CN114681500B - 一种普尔那总黄酮提取物及其应用 - Google Patents
一种普尔那总黄酮提取物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种普尔那总黄酮提取物及其应用，属于中医药技术领域。本发明普尔那总黄酮提取物采用半仿生提取法，依次经过胃蛋白酶和胰蛋白酶酶解后制得。本发明的普尔那总黄酮提取物的成分种类更少，但是却表现出了毒性更低、抗炎活性更佳的优良效果，采用传统溶剂提取法制备的普尔那总黄酮在200μg/mL时可致斑马鱼畸形，而本发明的普尔那总黄酮提取物在400μg/mL时斑马鱼才出现畸形现象，并且当两种普尔那总黄酮的浓度相同时，本发明的普尔那总黄酮提取物的抗炎活性更佳。将本发明的普尔那总黄酮提取物应用于抗炎药物的制备，具有良好的应用开发前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种低毒高效的普尔那总黄酮提取物及其应用，属于中医药技术领域。
背景技术
藏药普尔那，又名普尔芒嘎保、普尔芒蒿、结血蒿，是菊科植物毛莲蒿的地上部分，其味苦、辛，性寒，具有清热解毒、消肿消炎、杀虫利湿等功效，藏医临床常用来治疗虫病、脑炎、皮肤病、温毒疔毒疮、咽喉病等，现代研究也用于治疗妇科疾病，如乳腺炎、痛经等。普尔那中主要含有黄酮类、挥发油、香豆素、有机酸、甾体类等多种成分，具有抗寄生虫、抗炎、抗肿瘤、抑菌等作用。
许多研究表明黄酮类化合物具有显著的抗氧化、清除氧自由基作用、扩张心血管作用、降血脂、阻断动脉粥样硬化、调节免疫机能、抗炎抗病毒、利胆、强心、镇静镇痛和抗肿瘤等作用，因而近些年来关于黄酮类化合物分离提取的研究较多。常见的提取黄酮类化合物的方法有溶剂提取法、酶法、超声波提取法、半仿生提取法等。溶剂提取法是传统的黄酮提取方法，主要是采用有机溶剂乙醇进行提取；酶法提取则是根据植物药材细胞壁的构成，利用酶反应所具有的高度专一性的特点，选择相应的酶，将细胞壁的组成成分水解或降解，使有效成分充分暴露出来，目前使用较多的酶是纤维素酶和果胶酶；半仿生提取法是将整体药物研究法与分子药物研究法相结合，模拟口服给药后药物经胃肠道转运吸收的环境，为经消化道给药的中药制剂设计的一种新的提取工艺。
藏药普尔那中黄酮含量丰富，拉萨产地普尔那总黄酮含量达276.62mg/g，但普尔那总黄酮的成分组成和抗炎活性仍未见报道。本发明通过对比半仿生提取法与传统溶剂提取法制备的普尔那总黄酮的成分、毒性和活性差异，并利用斑马鱼模型探讨了普尔那总黄酮的抗炎活性，得到了一种低毒高效的普尔那总黄酮提取物。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种低毒高效的普尔那总黄酮提取物及其应用。
术语说明：
dpf(days post fertilization)：生物学专用术语，指受精后的天数。如3dpf指受精后3天的胚胎。
本发明的技术方案如下：
一种低毒高效的普尔那总黄酮提取物，所述普尔那总黄酮提取物采用半仿生提取法，依次经过胃蛋白酶和胰蛋白酶酶解后制得。
本发明中，所述普尔那总黄酮提取物中共检测到185种成分，具体成分信息详见表1。
根据本发明优选的，所述半仿生提取法包括如下步骤：
(1)取普尔那样品粉末，分散于超纯水中，加入胃蛋白酶，胃蛋白酶与底物的比为10000～15000U/g，调节溶液pH值至3.0～3.5，于37℃条件下超声酶解5～10h，终止反应，离心取上清；
(2)收集步骤(1)离心后的药渣，分散于超纯水中，加入胰蛋白酶，胰蛋白酶与底物的比为10000～15000U/g，调节溶液pH值至7.0～7.5，于37℃条件下超声酶解5～10h，终止反应，离心取上清；
