KR20160029894A - 진세노사이드 f2의 간 질환 예방 또는 치료 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 진세노사이드 F2의 간 질환 예방, 개선 또는 치료 용도, 및 이를 이용한 약학 조성물, 건강기능식품, 사료용 조성물에 관한 것으로, 진세노사이드 F2는 간에서의 지방 형성 및 축적을 억제하며, 염증세포의 활성을 억제하는 조절 T 세포의 분포를 증가시켜 간염을 보호하고, 조절 T 세포에서 항염증성 싸이토카인인 IL-10의 발현을 증가시키며, 미접촉 T세포에서 Th17 세포로의 분화를 억제하여, 효과적으로 다양한 간 질환을 치료할 수 있다.

Description

진세노사이드 F2의 간 질환 예방 또는 치료 용도 {Use of ginsenoside F2 for prophylaxis and treatment of liver disease}

본 발명은 진세노사이드 F2의 간 질환 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물, 건강기능식품, 및 사료 조성물에 관한 것이다.

알코올성 간 질환은 임상증상에 따라 알코올성 지방간, 알코올성 간염, 알코올성 간경변증으로 크게 나눌 수 있고 개인별로 유전적인 특징, 성별에 따라 차이가 있지만, 하루 80g 이상의 알코올의 섭취를 하는 경우 간질환이 발생할 가능성이 높다고 알려져 있다.

특히 알코올성 지방간이란 알코올의 대사 결과 지방산이 과량 생성되어 지방이 간에 축적되어 발생하는 것으로, 간에서 축적된 지질이 차지하는 무게 비중이 5% 이상일 때 지방간으로 정의된다. 대부분 축적되는 지질의 종류는 중성지방(triglyceride)이다.

알코올성 지방간의 원인으로는 여러 가지가 알려져 있다. 첫째로, 알코올이 대사되는 과정에서 발생되는 과량의 수소(NADH)가 원인이 되어 간 내에서 지방산의 산화 감소, 지방산 농도 증가 등에 의해 중성지방이 축적되어 발생할 수 있다. 또한, 알코올대사 중에 생성되는 유해한 중간생성 물질인 아세트알데히드가 세포내의 단백질과 결합하여 단백질의 간 외로 배출 통로를 차단하고, 또한 지질과산화를 유도하여 세포막을 손상시켜 지단백질의 간 외로의 배출을 차단함으로서 간 내의 중성지방이 축적될 수 있다. 알코올 섭취에 의해서 간 내의 지방축적은 간질환(간염, 간경화, 간암)으로의 이행에 있어 아주 중요한 초기 증상으로 인정되고 있다.

알코올성 지방간을 억제할 수 있는 물질로는 글루타치온(glutathione), 2-메캅토프로피오일글리신(2-mecaptopropioylglycine), 3-아미노-1,2,4-트리아졸(3-amino-1,2,4-triazole), N,N'-디페닐-p-페닐렌디아민(N,N'-diphenyl-p-phenylenediamine) 등의 항산화활성이 있는 물질과, S-아데노실-L-메치오닌(S-adenosyl-L-Methionine), 베타인(betaine) 등 인지질 및 글루타치온 합성 촉진 물질, L-글리신(L-glycine), L-시스테인(L-cysteine) 등 알코올대사를 촉진하는 물질 등이 알려져 있다(한국공개특허 제2012-0138392호). 그러나 부작용이 없으면서도 효과가 뛰어난 알코올성 간 질환 치료제가 여전히 요구되고 있다.

