TWI530293B - 一種荷葉萃取物用於製備預防或治療酒精性肝炎病變之醫藥組合物的用途 - Google Patents
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Description
本發明係一種荷葉萃取物用於製備預防或治療酒精性肝炎病變之醫藥組合物的用途,該醫藥組合物包含有效劑量之荷葉萃取物及其醫藥上可接受之載體、佐藥或賦形劑。
酒精性肝病變(Alcohol-related liver disease,ALD)是長期大量飲酒所致的肝臟損害性病變,常見的病理狀況包括:脂肪變性(steatosis)、肝臟發炎(steatohepatitis)和肝臟纖維化(fibrosis)/肝硬化(cirrhosis),酒精性肝病變已證實會增加肝癌(hepatocellular carcinoma,3-10%)的風險。酒精性脂肪肝(alcoholic fatty liver或Alcoholic steatosis,AS)的特徵在於脂質顆粒、三酸甘油脂(triglycerides,TG)和膽固醇(cholesterol,TC)在肝臟的堆積,是肝臟受損的早期徵象,80-90%的飲酒者有酒精性脂肪肝的問題。持續大量攝取酒精會導致肝臟發炎,稱為酒精性肝炎(alcoholic hepatitis或alcoholic steatohepatitis,ASH;10-35%),終致酒精性肝纖維化(liver fibrosis;20-40%)和酒精性肝硬化(cirrhosis;8-20%)。
證據顯示酒精誘發的氧化壓力(oxidative stress),能透過數個機轉造成酒精性肝損傷,包括降低肝臟的抗氧化功能、分泌前炎性反應介質(pro-inflammatory mediators)、加速脂質的過氧化作用和合成過量的脂質。此外,氧化壓力、受到干擾破壞的一氧化氮訊息傳遞(NO signaling)和粒線體功能障礙等,被認為是加速或惡化脂肪變性(steatosis)、啟動其向肝炎和纖維化開展的關鍵性細胞內活動。慢性酒精攝取會誘發氧化壓力,活化免疫路徑和下游訊息,導致前炎性細胞因子(pro-inflammatory cytokine)的分泌。前炎性細胞因子的活性作用,特別是誘導型一氧化氮合酶(inducible NOS,iNOS)、環氧合酶-2(COX-2)、核因子活化B細胞κ輕鏈增強子(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells,NF-κB)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素-6(IL-6),對於酒精性肝損傷的惡化有關鍵性的影響。
脂質在肝臟內的堆積,能透過數個機轉使肝臟承受更嚴重的傷害。過程中最主要的致病因素是脂肪酸的增加和三酸甘油脂的合成,加速來自脂肪組織和腸黏膜乳糜微粒的游離脂肪酸大量湧入肝臟,增加肝臟脂質的生成作用,抑制脂質的分解作用,破壞粒線體和微管,導致極低密度脂蛋白(very-low-density lipoprotein,VLDL)的堆積。研究報告指出,慢性酒精攝取會抑制過氧化物酶體增殖物活化受體-α(peroxisome proliferator activated receptor-α,PPAR-α)和AMP-活化蛋白激酶(腺苷酸活化蛋白激酶,AMP-activate protein kinase,AMPK),導致脂肪酸的氧化作用受到阻斷。酒精攝取對AMPK的抑制作用會增加固醇類轉錄因子-1(sterol response element-binding protein-1,SREBP-1)的活性,增加肝臟內
脂質的合成。AMPK也會影響PPAR-α的活性,下降PPAR-α的活性將導致脂肪酸氧化作用能力的下降。
開發預防或治療酒精性肝炎的有效藥劑,有賴於抑制或阻斷導致肝臟損傷的任何一個步驟。近年的研究報告指出,某些植物和水果成分,能透過強化肝臟的抗氧化作用舒緩酒精性肝臟損傷。證據亦顯示,來自天然植物萃取物之多酚類,具有保護免於酒精誘發之肝臟損傷的作用,例如綠茶中的没食子兒茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG),藍莓中的多酚和柑橘類的類黃酮。
蓮,學名為“Nelumbo nucifera”,是廣泛分佈於亞州的植物。荷葉是蓮的葉片部分。荷葉萃取物超過70%的成分是由酚酸(phenolic acids)和類黃酮(flavonoids)組成,尤其是大量的沒食子酸(gallic acid)(20.32%)、蘆丁(rutin)(6.7%)和槲皮素(quercetin)(4.68%)等多酚(polyphenols)。其餘30%是蛋白質、脂肪、碳水化合物及其他未被偵測到的物質。近年來,沒有研究顯示荷葉萃取物含有任何蛋白質、脂肪或碳水化合物類的生物活性物質,具有降脂的作用。許多證據顯示,沒食子酸、蘆丁和槲皮素具有多重生物特性,包括抗氧化作用、抗炎、抗菌、抑制脂肪堆積、預防體內和體外非酒精性肝炎。
