CN107582588A - 一种白凤菜总黄酮提取物及其制备方法与治疗酒精性脂肪肝的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于药品或保健品领域，具体涉及一种白凤菜总黄酮提取物及其制备方法与治疗酒精性脂肪肝的用途。该提取物中，以重量百分含量计，含有80～85％的芦丁。本发明进一步以斑马鱼酒精性脂肪肝模型为实验模型进行药效实验研究，实验结果表明，本发明白凤菜总黄酮提取物能够有效对酒精性肝损伤起到保护效果，具有保肝护肝药效作用，可以作为潜在的治疗酒精性肝损伤的药物；本发明白凤菜总黄酮提取物的制备方法，在提取步骤后，通过选择特定组成、特定配比的酶组成的复合酶进行酶解，进一步通过大孔树脂萃取浓缩和大孔树脂分离纯化步骤，使得制备得到的白凤菜总黄酮提取物中芦丁的HPLC纯度可达80～85％。

Description

一种白凤菜总黄酮提取物及其制备方法与治疗酒精性脂肪肝 的用途
技术领域
本发明属于药品或保健品领域，具体涉及一种白凤菜总黄酮提取物及其制备方法与治疗酒精性脂肪肝的用途。
背景技术
酒精性脂肪肝(alcoholic fatty liver diseas，AFLD)是指由于长时间大剂量摄入酒精而发生的肝损害性疾病，为临床最常见酒精性肝病(ALD)之一。其约占酒精性肝病的90％，病理特点为肝细胞内脂质蓄积超过肝湿重的5％。在我国，酒精性肝病已成为继病毒性肝病后导致肝损害的第二大肝病，病程进一步进展将演变为肝纤维化甚至肝硬化等不可逆肝损伤，严重威胁生命健康。现代医学对AFLD的病因病理研究取得很大突破，但治疗上尚无特效药物，以戒酒限酒、对症及营养支持为主，效果不甚满意。
白凤菜(Gynura formosana Kitam.)是菊科菊三七属多年生草本植物，又名白背天葵、片仔癀草，其含有丰富的维生素、生物碱类以及黄酮类物质，是一种药食两用的植物。研究表明，白凤菜主要用于肺炎、肺癌、肝炎、肝硬化、高血压等疾病的治疗，其还有解热解毒的功效。
有文献报道，白凤菜提取物能够有效对酒精性肝损伤起到保护效果，具有保肝护肝的作用。由于白凤菜提取物含有种类众多的化学成分，具体哪种化学成分是对酒精性肝损伤起保护作用的活性成分，目前尚不明确。
因此，进一步研究白凤菜提取物中对酒精性肝损伤起保护作用的活性成分，对于研发新型的治疗酒精性脂肪肝的药物具有重要的意义。
发明内容
为此，本发明提供一种白凤菜总黄酮提取物，进而提供其制备方法与用途。
为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案来实现的：
本发明提供一种白凤菜总黄酮提取物，以重量百分含量计，含有80～85％的芦丁。
本发明还提供一种上述白凤菜总黄酮提取物的制备方法，包括以下步骤：
(1)提取：取白凤菜加入提取溶剂进行提取，调节提取液的pH值为4-8，得反应液；
(2)酶解：然后向反应液中加入复合酶进行酶解，30-50℃强制循环反应1-4小时，抽滤，收集滤液；
(3)萃取、浓缩：将滤液用大孔树脂A进行萃取，合并萃取液，将萃取液浓缩，得浓缩液；
(4)分离、纯化：将浓缩液离心，取上清液用大孔树脂B分离纯化，在波长为510nm下测定吸光度，收集洗脱液，浓缩、干燥，即得。
优选地，上述白凤菜总黄酮提取物的制备方法，所述酶解步骤中，采用由木瓜蛋白酶、纤维素酶和果胶酶组成的复合酶进行酶解。
进一步优选地，上述白凤菜总黄酮提取物的制备方法，所述复合酶与所述白凤菜的重量之比为：1:5～1:3。
进一步优选地，白凤菜总黄酮提取物的制备方法，所述复合酶中，木瓜蛋白酶、纤维素酶和果胶酶三者的重量比为(0.5-1.5)：(2-5)：(1-3)；
进一步优选地，上述白凤菜总黄酮提取物的制备方法，所述复合酶中，木瓜蛋白酶、纤维素酶和果胶酶三者的重量比为1：3：2。
进一步优选地，上述白凤菜总黄酮提取物的制备方法，
所述大孔树脂A选自AB-8、DM-130、HZ841、ZH-00、ZH-01、ZH-02、ZH-03、CAD-40、CAD-45、BS-30中的至少一种；
