CN102719483B - 一种提高植物发酵沼气产量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高植物发酵沼气产量的方法。属生物技术领域。首先克隆白腐真菌的木质素过氧化物酶基因和猛过氧化物酶基因，枯草芽孢杆菌的漆酶基因和木霉的葡聚糖内切酶基因、葡聚糖外切酶基因和β葡萄糖苷酶基因；构建含以上六种基因表达框架的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒，将其质粒转化枯草芽孢杆菌获得工程菌；将枯草芽孢杆菌工程菌应用于植物原料发酵沼气的预处理过程以及与天然的沼气发酵微生物联合应用于发酵植物原料生产沼气过程，起到显著提高植物原料的利用率和增加沼气产量的作用。本发明解决了植物发酵沼气中遗留的木质素和纤维素不能有效地被水解利用的问题，有利于利用植物发酵沼气的产业的发展。

Description

一种提高植物发酵沼气产量的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及构建携带木质素过氧化物酶基因表达框架、猛过氧化物酶基因表达框架、漆酶基因表达框架、葡聚糖内切酶基因表达框架、葡聚糖外切酶基因表达框架和β-葡萄糖苷酶基因表达框架的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒的枯草芽孢杆菌工程菌和应用工程菌提高植物发酵沼气产量的方法。具体是一种应用携带木质素过氧化物酶基因表达框架、猛过氧化物酶基因表达框架、漆酶基因表达框架、葡聚糖内切酶基因表达框架、葡聚糖外切酶基因表达框架和β-葡萄糖苷酶基因表达框架的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒的枯草芽孢杆菌工程菌对植物原料进行预处理以及与天然的沼气发酵微生物共同厌氧消化植物生产沼气的方法。
背景技术
沼气是一些有机物质在一定的温度、湿度、酸度条件下，隔绝空气，经微生物发酵而产生的一种以甲烷为主的可燃混合气体，是一种有多种用途的可再生能源。它能够代替石化燃料而应用于动力和热的产生，也能作为车用燃气，还能替代天然气作为生产一些化学制剂的原料。通过厌氧发酵生产沼气是一条CO2零排放的生产途径。
沼气发酵必须有微生物参与。沼气发酵微生物是一个统称，包括发酵性细菌、产氢产乙酸菌、耗氢产乙酸菌、食氢产甲烷菌、食乙酸产甲烷菌五大类群。植物物质(包括农林废弃物，能源作物和水生植物等)是生产沼气的主要原料来源，由于能够通过光合作用而再生，资源十分的丰富。然而，在沼气发酵中，植物的发酵时间较长，有效成分转化为沼气的效率较低，通常小于50％。植物的粗纤维约占植物总物质的70～80％。粗纤维主要包括纤维素、半纤维素和木质素物质，其中纤维素所占的比例最大。纤维素和半纤维素水解后生成能被沼气发酵微生物食物链中之下游微生物所能利用的糖。但是纤维素分子之间被木质素镶嵌，被镶嵌着的纤维素不能被水解。木质素是由苯基丙烷结构单元通过醚键、碳-碳键联结而成的高分子化合物。用物理、化学或生物的方法于发酵之前对植物材料进行预处理使木质素水解，但是其作用很难达到完全。植物发酵沼气的预处理是其生产过程的瓶颈问题之一，是研究的热点之一。当前，对植物原料的预处理的物理法主要是机械粉碎法、高温热解预处理以及辐射预处理等，但是物理法耗能大，并且需要特殊设备；化学处理法具有工艺简单、效率高等特点，但所需无机酸、碱浓度高，处理后的纤维素和半纤维素损失大(回收率仅约50％)。与化学法预处理和物理法预处理相比，生物法具有反应温和、能耗较小，设备简单，不会带来环境污染等诸多优点。复合菌种方法和白腐真菌方法是生物法预处理植物原料的主要研究方向。前者一般包括多株具有分解木质素的微生物及由霉菌、细菌和放线菌等多种微生物组成的辅助功能菌的联合应用。其优势在于能够在分泌木质素酶上互补，使形成完整的木质素酶系，并且在生长上相互依存。但是，由于这些微生物的种类不同，其生长条件(包括温度的需求、酸碱度的需求和营养的需求)不可能一致，难于实现高效的表达酶。后者是应用含木质素酶的白腐真菌进行预处理。这种方法的优势在于，白腐真菌有完整的木质素酶系，但是白腐真菌生长缓慢，需较长的预处理过程。木质素酶系由木质素过氧化物酶，猛过氧化物酶和漆酶组成。木质素酶系具有分解木质素的功能。纤维素酶系由葡聚糖内切酶，葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶组成。纤维素在纤维素酶系的协同作用下水解成葡萄糖。近些年来，人们十分关注酶对于沼气发酵的作用。即在沼气生产的过程中(包括预处理和发酵过程)加入相关的酶。加酶的方法能够较好地提高沼气的产量，但是价格昂贵。
枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)营养要求低，繁殖迅速，是对环境无害的微生物，能分泌表达蛋白，并且兼性厌氧，对温度和酸碱环境的耐受范围较广。
发明内容
本发明的目的是为了解决当前的植物原料发酵沼气的木质素和纤维素不能有效地被水解的问题，根据木质素酶系具有水解木质素的作用，纤维素酶系具有水解纤维素为葡萄糖的作用，通过分子生物学技术，构建携带木质素过氧化物酶基因表达框架，猛过氧化物酶基因表达框、漆酶基因表达框架、葡聚糖内切酶基因表达框架，葡聚糖外切酶基因表达框架和β-葡萄糖苷酶基因表达框架的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒的枯草芽孢杆菌工程菌，而提供一种应用枯草芽孢杆菌工程菌进行植物原料沼气发酵的预处理以及与天然的沼气发酵微生物共同厌氧消化植物生产沼气的方法。
本发明所采用的技术方案是：
一种提高植物发酵沼气产量的方法，其步骤是：
1构建含木质素过氧化物酶基因表达框架、猛过氧化物酶基因表达框架、漆酶基因表达框架、葡聚糖内切酶基因表达框架、葡聚糖外切酶基因表达框架和β-葡萄糖苷酶基因表达框架的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒。
1.1应用反转录PCR技术克隆白腐真菌(Whiterotfungi)的木质素过氧化物酶基因和猛过氧化物酶基因；应用PCR技术克隆枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的漆酶基因；应用反转录PCR技术克隆木霉(Trichoderma)的葡聚糖内切酶基因、葡聚糖外切酶基因和β-葡萄糖苷酶基因。
1.2获得构建大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒所需的启动子、信号肽、转录终止子、抗性基因、大肠杆菌复制起点、革兰氏阳性杆菌复制起点、多克隆位点、氨苄青霉素抗性基因和G418抗性基因。