한편, 진세노사이드 F2는 유방암 줄기세포(CSCs)에서 자가소화(autophagy)와 함께 세포사멸을 유도하여 유방암에서 항암 효과를 나타내며(Mai TT et al. 2012; 28;321 (2):144-53), SD 래트의 제노그래프트 모델에서 진세노사이드 F2가 교모세포종에 대하여 항암효과를 나타낸다는 것이 보고된 바 있다(Shin JY et al. 2012; 36(1):86-92). 또한, 진세노사이드 F2를 주름개선, 피부미백 또는 여드름 개선용 화장료 조성물로 사용할 수 있음이 알려져 있다(한국공개특허 2014-0013795). 그러나 진세노사이드 F2의 간 질환 치료 효과에 대해서는 밝혀지지 않았다.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 간 질환을 치료하기 위한 방법을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 인삼에서 추출할 수 있는 진세노사이드 F2가 알코올 매개 간 손상을 보호할 뿐만 아니라, 간 내 중성지방 형성, 축적 및 염증을 억제하여 다양한 알콜성 또는 비알콜성 간 질환 예방 또는 치료용도로 사용할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 진세노사이드 F2를 포함하는 간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 진세노사이드 F2를 포함하는 알코올성 간 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 진세노사이드 F2를 포함하는 간 질환 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 간 질환의 치료방법을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하나의 양태로서 진세노사이드 F2를 포함하는 간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

진세노사이드 F2는 하기 화학식 1로 표시되는 4환계 PPD (protopanaxadiol) 사포닌으로, 메이저 사포닌에 비하여 상대적으로 흡수 및 약효가 뛰어난 마이너 사포닌의 일종이다.

[화학식 1]

본 발명에서 진세노사이드 F2는 상업적으로 판매되는 것을 구입하거나 또는 자연계에서 재배 또는 채취한 인삼으로부터 분리, 또는 분리된 진세노사이드로부터 전환한 것을 사용할 수 있다. 또는 합성방법에 의해 합성된 진세노사이드 F2를 사용할 수 있으나, 본 발명의 간 질환 예방 또는 치료 효과를 나타내는 진세노사이드 F2라면 제한없이 사용할 수 있다.

상기 간 질환은 일 예로, 간염, 간경변, 지방간, 간부전, 및 간암을 포함하는 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

간염은 간세포 및 간 조직의 염증을 의미하며, 만성 간염에 의하여 장기간에 걸쳐 간세포가 파괴되고 재생하는 과정이 반복되면 간에 섬유조직과 재생 결절이 증가하여 간경변 또는 간경화가 진행될 수 있다. 간경변이 일정 수준 이상으로 진행되면, 간성뇌증 (Hepatic encephalopathy), 식도정맥류 (Esophageal varix) 등의 합병증을 유발할 수 있다.

지방간(fatty liver)은 정상 간에서 지방이 차지하는 비율(5%)보다 많은 양의 지방이 간에 축적된 것을 의미한다. 상기 지방간은 알코올성 지방간, 또는 비만, 당뇨병, 고지혈증 또는 약물 등으로 인한 비알코올성 지방간일 수 있다.

간부전은 간의 합성 및 해독 기능이 저하된 상태로, 간염과 간경변이 혼재되면서 나타난다.

상기 간 질환은 AST, ALT, ALP, GGT, 또는 빌리루빈(Bilirubin)을 통하여 진단되는 질환일 수 있다.

본 발명자들은 진세노사이드 F2가, 지방 생산을 자극하는 단백질인 LXR(liver X receptor)의 효능제(agonist)인 TO901317에 의해 증가된 지방합성 유전자인 SREBP1c와 FAS의 발현을 간세포주에서 억제함을 확인하였다(실시예 2, 도 5e, 5f 내지 도 5g). 따라서, 진세노사이드 F2는 간세포, 간성상 세포에서 지방 합성을 억제하는 효과가 우수하며, 구체적으로 진세노사이드 F2가 알코올 매개 엔도카나비노이드 발생을 억제하여 인접한 간세포 내의 CB1R 신호전달을 저하시킴으로써 간에서의 지방형성을 억제함을 확인하였다. 따라서 본 발명의 진세노사이드 F2를 포함하는 약학 조성물은 간 지방 형성으로 인한 비알코올성 및 알코올성 간 질환을 효과적으로 예방, 치료할 수 있다.

상기 간 질환은 다른 일 예로, 알코올성 간 질환일 수 있다. 상기 알코올성 간 질환은 과다한 음주로 인해 발생하는 간질환을 의미한다.

알코올성 간염은 지나친 알코올의 섭취로 인하여 산화성 스트레스 및 각종 염증 매개물질(TNF, proinflammatory cytokine, IL-1β, IL-6, IL-8)이 증가하며 이에 따른 반응성 대사산물과 산소종(oxygen species)이 만들어져 간세포의 방어기전에 영향을 주게 된다. 이로 인하여 정상적인 간재생기전이 손상되어 간독성이 발생 하는 것으로 보고되고 있다(McClain CJ 외, Semin Liver Dis 1999;19:205-219).

