CN105395565A

CN105395565A - 人参皂苷f2的肝病预防或治疗用途

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Publication number: CN105395565A
Application number: CN201510559592.5A
Authority: CN
Inventors: 郑元日; 郑朱延; 金善昌; 林完泽
Original assignee: Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST; Intelligent Synthetic Biology Center
Current assignee: Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST; Intelligent Synthetic Biology Center
Priority date: 2014-09-05
Filing date: 2015-09-06
Publication date: 2016-03-16
Anticipated expiration: 2035-09-06
Also published as: JP6293099B2; EP2992933B1; CN105395565B; JP2016065041A; EP2992933A1; KR101621356B1; KR20160029894A; US20160067270A1

Abstract

本发明涉及一种人参皂苷F2的肝病预防、改善或治疗用途及利用其的药物组合物、健康功能食品、饲料用组合物，人参皂苷F2抑制在肝内形成及堆积脂肪，增加抑制炎症细胞的活性的调节性T细胞的分布而保护肝脏，在调节性T细胞中增加抗炎性细胞因子IL-10的表达，抑制从纯真T细胞分化成Th17细胞，从而可有效地治疗各种肝病。

Description

人参皂苷F2的肝病预防或治疗用途

技术领域

本发明涉及一种人参皂苷F2的肝病预防、改善或治疗用药物组合物、健康功能食品及饲料组合物。

背景技术

酒精性肝病根据临床症状可大致分为酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝硬化，虽然根据遗传特征、性别而存在个体差异，但已知在每天摄入80g以上的酒精的情况下，诱发肝病的可能性较高。

尤其，酒精性脂肪肝是在酒精的代谢作用下过量生成脂肪酸而脂肪堆积到肝部产生的疾病，当堆积在肝部的脂质所占的比重为5％以上时定义为脂肪肝。堆积的脂质的种类大部分为中性脂肪(triglyceride(甘油三酯))。

导致酒精性脂肪肝的原因有很多。第一，因在酒精代谢过程中产生的过量的氢(NADH)而在肝内引起脂肪酸氧化减少、脂肪酸浓度增加等，从而致使中性脂肪堆积而可诱发酒精性脂肪肝。另外，在酒精代谢过程中生成的作为有害的中间生成物质的乙醛与细胞内的蛋白质结合而阻断向肝外部排出蛋白质的通道，并且诱发脂质过氧化而使细胞膜受损来阻断脂蛋白向肝外部排出，从而可导致在肝的内部堆积中性脂肪。因摄入酒精所致的肝内脂肪堆积在演化为肝病(肝炎、肝硬化、肝癌)的过程中被认为是非常重要的初期症状。

作为可抑制酒精性脂肪肝的物质，已知有谷胱甘肽(glutathione)、2-巯基丙酰基甘胺酸(2-mecaptopropioylglycine)、3-氨基-1,2,4-三唑(3-amino-1,2,4-triazole)、N,N'-二苯基-对苯二胺(N,N'-diphenyl-p-phenylenediamine)等具有抗氧化活性的物质；S-腺苷基-L-蛋氨酸(S-adenosyl-L-Methionine)、甜菜碱(betaine)等磷脂质及谷胱甘肽合成促进物质；L-甘氨酸(L-glycine)、L-半胱氨酸(L-cysteine)等促进酒精代谢的物质等(韩国公开专利第2012-0138392号)。然而，仍需要一种既无副作用效果又出众的酒精性肝病治疗剂。

另一方面，曾报告人参皂苷F2在乳腺癌干细胞(CSCs)中进行自体吞噬(autophagy)的同时杀灭细胞，从而在乳腺癌中表现出抗癌效果(MaiTTetal.2012；28；321(2):144-53)，在SD小鼠的异种移植模型中，人参皂苷F2对胶质母细胞瘤表现出抗癌效果(ShinJYetal.2012；36(1):86-92)。另外，已知还可将人参皂苷F2用作去皱、美白或祛痘用化妆原料组合物(韩国公开专利2014-0013795)。然而，未曾揭示人参皂苷F2的肝病治疗效果。

在这种背景下，本发明人等为了开发用于治疗肝病的方法而进行锐意研究，结果确认到如下情况而完成了本发明：可从人参中提取的人参皂苷F2不仅可保护肝脏而避免引起酒精肝的损伤，还可抑制肝内中性脂肪的形成、堆积及炎症，从而可用作各种酒精性或非酒精性肝病的预防或治疗用途。

发明内容

[发明要解决的问题]

本发明的一个目的在于提供一种包含人参皂苷F2的肝病预防或治疗用药物组合物。

本发明的另一目的在于提供一种包含人参皂苷F2的酒精性肝病预防或改善用健康功能食品。

本发明的又一目的在于提供一种包含人参皂苷F2的肝病预防或改善用饲料组合物。

本发明的又一目的在于提供一种包含向个体投用所述药物组合物的步骤的肝病治疗方法。

[解决问题的手段]

