JP6893364B2

JP6893364B2 - 牛樟芝抗がん活性組成物の製造方法

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Publication number: JP6893364B2
Application number: JP2019112684A
Authority: JP
Inventors: 進忠林; 秋萍駱; 韻▲よ▼ 陳; 宗賢 ▲頼▼; 力川許
Original assignee: 台灣利得生物科技股▲ふん▼有限公司
Priority date: 2016-06-23
Filing date: 2019-06-18
Publication date: 2021-06-23
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Description

本発明は、牛樟芝活性組成物の製造方法に関し、特に、抗がん剤の補助効果を有する牛樟芝抗がん活性組成物の製造方法に関する。

がんは、現在世界において致命率が最も高い疾病の一つである。世界保健機関の統計資料によると、２０１２年の世界のがん発生数は、１４０９万人であり、がんによる死亡数は、８２０万人である。人口構成が次第に老化するにつれて、がんの発生率も次第に増加する。２０３０年にがんの発生数は２１２６万人、死亡数は１２６６万人に達すると推計され、世界のがんに対する負担は絶えずに増加しつつある。

現在、がんの治療として主に手術、放射線療法及び化学療法が採用されている。しかしながら、従来のがんの治療方法は、多くの欠陥が存在する。その一つとして、早期の患者だけが手術治療を行うことができるが、手術の成功や失敗に関わらず、転移をもたらす可能性がある。化学療法は、全身的な治療を行い、多くの実態腫瘍の負荷を高効率に縮小することができるが、快速に増殖する細胞を消滅する化学療法に用いられている抗腫瘍薬は、すべて理想的な選択性作用が欠けているので、がん細胞を抑制すると同時に、しばしば骨髄、胃腸と生殖細胞及び中枢神経系のような生体の増殖が活発な細胞に対してある程度の影響を及ぼす。ある抗腫瘍薬は、肝臓、腎臓、心臓の機能及び内分泌系に影響を及ぼす。特に、腫瘍の薬剤抵抗性は、化学治療における最大な障害とみなされている。化学治療の副作用の発生は、がん患者の体に不快症状を引き起こし、さらにはがん患者が全治療過程を持続して完成できるか否かに影響される。よって、化学治療を進行すると同時に、補助治療と組み合わせることで、がん患者が化学治療を進行すると同時に、化学治療による副作用を軽減かつ改善することができる。

牛樟芝（Antrodia cinnamomea,別名Antrodia camphorataまたはTaiwanofungus camphoratus）は、台湾固有の薬用の真菌類である。菌学上の分類では、ヒダナシタケ目（Aphyllophorales）、サルノコシカケ科（Polyporaceae）に属する多年生の大型菌類である。台湾原住民は、古くから牛樟芝を二日酔いとアルコール関連の症状を緩和するのに用いている。台湾民間において牛樟芝の子実体は、炎症、肝臓病と胃腸の不快症状に有効であるとされている。牛樟芝は、一般の食薬両用の大型菌類と同様に多くの複雑な成分を有する。たとえば、トリテルペン類化合物、多糖体、アデノシン、ビタミン、タンパク質、核酸、ステロール類など既知の生理活性成分が含まれている。多くの研究では、牛樟芝が抗腫瘍、免疫力アップ、抗アナフィラキシー、抗病原菌、抗高血圧、血糖降下作用及びコレステロール降下作用など多種な効果があり、かつ肝臓保護及び肝臓に関連する疾病の治療に役立つことが明らかになっている。

研究では、牛樟芝の子実体及び菌糸体抽出物は、自由基を取り除き、抗酸化力、アルコールにより誘発された急性肝障害を低下し、四塩化炭素により誘発された急性ならびに慢性肝障害を保護し、免疫力アップ、及び腫瘍細胞の成長を抑制する効果を有する可能性があると指摘されている。

近年、産業界でも牛樟原木における菌の人工栽培技術に関する研究に多量の投入がなされている。実験結果から、菌を植える成功率と子実体の成長レートを指標とした場合、人工栽培の牛樟芝と天然の牛樟芝の生長の差は、大きくないため、適当な処理によって、牛樟原木においても質のよい牛樟芝の子実体が栽培可能である。但し、さらにその二次代謝物量及び生理活性を分析すると、差異が存在することが分かる。実験結果から見ると、通常牛樟原木において生長した牛樟芝を三回連続して抽出してもかなりの量の二次代謝物を得ることが可能である。この結果から、牛樟原木において栽培された牛樟芝は、比較的に高い量の二次代謝物量が含まれることを表す。このほか、牛樟芝を栽培する宿主によって、その二次代謝物の構成も大きく異なる。牛樟原木において栽培された牛樟芝に含まれる低極性二次代謝物の量は、その他の原木において栽培された牛樟芝の低極性二次代謝物の量よりはるかに高い。通常、この範囲の二次代謝物は、がんの活性の抑制に最も効果がある。

牛樟芝のがん治療への応用に関する研究は多くみられ、牛樟芝抽出物、分離物及びその中に含まれている成分、腫瘍の生長を抑制する作用に関する検討が含まれている。たとえば、特許文献１では、４−アセチル−アントロクィノーノールＢ（4-acetyl-antroquinonol B）が含まれるがん治療剤の一種が開示されている。では、牛樟芝抽出物により分離、精製することによって得られた４−ヒドロキシ−２，３−ジメトキシ−６−メチル−５（３，７，１１−トリメチル−２，６，１０−シクロドデカトリエン）−２−シクロヘキセノンが掲載され、そのシクロヘキセノン化合物の混合物は、リンパ腫瘍細胞の生長を抑制するのに応用できると同時に、胃の腫瘍細胞ＴＳＧＨ−９２０１の生長を抑制するにも応用可能の薬剤である。特許文献３では、牛樟芝抽出物から分離して得られた白血病と膵臓癌細胞の生長を抑制するデヒドロサルフューレニックアシッド（dehydrosulphurenic acid）が掲載されている。特許文献４では、乳癌、肝臓癌及び前立腺癌の腫瘍細胞の生長を抑制する一種の４，７−ジメトキシ−５−メチル−１，３−ベンゾジオキソールが記述されている。しかしながら、現在までの牛樟芝の抗がん効果に関する研究は、主に牛樟芝の子実体または菌糸体抽出物の単独の抗がん効果、及びそれらが含まれる成分が癌細胞増殖に対する抑制効果に着目されている。

