CN112716988A - 倒心盾翅藤提取物在制备预防和/或治疗糖尿病肾病的药物中的应用 - Google Patents
倒心盾翅藤提取物在制备预防和/或治疗糖尿病肾病的药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了倒心盾翅藤提取物在制备预防和/或治疗糖尿病肾病的药物中的应用。本发明提供的用于预防和/或治疗糖尿病肾病的药物以倒心盾翅藤提取物为活性组分,该药物可以和药学上常用的辅料制成任何剂型。所述的倒心盾翅藤提取物可以减轻肾脏的损伤,抑制高葡萄糖水平下纤维细胞的增殖,具有抗肾脏间质纤维化的作用,并且对正常组织细胞无明显细胞毒性,具有良好的糖尿病肾病治疗的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,具体涉及倒心盾翅藤提取物在制备预防和/
或治疗糖尿病肾病的药物中的应用。
背景技术
糖尿病肾病是糖尿病引起的发生率比较高的慢性严重微血管并发症之一,是导致糖尿病患者发展为终末期肾脏病及患者死亡的一个主要原因。糖尿病肾病的临床症状有蛋白尿,肾小球肥大、滤过率升高、肾脏基底膜增厚、肾小管数目增加等。后期发生肾小管萎缩及间质纤维化,肾间质纤维化是糖尿病肾病进行性发展的重要病理基础,可引起成肾小管萎缩、变性和肾小球硬化,最终导致肾功能衰竭。糖尿病病程10-20年后,约50%患者会发生肾功能衰竭。因此,糖尿病肾病的预防和治疗均应得到足够的重视。
糖尿病患者在未出现糖尿病肾病临床症状之前,只服用降血糖药物。临床用于治疗糖尿病的药物在降低血糖之外,并不具备肾脏功能的改善或保护,有些降糖药物甚至发生肾损伤作用,例如在肾脏功能出现损害时不宜使用双胍类及经肾脏代谢的药物,双胍类降糖药易诱发乳酸中毒,并可加重肾功能衰竭时的代谢性酸中毒症状;经肾代谢的降糖药,可加重肾脏负担,并可造成严重的持续性低血糖。厄贝沙坦是治疗糖尿病肾病的常用药物,其疗效好,但是存在消化不良、胃灼热感、腹泻、骨骼肌疼痛、疲劳和上呼吸道感染、焦虑、神经质、胸痛、咽炎、恶心呕吐、皮疹、心动过速等副作用。
倒心盾翅藤为金虎尾科植物倒心盾翅藤(Aspidopterys obcordataHemsL.var.obcordata),收载于《云南省中药材标准-傣族药》(2005年版)。其干燥藤茎提取物主要用于治疗尿路感染、膀胱炎、尿路结石、风湿骨痛、产后体虚、食欲不振等疾病。目前尚未见该提取物用于糖尿病肾病治疗的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供倒心盾翅藤提取物在制备预防和/或治疗糖尿病肾病的药物中的应用,开辟了倒心盾翅藤的一种新用途,也为糖尿病肾病的治疗提供了一种新的途径。
在第一方面,本发明提供了倒心盾翅藤提取物在制备预防和/或治疗糖尿病肾病的药物中的应用。
根据本发明的一些实施方式,所述倒心盾翅藤提取物包含倒心盾翅藤甾体。
根据本发明的一些实施方式,以质量含量计,所述倒心盾翅藤提取物包含30%以上例如35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%的倒心盾翅藤甾体。
根据本发明的一些实施方式,以质量含量计,所述倒心盾翅藤提取物包含50%以上的倒心盾翅藤甾体。
根据本发明的优选实施方式,以质量含量计,所述倒心盾翅藤提取物包含70%以上的倒心盾翅藤甾体。
根据本发明的进一步优选实施方式,以质量含量计,所述倒心盾翅藤提取物包含85%以上的倒心盾翅藤甾体。
根据本发明的一些实施方式,所述倒心盾翅藤甾体的平均相对分子量为850-950。
根据本发明的优选实施方式,所述倒心盾翅藤甾体的平均相对分子量为870-920。
根据本发明的一些实施方式,所述倒心盾翅藤提取物为倒心盾翅藤的藤茎提取物,优选为倒心盾翅藤的干燥藤茎提取物。
根据本发明的另一些实施方式,所述倒心盾翅藤提取物也可采用其他有效部位的提取物。
根据本发明的一些实施方式,所述倒心盾翅藤提取物是由包括以下步骤的方法制备的:用醇类化合物溶液对倒心盾翅藤优选倒心盾翅藤的藤茎进行提取,以及将所得到的提取液进行分离纯化。
根据本发明的一些实施方式,所述醇类化合物选自C1-C6的醇类化合物。
根据本发明的一些实施方式,所述醇类化合物选自C2-C4的醇类化合物,例如乙醇。
根据本发明的另一些实施方式,所述倒心盾翅藤提取物也可以采用其他有机溶剂提取,具有类似的药效。