本發明提供一種荷葉萃取物用於製備醫藥組合物的用途,該醫藥組合物包含有效劑量之荷葉萃取物及其活性成分,能預防和治療酒精性肝炎病變。在一較佳實施例中,該荷葉萃取物為水萃物,其食用萃取物之有效劑量為每日總食量乾重之0.5%~2%;於本發明的
一個較佳實施例中,該荷葉萃取物之有效劑量至少2.5克/每人/每天。
於本發明的一個具體實施例中,該醫藥組合物可包括一醫藥上可接受之載劑、佐藥或賦形劑;於本發明的另一具體實施例中,該組合物可用於製備藥品、膳食補充物、食品、保健食品。
本發明之荷葉萃取物(NLE)的主要成分如下:約14.9%酚酸(phenolic acids)、57.6%類黃酮(flavonoids)、4.2%蛋白質、2.1%脂肪和15.8%醣類。NLE中所含有的多酚種類,主要是20.32%沒食子酸(gallic acid)、1.93%原兒茶酸(protocatechuic acid,PCA)、2.59%兒茶素(catechin)、1.32%沒食子兒茶素沒食子酸酯(gallocatechin gallate,GCG)、1.08%咖啡酸(caffeic acid)、1.32%表兒茶素(epicatechin)、6.72%蘆丁(rutin)、4.68%槲皮素(quercetin)和3.56%柚皮素(naringenin);亦即其活性成分係選自酚酸、類黃酮及多酚所組成之群組。於本發明的一個具體實施例中,該荷葉萃取物係將蓮的葉片乾燥磨碎後,經溶解、過濾、離心及冷凍乾燥方式獲得。
於本發明的一個實施例中,該醫藥組合物是用於脊椎動物。於本發明的另一個實施例中,該醫藥組合物是用於小鼠。於另一較佳實施例,該醫藥組合物是用於人類。於本發明的一個實施例中,該醫藥組合物之施用途徑是口服,具有潛力發展為健康食品以預防酒精誘導之酒精性肝炎。
血清中的天門冬胺酸轉胺酶(AST)、丙胺酸轉胺酶(ALT)和鹼性磷酸酶(ALP),常用於檢測酒精所誘發之肝損傷指標。於
本發明的一個具體實施例中,荷葉萃取物降低酒精誘導之肝功能指標,其中該肝功能指標包含丙胺酸轉胺酶、天門冬胺酸轉胺酶和鹼性磷酸酶,保護肝臟免於酒精的傷害,具有護肝的功效。
根據數個研究報告,當NF-κB到達細胞核時,引發快速的基因誘導反應,導致前炎性反應介質的表現,包括細胞因子(cytokine)、趨化因子(chemokines)、脂質介質(lipid mediators)和黏附性分子(adhesion molecules)。活化NF-κB導致大量生產細胞因子,誘發肝臟損傷,顯示TNF-α進一步刺激活化細胞生產大量的活性含氧物(reactive oxygen species,ROS)和活性氮中間物,因氧化壓力造成肝臟受損。因此,若能抑制NF-κB依賴性蛋白的活性,便能進一步負調控TNF-α,預防酒精性肝臟損傷。
於本發明的一個實施例中,本發明之醫藥組合物所含之荷葉萃取物,係藉抑制酒精所誘導之前炎性反應介質的表現,包括趨化因子和細胞因子如:iNOS、COX-2、NF-κB、TNF-α和IL-6(圖1(C)和圖1(D)),降低酒精對肝臟之氧化性損傷和發炎反應。於本發明的一個實施例中,荷葉萃取物預防乙醇誘發之肝臟發炎與增加的抗氧化作用有關,阻斷ROS介導之前炎性反應介質的活化作用。於本發明的一個較佳實施例中,荷葉萃取物之抗發炎特性,對於預防肝臟損傷的療效,相當於標準藥劑水飛薊素(silymarin)。
本發明之實驗結果證明NLE和水飛薊素一樣,能有效降低酒精(EtOH)組小鼠的脂質過氧化作用,預防酒精引發之肝炎(圖2(A))。於本發明的一個實施例中,荷葉萃取物預防或治療酒精性
肝病變,其係藉由回復酒精所抑制之抗氧化酵素的表現,降低酒精所引起之氧化作用而達成。於本發明的一個較佳實施例中,該抗氧化酵素是麩胱甘肽(glutathione,GSH)、麩胱甘肽過氧化酶(glutathione peroxidase,GSH Px)、過氧化氫酶(catalase)與超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)(圖2(B))。