1.3构建如附图的含木质素过氧化物酶基因表达框架、猛过氧化物酶基因表达框架、漆酶基因表达框架、葡聚糖内切酶基因表达框架、葡聚糖外切酶基因表达框架和β-葡萄糖苷酶基因表达框架的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒。(说明.表达框架的DNA序列组成：启动子-信号肽-基因-转录终止子)
2.构建枯草芽孢杆菌工程菌。
2.1应用电转化方法将含木质素过氧化物酶基因表达框架、猛过氧化物酶基因表达框架、漆酶基因表达框架、葡聚糖内切酶基因表达框架、葡聚糖外切酶基因表达框架和β-葡萄糖苷酶基因表达框架的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒转化枯草芽孢杆菌(枯草芽孢杆菌转化子)。
2.2筛选高表达木质素过氧化物酶、猛过氧化物酶、漆酶、葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶的枯草芽孢杆菌转化子作为枯草芽孢杆菌工程菌。
3.将枯草芽孢杆菌工程菌应用于植物材料的沼气生产。
3.1将枯草芽孢杆菌工程菌应用预处理植物材料。
3.2将枯草芽孢杆菌工程菌与天然的沼气发酵微生物共同厌氧消化植物生产沼气。
本发明的提高植物发酵沼气产量的方法的优点体现于：
针对植物原料生产沼气的木质素不能有效地被水解，纤维素不能有效地被利用，致使原材料利用率低，沼气生产效率低，从而制约应用植物原料生产沼气产业发展的关键问题，而构建携带木质素过氧化物酶基因表达框架、猛过氧化物酶基因表达框架、漆酶基因表达框架、葡聚糖内切酶基因表达框架、葡聚糖外切酶基因表达框架和β-葡萄糖苷酶基因表达框架的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒的枯草芽孢杆菌工程菌，赋予其工程菌表达完整的木质素酶系和纤维素酶系的能力，并将这一工程菌应用于植物原料发酵沼气的预处理以及与天然的沼气发酵微生物共同厌氧消化植物生产沼气，起到加强植物原料的木质素的水解和纤维素的糖化作用，提高原材料利用率，提高沼气产量的作用。
附图说明
附图.含木质素过氧化物酶基因表达框架、猛过氧化物酶基因表达框架、漆酶基因表达框架、葡聚糖内切酶基因表达框架、葡聚糖外切酶基因表达框架和β-葡萄糖苷酶基因表达框架的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒。
A.巨大枯草芽孢杆菌的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子；S.α因子信号肽；G1.白腐真菌的木质素过氧化物酶基因；G2.白腐真菌的猛过氧化物酶基因；G3.枯草芽孢杆菌的漆酶基因；G4.木霉的葡聚糖内切酶基因；G5.木霉的葡聚糖外切酶基因；G6.木霉的β-葡萄糖苷酶基因；T.转录终止子；G418.G418抗性基因(应用于筛选枯草芽孢杆菌转化子)；ColE1.大肠杆菌复制起点；AMP.氨苄青霉素抗性基因(应用于筛选大肠杆菌转化子)；G+ori.革兰氏阳性菌复制起点。
具体实施方式
下面采用非限定性实施例对本发明作进一步说明。
实施例一
1.1.构建含木质素过氧化物酶基因表达框架、猛过氧化物酶基因表达框架、漆酶基因表达框架、葡聚糖内切酶基因表达框架、葡聚糖外切酶基因表达框架和β-葡萄糖苷酶基因表达框架的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒。
1.1.1构建克隆载体
由专业的DNA序列合成公司合成含革兰氏阳性菌复制起点、多克隆接头和大肠杆菌复制起点的两条碱基互补的双链，并且在每条DNA链序列的两端形成粘性末端。通过T4DNA连接酶的作用使其环化，形成DNA克隆载体。将这克隆载体命名为pPB。
1.1.2克隆木质素过氧化物酶，猛过氧化物酶，漆酶基因，葡聚糖内切酶，葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶基因。
1.1.2.1用反转录PCR扩增白腐真菌的木质素过氧化物酶基因和猛过氧化物酶基因合成如下PCR引物：
引物1.5’tcgaattcgccacctgttccaacggcaagaccgtcggc3’[说明：引物5’端的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的6个碱基)]
引物2.5’CAGCGGCCGCCTAAGCACCCGGAGGCGGAGGGATGCGCTG3’[说明：5’端的10个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的8个碱基)]
引物3.5’ttgaattcgcggtctgccccgacggcacccgcgtcagcc3’[说明：引物5’端的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的6个碱基)]
引物4.5’CTGCGGCCGCCTATGCGGGACCGTTGAACTGGACACCGGG3’[说明：5’端的10个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的8个碱基)]
应用RNA提取试剂盒提取白腐真菌菌属的总RNA，以总RNA为模板，应用cDNA合成试剂盒反转录成cDNA。以上述合成的cDNA为模板，应用引物1和引物2进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是白腐真菌的木质素过氧化物酶基因序列；以上述合成的cDNA为模板，应用引物3和引物4进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是白腐真菌的猛过氧化物酶基因序列
1.1.2.2用PCR扩增枯草芽孢杆菌的漆酶基因序列
合成如下PCR引物：
引物1.5’CGCCTAGGatgacacttgaaaaatttgtggatgctctccc3’[说明：5’端的8个碱基是酶护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的6个碱基)]
引物2.5’CAGCGGCCGCCTATTTATGGGGATCAGTTATATCCATCGG3’[说明：5’端的10个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的8个碱基)]