为了达成所述目的，作为本发明的一个实施方式，提供一种包含人参皂苷F2的肝病预防或治疗用药物组合物。

人参皂苷F2作为以下述化学式1表示的四环系原人参二醇(PPD，protopanaxadiol)皂苷，是吸收及药效相对出色于主要皂苷的次要皂苷的一种。

[化学式1]

在本发明中，人参皂苷F2可使用从市售或在自然界中栽培或摘取的人参中分离的人参皂苷F2、或从所分离出的人参皂苷转化的参皂苷F2。或者，可使用通过合成方法而合成的人参皂苷F2，只要为本发明的表现出肝病预防或治疗效果的人参皂苷F2，则可无限制地使用。

作为所述肝病的一例，可选自由肝炎、肝硬化、脂肪肝、肝功能不全及肝癌所构成的群组，但并不限制于此。

肝炎是指肝细胞及肝组织的炎症，如果因慢性肝炎而长期反复破坏肝细胞并再生的过程，则肝内的纤维组织与再生结节增加而演变为肝硬变或肝硬化。如果肝硬变发展到一定等级以上，则可诱发肝性脑病(Hepaticencephalopathy)、食道静脉曲张(Esophagealvarix)等并发症。

脂肪肝(fattyliver)是指肝中堆积有大于在正常的肝中脂肪所占的比例(5％)的脂肪。所述脂肪肝可为酒精性脂肪肝或因肥胖、糖尿病、高血脂症或药物等引起的非酒精性脂肪肝。

肝功能不全是肝合成功能及解毒功能下降的状态，混合存在肝炎与肝硬变而体现。

所述肝病可为通过AST、ALT、ALP、GGT或胆红素(Bilirubin)来诊断的疾病。

本发明人等确认到人参皂苷F2在肝细胞株中抑制作为因TO901317而增加的脂肪合成基因的SREBP1c及FAS的表达，所述TO901317是作为刺激脂肪生成的蛋白质的肝X受体(LXR，liverXreceptor)的激动剂(agonist)(实施例2，图5e、图5f至图5g)。因此，确认到人参皂苷F2在肝细胞、肝星状细胞中抑制脂肪合成的效果优异，具体而言，人参皂苷F2抑制酒精性内源性大麻素的产生而减少相邻的肝细胞内的CB1R信号传递，由此抑制在肝内形成脂肪。因此，本发明的包含人参皂苷F2的药物组合物可有效预防、治疗因形成肝脂肪所致的非酒精性及酒精性肝病。

作为所述肝病的另一例，可为酒精性肝病。所述酒精性肝病是指因过量饮酒所致的肝疾病。

酒精性肝炎是因过量摄入酒精而氧化应激及各种炎症介质(TNF，proinflammatorycytokine，IL-1β、IL-6、IL-8)增加，由此生成反应性代谢产物与氧物种(oxygenspecies)而对肝细胞的防卫机制造成影响。因此，正常的肝再生机制受损而诱发肝坏死(McClainCJ等，SeminLiverDis1999；19:205-219)。

酒精性脂肪肝(NAFLD)是因过量饮酒而导致中性脂肪堆积到肝组织的疾病，已知酒精对糖代谢及脂肪代谢产生影响而使肝细胞的NADH/NAD+比例与脂肪合成所需的前驱物增加，从而增加中性脂肪的合成并减少分解(NeumanMG等，ExpMolPathol95:376-384)，过多生成的乙醛弱化肝细胞的主要蛋白质及脂质的功能，减少蛋白质合成并使中性脂质堆积，引发肝细胞损伤(ReubenA.2008.CurrOpinGastroenterol24:328-338)。当持续摄入酒精时，脂肪肝还会发展成肝炎、肝硬变、肝癌。

本发明人等通过分析血清确认到人参皂苷F2可减少因酒精而增加的血清内的ALT、AST数值(实施例1，图2)，通过肝组织染色确认到人参皂苷F2可减少因投用乙醇所致的炎症及细胞损伤(图3a、图3b)。

另外，确认到人参皂苷F2通过在酒精性肝炎中增加抑制如巨噬细胞或嗜中性粒细胞的炎症细胞的活性的调节性T细胞(Treg)的分布来保护肝脏(图6a及图6b)，且确认到抑制因酒精而增加的作为炎性细胞因子的TNF-α、IL-6、IL-17的表达，增加作为抗炎性细胞因子的IL-10的表达(图6d及图6e)。进而，确认到抑制纯真T细胞向作为表达IL-17的炎症诱发细胞的Th17细胞分化(实施例4，图7a至图7c)。