酒精可藉誘導前炎性介質引發脂質在肝臟中的堆積,下降肝臟內脂肪酸的氧化作用,增加肝細胞內脂質的生成。有報告指出,乙醇的攝取會增加小鼠和大鼠肝臟內的脂肪量,與加速三酸甘油脂和膽固醇之生物合成有關。本發明的實例中,小鼠對於酒精攝取之反應與高三酸甘油脂症和高膽固醇症有關,導致三酸甘油脂和膽固醇在肝臟中堆積。於本發明的一個具體實施例中,荷葉萃取物預防或治療酒精性肝炎係藉由降低肝臟和血漿內三酸甘油脂(TG)和總膽固醇(TC)的含量,抑制酒精在肝臟內誘發脂質的堆積而達成(表2)。
根據過去的證據,AMPK和PPAR-α能作為肝臟內脂肪代謝的調節因子,因為AMPK的活性受到酒精對於脂聯素(adiponectin)和TNF-α作用的影響。PPAR-α能活化脂肪酸的氧化作用和運輸,從來防止三酸甘油脂的堆積,改善酵素對氧化壓力的防禦作用,降低酒精餵食之小鼠的細胞凋亡反應(apoptotic response)。PPAR-α配位體(ligands)和AMPK活化劑(activator)能作為治療代謝異常的藥劑。近年來,許多證據顯示,作為生理促效劑(physiological agonists)的PPAR-α促效劑(agonists)和AMPK活化劑,能預防和反轉酒精誘發之肝臟脂肪堆積。因此,能預防或反轉AMPK和PPAR-α訊息的下降或人工提升訊息的新治
療方法,可能具有療效。另一方面,AMPK能夠透過下降肝臟細胞內mRNA和蛋白的量以及下游的脂肪合成基因,調節固醇類轉錄因子-1(sterol response element-binding protein-1,SREBP-1)和固醇類轉錄因子-2(sterol response element-binding protein-2,SREBP-2)的活性。SREBP-1較佳是藉活化參與游離脂肪酸(free fatty acid,FFA)和三酸甘油脂合成作用的基因,調控脂肪生成過程;而SREBP-2主要是透過活化合成和吸收膽固醇所需的基因,控制膽固醇的體內恒定。
根據本發明的實驗結果,荷葉萃取物可抑制肝臟內SREBP-1和SREBP-2的表現和下降SREBP-1和SREBP-2向細胞核的移位,達到預防酒精誘發之酒精性肝病變(圖3(B)和圖3(C))。於本發明的一個具體實施例中,荷葉萃取物預防或治療酒精性肝病變,其係藉由抑制肝臟內SREBP-1及其下游的三酸甘油脂生成酵素,降低三酸甘油脂的合成而達成。於本發明的一個較佳具體實施例中,三酸甘油脂生成酵素是乙醯輔酶A羧化酶(acetyl CoA carboxylase,ACC)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FAS)和甘油-3-磷酸醯基轉移酶(glycerol-3-phosphate acyltransferase,GPAT)(圖3(B))。
於本發明的一個具體實施例中,荷葉萃取物預防或治療酒精性肝病變,其係藉由抑制肝臟內SREBP-2和調控下游之膽固醇生成和吸收訊息蛋白。於本發明的一個較佳具體實施例中,膽固醇生成訊息蛋白是3-羥基-3-甲戊二酸單醯輔酶A(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase,HMG-CoAR),膽固醇吸收訊息蛋白是低密度脂蛋白受體(LDL receptor,LDLR),能清除血液中之膽固醇(圖3(C))。
之前的研究報告顯示,許多植物的多酚萃取物能活化AMPK,主要是促進AMPK的磷酸化作用(C.H.Wu et al.,J.Agric.Food Chem.,2010,58,7075-7081;J.T.Hwang et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,2005,338,694-699)。於本發明的一個實施例中,荷葉萃取物抑制酒精誘導之肝炎病變,其係藉由促進AMPK之磷酸化作用(圖3(A)),而不是AMPK本身的表現。
荷葉萃取物抑制肝臟脂肪的堆積,其係藉活化AMPK和PPAR-α之訊息,從來抑制脂肪生成酵素,下降肝臟內參與三酸甘油脂和膽固醇合成之SREBP-1和SREBP-2的表現,增加肝臟內參與脂肪酸氧化作用和運輸之肉鹼棕櫚酰轉移酶(carnitine palmitoyltransferase-1,CPT-1)和微粒體甘油三酯轉移蛋白(microsomal triglyceride transfer protein,MTP)的表現。對於因應AMP/ATP比值的增加,AMPK能藉負調控參與中間代謝之關鍵酵素的活性,關閉合成代謝途徑和促進分解代謝。長期攝取酒精會抑制MTP的活性,也會造成肝肪在肝臟的堆積。數個研究顯示,MTP抑制劑能降低血液內的脂肪量。但也有證據顯示,10-30%接受MTP抑制劑治療的患者,出現血液內肝臟轉胺酶(transaminase)增加和較多肝脂肪含量的現象。荷葉萃取物能夠抑制酒精誘發之血液轉胺酶的增加,改善肝臟中影響脂肪酸運輸之MTP的量,並且下降血液內的脂肪量。