알코올성 지방간(NAFLD)은 과음으로 인해 중성지방이 간 조직에 축적되는 질환으로, 알코올은 당대사와 지방대사에 영향을 미쳐 간세포의 NADH/NAD+ 비율과 지방 합성에 필요한 전구체 증가를 유도하여 중성지방의 합성은 증가시키고 분해는 감소시키며(Neuman MG 외, Exp Mol Pathol 95: 376-384), 과잉 생산된 아세트알데히드는 간세포의 주요 단백질과 지질의 기능을 약화시켜 단백질 합성 감소와 중성지질 축적을 유도하며 간세포 손상을 일으킨다고 알려져 있다(Reuben A. 2008. Curr Opin Gastroenterol 24: 328-338). 지속적으로 알코올에 노출 시, 지방간은 간염, 간경변증, 간암으로 발전하기도 한다.

본 발명자들은 진세노사이드 F2가 알코올로 인하여 증가된 혈청 내 ALT, AST 수치를 감소시킴을 혈청 분석을 통하여 확인하였고(실시예 1, 도 2), 에탄올 투여에 의하여 발생한 염증 및 세포 손상이 진세노사이드 F2에 의해 감소됨을 간 조직 염색을 통하여 확인하였다(도 3a, 도 3b).

또한, 진세노사이드 F2가 알코올 매개 간염에서 대식구 또는 호중구와 같은 염증세포의 활성을 억제하는 조절 T 세포(Treg)의 분포를 증가시켜 간염을 보호함을 확인하였으며(도 6a 및 도 6b), 알코올에 의하여 증가된 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-6, IL-17의 발현을 억제시키고 항염증 사이토카인인 IL-10의 발현은 증가시키는 것을 확인하였다(도 6d 및 도 6e). 나아가, 미접촉 T세포에서 IL-17을 발현하는 염증유발세포인 Th17 세포로의 분화를 억제함을 확인하였다(실시예 4, 도 7a 내지 도 7c).

따라서 진세노사이드 F2는 알코올에 의해 유발된 간 염증 및 이로 인한 간 손상을 완화할 수 있다.

나아가, 본 발명자들은 진세노사이드 F2가 알코올로 인하여 증가된 혈청 내 중성지질(TG), 총 콜레스테롤 함량을 감소시킴을 혈청 분석을 통하여 확인하였고(실시예 1, 도 2), 에탄올 투여에 의하여 증가된 간 조직에서 중성지질의 축적을 감소시킴을 간 조직 염색을 통하여 확인하였다(도 3a, 도 3c).

또한, 간세포 및 간성상세포에서 지방을 축적하는 경로를 조절하는 전사인자인 SREBP1c와 FAS, 간 세포내 지방 합성에 중요하다고 알려진 CB1R, 지방의 합성을 유도하는 엔도카나비노이드 합성효소 DAGL-α,β의 발현 증가를 억제하고, 지방산 가수분해 효소 FAAH, 지방의 산화를 유발하는 pAMPK의 발현의 감소를 저해함으로써(도 4a 내지 도 4c, 도 5b 내지 5d), 진세노사이드 F2가 간에서의 지방 형성 및 축적을 예방 또는 억제하여 간 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있음을 확인하였다.