因此，人参皂苷F2可缓解因酒精所致的肝炎及由此导致的肝损伤。

进而，本发明人等通过血清分析确认到人参皂苷F2可减少因酒精而增加的血清内的中性脂质(TG)、总胆固醇含量(实施例1，图2)，且通过肝组织染色确认到在因投用酒精而增加的肝组织中减少中性脂质的堆积(图3a、图3c)。

另外，确认到通过抑制SREBP1c与FAS、CB1R、DAGL-α与DAGL-β的表达增加，阻碍脂肪酸水解酶FAAH、使脂肪氧化的pAMPK的表达减少(图4a至图4c、图5b至图5d)，人参皂苷F2可预防或抑制肝内脂肪形成及堆积而有效地预防或治疗肝病，所述SREBP1c与FAS是在肝细胞及肝星状细胞中调节脂肪堆积路径的转录因子，所述CB1R是在肝细胞内合成脂肪的重要因素，DAGL-α与DAGL-β是使脂肪合成的内源性大麻素合成酶。

因此，作为一例，所述人参皂苷F2可为抑制肝内脂肪堆积的人参皂苷F2，且可为增加调节性T细胞(Treg)的分布来抑制肝炎的人参皂苷F2。作为另一例，所述人参皂苷F2可为增加抗炎性细胞因子IL-10的表达的人参皂苷F2。另外，所述人参皂苷F2可为抑制纯真T细胞(NaiveTcell)分化成Th17细胞的人参皂苷F2。另外，所述人参皂苷F2可为抑制LXR(liverXreceptor)的活性的人参皂苷F2。

本发明中所使用的术语“预防”可指向个体投用本发明的人参皂苷F2而抑制或延缓肝病的发病的所有行为。

本发明中所使用的术语“治疗”可指向肝病疑似个体投用所述组合物而使肝病症状好转或利于症状缓解的所有行为。

本发明的药物组合物可作为单一制剂来使用，还可加添公认的具有肝病治疗效果的药物而制备成复合制剂来使用，可通过利用在药学上容许的载体或赋形剂来制剂化而制备成单位容量形态或装入到多容量容器内制备。

本发明中所使用的术语“在药学上可容许的载体”可指既不刺激生物体又不阻碍所注入的化合物的生物学活性及特性的载体或稀释剂。在本发明中可使用的所述载体的类型并无特别限制，可使用在本技术领域中普遍使用且在药学上容许的任一载体。作为所述载体的非限制性的例，可列举食盐水、灭菌水、林格氏液、缓冲食盐水、白蛋白注射溶液、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇等。这些可单独使用或混合两种以上来使用。另外，可视需要添加抗氧化剂、缓冲液及/或抑菌剂等其他普通添加剂来使用，还可加添稀释剂、分散剂、表面活性剂、结合剂、润滑剂等而制剂化成如水溶液、悬浮液、乳浊液等的注射用剂型、丸剂、胶囊、颗粒或片剂等来使用。

另外，本发明的药物组合物可包含在药学上有效的量的人参皂苷F2。在本发明中，术语“在药学上有效的量”是指足以按照可应用于医学治疗的合理的受益/危险比例治疗疾病的量，通常每天可分1次至数次投用如下量：0.001至1000mg/kg，优选为0.05至200mg/kg，更优选为0.1至100mg/kg。然而，根据本发明的目的，针对特定患者的具体治疗有效量优选为按照所要达成的反应的类型及程度、不同情况下是否使用其他制剂等具体组合物、患者的年龄、体重、一般健康状态、性别及食疗、投用时间、投用路径及组合物的分泌率、治疗期间、与具体组合物一起使用或同时使用的药物等各种因子与在医学领域中公开的类似因子来采用不同的应用方式。

本发明的药物组合物可作为单个治疗剂来投用，或者可与其他治疗剂并用，也可与以往的治疗剂依次投用或同时投用。另外，可单一投用或多重投用。重要的是考虑所述要素而投用既不诱发副作用也能够以最少的量获得最大效果的量，这可由本领域技术人员容易地决定。

本发明中所使用的术语“投用”是指采用某种适当的方法向患者导入本发明的药物组合物，只要可到达靶组织则本发明的组合物的投用路径可为口服或非口服的各种路径。

本发明的药物组合物的投用方式并无特别限制，可采用在本技术领域中普遍使用的方法。作为所述投用方式的非限制性的例，可采用口服或非口服方式投用组合物。本发明的药物组合物可与投用方式对应地制备成各种剂型。

本发明的组合物的投用频度并无特别限制，可一天投用一次或分量投用多次。

作为又一实施方式，本发明提供一种包含向肝病疑似个体投用所述组合物的步骤的肝病预防或治疗方法。作为一例，提供一种包含向除人类以外的肝病疑似个体投用所述组合物的步骤的肝病预防或治疗方法。