於本發明之一個具體實施例中,荷葉萃取物預防或治療酒精性肝病變,其係藉由活化過氧化物酶體增殖物活化受體-α(peroxisome proliferator activated receptor-α,PPAR-α)及下游訊息蛋白CPT-1和MTP,
誘發脂肪酸之β-氧化作用和運輸(圖3(D))。於本發明的另一具體實施例中,荷葉萃取物預防或治療酒精性肝病變,其係藉多重機轉緩解肝炎,包括抗氧化作用、抗發炎、抑制肝臟內脂肪的形成和脂肪的堆積,增加脂肪酸的β-氧化作用和運輸(圖4)。
本文中所使用的術語「醫藥上可接受之載劑」意指為了藥物製造過程之需要、便於藥物劑量調配,或不同投藥劑型等需求,根據習知醫藥組合技術將醫藥組合物與醫藥可接受載劑混合,合適的醫藥可接受載劑為此項技術領域中所熟知,其中該載劑可有廣範之形式。某些醫藥可接受載劑之處方可見於由美國醫藥協會及英國醫藥協會(American Pharmaceutical Association and the Pharmaceutical Society of Great Britain)所出版的醫藥賦形劑手冊(The Hand Book of Pharmaceutical Excipients)中。舉例而言,錠劑、膠囊、凝膠、溶液或懸浮液亦可包含下述成分:醫藥可接受賦形劑或載劑,其為無毒性、惰性固體或半固體、稀釋劑、封裝物質(encapsulating material)、凝膠基劑或任何形式之配方佐劑,例如:微晶纖維素(Microcrystalline cellulose)、葡萄糖、脫脂奶粉、澱粉、矽石、無水磷酸氫鈣、磷酸鎂、硬脂酸、硬脂酸鎂,或人工香料等物質。
本文中的用語「一」或「一種」係用以敘述本發明之元件及成分。此術語僅為了敘述方便及給予本發明之基本觀念。此敘述應被理解為包括一種或至少一種,且除非明顯地另有所指,表示單數時亦包括複數。
本文中的用語「或」其意同「及/或」。
圖1說明NLE對於緩解餵食乙醇之C57BL/6小鼠酒精誘發之肝臟損傷的影響。圖1(A)取自小鼠之肝臟外觀和體重變化的情形。圖1(B)呈現肝臟石蠟包封切片經蘇木精-伊紅法(H&E)染色的結果。實驗結果呈現出乙醇誘發的瀰漫性大泡型脂肪泡狀結構(長箭頭)和一些白細胞浸潤(短箭頭)的情形。圖1(C)是使用免疫組織化學染色法觀察小鼠肝臟內iNOS、COX-2、NF-κB、TNF-α和IL-6等蛋白的表現。實驗結果顯示乙醇誘導組肝細胞細胞質內的免疫活性顯著的增加(長箭頭)。圖1(D)利用西方墨點法檢測肝臟組織內前炎性反應介質的表現,包括iNOS、COX2、NF-κB、TNF-α和IL-6的表現。上述的蛋白表現再以密度計分析予以定量,控制組設定為100%。圖中代表性照片的放大倍數為100倍。測定的表現量是三次實驗的平均值±標準誤差,與正常控制組(ND)相比,# p<0.001;與EtOH組相比, a p<0.05,b p<0.01和 c p<0.001。
圖2說明NLE在餵食乙醇之C57BL/6J小鼠內,對於硫代巴比妥酸反應產物(thiobarbituricacid-reactive substances,TBARS)和相關之抗氧化酵素之影響。圖2(A)顯示血清和肝臟內TBARS的量,作為氧化壓力的標記。圖2(B)是肝臟內GSH的量以及抗氧化酵素的活性。實驗數據是每組8個樣本、至少測量3次之平均值±標準誤差,與控制組比較,# p<0.001;與EtOH組比較, c p<0.001。
圖3說明NLE對於餵食乙醇之C57BL/6J小鼠AMPK磷酸化作用、脂質生成作用和脂質氧化作用的影響。取實驗老鼠的肝臟,萃
取肝臟內全部的蛋白質。圖3(A)是Thr-172磷酸化AMPK。圖3(B)是參與三酸甘油脂合成之相關蛋白。圖3(C)是參與膽固醇合成之相關蛋白。圖3(D)是利用西方點墨分析法測得之參與脂質氧化和運輸之相關蛋白。使用密度計分析定量前述的蛋白表現,控制組設定為100%,所得數據是三次實驗的平均值±標準誤差,與正常控制組相較,# p<0.01,## p<0.001;與EtOH組相較,a p<0.05, b p<0.01和 c p<0.001。
圖4係與荷葉萃取物預防酒精性肝炎病變有關的機制。
為了讓本發明之上述和其他目的、特徵、和優點能更明顯易懂,下文特舉較佳實施例,並配合所附圖示,作詳細說明如下:
本實施例經過中山醫學大學動物福祉委員會(Chung Shan Medical University Animal Care Committee,IACUC approval NO.740 and NO.885)核准通過後實施。由國家實驗動物繁殖及研究中心提供體重約20.3±0.21g、八週齡的雄性小鼠(C57BL/6J),飼養於中山醫學大學動物中心。
