TW201919680A - 一種白鳳菜總黃酮提取物及其製備方法與治療酒精性脂肪肝的用途 - Google Patents

一種白鳳菜總黃酮提取物及其製備方法與治療酒精性脂肪肝的用途 Download PDF

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Abstract

本發明屬於藥品或保健品領域，具體涉及一種白鳳菜總黃酮提取物及其製備方法與治療酒精性脂肪肝的用途。該提取物中，以重量百分含量計，含有80~85%的芸香苷。本發明進一步以斑馬魚酒精性脂肪肝模型為實驗模型進行藥效實驗研究，實驗結果顯示，本發明白鳳菜總黃酮提取物能夠有效對酒精性肝損傷起到保護效果，具有保肝護肝藥效作用，可以作為潛在的治療酒精性肝損傷的藥物；本發明白鳳菜總黃酮提取物的製備方法，在提取步驟後，通過選擇特定組成、特定配比的酶組成的複合酶進行酶解，進一步通過大孔樹脂萃取濃縮和大孔樹脂分離純化步驟，使得製備得到的白鳳菜總黃酮提取物中芸香苷的HPLC純度可達80~85%。

Description

一種白鳳菜總黃酮提取物及其製備方法與治療酒精性脂肪肝的用途
本發明屬於藥品或保健品領域，具體涉及一種白鳳菜總黃酮提取物及其製備方法與治療酒精性脂肪肝的用途。
酒精性脂肪肝（alcoholic fatty liver diseas，AFLD）是指由於長時間大劑量攝入酒精而發生的肝損害性疾病，為臨床最常見酒精性肝病（ALD）之一。其約占酒精性肝病的90%，病理特點為肝細胞內脂質蓄積超過肝濕重的5%。在我國，酒精性肝病已成為繼病毒性肝病後導致肝損害的第二大肝病，病程進一步進展將演變為肝纖維化甚至肝硬化等不可逆肝損傷，嚴重威脅生命健康。現代醫學對AFLD 的病因病理研究取得很大突破，但治療上尚無特效藥物，以戒酒限酒、對症及營養支持為主，效果不甚滿意。
白鳳菜（Gynura formosana Kitam .）是菊科菊三七屬多年生草本植物，又名白背天葵、片仔癀草，其含有豐富的維生素、生物鹼類以及黃酮類物質，是一種藥食兩用的植物。研究顯示，白鳳菜主要用於肺炎、肺癌、肝炎、肝硬化、高血壓等疾病的治療，其還有解熱解毒的功效。
有文獻報導，白鳳菜提取物能夠有效對酒精性肝損傷起到保護效果，具有保肝護肝的作用。由於白鳳菜提取物含有種類眾多的化學成分，具體哪種化學成分是對酒精性肝損傷起保護作用的活性成分，目前尚不明確。
因此，進一步研究白鳳菜提取物中對酒精性肝損傷起保護作用的活性成分，對於研發新型的治療酒精性脂肪肝的藥物具有重要的意義。
為此，本發明提供一種白鳳菜總黃酮提取物，進而提供其製備方法與用途。
為解決上述技術問題，本發明是通過以下技術方案來實現的：
本發明提供一種白鳳菜總黃酮提取物，以重量百分含量計，含有80~85%的芸香苷(rutin)。
本發明還提供一種上述白鳳菜總黃酮提取物的製備方法，包括以下步驟： （1）提取：取白鳳菜加入提取溶劑進行提取，調節提取液的pH值為4-8，得反應液； （2）酶解：然後向反應液中加入複合酶進行酶解，30-50℃強制迴圈反應1-4小時，抽濾，收集濾液； （3）萃取、濃縮：將濾液用大孔樹脂A進行萃取，合併萃取液，將萃取液濃縮，得濃縮液； （4）分離、純化：將濃縮液離心，取上清液用大孔樹脂B分離純化，在波長為510nm下測定吸光度，收集洗脫液，濃縮、乾燥，即得。
較佳地，上述白鳳菜總黃酮提取物的製備方法，所述酶解步驟中，採用由木瓜蛋白酶、纖維素酶和果膠酶組成的複合酶進行酶解。
進一步較佳地，上述白鳳菜總黃酮提取物的製備方法，所述複合酶與所述白鳳菜的重量之比為：1:5~1:3。
進一步較佳地，白鳳菜總黃酮提取物的製備方法，所述複合酶中，木瓜蛋白酶、纖維素酶和果膠酶三者的重量比為（0.5-1.5）：（2-5）：（1-3）；
進一步較佳地，上述白鳳菜總黃酮提取物的製備方法，所述複合酶中，木瓜蛋白酶、纖維素酶和果膠酶三者的重量比為1：3：2。
