CN105669876A - 灰树花多糖的提取工艺及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了灰树花多糖的提取工艺及其应用，采用水提→碱提→超滤→醇沉的方法获得灰树花多糖，并发现灰树花多糖可以通过上调TFF2的mRNA和蛋白表达水平、EGF的蛋白表达水平，下调TGF-β1的mRNA和蛋白表达水平等方面，促进胃粘膜上皮细胞增殖和向胃粘膜创伤区域迁移，从而达到促进胃粘膜愈合修复的目的，为灰树花的开发利用及战胜胃粘膜创伤和慢性胃炎提供了依据。

Description

灰树花多糖的提取工艺及其应用
技术领域
本发明涉及了灰树花多糖的提取工艺及其应用。
背景技术
胃黏膜具有防止胃液自身消化与各种损伤因子的刺激，保护胃黏膜细胞的生理功能的组织结构，该屏障的完整性是胃黏膜得以保护的重要基础。胃黏膜常因化学因素(喝酒、浓茶、咖啡、吸烟及刺激性药品如阿司匹林、消炎痛等)、物理因素(过冷、过烫、过于粗糙的食物或暴饮暴食)、细菌或其毒素刺激的原因造成损伤。临床多表现为胃脘部疼痛不适、饱胀、嗳气、反酸、胃烧灼感、恶心、呕吐等一系列症状。胃镜检查多出现不同程度的胃黏膜改变，如粘膜水肿、糜烂、渗出、充血、或由浅表溃疡，并有可能有出血或渗血等。胃黏膜损伤在临床上十分常见，是引发多数胃病的主要原因，目前尚无有效的防治手段。
灰树花Grifolafrondosa(Dicks.)Gray隶属真菌界，担子菌门，伞菌纲，多孔菌目，盖孔菌科，又名贝叶多孔菌，是一种食、药兼用蕈菌。大量的药理研究证明，灰树花多糖(GFP)具有显著的抗肿瘤、降血糖、降血脂、抑制B型肝炎DNA复制、抗HIV病毒、抗氧化以及改善免疫系统功能等功效，但暂未有其在修复胃粘膜创伤方面应用的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了灰树花多糖的提取工艺及其应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：
一种灰树花多糖的提取工艺，取灰树花子实体干品，粉碎后过10目筛，加入8～12倍量水微沸提取1～3h；过滤，滤渣用5～10倍量的1～3％的NaOH溶液进行浸提1～3h；过滤，滤液浓缩至Brix≥15％，离心，上清液先后泵入三个截留分子量依次减小的超滤分离组件，上一个超滤分离组件的滤出液继续泵入下一个超滤分离组件，分别收集每个超滤分离组件的截留液和最终的滤出液，得到分子量>100kDa的第一截留液、30kDa<分子量<100kDa的第二截留液、5kDa<分子量<30kDa的第三截留液和分子量<5kDa的滤出液；上述第一截留液、第二截留液、第三截留液和滤出液分别按照1:2～4的体积比加入95％的乙醇进行醇沉2～5h，过滤，滤渣复溶于水，离心，收集上清液，分别制得第一碱提物，为分子量>100kDa、多糖含量28～34％的灰树花多糖，第二碱提物，为30kDa<分子量<100kDa、多糖含量23～27％的灰树花多糖，第三碱提物，为5kDa<分子量<30kDa、多糖含量20～26％的灰树花多糖，第四碱提物，为分子量<5kDa、多糖含量9～13％的灰树花多糖。
一实施例中：所述超滤膜经以下步骤清洗后再行超滤：去离子水清洗→NaOH回流清洗→去离子水清洗→HCl清洗→去离子水清洗至超滤膜干净。
一实施例中：所述超滤步骤中，通过透过液的折光率变化判断超滤进度。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之二是：
灰树花多糖在制备修复人胃粘膜创伤的药物上的用途。