根据本发明的一些实施方式,所述倒心盾翅藤提取物是由包括以下步骤的方法制备的:
S1:将倒心盾翅藤的藤茎破碎后,用乙醇溶液进行提取,得到提取液;
S2:将所述提取液浓缩干燥后,通过层析分离、洗脱,得到所述倒心盾翅藤提取物。
根据本发明的一些实施方式,所述乙醇溶液的浓度为70%-100%。
根据本发明的优选实施方式,所述乙醇溶液的浓度为80%-95%。
根据本发明的一些实施方式,所述乙醇溶液的体积用量为所述倒心盾翅藤的藤茎质量用量的2-5倍。
根据本发明的一些实施方式,所述提取的温度为50-70℃,例如60℃。若提取的温度太高则会明显影响提取率。
根据本发明的一些实施方式,所述提取的时间为1-3h。
根据本发明的一些实施方式,所述提取的次数为1-5次。
根据本发明的优选实施方式,所述提取的次数为2-3次。
根据本发明的一些实施方式,所述层析采用大孔树脂层析,例如采用AB-8型大孔树脂层析。
根据本发明的一些实施方式,所述洗脱采用乙醇-水作为洗脱剂。
根据本发明的一些实施方式,所述洗脱采用的乙醇-水洗脱剂的乙醇浓度为50%-95%。
根据本发明的一些具体的实施方式,本发明所涉及的倒心盾翅藤总甾体可以使用但不限于如下方法进行提取分离。取倒心盾翅藤的干燥藤茎,净选、切段,用95%的乙醇提取两次合并提取液,95%的乙醇的体积用量为所述倒心盾翅藤的干燥藤茎质量用量的3倍。提取液经浓缩干燥获得提取物。经AB-8型大孔树脂层析,以乙醇-水为洗脱剂,得到60%乙醇洗脱物,精制后得到倒心盾翅藤总甾体。
本发明所述的药物可以和药学上常用的辅料制成任何剂型。根据本发明的一些实施方式,所述药物的剂型选自口服剂型或注射剂型,例如选自片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、散剂或注射剂等剂型。
根据本发明的一些实施方式,所述药物包括药学上有效量的倒心盾翅藤提取物和药学上可接受的载体。
根据本发明的一些实施方式,所述药物中,倒心盾翅藤提取物的浓度为1.0-30μg/mL,例如可以是1.5μg/mL、3.0μg/mL、4.5μg/mL、6.0μg/mL、7.5μg/mL、9.0μg/mL、12.0μg/mL、15.0μg/mL、20.0μg/mL、25.0μg/mL及其之间的任意值。
本发明所述的倒心盾翅藤提取物还可以与目前已知的其他预防和/或治疗糖尿病肾病的药物制成复方制剂,用于预防和/或治疗糖尿病肾病。
本发明的第二方面提供了一种用于预防和/或治疗糖尿病肾病的药物,所述药物的活性组分为倒心盾翅藤提取物。
根据本发明的一些实施方式,所述倒心盾翅藤提取物为倒心盾翅藤甾体。
本发明中的“倒心盾翅藤甾体”或“倒心盾翅藤总甾体”是指存在于倒心盾翅藤的一类天然化学提取的总甾体,包括植物甾醇、C21甾类、强心苷、甾体皂苷、甾体生物碱等。
本发明提供的倒心盾翅藤提取物在制备预防和/或治疗糖尿病肾病的药物中的应用中,将倒心盾翅藤提取物作为原料药用于制备治疗糖尿病肾病的药物,该倒心盾翅藤提取物包含倒心盾翅藤甾体。本发明通过动物模型及实验证明,倒心盾翅藤甾体降低了尿蛋白、肌酐、尿素氮的含量,可以减轻肾脏的损伤;改善肾小球系膜细胞和基质增殖情况,减少囊壁粘连。倒心盾翅藤甾体还可以抑制高葡萄糖水平下纤维细胞的增殖,具有抗肾脏间质纤维化的作用,并且对正常组织细胞无明显细胞毒性。可见,倒心盾翅藤提取物对于糖尿病肾病有确切的疗效。此外,由于倒心盾翅藤来源广泛,提取物的制备方法简单,不需要贵重仪器设备和试剂。因此,倒心盾翅藤提取物具有良好的糖尿病肾病治疗的应用前景。
附图说明
下面将结合附图对本发明作进一步说明。
图1显示了根据本发明实施例2的不同实验组的HE染色观察肾脏病理变化情况。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是,此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明,并不用于限制本发明。
实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1、倒心盾翅藤总甾体的提取
取倒心盾翅藤的干燥藤茎2kg,净选、切段,用95%的乙醇(用量为倒心盾翅藤的干燥藤茎的3倍体积)提取两次合并提取液,提取的温度为60℃,时间为2h。提取液经浓缩干燥获得247g提取物。经AB-8型大孔树脂层析,以乙醇-水为洗脱剂,得到60%乙醇洗脱物,精制后得到倒心盾翅藤提取物160g。
