CN110201020B - 具有防治发热合并咳嗽和炎症的菊叶活性提取物及其制备方法与应用 - Google Patents

具有防治发热合并咳嗽和炎症的菊叶活性提取物及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有防治感冒的菊叶活性提取物及其制备方法与应用，该活性提取物由菊叶多糖和菊叶酚酸类、黄酮类成分复配而成，实验结果表明该活性提取物具有良好的解热、镇痛、镇咳、祛痰、抗炎作用，能够用于防治感冒引起的发热、咳嗽、生痰、炎症反应等。本发明主要以药用菊花采收过程中产生的废弃物菊叶为原料，制备其活性提取物，开发其新用途，实现变废为宝，可实现菊资源的综合利用和产业的提质增效，具有很好的经济效应、社会效益、生态效益和环境效益。本发明提供的制备方法工艺路线简单，自动化程度高；能较为全面地保留菊叶原料中的多糖类、黄酮类和酚酸类有效成分，可以用于制备防治感冒的中成药或中兽药，具有重要的应用前景。

Description

具有防治发热合并咳嗽和炎症的菊叶活性提取物及其制备方 法与应用
技术领域
本发明涉及一种具有防治感冒的菊叶活性提取物及其制备方法与应用。
背景技术
菊花为菊科植物菊(Chrysanthemum morifolium Ramat.)的干燥头状花序，具有散风清热、平肝明目的功效，用于治疗风热感冒，头痛眩晕，目赤肿痛，眼目昏花，疮痈肿毒等症。菊在我国的药用和食用历史悠久，始载于《神农本草经》，被列为上品，现代研究亦证实其安全性。
菊花是我国传统的大宗中药材，全国干菊花年产量约1.5万吨，在种植和采收过程中，仅使用花序，大量的叶片产量远高于花序，却通常被当作生产垃圾处理废弃，造成巨大的资源浪费和环境污染。据《食疗本草》记载菊叶"主头风，目眩，泪出，去烦热"，研究结果表明，菊根、茎、叶中各类资源性物质及其化学成分分布差异较大，菊的非药用部位各成分总量叶中明显高于根和茎。菊叶中含有丰富的资源性成分，尤其是黄酮和有机酸类成分量甚至高于菊花。可见，菊叶具有扎实的药用、食用实践，是一种宝贵的资源。在当今社会资源愈来愈短缺的严峻形势下，应加强菊叶的资源化价值发现及其利用，充分发挥其资源价值。
感冒是感受触冒风邪或时行病毒，引起肺卫功能失调，出现鼻塞、流涕、喷嚏、头痛、恶寒、发热、全身不适等主要临床表现的一种外感疾病，又名伤风、冒风、重伤风等。感冒为常见多发病，其发病之广、个体重复发病率之高，是其他任何疾病都无法与之相比的，且感冒也是咳嗽、心悸、痹症等多种疾病发生和加重的因素，故须积极防治。中医理论认为六淫病邪风寒暑湿燥火均可为感冒的病因，风为六气之首，百病之长，放风为感冒的主因，因此治则上多采用祛风，如临床上常用桑菊饮來治理风热感冒。
发明内容
发明目的：本发明的目的在于提供一种具有防治感冒的菊叶活性提取物，其具有良好的解热、镇痛、止咳、祛痰、抗炎活性，能够显著修复酵母注射引起的发热、冰醋酸注射引起的疼痛、吸入氨水引起的咳嗽，以及二甲苯和角叉菜胶引起的炎症反应等，有望防治感冒的发生和发展。本发明的另一目的是提供上述菊叶活性提取物的制备方法和应用。
技术方案：为了实现以上目的，本发明所述的具有防治感冒的菊叶活性提取物采取的技术方案为：