水飛薊素(silymarin)具有各種藥理活性,包括保肝,抗氧化,抗炎,抗癌,和心臟保護作用,能作為對抗乙醇誘發之肝臟毒性的抗氧化劑和抗脂肪變性劑。在本實施例中,以水飛薊素(200mg/kg)作為正對照組,比較NLE與水飛薊素的效果。
本實施例是以流質乙醇飼料(Lieber-DeCarli ethanol liquid diet)誘發C57BL/6J(B6)小鼠酒精性肝損傷。實驗前,將性成熟的C57BL/6J(B6)小鼠以亂數法分為六組,每組8隻。流質飼料是以Lieber-DeCarli的配方為基礎(由Dyets,Inc.,Bethlehem,PA製備),每毫升提供1大卡的熱量,35%熱量來自脂肪,11%來自碳水化合物,18%來自蛋白質,36%來自乙醇(95%乙醇,購自台中台灣菸酒公賣局)或等熱量的麥芽糖(控制組)。NLE(0.5、1.0和2.0%)和水飛薊素(200mg/kg)是混滲在含乙醇之流質飼料內餵食(表1),全部小鼠根據指定飼料餵食(每隻小鼠每日10-12大卡,任食)。
A組為控制組(ND):Lieber-DeCarli流質正常飼料任食。B組為乙醇誘導組(肝損傷組,EtOH組):Lieber-DeCarli流質乙醇飼料任食(36%熱量源自於乙醇)。C、D和E組為NLE實驗組(NLE組):Lieber-DeCarli流質乙醇飼料+荷葉萃取物(NLE,0.5%、1.0%和2.0%)任食。F組為正對照組(Silymarlin):Lieber-DeCarli流質乙醇飼料+水飛薊素,劑量為200mg/kg,任食。餵食六週後採集血液樣本,然後以心臟穿刺法人道犧牲。
購自台南縣白河農民協會之新鮮荷葉(Nelumbo nucifera Gaertn Leaf,大憨蓮),經過冷凍乾燥和處理後成為荷葉粉末。取200公克之荷葉粉末,加入5000毫升的二次水(超純水),室溫下攪拌2小時至完全溶解,浸置於4℃冷房隔夜,過濾(濾孔尺寸5毫米)、離心(每分鐘1500轉,15分鐘)荷葉汁液,冷凍乾燥所得之荷葉萃取液(-80℃,12
小時)去除水分,細磨成荷葉粉末,該乾燥粉末產物即為荷葉萃取物(NLE),將該葉荷萃取物儲存於-20℃備用。
實施例中,NLE之劑量和人體與高等實驗動物間試驗劑量間的換算,是根據修改後之美國食品藥物管理局藥物評估和研究中心,於2005年公告的實驗初期估算方法設計制(U.S.Department of Health and Human Services,Food and Drug Administration,Center for Drug Evaluation and Research(CDER))判定。換算基礎是設定60公斤健康成人每日攝取基準為500克乾重食物,再進一步換算建議攝取量百分比。例如本實施例中飼料內2.0%的NLE相當於:(2.0% x 500g)/60kg=166mg/kg/day,與正對照組水飛薊素(silymarin,200mg/kg)的劑量相當。根據實驗結果,0.5%(相當於每日2.5g/每人/每天)低劑量的NLE(荷葉萃取物)具備預防酒精性肝炎病變的療效。
根據習知方法(Ho et al.Food Chem.Toxicol.,2010,48,159-168)測量NLE內酚酸(phenolic acid)和類黃酮(flavonoids)總含量的濃度,使用苯酚-硫酸法(phenol-sulfuric acid method)和蛋白商品化試劑(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)分別測量NLE之多醣和蛋白質的含量。
使用Beckman Synchron CX9臨床化學分析儀和Beckman Coulter Co.提供之試劑測量血漿內天門冬胺酸轉胺酶(Aspartate
Transaminase,AST)、丙胺酸轉胺酶(Alanini Transaminase,ALT)、鹼性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)、三酸甘油脂(TG)和總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)的含量。取定量之肝臟組織(0.2克)剪碎,加入萃取溶劑氯仿/甲醇(chloroform/methanol,2:1),使用均質機均質化,肝脂肪之萃取和處理參採C.H.Wu et a.,J.Agric.Food Chem.,2010,58,7075-7081所述方法進行。