人参皂苷F2及肝病与上述内容相同。

本发明中所使用的术语“个体”可指包含已诱发肝病或存在发病可能性的人类在内的所有动物。所述动物不仅为人类，而且还可为需要治疗与此类似的症状的牛、马、绵羊、猪、山羊、骆驼、羚羊、狗、猫等哺乳动物，但并不限制于此。

具体而言，本发明的所述预防或治疗方法可包含以在药学上有效的量向已诱发肝病或存在发病危险的个体投用所述组合物的步骤。

作为又一实施方式，本发明提供一种包含人参皂苷F2的肝病预防或改善用健康功能食品。

人参皂苷F2及肝病与上述内容相同。

所述人参皂苷F2是可从人参、白参、山参中提取的天然物质，其稳定性在长期使用过程中得到认可，因此可制备成既可日常服用又可预防或改善肝病的食品形态来摄取。

*49健康功能食品(functionalfood)是与特定保健用食品(foodforspecialhealthuse，FoSHU)相同的术语，指除供给营养以外还可有效地呈现生物体调节功能的医学、医疗效果明显的食品，为了获得有利于肝病的预防或改善的效果，所述食品可制备成片剂、胶囊、粉末、颗粒、口服液、丸剂等各种形态。

本发明的食品组合物还可包含在食品学上可容许的载体。

可添加本发明的包含人参皂苷F2的组合物的食品种类并无特别限制，例如有各种饮料、口香糖、茶、维生素复合剂、健康辅助食品类等。在所述食品组合物中可添加不妨碍肝病的预防或改善效果的其他成分，其种类并无特别限制。例如，可像普通的食品一样含有各种生药提取物、在食品学上可容许的食品辅助添加剂或天然碳水化物等作为补充成分。

所述食品辅助添加剂是在制备各种剂型的健康功能食品时添加的添加剂，可由本领域技术人员适当地选择使用。例如，包含各种营养剂、维生素、矿物质(电解质)、合成调味剂及天然调味剂等调味剂、着色剂及填充剂、果胶酸及其盐、褐藻酸及其盐、有机酸、保护性凝胶增粘剂、pH值调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、酒精、使用在碳酸饮料中的碳酸化剂等，但其种类并不限制于所述例。

此时，包含在所述食品的提取物的含量并无特别限制，但可相对于食品组合物的总重量而包含0.01至100重量％，更优选为包含1至80重量％。

在食品为饮料的情况下，能够以100Ml为基准而按照1至30g的比例包含，优选为按照3至20g的比例包含。另外，所述组合物可包含通常使用在食品组合物中而可提升气味、味道、视觉效果等的补充成分。例如，可包含维生素A、维生素C、维生素D、维生素E、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、烟酸(niacin)、生物素(biotin)、叶酸(folate)、泛酸(panthotenicacid)等。另外，可包含锌(Zn)、铁(Fe)、钙(Ca)、铬(Cr)、镁(Mg)、锰(Mn)、铜(Cu)等矿物质。另外，可包含赖氨酸、色氨酸、半胱氨酸、缬氨酸等氨基酸。另外，可添加防腐剂(山梨酸钾、苯甲酸钠、水杨酸、脱氢乙酸钠等)、杀菌剂(漂白粉及高度漂白粉、次氯酸钠等)、防氧化剂(丁基羟基茴香醚(BHA)、二丁基羟基甲苯(BHT)等)、着色剂(煤焦油色素等)、固色剂(亚硝酸钠、亚醋酸钠等)、漂白剂(亚硫酸钠)、调料(MSG谷氨酸钠等)、甜味剂(甘素、甜蜜素、糖精、钠等)、香料(香草醛、内酯类等)、膨胀剂(明矾、D-酒石酸钾等)、强化剂、乳化剂、增粘剂(糊料)、覆膜剂、添加剂、泡沫抑制剂、溶剂、改良剂等食品添加物(foodadditives)。根据食品的种类选择所述添加物，并适量使用。

本发明的健康功能食品可通过在本技术领域中常用的方法来制备，在制备所述健康功能食品时，可添加在本技术领域中普遍添加的原料及成分来制备。另外，其与普通的药物不同地以食品为原料，具有不存在因长期服用药物引起的副作用等的优点，且便携性优异。