提取枯草芽孢杆菌基因组DNA，以基因组DNA为模板，用引物1和2进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是枯草芽孢杆菌漆酶基因序列。
1.1.2.3用反转录PCR扩增木霉的葡聚糖内切酶基因、葡聚糖外切酶基因和β葡萄糖苷酶基因
合成如下引物：
引物a：5′tcgaattcccgaattccagcagactg3′[说明：5’端的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的6个碱基)]
引物b：5′ttGCGGCCGCatgcggccgcctactttc3′[说明：5’端的10个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的8个碱基)]
引物c：5′gcgaattcccgaattccaagcttgct3′[说明：5’端的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的6个碱基)]
引物d：5′aaGCGGCCGCcagcggccgcttacaggaa3’[说明：5’端的10个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的8个碱基)]
引物e：5′ccgaattcgcgctacgtagttgtacct3′[说明5’端的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的6个碱基)]
引物f：5′tagcggccgcataagcggccgcctac3′[说明：5’端的10个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的8个碱基)]
应用RNA提取试剂盒提取木霉的总RNA，应用cDNA合成试剂盒合成其cDNA。以上述合成的木霉的cDNA为模板，应用引物a和引物b进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是木霉的葡聚糖内切酶基因序列；以上述合成的木霉的cDNA为模板，应用引物c和引物d进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是木霉的葡聚糖外切酶基因序列；以上述合成的木霉的cDNA为模板，应用引物e和引物f进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是木霉的β葡萄糖苷酶基因序列。
1.1.3分别构建各种酶基因表达框架
1.1.3.1用PCR扩增巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子序列
引物1：5’CCTACGTAGATCCATTATCGGTGAACCA3’[说明：引物5’端的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的6个碱基)]
引物2：5’GGGCATGCGGGTATTTCCTCCTTGAATGT3’[说明：引物5’端的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的6个碱基)]
提取巨大芽孢杆菌的基因组DNA，应用引物1和引物2进行PCR扩增，PCR产物经序列测定和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是巨大芽孢杆菌三磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子序列[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是三磷酸甘油醛脱氢酶启动子序列]：
CCTACGTAGATCCATTATCGGTGAACCATCTATTAAAGACATGCTTCATTTAATTAAGTCCGCTGGTATGGTTGTTCACGGAATAGGAGACGCTATGACAATGGCAGAACGCCGTAAAACACCACAAGCAGACTTAGAAAAAGTGAAAAATGGACATGCTGTAGGTGAGGCATTTGGATACTATTTTAATCATCAAGGCGAAGTTGTTCATAAAGTTAAAACAGTTGGCATACAACTCGATGATTTAAAGAACAATAAATGTGTTATTGCTGTTGCAGGAGGTTCATCAAAAGCAAAGGCAATTAAAGCGTTTATGCAACAAGCGCATGATTCGATTCTCATTACAGATGAAGGCGCCGCAAAAGAGTTAGTAAGGGATTTTAATTAATCCCTCATATAAAAAATACTTTTTACATTCAAGGAGGAAATACCCGCATGCCC
1.1.3.2由专业的DNA序列合成公司合成α因子信号肽[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是α因子信号肽序列]：
CCGCATGCATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTACACTAGTCC
1.1.3.3由专业的DNA序列合成公司合成转录终止子序列[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是转录终止子序列]：
GGACTAGTCCTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTCAAGTTGGGCACTTACGAGAAGACCGGTCTTGCTAGATTCTAATCAAGAGGATGTCAGAATGCCATTTGCCTGAGAGATGCAGGCTTCATTTTTGATACTTTTTTATTTGTAACCTATATAGTATAGGATTTTTTTTGTCATTTTGTTTCTTCTCGTACGAGCTTGCTCCTGATCAGCCTATCTCGCAGCTGATGAATATCTTGTGGTAGGGGTTTGGGAAAATCATTCGAGTTTGATGTTTTTCTTGGTATTTCCCACTCCTCTTCAGAGTACAGAAGATTAAGTGAGAAGTTCGTTTGTGCAAGCTTATC GATCC
1.1.3.4用重叠PCR法合成如下G418抗性基因序列[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是G418抗性基因序列]
GGATCGATCCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATGGTACCGG
1.1.3.5用重叠PCR法合成如下氨苄青霉素抗性基因序列[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是氨苄青霉素抗性基因序列]
5’CCGGTACCTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTGCAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAACACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATAAGCTTCC3’
1.1.3.6表达框架(启动子-信号肽-基因-转录终止子序列)的构建过程
A.构建木质素过氧化物酶基因表达框架：
通过DNA限制性内切酶和T4DNA连接酶的作用，将巨大芽孢杆菌的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列重组于pPB载体的多克隆位点；将α因子信号肽DNA序列重组于pPB载体的多克隆位点，并使其位于启动子序列的下游；将白腐真菌的木质素过氧化物酶基因序列重组于pPB载体的多克隆位点，并使其位于α因子信号肽DNA序列的下游；将转录终止子序列重组于pPB载体的多克隆位点，并使其位于基因序列下游。此含过氧化物酶基因表达框架的载体称为pPB1。
B.构建猛过氧化物酶基因表达框架：
通过DNA限制性内切酶和T4DNA连接酶的作用，将巨大芽孢杆菌的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列重组于pPB载体的多克隆位点；将α因子信号肽DNA序列重组于pPB载体的多克隆位点，并使其位于启动子序列的下游；将白腐真菌的猛过氧化物酶基因序列重组于pPB载体的多克隆位点，并使其位于信号肽序列的下游；将转录终止子序列重组于pPB载体的多克隆位点，并使其位于基因序列下游。此含猛过氧化物酶基因表达框架的载体称为pPB2。
C.构建漆酶基因表达框架：
通过DNA限制性内切酶和T4DNA连接酶的作用，将巨大芽孢杆菌的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列重组于pPB载体的多克隆位点；将α因子信号肽DNA序列重组于pPB载体的多克隆位点，并使其位于启动子序列的下游；将枯草芽孢杆菌的漆酶基因序列重组于pPB载体的多克隆位点，并使其位于信号肽序列的下游；将转录终止子序列重组于pPB载体的多克隆位点，并使其位于基因序列下游。此含漆酶基因表达框架的载体称为pPB3。
D.构建葡聚糖内切酶基因表达框架：
通过DNA限制性内切酶和T4DNA连接酶的作用，将巨大芽孢杆菌的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列重组于pPB载体的多克隆位点；将α因子信号肽DNA序列重组于pPB载体的多克隆位点，并使其位于启动子序列的下游；将木霉的葡聚糖内切酶基因序列重组于pPB载体的多克隆位点，并使其位于信号肽序列的下游；将转录终止子序列重组于pPB载体的多克隆位点，并使其位于基因序列下游。此含葡聚糖内切酶基因表达框架的载体称为pPB4。
E.构建葡聚糖外切酶基因表达框架：
通过DNA限制性内切酶和T4DNA连接酶的作用，将巨大芽孢杆菌的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列重组于pPB载体的多克隆位点；将α因子信号肽DNA序列重组于pPB载体的多克隆位点，并使其位于启动子序列的下游；将木霉的葡聚糖外切酶基因序列重组于pPB载体的多克隆位点，并使其位于信号肽序列的下游；将转录终止子序列重组于pPB载体的多克隆位点，并使其位于基因序列下游。此含葡聚糖外切酶基因表达框架的载体称为pPB5。
F.构建β葡萄糖苷酶基因表达框架：
通过DNA限制性内切酶和T4DNA连接酶的作用，将巨大芽孢杆菌的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列重组于pPB载体的多克隆位点；将α因子信号肽DNA序列重组于pPB载体的多克隆位点，并使其位于启动子序列的下游；将木霉的β葡萄糖苷酶基因序列重组于pPB载体的多克隆位点，并使其位于信号肽序列的下游；将转录终止子序列重组于pPB载体的多克隆位点，并使其位于基因序列下游。此含β葡萄糖苷酶基因表达框架的载体称为pPB6。
1.1.4完成表达载体的构建
1.1.4.1将6套表达框架组装于同一个克隆载体。
通过DNA限制性内切酶和T4DNA连接酶的作用，切取pPB2，pPB3，pPB4，pPB5和pPB6载体的表达框架，并将切下的这套表达框架依次插入于pPB1的多克隆位点。此载体称为pPB123456。
1.1.4.2通过DNA限制性内切酶和T4DNA连接酶的作用依次将氨苄青霉素抗性基因和G418基因重组于pPB123456载体的多克隆位点。构成含木质素过氧化物酶基因表达框架、猛过氧化物酶基因表达框架、漆酶基因表达框架、葡聚糖内切酶基因表达框架、葡聚糖外切酶基因表达框架和β-葡萄糖苷酶基因表达框架的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒(附图)。将构建的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒转化大肠杆菌，然后提取质粒DNA。以质粒DNA为模板，分别应用这六个基因的基因特异引物进行PCR扩增，并对PCR产物进行DNA序列测定证明构建的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒中含这6个酶基因；进一步用DNA限制性内切酶酶切构建的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒，通过对其质粒的分子量分析，证明所构建大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒是正确的。
1.2构建携带木质素过氧化物酶基因表达框架、猛过氧化物酶基因表达框架、漆酶基因表达框架、葡聚糖内切酶基因表达框架、葡聚糖外切酶基因表达框架和β-葡萄糖苷酶基因表达框架的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒的枯草芽孢杆菌工程菌。