所述大孔树脂B选自D-101、D-140、D-141、XAD-3、XAD-4、HP-20、HP-21、LD-605、LSA-10中的至少一种。
进一步优选地，上述白凤菜总黄酮提取物的制备方法，所述提取步骤中，提取溶剂为水，所述白凤菜与所述水的重量之比为1：(20-60)。
进一步优选地，上述白凤菜总黄酮提取物的制备方法，所述分离、纯化步骤中，洗脱溶剂为体积浓度为70-80％的乙醇水溶液，洗脱速度为3-15m/h。
进一步优选地，上述白凤菜总黄酮提取物的制备方法，所述分离、纯化步骤中，洗脱溶剂为体积浓度为75％的乙醇水溶液，洗脱速度为5m/h。
进一步优选地，上述白凤菜总黄酮提取物的制备方法，所述浓缩液中，白凤菜总黄酮的浓度为0.5mg/mL。
进一步优选地，上述白凤菜总黄酮提取物的制备方法，所述萃取、浓缩步骤中，将滤液加入至盛有大孔树脂A的提取罐中，在30℃、80-150rpm下搅拌6-24小时，过滤，以大孔树脂A的重量计，取吸附后的大孔树脂A加入10-30重量倍量的体积浓度为70-95％的乙醇溶液，然后在30℃、80-150rpm下搅拌6-24小时，过滤，即得萃取液。
进一步优选地，上述白凤菜总黄酮提取物的制备方法，所述提取步骤中，采用盐酸或氢氧化钠调节提取液的pH值为4-8。
进一步优选地，上述白凤菜总黄酮提取物的制备方法，所述干燥为冷冻干燥。
本发明还提供上述制备方法制备得到的白凤菜总黄酮提取物。
本发明还提供一种药物制剂，以上述白凤菜总黄酮提取物、或者上述制备方法制备得到的白凤菜总黄酮提取物为活性成分，按照常规工艺，加入常规辅料制成临床上可接受的片剂、胶囊剂、散剂、合剂、丸剂、颗粒剂、糖浆剂、贴膏剂、栓剂、气雾剂、软膏剂或注射剂。
所述常规辅料为：填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质等。填充剂包括：淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等；崩解剂包括：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素纳等；润滑剂包括：硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等；助悬剂包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等；粘合剂包括，淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等；甜味剂包括：糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等；矫味剂包括：甜味剂及各种香精；防腐剂包括：尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸及其盐类、苯扎溴铵、醋酸氯乙定、桉叶油等；基质包括：PEG6000、PEG4000、虫蜡等。
本发明还提供上述白凤菜总黄酮提取物、上述制备方法制备得到的白凤菜总黄酮提取物、或者上述药物制剂在制备治疗酒精性脂肪肝的药品或保健品中的应用。
本发明的技术方案具有如下优点：
(1)本发明通过对白凤菜提取物进行进一步深入研究，提取分离得到一种含有80～85％的芦丁的白凤菜总黄酮提取物；进一步以斑马鱼酒精性脂肪肝模型为实验模型进行药效实验研究，实验结果表明，本发明白凤菜总黄酮提取物能够有效对酒精性肝损伤起到保护效果，具有保肝护肝药效作用，可以作为潜在的治疗酒精性肝损伤药物；
(2)本发明白凤菜总黄酮提取物的制备方法，在提取步骤后，通过选择特定组成、特定配比的酶组成的复合酶在30-50℃下进行酶解，不仅避免了白凤菜总黄酮化合物的结构在高温下被破坏，而且使得白凤菜总黄酮化合物能够最大程度地被提取出来，进一步通过大孔树脂萃取浓缩和大孔树脂分离纯化步骤，使得白凤菜总黄酮化合物的提取率可达1.8％-2.0％，比现有方法中白凤菜总黄酮化合物的提取率提高可达30％以上，制备得到的白凤菜总黄酮提取物中芦丁的HPLC纯度可达80～85％。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中：