一实施例中：所述灰树花多糖为多糖含量9～34％的灰树花多糖，该多糖含量9～34％的灰树花多糖的临床上可接受的盐、临床上可接受的制剂；含有该多糖含量9～34％的灰树花多糖的复方药物组合物，该复方药物组合物的临床上可接受的盐、临床上可接受的制剂；所述多糖含量9～34％的灰树花多糖例如为多糖含量28～34％的灰树花多糖，多糖含量23～27％的灰树花多糖，多糖含量20～26％的灰树花多糖，多糖含量9～13％的灰树花多糖，最好是多糖含量31％的灰树花多糖，多糖含量25％的灰树花多糖，多糖含量23％的灰树花多糖，多糖含量11％的灰树花多糖。
一实施例中：所述灰树花多糖为根据技术方案之一的提取工艺得到的第一碱提物和/或第二碱提物和/或第三碱提物和/或第四碱提物，或该第一碱提物和/或第二碱提物和/或第三碱提物和/或第四碱提物的临床上可接受的盐、临床上可接受的制剂，或含有该第一碱提物和/或第二碱提物和/或第三碱提物和/或第四碱提物的复方药物组合物，或该复方药物组合物的临床上可接受的盐、临床上可接受的制剂。
一实施例中：所述修复人胃粘膜创伤是指促进人胃粘膜上皮细胞增殖和/或促进人胃粘膜上皮细胞向胃粘膜创伤区域迁移。
一实施例中：所述修复人胃粘膜创伤是指调节人胃粘膜上皮细胞中的攻击因子和防御因子的表达水平平衡。
一实施例中：所述促进人胃粘膜上皮细胞增殖和/或促进人胃粘膜上皮细胞向胃粘膜创伤区域迁移是指上调人胃粘膜上皮细胞的表皮生长因子EGF表达，和/或上调人胃粘膜上皮细胞的三叶因子2TFF2表达，和/或下调人胃粘膜上皮细胞的转移生长因子TGF-β1表达。
一实施例中：其特征在于：还包括预防和/或治疗慢性胃炎。
本发明所指的临床上可接受的盐意指能保留药物本身性质和生物学有效性的盐，包括与无机酸或有机酸形成的酸加成盐；所述无机酸例如盐酸、氢溴酸、硝酸、磷酸、硫酸、高氯酸等；所述有机酸例如乙酸、抗坏血酸、三氟乙酸、丙酸、羟乙酸、(D)或(L)乳酸、(D)或(L)苹果酸、草酸、富马酸、马来酸、甲磺酸、乙磺酸、苯甲酸、对甲苯磺酸、水杨酸、肉桂酸、扁桃酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸、羟乙磺酸和丙二酸等。
本发明所指的临床上可接受的制剂，包括但不限于片剂、胶囊剂、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂、滴丸剂、注射剂等。
本发明所涉及的仪器、试剂等，除有特别说明外，均可从市面上购得；本发明所涉及的各实验方法，除有特别说明外，均为本领域常规技术。
本技术方案与背景技术相比，它具有如下优点：
1.本发明采用的水提→碱提→超滤→醇沉的方式能够有效避免灰树花多糖在提取过程中的水解损失，还能有效去除杂质，提高提取效率。
2.本发明的结果表明，灰树花多糖可以调节人胃粘膜上皮细胞中重要的防御性细胞因子TFF2、EGF、TGF-β1的表达水平，通过上调TFF2的mRNA和蛋白表达水平、EGF的蛋白表达水平，下调TGF-β1的mRNA和蛋白表达水平等方面，促进人胃粘膜上皮细胞增殖和向胃粘膜创伤区域迁移，从而达到促进人胃粘膜愈合修复的目的。本发明提供了灰树花多糖在制备修复胃粘膜创伤的药物上的用途，为灰树花开发利用及防治胃病难题提供了依据。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1为实施例2中不同溶度GFP作用下GES-1增殖率的变化(n＝6)，与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01。