一种具有防治感冒的菊叶活性提取物，其特征在于，它由菊叶多糖与菊叶黄酮类、酚酸类成分复配而成。
作为优选方案，所述的具有防治感冒的菊叶活性提取物，菊叶多糖与菊叶黄酮类、酚酸类成分的重量比为1:9-9:1。
作为特别优选方案，所述的具有防治感冒的菊叶活性提取物，菊叶多糖与菊叶黄酮类、酚酸类成分的重量比为4：1。
作为优选方案，所述的具有防治感冒的菊叶活性提取物，它是由下列方法制备得到：
(1)取新鲜菊叶，干燥，粉碎，加入5-20倍量95％乙醇，浸泡，加热煎煮3次，过滤，滤液备用；
(2)取步骤(1)滤渣，加入5-20倍量纯净水，加热煎煮3次，过滤，滤液浓缩至浸膏；
(3)向步骤(2)浸膏中加入80％乙醇，搅拌均匀，过滤，沉淀用水复溶，加入0.1-3％的吸附剂，搅拌均匀，加热0.5-1.0h，过滤，滤液浓缩得菊叶多糖；
(4)取步骤(1)滤液与步骤(3)上清液合并，加入0.1-3％的吸附剂，搅拌均匀，加热0.5-1.0h，过滤，滤液浓缩得菊叶黄酮类、酚酸类成分；
(5)取步骤(3)菊叶多糖与步骤(4)菊叶黄酮类、酚酸类成分按1:9-9:1进行复配，混合均匀，即为菊叶活性提取物。
作为优选方案，以上所述的具有防治感冒的菊叶活性提取物，步骤(1)中菊叶乙醇提取条件为：依次加入10倍、8倍、6倍量95％乙醇，浸泡，加热煎煮3次，分别2h、1.5h、 1.0h，合并煎煮液，过滤，上清液过200目筛，过滤，滤液备用。
作为优选方案，以上所述的具有防治感冒的菊叶活性提取物，步骤(2)中菊叶水提取条件为：取步骤(1)滤渣，依次加入10倍、8倍、6倍量的纯净水，加热煎煮3次，每次依次2h、1.5h、1h，合并煎煮液，过滤，上清液过200目筛，滤液减压浓缩至稠膏状。
作为优选方案，以上所述的具有防治感冒的菊叶活性提取物，步骤(3)和步骤(4)中所用吸附剂为活性炭、硅藻土、皂土、酸性白土、高岭土、富勒土、蒙脱土、氧化铝等中的一种或多种。上述吸附剂具有多孔径结构，可作为吸附剂和助滤剂，通过物理吸附、离子交换等作用起到助滤、脱色、除杂、精制等效果。
作为特别优选方案，以上所述的具有防治感冒的菊叶活性提取物，步骤(3)中所用吸附剂为硅藻土。硅藻土利用自身的筛分作用、深度效应和吸附作用，既能够有助于粘度较大的菊叶多糖溶液方便、快速地进行抽滤，同时可以吸附菊叶多糖类成分中絮状或混悬的不溶物及色素，起到精制、纯化的目的。
作为特别优选方案，以上所述的具有防治感冒的菊叶活性提取物，步骤(3)中菊叶多糖制备条件为：向步骤(2)浓缩液中加入80％乙醇，搅拌均匀，过滤，沉淀用水复溶，加入0.4％的硅藻土，搅拌均匀，75℃加热1.0h，抽滤，滤液浓缩得菊叶多糖。
作为特别优选方案，以上所述的具有防治感冒的菊叶活性提取物，步骤(4)中菊叶黄酮类、酚酸类成分所用吸附剂为1:1的活性炭和硅藻土。高浓度乙醇溶液中的活性炭和硅藻土联合应用可以充分发挥二者的组合优势：活性炭作为非极性吸附剂，在极性溶剂系统中对非极性及小极性成分，如绿叶素、脂肪酸、内酯类等杂质具有良好的吸附作用；硅藻土多用于糖液的助滤和脱色，可有效吸附极性溶液中的微小颗粒，进一步起到精制和纯化作用。
作为特别优选方案，以上所述的具有防治感冒的菊叶活性提取物，步骤(4)中菊叶黄酮类、酚酸类成分的制备条件为：取步骤(1)滤液与步骤(3)上清液合并，加入0.8％的活性炭和0.8％的硅藻土，搅拌均匀，75℃加热1.0h，抽滤，滤液浓缩得菊叶黄酮类、酚酸类成分。