따라서, 일 예로, 상기 진세노사이드 F2는 간에서의 지방 축적을 억제하는 것일 수 있으며, 상기 진세노사이드 F2는 조절 T 세포(Treg)의 분포를 증가시켜 간의 염증을 억제하는 것일 수 있다. 다른 일 예로, 상기 진세노사이드 F2는 항염증 사이토카인 IL-10의 발현을 증가시키는 것일 수 있다. 또한, 상기 진세노사이드 F2는 미접촉 T세포(Naive T cell)의 Th17 세포로의 분화를 억제하는 것일 수 있다. 또한, 상기 진세노사이드 F2는 LXR(liver X receptor)의 활성을 억제하는 것일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란, 본 발명에 따른 진세노사이드 F2를 개체에 투여하여 간 질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란, 본 발명의 상기 조성물을 간 질환 발병 의심 개체에 투여하여 간 질환의 증세가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 단일제제로도 사용할 수 있고, 공인된 간 질환 치료 효과를 가진다고 알려진 약물을 추가로 포함하여 복합제제로 제조하여 사용할 수 있으며, 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않으면서, 주입되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미할 수 있다. 본 발명에 사용 가능한 상기 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 약학적으로 허용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다. 또한, 필요한 경우 항산화제, 완충액 및/또는 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가하여 사용할 수 있으며, 희석제, 분산제, 계면 활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제 등으로 제제화하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양의 진세노사이드 F2를 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 일반적으로 0.001 내지 1000 mg/kg의 양, 바람직하게는 0.05 내지 200 mg/kg, 보다 바람직하게는 0.1 내지 100 mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여할 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용을 유발하지 않으면서 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물의 투여 방식은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방식에 따를 수 있다. 상기 투여 방식의 비제한적인 예로, 조성물을 경구 투여 또는 비경구 투여 방식으로 투여할 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 목적하는 투여 방식에 따라 다양한 제형으로 제작될 수 있다.

본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다.

본 발명은 또 하나의 양태로서, 상기 조성물을 간 질환 의심 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 간 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다. 일 예로, 상기 조성물을 인간을 제외한 간 질환 의심 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 간 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

진세노사이드 F2 및 간 질환은 상기에서 설명한 것과 같다.

본 발명에서 사용되는 용어, "개체"란, 간 질환이 발병되었거나 발병할 가능성이 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미할 수 있다. 상기 동물은 인간뿐만 아니라 이와 유사한 증상의 치료를 필요로 하는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 고양이 등의 포유동물일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 상기 예방 또는 치료 방법은 구체적으로, 간 질환이 발병하였거나 발병할 위험이 있는 개체에 상기 조성물을 약학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.

본 발명은 또 하나의 양태로서, 진세노사이드 F2를 포함하는 간 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

진세노사이드 F2 및 간 질환은 상기에서 설명한 것과 같다.

상기 진세노사이드 F2는 인삼, 백삼, 산삼 등에서 추출 가능한 천연 물질로서 오랫동안 사용되어 안정성이 입증되었으므로, 상식할 수 있으면서도 간 질환의 예방 또는 개선을 도모할 수 있는 식품의 형태로 제조되어 섭취할 수 있다.

건강기능식품(functional food)이란, 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)와 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미하는데, 상기 식품은 간 질환의 예방 또는 개선에 유용한 효과를 얻기 위하여 정제, 캡슐, 분말, 과립, 액상, 환 등의 다양한 형태로 제조될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 식품학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 진세노사이드 F2를 포함하는 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 종류에는 별다른 제한이 없으며, 예를 들어 각종 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있다. 상기 식품 조성물에는 간 질환의 예방 또는 개선 효과에 방해가 되지 않는 다른 성분을 추가할 수 있으며, 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 통상의 식품과 같이 여러 가지 생약 추출물, 식품학적으로 허용가능한 식품보조첨가제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상기 식품보조첨가제는 각 제형의 건강기능식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 예를 들어 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함되지만, 상기 예들에 의해 그 종류가 제한되는 것은 아니다.

이때, 상기 식품에 포함되는 추출물의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 식품 조성물의 총 중량에 대하여 0.01 내지 100 중량%, 보다 바람직하게는 1 내지 80 중량%로 포함될 수 있다.

식품이 음료인 경우에는 100㎖를 기준으로 1 내지 30g, 바람직하게는 3 내지 20g의 비율로 포함될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu) 등의 미네랄을 포함할 수 있다. 또한, 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다. 또한, 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 첨가할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용된다.

본 발명의 건강기능식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조 시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어날 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 진세노사이드 F2를 포함하는 간 질환의 예방 또는 개선을 위한 사료용 조성물을 제공한다.

진세노사이드 F2 및 간 질환은 상기에서 설명한 것과 같다.

상기 사료용 조성물은 사료 첨가제를 포함할 수 있다. 본 발명의 사료첨가제는 사료관리법상의 보조사료에 해당한다.