(3)将步骤(1)和步骤(2)得到的上清混合，减压浓缩，得到浸膏；
(4)将步骤(3)的浸膏用超纯水溶解制成浓度为0.8-1.6mg/mL的上样液，采用大孔树脂纯化，浓缩干燥后即得普尔那总黄酮提取物。
优选的，步骤(1)中所述普尔那样品粉末于超纯水中的底物质量浓度为0.04～0.08g/mL。
优选的，步骤(1)中胃蛋白酶与底物的比为10000U/g。
优选的，步骤(1)中调节溶液pH值采用1M HCl溶液。
优选的，步骤(1)中调节溶液pH值至3.0。
优选的，步骤(1)中于37℃条件下超声酶解5h。
优选的，步骤(1)中终止反应是100℃水浴10～15min；进一步优选为100℃水浴10min。
优选的，步骤(2)中药渣于超纯水中的底物质量浓度为0.04～0.08g/mL。
优选的，步骤(2)中胰蛋白酶与底物的比为10000U/g。
优选的，步骤(2)中调节溶液pH采用1M NaOH溶液。
优选的，步骤(2)中调节溶液pH值至7.5。
优选的，步骤(2)中终止反应是100℃水浴10～15min；进一步优选为100℃水浴10min。
优选的，步骤(4)中所述大孔树脂纯化的方法为：大孔树脂湿法装柱，径高比为1：15～18，以1.0-4.0mL/min速度上样3BV的上样液，先以超纯水洗脱1BV，随后再以体积百分比为70～80％的乙醇溶液洗脱3BV，收集洗脱液；进一步优选的，所述上样液的上样速度为1.0mL/min；所述乙醇溶液的体积百分比为70％。
优选的，步骤(4)中所述上样液的浓度为1.2mg/mL。
优选的，步骤(4)中所述大孔树脂型号为DA-201-CIV大孔树脂。
本发明中的普尔那总黄酮提取物具有低毒高效的特点：采用传统溶剂提取法制备的普尔那总黄酮在200μg/mL时可致斑马鱼畸形，400μg/mL时可致斑马鱼全部死亡，而本发明的普尔那总黄酮提取物在400μg/mL时斑马鱼才出现畸形现象，800μg/mL时斑马鱼全部死亡，25μg/mL时在硫酸铜诱导的斑马鱼炎症模型中表现出抗炎活性，并在25、50、100和200μg/mL时均具有抗炎活性；并且在相同浓度条件下，本发明的普尔那总黄酮提取物的抗炎效果要显著优于采用传统溶剂提取法制备的普尔那总黄酮。
上述普尔那总黄酮提取物在制备抗炎药物中的应用。
一种抗炎药物，包括药学上有效剂量的上述普尔那总黄酮提取物。
根据本发明优选的，所述抗炎药物还包括药学上可接受的载体或辅料。
本发明的技术特点和有益效果：
1.本发明提供了一种普尔那总黄酮提取物，普尔那总黄酮提取物中共含有185种成分，其中相对含量大于1％的有20种。本发明的普尔那总黄酮提取物是采用半仿生提取法制备，与传统的溶剂提取法相比，传统溶剂提取法制备的普尔那总黄酮中含有194种成分，其中相对含量大于1％的有24种，传统溶剂法制备的普尔那总黄酮提取物与本发明的普尔那总黄酮提取物在成分组成及成分相对含量上均存在差异。
2.本发明的普尔那总黄酮提取物的毒性更低：采用传统溶剂提取法制备的普尔那总黄酮在200μg/mL时可致斑马鱼畸形，400μg/mL时可致斑马鱼全部死亡，而本发明的普尔那总黄酮提取物在400μg/mL时斑马鱼才出现畸形现象，800μg/mL时斑马鱼全部死亡。
3.本发明的普尔那总黄酮提取物的抗炎活性更佳：在硫酸铜诱导的斑马鱼炎症模型中，传统溶剂提取法制备的普尔那总黄酮在50、100μg/mL显示出了抗炎活性，本发明的普尔那总黄酮提取物在25μg/mL时就显示出了抗炎活性，并在25、50、100和200μg/mL时均具有抗炎活性；在断尾损伤诱导的斑马鱼炎症模型中，本发明的普尔那总黄酮提取物也表现出了更加优良的抗炎活性；且在两种斑马鱼炎症模型中，当两种普尔那总黄酮的浓度相同时，本发明的普尔那总黄酮提取物的抗炎活性更佳。