图1是本发明实验例1中洗脱液的图谱；
图2是本发明实施例1制备的白凤菜总黄酮提取物的红外光谱图；
图3是本发明实施例1中芦丁对照品溶液的HPLC色谱图；
图4是本发明实施例1制备的白凤菜总黄酮提取物的HPLC色谱图；
图5是本发明实验例1中斑马鱼处死取样顺序。
具体实施方式
本发明以下实施例和实验例中，白凤菜采自福建省漳州市龙文区登科村，经鉴定为白凤菜。
实施例1
本实施例白凤菜总黄酮提取物按照以下方法制备而成：
(1)提取：取白凤菜100g，加入30重量倍量的水进行提取，用稀盐酸调节提取液的pH值为5，得反应液；
(2)酶解：然后向反应液中加入25g复合酶(该复合酶由重量比为1：3：2的木瓜蛋白酶、纤维素酶和果胶酶组成)进行酶解，40℃强制循环反应3小时，抽滤，收集滤液；
(3)萃取、浓缩：将滤液加入至盛有AB-8大孔树脂的提取罐中，在30℃、100rpm下搅拌12小时，过滤，以AB-8大孔树脂的重量计，取吸附后的AB-8大孔树脂加入20重量倍量的体积浓度为75％的乙醇溶液，然后在30℃、120rpm下搅拌12小时，过滤，即得萃取液，合并萃取液，将萃取液减压浓缩至白凤菜总黄酮的浓度为0.5mg/mL，得浓缩液；
(4)分离、纯化：将浓缩液10000rpm高速离心10分钟，取上清液加入装有大孔树脂D-101的层析柱内静止吸附60min，用体积浓度为75％的乙醇水溶液以5m/h的速度洗脱，在波长为510nm下测定吸光度，以吸光度值为纵坐标、以洗脱时间为横坐标作洗脱曲线图(其图谱如图1所示)，收集洗脱曲线中吸收峰范围内的洗脱液，浓缩、冷冻干燥，即得白凤菜总黄酮提取物。
经过计算，本实施例白凤菜总黄酮化合物的提取率为2.0％。
由图1可知，洗脱液在340min处出现一个明显的吸收峰，峰形较为单一，说明洗脱液中黄酮相对较纯。
A、本实施例白凤菜总黄酮提取物按照以下方法进行红外光谱鉴定：
取一定质量烘干后的芦丁标准品，以1：100加入烘干后的溴化钾，经研磨后制成固体压片，用傅立叶红外分光光度计在扫描范围4000-400cm-1、分辨率4、扫描次数为4的条件下绘制红外光谱图；同法绘制纯化后的白背天葵提取物的红外光谱图，对比鉴定。结果如图2所示。
由图2可知，芦丁标准品和白凤菜总黄酮提取物的红外光谱分别在3685.455～3018.177cm-1左右均出现宽而强的吸收峰，是-OH的伸缩振动峰，表明存在酚羟基或糖上的羟基，且数目较大；在2914.036cm-1处出现弱吸收峰，是碳氢键的伸缩振动峰，说明饱和碳上的氢较少；在1654.694cm-1处出现C＝O的伸缩振动中强峰，两者位置和峰型基本一致，说明提取物是黄酮类物质；在1371.88、1362.89cm-1处出现羟基的弯曲振动峰；在804.80、810.56cm-1处出现苯环邻位氢引起的吸收峰；在1010.07～696.62cm-1处出现苯环上取代基位置引起的吸收峰，但峰位置不同，说明提取物与芦丁的羟基取代位置不同；这些表明，提取物中含有羟基、羰基以及不同位置取代的苯环等官能团，特征吸收峰基本一致。因此可确定提取物是黄酮类化合物。
B、按照以下方法通过液相色谱分析本实施例白凤菜总黄酮提取物中的芦丁的含量:
B1、液相色谱条件的确定
液相色谱条件:保护柱:Eclipse XDB-C18AnalyticalGuard Column(4.6×12.5mm，5μm)：ZOR BZX Eclipse XDB-C18(4.6×150mm，5μm)；流速：0.5mL/min；柱温：35℃；检测波长：368nm、254nm、210nm；进样体积：10μL；流动相:0.03％甲酸水溶液(A)，乙腈(B)；梯度洗脱程序如下：0～10min，20％B；10～12min，20％～24％B；12～20min，24％B；20～25min，24％～30％B；25～48min，30％B。