脂質氧化過程中產生之丙二醛(Malondialdehyde,MDA)會與硫代巴比妥酸(Thiobarbituric acid,TBA)形成硫代巴比妥酸反應物(Thiobarbituric acid reactive substance,TBARS),可根據MDA的形成量測量脂質過氧化的程度(J.A.Buege and S.D.Aust,Methods Enzymol.,1978,52,302-310.)。使用o-phtal-aldehyde(OPA)測量麩胱甘肽(glutathione,GSH)濃度的程序是參照A.P.Senft et al.所述程序進行(A.P.Senft,T.P.Dalton and H.G.Shertzer,Anal.Biochem.,2000,280,80-86)。
麩胱甘肽過氧化酶(glutathione peroxidase,GSH Px)之活性分析是根據Lawrence和Burk所述之分光光度法測量(R.A.Lawrence and R.F.Burk,Biochem.Biophys.Res.Commun.,1976,71,952-958)。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)之活性分析是根據改良的Marklund和Marklund方法執行(S.Marklund and G.Marklund,Eur.J.Biochem.,1974,47,469-474.)。過氧化氫酶(catalase)分解過氧化氫的活性,是根據修改後之Aebi方法分析(H.Aebi,Methods Enzymol.,1984,
105,121-126.)。
肝臟組織切片置於二甲苯(xylene)中脫蠟,再依序置於99.5%、95%、70%、50%及30%之乙醇內復水,再用3%過氧化氫或5%甲醇內之牛血清蛋白阻卻(block)10-30分鐘。使用磷酸緩衝食鹽水沖洗組織切片,加入一級抗體進行免疫染色觀察誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、環氧合酶-2(cyclooxygenase2,COX-2)、核因子活化B細胞κ輕鏈增強子(transcription factor nuclear factor-κB,NF-κB)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)和白細胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)。再加入未稀釋HRP-共軛聚合物山羊抗-鼠/免IgG多無性系聚合物(undiluted HRP-conjugated polymer goat anti-mouse/rabbit IgG polyclonal polymer)作為二級抗體。沖洗後,再用Meyer氏蘇木精(Meyer's hematoxylin)進行對比染色(counterstain),最後以自來水沖洗。
肝臟樣本在冷蛋白粹取液(iNtRON Biotechology,Cat.No.17081)中均質化。等量的蛋白樣本(60mg)進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,再轉漬至硝酸纖維膜(nitrocellulose membrance,Millipore,Billerica,MA)。在4℃下以一級抗體培養硝酸纖維膜過夜。沖洗三次,再以與辣根過氧化物酶共軛之二級抗體(GE Healthcare,Buckinghamshire,U.K.)培養。最後使用套裝軟體(FUJIFILM Multi Gauge,version 2.2,software)以光密度測定法(densitometry)定蛋白的量。
動物實驗所得數據資料以套裝軟體(SigmaPlot11.0,SigmaStat3.11)進行一元變方分析(One-way analysis of variance,ANOVA,p<0.05)。試算過後,再進行多重比較分析,表示為具統計意義的差異。
表1提供NLE主要成分分析結果,含有約14.9%酚酸(phenolic acids)、57.6%類黃酮(flavonoids)、4.2%蛋白質、2.1%脂肪與15.8%醣類。
利用HPLC/ESI/MS/MS分析荷葉抽出物(NLE)中多酚成分的種類,與標準品比對及LC-ESI/MS/MS的分析結果,顯示NLE中所含有的多酚種類,主要是20.3%沒食子酸(gallic acid)、1.9%原兒茶酸(protocatechuic acid,PCA)、2.6%兒茶素(catechin)、1.3%沒食子兒茶素沒食子酸酯(gallocatechin gallate,GCG)、1.1%咖啡酸(caffeic acid)、