作为优选方案，本发明所述的具有防治感冒的菊叶活性提取物的制备方法，其包括以下步骤：
(1)取新鲜菊叶，干燥，粉碎，依次加入10倍、8倍、6倍量95％乙醇，浸泡，加热煎煮3次，分别2h、1.5h、1.0h，合并煎煮液，过滤，上清液过200目筛，过滤，滤液备用；
(2)取步骤(1)煎煮后滤渣，依次加入10倍、8倍、6倍量纯净水，加热煎煮3次，分别2h、1.5h、1.0h，合并煎煮液，过滤，上清液过200目筛，滤液减压浓缩至稠膏状；
(3)向步骤(2)浓缩液中加入80％乙醇，搅拌均匀，过滤，取沉淀用水复溶，加入0.4％的硅藻土，搅拌均匀，75℃加热1.0h，抽滤，滤液浓缩得菊叶多糖；
(4)取步骤(1)滤液与步骤(3)上清液合并，加入0.8％的活性炭和0.8％的硅藻土，搅拌均匀，75℃加热1.0h，抽滤，滤液浓缩得菊叶黄酮类、酚酸类成分；
(5)取步骤(3)菊叶多糖与步骤(4)菊叶黄酮类、酚酸类成分按1:9-9:1的重量比进行复配，混合均匀，即为菊叶活性提取物。
作为优选方案，以上所述的具有防治感冒的菊叶活性提取物制备方法，它由质量百分含量为80％的菊叶多糖，质量百分含量为20％的菊叶黄酮类、酚酸类成分复配组成。
本发明所述的具有防治感冒的菊叶活性提取物在制备具有解热镇痛作用的中成药或中兽药中的应用。
本发明所述的具有防治感冒的菊叶活性提取物在制备镇咳祛痰作用的中成药或中兽药中的应用。
本发明所述的具有防治感冒的菊叶活性提取物在制备抗炎活性的中成药或中兽药中的应用。
本发明所述的具有防治感冒的菊叶活性提取物在制备防治发热合并咳嗽和炎症的中成药或中兽药中的应用。
有益效果：本发明提供的具有防治感冒的菊叶活性提取物在菊叶传统应用基础上进行新的工艺制备及其在中成药和中兽药中的开发，和现有技术相比具有以下优点：
(1)本发明主要以药用菊花采收过程中产生的废弃物菊叶为原料，制备其活性提取物，开发其新用途，实现变废为宝，可延伸菊产业链，可实现菊资源的综合利用和产业的提质增效，具有很好的经济效应、社会效益、生态效益和环境效益。
(2)本发明提供的具有防治感冒的菊叶活性提取物，依据中药基础理论和现代药理研究成果，通过大量实验筛选得到，由菊叶多糖和菊叶黄酮类、酚酸类成分复配制成。在解热镇痛实验中，各菊叶活性提取物不影响小鼠的基础体温，但能够降低酵母所致体温升高；同时有效降低醋酸注射所致小鼠扭体次数，并延长扭体潜伏期。在止咳祛痰实验中，各实施例均能够降低氨水刺激所致小鼠咳嗽次数，同时延长咳嗽潜伏期，并增加小鼠气管中酚红的分泌量。在二甲苯和角叉菜胶所致小鼠耳肿胀和足肿胀炎症模型中，各菊叶活性提取物组能够有效减少耳片和足趾厚度、重量、肿胀率，同时减少炎性小鼠血清中NO和PGE2含量，表现为显著的抗炎活性，有望防治感冒的发生和发展。
(3)本发明提供的制备方法工艺路线简单、便捷，较少使用有机试剂，环境友好，且自动化程度高；同时，能较为全面地保留菊叶原料中的多糖类、黄酮类、酚酸类有效成分，且活性成分纯度较高，无毒副作用，可以用于制备防治感冒的中成药或中兽药，具有重要的应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