본 발명에서 용어, "사료"는 동물이 먹고, 섭취하며, 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공 규정식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분을 의미할 수 있다.

상기 사료의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 사료를 사용할 수 있다. 상기 사료의 비제한적인 예로는, 곡물류, 근과류, 식품 가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박류 또는 곡물 부산물류 등과 같은 식물성 사료; 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단세포 단백질류, 동물성 플랑크톤류 또는 음식물 등과 같은 동물성 사료를 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 진세노사이드 F2를 포함하는 약학 조성물은 간에서의 지방 형성 및 축적을 억제하며, 염증세포의 활성을 억제하는 조절 T 세포의 분포를 증가시키고, 조절 T 세포에서 항염증성 싸이토카인인 IL-10의 발현을 증가시키며, 미접촉 T세포에서 염증유발세포인 Th17세포로의 분화를 억제하여, 효과적으로 간 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

도 1은 진세노사이드 F2가 간 질환 예방 또는 치료 효과를 나타내는 기작을 나타낸 것이다. 통계값은 평균±SEM으로 표시하였으며, 대응되는 대조군과 비교하여 *P < 0.05, **P < 0.01 으로 유의성을 표시하였다(이하 동일).
도 2는 진세노사이드 F2 처리에 따른 혈청분석(ALT, AST, TG, 총 콜레스테롤 함량) 결과를 나타낸 것이다.
도 3a 내지 도 3c는 진세노사이드 F2 처리에 따른 간 조직의 조직학적 변화를 나타낸 것이다.
도 4a 내지 도 4c는 진세노사이드 F2 처리에 따른 간세포 및 간성상세포의 지방 합성 관련 지표(SREBP1c, FAS, CB1R, DAGL-α,β, FAAH, pAMPK 등)의 변화를 나타낸 것이다.
도 5a 내지 도 5g는 진세노사이드 F2 처리에 따른 간세포, 간성상세포에서의 지방 합성 억제 효과 및 그의 지방 합성억제 기전을 확인하여 나타낸 것이다.
도 6a 내지 도 6e는 진세노사이드 F2의 조절 T세포 증가 유도에 의한 간의 염증성 변화 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 7a 내지 도 7c는 진세노사이드 F2의 처리에 따른 미접촉 T세포에서의 IL-17 생산하는 Th17 세포로의 분화 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 8a 내지 도 8h는 IL-10 결핍 마우스에서 진세노사이드 F2의 간 보호효과가 소멸됨을 나타낸 것이다.

이하 본 발명을 하기 예에 의해 상세히 설명한다. 다만, 하기 예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 하기 예에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

실시예 1. 알코올에 의한 간 손상 완화 및 지방간 형성 억제 효과

8주령의 수컷 마우스(무게 25-28g)에게 2주 동안 정상식이와 함께 3g/kg의 에탄올에 50mg/kg의 진세노사이드 F2(도면에는 GF2로 표시)를 녹여 매일 오후 3-4시경 경구로 투여하고 2주 후 희생시켜 하기 실험을 진행하였다.

진세노사이드 F2의 제조방법은 다음과 같다. 고려인삼, 화기삼, 죽절삼을 포함한 여타 인삼의 잎 및 뿌리를 20배 체적의 80% 주정을 가하여 2회 이상 추출하고 건조하여 조사포닌을 획득한다. 상기 조사포닌을 물에 다시 용해시켜서 HP-20 수지에 흡착시킨 후, 물 100%로 세정하여 당을 제거시킨 후, 40% 주정으로 1차 세정을 하여 프로토파낙사트리올(protopanaxatriol) 계열인 진세노사이드 Re와 Rg1을 우선적으로 제거한다. 그 후, 80% 주정으로 세정을 하면 프로토파낙사디올(protopanaxadiol) 계열인 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd 가 용출되어 나오며, 이를 건조하여 획득한다. 상기 프로토파낙사디올 진세노사이드 혼합물을 기질로 이용하여 한국공개특허 제2013-0134930호에 기재된 방법에 따라 반응 시켜 70% 이상의 진세노사이드 F2를 획득하였다. 그 후에 시료용으로 사용할 진세노사이드 F2는 ODS 수지를 활용하여 흡착한 후, 적정 농도의 주정을 농도구배분으로 연속적으로 흘려보내면 95% 이상의 순도가 높은 진세노사이드 F2 분획을 얻을 수 있으며, 이를 건조 후 사용하였다.