以雪胆素A为对照品,精密量取对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL,分别置15mL具塞试管中,挥干,放冷,精密加入新配制的香草醛冰醋酸溶液(精密称取香草醛0.5g,加冰醋酸使溶解成10mL,即得)0.2mL、高氯酸0.8mL,摇匀,在70℃水浴中加热15分钟,立即置冰浴中冷却5分钟,取出,精密加入乙酸乙酯4mL,摇匀,以相应试剂为空白,照紫外-可见分光光度法,在546nm波长处测定吸光度,以吸光度为纵坐标、浓度为横坐标绘制标准曲线。取上述精制后得到的倒心盾翅藤提取物约2g,精密称定,置具塞锥形瓶中,加甲醇50mL,超声处理(功率140W,频率42kHz)45分钟,滤过,滤液置100mL量瓶中,用适量甲醇分次洗涤滤器和滤渣,洗液并入同一量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,精密量取供试品溶液0.2mL,置15mL具塞试管中,按照标准品显色方法处理后,测定吸光度,计算出其中倒心盾翅藤总甾体的纯度为75.33%,平均相对分子量为895。
实施例2、倒心盾翅藤甾体对糖尿病肾病模型小鼠的保护作用
60只雄性C57BL/6N小鼠,SPF级,体重18-22g,适应性饲养5天后,随机抽取10只作为空白对照组,给予普通的大小鼠维持饲料进行喂养。余下的50只使用高脂饲料喂养4周后,禁食但不禁水12小时,腔注射链脲佐菌素150mg/kg复制2型糖尿病模型。造模后,取尾尖血使用罗氏血糖仪测定小鼠空腹血糖,超过7.8mmol/L者作为造模成功的判断标准。
造模成功的小鼠随机分为阳性对照组、倒心盾翅藤甾体低、中、高剂量组、模型组。阳性对照组每天灌胃给药二厄贝沙坦0.04g/kg,倒心盾翅藤甾体低、中、高剂量组给药倒心盾翅藤甾体0.25g/kg、0.5g/kg、1g/kg,连续给药14天。给药最后一天,将小鼠单独放入代谢笼内,收集各组小鼠24小时尿液,测定尿液体积。取20μL尿液于96孔板中,每孔加入200μLBCA工作液,37摄氏度避光孵育20min,酶标仪562nm处测定吸光度值,按照标准曲线计算尿液中的蛋白浓度。根据尿液体积计算出每只小鼠24小时尿液中蛋白含量。末次给药1小时后,小鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉,由眼静脉丛取血,4℃静置2小时,3000r/min离心10min获得血清,ELISA法检测血清肌酐和尿素氮的含量。小鼠肾脏分离后4%多聚甲醛浸泡固定48小时,经过脱水、石蜡包埋后切片,HE染色观察肾脏病理变化情况。
实验结果表明,倒心盾翅藤甾体低、中、高剂量组明显降低了糖尿病肾病模型小鼠尿蛋白以及血清中肌酐、尿素氮的水平,见表1。蛋白尿是糖尿病肾病早期的唯一临床症状,因肾脏滤过功能异常导致。肌酐和尿素氮都是通过肾小球的滤过排出体外,当肾脏功能不全时,血中尿素氮和肌酐水平提高,可以反映肾脏损伤的程度。倒心盾翅藤甾体降低了尿蛋白、肌酐、尿素氮的含量,证明其减轻了肾脏的损伤。
表1倒心盾翅藤总甾体对糖尿病肾病模型小鼠尿蛋白、血肌酐和尿素氮的影响
注:与模型组比较,**P<0.01。
对糖尿病肾病模型小鼠肾脏病理切片可以观察到肾小球体积明显增大、系膜细胞增生、基质增宽、囊壁粘连等病理改变。结果如图1所示,与模型组相比较,倒心盾翅藤总甾体高、中、低剂量组肾小球体积减小,肾小球系膜细胞和基质增殖情况有所改善,囊壁粘连较少。
实施例3、倒心盾翅藤总甾体可抑制高糖引起的纤维细胞增殖
肾间质纤维化是糖尿病肾病发展的关键过程,大鼠肾脏成纤维细胞NRK-49F在较高葡萄糖水平下会加速增殖,常被用作体外筛选抗纤维化药物的模型。
NRK-49F细胞使用含10%胎牛血清和1%双抗的EMEM培养基培养。经消化后接种到96孔板,待细胞贴壁后,加入不同浓度的倒心盾翅藤总甾体培养24h。加入CCK-8试剂孵育4h后,于酶标仪中450nm波长处测定吸光度值,以空白对照孔吸光度值作为细胞100%存活,用百分比表示各组细胞相对存活率。各组细胞存活率与空白对照组比较无明显差异,见表2。该结果表明倒心盾翅藤总甾体在1.56~25μg/mL剂量范围内未对NRK-49F细胞产生明显的毒性。
表2倒心盾翅藤总甾体对NRK-49F的影响
