13 | Sanofi Sa | Adn recombinant codant pour un precurseur de l'endothiapepsine, vecteur d'expression, bacteries et cellules eucaryotes transformees. |
| EP0562003B2 (en) | 1990-12-10 | 2015-04-01 | Danisco US Inc. | Improved saccharification of cellulose by cloning and amplification of the beta-glucosidase gene of trichoderma reesei |
| US5231017A (en) | 1991-05-17 | 1993-07-27 | Solvay Enzymes, Inc. | Process for producing ethanol |
| US5861271A (en) | 1993-12-17 | 1999-01-19 | Fowler; Timothy | Cellulase enzymes and systems for their expressions |
| BE1008738A3 (fr) * | 1994-06-17 | 1996-07-02 | Solvay | Systeme d'expression, vecteur d'integration et cellule transformee par ce vecteur d'integration. |
| US6093562A (en) | 1996-02-05 | 2000-07-25 | Novo Nordisk A/S | Amylase variants |
| DE69637940D1 (de) | 1995-02-03 | 2009-07-09 | Novozymes As | Eine methode zum entwurf von alpha-amylase mutanten mit vorbestimmten eigenschaften |
| US5736499A (en) | 1995-06-06 | 1998-04-07 | Genencor International, Inc. | Mutant A-amylase |
| EP0904360B1 (en) | 1996-04-30 | 2013-07-31 | Novozymes A/S | alpha-AMYLASE MUTANTS |
| US5958739A (en) | 1996-06-06 | 1999-09-28 | Genencor International Inc. | Mutant α-amylase |
| DE69813800T2 (de) | 1997-01-21 | 2004-02-12 | Mitsubishi Chemical Corp. | Organische verbindungen enthaltend silizium oder germanium, übergangsmetallkomplexe, katalysatoren für alpha-olefin polymerisation und verfahren zur herstellung von alpha-olefinpolymeren |
| DE69822142T2 (de) | 1997-04-07 | 2005-03-03 | Unilever N.V. | Transformation von schimmeln durch agrobacterium, insbesondere von der gattung aspergillus |
| EP1032655B1 (en) | 1997-11-21 | 2005-06-29 | Novozymes A/S | Protease variants and compositions |
| DE19752855C2 (de) | 1997-11-28 | 2003-04-03 | Bundesrepublik Deutschland Let | Retrovirale Pseudotyp-Vektoren mit modifizierten Oberflächen-Hüllproteinen und Verpackungszelle zu ihrer Herstellung für den selektiven Gentransfer |
| JP2002500019A (ja) | 1997-12-24 | 2002-01-08 | ジェネンコア インターナショナル インコーポレーテッド | 好ましい酵素および／または好ましい洗剤組成物についての改良された分析方法 |
| JPH11328408A (ja) | 1998-05-12 | 1999-11-30 | Advantest Corp | データ処理装置および方法、情報記憶媒体 |
| US6352851B1 (en) | 1998-07-15 | 2002-03-05 | Novozymes A/S | Glucoamylase variants |
| US6268328B1 (en) | 1998-12-18 | 2001-07-31 | Genencor International, Inc. | Variant EGIII-like cellulase compositions |
| US6254914B1 (en) | 1999-07-02 | 2001-07-03 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Process for recovery of corn coarse fiber (pericarp) |
| ATE288493T1 (de) | 1999-12-30 | 2005-02-15 | Genencor Int | Trichoderma reesei xylanase |
| US6566125B2 (en) * | 2000-06-02 | 2003-05-20 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Use of enzymes to reduce steep time and SO2 requirements in a maize wet-milling process |
| US6936294B2 (en) | 2001-12-04 | 2005-08-30 | Satake Usa, Inc. | Corn degermination process |
| US20030180900A1 (en) | 2002-02-08 | 2003-09-25 | Oreste Lantero | Methods for producing ethanol from carbon substrates |
| AU2003205556A1 (en) | 2002-02-14 | 2003-09-04 | Novozymes A/S | Process for producing starch hydrolysate |
| CN1780560B (zh) | 2003-03-10 | 2011-05-25 | 布罗因联合公司 | 利用生淀粉生产乙醇的方法 |
| CN1788083B (zh) * | 2003-03-10 | 2011-10-05 | 诺维信公司 | 酒精产品生产方法 |
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| US20080113418A1 (en) * | 2004-01-16 | 2008-05-15 | Novozymes A/S | Processes for Producing a Fermantation Product |
| CA2559015C (en) | 2004-03-10 | 2014-07-29 | Broin And Associates, Inc. | Methods and systems for producing ethanol using raw starch and fractionation |
| WO2005117756A2 (en) * | 2004-05-27 | 2005-12-15 | Genencor International, Inc. | Acid-stable alpha amylases having granular starch hydrolyzing activity and enzyme compositions |
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