4.本发明的普尔那总黄酮提取物的成分种类更少，但是却表现出了毒性更低、抗炎活性更佳的优良效果；另外，酶法提取是利用纤维素酶与果胶酶分解植物细胞壁中的纤维素与果胶，促进胞内活性物质的释放，与酶法提取相比，本发明半仿生提取法提取的总黄酮提取物在提取过程中加入胃蛋白酶和胰蛋白酶(拟人体消化酶)，提取过程更接近药物在人体胃肠道的转运吸收过程，提取原理与酶法提取不同，提取得到的总黄酮提取物的成分及相对含量也不相同，将本发明的普尔那总黄酮提取物应用于抗炎药物的制备，具有良好的应用开发前景。
附图说明
图1为传统提取法制备的普尔那总黄酮对斑马鱼毒性的照片；
图2为传统提取法制备的普尔那总黄酮导致斑马鱼畸形和死亡情况统计图；
图3为半仿生提取法制备的普尔那总黄酮对斑马鱼毒性的照片；
图4为半仿生提取法制备的普尔那总黄酮导致斑马鱼畸形和死亡情况统计图；
图5为传统提取法制备的普尔那总黄酮对硫酸铜诱导的斑马鱼抗炎作用的荧光照片；
图6为传统提取法制备的普尔那总黄酮对硫酸铜诱导的斑马鱼抗炎作用的统计图；图中，与Control组相比，####表示P<0.0001；与Model组相比，***表示P<0.001，****表示P<0.0001；
图7为半仿生提取法制备的普尔那总黄酮对硫酸铜诱导的斑马鱼抗炎作用的荧光照片；
图8为半仿生提取法制备的普尔那总黄酮对硫酸铜诱导的斑马鱼抗炎作用的统计图；图中，与Control组相比，####表示P<0.0001；与Model组相比，**表示P<0.01，***表示P<0.001，****表示P<0.0001；
图9为两种提取方法制备的普尔那总黄酮对硫酸铜诱导的斑马鱼抗炎作用比较的统计图；图中，与Control组相比，####表示P<0.0001；与Model组相比，**表示P<0.01，***表示P<0.001，****表示P<0.0001；与100μg/mL传统提取法制备的普尔那总黄酮组相比，&表示P<0.05；
图10为传统提取法制备的普尔那总黄酮对断尾诱导的斑马鱼抗炎作用的荧光照片；
图11为传统提取法制备的普尔那总黄酮对断尾诱导的斑马鱼抗炎作用的统计图；图中，与Control组相比，####表示P<0.0001；与Model组相比，***表示P<0.001，****表示P<0.0001；
图12为半仿生提取法制备的普尔那总黄酮对断尾诱导的斑马鱼抗炎作用的荧光照片；
图13为半仿生提取法制备的普尔那总黄酮对断尾诱导的斑马鱼抗炎作用的统计图；图中，与Control组相比，####表示P<0.0001；与Model组相比，****表示P<0.0001；
图14为两种提取方法制备的普尔那总黄酮对断尾诱导的斑马鱼抗炎作用比较的统计图；图中，与Control组相比，####表示P<0.0001；与Model组相比，***表示P<0.001，****表示P＜0.0001。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。实施例中涉及的药品及材料，若无特殊说明，均为普通市售产品；实施例中涉及的实验操作，若无特殊说明，均为本领域常规技术操作。
本发明具体包括普尔那总黄酮的制备及成分分析；基于斑马鱼模型对两种提取方法制备的普尔那总黄酮进行毒性评价；采用斑马鱼硫酸铜诱导的炎症模型评价两种提取方法制备的普尔那总黄酮的抗炎活性；采用斑马鱼断尾损伤诱导的炎症模型评价两种提取方法制备的普尔那总黄酮的抗炎活性。
药品来源：