進一步較佳地，上述白鳳菜總黃酮提取物的製備方法， 所述大孔樹脂A選自AB-8、DM-130、HZ841、ZH-00、ZH-01、ZH-02、ZH-03、CAD-40、CAD-45、BS-30中的至少一種； 所述大孔樹脂B選自 D-101、D-140、D-141、XAD-3、XAD-4、HP-20、HP-21、LD-605、LSA-10中的至少一種。
進一步較佳地，上述白鳳菜總黃酮提取物的製備方法，所述提取步驟中，提取溶劑為水，所述白鳳菜與所述水的重量之比為1：（20-60）。
進一步較佳地，上述白鳳菜總黃酮提取物的製備方法，所述分離、純化步驟中，洗脫溶劑為體積濃度為70-80%的乙醇水溶液，洗脫速度為 3-15m/小時。
進一步較佳地，上述白鳳菜總黃酮提取物的製備方法，所述分離、純化步驟中，洗脫溶劑為體積濃度為75%的乙醇水溶液，洗脫速度為5m/小時。
進一步較佳地，上述白鳳菜總黃酮提取物的製備方法，所述濃縮液中，白鳳菜總黃酮的濃度為0.5mg/mL。
進一步較佳地，上述白鳳菜總黃酮提取物的製備方法，所述萃取、濃縮步驟中，將濾液加入至盛有大孔樹脂A的提取罐中，在30℃、80-150rpm下攪拌6-24小時，過濾，以大孔樹脂A的重量計，取吸附後的大孔樹脂A加入10-30重量倍量的體積濃度為70-95%的乙醇溶液，然後在30℃、80-150rpm下攪拌6-24小時，過濾，即得萃取液。
進一步較佳地，上述白鳳菜總黃酮提取物的製備方法，所述提取步驟中，採用鹽酸或氫氧化鈉調節提取液的pH值為4-8。
進一步較佳地，上述白鳳菜總黃酮提取物的製備方法，所述乾燥為冷凍乾燥。
本發明還提供上述製備方法製備得到的白鳳菜總黃酮提取物。
本發明還提供一種藥物製劑，以上述白鳳菜總黃酮提取物、或者上述製備方法製備得到的白鳳菜總黃酮提取物為活性成分，按照常規工藝，加入常規輔料製成臨床上可接受的片劑、膠囊劑、散劑、合劑、丸劑、顆粒劑、糖漿劑、貼膏劑、栓劑、氣霧劑、軟膏劑或注射劑。
所述常規輔料為：填充劑、崩解劑、潤滑劑、助懸劑、粘合劑、甜味劑、矯味劑、防腐劑、基質等。填充劑包括：澱粉、預膠化澱粉、乳糖、甘露醇、甲殼素、微晶纖維素、蔗糖等；崩解劑包括：澱粉、預膠化澱粉、微晶纖維素、羧甲基澱粉鈉、交聯聚乙烯吡咯烷酮、低取代羥丙纖維素、交聯羧甲基纖維素納等；潤滑劑包括：硬脂酸鎂、十二烷基硫酸鈉、滑石粉、二氧化矽等；助懸劑包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纖維素、蔗糖、瓊脂、羥丙基甲基纖維素等；粘合劑包括，澱粉漿、聚乙烯吡咯烷酮、羥丙基甲基纖維素等；甜味劑包括：糖精鈉、阿斯巴甜、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等；矯味劑包括：甜味劑及各種香精；防腐劑包括：尼泊金類、苯甲酸、苯甲酸鈉、山梨酸及其鹽類、苯紮溴銨、醋酸氯乙定、桉葉油等；基質包括：PEG6000、PEG4000、蟲蠟等。
本發明還提供上述白鳳菜總黃酮提取物、上述製備方法製備得到的白鳳菜總黃酮提取物、或者上述藥物製劑在製備治療酒精性脂肪肝的藥品或保健品中的應用。
本發明的技術方案具有如下優點：
（1）本發明通過對白鳳菜提取物進行進一步深入研究，提取分離得到一種含有80~85%的芸香苷的白鳳菜總黃酮提取物；進一步以斑馬魚酒精性脂肪肝模型為實驗模型進行藥效實驗研究，實驗結果顯示，本發明白鳳菜總黃酮提取物能夠有效對酒精性肝損傷起到保護效果，具有保肝護肝藥效作用，可以作為潛在的治療酒精性肝損傷藥物；
（2）本發明白鳳菜總黃酮提取物的製備方法，在提取步驟後，通過選擇特定組成、特定配比的酶組成的複合酶在30-50℃下進行酶解，不僅避免了白鳳菜總黃酮化合物的結構在高溫下被破壞，而且使得白鳳菜總黃酮化合物能夠最大程度地被提取出來，進一步通過大孔樹脂萃取濃縮和大孔樹脂分離純化步驟，使得白鳳菜總黃酮化合物的提取率可達1.8%-2.0%，比現有方法中白鳳菜總黃酮化合物的提取率提高可達30%以上，製備得到的白鳳菜總黃酮提取物中芸香苷的HPLC純度可達80~85%。