NRK-49F细胞5000细胞/孔接种到96孔板,培养24h后,用含葡萄糖60mmol/L无血清EMEM培养基配制盾翅藤甾体母液,按25、12.5、6.25、3.125、1.5625、μg/mL浓度梯度加入96孔板中,模型孔加含葡萄糖60mmol/L无血清EMEM培养基,空白对照孔加无血清EMEM培养基,每个浓度3个复孔。培养24h,使用CCK-8法测定各孔细胞增殖情况。结果见表3,在较高葡萄糖水平下,NRK-49F细胞的增殖明显加快,模型组的细胞数量明显多于空白对照组。倒心盾翅藤总甾体在各个浓度下都能抑制高葡萄糖水平下纤维细胞的增殖,提示其具有抗肾脏间质纤维化的作用。
表3倒心盾翅藤总甾体对葡萄糖引起的NRK-49F细胞增殖的影响
注:与模型组比较,**P<0.01。
应当注意的是,以上所述的实施例仅用于解释本发明,并不对本发明构成任何限制。通过参照典型实施例对本发明的描述,但应当解释为其中所用的词语为描述性和解释性的词汇,而不是限定性的词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明做出修改,以及在不背离本发明的精神和范围的情况下对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例,但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例,相反,本发明可以扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。
Claims (10)
1.倒心盾翅藤提取物在制备预防和/或治疗糖尿病肾病的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述倒心盾翅藤提取物包含倒心盾翅藤甾体。
3.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于,以质量含量计,所述倒心盾翅藤提取物包含30%以上,优选50%以上,更优选70%以上的倒心盾翅藤甾体。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的应用,其特征在于,所述倒心盾翅藤提取物为倒心盾翅藤的藤茎提取物。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的应用,其特征在于,所述倒心盾翅藤提取物是由包括以下步骤的方法制备的:用醇类化合物溶液对倒心盾翅藤优选倒心盾翅藤的藤茎进行提取,以及将所得到的提取液进行分离纯化。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的应用,其特征在于,所述倒心盾翅藤提取物是由包括以下步骤的方法制备的:
S1:将倒心盾翅藤的藤茎破碎,用乙醇溶液进行提取,得到提取液;
S2:将所述提取液浓缩干燥,通过层析分离、洗脱,得到所述倒心盾翅藤提取物。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述乙醇溶液的浓度为70%-100%,优选为80%-95%;和/或
所述提取的温度为50-70℃,时间为1-3h;和/或
所述提取的次数为1-5次,优选为2-3次;和/或
所述层析采用大孔树脂层析;和/或
所述洗脱采用乙醇-水作为洗脱剂。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的应用,其特征在于,所述药物的剂型选自口服剂型或注射剂型,例如选自片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、散剂或注射剂。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的应用,其特征在于,所述药物包括药学上有效量的倒心盾翅藤提取物和药学上可接受的载体。
10.一种用于预防和/或治疗糖尿病肾病的药物,所述药物的活性组分为倒心盾翅藤提取物,优选为倒心盾翅藤甾体。
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PB01 | Publication | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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