普尔那：野外采集，采集地点为拉萨市夺底沟，经西藏自治区藏药材鉴定专家格桑顿珠教授鉴定为蒿属结血蒿。本发明的结论适合不同产地相同科属的普尔那，但不适合其他科属。
实施例1：半仿生提取法制备普尔那总黄酮
半仿生提取法制备普尔那总黄酮，步骤如下：
(1)取普尔那样品粉末20g，分散于超纯水中，底物质量浓度为1g/25mL，加入胃蛋白酶，胃蛋白酶酶底物比10000U/g(胃蛋白酶酶活力为30000U/mg，胃蛋白酶添加量6.67mg)，用1M HCl溶液调节溶液pH值至3.0，于37℃条件下，超声酶解5h，100℃水浴10min终止反应，离心取上清；
(2)收集步骤(1)的药渣，分散于超纯水中，底物质量浓度为1g/25mL，加入胰蛋白酶，胰蛋白酶酶底物比10000U/g(胰蛋白酶酶活力为2500U/mg，胰蛋白酶添加量80mg)，用1MNaOH溶液调节溶液pH值至7.5，于37℃条件下，超声酶解5h，100℃水浴10min终止反应，离心取上清；
(3)将步骤(1)和步骤(2)得到的上清混合，减压浓缩，得到浸膏；
(4)将步骤(3)得到的浸膏用超纯水溶解制成浓度为1.2mg/mL的上柱液，DA-201-CIV大孔树脂湿法装柱，径高比为1：15，以1.0mL/min速度上样3BV(1130mL)的上样液，先以超纯水按照1.0mL/min流速洗脱1BV，随后再以体积百分比为70％的乙醇溶液按照1.0mL/min流速洗脱3BV，收集洗脱液，减压浓缩，干燥，即得纯化后普尔那总黄酮。
对比例1：传统溶剂提取法制备普尔那总黄酮
传统溶剂提取法制备普尔那总黄酮，步骤如下：
(1)取普尔那样品粉末50g，加入750mL体积百分比为50％的乙醇溶液，超声提取2次，每次3h；
(2)过滤，合并滤液，减压浓缩，得到浸膏；
(3)将步骤(2)的浸膏用超纯水溶解制成浓度为1.2mg/mL的上样液，DA-201-CIV大孔树脂湿法装柱，径高比为1：15，以1.0mL/min速度上样3BV(约1130mL)的上样液，先以超纯水按照1.0mL/min流速洗脱1BV，随后再以体积百分比为70％的乙醇溶液按照1.0mL/min流速洗脱3BV，收集洗脱液，减压浓缩，干燥，即得纯化后普尔那总黄酮。
实施例2：分析比较两种提取方法制备的普尔那总黄酮的成分差异
利用LC-MS结合靶向代谢组学方法，分析对比例1利用传统溶剂提取法制备的普尔那总黄酮(CTH)和实施例1利用半仿生提取法制备的普尔那总黄酮(BFSH)的具体成分，结果如表1所示：
表1.对比例1和实施例1制备的普尔那总黄酮的成分分析表
从上表数据可以看出，从传统溶剂提取法制备的普尔那总黄酮(CTH)中共检测到194种成分，其中相对含量大于1％的有24种；从半仿生提取法制备的普尔那总黄酮(BFSH)中共检测到185种成分，其中相对含量大于1％的有20种；CTH与BFSH中共有成分为182种，其中相对含量均大于1％的共有成分为13种；CTH与BFSH在成分组成及成分相对含量上均存在差异。
实施例3：基于斑马鱼模型对普尔那总黄酮进行毒性评价
1.对对比例1利用传统溶剂提取法制备的普尔那总黄酮进行毒性评价，步骤如下：
(1)在体式显微镜下挑选发育正常的3dpf的Tg:zlyz-EGFP斑马鱼移入24孔培养板中，每孔12条，分为空白对照组(control组)和实验组，实验组根据添加普尔那总黄酮浓度的不同分为A组、B组、C组、D组、E组和F组；用斑马鱼培养用水(5mM NaCl，0.17mM KCl，0.33mM CaCl2，0.33mM MgSO4·7H2O)配制浓度为0、25、50、100、200、400、800μg/mL的普尔那总黄酮样品溶液，分别用于control组、A组、B组、C组、D组、E组和F组的斑马鱼孵育，将斑马鱼直接浸泡在药液中孵育，孵育温度为28℃，明暗交替孵育，孵育时间为24h，光照14h避光10h；