B2、对照品溶液的配置
准确称取芦丁0.001g，溶解于1mL甲醇中，制成1mg/mL的单一对照品溶液。并用一次性滤膜过滤，装入小试管中待用。
B3、测定
精密吸取对照品溶液、供试品溶液(实施例1制备的白凤菜黄酮提取物，配制成浓度为1μg/μL的甲醇溶液)，按照液相色谱检测条件分别进行检测分析。
对照品溶液的HPLC色谱图如图3所示，供试品溶液的HPLC色谱图如图4所示。
由图3可知，芦丁对照品溶液可在10分钟内完全分离，芦丁在本实验的色谱条件下，色谱基线基本平直，呈现色谱峰无拖尾现象，杂质也无干扰，且出峰较早，其保留时间为2.745min。
由图4，通过面积归一法计算可知，白凤菜提取物中芦丁的含量为81.29％。
实施例2
本实施例白凤菜总黄酮提取物按照以下方法制备而成：
(1)提取：取白凤菜100g，加入20重量倍量的水进行提取，用稀氢氧化钠溶液调节提取液的pH值为8，得反应液；
(2)酶解：然后向反应液中加入20g复合酶(该复合酶由重量比为0.5：5：1的木瓜蛋白酶、纤维素酶和果胶酶组成)进行酶解，30℃强制循环反应4小时，抽滤，收集滤液；
(3)萃取、浓缩：将滤液加入至盛有DM-130大孔树脂的提取罐中，在30℃、80rpm下搅拌24小时，过滤，以DM-130大孔树脂的重量计，取吸附后的DM-130大孔树脂加入10重量倍量的体积浓度为95％的乙醇溶液，然后在30℃、80rpm下搅拌24小时，过滤，即得萃取液，合并萃取液，将萃取液减压浓缩至白凤菜总黄酮的浓度为0.5mg/mL，得浓缩液；
(4)分离、纯化：将浓缩液6000rpm高速离心8分钟，取上清液加入装有大孔树脂HP-21的层析柱内静止吸附60min，用体积浓度为80％的乙醇水溶液以3m/h的速度洗脱，在波长为510nm下测定吸光度，以吸光度值为纵坐标、以洗脱时间为横坐标作洗脱曲线图，收集洗脱曲线中吸收峰范围内的洗脱液，浓缩、冷冻干燥，即得白凤菜总黄酮提取物。
经过计算，本实施例白凤菜总黄酮化合物的提取率为1.82％。
按照实施例1中“B项下”测定本实施例白凤菜总黄酮提取物中的芦丁。通过测定分析可知，HPLC图谱中，本实施例白凤菜总黄酮提取物中的芦丁含量为80％。
实施例3
本实施例白凤菜总黄酮提取物按照以下方法制备而成：
(1)提取：取白凤菜100g，加入60重量倍量的水进行提取，用稀盐酸调节提取液的pH值为4，得反应液；
(2)酶解：然后向反应液中加入32g复合酶(该复合酶由重量比为1.5：2：3的木瓜蛋白酶、纤维素酶和果胶酶组成)进行酶解，50℃强制循环反应1小时，抽滤，收集滤液；
(3)萃取、浓缩：将滤液加入至盛有ZH-01大孔树脂的提取罐中，在30℃、150rpm下搅拌6小时，过滤，以ZH-01大孔树脂的重量计，取吸附后的ZH-01大孔树脂加入30重量倍量的体积浓度为70％的乙醇溶液，然后在30℃、150rpm下搅拌6小时，过滤，即得萃取液，合并萃取液，将萃取液减压浓缩至白凤菜总黄酮的浓度为0.5mg/mL，得浓缩液；
(4)分离、纯化：将浓缩液8000rpm高速离心5分钟，取上清液加入装有大孔树脂XAD-3的层析柱内静止吸附60min，用体积浓度为70％的乙醇水溶液以15m/h的速度洗脱，在波长为510nm下测定吸光度，以吸光度值为纵坐标、以洗脱时间为横坐标作洗脱曲线图，收集洗脱曲线中吸收峰范围内的洗脱液，浓缩、冷冻干燥，即得白凤菜总黄酮提取物。
经过计算，本实施例白凤菜总黄酮化合物的提取率为1.91％。
按照实施例1中“B项下”测定本实施例白凤菜总黄酮提取物中的芦丁。通过测定分析可知，HPLC图谱中，本实施例白凤菜总黄酮提取物中的芦丁含量为85％。
实验例1白凤菜总黄酮提取物对斑马鱼酒精性脂肪肝损伤实验研究
一、实验材料