1.3%表兒茶素(epicatechin)、6.7%蘆丁(rutin)、4.7%槲皮素(quercetin)和3.6%柚皮素(naringenin)。由於多酚成分的總量超過70%,可推定此等多酚是NLE的主要功能性成分。有研究報告指出荷葉萃取物含有生物鹼,具有各種療效,但實驗結果並未發現任何具藥理活性的生物鹼。
如圖1(A)所示,EtOH組肝臟組織的整體外觀色澤呈黃褐色,肝臟組織重量和小鼠體重比值也偏高。如圖1(B)所示,ND組之H&E染色(hematoxylin & eosin)肝臟切片呈現正常的肝細胞,保存完好的細胞質、正弦空間(sinusoidal spaces),明顯的核仁和中央靜脈。餵食EtOH六週之小鼠的肝臟切片,呈現明顯的酒精性肝炎(steatohepatitis,ASH)和嗜中性發炎細胞浸潤(neutrophil infiltration)現象。
如表2所示(P<0.05),EtOH組小鼠血漿中天門冬胺酸轉胺酶(AST)、丙胺酸轉胺酶(ALT)和鹼性磷酸酶(ALP)的活性明顯高於控制組,分別是控制組的1.6倍、1.7倍和1.3倍,證明乙醇本身能夠引發肝損傷。餵食乙醇和NLE的小鼠,根據血漿中上述三種酶的活性,未對肝臟造成損傷或是只有極輕微的損傷,顯示NLE對於保護肝臟免於乙醇所造成之肝功能損傷效果顯著,能避免肝臟受到酒精的傷害。再者,正對照組之生物指標也低於EtOH組。尤有甚者,血漿內酶的活性支持組織檢查的結果。這些結果都證明NLE對於保護肝臟免於酒精性肝炎
的效果顯示。
為了調查乙醇對前炎性反應,以免疫組織化學染色法觀察肝臟組織切片內iNOS、COX-2、NF-κB、TNF-α和IL-6的表現。EtOH組在餵食乙醇飼料六週後,出現肝細胞變性,肝細胞之細胞質中大量表現前炎性反應介質。水飛薊素或1.0%、2.0% NLE明顯改善小鼠的肝臟組織,結果與正常餵食之控制組類似(圖1(C)),除TNF-α組別外,餵食0.5% NLE的小鼠呈現輕度的前炎性反應介質。另外,西方墨點法分析的結果和免疫組織評量法的結果類似。NLE是以劑量相關的方式(dose-dependent)負調控該等前炎性蛋白(圖1(D),P<0.05)。1.0%和2.0% NLE能緩解EtOH的毒性效果,下降該等前炎性反應介質至正常量。NLE的上述良性反應亦出現在餵食水飛薊素的組別中,將ASH回復到正常量。實驗結果證明NLE能相當程度的抑制酒精誘導之前炎性反應介質的表現,降低酒精對肝臟的發炎反應。
本實施例測量血清和肝組織內TBARS(thiobarbituric acid reactive substances)的量,檢視NLE對脂質氧化作用的影響。實驗結果如圖2(A)所示,EtOH組小鼠的血清和肝組織的TBARS的量都明顯增加(P<0.001),血清內的量是控制組的2.9倍,肝臟組織內的量是控制組的1.8倍。但是在NLE(0.5、1.0和2.0%)的組別中,血清和肝臟組織內TBARS的量低於EtOH組(P<0.001)。實驗結果證明NLE和水飛薊素能有效降低EtOH組小鼠的脂質過氧化作用,預防酒精引發之肝炎。
酒精誘發的肝損傷會造成氧化壓力(oxidative stress),並且會枯竭內在的抗氧化能力。有鑑於此,本實施例測試NLE對於抗氧化酵素活性的影響(圖2(B))。與控制組比較,EtOH組小鼠的全部肝臟內抗氧化酵素的的活性都明顯下降,包括麩胱甘肽(GSH)、麩胱甘肽過氧化酶(GSH-Px)、過氧化氫酶和超氧化物歧化酶(SOD)(P<0.001)。NLE(0.5、1.0和2.0%)則明顯提升此等酵素的活性(P<0.001)。再者,以水飛薊素治療小鼠時,亦能回復上述酵素的活性(P<0.001)。實驗結果證明NLE能促進肝臟內抗氧化酵素的活性,進而強化其抗氧化效果。
酒精性肝炎之特徵在於過量脂質堆積於肝細胞內(>5%)和發炎,是酒精誘導之病變中最常見的一種。有鑑於此,本實施例探討NLE對肝臟三酸甘油脂(TG)和總膽固醇(TC)的影響。與控制
組相較,EtOH分別提高肝臟三酸甘油脂1.7倍的量,總膽固醇1.4倍的量(表2,P<0.01)。再者,NLE(0.5、1.0和2.0%)明顯降低酒精引起的肝臟三酸甘油脂和總膽固醇的量。此外,EtOH組小鼠之血漿三酸甘油脂的量上升(P<0.05),但是與EtOH組相較,同時餵食乙醇和NLE(0.5-2.0%)之小鼠的血漿三酸甘油脂的量分別下降29.7%、34%和40.7%(表2)。在EtOH組中,血漿內的總膽固醇量上升(P<0.05),但是與EtOH組相較,同時餵食乙醇和0.5%、1.0%和2% NLE之小鼠的血漿總膽固醇量分別下降20.3%、24.9%和29.8%(P<0.01)(表2)。餵食NLE顯然增加HDL-C的量(P<0.05),下降LDL-C/HDL-C的比值。上述實驗結果證明NLE能有效的下降三酸甘油脂和總膽固醇的含量,抑制EtOH在肝臟中誘發脂質的堆積。