(2)孵育24h之后，将各组斑马鱼用质量浓度为0.3‰的三卡因麻醉1min，置于载玻片上，于显微镜下对斑马鱼进行拍照并保存，结果如图1，观察斑马鱼形态，统计畸形率及死亡率，统计结果如图2。
2.对实施例1利用半仿生提取法制备的普尔那总黄酮进行毒性评价，步骤同上；结果如图3和图4。
3.分析比较两种提取方法制备的普尔那总黄酮的毒性差异
结果显示，当对比例1传统溶剂提取法制备的普尔那总黄酮浓度为200μg/mL时，斑马鱼出现畸形，400、800μg/mL时全部死亡；当实施例1半仿生提取法制备的普尔那总黄酮浓度为400μg/mL时，斑马鱼出现畸形，800μg/mL时全部死亡；说明与传统溶剂提取法相比，半仿生提取法制备的普尔那总黄酮毒性更低。
实施例4：采用斑马鱼硫酸铜诱导的炎症模型评价普尔那总黄酮的抗炎活性
1.对对比例1传统溶剂提取法制备的普尔那总黄酮进行抗炎活性研究，步骤如下：
(1)在体式显微镜下挑选发育正常的3dpf的Tg:zlyz-EGFP斑马鱼移入6孔培养板中，每孔20条，分为空白对照组(Control组)、模型组(Model组)、阳性对照组(Ibuprofen组)和实验组，实验组根据添加普尔那总黄酮浓度的不同分为A组、B组和C组；用斑马鱼培养用水配制浓度为0、25、50、100μg/mL的普尔那总黄酮样品溶液，分别用于Model组、A组、B组和C组的斑马鱼孵育；用斑马鱼培养用水配制20μM的布洛芬溶液用于Ibuprofen组斑马鱼孵育；Control组直接用斑马鱼培养用水孵育；孵育温度为28℃，明暗交替孵育，孵育时间为24h，光照14h避光10h；再将Model组、Ibuprofen组、A组、B组和C组的斑马鱼置于40μM的五水硫酸铜溶液中避光孵育1h，Control组斑马鱼继续在原培养液中避光孵育1h，所述五水硫酸铜溶液用斑马鱼培养用水配制；
(2)孵育结束后，将各组斑马鱼用质量浓度为0.3‰的三卡因麻醉1min，置于载玻片上，固定斑马鱼于侧面体位，于荧光显微镜下对各组斑马鱼进行拍照并保存，结果如图5，观察斑马鱼巨噬细胞炎症反应；
(3)利用图像处理软件Image-Pro Plus 5.1对各组斑马鱼免疫细胞迁移到测线的数量(泄殖孔至尾部)进行统计，统计结果如图6；
(4)利用数据处理软件GraphPad Prism 8分析数据，以Mean±SEM表示，分析比较Control组、Model组、Ibuprofen组、A组、B组和C组的差异显著性；两组间差异性比较采用t检验分析，多组间差异性采用One-way ANOVA进行检验，P<0.05为具有统计学差异。
结果显示，与Control组相比，Model组斑马鱼免疫细胞迁移到测线的数量(泄殖孔至尾部)显著升高，说明斑马鱼硫酸铜诱导的炎症模型建立成功；与Model组相比，Ibuprofen组斑马鱼免疫细胞迁移到测线的数量(泄殖孔至尾部)显著降低，B组和C组斑马鱼免疫细胞迁移到测线的数量(泄殖孔至尾部)也显著降低，且呈剂量依赖，说明浓度为50、100μg/mL的普尔那总黄酮具有抗炎活性。
2.对实施例1半仿生提取法制备的普尔那总黄酮进行抗炎活性研究，步骤如下：