图2为实施例2中不同溶度GFP作用下GES-1细胞形态及数量变化(100×)，A：对照组24h；B：0.4mg/mLGPF作用24h；C：0.08mg/mLGPF作用24h；D：对照组48h；E：0.4mg/mLGPF作用48h；F：0.08mg/mLGPF作用48h；G：对照组72h；H：0.4mg/mLGPF作用72h；I：0.08mg/mLGPF作用72h；J：对照组96h；K：0.4mg/mLGPF作用96h；L：0.08mg/mLGPF作用96h。
图3为实施例3中不同溶度GFP作用下GES-1的愈合率变化(n＝6)，与对照组比较*P<0.05，**P<0.01。
图4为实施例3中GPF作用下的胃粘膜创伤修复情况(100×)。A：对照组0h；B：2mg/mLGPF作用0h；C：0.08mg/mLGPF作用0h；D：对照组6h；E：2mg/mLGPF作用6h；F：0.08mg/mLGPF作用6h；G：对照组12h；H：2mg/mLGPF作用12h；I：0.08mg/mLGPF作用12h；J：对照组24h；K：2mg/mLGPF作用24h；L：0.08mg/mLGPF作用24h。
图5a为实施例4中GFP对TFF2mRNA表达的影响。
图5b为实施例4中GFP对TGF-β1mRNA表达的影响。
具体实施方式
下面通过实施例具体说明本发明的内容：
实施例1：灰树花多糖的提取
取灰树花子实体干品，粉碎后过10目筛制得灰树花子实体颗粒，加入10倍量(质量体积比)的水微沸提取2h；过滤，滤渣用8倍量的2％的NaOH溶液浸提2h；过滤，滤液浓缩至Brix(可溶性固形物)≥15％，10000rpm离心10min后，上清液先后泵入截留分子量为100kDa、30kDa、5kDa的超滤分离组件，即截留分子量100kDa超滤分离组件的滤出液继续泵入截留分子量30kDa的超滤分离组件，该截留分子量30kDa的超滤分离组件的滤出液继续泵入截留分子量5kDa的超滤分离组件，收集每个超滤分离组件的截留液和最终的滤出液，得到分子量>100kDa的第一截留液、30kDa<分子量<100kDa的第二截留液、5kDa<分子量<30kDa的第三截留液和分子量<5kDa的滤出液；取上述第一截留液、第二截留液、第三截留液和滤出液分别按照1:3的体积比加入95％的乙醇进行醇沉4h，过滤，滤渣复溶于水，10000rpm离心10min后，收集上清液，分别制得第一碱提物，为分子量>100kDa、多糖含量31％的灰树花多糖，第二碱提物，为30kDa<分子量<100kDa、多糖含量25％的灰树花多糖，第三碱提物，为5kDa<分子量<30kDa、多糖含量23％的灰树花多糖，第四碱提物，为分子量<5kDa、多糖含量11％的灰树花多糖。
其中，采用的超滤膜均经以下步骤清洗后再行超滤：去离子水1L清洗→0.2mol/LNaOH500ml回流清洗20min→第二次去离子水清洗→0.1mol/LHCl500ml清洗至完全中和残留NaOH→第三次去离子水清洗至超滤膜干净。
其中，超滤过程中通过透过液的折光率变化判断超滤进度，当透过液折光率为0时停止超滤。
实施例2：灰树花多糖对人胃粘膜上皮细胞增殖的影响
1.材料
细胞株：人正常胃粘膜上皮细胞GES-1购自北京市肿瘤防治研究所。
培养基：GES-1细胞培养的基础培养基为DMEM培养基(10％FBS、100U青霉素、100U链霉素)。
灰树花多糖GFP(polysaccharideofGrifolafrondosa)：采用实施例1中制备得到的灰树花多糖。
2.方法