(1) 혈청 내 ALT, AST, TG, 총 콜레스테롤 함량 측정

상기 마우스의 복부 대동맥에서 혈액을 채혈하여 원심분리기로 3,300 rpm에서 10분간 원심분리 후 혈청만 분리하여, 혈청 내 ALT(alanine aminotransferase), AST(alanine aminotransferase) 함량을 아이덱스 래버러토리(IDEXX Laboratories, 미국) 회사의 키트를 사용하여 제조회사에서 제공하는 실험방법에 따라 베트테스트(VetTEST, IDEXX, 미국)로 측정하였다. 또한 중성지방(triglyceride, TG) 및 총 콜레스테롤 함량은 간 조직 중 50mg을 적출하여 분쇄한 후, 클로로포름-메탄올 (2:1) 용액을 첨가하고 원심분리 하여, 간 조직 내 함유되어 있는 지질 성분을 추출하여 제조한 추출액을 아이덱스 래버러토리의 키트를 사용하여 제조회사에서 제공하는 실험방법에 따라 베트테스트로 측정하였다.

그 결과, 도 2의 (a)에 도시된 것과 같이, 간 손상의 지표인 ALT는 알코올과 담체(EtOH+Vehicle)를 투여하면 2배 이상 증가하나, 알코올과 함께 진세노사이드(EtOH+GF2)를 투여하면 ALT의 증가율이 높지 않음을 확인하였다. 또한 도 2의 (b)에 도시된 것과 같이, 진세노사이드 투여에 의해 AST 수치도 감소하였다.

또한, 도 2의 (c)에 도시된 것과 같이, 지방간염의 지표 중 하나인 TG 또한 알코올과 함께 진세노사이드(EtOH+GF2)를 투여하면 정상 수치까지 TG 레벨이 낮아져, ALT와 비슷한 경향을 보였다.

(2) 간 조직 분석

간 조직의 조직학적 변화를 관찰하기 위한 H&E(Hematoxylin and eosin) 염색 및 세포자멸사의 확인을 위한 TUNEL (Terminal deoxyribonucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling) 염색을 진행하였다. 상기 TUNEL 염색은 아폽토시스 염색(TAKARA BIO INC, Shiga, Japan)을 사용하여 제조회사에서 제공하는 실험방법에 의해 진행하였다. 또한, 오일-레드오(Oil-red O) 염색으로 간세포의 중성지질을 염색하였다. 결과는 도 3a에 x200 또는 x400의 배율로 나타내었다.

그 결과, 도 3a와 같이, 에탄올 투여에 의하여 발생한 염증이 진세노사이드 F2를 투여하면 감소하며(H&E 염색), 세포손상도 역시 진세노사이드 F2에 의하여 줄어듦을 확인하였다(TUNEL 염색). 중성지질의 축적 역시 진세노사이드 F2 투여에 의해 감소됨을 확인하였다(오일-레드오 염색).

도 3b는 도 3a에서 TUNEL 양성을 보이는 세포를 수치화하여 통계 분석한 것으로, 진세노사이드 F2를 투여한 결과 알코올 투여로 인하여 TUNEL 양성으로 나타나는 사멸 세포가 현저히 감소함을 확인하였다. 도 3c는 도 3a의 중성지질을 수치화하여 통계분석 한 것으로, 진세노사이드 F2를 투여했을 때 간 조직에서의 중성지방이 감소한 것을 확인하였다.

(3) 간세포 및 간성상세포의 지방 합성 관련 지표 분석

과도한 알코올을 섭취할 경우 간에서는 엔도카나비노이드(endocannabi noid) 중 하나인 2-아라키도노일 글리세롤(2-arachidonoylglycerol, 2-AG)이 증가되고, 이는 간세포의 2-아라키도노일 글리세롤의 수용체인 엔도카나비노이드 수용체(CB1R)를 활성화시켜 핵 호르몬 수용체 ERRγ의 발현을 증가시킨다. 또한 증가된 ERRγ는 CYP2E1의 전사조절부위에 직접 결합하여 CYP2E1의 발현을 증가시키고, 이는 활성산소의 증가로 이어져 결국 간 손상을 유발하게 된다(Kim DK et al., Gut. 2013 Jul;62(7):1044-54).