本发明所述的药材和乙醇用量均指得是重量体积比。乙醇均指的是体积浓度。
实施例1
具有防治感冒的菊叶活性提取物的制备方法，其包括以下步骤：
(1)取新鲜菊叶1Kg，干燥，粉碎，加入10倍量95％乙醇，浸泡，加热煎煮3次，每次2h，合并煎煮液，过滤，上清液过200目筛，过滤，滤液备用；
(2)取步骤(1)滤渣，加入10倍量纯净水，加热煎煮3次，每次2h，合并煎煮液，过滤，上清液过200目筛，滤液减压浓缩至稠膏状浓缩物；
(3)向步骤(2)浓缩物中加入80％乙醇，搅拌均匀，过滤，沉淀用水复溶，加入0.1％的蒙脱土，搅拌均匀，60℃加热0.5h，抽滤，滤液浓缩得菊叶多糖；
(4)取步骤(1)滤液与步骤(3)上清液合并，加入0.2％的活性炭，搅拌均匀，60℃加热0.5h，抽滤，滤液浓缩得菊叶黄酮类、酚酸类成分；
(5)取步骤(3)菊叶多糖与步骤(4)菊叶黄酮类、酚酸类成分按1:9进行复配，混合均匀，即为菊叶活性提取物。
实施例2
具有防治感冒的菊叶活性提取物的制备方法，其包括以下步骤：
(1)取新鲜菊叶1Kg，干燥，粉碎，依次加入20倍、15倍、10倍量95％乙醇，浸泡，加热煎煮3次，每次2h，合并煎煮液，过滤，上清液过200目筛，过滤，滤液备用；
(2)取步骤(1)滤渣，依次加入20倍、15倍、10倍量纯净水，加热煎煮3次，每次 2h，合并煎煮液，过滤，上清液过200目筛，滤液减压浓缩至稠膏状浓缩物；
(3)向步骤(2)浓缩物中加入80％乙醇，搅拌均匀，过滤，沉淀用水复溶，加入0.2％的皂土，搅拌均匀，65℃加热0.5h，抽滤，滤液浓缩得菊叶多糖；
(4)取步骤(1)滤液与步骤(3)上清液合并，加入0.4％的活性炭，搅拌均匀，65℃加热0.5h，抽滤，滤液浓缩得菊叶黄酮类、酚酸类成分；
(5)取步骤(3)菊叶多糖与步骤(4)菊叶黄酮类、酚酸类成分按1:4进行复配，混合均匀，即为菊叶活性提取物。
实施例3
具有防治感冒的菊叶活性提取物的制备方法，其包括以下步骤：
(1)取新鲜菊叶1Kg，干燥，粉碎，依次加入10倍、8倍、6倍量95％乙醇，浸泡，加热煎煮3次，每次2h，合并煎煮液，过滤，上清液过200目筛，过滤，滤液备用；
(2)取步骤(1)滤渣，依次加入10倍、8倍、6倍量纯净水，加热煎煮3次，每次2h，合并煎煮液，过滤，上清液过200目筛，滤液减压浓缩至稠膏状浓缩物；
(3)向步骤(2)浓缩物中加入80％乙醇，搅拌均匀，过滤，沉淀用水复溶，加入0.3％的高岭土，搅拌均匀，70℃加热1.0h，抽滤，滤液浓缩得菊叶多糖；
(4)取步骤(1)滤液与步骤(3)上清液合并，加入0.6％的活性炭，搅拌均匀，70℃加热1.0h，抽滤，滤液浓缩得菊叶黄酮类、酚酸类成分；
(5)取步骤(3)菊叶多糖与步骤(4)菊叶黄酮类、酚酸类成分按1:1进行复配，混合均匀，即为菊叶活性提取物。
实施例4
具有防治感冒的菊叶活性提取物的制备方法，其包括以下步骤：
(1)取新鲜菊叶1Kg，干燥，粉碎，依次加入菊叶重量10倍、8倍、6倍体积量的95％乙醇，浸泡，加热煎煮3次，分别2h、1.5h、1.0h，合并煎煮液，过滤，上清液过200目筛，过滤，滤液备用；