按照常规方法制备枯草芽孢杆菌感受态，用电转化方法将含木质素过氧化物酶基因表达框架、猛过氧化物酶基因表达框架、漆酶基因表达框架、葡聚糖内切酶基因表达框架、葡聚糖外切酶基因表达框架和β-葡萄糖苷酶基因表达框架的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒转化枯草芽孢杆菌感受态，将经过转化作用的枯草芽孢杆菌细胞涂布于含G418浓度为700μg/ml的LB琼脂平板(1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％氯化钠)，37℃培养2天。从G418抗性平板上挑取菌落进行增菌。将枯草芽孢杆菌转化子进行摇瓶发酵表达，根据SDS-PAGE电泳初步分析目标蛋白的表达。用离子交换和分子筛层析方法分离纯化各种目标蛋白，然后将分离纯化的目标蛋白用蛋白印迹法进行验证(说明.蛋白印迹：委托专业的多肽合成服务公司人工合成以上六种蛋白序列C端的35个氨基酸序列，将这些合成的多肽分别注射于家兔制备抗这些多肽的抗体而应用于蛋白印迹)证明以上所述的6种基因在枯草芽孢杆菌中表达和分泌到胞外。挑选不同的克隆分别用摇瓶发酵表达，应用常规方法测定发酵液的木质素过氧化物酶活性、猛过氧化物酶活性、漆酶活性、葡聚糖内切酶活性、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶活性，筛选酶活性高的克隆作为携带木质素过氧化物酶基因表达框架、猛过氧化物酶基因表达框架、漆酶基因表达框架、葡聚糖内切酶基因表达框架、葡聚糖外切酶基因表达框架和β-葡萄糖苷酶基因表达框架的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒的枯草芽孢杆菌工程菌。
1.3应用构建的枯草芽孢杆菌工程菌预处理秸秆。
取1000公斤水稻秸秆日晒风干，然后粉碎秸秆长度至1cm以下。将粉碎的秸秆用水润湿1天后，加碳铵。充分搅拌混合。将以上混合物以等量分成9份，3份为实验组，3份为对照组1，另3份对照组2。实验组的每份材料中分别接种用LB培养培养OD600为1.8的携带木质素过氧化物酶基因表达框架、猛过氧化物酶基因表达框架、漆酶基因表达框架、葡聚糖内切酶基因表达框架、葡聚糖外切酶基因表达框架和β-葡萄糖苷酶基因表达框架的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒的枯草芽孢杆菌工程菌的菌液(菌液接种量为1/30体积，即30份体积的秸秆-水-碳铵混合物加一份体积的菌液)；对照组1的每份材料中分别加入1/30体积的用马铃薯培养基培养的OD600为1.8的白腐真菌菌液；对照组2的每份材料中分别加入复合菌剂(说明：市场上销售的复合菌剂，复合菌剂的加入量按照复合菌剂商品说明书添加)。用塑料薄膜覆盖，于室温堆沤5天。分别计算实验组、对照组1和对照组2的总固体含量变化。实验组的平均总固体含量比对照组1的平均总固体含量和对照组2的平均总固体分别少9.62％和9.95％。经过统计学的差异性分析证明，实验组的平均总固体含量变化与对照组1的平均总固体含量变化和对照组2的平均总固体含量变化存在显著性差异(P＜0.05)。
1.4应用携带木质素过氧化物酶基因表达框架、猛过氧化物酶基因表达框架、漆酶基因表达框架、葡聚糖内切酶基因表达框架、葡聚糖外切酶基因表达框架和β-葡萄糖苷酶基因表达框架的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒的枯草芽孢杆菌工程菌与沼气发酵微生物共同厌氧消化秸秆生产沼气。
在应用常规的复合菌剂的方法预处理的秸秆混合物，按照常规方法接种沼气分成6份，三份为对照组，三份为实验组。具体的配置按表1，分别置于相同规格的沼气发酵池中发酵15天。测量及记录实验组1，实验组2和对照组的产气量至第15天，对照组平均产气量为290万升，实验组平均产气量为2305万升。实验组的产气量明显多于对照组，统计学分析结果表明两组产气量的差异性呈显著性差异(P＜0.01)。
表1.每份发酵成分的配制
说明：白腐真菌、木霉、巨大芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的总RNA提取或基因组DNA提取之前的裂解菌细胞方法：将菌细胞加于9mg/ml的蜗牛酶溶液(蜗牛酶用1mol/L山梨醇溶解)于30℃振摇30分钟而裂解菌细胞。
实施例二
2.1.构建含木质素过氧化物酶基因表达框架、猛过氧化物酶基因表达框架、漆酶基因表达框架、葡聚糖内切酶基因表达框架、葡聚糖外切酶基因表达框架和β-葡萄糖苷酶基因表达框架的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒。
2.1.1构建克隆载体
由专业的DNA序列合成公司合成含革兰氏阳性菌复制起点、多克隆接头和大肠杆菌复制起点的两条碱基互补的双链，并且在每条DNA链序列的两端形成粘性末端。通过T4DNA连接酶的作用使其环化，形成DNA克隆载体。将这克隆载体命名为pPB。
2.1.2克隆木质素过氧化物酶，猛过氧化物酶，漆酶基因，葡聚糖内切酶，葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶基因。
2.1.2.1用反转录PCR扩增白腐真菌的木质素过氧化物酶基因和猛过氧化物酶基因合成如下PCR引物：
引物1.5’tcgaattcgccacctgttccaacggcaagaccgtcggc3’[说明：5’端的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的6个碱基)]
引物2.5’CAGCGGCCGCCTAAGCACCCGGAGGCGGAGGGATGCGCTG3’[说明：5’端的10个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的8个碱基)]
引物3.5’ttgaattcgcggtctgccccgacggcacccgcgtcagcc3’[说明：5’端的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的6个碱基)]
引物4.5’CTGCGGCCGCCTATGCGGGACCGTTGAACTGGACACCGGG3’[说明：5’端的10个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的8个碱基)]
应用RNA提取试剂盒提取白腐真菌菌属的总RNA，以总RNA为模板，应用cDNA合成试剂盒反转录成cDNA。以上述合成的cDNA为模板，应用引物1和引物2进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是白腐真菌的木质素过氧化物酶基因序列；以上述合成的cDNA为模板，应用引物3和引物4进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是白腐真菌的猛过氧化物酶基因序列