采用MTS法检测GFP对GES-1增殖活性的影响。取对数生长期GES-1经胰蛋白酶消化后将其浓度调整为2.0×104个/mL，接种于96孔板，每孔100μL，置37℃、饱和湿度、5％CO2无菌培养箱培养24h后弃旧培养液，实验组分别加入GFP溶液各200μL并使GFP的终浓度分别为10、2、0.4、0.08mg/mL，对照组(CT)为基础培养基，溶剂空白组为各组相应的培养液，每组设6个平行复孔，培养24h、48h、72h、96h后，观察记录细胞生长状态后，每孔加20μLMTS，充分震荡，测吸光度(A490)，按下式计算细胞增殖率：
3.数据处理
实验数据以平均数±标准差表示，用SPSS19.0软件处理，显著性分析采用方差分析法。
4.结果
GES-1细胞增殖与GFP的作用溶度、处理时间相关，在一定的溶度范围内GFP处理GES-1一定时间，GFP对其有促进增殖作用，低溶度的GFP如0.08mg/mL、0.4mg/mL促进GES-1细胞增殖，作用24h后，GES-1的增值率分别达到332.94％±56.67％、265.3％±52.19％，作用48h后的增值率高达382.84％±29.82％、389.77％±41.8％，而经72h后GFP的促进增殖的效果不明显，而高溶度的GFP对GES-1则是抑制其增殖，2mg/mL、10mg/mL作用时可能溶液的高渗透压改变GES-1的生长体系从而抑制其增殖(图1)。经GFP作用的GES-1生长状态明显比对照组好(图2)，24hGES-1细胞呈长梭状生长，开始聚集，48h更为显著，呈上皮纤维状生长，已有呈现单层细胞生长趋势，而后期与对照组无差别，说明GFP起有效作用时间较快，有利于其应用。
实施例3：灰树花多糖对人胃粘膜创伤愈合修复情况的影响
1.材料：同实施例2
2.方法
选呈对数生长期的GES-1，以每孔6×104个细胞接种于24孔板，每孔400μL。置37℃，5％CO2培养箱中培养24h，待细胞间形成较紧密的连接成单层后，用直径为1.5mm的毛细管在24孔板每个孔的中央垂直划一道痕迹，且在显微镜下可同时看到创面两侧。划伤后吸出原培养液，每孔用1mLPBS洗两次以除净未贴壁细胞，参考增殖实验结果选定GFP终浓度为2、0.4、0.08mg/mL，培养液400μL，对照组仅加入DMEM基础培养基400μL。每个浓度组设4平行复孔，选择6个不同视野，分别测量0、6、12、24h的划痕创面愈合情况，使用专业图像软件ImageProPlus6.0测量创面面积，按下式计算创伤区域的修复率，其中0h指灰树花多糖作用0h，th指灰树花多糖作用th：
3.数据处理
实验数据以平均数±标准差表示，用SPSS19.0软件处理，显著性分析采用方差分析法。
4.结果
通过体外胃粘膜创伤模型，可以从单层细胞水平评价GFP促进GES-1细胞向创伤区域迁移并实现修复与愈合(如图3，图4)，与对照组相比，GFP可以加速GES-1胃粘膜愈合，在单层GES-1细胞受到创伤立即接受GFP处理6h后，2mg/mLGFP组，0.4mg/mLGFP组，0.08mg/mLGFP组的胃粘膜修复率分别为(36.71±4.01)％、(32.46±1.62)％、(29.22±1.39)％，而对照组仅为(12.89±1.47)％，作用效果极显著，作用12h后，胃粘膜修复率分别为(61.02±5.81)％、(70.31±2.68)％、(65.22±0.97)％，对照组仅为(30.34±3.52)％，具有统计学意义，24h后胃粘膜创伤完全愈合。
实施例4：灰树花多糖对人胃粘膜上皮细胞中相关细胞因子表达的影响
1.材料：同实施例2
2.方法
1)对相关细胞因子表皮生长因子(EGF)、转移生长因子(TGF-β1)、三叶因子2(TFF2)蛋白表达水平的影响
