CN1884509A - 用于提高沼气发酵产气率的混合水解酶制剂的制备方法 - Google Patents

Abstract

用于提高沼气发酵产气率的混合水解酶制剂的制备方法，属于用于沼气发酵的补充外源酶的制备方法。本发明目的是提供提高沼气发酵产气率混合水解酶制剂的制备方法。它具有下表所示酶活力指标的生产菌种：并以麦麸、米糠为混合培养基，采用菌种的固态法纯种两级扩大培养获得混合麸曲种，拌匀后28℃发酵3～4天，取样分析各酶活力值，补加商品酶制剂达到酶活力指标，风干至水分含量低于5％。所述混合麸曲种中蛋白酶的酶活力值不超过2000±5％μg酪氨酸/g·min。本发明菌种能从不同环境分离的细菌和真菌得 到。实验证明，向沼气池发酵原料内投入混合水解酶制剂，能提高沼气发酵原料水解速率和降解率，增加沼气发酵产气量、TS和VS产气潜力及沼气中甲烷量。

Description

用于提高沼气发酵产气率的混合水解酶制剂的制备方法

                              所属技术领域

本发明属于用于沼气发酵的补充外源酶的制备方法。

                                背景技术

1901年S_hngen指出产甲烷过程是一个微生物的过程，1967年O.W.Lawrence和P.L.McCarty提出了厌氧消化过程的阶段理论，即水解、产氢产乙酸和产甲烷三个阶段。沼气发酵是一个多菌群在厌氧条件下共生代谢、使有机物矿化为甲烷和二氧化碳的过程。自20世纪80年代后期出现小型高效沼气池以来，沼气的推广应用到达了一个较高的水平，使用管理十分方便，池型设计合理，无需大换料，实现的半连续发酵方法，池容产气率高，产气均衡。但国内外现有家用沼气池均普遍存在着原料利用率不高、产气量偏低等问题，而我国农村沼气池的猪粪原料产气率一般低于0.3m³/KgTS。由于产气率低不得不增大发酵容积，小型高效沼气池的池容都在6m³以上，一些地区还有8m³、甚至10m³以上，尽管如此，这些沼气池的池容产气率也只有0.3m³/m³·d左右。研究表明，水解酶酶活与沼气产量存在正比关系，水解酶活均出现在产气峰值的附近，并且水解酶活与沼气产量的变化曲线相似。国内外许多学者试图用高产水解酶的水解性细菌改善沼气发酵的水解过程，提高发酵原料的利用率，进而提高沼气产气率，但事实上，寻求高产水解酶的微生物至今很难有大的突破。研究表明，适量添加纤维素水解酶能加快发酵原料中纤维素的降解速度，提高沼气产量。此前，我们取得ZL01129073.0“沼气发酵生物活性添加剂”发明专利权，并提出申请号200510010991.2“应用木聚糖酶提高沼气发酵产气率的方法”发明专利申请，这两项发明显示：一定量的木聚糖酶与沼气发酵生物活性添加剂配合能改善发酵状况，能够提高连续发酵或半连续沼气发酵的起动过程产气率。但由于水解对象和产物不同，发酵体系引起混合菌群产生优势微生物存在时间差异，木聚糖酶与活性添加剂投入时间需要一定间隔，酶活力指标要求较高，尚未涉及混合酶制剂的生产方法。

                                发明内容

本发明的目的是提供用于添加进入沼气发酵系统、提高沼气发酵产气率的混合水解酶制剂的制备方法。

上述目的通过以下途径实现：

A、具有下表所示酶活力指标的生产菌种：

水解酶类	酶活单位	酶活力值
			糖化型淀粉酶	mg葡萄糖/g·h	50000±1％
液化型淀粉酶	mg可溶性淀粉/g·h	600±10％
			纤维素酶	μg葡萄糖/g·min	1000±10％
半纤维素酶	μg木糖/g·h	8000±5％

B、制备生产用种：以麦麸为培养基，加水调成浆状，分装于试管中或250mL的三角瓶中，121℃灭菌30分钟，冷却后分别接入上列菌种的纯斜面种，28℃恒温培养至各菌种长满麦麸，再用较大的容器分别扩大培养制备麸曲生产用种，将各菌麦麸种按相同体积或重量的量混合获得混合麸曲种；

C、固态法混合发酵：以麦麸80％～100％，辅料米糠0～20％为发酵原料，加水为原料体积的60～70％，发酵原料拌匀后接入5％左右的混合麸曲种，拌匀装入簸芨，扣盖相同大小的簸芨上架摆放，于28℃恒温培养3～4天，其间进行1～2次翻料，发酵完毕，风干至水分含量低于5％，各簸芨发酵产物集中混合均匀后装袋。