(2)取步骤(1)煎煮后的滤渣，依次加入10倍、8倍、6倍量纯净水，加热煎煮3次，分别2h、1.5h、1.0h，合并煎煮液，过滤，上清液过200目筛，滤液减压浓缩至稠膏状浓缩物；
(3)向步骤(2)浓缩物中加入80％乙醇，搅拌均匀，过滤，沉淀用水复溶，加入0.4％的硅藻土，搅拌均匀，75℃加热1.0h，抽滤，滤液浓缩得菊叶多糖；
(4)取步骤(1)滤液与步骤(3)上清液合并，加入0.8％的活性炭和0.8％的硅藻土，搅拌均匀，75℃加热1.0h，过滤，滤液浓缩得菊叶黄酮类、酚酸类成分；
(5)取步骤(3)菊叶多糖与步骤(4)菊叶黄酮类、酚酸类成分按4:1进行复配，混合均匀，即为菊叶活性提取物。
实施例5
具有防治感冒的菊叶活性提取物的制备方法，其包括以下步骤：
(1)取新鲜菊叶1Kg，干燥，粉碎，依次加入10倍、8倍、6倍量95％乙醇，浸泡，加热煎煮3次，每次1.0h，合并煎煮液，过滤，上清液过200目筛，过滤，滤液备用；
(2)取步骤(1)滤渣，依次加入10倍、8倍、6倍量纯净水，加热煎煮3次，每次1.0 h，合并煎煮液，过滤，上清液过200目筛，滤液减压浓缩至稠膏状浓缩物；
(3)向步骤(2)浓缩物中加入80％乙醇，搅拌均匀，过滤，沉淀用水复溶，加入0.5％的酸性白土，搅拌均匀，80℃加热1.0h，过滤，滤液浓缩得菊叶多糖；
(4)取步骤(1)滤液与步骤(3)上清液合并，加入1.0％的活性炭和1.0％的酸性白土，搅拌均匀，80℃加热1.0h，过滤，滤液浓缩得菊叶黄酮类、酚酸类成分；
(5)取步骤(3)菊叶多糖与步骤(4)菊叶黄酮类、酚酸类成分按9:1进行复配，混合均匀，即为菊叶活性提取物。
实施例6解热镇痛药效实验
1、药品及试剂
羧甲基纤维素钠(CMC-Na，纯度≥99％)、冰醋酸购自百灵威生物科技有限公司，干酵母粉由湖北安琪酵母股份有限公司生产；临用前CMC-Na以纯水制成0.5％溶液，酵母粉以纯水制成20％的混悬液，冰醋酸以纯水配制0.6％的水溶液；菊叶活性提取物临用前以0.5％的 CMC-Na制成混悬液。
2、实验动物
ICR小鼠，雄性，体重21.0±1.0g，7w，购于上海杰思捷实验动物有限公司，SPF级，实验动物合格证编号：NO.2010002611759，动物生产许可证号：SCXK(沪)2013-0006；屏障饲养环境系统，温度20～25℃，相对湿度40～70％，换气次数10～20次/h，每日12h/12h 交替照明；实验期间每日消毒地面、台面和墙面，消毒剂为新洁而灭、来苏尔、乙醇交替使用。
3、实验方法
3.1动物分组及给药剂量
适应饲养一周后，随机分为空白组、模型组、各给药组。给药组灌胃本发明实施例1～5 制备得到的菊叶活性提取物(1.3g/Kg体重)，空白对照组和模型组灌胃同体积CMC-Na溶液。
3.2操作步骤
3.2.1解热实验
按照上述分组及给药方法进行预防给药，每天灌胃给药一次，连续一周。末次给药1h 后，先测每只小鼠基础体温，除空白组外其他各组小鼠背部皮下注射20％酵母悬液10ml/kg， 4h后分别测各组小鼠肛温。
3.2.2镇痛实验
按照上述分组及给药方法进行预防给药，每天灌胃给药一次，连续一周。末次给药1h 后，除空白组外其他各组小鼠按0.1ml/10g体重腹腔注射0.6％冰醋酸，观察并记录30min内小鼠扭体次数，按下式计算镇痛抑制率。