作为又一实施方式，本发明提供提供一种包含人参皂苷F2的用以预防或改善肝病的饲料用组合物。

人参皂苷F2及肝病与上述内容相同。

所述饲料用组合物可包含饲料添加剂。本发明的饲料添加剂为饲料管理法中所规定的辅助饲料。

在本发明中，术语“饲料”可指供动物食用、摄取及消化或适当的任一天然规定餐或人工规定餐、一顿餐等或者所述一顿餐的成分。

所述饲料的种类并无特别限制，可使用本技术领域中普遍使用的饲料。作为所述饲料的非限制性的例，可列举如谷物类、根果类、食品加工副产物类、藻类、纤维质类、制药副产物类、油脂类、淀粉类、瓢类或谷物副产物类等的植物性饲料；如蛋白质类、无机物类、乳脂类、矿物性类、油脂类、单细胞蛋白质类、动物性浮游生物类或食物等的动物性饲料。其等可单独使用或混合两种以上来使用。

[发明的效果]

本发明的包含人参皂苷F2的药物组合物抑制在肝内形成及堆积脂肪，增加抑制炎症细胞的活性的调节性T细胞的分布，在调节性T细胞中增加抗炎性细胞因子IL-10的表达，抑制从纯真T细胞分化成炎症诱发细胞Th17细胞，从而可有效地治疗各种肝病。

附图说明

图1表示人参皂苷F2表现出预防或治疗肝病的效果的机制。以平均±SEM表示统计值，与对应的对照组进行比较而以*P＜0.05、**P＜0.01表示显著性(以下相同)。

图2表示通过人参皂苷F2处理进行的血清分析(ALT、AST、TG、总胆固醇含量)结果。

图3a至图3c表示通过人参皂苷F2处理引起的肝组织的组织学变化。

图4a至图4c表示通过人参皂苷F2处理引起的肝细胞及肝星状细胞的脂肪合成相关指标(SREBP1c、FAS、CB1R、DAGL-α、DAGL-β、FAAH、pAMPK等)的变化。

图5a至图5g表示经确认的通过人参皂苷F2处理产生的肝细胞、肝星状细胞中的脂肪合成抑制效果及其脂肪合成抑制机制。

图6a至图6e表示通过增加人参皂苷F2的调节性T细胞产生的肝脏炎性变化的抑制效果。

图7a至图7c表示通过人参皂苷F2的处理产生的从纯真T细胞向生产IL-17的Th17细胞的分化抑制效果。

图8a至图8h表示在缺乏IL-10的老鼠中，人参皂苷F2的肝脏保护效果消失。

具体实施方式

以下，根据下述例，详细地对本发明进行说明。然而，下述例仅用于例示本发明，本发明的范围并不限制于下述例。

实施例1.缓解因酒精所致的肝损伤及抑制脂肪肝形成的效果

对8周大的雄鼠(重量为25～28g)正常供食两周，与此同时在3g/kg的乙醇中溶解50mg/kg的人参皂苷F2(附图中以GF2表示)而在每天下午3-4点左右以口服形式投用给雄鼠，在两周后使雄鼠死亡而进行下述实验。

人参皂苷F2的制备方法如下。将包含高丽人参、花旗参、竹节参在内的其他人参的叶及根放入到20倍体积的80％酒精中，提取2次以上并进行干燥而获得粗皂苷。将所述粗皂苷再次溶解于水，并使其吸附到HP-20树脂后，使用100％水来进行清洗而去除糖，之后使用40％酒精来进行一次清洗而优先去除作为原人参三醇(protopanaxatriol)系的人参皂苷Re与Rg1。此后，如果使用80％酒精来进行清洗，则溶出作为原人参二醇(protopanaxadiol)系的人参皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd，对其干燥而获得所述人参皂苷F2。将所述原人参二醇人参皂苷混合物用作基质，按照韩国公开专利第2013-0134930号中记载的方法进行反应而获得70％以上的人参皂苷F2。此后，如果使用ODS树脂吸附将用作试样的人参皂苷F2后，按照浓度梯度连续滴加适当的浓度的酒精，则可获得纯度高至95％以上的人参皂苷F2，对其进行干燥后使用。

(1)血清内的ALT、AST、TG、总胆固醇含量的测定

从所述老鼠的腹部大动脉采集血液，使用离心分离机在3,300rpm下进行10分钟的离心分离而仅分离血清，使用艾狄斯实验室(IDEXXLaboratories，美国)公司的试剂盒，按照试剂盒制造公司所提供的实验方法，通过生化分析仪(VetTEST，IDEXX，美国)测定血清内的ALT(alanineaminotransferase)、AST(alanineaminotransferase)含量。另外，按照以下方式测定中性脂肪(triglyceride，TG)及总胆固醇含量：从肝组织中摘除50mg进行粉碎后，添加氯仿-甲醇(2∶1)溶液而进行离心分离，使用艾狄斯实验室的试剂盒，按照由试剂盒制备公司所提供的实验方法，通过生化分析仪测定提取肝组织内所含的脂质成分而制备的提取液。