特許文献５では、牛樟芝の菌糸体が含まれる抗がん治療の補助薬膳食品の一種が掲載されている。その食品は、多種な薬食両用の漢方薬からの抽出物と適性を有する食材とを組み合わせて、肝臓がん、肺がん、腸がん、胃がん、急性白血病及び慢性白血病の末期患者に対して、食治療方法の補助治療を行う煎じ薬食品が掲載されている。特許文献では、一種の液体状態の発酵牛樟芝が開発され、プラチナベース（platinum-based）またはアントラサイクリンベース（anthracycline-based）が含まれる抗がん薬剤による副作用を改善することができる、例えば、痛み、疲労、うつ病及び有効時間の短縮と体力の衰えなどを改善する。特許文献７では、一種の４−アセチル−アントロクィノーノールＢ（4-acetyl-antroquinonol B）が含まれる牛樟芝の液体状態の発酵酢の酸エチル抽出物が掲載されている。その抽出物は、がん幹細胞によるがんの治療作用があり、さらに、化学治療薬のシスプラチン（Cisplatin）やタキソール（Taxol）、または放射線治療と組み合わせて、更なるがん細胞の抑制作用がある。しかしながら、固体培養された菌糸体と子実体の水抽出物及びエタノール抽出物を特定の比例で組成する組成物がなく、且つ化学治療薬のがん抑制作用の補助及び化学治療薬による副作用を低減する抗がん補助剤がないのが現状である。

台湾特許Ｉ４８４９５４号台湾特許Ｉ３７９６７８号台湾特許Ｉ３６３６３１号台湾特許出願公開第２００８１１１１号明細書中国特許１０３３００４２１号米国特許９，０４４，４６７号米国特許２０１３００８９６２７号

本発明は、上記の目的に基づいてなされたものであって、抗がん薬剤の補助剤の効果を果たす牛樟芝抗がん活性組成物の製造方法を提供する。

本発明の一態様は、一種の抗がん薬剤の補助剤の効果を果たす牛樟芝抗がん活性組成物の製造方法であり、ステップ１からステップ７を含む。ステップ１では、牛樟原木において栽培された牛樟芝の子実体を５倍から１５倍（ｗ／ｖ）の９５％エタノールによりエタノール抽出を行い、子実体のエタノール抽出物及び子実体かす(residue)が得られる。ステップ２では、子実体かすを５倍から１５倍（ｗ／ｖ）体積の水により水抽出を行い、子実体の水抽出物が得られる。ステップ３では、子実体のエタノール抽出物と子実体の水抽出物とを混合し、子実体の水抽出物及びエタノール抽出物が得られる。ステップ４では、牛樟芝の固体培養された菌糸体を５倍から１５倍（ｗ／ｖ）の９５％エタノールでエタノール抽出を行い、菌糸体のエタノール抽出物及び菌糸体かすが得られる。ステップ５では、菌糸体かすは５倍から１５倍（ｗ／ｖ）体積の水により水抽出を行い、菌糸体の水抽出物が得られる。ステップ６では、菌糸体のエタノール抽出物及び菌糸体の水抽出物を混合し、牛樟芝の固体培養された菌糸体の水抽出物及びエタノール抽出物が得られる。そして、ステップ７では、子実体の水抽出物及びエタノール抽出物と菌糸体の水抽出物及びエタノール抽出物をそれぞれ５％から４０％（Ｗ／Ｗ）及び６０％から９５％（Ｗ／Ｗ）の割合で混合し、牛樟芝抗がん活性組成物が得られる。

本発明の一態様では、上述の抗がん剤の補助剤は、抗がん剤の癌細胞増殖抑制を増進するのに用いられる。本発明の一形態では、上述の抗がん剤の補助剤は、抗がん剤による副作用を軽減するのに用いられる。本発明の一形態では、上述の抗がん剤の補助剤は、特に化学療法薬による骨髄中の顆粒球単球コロニー刺激因子（ＣＦＵ−ＧＭ）の減少を軽減する。本発明の他の一形態では、抗がん剤の補助剤は、化学療法薬による血液中の白血球、赤血球とリンパ球と好中性白血球を含む血球数の減少を緩和かつ回復させる。

本発明における抗がん剤は、化学療法薬が含まれているが、化学療法薬に限らない。たとえば、抗ウイルス剤、遺伝子治療剤、分子標的治療剤などが含まれている。本発明の一態様では、前記化学療法薬は、代謝拮抗薬剤、アルキル化剤、アントラサイクリン系、抗生剤、抗有糸分裂剤、タンパク質分解酵素阻害剤及びプラチナ類化学療法薬が含まれているが、それに限らない）。本発明の一態様では、化学療法薬は、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、エピルビシン（Epirubicin）、オキサリプラチン（oxaliplatin）またはその組み合わせが含まれるが、それに限らない。本発明のその他態様では、前記がんは、肺がん、腸がん、胃がん及び乳がんにより選択し、比較的によいのは胃がんである。
牛樟芝抗がん活性組成物は、化学療法薬を補助し、化学療法薬のがん細胞増殖抑制を増進し、化学療法薬による副作用を軽減かつ緩和する。特に、化学療法薬による骨髄の顆粒球単球コロニー刺激因子（ＣＦＵ−ＧＭ）の下降、及び化学療法薬による白血球、赤血球、リンパ球と好中性白血球の数の下降を緩和する効果を果たす。