镇痛抑制率＝(模型组扭体次数-给药组扭体次数)/模型组扭体次数×100％
4、实验结果
从表1可以看出：各组小鼠基础体温无明显差异，表明各给药组并不影响小鼠的基础体温；酵母粉造模4h后模型组小鼠体温显著升高1.27℃，各给药组小鼠均小幅度升高但均不高于0.7℃，表明各实施例给药组小鼠的体温均得到有效的降低，表现为解热作用。冰醋酸腹腔注射后，小鼠因疼痛发生扭体，各给药组小鼠扭体潜伏期增长、扭体次数减少、扭体抑制率增加，表现为显著的镇痛作用。其中，以实施例4的解热镇痛效果最为明显。
表1解热镇痛实验数据
Figure BDA0002118216950000071
Figure BDA0002118216950000081
与空白对照组比较，*p<0.05，**p<0.01。与模型组比较，#p<0.05，##p<0.01。
实施例7镇咳祛痰药效实验
1、样品与试剂
浓氨水(25％～28％)、碳酸氢钠、酚红购自国药集团化学试剂有限公司，双圈牌定性化学分析滤纸购自杭州沃华滤纸有限公司；碳酸氢钠临用前纯净水配制成5％的水溶液，酚红以生理盐水配制为0.5％的溶液，滤纸临用前裁剪为2×2cm2大小的滤纸片；菊茎叶多成分颗粒剂1-5临用前均以0.5％的羧甲基纤维素钠制成混悬液。
2、实验动物
同实施例6。
3、实验方法
3.1动物分组及给药剂量
动物分组及给药剂量同实施例6。
3.2操作步骤
3.2.1镇咳实验
按照上述分组及给药方法进行预防给药，每天灌胃给药一次，连续一周。末次给药1h 后，除空白组外将小鼠逐个放入玻璃罩内，再将0.5ml浓氨水滴入玻璃罩内的滤纸片(2×2 cm2)，1分钟后取出小鼠，观察并记录各组小鼠的咳嗽潜伏期和2min内咳嗽次数(典型咳嗽为小鼠腹肌收缩，同时张大嘴，有咳声)。
3.2.2祛痰实验
按照上述分组及给药方法进行预防给药，每天灌胃给药一次，连续一周。末次给药1h 后，除空白组外每只小鼠皮下注射0.5％酚红溶液0.25ml/10g，30min后脱颈椎处死，仰位固定，解剖分离出自甲状软骨下至气管分支处的一段气管，放入离心试管中，用5％碳酸氢钠溶液2ml浸泡。于高速离心机上以3000rpm的转速离心分离10min，取上清液于紫外- 可见分光光度计上测546nm处的吸光度值，通过酚红浓度标准曲线计算各样品溶液酚红含量(μg/ml)。
4、实验结果
由表2可知：给予氨水刺激后模型组小鼠咳嗽，各实施例给药组均能显著减少咳嗽次数，同时能够不同程度地延长小鼠咳嗽的潜伏期，表现为显著的镇咳作用；腹腔注射酚红后，在其支气管能够检测到酚红的分泌，各给药组酚红分泌量均有不同程度的增加，表现为祛痰活性。综合考虑，实施例4的镇咳和祛痰作用较为显著。
表2镇咳祛痰实验数据
组别 2min咳嗽次数(次) 咳嗽潜伏期(s) 酚红排泌量(μg/ml)
空白对照组 0.00±0.00 -- --
模型组 12.30±1.83<sup>**</sup> 10.50±1.05** 50.4±0.82
实施例1 6.80±0.55<sup>##</sup> 13.80±1.08 65.2±0.55
实施例2 7.60±0.65<sup>##</sup> 12.70±1.13 73.2±0.76<sup>#</sup>