选对数生长期的GES-1，以每孔6×105个细胞接种于6孔板。置37℃，5％CO2培养箱中培养24h，弃旧培养基，加入GFP培养液并使GFP终浓度为2、0.4、0.08mg/mL，对照组仅加入DMEM基础培养基，每孔2mL，每个浓度组设4平行复孔，处理24h后，采用ELISA方法测定培养液中EGF、TGF-β1、TFF2的含量。
2)对相关细胞因子EGF、TGF-β1、TFF2的mRNA表达水平的影响
用TRIzol提取上述1)中处理GFP处理24h后GES-1细胞总RNA，电泳分析表明18S和28S条带清晰可见，A260/A280值在1.7–2.0，总RNA片段完整未降解可用，取2.0μgRNA按照AMVFirstStrandcDNASynthesisKit说明进行反转录，取2.0μL反转录产物作为PCR反应模板，加入上下游引物10μmol/L各1μL，SybrGreenPCRMasterMix10μL，补充Rase-freewater至20μL。反应参数：95℃、20s预变性，95℃、10s变性，60℃30s退火，共40个循环。每次扩增设置β-actin内参照，进行PCR扩增产物的实时定量分析，用2-(ΔΔCt)方法分析EGF、TGF-β1、TFF2的mRNA表达水平。
表1TFF2、TGF-β1基因的特异性引物
3.数据处理
实验数据以平均数±标准差表示，用SPSS19.0软件处理，显著性分析采用方差分析法。
4.结果
1)对EGF、TGF-β1、TFF2蛋白表达水平的影响
与对照组相比，经GFP24h处理后，GES-1细胞表达EGF、TFF2、TGF-β1发生显著性变化(如表2所示)，EGF、TFF2极显著性高表达(P<0.01)，而且随溶度上升表达量也随之升高，而TGF-β1表达量受到抑制，呈下降趋势，显著性低表达(P<0.01)。
表2不同溶度GFP作用下对EGF、TFF2、TGF-β1表达量的影响
注：与对照组比较*P<0.05，**P<0.01.
2)对TGF-β1、TFF2的mRNA表达水平的影响
GFP对TFF2、TGF-β1两个mRNA的表达影响是截然相反的(图5)，GFP极显著促进TFF2mRNA上调表达，抑制TGF-β1mRNA表达，进一步影响TFF2、TGF-β1两种细胞因子的表达。
5.结果分析
现代医学认为胃粘膜损伤是由胃粘膜上皮细胞中的攻击因子和防御因子失衡造成的，防御因子主要是指胃粘膜自身的保护修复作用，其中TFF2、EGF、TGF-β1作为重要的防御性细胞因子参与了胃粘膜的愈合过程。
TFF2是TFF家族唯一一个具有两个三叶草型结构域和糖基化的小分子多肽，由106个氨基酸所组成，大量研究表明TFF2在维持胃肠粘膜屏障、粘膜损伤后上皮修复等方面起作用，本实施例中灰树花多糖促进GES-1细胞上调TFF2mRNA表达量，进一步促进TFF2表达，说明灰树花多糖促进GES-1增殖，加快细胞迁移和粘膜修复与TFF2成正相关。
EGF具有促进上皮增殖、分化、组织修复等作用，在保护胃粘膜免受损伤因子的破坏、维持胃粘膜完整性方面起着非常重要的作用，本实施例的结果表明灰树花多糖有促进GES-1表达EGF的作用，且呈现剂量效应。
TGF-β1是一种多功能的细胞因子，参与细胞周期调节、伤口愈合、细胞增殖与分化、粘附、移行等，在生物整体及各种器官的发育过程中起着重要的作用。在创伤初期，TGF-β1则起到抑制上皮细胞增殖的作用。本实施例之中，经灰树花多糖处理后GES-1细胞减少TGF-β1的mRNA水平和蛋白水平的表达，减少抑制GES-1细胞增殖的因素，从另一方面起到促进增殖的效果。
综上所述，灰树花多糖通过上调GES-1中TFF2的mRNA和蛋白表达水平、EGF的蛋白表达水平，下调TGF-β1的mRNA和蛋白表达水平等方面，促进胃粘膜上皮细胞增殖和向胃粘膜创伤区域迁移，从而达到促进胃粘膜愈合修复的目的，可用于预防和/或治疗人慢性胃炎药物的制备。