異なる割合の牛樟原木に栽培された牛樟芝の子実体の水抽出物及びエタノール抽出物と、固体培養された菌糸体の水抽出物及びエタノール抽出物とを、ＭＫＮ−４５胃がんの腫瘍を有するマウスに三週間食べさせた後の腫瘍重量に対する影響を示す。牛樟原木に栽培された牛樟芝の子実体の水抽出物及びエタノール抽出物と、固体培養された菌糸体の水抽出物及びエタノール抽出物とが、化学療法薬５−ＦＵを補助して腫瘍増殖抑制作用が顕著であることを示す。牛樟原木に栽培された牛樟芝の子実体の水抽出物及びエタノール抽出物と、固体培養された菌糸体の水抽出物及びエタノール抽出物とが、化学療法薬５−ＦＵによる骨髄細胞におけるＣＦＵ−ＧＭの減少を降下させることを示す。牛樟原木に栽培された牛樟芝の子実体の水抽出物及びエタノール抽出物と、固体培養された菌糸体の水抽出物及びエタノール抽出物とが、化学療法薬５−ＦＵによる白血球の数を減少させる副作用を降下することを示す。牛樟原木に栽培された牛樟芝の子実体の水抽出物及びエタノール抽出物と、固体培養された菌糸体の水抽出物及びエタノール抽出物とが、化学療法薬５−ＦＵによる赤血球の数を減少させる副作用を降下することを示す。牛樟原木に栽培された牛樟芝の子実体の水抽出物及びエタノール抽出物と、固体培養された菌糸体の水抽出物及びエタノール抽出物とが、化学療法薬５−ＦＵによるリンパ球の数を減少させる副作用を降下することを示す。牛樟原木に栽培された牛樟芝の子実体の水抽出物及びエタノール抽出物と、固体培養された菌糸体の水抽出物及びエタノール抽出物とが、化学療法薬５−ＦＵによる好中性白血球の数を減少させる副作用を降下することを示す。牛樟原木に栽培された牛樟芝の子実体の水抽出物及びエタノール抽出物と、固体培養された菌糸体の水抽出物及びエタノール抽出物とが、化学療法薬５−ＦＵ及びオキサリプラチン（oxaliplatin）による骨髄抑制（ＣＦＵ−ＧＭ及びコロニー数の降下）現象を改善することを示す。図中の＊は、対照群に比べて、ｐ＜０．０５、＃は、５−ｆｕ＋ｏｘａ組に比べてｐ＜０．０５である。牛樟芝原木に栽培された牛樟芝の子実体の水抽出物及びエタノール抽出物と、固体培養された菌糸体の水抽出物及びエタノール抽出物とが、化学療法薬５−ＦＵ及びオキサリプラチン（oxaliplatin）による白血球減少現象を回復することを示す。図中の＊は、対照群に比べてｐ＜０．０５、＃は、５−ｆｕ＋ｏｘａ組に比べてｐ＜０．０５であるである。牛樟原木に栽培された牛樟芝の子実体の水抽出物及びエタノール抽出物と、固体培養された菌糸体の水抽出物及びエタノール抽出物とが、化学療法薬５−ＦＵ及びオキサリプラチン（oxaliplatin）による赤血球減少現象を緩和することを示す。図中の＊は、対照群に比べてｐ＜０．０５、＃は、５−ｆｕ＋ｏｘａ組に比べてｐ＜０．０５であるである。

下記の実施例において、本発明のその他の特徴及びメリットについてさらに例を挙げて説明する。但し、当該実施例は、単なる補助説明するためであり、それによって、本発明の特許請求の範囲が制限されることはない。以下において、「牛樟芝活性組成物」とは「牛樟芝抗がん活性組成物」を意味する。
本発明の実施形態は、牛樟原木において栽培された牛樟芝の子実体及び固体培養された菌糸体の水抽出物及びエタノール抽出物を含む組成物が、抗腫瘍薬剤及び化学療法薬の補助剤への応用に関し、特に、５０％から９９％重量パーセント（Ｗ／Ｗ）の固体培養された牛樟芝菌糸体の水抽出物及びエタノール抽出物と１％から５０％の重量パーセント（Ｗ／Ｗ）の牛樟原木で栽培された牛樟芝の子実体の水抽出物及びエタノール抽出物により構成された牛樟芝組成物が、化学療法薬の補助剤の製造への応用に関する。

本発明の実施形態における抗がん剤は、化学療法薬が含まれているが、化学療法薬に限らない。たとえば、抗ウイルス剤、遺伝子治療剤、分子標的治療剤などが含まれている。本実施形態の化学療法薬は、代謝拮抗薬剤、アルキル化剤、アントラサイクリン系、抗生剤、抗有糸分裂剤、タンパク質分解酵素阻害剤及びプラチナ類化学療法薬が含まれているが、それに限らない）。また、化学療法薬は、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、エピルビシン（Epirubicin）、オキサリプラチン（oxaliplatin）またはその組み合わせが含まれるが、それに限らない。本発明のその他態様では、がんには、肺がん、腸がん、胃がん及び乳がんにより選択し、比較的によいのは胃がんである。
牛樟芝活性組成物は、化学療法薬を補助し、化学療法薬のがん細胞増殖抑制を増進し、化学療法薬による副作用を軽減かつ緩和する。特に、化学療法薬による骨髄の顆粒球単球コロニー刺激因子（ＣＦＵ−ＧＭ）の下降、及び化学療法薬による白血球、赤血球、リンパ球と好中性白血球の数の下降を緩和する効果を果たす。

実施例１、牛樟芝の活性組成物の製造

牛樟原木において栽培された牛樟芝の子実体の水抽出物及びエタノール抽出物を製造する。牛樟原木で栽培された新鮮な牛樟芝の子実体を４５℃のオーブンで２日間低温乾燥させる。乾燥粉末を取り体積の５〜１５倍（本実施形態では１０倍）である（ｗ：ｖ＝１：１０）９５％エタノールを加え、超音波で３０分振動後に、一晩浸けてから抽出を行う。抽出液をＮｏ．１の濾紙を用いて空気を抜いて濾過する。濾過して出たかすは、再び上述の９５％エタノールで抽出し濾過するステップを繰り返す。次いで、濾過して出たかすは、体積の５〜１５倍（本実施形態では１０倍）である（ｗ：ｖ＝１：１０）水で２時間煮詰めることによって水抽出ステップを行い、重複して２回抽出する。上述のエタノール抽出物及び水抽出物を合わせてエキスに濃縮する。得られた生成物を以下「ＦＢ」と略称する。