本發明以下實施例和實驗例中，白鳳菜採自福建省漳州市龍文區登科村，經鑒定為白鳳菜。
實施例1
本實施例白鳳菜總黃酮提取物按照以下方法製備而成：
（1）提取：取白鳳菜100g，加入30重量倍量的水進行提取，用稀鹽酸調節提取液的pH值為5，得反應液；
（2）酶解：然後向反應液中加入25g複合酶（該複合酶由重量比為1：3：2的木瓜蛋白酶、纖維素酶和果膠酶組成）進行酶解，40℃強制迴圈反應3小時，抽濾，收集濾液；
（3）萃取、濃縮：將濾液加入至盛有AB-8大孔樹脂的提取罐中，在30℃、100rpm下攪拌12小時，過濾，以AB-8大孔樹脂的重量計，取吸附後的AB-8大孔樹脂加入20重量倍量的體積濃度為75%的乙醇溶液，然後在30℃、120rpm下攪拌12小時，過濾，即得萃取液，合併萃取液，將萃取液減壓濃縮至白鳳菜總黃酮的濃度為0.5mg/mL，得濃縮液；
（4）分離、純化：將濃縮液10000rpm高速離心10分鐘，取上清液加入裝有大孔樹脂D-101的層析柱內靜止吸附60分鐘，用體積濃度為75%的乙醇水溶液以5m/小時的速度洗脫，在波長為510nm下測定吸光度，以吸光度值為縱坐標、以洗脫時間為橫坐標作洗脫曲線圖（其圖譜如圖1所示），收集洗脫曲線中吸收峰範圍內的洗脫液，濃縮、冷凍乾燥，即得白鳳菜總黃酮提取物。
經過計算，本實施例白鳳菜總黃酮化合物的提取率為2.0%。
由圖1可知，洗脫液在340分鐘處出現一個明顯的吸收峰，峰形較為單一，說明洗脫液中黃酮相對較純。
A 、本實施例白鳳菜總黃酮提取物按照以下方法進行紅外光譜鑒定：
取一定品質烘乾後的芸香苷標準品，以1：100加入烘乾後的溴化鉀，經研磨後製成固體壓片，用傅立葉紅外分光光度計在掃描範圍4000-400cm-1 、解析度4、掃描次數為4的條件下繪製紅外光譜圖；同法繪製純化後的白背天葵提取物的紅外光譜圖，對比鑒定。結果如圖2所示。
由圖2可知，芸香苷標準品和白鳳菜總黃酮提取物的紅外光譜分別在3685.455~3018.177cm-1 左右均出現寬而強的吸收峰，是-OH的伸縮振動峰，顯示存在酚羥基或糖上的羥基，且數目較大；在2914.036cm-1 處出現弱吸收峰，是碳氫鍵的伸縮振動峰，說明飽和碳上的氫較少；在1654.694cm-1 處出現C=O的伸縮振動中強峰，兩者位置和峰型基本一致，說明提取物是黃酮類物質；在1371.88、1362.89 cm-1 處出現羥基的彎曲振動峰；在804.80、810.56cm-1 處出現苯環鄰位氫引起的吸收峰；在1010.07~696.62cm-1 處出現苯環上取代基位置引起的吸收峰，但峰位置不同，說明提取物與芸香苷的羥基取代位置不同；這些顯示，提取物中含有羥基、羰基以及不同位置取代的苯環等官能團，特徵吸收峰基本一致。因此可確定提取物是黃酮類化合物。
B、按照以下方法通過液相色譜分析本實施例白鳳菜總黃酮提取物中的芸香苷的含量:
B1、液相色譜條件的確定
液相色譜條件: 保護柱: Eclipse XDB-C18 AnalyticalGuard Column （4.6×12.5mm，5μm）：ZOR BZX Eclipse XDB-C18（4.6×150mm，5μm）；流速：0.5mL/分鐘；柱溫：35 ℃；檢測波長：368nm、254nm、210nm；進樣體積：10μL；流動相: 0.03% 甲酸水溶液（A），乙腈（B）；梯度洗脫程式如下：0~10分鐘，20%B； 10~12分鐘，20%~24%B；12~20分鐘，24%B；20~25分鐘，24%~30%B； 25~48分鐘，30%B。
B2、對照品溶液的配置
準確稱取芸香苷0.001g，溶解於1mL甲醇中，製成1mg/mL的單一對照品溶液。並用一次性濾膜過濾，裝入小試管中待用。