以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (10)

1.一种灰树花多糖的提取工艺，其特征在于：取灰树花子实体干品，粉碎后过10目筛，加入8～12倍量水微沸提取1～3h；过滤，滤渣用5～10倍量的1～3％的NaOH溶液进行浸提1～3h；过滤，滤液浓缩至Brix≥15％，离心，上清液先后泵入三个截留分子量依次减小的超滤分离组件，分别收集每个超滤分离组件的截留液和最终的滤出液，得到分子量>100kDa的第一截留液、30kDa<分子量<100kDa的第二截留液、5kDa<分子量<30kDa的第三截留液和分子量<5kDa的滤出液；上述第一截留液、第二截留液、第三截留液和滤出液分别按照1:2～4的体积比加入95％的乙醇进行醇沉2～5h，过滤，滤渣复溶于水，离心，收集上清液，分别制得第一碱提物，为分子量>100kDa、多糖含量28～34％的灰树花多糖，第二碱提物，为30kDa<分子量<100kDa、多糖含量23～27％的灰树花多糖，第三碱提物，为5kDa<分子量<30kDa、多糖含量20～26％的灰树花多糖，第四碱提物，为分子量<5kDa、多糖含量9～13％的灰树花多糖。
2.根据权利要求1所述的灰树花多糖的提取工艺，其特征在于：所述超滤膜经以下步骤清洗后再行超滤：去离子水清洗→NaOH回流清洗→去离子水清洗→HCl清洗→去离子水清洗至超滤膜干净。
3.根据权利要求1所述的灰树花多糖的提取工艺，其特征在于：所述超滤步骤中，通过透过液的折光率变化判断超滤进度。
4.灰树花多糖在制备修复人胃粘膜创伤的药物上的用途。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述灰树花多糖为多糖含量9～34％的灰树花多糖，该多糖含量9～34％的灰树花多糖的临床上可接受的盐、临床上可接受的制剂；含有该多糖含量9～34％的灰树花多糖的复方药物组合物，该复方药物组合物的临床上可接受的盐、临床上可接受的制剂。
6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述灰树花多糖为根据权利要求1的提取工艺得到的第一碱提物和/或第二碱提物和/或第三碱提物和/或第四碱提物，或该第一碱提物和/或第二碱提物和/或第三碱提物和/或第四碱提物的临床上可接受的盐、临床上可接受的制剂，或含有该第一碱提物和/或第二碱提物和/或第三碱提物和/或第四碱提物的复方药物组合物，或该复方药物组合物的临床上可接受的盐、临床上可接受的制剂。
7.根据权利要求4或5或6所述的用途，其特征在于：所述修复人胃粘膜创伤是指促进人胃粘膜上皮细胞增殖和/或促进人胃粘膜上皮细胞向胃粘膜创伤区域迁移。
8.根据权利要求4或5或6所述的用途，其特征在于：所述修复人胃粘膜创伤是指调节人胃粘膜上皮细胞中的攻击因子和防御因子的表达水平平衡。
9.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述促进人胃粘膜上皮细胞增殖和/或促进人胃粘膜上皮细胞向胃粘膜创伤区域迁移是指上调人胃粘膜上皮细胞的表皮生长因子EGF表达，和/或上调人胃粘膜上皮细胞的三叶因子2TFF2表达，和/或下调人胃粘膜上皮细胞的转移生长因子TGF-β1表达。
10.根据权利要求4或5或6所述的用途，其特征在于：还包括预防和/或治疗慢性胃炎。
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