(1)在体式显微镜下挑选发育正常的3dpf的Tg:zlyz-EGFP斑马鱼移入6孔培养板中，每孔20条，分为空白对照组(Control组)、模型组(Model组)、阳性对照组(Ibuprofen组)和实验组，实验组根据添加普尔那总黄酮浓度的不同分为A组、B组、C组和D组；用斑马鱼培养用水配制浓度为0、25、50、100和200μg/mL的普尔那总黄酮样品溶液，分别用于Model组、A组、B组、C组和D组的斑马鱼孵育；用斑马鱼培养用水配制20μM的布洛芬溶液用于Ibuprofen组斑马鱼孵育，Control组直接用斑马鱼培养用水孵育；孵育温度为28℃，明暗交替孵育，孵育时间为24h，光照14h避光10h；再将Model组、Ibuprofen组、A组、B组、C组和D组的斑马鱼置于40μM的五水硫酸铜溶液中避光孵育1h，Control组斑马鱼继续在原培养液中避光孵育1h，所述五水硫酸铜溶液用斑马鱼培养用水配制；
(2)孵育结束后，将各组斑马鱼用质量浓度为0.3‰的三卡因麻醉1min，置于载玻片上，固定斑马鱼于侧面体位，于荧光显微镜下对各组斑马鱼进行拍照并保存，结果如图7，观察斑马鱼巨噬细胞炎症反应；
(3)利用图像处理软件Image-Pro Plus 5.1对各组斑马鱼免疫细胞迁移到测线的数量(泄殖孔至尾部)进行统计，统计结果如图8；
(4)利用数据处理软件GraphPad Prism 8分析数据，以Mean±SEM表示，分析比较Control组、Model组、Ibuprofen组、A组、B组、C组和D组的差异显著性；两组间差异性比较采用t检验分析，多组间差异性采用One-way ANOVA进行检验，P<0.05为具有统计学差异。
结果显示，与Control组相比，Model组斑马鱼免疫细胞迁移到测线的数量(泄殖孔至尾部)显著升高，说明斑马鱼硫酸铜诱导的炎症模型建立成功；与Model组相比，Ibuprofen组斑马鱼免疫细胞迁移到测线的数量(泄殖孔至尾部)显著降低，A组、B组、C组和D组斑马鱼免疫细胞迁移到测线的数量(泄殖孔至尾部)也显著降低，且呈剂量依赖，说明浓度为25、50、100和200μg/mL的普尔那总黄酮具有抗炎活性。
3.分析比较两种提取方法制备的普尔那总黄酮的抗炎活性差异
利用数据处理软件GraphPad Prism 8分析数据，以Mean±SEM表示，分析比较两种提取方法制备的普尔那总黄酮的抗炎活性的差异，结果如图9。两组间差异性比较采用t检验分析，多组间差异性采用One-way ANOVA进行检验，P<0.05为具有统计学差异。
结果显示，传统溶剂提取法制备的普尔那总黄酮(CTH)浓度为50、100μg/mL时具有抗炎活性，半仿生提取法制备的普尔那总黄酮(BFSH)浓度为25、50、100和200μg/mL时具有抗炎活性，且与100μg/mL CTH相比，100μg/mL、200μg/mL BFSH斑马鱼免疫细胞迁移到测线的数量(泄殖孔至尾部)显著降低，说明与传统溶剂提取法相比，半仿生提取法制备的普尔那总黄酮抗炎活性更好。
实施例5：采用斑马鱼断尾损伤诱导的炎症模型评价普尔那总黄酮的抗炎活性
1.对对比例1传统溶剂提取法制备的普尔那总黄酮进行抗炎活性研究，步骤如下：
(1)在体式显微镜下挑选发育正常的3dpf的Tg:zlyz-EGFP斑马鱼移入6孔培养板中，每孔20条，分为空白对照组(Control组)、模型组(Model组)、阳性对照组(Ibuprofen组)和实验组，实验组根据添加普尔那总黄酮浓度的不同分为A组、B组和C组；Model组、Ibuprofen组、A组、B组和C组的斑马鱼先用质量浓度为0.3‰的三卡因麻醉1min，再用刀片进行斑马鱼尾部横切术，后用斑马鱼培养用水复苏；
(2)用斑马鱼培养用水配制浓度为0、0、25、50、100μg/mL的普尔那总黄酮样品溶液，分别用于Control组、Model组、A组、B组和C组的斑马鱼孵育；用斑马鱼培养用水配制20μM的布洛芬溶液用于Ibuprofen组斑马鱼孵育；孵育温度为28℃，孵育时间为6h；