其结果，如图2(a)所示，确认到当投用酒精与载体(EtOH+Vehicle)时，作为肝损伤指标的ALT增加两倍以上，而当投用酒精与人参皂苷(EtOH+GF2)时，ALT的增加率并不高。另外，如图2(b)所示，因投用人参皂苷而AST数值也减少。

另外，如图2(c)所示，当同时投用酒精与人参皂苷(EtOH+GF2)时，作为脂肪肝指标之一的TG的等级也降至正常数值，呈现出与ALT相似的趋向。

(2)肝组织分析

进行用于观察肝组织的组织学变化的苏木精与伊红(H&E，Hematoxylinandeosin)染色及用于确认细胞凋亡的脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL，TerminaldeoxyribonucleotidyltransferasemediateddUTPnickendlabeling)染色。使用细胞凋亡(apoptosis)染色(TAKARABIOINC,Shiga,Japan)，按照由制造公司所提供的实验方法进行所述TUNEL染色。另外，通过油红O(Oil-redO)染色对肝细胞的中性脂质进行染色。将结果以x200或x400的倍率示于图3a。

其结果，如图3a所示，确认到当投用人参皂苷F2时，因投用乙醇所产生的炎症减少(H％E染色)，细胞损伤也因投用人参皂苷F2而减少(TUNEL染色)。确认到中性脂质的堆积也因投用人参皂苷F2而减少(油红O染色)。

图3b是对图3a中的在TUNEL中表现为阳性的细胞进行数值化而进行统计分析的图，根据图3b确认到投用人参皂苷F2结果，因投用酒精而在NUNEL中表现为阳性的凋亡细胞明显减少。图3c是对图3a的中性脂质进行数值化而进行统计分析的图，根据图3a确认到当投用人参皂苷F2时，肝组织中的中性脂肪减少。

(3)肝细胞及肝星状细胞的脂肪合成相关指标的分析

在摄入过量的酒精的情况下，作为内源性大麻素(endocannabinoid)之一的2-花生四烯酸甘油(2-arachidonoylglycerol，2-AG)在肝内增加，其激活作为肝细胞的2-花生四烯酸甘油受体的内源性大麻素受体(CB1R)而增加核激素受体ERRγ的表达。另外，所增加的ERRγ与CYP2E1的转录调节部位直接结合而增加CYP2E1的表达，这会增加活性氧而最终诱发肝损伤(KimDKetal.，Gut.2013Jul；62(7):1044-54)。

如图4a所示，在向从老鼠的肝脏中分离出的肝细胞投用酒精与载体(EtOH+Vehicle)的情况下，作为肝损伤相关因子的CYP2e1、ADH1、CB1R、SREBP1c、FAS的表达增加，但在投用人参皂苷(EtOH+GF2)的情况下，所述因子的表达显著减少。尤其，确认到当投用人参皂苷F2时，SREBP1c与FAS的表达减少，所述SREBP1c与FAS是用于调节在肝脏内堆积脂肪的路径的转录因子，被认为在肝细胞内的脂肪合成中发挥重要作用的CB1R的表达也同样减少。

另外，如图4b所示，在向从老鼠的肝脏中分离出的肝星状细胞投用酒精与载体(EtOH+Vehicle)的情况下，作为肝损伤相关因子的NAPE-PLD、DAGL-α、DAGL-β、MGL的表达增加，FAAH的表达减少，但在投用人参皂苷(EtOH+GF2)的情况下，尤其用于诱导脂肪合成的内源性大麻素合成酶DAGL-α、DAGL-β的表达显著减少，脂肪酸水解(FattyAcidAmideHydrolase，FAAH)酶则显著增加。

图4c表示从肝组织提取蛋白质而进行蛋白质印迹法的结果。可见，当投用人参皂苷F2时，诱发脂肪氧化的pAMPK的表达增加，与脂肪合成相关的SREBP1c、FAS的表达减少。

由此可见，本发明的人参皂苷F2具有调节肝内脂肪的代谢而抑制脂肪肝的形成，缓解肝损伤的效果。

实施例2.对经共同培养的肝细胞及肝星状细胞进行的实验

(1)肝细胞、肝星状细胞的脂肪合成抑制

如图5a所示的示意图，在分离老鼠的肝细胞与肝星状细胞后，在下侧底面放置肝星状细胞(HSC)且在上侧放置肝细胞(hepatocyte)的状态下，实施共同培养。在进行培养时，将乙醇按照100mM处理12小时后，以6小时或12小时进行30μM的人参皂苷F2处理。

图5b表示回收共同培养的肝细胞而进行蛋白质印迹法的结果。与仅利用乙醇进行处理的肝细胞不同地，在同时利用人参皂苷F2进行处理的情况下，减少脂肪的pAMPK的表达增加，相反地，合成脂肪的SREBP1c、FAS的表达减少。