2.1.2.2用PCR扩增枯草芽孢杆菌的漆酶基因序列
合成如下PCR引物：
引物15’CGCCTAGGatgacacttgaaaaatttgtggatgctctccc3’[说明：5’端的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的6个碱基)]
引物2.5’CAGCGGCCGCCTATTTATGGGGATCAGTTATATCCATCGG3’[说明：5’端的10个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的8个碱基)]
提取枯草芽孢杆菌基因组DNA，以基因组DNA为模板，用引物1和2进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是枯草芽孢杆菌漆酶基因序列。
2.1.2.3用反转录PCR扩增木霉的葡聚糖内切酶基因、葡聚糖外切酶基因和β葡萄糖苷酶基因合成如下引物：
引物a：5′tcgaattcccgaattccagcagactg3′[说明：5’端的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的6个碱基)]
引物b：5′ttGCGGCCGCatgcggccgcctactttc3′[说明：5’端的10个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的8个碱基)]
引物c：5′gcgaattcccgaattccaagcttgct3′[说明：5’端的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的6个碱基)]
引物d：5′aaGCGGCCGCcagcggccgcttacaggaa3’[说明：5’端的10个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的8个碱基)]
引物e：5′ccgaattcgcgctacgtagttgtacct3′[说明：5’端的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的6个碱基)]
引物f：5′tagcggccgcataagcggccgcctac3′[说明：5’端的10个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的8个碱基)]
应用RNA提取试剂盒提取木霉的总RNA，应用cDNA合成试剂盒合成其cDNA。以上述合成的木霉的cDNA为模板，应用引物a和引物b进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是木霉的葡聚糖内切酶基因序列；以上述合成的木霉的cDNA为模板，应用引物c和引物d进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是木霉的葡聚糖外切酶基因序列；以上述合成的木霉的cDNA为模板，应用引物e和引物f进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是木霉的β葡萄糖苷酶基因序列。
2.1.3分别构建各种酶基因表达框架
2.1.3.1用PCR扩增巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子序列
引物1：5’CCTACGTAGATCCATTATCGGTGAACCA3’[说明：5’端的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的6个碱基)]
引物2：5’GGGCATGCGGGTATTTCCTCCTTGAATGT3’[说明：5’端的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(有下划线的6个碱基)]
提取巨大芽孢杆菌的基因组DNA，应用引物1和引物2进行PCR扩增，PCR产物经序列测定和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是巨大芽孢杆菌三磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子序列[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是三磷酸甘油醛脱氢酶启动子序列]：
CCTACGTAGATCCATTATCGGTGAACCATCTATTAAAGACATGCTTCATTTAATTAAGTCCGCTGGTATGGTTGTTCACGGAATAGGAGACGCTATGACAATGGCAGAACGCCGTAAAACACCACAAGCAGACTTAGAAAAAGTGAAAAATGGACATGCTGTAGGTGAGGCATTTGGATACTATTTTAATCATCAAGGCGAAGTTGTTCATAAAGTTAAAACAGTTGGCATACAACTCGATGATTTAAAGAACAATAAATGTGTTATTGCTGTTGCAGGAGGTTCATCAAAAGCAAAGGCAATTAAAGCGTTTATGCAACAAGCGCATGATTCGATTCTCATTACAGATGAAGGCGCCGCAAAAGAGTTAGTAAGGGATTTTAATTAATCCCTCATATAAAAAATACTTTTTACATTCAAGGAGGAAATACCCGCATGCCC
2.1.3.2由专业的DNA序列合成公司合成α因子信号肽[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是α因子信号肽序列]：
CCGCATGCATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTACACTAGTCC
2.1.3.3由专业的DNA序列合成公司合成转录终止子序列[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是转录终止子序列]：
GGACTAGTCCTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTCAAGTTGGGCACTTACGAGAAGACCGGTCTTGCTAGATTCTAATCAAGAGGATGTCAGAATGCCATTTGCCTGAGAGATGCAGGCTTCATTTTTGATACTTTTTTATTTGTAACCTATATAGTATAGGATTTTTTTTGTCATTTTGTTTCTTCTCGTACGAGCTTGCTCCTGATCAGCCTATCTCGCAGCTGATGAATATCTTGTGGTAGGGGTTTGGGAAAATCATTCGAGTTTGATGTTTTTCTTGGTATTTCCCACTCCTCTTCAGAGTACAGAAGATTAAGTGAGAAGTTCGTTTGTGCAAGCTTATC GATCC
2.1.3.4用重叠PCR法合成如下G418抗性基因序列[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是G418抗性基因序列]
GGATCGATCCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATGGTACCGG
2.1.3.5用重叠PCR法合成如下氨苄青霉素抗性基因序列[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是氨苄青霉素抗性基因序列]
5’CCGGTACCTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTGCAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAACACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATAAGCTTCC3’
2.1.3.6表达框架(启动子-信号肽-基因-转录终止子序列)构建过程
A.构建木质素过氧化物酶基因表达框架：
通过DNA限制性内切酶和T4DNA连接酶的作用，将巨大芽孢杆菌的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列重组于pPB载体的多克隆位点；将α因子信号肽DNA序列重组于pPB载体的多克隆位点，并使其位于启动子序列的下游；将白腐真菌的木质素过氧化物酶基因序列重组于pPB载体的多克隆位点，并使其位于α因子信号肽DNA序列的下游；将转录终止子序列重组于pPB载体的多克隆位点，并使其位于基因序列下游。此含过氧化物酶基因表达框架的载体称为pPB1。
B.构建猛过氧化物酶基因表达框架：
通过DNA限制性内切酶和T4DNA连接酶的作用，将巨大芽孢杆菌的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列重组于pPB载体的多克隆位点；将α因子信号肽DNA序列重组于pPB载体的多克隆位点，并使其位于启动子序列的下游；将白腐真菌的猛过氧化物酶基因序列重组于pPB载体的多克隆位点，并使其位于信号肽序列的下游；将转录终止子序列重组于pPB载体的多克隆位点，并使其位于基因序列下游。此含猛过氧化物酶基因表达框架的载体称为pPB2。
C.构建漆酶基因表达框架：
通过DNA限制性内切酶和T4DNA连接酶的作用，将巨大芽孢杆菌的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列重组于pPB载体的多克隆位点；将α因子信号肽DNA序列重组于pPB载体的多克隆位点，并使其位于启动子序列的下游；将枯草芽孢杆菌的漆酶基因序列重组于pPB载体的多克隆位点，并使其位于信号肽序列的下游；将转录终止子序列重组于pPB载体的多克隆位点，并使其位于基因序列下游。此含漆酶基因表达框架的载体称为pPB3。
D.构建葡聚糖内切酶基因表达框架：
通过DNA限制性内切酶和T4DNA连接酶的作用，将巨大芽孢杆菌的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列重组于pPB载体的多克隆位点；将α因子信号肽DNA序列重组于pPB载体的多克隆位点，并使其位于启动子序列的下游；将木霉的葡聚糖内切酶基因序列重组于pPB载体的多克隆位点，并使其位于信号肽序列的下游；将转录终止子序列重组于pPB载体的多克隆位点，并使其位于基因序列下游。此含葡聚糖内切酶基因表达框架的载体称为pPB4。
E.构建葡聚糖外切酶基因表达框架：
通过DNA限制性内切酶和T4DNA连接酶的作用，将巨大芽孢杆菌的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列重组于pPB载体的多克隆位点；将α因子信号肽DNA序列重组于pPB载体的多克隆位点，并使其位于启动子序列的下游；将木霉的葡聚糖外切酶基因序列重组于pPB载体的多克隆位点，并使其位于信号肽序列的下游；将转录终止子序列重组于pPB载体的多克隆位点，并使其位于基因序列下游。此含葡聚糖外切酶基因表达框架的载体称为pPB5。
F.构建β葡萄糖苷酶基因表达框架：
通过DNA限制性内切酶和T4DNA连接酶的作用，将巨大芽孢杆菌的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列重组于pPB载体的多克隆位点；将α因子信号肽DNA序列重组于pPB载体的多克隆位点，并使其位于启动子序列的下游；将木霉的β葡萄糖苷酶基因序列重组于pPB载体的多克隆位点，并使其位于信号肽序列的下游；将转录终止子序列重组于pPB载体的多克隆位点，并使其位于基因序列下游。此含β葡萄糖苷酶基因表达框架的载体称为pPB6。
2.1.4完成表达载体的构建
2.1.4.1将6套表达框架组装于同一个克隆载体。
通过DNA限制性内切酶和T4DNA连接酶的作用，切取pPB2，pPB3，pPB4，pPB5和pPB6载体的表达框架，并将切下的这套表达框架依次插入于pPB1的多克隆位点。此载体称为pPB123456。
2.1.4.2通过DNA限制性内切酶和T4DNA连接酶的作用依次将氨苄青霉素抗性基因和G418基因重组于pPB123456载体的多克隆位点。构成含木质素过氧化物酶基因表达框架、猛过氧化物酶基因表达框架、漆酶基因表达框架、葡聚糖内切酶基因表达框架、葡聚糖外切酶基因表达框架和β-葡萄糖苷酶基因表达框架的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒(附图)。将构建的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒转化大肠杆菌，然后提取质粒DNA。以质粒DNA为模板，分别应用这六个基因的基因特异引物进行PCR扩增，并对PCR产物进行DNA序列测定证明构建的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒中含这6个酶基因；进一步用DNA限制性内切酶酶切构建的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒，通过对其质粒的分子量分析，证明所构建大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒是正确的。