(3)孵育结束后，将各组斑马鱼用质量浓度为0.3‰的三卡因麻醉1min，置于载玻片上，固定斑马鱼于侧面体位，于荧光显微镜下对各组斑马鱼进行拍照并保存，结果如图10，观察斑马鱼巨噬细胞炎症反应；
(4)利用图像处理软件Image-Pro Plus 5.1分析计算各组斑马鱼免疫细胞迁移到机械损伤区域(尾部横切处)的IOD值，进行统计，统计结果如图11；
(5)利用数据处理软件GraphPad Prism 8分析数据，以Mean±SEM表示，分析比较Control组、Model组、Ibuprofen组、A组、B组和C组的差异显著性；两组间差异性比较采用t检验分析，多组间差异性采用One-way ANOVA进行检验，P<0.05为具有统计学差异。
结果显示，与Control组相比，Model组斑马鱼免疫细胞迁移到机械损伤区域(尾部横切处)的IOD值显著升高，说明斑马鱼断尾损伤诱导的炎症模型建立成功；与Model组相比，Ibuprofen组斑马鱼免疫细胞迁移到机械损伤区域(尾部横切处)的IOD值显著降低，A组、B组和C组斑马鱼免疫细胞迁移到机械损伤区域(尾部横切处)的IOD值也显著降低，且呈剂量依赖，说明浓度为25、50、100μg/mL的普尔那总黄酮具有抗炎活性。
2.对实施例1半仿生提取法制备的普尔那总黄酮进行抗炎活性研究，步骤如下：
(1)在体式显微镜下挑选发育正常的3dpf的Tg:zlyz-EGFP斑马鱼移入6孔培养板中，每孔20条，分为空白对照组(Control组)、模型组(Model组)、阳性对照组(Ibuprofen组)和实验组，实验组根据添加普尔那总黄酮浓度的不同分为A组、B组、C组和D组；Model组、Ibuprofen组、A组、B组、C组和D组的斑马鱼先用质量浓度为0.3‰的三卡因麻醉1min，再用刀片进行斑马鱼尾部横切术，后用斑马鱼培养用水复苏；
(2)用斑马鱼培养用水配制浓度为0、0、25、50、100和200μg/mL的普尔那总黄酮样品溶液，分别用于Control组、Model组、A组、B组、C组和D组的斑马鱼孵育；用斑马鱼培养用水配制20μM的布洛芬溶液用于Ibuprofen组斑马鱼孵育；孵育温度为28℃，孵育时间为6h；
(3)孵育结束后，将各组斑马鱼用质量浓度为0.3‰的三卡因麻醉1min，置于载玻片上，固定斑马鱼于侧面体位，于荧光显微镜下对各组斑马鱼进行拍照并保存，结果如图12，观察斑马鱼巨噬细胞炎症反应；
(4)利用图像处理软件Image-Pro Plus 5.1分析计算各组斑马鱼免疫细胞迁移到机械损伤区域(尾部横切处)的IOD值，进行统计，统计结果如图13；
(5)利用数据处理软件GraphPad Prism 8分析数据，以Mean±SEM表示，分析比较Control组、Model组、Ibuprofen组、A组、B组、C组和D组的差异显著性；两组间差异性比较采用t检验分析，多组间差异性采用One-way ANOVA进行检验，P<0.05为具有统计学差异。
结果显示，与Control组相比，Model组斑马鱼免疫细胞迁移到机械损伤区域(尾部横切处)的IOD值显著升高，说明斑马鱼断尾损伤诱导的炎症模型建立成功；与Model组相比，Ibuprofen组斑马鱼免疫细胞迁移到机械损伤区域(尾部横切处)的IOD值显著降低，A组、B组、C组和D组斑马鱼免疫细胞迁移到机械损伤区域(尾部横切处)的IOD值也显著降低，且呈剂量依赖，说明浓度为25、50、100和200μg/mL的普尔那总黄酮具有抗炎活性。
3.分析比较两种提取方法制备的普尔那总黄酮的抗炎活性差异