牛樟芝の固体培養された菌糸体の水抽出物及びエタノール抽出物を製造する。牛樟芝の固体培養された菌糸体の乾燥粉末に体積の５〜１５倍（本実施形態では１０倍）である（ｗ：ｖ＝１：１０）９５％エタノールを加え、超音波で６０分振動させた後に、一晩浸けてから抽出を行い、Ｎｏ．１の濾紙を用いて空気を抜いて濾過する。濾過して出たかすは、再び抽出して濾過するステップを２回重複する。かすは、体積の５〜１５倍（本実施形態では１０倍）である水で２時間煮詰め、重複して２回抽出する。エタノール抽出物及び水抽出物を合わせ、エキスに濃縮する。得られた生成物は、以下「ＳＣ」と略称する。
本実施形態では、エタノール抽出物、および、エタノール抽出後のかすを水抽出した水抽出物を合わせたエキス、および、エキスの濃縮物を、「水抽出物及びエタノール抽出物」とする。

上述の牛樟芝の固体培養された菌糸体抽出物（ＳＣ）と牛樟原木において栽培された牛樟芝の子実体の抽出物（ＦＢ）とを異なる比率（子実体の抽出物／固体培養による抽出物、％ｗ／ｗ）で混合する。４０％ＦＢ／ＳＣ、２０％ＦＢ／ＳＣ、１０％ＦＢ／ＳＣ及び５％ＦＢ／ＳＣの４種の牛樟芝の活性組成物に調整する。

実施例２牛樟芝の活性組成物の腫瘍細胞抑制機能

実施例１の牛樟芝の固体培養された菌糸体のエタノール抽出物及び水抽出物（ＳＣ）と牛樟原木において栽培された牛樟芝の子実体のエタノール抽出物及び水抽出物（ＦＢ）とを、まず１００％ＤＭＳＯで濃度が５０ｍｇ／ｍＬになるよう調整した後に、その２つを混合して４種の異なる比率の子実体の抽出物／固体培養による抽出物に調整する。測定対象物は、１００％ＦＢ、４０％ＦＢ／ＳＣ、２０％ＦＢ／ＳＣ、１０％ＦＢ／ＳＣ、５％ＦＢ／ＳＣ、１００％ＳＣの６個のサンプルがあり、濃度はすべて５０ｍｇ／ｍＬである。測定対象物は、まずＤＭＳＯで８つの濃度（４０、３０、２０、１０、５、１、０．５、０．２５ｍｇ／ｍＬ）に希釈した後に、８つの異なる濃度の測定対象物を５％ＦＢＳ含有の細胞培養液で２０倍希釈する。濃度は、２０００、１５００、１０００、５００、２５０、５０、２５、１２．５μｇ／ｍＬである。それが９６ホールプレートにおいて最終濃度が２００、１５０、１００、５０、２５、５、２．５、１．２５μｇ／ｍＬになるようにする。５−ＦＵを陽性対照組（positive control）とする。

Ａ５４９（肺がん）、ＮＣＩ−Ｈ４６０（肺がん）、ＳＷ４８０（腸がん）、Ｃｏｌｏ２０５（腸がん）、ＭＫＮ４５（胃がん）、ＡＧＳ（胃がん）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（乳がん）及びＭＣＦ−７（乳がん）の８種のがん細胞を６×１０³ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの密度でそれぞれ９６ホールプレートに植える。培養液の体積は１８０μＬ／ｗｅｌｌであり、培養条件は３７℃、４時間である。また、２０μＬの異なる濃度を有する測定対象物の培養液（５％ＦＢＳ）を加え、各ホールの総体積が２００μＬとなるようにし、培養器に入れて培養する。４８時間経過後に古い培養液を取り除いてから、ＭＴＳの５％ＦＢＳ含有の細胞培養液を加え、培養器に入れて１時間培養する。ELISA Readerにより読み取り波長４９０ｎｍの吸光値を読み取る。またGraphPad Prism 5ソフトウェアを利用してＩＣ₅₀を算出する。結果は下記の表１に示す。

表１のように、牛樟原木において栽培された牛樟芝の子実体抽出物及び固体培養された菌糸体抽出物は、Ａ５４９及びＮＣＩ−Ｈ４６０肺がん細胞に対して、最もよい比率の組は、４０％ＦＢ／ＳＣであり、腫瘍増殖抑制作用は、子実体抽出物よりよい。乳がん細胞と腸がん細胞に対して最もよい比率の組は、すべて１００％ＦＢである。実験から、肺がん、腸がん及び乳がんに比べて、１００％ＳＣの組は、胃がん細胞に対して最も有効である。ＡＧＳのＩＣ₅₀は１３７．１μｇ／ｍＬであり、ＭＫＮ４５のＩＣ₅₀は１０８．９μｇ／ｍＬである。胃がん細胞株ＭＫＮ４５は、８種のがん細胞において試験物質に対して最も敏感ながんの種類である。試験する６種のサンプルは、ＩＣ₅₀の範囲が６９．７〜１０８．９μｇ／ｍＬである。