图5c是共同培养的肝细胞的实时(real-time)PCR结果，在利用人参皂苷F2进行处理的情况下，在脂肪合成中发挥重要作用的CB1R、SREBP1c及FAS的表达减少。在共同培养的肝星状细胞的情况下，在利用人参皂苷F2进行处理时，诱导脂肪合成的内源性大麻素合成酶DAGL-α、DAGL-β的表达减少(图5d)。

(2)抑制LXR脂肪合成及内源性大麻素产生

为了确认人参皂苷F2的脂肪合成抑制机制，利用30μM的人参皂苷F2对人类肝细胞株HepG2A进行处理，在经过30分钟后，利用10μM的作为诱导脂肪合成的物质的TO901317进行补充处理，所述TO901317是作为刺激脂肪生成的蛋白质的LXR的激动剂(agonist)，之后培养9小时。此后，对肝细胞进行实时PCR，结果确认到人参皂苷F2抑制因TO901317而增加的脂肪合成基因SREBP1c与FAS的表达(图5e)。

另外，分别利用0至100μM的浓度的人参皂苷F2对HepG2A进行处理并培养12小时，结果SREBP1c、FAS的表达减少，尤其在40μM以上时表现出优异的表达抑制效果(图5f)。

利用30μM的人参皂苷F2对肝星状细胞进行处理，在经过30分钟后，利用10μM的TO901317进行补充处理，之后培养12小时。图5f及图5g表示对所培养的肝星状细胞进行实时PCR并进行蛋白质印迹法的结果。其结果，当利用诱导脂肪的合成的物质TO901317进行处理时，作为谷氨酸盐受体的mGluR1或mGluR5几乎未表达，但利用人参皂苷F2进行处理的结果，mGluR1或mGluR5的表达显著。

由此可见，本发明的人参皂苷F2在肝细胞、肝星状细胞中抑制脂肪合成的效果优异，确认到这一效果是通过如下机制实现：人参皂苷F2抑制酒精性内源性大麻素的产生，降低相邻的肝细胞内的CB1R信号传递，由此抑制在肝内形成脂肪。

实施例3.通过增加调节性T细胞实现的肝脏炎性变化的抑制效果

对老鼠正常供食两周，与此同时按照3g/kg向每一个体投用两周。此时，对第一组(E+Veh)投用载体，对第二组(E+GF2)投用人参皂苷F2。

此后，从肝脏分离单核球细胞，利用巨噬细胞的标记CD11b、F4/80染色而进行流式细胞分析，结果确认到当利用人参皂苷F2进行处理时，巨噬细胞的比例减少(图6a)，利用嗜中性粒细胞的标记CD11b、Gr-1染色而进行流式细胞分析，结果确认到当利用人参皂苷F2进行处理时，嗜中性粒细胞的比例减少(图6b)。巨噬细胞及嗜中性粒细胞是与炎症反应密切相关的细胞，由此可知，人参皂苷F2在肝细胞中可缓解炎症反应。

另外，利用调节性T细胞(Treg)的标记CD4、CD25、Foxp3对肝内炎症细胞染色，结果当利用人参皂苷F2进行处理时，调节性T细胞增加，作为加速炎症的细胞之一的Th17细胞(IL-17及CD4阳性)因人参皂苷F2而减少。然而，如图6c所示，确认到人参皂苷F2未对CD4、CD8T细胞、NK细胞、NKT细胞等的比例产生显著影响。

*95另外，以所述分离的单核球为对象进行实时PCR，结果确认到人参皂苷F2抑制因酒精而增加的炎性细胞因子TNF-α、IL-6、IL-17的表达，增加抗炎性细胞因子IL-10的表达(图6d)。在对老鼠的血清进行ELISA的结果中也同样地出现这种效果(图6e)。

因此，确认到本发明的人参皂苷F2在酒精性肝炎中增加抑制如巨噬细胞或嗜中性粒细胞的炎症细胞的活性的调节性T细胞的分布，在调节性T细胞中增加抗炎性细胞因子IL-10的表达，由此缓解肝炎。因此，人参皂苷F2可用作肝病预防或治疗用途。

实施例4.抑制纯真T细胞向生产IL-17的Th17细胞的分化的效果

从老鼠中分离纯真T细胞(naiveTcell)而利用5ng/ml的TGF-β1、20ng/ml的IL-6进行处理，在涂敷有CD3/28抗体的器皿中培养3.5天而分化为作为炎症诱发细胞的Th17细胞(Thelper17cell)。此时，还同时利用各种浓度(0至30μM)的人参皂苷F2进行处理，将观察Th17细胞的标记的结果示于图7a至图7c。N表示均未利用TGF-β1、IL-6、人参皂苷F2进行处理的纯真T细胞。