利用数据处理软件GraphPad Prism 8分析数据，以Mean±SEM表示，分析比较两种提取方法制备的普尔那总黄酮的抗炎活性的差异，分析结果如图14。两组间差异性比较采用t检验分析，多组间差异性采用One-way ANOVA进行检验，P<0.05为具有统计学差异。
结果显示，传统溶剂提取法制备的普尔那总黄酮(CTH)浓度为25、50、100μg/mL时具有抗炎活性，半仿生提取法制备的普尔那总黄酮(BFSH)浓度为25、50、100和200μg/mL时具有抗炎活性，但是在两种普尔那总黄酮浓度相同时，BFSH的IOD低于CTH的IOD，说明与传统溶剂提取法相比，半仿生提取制备的普尔那总黄酮抗炎活性更好。
Claims (10)
1.一种普尔那总黄酮提取物，其特征在于，所述普尔那总黄酮提取物采用半仿生提取法，依次经过胃蛋白酶和胰蛋白酶酶解后制得；
所述半仿生提取法包括如下步骤：
（1）取普尔那样品粉末，分散于超纯水中，加入胃蛋白酶，胃蛋白酶与底物的比为10000~15000 U/g，调节溶液pH值至3.0~3.5，于37℃条件下超声酶解5~10h，终止反应，离心取上清；
（2）收集步骤（1）离心后的药渣，分散于超纯水中，加入胰蛋白酶，胰蛋白酶与底物的比为10000~15000 U/g，调节溶液pH值至7.0~7.5，于37℃条件下超声酶解5~10h，终止反应，离心取上清；
（3）将步骤（1）和步骤（2）得到的上清混合，减压浓缩，得到浸膏；
（4）将步骤（3）的浸膏用超纯水溶解制成浓度为0.8-1.6 mg/mL的上样液，采用大孔树脂纯化，所述大孔树脂纯化的方法为，大孔树脂湿法装柱，所述大孔树脂型号为DA-201-CIV大孔树脂，径高比为1：15~18，以1.0-4.0mL/min速度上样3 BV的上样液，先以超纯水洗脱1BV，随后再以体积百分比为70~80%的乙醇溶液洗脱3 BV，收集洗脱液，浓缩干燥后即得普尔那总黄酮提取物。
2.如权利要求1所述的普尔那总黄酮提取物，其特征在于，步骤（1）满足以下条件之一项或多项：
i. 所述普尔那样品粉末于超纯水中的底物质量浓度为0.04~0.08 g/mL；
ii. 胃蛋白酶与底物的比为10000 U/g；
iii. 调节溶液pH值采用1M HCl溶液；
iv. 调节溶液pH值至3.0；
v. 于37℃条件下超声酶解5h；
vi. 终止反应是100℃水浴10~15min。
3.如权利要求2所述的普尔那总黄酮提取物，其特征在于，终止反应是100℃水浴10min。
4.如权利要求1所述的普尔那总黄酮提取物，其特征在于，步骤（2）满足以下条件之一项或多项：
i. 药渣于超纯水中的底物质量浓度为0.04~0.08 g/mL；
ii. 胰蛋白酶与底物的比为10000 U/g；
iii. 调节溶液pH采用1M NaOH溶液；
iv. 调节溶液pH值至7.5；
v. 终止反应是100℃水浴10~15min。
5.如权利要求4所述的普尔那总黄酮提取物，其特征在于，终止反应是100℃水浴10min。
6.如权利要求1所述的普尔那总黄酮提取物，其特征在于，步骤（4）中所述上样液的浓度为1.2 mg/mL。
7.如权利要求1所述的普尔那总黄酮提取物，其特征在于，步骤（4）中所述上样液的上样速度为1.0 mL/min；所述乙醇溶液的体积百分比为70%。
8.权利要求1所述的普尔那总黄酮提取物在制备抗炎药物中的应用。
9.一种抗炎药物，其特征在于，包括药学上有效剂量的权利要求1所述的普尔那总黄酮提取物。
10.如权利要求9所述的抗炎药物，其特征在于，所述抗炎药物还包括药学上可接受的辅料。
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