2.2构建携带木质素过氧化物酶基因表达框架、猛过氧化物酶基因表达框架、漆酶基因表达框架、葡聚糖内切酶基因表达框架、葡聚糖外切酶基因表达框架和β-葡萄糖苷酶基因表达框架的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒的枯草芽孢杆菌工程菌。
按照常规方法制备枯草芽孢杆菌感受态，用电转化方法将含木质素过氧化物酶基因表达框架、猛过氧化物酶基因表达框架、漆酶基因表达框架、葡聚糖内切酶基因表达框架、葡聚糖外切酶基因表达框架和β-葡萄糖苷酶基因表达框架的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒转化枯草芽孢杆菌感受态，将经过转化作用的枯草芽孢杆菌细胞涂布于含G418浓度为700μg/ml的LB琼脂平板(1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％氯化钠)，37℃培养2天。从G418抗性平板上挑取菌落进行增菌。将枯草芽孢杆菌转化子进行摇瓶发酵表达，根据SDS-PAGE电泳初步分析目标蛋白的表达。用离子交换和分子筛层析方法分离纯化各种目标蛋白，然后将分离纯化的目标蛋白用蛋白印迹法进行验证(说明.蛋白印迹：委托专业的多肽合成服务公司人工合成以上六种蛋白序列C端的35个氨基酸序列，将这些合成的多肽分别注射于家兔制备抗这些多肽的抗体而应用于蛋白印迹)证明以上所述的6种基因在枯草芽孢杆菌中表达和分泌到胞外。挑选不同的克隆分别用摇瓶发酵表达，应用常规方法测定发酵液的木质素过氧化物酶活性、猛过氧化物酶活性、漆酶活性、葡聚糖内切酶活性、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶活性，筛选酶活性高的克隆作为携带木质素过氧化物酶基因表达框架、猛过氧化物酶基因表达框架、漆酶基因表达框架、葡聚糖内切酶基因表达框架、葡聚糖外切酶基因表达框架和β-葡萄糖苷酶基因表达框架的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒的枯草芽孢杆菌工程菌。
2.3应用构建的枯草芽孢杆菌工程菌预处理秸秆以及与天然的沼气发酵微生物共同厌氧消化秸秆生产沼气。
取水稻秸秆日晒风干，然后粉碎秸秆长度至1cm以下。取粉碎后的水稻秸秆，混合均匀；将粉碎的秸秆用水润湿1天后，加碳铵。充分搅拌混合。将以上混合物以等量分成9份，3份为实验组，3份为对照组1，另3份对照组2。实验组的每份材料中分别接种用LB培养培养OD600为1.8的携带木质素过氧化物酶基因表达框架、猛过氧化物酶基因表达框架、漆酶基因表达框架、葡聚糖内切酶基因表达框架、葡聚糖外切酶基因表达框架和β-葡萄糖苷酶基因表达框架的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒的枯草芽孢杆菌工程菌菌液(菌液接种量为1/30体积，即30体积的秸秆-水-碳铵混合物中加入1体积的菌液)；对照组1每份材料中分别加入1/30体积的用马铃薯培养基培养的OD600为1.8的白腐真菌菌液；对照组2每份材料中分别加入复合菌剂(说明：市场上销售的复合菌剂，复合菌剂的加入量按照复合菌剂商品说明书添加)。用塑料薄膜覆盖，于室温堆沤5天后，分别将每份经过以上预处理物转入型号相同沼气发酵池进行厌氧发酵。厌氧发酵的具体的配置按表2。厌氧发酵15天沼气的产量见表3。用统计学分析表明实验组的产气量显著高于对照组1的产气量(P＜0.01)和对照组2的产气量(P＜0.01)。说明用携带木质素过氧化物酶基因表达框架、猛过氧化物酶基因表达框架、漆酶基因表达框架、葡聚糖内切酶基因表达框架、葡聚糖外切酶基因表达框架和β葡萄糖苷酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌预处理秸秆和与天然的沼气发酵微生物共同厌氧消化秸秆生产沼气是具有优越性的。
表2.每份发酵成分的配制
表3.每份发酵成分生产沼气的产量(万升)
说明：白腐真菌、木霉、巨大芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的总RNA提取或基因组DNA提取之前的裂解菌细胞方法：将菌细胞加于9mg/ml的蜗牛酶溶液(蜗牛酶用1mol/L山梨醇溶解)于30℃振摇30分钟而裂解菌细胞。

Claims (2)

1.一种提高植物发酵沼气产量的方法，其特征在于：
A.应用分子生物学技术克隆白腐真菌的木质素过氧化物酶基因、白腐真菌的锰过氧化物酶基因，枯草芽孢杆菌的漆酶基因，木霉的葡聚糖内切酶基因、木霉的葡聚糖外切酶基因和木霉的β葡萄糖苷酶基因；
B.构建含木质素过氧化物酶基因表达框架，锰过氧化物酶基因表达框架、漆酶基因表达框架、葡聚糖内切酶基因表达框架，葡聚糖外切酶基因表达框架和β-葡萄糖苷酶基因表达框架的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒，以上所述的表达框架的组成是：三磷酸甘油醛脱氢酶启动子-α因子信号肽-酶基因-转录终止子；
C.将以上构建的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒转化枯草芽孢杆菌，筛选高表达木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、漆酶、葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶的枯草芽孢杆菌转化子作为枯草芽孢杆菌工程菌；
D.将以上所构建的枯草芽孢杆菌工程菌直接与植物材料作用，枯草芽孢杆菌工程菌在生长代谢的过程中分泌木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶，漆酶，葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和β葡萄糖苷酶而降解植物材料的木质素和纤维素，应用于植物生产沼气的预处理以及与天然的沼气发酵微生物共同厌氧消化植物生产沼气。
2.根据权利要求1所述的一种提高植物发酵沼气产量的方法，其特征在于，将权利要求1所述的枯草芽孢杆菌工程菌制备成菌剂产品而应用于植物发酵沼气。
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