所述混合麸曲种中蛋白酶的酶活力值不超过2000±5％μg酪氨酸/g·min，过高的蛋白酶会降解糖化酶和其它水解酶，使加入的水解酶失活。

所述发酵原料为麦麸90％+米糠10％。

所述固态法混合发酵中，装入簸芨的料量以5～7cm为宜，发酵24小时揭盖降温，48小时成块状翻料降温，待菌丝长满并产生孢子，风干至水分含量低于5％。

所述取样分析各酶活力值，用市售商品酶制剂补充酶活力达到表列的酶活力值。

本发明生产用菌种能够从不同环境分离的细菌和真菌得到，有广泛的来源和种类，不作特别要求。如产生具有较高糖化酶型及液化型淀粉酶活性的黑曲霉或根霉属类；具有较高半纤维素酶和木聚糖酶活性的木霉属或黑曲霉；具有较高蛋白酶活性的米曲霉等。但以产蛋白酶为主的菌种不可混入混合麸曲种。

本发明采用菌种的固态法纯种两级扩大培养过程生产用种获得混合麸曲种，即以普通水解酶的微生物为菌种，经麦麸米糠混合培养基取得麸曲生产用种；固态混合发酵后取样分析各酶活力值，适量补加商品酶制剂达到酶活力指标。使用时，把混合水解酶制剂投入正常产沼气的沼气池发酵原料内，提高沼气发酵原料在厌氧消化过程中的水解速率，促进厌氧微生物活动，提高发酵原料的降解率和原料利用率，缩短新池起动时间，增加沼气发酵产气量、TS和VS产气潜力及沼气中甲烷量。

                                附图说明

图1为采用混合菌种，培养麸曲用种的制种工艺流程图。

图2为采用麦麸生料发酵，并适当添加商品酶制剂，混合水解酶制剂的产品生产工艺流程图。

                                具体实施方式

                        (一)混合水解酶制剂的制备

本发明混合水解酶制剂的制备涉及制种和产品生产两个部分，其一是制种工艺采用纯菌种固态法灭菌熟料扩大，培养麸曲生产用种；其二为产品生产工艺采用麦麸生料发酵，并适当添加商品酶制剂。

如图1，以麦麸为培养基，加水至麦麸含水量60～70％调成浆状，分装于试管中或250mL的三角瓶中，121℃灭菌30分钟，冷却后分别接入所需各菌种的纯斜面种，28℃恒温培养至各菌种长满麦麸，再用较大容器，如1000mL的三角瓶或普通的罐头瓶若干，对应分别扩大培养制备为麸曲生产用种。将各菌麦麸种按大约1∶1的量混合即获得混合麸曲种。以产蛋白酶为主的菌种不可混入，需单独培养与生产。

如图2，发酵原料为麦麸90％+米糠10％，加水到原料含水60～70％，发酵原料拌匀后接入5％左右的混合麸曲种，拌匀装入簸芨中，装入簸芨的料量冬天以6～8cm为宜，夏天以4～6cm为宜；上架摆放，上扣盖相同大小的簸芨，于室温培养3～4天，其间进行1～2次翻料；翻料时，不宜把料弄碎，应成块状进行翻料降温；发酵完毕，风干至水分含量低于5％。各簸芨发酵产物集中混合均匀后，取样分析各酶活值。若酶活力达不到下表1所示酶活力值的酶，用市集商品酶制剂补充相应酶活指标后，装袋密封，于阴凉干燥处贮藏。

                 表1  混合水解酶制剂酶活指标

水解酶类	酶活单位	产品酶活要求
			糖化型淀粉酶	mg葡萄糖/g·h	50000±1％
液化型淀粉酶	mg可溶性淀粉/g·h	600±10％
			纤维素酶	μg葡萄糖/g·min	1000±10％
蛋白酶	μg酪氨酸/g·min	2000±5％
			半纤维素酶	μg木糖/g·h	8000±5％

(二)混合水解酶制剂在沼气发酵中的作用和量效关系

以下术语中，

总固形物TS(Total Solid)指一定量的发酵物料在105℃下烘干至恒重所得净重。

挥发性物质VS(Volatility Substrate)指TS在马弗炉中550℃灼烧掉的挥发性部分。

用本发明混合水解酶制剂进行沼气发酵实验：

发酵原料：鲜猪粪，TS＝34.96％，VS＝47.07％

接种物：本室富集，TS＝7.28％，VS＝79.17％

发酵方法：500ml批量发酵装置，进行常温批量发酵，

发酵料液配比：接种物2400ml+鲜猪粪644.2g+补加沼液＝8000ml

发酵料液搅拌均匀后，取样测定其TS、VS、pH，烘干粉碎后测定其纤维素、木质素、脂肪含量见表2。

                         表2  发酵原料的各项指标

TS(％)	VS(％)	纤维素(％)	木质素(％)	脂肪(％)	pH
						3.86	64.40	10.84	20.83	1.52	6.8

采用批量发酵方法发酵，具体操作如下：取16套500ml气密性良好的批量发酵装置，编号分别为1-16号，各装入以上摇匀混合液400ml，进行预发酵，待正常产气后，随机分为4组，即对照组，实验1组、实验2组、实验3组。分别取沼气发酵混合水解酶制剂2.0g、4.0g、6.0g配制成50ml水溶液，各取5ml，分别加入实验1组、实验2组和实验3组，对照组各加入5ml自来水，发酵实验共17天，每天进行产气量的统计，统计结果见表3。整个发酵过程中pH和室温较稳定，pH在7.2-7.3之间、室温在23℃-25℃之间。