B3、測定
精密吸取對照品溶液、供試品溶液（實施例1製備的白鳳菜黃酮提取物，配製成濃度為1μg/μL的甲醇溶液），按照液相色譜檢測條件分別進行檢測分析。
對照品溶液的HPLC色譜圖如圖3所示，供試品溶液的HPLC色譜圖如圖4所示。
由圖3可知，芸香苷對照品溶液可在10分鐘內完全分離，芸香苷在本實驗的色譜條件下，色譜基線基本平直，呈現色譜峰無拖尾現象，雜質也無干擾，且出峰較早，其保留時間為2.745分鐘。
由圖4，通過面積歸一法計算可知，白鳳菜提取物中芸香苷的含量為81.29%。
實施例2
本實施例白鳳菜總黃酮提取物按照以下方法製備而成：
（1）提取：取白鳳菜100g，加入20重量倍量的水進行提取，用稀氫氧化鈉溶液調節提取液的pH值為8，得反應液；
（2）酶解：然後向反應液中加入20g複合酶（該複合酶由重量比為0.5：5：1的木瓜蛋白酶、纖維素酶和果膠酶組成）進行酶解，30℃強制迴圈反應4小時，抽濾，收集濾液；
（3）萃取、濃縮：將濾液加入至盛有DM-130大孔樹脂的提取罐中，在30℃、80rpm下攪拌24小時，過濾，以DM-130大孔樹脂的重量計，取吸附後的DM-130大孔樹脂加入10重量倍量的體積濃度為95%的乙醇溶液，然後在30℃、80rpm下攪拌24小時，過濾，即得萃取液，合併萃取液，將萃取液減壓濃縮至白鳳菜總黃酮的濃度為0.5mg/mL，得濃縮液；
（4）分離、純化：將濃縮液6000rpm高速離心8分鐘，取上清液加入裝有大孔樹脂HP-21的層析柱內靜止吸附60分鐘，用體積濃度為80%的乙醇水溶液以3m/小時的速度洗脫，在波長為510nm下測定吸光度，以吸光度值為縱坐標、以洗脫時間為橫坐標作洗脫曲線圖，收集洗脫曲線中吸收峰範圍內的洗脫液，濃縮、冷凍乾燥，即得白鳳菜總黃酮提取物。
經過計算，本實施例白鳳菜總黃酮化合物的提取率為1.82%。
按照實施例1中“B項下”測定本實施例白鳳菜總黃酮提取物中的芸香苷。通過測定分析可知，HPLC圖譜中，本實施例白鳳菜總黃酮提取物中的芸香苷含量為80%。
實施例3
本實施例白鳳菜總黃酮提取物按照以下方法製備而成：
（1）提取：取白鳳菜100g，加入60重量倍量的水進行提取，用稀鹽酸調節提取液的pH值為4，得反應液；
（2）酶解：然後向反應液中加入32g複合酶（該複合酶由重量比為1.5：2：3的木瓜蛋白酶、纖維素酶和果膠酶組成）進行酶解，50℃強制迴圈反應1小時，抽濾，收集濾液；
（3）萃取、濃縮：將濾液加入至盛有ZH-01大孔樹脂的提取罐中，在30℃、150rpm下攪拌6小時，過濾，以ZH-01大孔樹脂的重量計，取吸附後的ZH-01大孔樹脂加入30重量倍量的體積濃度為70%的乙醇溶液，然後在30℃、150rpm下攪拌6小時，過濾，即得萃取液，合併萃取液，將萃取液減壓濃縮至白鳳菜總黃酮的濃度為0.5mg/mL，得濃縮液；
（4）分離、純化：將濃縮液8000rpm高速離心5分鐘，取上清液加入裝有大孔樹脂XAD-3的層析柱內靜止吸附60分鐘，用體積濃度為70%的乙醇水溶液以15m/小時的速度洗脫，在波長為510nm下測定吸光度，以吸光度值為縱坐標、以洗脫時間為橫坐標作洗脫曲線圖，收集洗脫曲線中吸收峰範圍內的洗脫液，濃縮、冷凍乾燥，即得白鳳菜總黃酮提取物。
經過計算，本實施例白鳳菜總黃酮化合物的提取率為1.91%。
按照實施例1中“B項下”測定本實施例白鳳菜總黃酮提取物中的芸香苷。通過測定分析可知，HPLC圖譜中，本實施例白鳳菜總黃酮提取物中的芸香苷含量為85%。
實驗例1 白鳳菜總黃酮提取物對斑馬魚酒精性脂肪肝損傷實驗研究
一、實驗材料