数码相差倒置显微镜(IX51日本Olympus)；Nikon SMZ18数码显微镜；全自动生化分析仪(BS-220深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)；组织包埋机(BMJ-Ⅲ常州中威电子仪器厂)；切片机(RM2235德国Leica)；病理组织漂烘仪(PHY-Ⅲ常州事郊区中威电子仪器厂)；酶标仪(SUNRISE瑞士Tecan)；组织匀浆器(PRO200美国PRO Scientific)；高速冷冻离心机(Centrifuge 5810R德国Eppendorf)；反渗透纯水系统(RO-200上海和泰仪器有限公司)；MDA测定试剂盒(碧云天生物技术研究所)；SOD测定试剂盒(碧云天生物技术研究所)；无水乙醇(西陇化工股份有限公司)；Oil red O油红染料(阿拉丁)；PBS缓冲溶液(ThermoFisher Scientific)；丙二醇(西陇化工股份有限公司)；甘油(西陇化工股份有限公司)；N-苯甲基硫脲(Sigma)；三卡因甲磺酸(Sigma)；多聚甲醛(北京拓英坊科技有限公司)；二甲苯(西陇化工股份有限公司)；苏木素-伊红(HE)；以上试剂均为分析纯；实验试剂盒由碧云天生物技术研究所提供。
二、实验方法
1、供试药物制备
按照实施1的方法制备白凤菜总黄酮提取物作为供试药物。
2、实验动物饲养及分组
野生型成年斑马鱼购自漳州市花鸟市场，于28℃恒温环境中，自动计时器控制实验室光照14h，黑暗10h，连续一个星期每日定时定量投放鱼饵料，实验待用。实验所采用的斑马鱼幼鱼全部来自实验室饲养野生型TU品系斑马鱼。斑马鱼根据Westerfield方法养殖：照明14h，黑暗10h交替进行，雌雄分开饲养，每天定时给予投放新鲜丰年虫，实验前一晚，将TU品系斑马鱼按雌雄1：1分开放入交配缸中，插入隔板；次日早上拨开隔板，斑马鱼交配产卵，收集卵至28℃恒温培养箱中培养96hpf，期间定时换水，剔除死卵，实验待用。
为选择白凤菜总黄酮提取物对斑马鱼酒精性脂肪肝损伤修复最大非致死浓度，以便对实验进行分组，按照斑马鱼慢性毒性实验常规方法，将斑马鱼成鱼60条，随机分为5组，每组10条，分缸饲养，白凤菜总黄酮提取物溶解于1.0％酒精，每天一换液，连续一周，以正常鱼水饲养斑马鱼作为对照。于实验开始后每天记录实验鱼的中毒症状和死亡条数，及时清理死鱼，每组剂量如表1所示。
表1 白凤菜总黄酮提取物对斑马鱼成鱼慢性毒性实验分组
组别 数量(条) 药物浓度(mg/mL)
1 10 0
2 10 0.03
3 10 0.06
4 10 0.12
5 10 0.18
对照组 10 正常鱼水
(注：对照组为正常鱼水饲养，其他组溶剂分别为1.0％酒精)
按照斑马鱼幼鱼急性毒性实验常规方法，将斑马鱼幼鱼随机分为7组，每组180条，分岗饲养，白凤菜总黄酮提取物溶解于2.0％酒精，连续32h，以正常鱼水饲养斑马鱼作为对照。于实验开始后每天记录实验鱼的中毒症状和死亡条数，及时清理死鱼，每组剂量如表2所示。
斑马鱼成鱼、幼鱼均分为对照组、模型组、白凤菜总黄酮提取物高、中、低剂量组共5组。斑马鱼成鱼高、中、低剂量组自实验开始分别以相应药物浓度，加入1.0％酒精鱼水中饲养，期间定时更换，连续28d，对照组以常规鱼水饲养。斑马鱼幼鱼高、中、低剂量组自实验开始分别以相应药物浓度加入2.0％酒精鱼水中饲养32h，对照组以常规鱼水饲养。
表2 白凤菜总黄酮提取物对斑马鱼幼鱼急性毒性实验分组
组别 数量(条) 药物浓度(mg/mL)
1 180 0
2 180 0.03
3 180 0.06
4 180 0.08
5 180 0.10
6 180 0.12
对照组 180 正常鱼水
(注：对照组为正常鱼水饲养，其他组溶剂分别为2.0％酒精)
3、斑马鱼成鱼肝脏指数测定
各实验组斑马鱼末次换水后，实验动物禁食12h。斑马鱼处死前称体重，自眼球采血，每50只为一组，空白对照组，模型组以及各实验组各3个，采血后即刻处死，称重，快速分离实验所需肝脏组织，将肝脏组织称重，然后甲醛固定或液氮保存。斑马鱼处死取样顺序如图5所示。
按照以下公式进行肝脏指数的计算：
4、斑马鱼血清肝功能生化指标检测
将血液在4000r/min、4℃下离心10min取上清，采用全自动生化分析仪测定血清谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)，上述指标按照试剂盒指示用全自动生化分析仪测定，并根据试剂盒使用说明测定肝脏中抗氧化水平SOD、抗逆境水平MDA。