                  表3  沼气发酵生物活性添加剂对产气量的影响

发酵结束，分别取样测TS、VS、pH，料液在烘箱内烘干、粉碎，测定纤维素、木质素、脂肪的含量，结果统计如表4。结果表明，混合水解酶制剂对沼气发酵的影响表现在，提高沼气发酵的产气量15％以上，提高沼气发酵原料的TS、VS产气率，提高了沼气发酵原料中的纤维素、脂肪、木质素的降解率。

                   表4  沼气发酵生物活性添加剂对沼气发酵的影响

                        (三)混合水解酶剂的使用方法

新池启动时，当投料至一半左右，即加入沼气发酵混合水解酶制剂，具体做法为将混合水解酶制剂用10～20千克水或粪水、沼液均可，溶解拌匀后倒入池中，当天内投料至封池。在以后的运行中，每年的冬季加一次混合水解酶制剂，具体做法为把混合水解酶制剂与10～20千克发酵原料充分拌匀后，从进料口倒入池中即可。

混合水解酶制剂的用量是以酶活值确定的，包装有400克、600克左右一袋两种，每次每口4m³玻璃钢沼气池使用400克包装一袋；6m³玻璃钢沼气池使用600克包装一袋；8m³玻璃钢沼气池使用400克包装两袋。混合水解酶制剂易置于避光、干燥及低温下贮藏，保存期2年。

                   (四)混合水解酶制剂沼气发酵实验效果

利用沼气发酵混合水解酶制剂对4m³商品化户用玻璃钢沼气池进行了为期1年的沼气发酵试验，结果表明，混合水解酶制剂能够提高猪粪发酵的沼气产量，年产沼气总产量604.3m³，比常规多产沼气100m³以上；以温度在19～24℃之间常温发酵，猪粪的原料产气率为0.377m³/KgTS，比常规的0.30m³/KgTS提高25.67％；池容产气率全年均在0.4～0.5m³/m³·d左右，比常规池容产气率0.3m³/m³·d提高33％以上；混合水解酶制剂除提高沼气发酵的产气率、沼气产量、原料利用率外，还能缩短新池的启动时间；沼气甲烷含量提高到70％左右。

Claims (5)

1、用于提高沼气发酵产气率的混合水解酶制剂的制备方法，其特征是：

A、具有下表所示酶活力指标的生产菌种：   水解酶类   酶活单位   酶活力值   糖化型淀粉酶   mg葡萄糖/g·h   50000±1％   液化型淀粉酶   mg可溶性淀粉/g·h   600±10％   纤维素酶   μg葡萄糖/g·min   1000±10％   半纤维素酶   μg木糖/g·h   8000±5％

B、制备生产用种：以麦麸为培养基，加水调成浆状，分装于试管中或250mL的三角瓶中，121℃灭菌30分钟，冷却后分别接入上列菌种的纯斜面种，28℃恒温培养至各菌种长满麦麸，再用较大的容器分别扩大培养制备麸曲生产用种，将各菌麦麸种按相同体积或重量的量混合获得混合麸曲种；

C、固态法混合发酵：以麦麸80％～100％，辅料米糠0～20％为发酵原料，加水为原料体积的60％～70％，发酵原料拌匀后接入5％左右的混合麸曲种，拌匀装入簸芨，扣盖相同大小的簸芨上架摆放，于28℃恒温培养3～4天，其间进行1～2次翻料，发酵完毕，风干至水分含量低于5％，各簸芨发酵产物集中混合均匀后装袋。

2、根据权利要求1所述的用于提高沼气发酵产气率的混合水解酶制剂的制备方法，其特征是在混合麸曲种中蛋白酶的酶活力值不超过2000±5％μg酪氨酸/g·min。

3、根据权利要求1所述的用于提高沼气发酵产气率的混合水解酶制剂的制备方法，其特征是发酵原料为麦麸90％+米糠10％。

4、根据权利要求1所述的用于提高沼气发酵产气率的混合水解酶制剂的制备方法，其特征是在固态法混合发酵中，装入簸芨的料量以5～7cm为宜，发酵24小时揭盖降温，48小时成块状翻料降温，待菌丝长满并产生孢子，风干至水分含量低于5％。

5、根据权利要求1、2所述的用于提高沼气发酵产气率的混合水解酶制剂的制备方法，其特征是取样分析各酶活力值，用市售商品酶制剂补充酶活力达到表列的酶活力值。