數碼相差倒置顯微鏡（IX51 日本Olympus）；Nikon SMZ18數碼顯微鏡；全自動生化分析儀（BS-220 深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司）；組織包埋機（BMJ-Ⅲ常州中威電子儀器廠）；切片機（RM2235 德國Leica）；病理組織漂烘儀（PHY-Ⅲ常州事郊區中威電子儀器廠）；酶標儀（SUNRISE 瑞士Tecan）；組織勻漿器（PRO200 美國PRO Scientific）；高速冷凍離心機（Centrifuge 5810R 德國 Eppendorf）；反滲透純水系統（RO-200 上海和泰儀器有限公司）；MDA測定試劑盒（碧雲天生物技術研究所）；SOD測定試劑盒（碧雲天生物技術研究所）；無水乙醇（西隴化工股份有限公司）；Oil red O油紅染料（阿拉丁）；PBS緩衝溶液（Thermo Fisher Scientific）；丙二醇（西隴化工股份有限公司）；甘油（西隴化工股份有限公司）；N-苯甲基硫脲（Sigma）；三卡因甲磺酸（Sigma）；多聚甲醛（北京拓英坊科技有限公司）；二甲苯（西隴化工股份有限公司）；蘇木素-伊紅（HE）；以上試劑均為分析純；實驗試劑盒由碧雲天生物技術研究所提供。
二、實驗方法
1、供試藥物製備
按照實施1的方法製備白鳳菜總黃酮提取物作為供試藥物。
2、實驗動物飼養及分組
野生型成年斑馬魚購自漳州市花鳥市場，於28℃恆溫環境中，自動計時器控制實驗室光照14小時，黑暗10小時，連續一個星期每日定時定量投放魚餌料，實驗待用。實驗所採用的斑馬魚幼魚全部來自實驗室飼養野生型TU品系斑馬魚。斑馬魚根據Westerfield 方法養殖：照明14小時，黑暗10小時交替進行，雌雄分開飼養，每天定時給予投放新鮮豐年蟲，實驗前一晚，將TU品系斑馬魚按雌雄1：1分開放入交配缸中，插入隔板；次日早上撥開隔板，斑馬魚交配產卵，收集卵至28℃恆溫培養箱中培養96受精後小時(hours post-fertilization, hpf)，期間定時換水，剔除死卵，實驗待用。
為選擇白鳳菜總黃酮提取物對斑馬魚酒精性脂肪肝損傷修復最大非致死濃度，以便對實驗進行分組，按照斑馬魚慢性毒性實驗常規方法，將斑馬魚成魚60條，隨機分為5組，每組10條，分缸飼養，白鳳菜總黃酮提取物溶解於1.0%酒精，每天一換液，連續一週，以正常魚水飼養斑馬魚作為對照。於實驗開始後每天記錄實驗魚的中毒症狀和死亡條數，及時清理死魚，每組劑量如表1所示。
表1白鳳菜總黃酮提取物對斑馬魚成魚慢性毒性實驗分組 （注：對照組為正常魚水飼養，其他組溶劑分別為1.0%酒精）
按照斑馬魚幼魚急性毒性實驗常規方法，將斑馬魚幼魚隨機分為7組，每組180條，分缸飼養，白鳳菜總黃酮提取物溶解於2.0%酒精，連續32小時，以正常魚水飼養斑馬魚作為對照。於實驗開始後每天記錄實驗魚的中毒症狀和死亡條數，及時清理死魚，每組劑量如表2所示。
斑馬魚成魚、幼魚均分為對照組、模型組、白鳳菜總黃酮提取物高、中、低劑量組共5組。斑馬魚成魚高、中、低劑量組自實驗開始分別以相應藥物濃度，加入1.0%酒精魚水中飼養，期間定時更換，連續28天，對照組以常規魚水飼養。斑馬魚幼魚高、中、低劑量組自實驗開始分別以相應藥物濃度加入2.0%酒精魚水中飼養32小時，對照組以常規魚水飼養。
表2白鳳菜總黃酮提取物對斑馬魚幼魚急性毒性實驗分組 （注：對照組為正常魚水飼養，其他組溶劑分別為2.0%酒精）
3、斑馬魚成魚肝臟指數測定
各實驗組斑馬魚末次換水後，實驗動物禁食12小時。斑馬魚處死前稱體重，自眼球採血，每50只為一組，空白對照組，模型組以及各實驗組各3個，採血後即刻處死，稱重，快速分離實驗所需肝臟組織，將肝臟組織稱重，然後甲醛固定或液氮保存。斑馬魚處死取樣順序如圖5所示。
按照以下公式進行肝臟指數的計算：。
4、斑馬魚血清肝功能生化指標檢測
將血液在4000r/分鐘、4℃下離心10分鐘取上清，採用全自動生化分析儀測定血清天門冬胺酸轉胺酶（AST）、丙胺酸轉胺酶（ALT）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG），上述指標按照試劑盒指示用全自動生化分析儀測定，並根據試劑盒使用說明測定肝臟中抗氧化水準SOD、抗逆境水準MDA。