实施例3 8.20±0.55<sup>#</sup> 14.70±1.26<sup>#</sup> 78.7±0.51<sup>#</sup>
实施例4 6.40±0.34<sup>##</sup> 15.40±1.32<sup>#</sup> 89.4±0.52<sup>#</sup>
实施例5 8.90±0.15<sup>#</sup> 13.80±1.17 76.5±0.41<sup>#</sup>
与空白对照组比较，*p<0.05，**p<0.01。与模型组比较，#p<0.05，##p<0.01。
实施例8抗炎药效实验
1、样品
二甲苯、角叉菜胶购自国药集团化学试剂有限公司，实施例菊叶活性提取物1-5临用前均以0.5％的羧甲基纤维素钠制成混悬液。一氧化氮试剂盒(NO)、前列腺素试剂盒(PGE2) 购自南京建成科技有限公司。
2、实验动物
ICR小鼠，雄性，体重21.0±1.0g，7w，购于上海杰思捷实验动物有限公司，SPF级，实验动物合格证编号：NO.2010002608850，动物生产许可证号：SCXK(沪)2013-0006。饲养环境同实施例6。
3、实验方法
3.1动物分组及给药剂量
动物分组及给药剂量同实施例6。
3.2操作步骤
3.2.1二甲苯致耳肿胀实验
按照上述分组及给药方法进行预防给药，每天灌胃给药一次，连续一周。末次给药1h 后，除空白组外将50μl二甲苯均匀涂抹于小鼠右耳两面使其致炎，左耳为对照，1.5h后麻醉小鼠，沿耳廓基线剪下两只耳朵，在同样的位置进行打孔(8mm直径打孔器)，立即电子天平称重，即时记录两耳片重量，以两耳重量差异为耳肿胀值。
小鼠耳肿胀值＝右耳片质量-左耳片质量
小鼠耳肿胀率(％)＝(右耳片质量-左耳片质量)/左耳片质量×100％。
剪完双耳后，立即将所有小鼠进行摘眼球取血，血液静置30min后于高速离心机上以3 000rpm的转速离心分离10min，取血清，测定血清NO和PGE2含量。
3.2.2角叉菜胶致足肿胀实验
按照上述分组及给药方法进行预防给药，每天灌胃给药一次，连续一周。末次给药1h 后，除空白组外各组动物小鼠右脚掌心皮下注射1％角叉菜胶50μl致炎，左脚不注射以作对照，静待4h，麻醉小鼠后，沿踝关节处剪下双脚，用游标卡尺测量双脚厚度并立刻称重，即时记录数据，计算小鼠足肿胀值及足肿胀率。
小鼠足肿胀值＝右足质量-左足质量
小鼠足肿胀率(％)＝(右足质量-左足质量)/左足质量×100％。
剪完双足后，立即将所有小鼠进行摘眼球取血，血液静置30min后于高速离心机上以3 000rpm的转速离心分离10min，取血清，测定血清NO和PGE2含量。
4、实验结果
由表3可知：与空白组相比，二甲苯导致模型组小鼠耳片肿胀，厚度、质量及肿胀率显著增加，各实施例的菊叶活性提取物均能不同程度地降低耳片厚度、重量和肿胀率；同时，角叉菜胶导致小鼠足趾明显肿胀，表现为足趾厚度、重量和肿胀率的显著增加，各实施例组均能不同程度地改善足趾肿胀的厚度、重量和肿胀率，表现为两种炎症肿胀的显著改善作用。
表3小鼠耳肿胀及足肿胀实验数据
Figure BDA0002118216950000101
与空白对照组比较，*p<0.05，**p<0.01。与模型组比较，#p<0.05，##p<0.01。