5、斑马鱼成鱼肝脏HE染色
将固定组织样脱水后(脱水顺序：75％乙醇30min→90％乙醇10min→95％乙醇10min→95％乙醇10min→100％乙醇10min→100％乙醇10min→100％乙醇10min→二甲苯Ⅰ5min→二甲苯Ⅱ5min→二甲苯Ⅲ5min)石蜡包埋，4μm切片，70℃烤片30min，常规染液苏木素-伊红(HE)染色，中性树胶封片，显微镜进行观察。
6、白凤菜总黄酮提取物对斑马鱼幼鱼肝脏生化指标影响测定
待实验进行32h后，随机挑选对照组、模型组、白凤菜总黄酮提取物高、中、低浓度组共5组斑马鱼幼鱼各50条，采用全自动生化分析仪测定斑马鱼幼鱼整体匀浆AST、ALT含量及按照试剂盒说明测定斑马鱼幼鱼整体匀浆SOD活力和MDA含量，每个组别重复三次。记录并分析数据。
7、数据统计学处理
实验数据以平均数±标准差形式表示，采用统计学软件SPSS10.0及单因素方差分析法对数据分析处理，P<0.05表示显著性水平差异，P<0.01表示极显著性水平差异。
三、实验结果
1、白凤菜总黄酮提取物对斑马鱼酒精性脂肪肝损伤修复最大非致死浓度确定
白凤菜总黄酮提取物对斑马鱼成鱼慢性毒性实验结果和急性毒性实验结果如表3和表4所示。由表3和表4可知，斑马鱼成鱼在一周给药时间内观察到，各分组在外观形态，游动能力，精神状态均表现正常，无死亡记录。斑马鱼幼鱼在32h给药时间内，白凤菜总黄酮提取物浓度达到0.08mg/mL的实验组出现死亡，0.12mg/mL组在4h开始出现死亡，在32h死亡率7％，没有出现大规模死亡。将白凤菜总黄酮提取物浓度0.08mg/mL、0.04mg/mL、0.02mg/mL作为斑马鱼幼鱼实验组高、中、低剂量组浓度。
表3 白凤菜总黄酮提取物对斑马鱼成鱼慢性毒性实验结果
药物浓度(mg/mL) 数量(条) 死亡数量(条) 存活数量(条)
0 10 0 10
0.03 10 0 10
0.06 10 0 10
0.12 10 0 10
0.18 10 0 10
对照组 10 0 10
(注：对照组为正常鱼水饲养，其他组溶剂分别为1.0％酒精)
表4 白凤菜总黄酮提取物对斑马鱼成鱼急性毒性实验结果
药物浓度(mg/mL) 数量(条) 死亡数量(条) 存活数量(条)
0 180 0 180
0.03 180 0 180
0.06 180 0 180
0.08 180 1 179
0.10 180 6 174
0.12 180 13 167
对照组 180 0 180
(注：对照组为正常鱼水饲养，其他组溶剂分别为2.0％酒精)
2、白凤菜总黄酮提取物对斑马鱼成鱼体重、肝重和肝指数的影响
白凤菜总黄酮提取物对斑马鱼成鱼体重、肝重和肝指数的影响如表5所示。由表5可知，与正常对照组相比，模型组斑马鱼成鱼经过酒精处理后体重下降，肝脏重量升高，肝指数显著升高，有显著差异(P＜0.05)，说明酒精在一定程度上对斑马鱼具有毒性作用，对斑马鱼肝脏造成损伤。而与模型组相比，经过不同浓度白凤菜总黄酮提取物组处理后斑马鱼肝重下降，体重和肝指数均升高，中、高剂量组肝指数与模型性相比具有显著差异(P＜0.05)，这表明白凤菜总黄酮提取物对改善斑马鱼肝指数的效果较好。
表5 白凤菜总黄酮提取物对酒精肝斑马鱼体重、肝重和肝指数的影响(n＝10)
组别 体重 肝重 肝指数(g/g)
对照组 0.298±0.03 0.0050±0.0007 0.0170±0.0011*
模型组 0.276±0.02 0.0059±0.0009 0.0212±0.0014
高剂量组 0.294±0.04 0.0056±0.0006 0.0175±0.0015*
中剂量组 0.283±0.02 0.0055±0.0006 0.0184±0.0012*
低剂量组 0.285±0.030 0.0054±0.0007 0.0197±0.0016
(与模型组相比，P*＜0.05)
3、白凤菜总黄酮提取物对酒精性脂肪肝斑马鱼成鱼血清指标的影响