5、斑馬魚成魚肝臟HE染色
將固定組織樣脫水後（脫水順序：75%乙醇30分鐘→90%乙醇10分鐘→95%乙醇10分鐘→95%乙醇10 分鐘→100%乙醇10分鐘→100%乙醇10分鐘→100%乙醇10 分鐘→二甲苯Ⅰ5分鐘 →二甲苯Ⅱ5分鐘→二甲苯Ⅲ5分鐘）石蠟包埋， 4μm切片， 70℃烤片30分鐘，常規染液蘇木素-伊紅（HE）染色，中性樹膠封片，顯微鏡進行觀察。
6、白鳳菜總黃酮提取物對斑馬魚幼魚肝臟生化指標影響測定
待實驗進行32小時後，隨機挑選對照組、模型組、白鳳菜總黃酮提取物高、中、低濃度組共5組斑馬魚幼魚各50條，採用全自動生化分析儀測定斑馬魚幼魚整體勻漿AST、ALT含量及按照試劑盒說明測定斑馬魚幼魚整體勻漿SOD活力和MDA含量，每個組別重複三次。記錄並分析資料。
7、資料統計學處理
實驗資料以平均數±標準差(±s)形式表示，採用統計學軟體SPSS10.0及單因素方差分析法對資料分析處理，P＜0.05表示顯著性水準差異，P＜0.01表示極顯著性水準差異。
三、實驗結果
1、白鳳菜總黃酮提取物對斑馬魚酒精性脂肪肝損傷修復最大非致死濃度確定
白鳳菜總黃酮提取物對斑馬魚成魚慢性毒性實驗結果和急性毒性實驗結果如表3和表4所示。由表3和表4可知，斑馬魚成魚在一週給藥時間內觀察到，各分組在外觀形態，遊動能力，精神狀態均表現正常，無死亡記錄。斑馬魚幼魚在32小時給藥時間內，白鳳菜總黃酮提取物濃度達到0.08mg/mL的實驗組出現死亡，0.12mg/mL組在4小時開始出現死亡，在32小時死亡率7%，沒有出現大規模死亡。將白鳳菜總黃酮提取物濃度0.08mg/mL、0.04mg/mL、0.02mg/mL作為斑馬魚幼魚實驗組高、中、低劑量組濃度。
表3 、白鳳菜總黃酮提取物對斑馬魚成魚慢性毒性實驗結果 （注：對照組為正常魚水飼養，其他組溶劑分別為1.0%酒精）
表4、白鳳菜總黃酮提取物對斑馬魚成魚急性毒性實驗結果 （注：對照組為正常魚水飼養，其他組溶劑分別為2.0%酒精）
2、白鳳菜總黃酮提取物對斑馬魚成魚體重、肝重和肝指數的影響
白鳳菜總黃酮提取物對斑馬魚成魚體重、肝重和肝指數的影響如表5所示。由表5可知，與正常對照組相比，模型組斑馬魚成魚經過酒精處理後體重下降，肝臟重量升高，肝指數顯著升高，有顯著差異（P＜0.05），說明酒精在一定程度上對斑馬魚具有毒性作用，對斑馬魚肝臟造成損傷。而與模型組相比，經過不同濃度白鳳菜總黃酮提取物組處理後斑馬魚肝重下降，體重和肝指數均升高，中、高劑量組肝指數與模型性相比具有顯著差異（P＜0.05），這顯示白鳳菜總黃酮提取物對改善斑馬魚肝指數的效果較好。
表5、白鳳菜總黃酮提取物對酒精肝斑馬魚體重、肝重和肝指數的影響(±s，n=10) (與模型組相比，P*＜0.05)
3、白鳳菜總黃酮提取物對酒精性脂肪肝斑馬魚成魚血清指標的影響
斑馬魚血清的丙胺酸轉胺酶（ALT）、天門冬胺酸轉胺酶（AST）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）含量如表6所示。
由表6可知，與正常對照組相比，模型組斑馬魚的血清AST、ALT活性有顯著性上升（P＜0.05），TG指標也有明顯增加，達到了極顯著差異（P＜0.01）；說明酒精飼養能明顯促進斑馬魚酒精性脂肪肝的生成。加入不同劑量白鳳菜總黃酮提取物的斑馬魚血清AST、ALT、TC、TG水平均有下降趨勢，其中ALT、AST、TG與模型組相比有顯著差異（P＜0.05），這顯示白鳳菜總黃酮提取物抑制斑馬魚體內血清ALT、AST、TG增加的效果較好。