进一步对上述两种炎症模型的小鼠进行血清生化分析，表4结果可知：二甲苯及角叉菜胶均能导致小鼠血清中NO和PGE2含量增加，各菊叶活性提取物实施例给药组均能不同程度地降低血清中上述两种炎症因子的含量，表现为抗炎活性，其中以实施例4综合抗炎效果最佳。
表4小鼠耳肿胀及足肿胀血清生化实验数据
Figure BDA0002118216950000111
与空白对照组比较，*p<0.05，**p<0.01。与模型组比较，#p<0.05，##p<0.01。
以上实验结果表明，本发明提供的菊叶活性提取物可以防治感冒引起的发热、疼痛、咳嗽、生痰等症状，具有良好的解热镇痛、止咳祛痰及抗炎活性，可应用于防治感冒的中成药和中兽药的开发。
在解热镇痛实验中，各菊叶活性提取物不影响小鼠的基础体温，但能够降低酵母所致体温升高；同时有效降低醋酸注射所致小鼠扭体次数，并延长扭体潜伏期。在止咳祛痰实验中，各实施例均能够降低氨水刺激所致小鼠咳嗽次数，同时延长咳嗽潜伏期，并增加小鼠气管中酚红的分泌量。在二甲苯和角叉菜胶所致小鼠耳肿胀和足肿胀炎症模型中，各菊叶活性提取物组能够有效减少耳片和足趾厚度、重量、肿胀率，同时减少炎性小鼠血清中NO和PGE2含量，表现为显著的抗炎活性。
本发明提供的制备方法工艺路线简单、便捷，较少使用有机试剂，环境友好，且自动化程度高；能较为全面地保留菊叶原料中的多糖类、黄酮类、酚酸类有效成分，且活性成分纯度较高，无毒副作用，可以用于制备防治感冒的中成药或中兽药，具有重要的应用前景。通过不同配比的菊叶活性提取物防治感冒活性比较可知，实施例4防治感冒活性最强，即菊叶多糖80％、菊叶黄酮类、酚酸类成分20％复配而成的菊叶活性提取物解热镇痛、止咳祛痰和抗炎综合活性最佳。
并且本发明实施例4的活性提取物与相同剂量的菊叶多糖和菊叶黄酮类、酚酸类成分的药效学相比，具有显著性差异(p<0.01)，也表明本发明采用菊叶多糖和菊茎黄酮类、酚酸类成分的适当配比显示出了很好的协同增效的作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种菊叶活性提取物在制备防治发热合并咳嗽和炎症的药物中的应用，菊叶活性提取物是由重量比为4:1的菊叶多糖和菊叶黄酮类、酚酸类成分组成；
所述的菊叶多糖，菊叶黄酮类、酚酸类成分是通过以下方法制备得到的：
（1）取新鲜菊叶1 Kg，干燥，粉碎，依次加入菊叶重量10倍、8倍、6倍体积量的95%乙醇，浸泡，加热煎煮3次，分别2 h、1.5 h、1.0 h，合并煎煮液，过滤，上清液过200目筛，过滤，滤液备用；
（2）取步骤（1）煎煮后的滤渣，依次加入10倍、8倍、6倍量纯净水，加热煎煮3次，分别2h、1.5 h、1.0 h，合并煎煮液，过滤，上清液过200目筛，滤液减压浓缩至稠膏状浓缩物；
（3）向步骤（2）浓缩物中加入80%乙醇，搅拌均匀，过滤，沉淀用水复溶，加入0.4%的硅藻土，搅拌均匀，75 °C加热1.0 h，抽滤，滤液浓缩得菊叶多糖；
（4）取步骤（1）滤液与步骤（3）上清液合并，加入0. 8%的活性炭和0.8%的硅藻土，搅拌均匀，75 °C加热1.0 h，过滤，滤液浓缩得菊叶黄酮类、酚酸类成分。
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