実施例３牛樟芝の活性組成物の生体内における胃がん腫瘍の生長を抑制する効果

本実施例は、さらに動物実験により、本発明の実施形態における牛樟芝の活性組成物（牛樟原木において栽培された牛樟芝の子実体の抽出物及び固体培養された菌糸体抽出物により構成されている）が、胃がん腫瘍の生長を抑制する効果について評価する。実験物質は、５％ＦＢ／９５％ＳＣ、１０％ＦＢ／９０％ＳＣ、２０％ＦＢ／８０％ＳＣ、４０％ＦＢ／６０％ＳＣを含む。動物実験では、人類の胃がん細胞株（ＭＫＮ−４５）を利用して免疫欠乏のマウスに移植するモデルである。マウスにがん細胞を注入して１０日間後、強制経口投与法で試験物質（３００ｍｇ／ｋｇ／日）を与える。２１日後、動物を犠牲させ、腫瘍を取り、並びに腫瘍の重量を比較することによって、腫瘍の生長を抑制する主な指標を評価する。

ＭＫＮ−４５胃がん腫瘍の接種は、ヌードマウスの体重を３ｇ低下させる。しかしながら、試験物質を食べさせる各組とコントロールグループまたは５−ＦＵ組と比較すると、その体重には顕著な差異がない。これによって、試験物質は、腫瘍を有するマウスの体重低下の幅を増加されないことが確認できる。３週間食べさせた後に動物を犠牲させる。手術によって腫瘍を取り重量を量る。５−ＦＵを注入した組及び１０％ＦＢ／９０％ＳＣを含有する試験物質を食べさせた組は、腫瘍の重量（ｐの値は、それぞれ０．００１及び０．０４６である）を顕著に減少させることが実証された。

このほか、図１の結果に示すように、１０％ＦＢ／９０％ＳＣ含有の牛樟芝抽出物（３００ｍｇ／ｋｇ／日）は、腫瘍重量を低下可能であることが実証され、かつ腫瘍を有するマウスの体重下降の幅が増加されない。また、試験物質３００ｍｇ／ｋｇ／日は、胃がん腫瘍に対する抑制効果が試験物質４０％ＦＢ／６０％ＳＣの胃がん腫瘍に対する抑制効果と類似している（図１）。

実施例４牛樟芝の活性組成物が化学療法薬のがん細胞増殖抑制作用を促進する。

牛樟原木において栽培された牛樟芝の子実体の抽出物及び固体培養された菌糸体抽出物を単独または化学療法薬と併合して処理することによる胃がん細胞増殖抑制作用について、ＭＫＮ４５、ＡＧＳ及びＨＧＣ２７の３種の細胞株を用いて測定試験を行う。試験薬物（牛樟芝の子実体の抽出物（ＦＢ）、固体培養された菌糸体抽出物（ＳＣ）、及び牛樟原木において栽培された牛樟芝の子実体の抽出物及び固体培養された菌糸体抽出物の混合物（ＦＢ＋ＳＣ））、及び、化学療法薬５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）またはエピルビシン（Epirubicin）を併合処理する。試験薬物及び化学療法薬の調製は、試験薬物と化学療法薬とのＩＣ₂₅濃度を参照する必要がある。単独的に試験薬物または化学療法薬ＩＣ₂₅濃度のみ含有する組は、実験が安定であるか否かの参照指標である。試験薬物及び化学療法薬の相乗作用の最初の濃度は、ＩＣ₂₅の組み合わせであり、並びに順に下方向へ半分ずつ希釈する。

ＭＫＮ４５及びＡＧＳ細胞は、５％ＦＢＳ含有のＲＰＭＩ−１６４０培養液を使用し、ＨＧＣ２７細胞は、５％ＦＢＳ含有のＭＥＭ培養液を使用する。９６ホールプレートの各ホールに６×１０³個細胞を植える。培養液の体積は１８０μＬであり、３７℃で４時間培養後、各ホールに試験薬物２０μＬを入れる。各濃度を３回重複して実験を行う。３７℃で４８時間培養後、古い培養液を取り除き、ＭＴＳ含有の５％ＦＢＳ細胞培養液を加え、３７℃で１時間反応させる。ELISA Readerで読み取り波長４９０ｎｍの吸光値を読み取る。並びにGraphPad Prism 5ソフトウェアを用いてＩＣ₂₅、ＩＣ₅₀、ＩＣ₇₅及び相乗作用因数（combination index、ＣＩ）の数値を算出する。その結果を表２に示す。

相乗作用因数（ＣＩ）により、本発明の牛樟芝の活性組成物が化学療法薬５−ＦＵ及びエピルビシンと相乗作用が発生されるか否かを判定する。内挿法により併合処理下において２５％細胞活性を抑制した個別の薬剤濃度を得る。それぞれ元ＩＣ₂₅数値で割った後、２つの数値を足すとＣＩを算出することができる。理論上ＣＩが１と等しいならば、付加作用であり、ＣＩが１より小さいならば、相乗作用である。結果からわかるように、ＦＢまたはＦＢ＋ＳＣをエピルビシンと併合してＭＫＮ４５細胞を処理することによって、相乗作用が発生する（ＣＩは、０．６０及び０．７７である）。ＳＣとエピルビシンを併合する組は、付加作用である（ＣＩは１．０２である）。ＦＢ＋ＳＣと５−ＦＵを併合する組は、付加作用を有する（ＣＩは０．９８である）。ＡＧＳ及びＨＧＣ２７細胞において、５−ＦＵまたはエピルビシンで３種の試験薬剤を併合したＣＩは、すべて１に接近または１より大きい。ＦＢまたはＦＢ＋ＳＣで化学療法薬剤のエピルビシンを併合してＭＫＮ４５細胞を処理するとき、相乗作用が発生される。ＦＢまたはＦＢ＋ＳＣで化学療法薬剤５−ＦＵを併合するとき、がん細胞増殖抑制作用において付加効果を有する。よって、本発明における牛樟芝の活性組成物は、化学療法薬のがん細胞増殖抑制作用を促進する効果を果たす。