斑马鱼血清的谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)含量如表6所示。
由表6可知，与正常对照组相比，模型组斑马鱼的血清AST、ALT活性有显著性上升(P<0.05)，TG指标也有明显增加，达到了极显著差异(P<0.01)；说明酒精饲养能明显促进斑马鱼酒精性脂肪肝的生成。加入不同剂量白凤菜总黄酮提取物的斑马鱼血清AST、ALT、TC、TG水平均有下降趋势，其中ALT、AST、TG与模型组相比有显著差异(P<0.05)，这表明白凤菜总黄酮提取物抑制斑马鱼体内血清ALT、AST、TG增加的效果较好。
斑马鱼血清和肝脏SOD活性和MDA水平的含量如表7所示。由表7可知，模型组斑马鱼SOD活性较对照组显著下降(P<0.05)，MDA含量显著升高(P<0.05)，说明酒精对斑马鱼肝脏具有毒性作用，使斑马鱼抗氧化能力下降以及鱼体内氧化应激水平出现下降。与模型组相比，白凤菜总黄酮提取物各剂量组SOD活性均有所升高，其中中高剂量组白凤菜总黄酮提取物差异达到显著性水平(P<0.05)；白凤菜总黄酮提取物各剂量组均降低了斑马鱼肝脏MDA含量。这表明，白凤菜总黄酮提取物对酒精导致斑马鱼酒精性脂肪肝具有一定的防治作用。
表6 白凤菜总黄酮提取物对酒精肝斑马鱼血清ALT、AST、TC、TG的影响(n＝10)
(与酒精模型组比较，P*＜0.05，P**＜0.01)
表7 白凤菜总黄酮提取物对酒精肝斑马鱼血清及肝组织SOD、MDA影响(n＝10)
(与酒精模型组比较，P*＜0.05)
4、白凤菜总黄酮提取物对斑马鱼幼鱼肝脏相关生化指标影响测定结果
白凤菜总黄酮提取物对酒精肝斑马鱼幼鱼匀浆ALT、AST、SOD、MDA的影响如表8所示。由表8可知，与对照组相比，模型组斑马鱼幼鱼ALT、AST、SOD活性都出现了明显下降，达到了极显著性差异(P＜0.01)，MDA出现了明显上升，达到了极显著性差异(P＜0.01)。ALT和AST变化趋势不同原因是如下：以往的研究中检测的是血清中ALT和AST的活性，本实验中检测的组织匀浆液中的ALT和AST活性。模型组肝脏损伤后，细胞通透性增强，血清中的ALT和AST活性增强。但从整体动物的角度来讲，肝脏损伤后，肝细胞合成ALT和AST能力降低，所以ALT和AST的总活力下降，从不同角度说明了酒精对ALT和AST的影响。
白凤菜总黄酮提取物各剂量组都能使酒精肝斑马鱼ALT、AST、SOD活性有所提高，说明白凤菜总黄酮提取物能够有效保护斑马鱼幼鱼肝脏正常的生长发育或修复肝损伤，减轻幼鱼肝脏肿大，脂滴堆积症状，增强肝细胞合成AST和ALT的能力，因此AST和ALT的总活力有所提高。其中高剂量组白凤菜总黄酮提取物ALT活性提高达到了极显著水平(P＜0.01)，中剂量组白凤菜总黄酮提取物ALT活性提高达到了显著水平(P＜0.05)；高剂量组、中剂量组白凤菜总黄酮提取物AST活性提高达到了显著性水平(P＜0.05)；各剂量组白凤菜总黄酮提取物SOD水平有一定提高，MDA水平有一定降低。以上结果表明，白凤菜总黄酮提取物对酒精引发斑马鱼幼鱼酒精性脂肪肝具有一定的防治作用，减轻斑马鱼体内自我应激的程度。
表8 白凤菜总黄酮提取物对酒精肝斑马鱼幼鱼匀浆ALT、AST、SOD、MDA的影响(n＝8)
组别 ALT(U/L) AST(U/L) SOD(mmol/l) MDA(mmol/l)
对照组 66.54±7.29** 584.53±25.67** 80.01±6.24** 1.52±0.46**
模型组 33.49±6.52 305.27±21.41 46.62±7.18 3.67±0.60
高剂量组 59.78±5.21** 474.92±31.27* 61.53±4.84 3.06±0.17
中剂量组 51.40±8.29* 445.79±26.46* 57.16±5.95 2.89±0.38
低剂量组 45.91±7.89 402.36±25.31* 58.38±4.10 2.55±0.40*