本實施例研究NLE是否藉調控動物肝臟內AMPK的活化影響酒精引發之脂質合成作用。如圖3(A)所示,NLE在濃度為0.5%、1.0%和2.0%時刺激AMPK蘇胺酸172的磷化作用。與EtOH組相較,NLE促使the p-AMPK/AMPK的比值增加2.5倍、2.6倍和2.9倍(P<0.001)。NLE和水飛薊素均能明顯增加AMPK之活性至正常控制組的程度(P<0.001)。實驗數據顯示NLE在緩解脂肪酸合成和促進脂肪酸氧化上扮演重要角色,藉調控AMPK的活化保護動物免於酒精性肝炎。
乙醇已經證實會促使三酸甘油脂於肝臟堆積。由於NLE
活化AMPK,本實施例研究NLE是否經由調控參與三酸甘油脂合成之相關蛋白緩解酒精性肝炎,包括固醇類轉錄因子-1(sterol regulatory element-binding protein-1,SREBP-1)、乙醯-輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase,ACC)、脂肪酸合酶(fatty acid synthase,FAS)和甘油-3-磷酸醯基轉移酶(glycerol-3-phosphate acyltransferase,GPAT)。如圖3(B)所示,與EtOH組相較,接受NLE和水飛薊素治療的小鼠蛋白質的表現受到抑制(P<0.001)。再者,濃度2.0% NLE組之SREBP-1、ACC和GPAT的抑制效果最為顯著(P<0.001),測得的量幾乎回復到正常。實驗結果證明NLE能夠經由調控三酸甘油脂的生物合成表現緩解酒精性肝炎。
本實施例分析SREBP-2、LDLR和HMGCoAR的表現,研究NLE是否是經由調控膽固醇的合成緩解ASH。如圖3(C)所示,與控制組相較,EtOH組明顯增加SREBP-2和HMG-CoAR的量(P<0.001),明顯下降LDLR的量(P<0.01)。餵食0.5%、1.0%和2.0%NLE的組別,與EtOH組相較,可觀察到較高的LDLR表現(P<0.05)。餵食濃度1.0%至2.0%NLE的組別,HMG-CoAR蛋白表現的量明顯下降(P<0.001)。然而意外的是NLE明顯的下降SREBP-2的表現至正常量(P<0.001)。實驗結果證明NLE能夠經由調控總膽固醇生物合成的表現,抑制酒精性肝炎。
本實施例研究NLE經由活化過氧化物酶體增殖物活化受體-α(peroxisome proliferator activated receptor-α,PPAR-α)對於肉鹼棕櫚酰
轉移酶1(camitine palmitoyltransferase 1,CPT-1)和微粒體甘油三酯轉移蛋白(microsomal triglyceride transfer protein,MTP)作為脂質降解標示以誘發脂肪酸β-氧化作用和運輸的影響。如圖3(D)所示,增加NLE的濃度能以一種與劑量有關的方式提高CPT-1的表現(P<0.05)。此外,1%和2%NLE能提高PPAR-α和MTP的表現量(P<0.01)。實驗結果證明NLE在調控脂肪酸、抑制肝臟脂質合成和促進肝臟脂質降解都扮演關鍵的角色。
Claims (6)
- 一種組合物用於製備預防或治療酒精性肝炎病變之醫藥組合物的用途,其中該組合物係由荷葉萃取物及其活性成分所組成,該荷葉萃取物為水萃物,該活性成分係選自由酚酸、類黃酮及多酚所組成之群組。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途,其中該荷葉萃取物之有效劑量至少2.5g/每人/每天以上。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途,其中該醫藥組合物降低血液樣本中的肝功能指標,該肝功能指標包含丙胺酸轉胺酶、天門冬胺酸轉胺酶、鹼性磷酸酶。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途,其中該醫藥組合物具有降低脂質過氧化作用、增加抗氧化酵素、抗發炎反應、抑制肝炎病變。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途,其中該醫藥組合物進一步包括一醫藥上可接受之載劑。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途,其中該醫藥組合物用於製備藥品、膳食補充物、食品、保健食品。
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