斑馬魚血清和肝臟SOD活性和MDA水準的含量如表7所示。由表7可知，模型組斑馬魚SOD活性較對照組顯著下降（P＜0.05），MDA含量顯著升高（P＜0.05），說明酒精對斑馬魚肝臟具有毒性作用，使斑馬魚抗氧化能力下降以及魚體內氧化壓力水準出現下降。與模型組相比，白鳳菜總黃酮提取物各劑量組SOD活性均有所升高，其中中高劑量組白鳳菜總黃酮提取物差異達到顯著性水準（P＜0.05）；白鳳菜總黃酮提取物各劑量組均降低了斑馬魚肝臟MDA含量。這顯示，白鳳菜總黃酮提取物對酒精導致斑馬魚酒精性脂肪肝具有一定的防治作用。
表6、白鳳菜總黃酮提取物對酒精肝斑馬魚血清ALT、AST、TC、TG的影響 (±s，n=10) (與酒精模型組比較，P*＜0.05，P**＜0.01)
表7、白鳳菜總黃酮提取物對酒精肝斑馬魚血清及肝組織SOD、MDA影響(±s，n=10) (與酒精模型組比較，P*＜0.05)
4、白鳳菜總黃酮提取物對斑馬魚幼魚肝臟相關生化指標影響測定結果
白鳳菜總黃酮提取物對酒精肝斑馬魚幼魚勻漿ALT、AST、SOD、MDA的影響如表8所示。由表8可知，與對照組相比，模型組斑馬魚幼魚ALT、AST、SOD活性都出現了明顯下降，達到了極顯著性差異（P＜0.01），MDA出現了明顯上升，達到了極顯著性差異（P＜0.01）。ALT和AST變化趨勢不同原因是如下：以往的研究中檢測的是血清中ALT和AST的活性，本實驗中檢測的組織勻漿液中的ALT和AST活性。模型組肝臟損傷後，細胞通透性增強，血清中的ALT和AST活性增強。但從整體動物的角度來講，肝臟損傷後，肝細胞合成ALT和AST能力降低，所以ALT和AST的總活力下降，從不同角度說明了酒精對ALT和AST的影響。
白鳳菜總黃酮提取物各劑量組都能使酒精肝斑馬魚ALT、AST、SOD活性有所提高，說明白鳳菜總黃酮提取物能夠有效保護斑馬魚幼魚肝臟正常的生長發育或修復肝損傷，減輕幼魚肝臟腫大，脂滴堆積症狀，增強肝細胞合成AST和ALT的能力，因此AST和ALT的總活力有所提高。其中高劑量組白鳳菜總黃酮提取物ALT活性提高達到了極顯著水準（P＜0.01），中劑量組白鳳菜總黃酮提取物ALT活性提高達到了顯著水準（P＜0.05）；高劑量組、中劑量組白鳳菜總黃酮提取物AST活性提高達到了顯著性水準（P＜0.05）；各劑量組白鳳菜總黃酮提取物SOD水準有一定提高，MDA水準有一定降低。以上結果顯示，白鳳菜總黃酮提取物對酒精引發斑馬魚幼魚酒精性脂肪肝具有一定的防治作用，減輕斑馬魚體內自我應激的程度。
表8、白鳳菜總黃酮提取物對酒精肝斑馬魚幼魚勻漿ALT、AST、SOD、MDA的影響(±s，n=8) (與模型組比較，P*＜0.05，P**＜0.01)
四、實驗結論
為了更深層次的探究白鳳菜總黃酮提取物是否具有保肝護肝功效，本實驗採用新型斑馬魚酒精性脂肪肝模型，該模型具有樣本量大、實驗技術操作簡單、實驗週期短以及耗費低等優勢。
實驗結果顯示，在斑馬魚成魚實驗中，與模型組對比，白鳳菜總黃酮提取物各劑量組的肝重和肝指數均有一定程度的下降，且能降低模型組斑馬魚血清中AST、ALT、TC、TG含量，減輕斑馬魚體內細胞損傷的情況；提高SOD活性水準，使斑馬魚抗氧化能力增強，下調MDA水準含量，使得斑馬魚體內氧化壓力水準出現下降。斑馬魚幼魚生化指標揭示了白鳳菜各提取物組別能夠提高斑馬魚幼魚整體勻漿的ALT、AST、SOD活性，增強肝細胞合成AST和ALT的能力，降低MDA水準含量，各藥物組中以白鳳菜總黃酮提取物高劑量組（0.08mg/mL）效果最佳，可見本實驗中白鳳菜總黃酮提取物能夠有效對酒精性肝損傷起到保護效果，具有保肝護肝藥效作用，白鳳菜總黃酮提取物為製備治療酒精性肝損傷藥物提供藥效學研究基礎。
顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明所作的舉例，而並非對實施方式的限定。對於所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這裡無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而由此所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處於本發明創造的保護範圍之中。