(与模型组比较，P*＜0.05，P**＜0.01)
四、实验结论
为了更深层次的探究白凤菜总黄酮提取物是否具有保肝护肝功效，本实验采用新型斑马鱼酒精性脂肪肝模型，该模型具有样本量大、实验技术操作简单、实验周期短以及耗费低等优势。
实验结果表明，在斑马鱼成鱼实验中，与模型组对比，白凤菜总黄酮提取物各剂量组的肝重和肝指数均有一定程度的下降，且能降低模型组斑马鱼血清中AST、ALT、TC、TG含量，减轻斑马鱼体内细胞损伤的情况；提高SOD活性水平，使斑马鱼抗氧化能力增强，下调MDA水平含量，使得斑马鱼体内氧化应激水平出现下降。斑马鱼幼鱼生化指标揭示了白凤菜各提取物组别能够提高斑马鱼幼鱼整体匀浆的ALT、AST、SOD活性，增强肝细胞合成AST和ALT的能力，降低MDA水平含量，各药物组中以白凤菜总黄酮提取物高剂量组(0.08mg/mL)效果最佳，可见本实验中白凤菜总黄酮提取物能够有效对酒精性肝损伤起到保护效果，具有保肝护肝药效作用，白凤菜总黄酮提取物为制备治疗酒精性肝损伤药物提供药效学研究基础。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种白凤菜总黄酮提取物，其特征在于，以重量百分含量计，含有80～85％的芦丁。
2.一种权利要求1所述的白凤菜总黄酮提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取：取白凤菜加入提取溶剂进行提取，调节提取液的pH值为4-8，得反应液；
(2)酶解：然后向反应液中加入复合酶进行酶解，30-50℃强制循环反应1-4小时，抽滤，收集滤液；
(3)萃取、浓缩：将滤液用大孔树脂A进行萃取，合并萃取液，将萃取液浓缩，得浓缩液；
(4)分离、纯化：将浓缩液离心，取上清液用大孔树脂B分离纯化，在波长为510nm下测定吸光度，收集洗脱液，浓缩、干燥，即得。
3.根据权利要求2所述的白凤菜总黄酮提取物的制备方法，其特征在于，
所述酶解步骤中，采用由木瓜蛋白酶、纤维素酶和果胶酶组成的复合酶进行酶解；
所述复合酶与所述白凤菜的重量之比为：1:5～1:3。
4.根据权利要求2或3所述的白凤菜总黄酮提取物的制备方法，其特征在于，所述复合酶中，木瓜蛋白酶、纤维素酶和果胶酶三者的重量比为(0.5-1.5)：(2-5)：(1-3)。
5.根据权利要求4所述的白凤菜总黄酮提取物的制备方法，其特征在于，所述复合酶中，木瓜蛋白酶、纤维素酶和果胶酶三者的重量比为1：3：2。
6.根据权利要求2-5任一项所述的白凤菜总黄酮提取物的制备方法，其特征在于，
所述大孔树脂A选自AB-8、DM-130、HZ841、ZH-00、ZH-01、ZH-02、ZH-03、CAD-40、CAD-45、BS-30中的至少一种；
所述大孔树脂B选自D-101、D-140、D-141、XAD-3、XAD-4、HP-20、HP-21、LD-605、LSA-10中的至少一种。
7.根据权利要求2-6任一项所述的白凤菜总黄酮提取物的制备方法，其特征在于，
所述提取步骤中，提取溶剂为水，所述白凤菜与所述水的重量之比为1：(20-60)。
8.根据权利要求2-7任一项所述的白凤菜总黄酮提取物的制备方法，其特征在于，
所述分离、纯化步骤中，洗脱溶剂为体积浓度为70-80％的乙醇水溶液，洗脱速度为3-15m/h；
所述浓缩液中，白凤菜总黄酮的浓度为0.5mg/mL。
9.一种药物制剂，其特征在于，以权利要求1所述的白凤菜总黄酮提取物、或者权利要求2-8任一项所述的制备方法制备得到的白凤菜总黄酮提取物为活性成分，按照常规工艺，加入常规辅料制成临床上可接受的片剂、胶囊剂、散剂、合剂、丸剂、颗粒剂、糖浆剂、贴膏剂、栓剂、气雾剂、软膏剂或注射剂。
10.权利要求1所述的白凤菜总黄酮提取物、权利要求2-8任一项所述的制备方法制备得到的白凤菜总黄酮提取物、或者权利要求9所述的药物制剂在制备治疗酒精性脂肪肝的药品或保健品中的应用。
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