実施例５牛樟芝の活性組成物の化学療法薬剤の生体内における腫瘍抑制効果

本実施例では、動物実験により、本発明の牛樟原木において栽培された牛樟芝の子実体の抽出物及び固体培養された菌糸体抽出物の混合物が化学療法薬５−ＦＵに対する効果を確認する。研究において使用する動物は、国家実験動物センターにより購入した６週齢のＢａｌｂ／ｃｎｕ／ｎｕヌードマウスである。胃がんの正のコントロールグループは、５−ＦＵを使用し、投薬量は２５ｍｇ／ｋｇである。薬剤の投与頻度は週３回であり、腹腔内注射を採用する。牛樟原木において栽培された牛樟芝の子実体の抽出物及び固体培養された菌糸体抽出物である牛樟芝の活性組成物（Ｌ）について、１倍の薬剤量は６８０ｍｇ／ｋｇ、０．５倍の薬剤量は３４０ｍｇ／ｋｇ、０．２５倍の薬剤量１７０ｍｇ／ｋｇ、０．１２５倍の薬剤量は８５ｍｇ／ｋｇ、薬剤投与の頻度は毎日１回であり、強制経口投与法を採用する。当日５−ＦＵを注入するならば、５−ＦＵ注入後４時間に強制経口投与Ｌを行う。人類の胃がん細胞ＭＫＮ−４５（細胞数は３×１０⁶）を免疫不全マウスに移植する。腫瘍サイズが１００〜２００ｍｍ³に達したときを基準として薬剤投与を進行しはじめる。動物実験は、対照群、５−ＦＵ、５−ＦＵ＋Ｌ、５−ＦＵ＋０．５Ｌ、５−ＦＵ＋０．２５Ｌ及び５−ＦＵ＋０．１２５Ｌの六つのグループが含まれており、各グループは８匹のマウスである。

結果は、図２に示す通りである。対照群に比べて、単独処理である５−ＦＵ組は、ＭＫＮ−４５胃がん細胞腫瘍の発育を抑制することができる（コントロールグループの腫瘍重量は１．６０ｇであり、単独処理である５−ＦＵ組は０．８５ｇであり、ｐ＜０．０５、統計上の差異に達している）。また、５−ＦＵ＋Ｌ及び５−ＦＵ＋０．５Ｌは、単独処理である５−ＦＵ組に比べて、いずれも腫瘍抑制効果を強化することができ、データは統計上の意義を有する（単独処理である５−ＦＵ組の腫瘍重量は０．８５ｇ、５−ＦＵ＋Ｌ組の腫瘍重量は０．３２ｇ、５−ＦＵ＋０．５Ｌ組の腫瘍重量は、０．３２ｇ、後の両者はそれぞれ前者と比較する、ｐ＜０．０５、統計上の差異に達している）。５−ＦＵ＋０．２５Ｌ処理組（腫瘍重量は０．５９ｇである）及び５−ＦＵ＋０．１２５Ｌ処理組（腫瘍重量は０．５３ｇである）は、５−ＦＵ（腫瘍重量は０．８５ｇである）単独処理組に比べて、統計上の意義に達していないが、前の二組の腫瘍抑制効果が後者の腫瘍抑制効果よりよいことがみられる。

実施例６牛樟芝の活性組成物が化学療法薬剤５−ＦＵによる血球減少を回復させる。

マウスの骨髄細胞のＣＦＵ−ＧＭを培養することによって、牛樟芝活性組成物（Ｌ）が５−ＦＵの使用による血球減少を回復させる効果について検討する。研究において使用する動物は、国家実験動物センターにより購入した８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスである。
動物実験は、対照群、５−ＦＵ、５−ＦＵ＋Ｌ、５−ＦＵ＋０．５Ｌ、５−ＦＵ＋０．２５Ｌ及５−ＦＵ＋アンジオテンシンＩＩ（Ａｉｉ）という六つの組が含まれている。各組は６匹のマウスである。初日は腹腔注射で５−ＦＵ（２００ｍｇ／ｋｇ）を注入した後、４日目から１０日目は、強制経口投与法により試験薬物の牛樟芝活性組成物（Ｌ）を投与する。或いは腹腔注射で正のコントロールグループ薬剤アンジオテンシンＩＩ（Ａｉｉ、薬剤量は１００μｇ／ｋｇである）を注入する。牛樟原木において栽培された牛樟芝の子実体の抽出物及び固体培養された菌糸体抽出物である牛樟芝の活性組成物（Ｌ）については、１倍の薬剤量は６８０ｍｇ／ｋｇ、０．５倍の薬剤量は３４０ｍｇ／ｋｇ、０．２５倍の薬剤量は１７０ｍｇ／ｋｇである。１１日目に実験動物が犠牲される前に、頬から採血して全血を収集し、全血球計算（Complete Blood Count，ＣＢＣ）を行うことによって、末梢血における各血球数を判定する。白血球、赤血球、リンパ球及び好中性白血球が含まれている。１１日目に実験動物が犠牲されるとき、手術によりマウスの大腿骨を取り、骨髄を収集してＣＦＵ−ＧＭを培養する。細胞は７日間培養して細胞コロニー数（ｃｏｌｏｎｙ）を観察する。

図３に示す結果から、以下のことがわかる。コントロールグループに比べて、単独処理された５−ＦＵ組は、ＧＭ−ＣＦＣ数（コントロールグループの細胞コロニー数は３０６１個／１０⁶個の骨髄細胞、単独処理された５−ＦＵ組の細胞コロニー数は、１８６９個／１０⁶個の骨髄細胞、ｐ＜０．０５、すでに統計上の差異に達している）を抑制する効果が顕著である。５−ＦＵ＋Ｌ、５−ＦＵ＋０．５Ｌ及び５−ＦＵ＋０．２５Ｌは、単独処理された５−ＦＵに比べて、いずれも腫瘍抑制効果を強化することができる。データは統計上の意義を有する。すなわち、単独処理された５−ＦＵ組の細胞コロニー数は１８６９個／１０⁶個の骨髄細胞であり、５−ＦＵ＋Ｌは２９１７個／１０⁶個の骨髄細胞であり、５−ＦＵ＋０．５Ｌは２７７８個／１０⁶個の骨髄細胞であり、５−ＦＵ＋０．２５Ｌは２７１７個／１０⁶個の骨髄細胞である。後の三者は、それぞれ単独処理された５−ＦＵ組と比較すると、ｐ＜０．０５であって、すべて統計上の差異に達している。実験結果から、本発明の実施形態による牛樟原木において栽培された牛樟芝の子実体の抽出物及び固体培養された菌糸体抽出物の混合物が５−ＦＵによる骨髄抑制作用を有効に回復させることがわかる。