图7a及图7b是对经分化的纯真T细胞进行FACS分析的结果，由此可见，依赖于人参皂苷F2的浓度而表达IL-17的Th17细胞减少，相反地，抗炎性细胞因子IL-10呈依赖于人参皂苷F2的浓度而增加的倾向。

另外，对所述经分化的细胞进行实时PCR分析，结果如图7c所示，作为不增加中性脂肪且仅选择性地减少HDL胆固醇的蛋白质的Abca1的表达依赖于人参皂苷F2的浓度而减少，Th17细胞的转录因子RORγt(RORgammat)、STAT3也因利用人参皂苷F2进行处理而减少。

由此可知，本发明的人参皂苷F2抑制纯真T细胞向作为炎症诱发细胞的Th17细胞分化，由此缓解因除酒精以外的原因所致的肝炎，从而可用作肝病治疗用途。

实施例5.GF2在缺乏IL-10的老鼠中发挥的肝脏保护效果的消失

对8周大的缺乏IL-10的雄鼠(重量为25～28g)正常供食两周，与此同时在3g/kg的乙醇中溶解50mg/kg的人参皂苷F2而以口服形式投用给雄鼠(E+GF2)。向对照组投用同量的乙醇与载体来替代人参皂苷F2(E+Veh)。两周后，尸检老鼠而获得血清、肝组织、肝单核球。此后，与实施例1.(1)中所记载的方法相同地测定血清内ALT、AST、TG、胆固醇，对肝组织观察坏死的坏死灶(necroticfoci)，在分离成两个的肝中计算坏死的坏死灶的数量。对于肝单核球，利用F4/80或Gr1抗原标记，对巨噬细胞及嗜中性粒细胞的表达程度进行流式细胞分析。

其结果，即便对缺乏IL-10的老鼠投用人参皂苷F2，也未对ALT、TG、胆固醇量等产生显著影响(图8a)，肝组织的坏死部分(necroticfoci)也未大幅改变(图8b及图8c)。另外，在巨噬细胞与嗜中性粒细胞的表达(图8d及图8e)及其他免疫细胞(图8f)中，人参皂苷F2未产生显著影响。

然而，表示CD4+CD25+Foxp3+的调节性T细胞在投用人参皂苷F2的组中表现出增加趋势(图8g)，并利用单核球进行实时PCR，结果如图8h所示，在投用人参皂苷F2的组中，不仅IL-6、IL-17等炎性细胞因子的表达增加，而且Foxp3的表达也一同增加。

由此可见，在缺乏IL-10的老鼠中，人参皂苷F2几乎未表现出肝脏保护效果，从而可推断出人参皂苷F2是通过增加调节性T细胞(Treg)与抗炎性细胞因子IL-10的生产的过程而表现出肝脏保护效果。

另一方面，对所述实施例进行的统计以平均±SEM表示，与对应的对照组进行比较而以*P＜0.05、**P＜0.01表示显著性。

根据上述说明，本发明所属技术领域内的技术人员应理解，本发明可不变更其技术思想或必要特征而通过其他具体方式实施。与此相关，应理解为以上所述的实施例在所有方面均为示例性的实施例，并非为限定性实施例。应解释为本发明的范围并不限定于在以上详细进行说明的内容，从权利要求书的含义、范围及其等效概念导出的所有变更或变形方式均包含在本发明的范围内。

Claims

1.一种人参皂苷F2的用途，其用于制备用以预防或治疗酒精性肝病的药物。

2.根据权利要求1所述的人参皂苷F2的用途，其中所述肝病选自由肝炎、肝硬化、脂肪肝、肝功能不全及肝癌所构成的群组。

3.根据权利要求1所述的人参皂苷F2的用途，其中所述人参皂苷F2抑制在肝内堆积脂肪。

4.根据权利要求1所述的人参皂苷F2的用途，其中所述人参皂苷F2增加调节性T细胞(Treg)的分布而抑制肝的炎症。

5.根据权利要求1所述的人参皂苷F2的用途，其中所述人参皂苷F2增加抗炎性细胞因子IL-10的表达。

6.根据权利要求1所述的人参皂苷F2的用途，其中所述人参皂苷F2抑制纯真T细胞(NaiveTcell)向Th17细胞分化。

7.根据权利要求1所述的人参皂苷F2的用途，其中所述人参皂苷F2抑制LXR(liverXreceptor)的活性。

8.一种人参皂苷F2的用途，其用于制备用以预防或改善酒精性肝病的健康功能食品。

9.一种人参皂苷F2的用途，其用于制备用以预防或改善酒精性肝病的饲料。