無。
為了使本發明的內容更容易被清楚的理解，下面根據本發明的具體實施例並結合附圖，對本發明作進一步詳細的說明，其中： 圖1是本發明實驗例1中洗脫液的圖譜； 圖2是本發明實施例1製備的白鳳菜總黃酮提取物的紅外光譜圖； 圖3是本發明實施例1中芸香苷對照品溶液的HPLC色譜圖； 圖4是本發明實施例1製備的白鳳菜總黃酮提取物的HPLC色譜圖； 圖5是本發明實驗例1中斑馬魚處死取樣順序。

Claims (10)

  1. 一種白鳳菜總黃酮提取物，其特徵在於，以重量百分含量計，含有80~85%的芸香苷。
  2. 一種如申請專利範圍第1項所述之白鳳菜總黃酮提取物的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟： （1）提取：取白鳳菜加入提取溶劑進行提取，調節提取液的pH值為4-8，得反應液； （2）酶解：然後向反應液中加入複合酶進行酶解，30-50℃強制迴圈反應1-4小時，抽濾，收集濾液； （3）萃取、濃縮：將濾液用大孔樹脂A進行萃取，合併萃取液，將萃取液濃縮，得濃縮液； （4）分離、純化：將濃縮液離心，取上清液用大孔樹脂B分離純化，在波長為510nm下測定吸光度，收集洗脫液，濃縮、乾燥，即得。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之白鳳菜總黃酮提取物的製備方法，其特徵在於， 所述酶解步驟中，採用由木瓜蛋白酶、纖維素酶和果膠酶組成的複合酶進行酶解； 所述複合酶與所述白鳳菜的重量之比為：1:5~1:3。
  4. 如申請專利範圍第2或3項所述之白鳳菜總黃酮提取物的製備方法，其特徵在於，所述複合酶中，木瓜蛋白酶、纖維素酶和果膠酶三者的重量比為（0.5-1.5）：（2-5）：（1-3）。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之白鳳菜總黃酮提取物的製備方法，其特徵在於，所述複合酶中，木瓜蛋白酶、纖維素酶和果膠酶三者的重量比為1：3：2。
  6. 如申請專利範圍第2-5項之任一項所述之白鳳菜總黃酮提取物的製備方法，其特徵在於， 所述大孔樹脂A選自AB-8、DM-130、HZ841、ZH-00、ZH-01、ZH-02、ZH-03、CAD-40、CAD-45、BS-30中的至少一種； 所述大孔樹脂B選自 D-101、D-140、D-141、XAD-3、XAD-4、HP-20、HP-21、LD-605、LSA-10中的至少一種。
  7. 如申請專利範圍第2-6項之任一項所述之白鳳菜總黃酮提取物的製備方法，其特徵在於， 所述提取步驟中，提取溶劑為水，所述白鳳菜與所述水的重量之比為1：（20-60）。
  8. 如申請專利範圍第2-7項之任一項所述之白鳳菜總黃酮提取物的製備方法，其特徵在於， 所述分離、純化步驟中，洗脫溶劑為體積濃度為70-80%的乙醇水溶液，洗脫速度為3-15m/小時； 所述濃縮液中，白鳳菜總黃酮的濃度為0.5mg/mL。
  9. 一種藥物製劑，其特徵在於，以如申請專利範圍第1項所述之白鳳菜總黃酮提取物、或者如申請專利範圍第2-8項之任一項所述之製備方法製備得到的白鳳菜總黃酮提取物為活性成分，按照常規工藝，加入常規輔料製成臨床上可接受的片劑、膠囊劑、散劑、合劑、丸劑、顆粒劑、糖漿劑、貼膏劑、栓劑、氣霧劑、軟膏劑或注射劑。
  10. 如申請專利範圍第1項所述之白鳳菜總黃酮提取物、如申請專利範圍第2-8項之任一項所述之製備方法製備得到的白鳳菜總黃酮提取物、或者如申請專利範圍第9項所述之藥物製劑在製備治療酒精性脂肪肝的藥品或保健品中的應用。
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