図４に示す全血球計算結果からわかるように、５−ＦＵは、白血球、赤血球及びリンパ球の数を顕著に抑制することができ（ｐ＜０．０５、すでに統計上の差異に達している）、好中性白血球数に対しても抑制作用がある。５−ＦＵ併合試験物質（Ｌ、１倍の薬剤量）は、単独処理の５−ＦＵに比べて、併合された物質Ｌは、白血球数を顕著に回復させ（ｐ＜０．０５、すでに統計上の差異に達している）、好中性白血球数及びリンパ球数も回復される。統計上の意義に達していないが、顕著な効果が得られた。ただし、赤血球に対しては回復効果がみられない。実験結果からわかるように、本発明の牛樟原木において栽培された牛樟芝の子実体の抽出物及び固体培養された菌糸体抽出物の混合物が５−ＦＵによる血球抑制作用を有効に回復させることができる。

実施例７牛樟芝の活性組成物は、化学療法薬５−ＦＵ及びオキサリプラチンによる骨髄抑制及び血球減少現象を改善する。

本実施例は、マウスの骨髄の免疫関連細胞の造血力の実験（ＣＦＵ−ＧＭコロニー数を算出して観察する）により、本発明の実施形態による牛樟芝の活性組成物（Ｌ）の化学療法薬５−ＦＵ及びオキサリプラチン（oxaliplatin）による骨髄抑制現象に対する改善効果を評価する。研究で使用する動物は、国家実験センターにより購入した８週齢のＣ５７ＢＬ／６オスマウスである。化学療法薬は、５−ＦＵ及びオキサリプラチンを使用する。０日目、２日目及び４日目に５−ＦＵ（３回の薬剤投与総量は１００ｍｇ／ｋｇである）及びオキサリプラチン（ｏｘａ、３回の薬剤投与総量は３ｍｇ／ｋｇ）を注入する。注射方法は、腹腔注射を採用する。０日目から９日目は、強制経口投与法で本発明の実施形態における牛樟芝の活性組成物（Ｌ）を投与する。頻度は、毎日１回である。毎日投与する薬剤量は、５１０ｍｇ／ｋｇ、３４０ｍｇ／ｋｇ、２２７ｍｇ／ｋｇ、または、１５１ｍｇ／ｋｇである。動物組は、それぞれコントロールグループ、５−ＦＵ＋オキサリプラチン（５−ＦＵ＋ｏｘａ）、５−ＦＵ＋オキサリプラチン＋Ｌ試験物質５１０ｍｇ／ｋｇ（５−ＦＵ＋ｏｘａ＋Ｌ５１０）、５−ＦＵ＋オキサリプラチン＋Ｌ試験物質３４０ｍｇ／ｋｇ（５−ＦＵ＋ｏｘａ＋Ｌ３４０）、５−ＦＵ＋オキサリプラチン＋Ｌ試験物質２２７ｍｇ／ｋｇ（５−ＦＵ＋ｏｘａ＋Ｌ２２７）及び５−ＦＵ＋オキサリプラチン＋Ｌ試験物質１５１ｍｇ／ｋｇ（５−ＦＵ＋ｏｘａ＋Ｌ１５１）である。各組は６匹のマウスであり、６組は全部で３６匹のマウスである。１０日目に実験動物が犠牲される前に、頬から採血する方法で全血を収集することによって、凝固を抑制した全血で全血細胞計算（Complete Blood Count，ＣＢＣ）を行い、末梢血の各血球数を判定する。１０日目に実験動物が犠牲されるとき、手術によりマウスの大腿骨を取り、骨髄細胞を収集して、ＣＦＵ−ＧＭ（Colony-forming unit-granulocyte,macrophage）を培養する。７日間培養後に、顕微鏡で観察し、並びにＣＦＵ−ＧＭの細胞コロニー（ｃｏｌｏｎｙ）数を算出する。

図５の結果に示すように、コントロールグループの細胞コロニー数は、約３１５３個／１０⁶個の骨髄細胞であり、５−ＦＵ＋オキサリプラチンの処理組の細胞コロニー数は、約１７１１個／１０⁶個の骨髄細胞であり、両者はすでに統計上の差異に達している。５−ＦＵ＋オキサリプラチンが確かに骨髄抑制をもたらすことを示す。しかしながら、５−ＦＵ＋オキサリプラチンに５１０ｍｇ／ｋｇ本発明における牛樟芝活性組成物（Ｌ）の処理組と併合したところ、その細胞コロニー数は３２５３個／１０⁶個の骨髄細胞になり、コントロールグループに相当する数に回復されている。また、５−ＦＵ＋オキサリプラチンに３４０ｍｇ／ｋｇ本発明の牛樟芝活性組成物（Ｌ）の処理組と併合した場合、その細胞コロニー数は２５８６個／１０⁶個の骨髄細胞である。これは、５−ＦＵ＋オキサリプラチンを３４０ｍｇ／ｋｇ及び５１０ｍｇ／ｋｇの本発明における牛樟芝活性組成物（Ｌ）と併合する場合、５−ＦＵ＋オキサリプラチンで処理した組に比べて、ＣＦＵ−ＧＭの細胞コロニー（ｃｏｌｏｎｙ）数は、いずれも顕著に増加し、すでに統計上の差異に達している。５−ＦＵ＋オキサリプラチンに比較的に低い薬剤量（２２７ｍｇ／ｋｇ及び１５１ｍｇ／ｋｇ）の牛樟芝活性組成物（Ｌ）の組を併合するとき、その細胞コロニー数の増加は、牛樟芝活性組成物（Ｌ）の濃度の上昇につれて徐々に増加される。このように、骨髄免疫関連細胞の造血力を改善する実験において、本発明の牛樟芝活性組成物（Ｌ）は、薬剤量に依頼する形で５−ＦＵ＋オキサリプラチンの骨髄抑制現象を有効に回復することができる。

図６は、マウスが犠牲される前の白血球数を計算した結果であり、５−ＦＵ＋オキサリプラチンが確かに末梢血における白血球数の減少をもたらすことを示す。５−ＦＵ＋オキサリプラチンに牛樟芝活性組成物（Ｌ）（５１０、３４０、２２７及び１５１ｍｇ／ｋｇ）の組を併合するときの白血球数は、５−ＦＵ＋オキサリプラチンを処理する組の白血球数と比べて、いずれも顕著に増加され、かつすでに統計上の差異に達している。末梢血の白血球数を改善する実験において、本発明の牛樟芝活性組成物（Ｌ）は、５−ＦＵ＋オキサリプラチンによる白血球低下を有効に改善することができる。

また、図７の結果に示すように、５−ＦＵ＋オキサリプラチンは、確かに末梢血における赤血球数の減少をもたらす。しかしながら、５−ＦＵ＋オキサリプラチンと牛樟芝活性組成物（Ｌ）とが併合して処理すると、その赤血球数は、牛樟芝活性組成物（Ｌ）の濃度の上昇につれて増加される。特に、５−ＦＵ＋オキサリプラチンに５１０ｍｇ／ｋｇの牛樟芝活性組成物（Ｌ）を併合して処理した組は、５−ＦＵ＋オキサリプラチンで処理した組に比べて、赤血球数は、いずれも顕著に増加され、かつすでに統計上の差異に達している。末梢血の赤血球数を改善する実験において、本発明の牛樟芝活性組成物（Ｌ）との併合は、５−ＦＵ＋オキサリプラチンによる赤血球低下を有効に回復することができる。

以上の結果により、本発明における牛樟原木において栽培された牛樟芝の子実体の水抽出物及びエタノール抽出物と、固体培養された菌糸体の水抽出物及びエタノール抽出物の牛樟芝活性組成物は、化学療法薬のがん細胞増殖抑制を促進する作用があり、化学療法薬の腫瘍抑制効果を補助する。また化学療法薬による骨髄抑制及び血球減少現象を改善かつ回復する。よって、抗腫瘍薬及び化学療法薬の補助剤を製造するのに応用することができる。また有害薬剤の使用量を減少させ、並びに薬剤による毒害副作用を改善させ、産業上の利用価値を有している。

Claims

牛樟原木において栽培された牛樟芝の子実体を５倍から１５倍（ｗ／ｖ）の９５％エタノールによりエタノール抽出を行い、前記子実体のエタノール抽出物及び子実体かす(residue)が得られるステップと、
前記子実体かすを５倍から１５倍（ｗ／ｖ）体積の水により水抽出を行い、前記子実体の水抽出物が得られるステップと、
前記子実体のエタノール抽出物と前記子実体の水抽出物とを混合し、前記子実体の水抽出物及びエタノール抽出物が得られるステップと、
前記牛樟芝の固体培養された菌糸体を５倍から１５倍（ｗ／ｖ）の９５％エタノールでエタノール抽出を行い、菌糸体のエタノール抽出物及び菌糸体かすが得られるステップと、
前記菌糸体かすは５倍から１５倍（ｗ／ｖ）体積の水により水抽出を行い、菌糸体の水抽出物が得られるステップと、
前記菌糸体のエタノール抽出物及び前記菌糸体の水抽出物を混合し、牛樟芝の固体培養された菌糸体の水抽出物及びエタノール抽出物が得られるステップと、
前記子実体の水抽出物及びエタノール抽出物と前記菌糸体の水抽出物及びエタノール抽出物をそれぞれ５％から４０％（Ｗ／Ｗ）及び６０％から９５％（Ｗ／Ｗ）の割合で混合し、牛樟芝活性組成物が得られるステップと、
を含むことを特徴とする牛樟芝抗がん活性組成物の製造方法。
化学療法薬の補助剤を製造するのに用いられる用途を有し、前記化学療法薬の補助剤は、化学療法薬のがん抑制効果を増進するのに用いられることを特徴とする請求項１に記載の牛樟芝抗がん活性組成物の製造方法。
前記がんは、肺がん、腸がん、胃がん及び乳がんにより構成されるグループであることを特徴とする請求項２に記載の牛樟芝抗がん活性組成物の製造方法。
前記がんは胃がんであることを特徴とする請求項３に記載の牛樟芝抗がん活性組成物の製造方法。
前記化学療法薬の補助剤は、化学療法薬による副作用を緩和するのに用いられることを特徴とする請求項１に記載の牛樟芝抗がん活性組成物の製造方法。
前記化学療法薬の補助剤は、化学療法薬による骨髄造血力下降の副作用を緩和するのに用いられることを特徴とする請求項５に記載の牛樟芝抗がん活性組成物の製造方法。
前記化学療法薬の補助剤は、化学療法薬による血液の血球数下降の副作用を緩和するのに用いられることを特徴とする請求項５に記載の牛樟芝抗がん活性組成物の製造方法。
前記血液の血球は、白血球、赤血球、リンパ球及び好中性白血球より選択されることを特徴とする請求項７に記載の牛樟芝抗がん活性組成物の製造方法。
前記化学療法薬は、代謝拮抗薬、アルキル化剤、アントラサイクリン系、抗生剤、抗有糸分裂薬、タンパク質分解酵素阻害剤及びプラチナ類化学療法薬より選択されることを特徴とする請求項２に記載の牛樟芝抗がん活性組成物の製造方法。
前記化学療法薬は、フルオロウラシル(５−ＦＵ)、エピルビシン(Epirubicin)、オキサリプラチン(oxaliplatin)及びその組み合わせより選択されることを特徴とする請求項９に記載の牛樟芝抗がん活性組成物の製造方法。