도 4a에 도시된 것과 같이, 마우스의 간에서 분리된 간세포에 대하여 알코올과 담체(EtOH+Vehicle)를 투여할 경우 간 손상과 관련된 인자인 CYP2e1, ADH1, CB1R, SREBP1c, FAS의 발현이 증가하였으나, 진세노사이드(EtOH+GF2)를 투여할 경우 상기 인자들의 발현이 유의하게 감소하였다. 특히, 간에서 지방을 축적하는 경로를 조절하는 전사인자인 SREBP1c와 FAS 의 발현이 진세노사이드 F2를 투여했을 때 감소하였으며, 간 세포내 지방 합성에 중요하다고 알려진 CB1R 발현 역시 줄어든 것을 확인하였다.

또한 도 4b에 도시된 것과 같이, 마우스의 간에서 분리된 간성상세포에 대하여 알코올과 담체(EtOH+Vehicle)를 투여할 경우 간 손상과 관련된 인자인 NAPE-PLD, DAGLα,β, MGL의 발현이 증가하고, FAAH의 발현이 감소하였으나, 진세노사이드(EtOH+GF2)를 투여할 경우 특히 지방의 합성을 유도하는 엔도카나비노이드 합성효소인 DAGL-α,β발현이 유의적으로 감소하였으며, 지방산 가수분해(Fatty Acid Amide Hydrolase, FAAH) 효소 또한 유의적으로 증가하였다.

도 4c는 간 조직에서 단백질을 추출하여 웨스턴 블롯을 시행한 결과를 나타낸 것이다. 진세노사이드 F2를 투여했을 때, 지방의 산화를 유발하는 pAMPK의 발현은 증가하고, 지방합성과 관련된 SREBP1c, FAS의 발현은 감소하는 것을 관찰할 수 있었다.

따라서 본 발명의 진세노사이드 F2가 간 내 지방의 대사를 조절하여 지방간의 형성을 억제하고 간 손상을 완화하는 효과가 있음을 확인하였다.

실시예 2. 공동배양된 간세포 및 간성상세포에서의 실험

(1) 간세포, 간성상세포에서의 지방 합성 억제

마우스에서 간세포와 간성상세포를 분리한 후, 도 5a에 도시된 모식도와 같이 아래쪽 바닥에 간성상세포(HSC)를 놓고 위 쪽에 간세포(hepatocyte)를 위치시킨 상태에서 공동배양을 실시하였다. 배양 시 에탄올 100mM을 12시간 동안 처리한 후 진세노사이드 F2 30 μM을 6시간 또는 12시간 동안 처리하였다.

도 5b는 공동배양한 간세포를 수거하여 웨스턴블롯을 시행한 결과를 나타낸 것이다. 에탄올만 처리한 간세포와 달리 진세노사이드 F2를 함께 처리할 경우, 지방을 감소시키는 pAMPK의 발현은 증가하였고, 반대로 지방을 합성하는 SREBP1c, FAS의 발현은 감소하였다.

도 5c는 공동배양한 간세포의 실시간(real-time) PCR 결과로, 진세노사이드 F2를 처리할 경우, 지방합성에 중요한 역할을 하는 CB1R, SREBP1c 및 FAS의 발현이 감소했다. 공동배양한 간성상세포의 경우 진세노사이드 F2를 처리했을 경우 지방합성을 유도하는 엔도카나비노이드 합성효소인 DAGL-α,β의 발현이 감소하였다(도 5d).

(2) LXR 매개 지방합성 및 엔도카나비노이드 생산의 억제

진세노사이드 F2의 지방 합성억제 기전을 확인하기 위하여, 인간 간세포주인 HepG2A에 진세노사이드 F2 30μM을 처리하고 30분 후 지방 생산을 자극하는 단백질인 LXR의 효능제(agonist)로서, 지방의 합성을 유도하는 물질인 TO901317 10μM을 추가로 처리한 후 9시간 동안 배양하였다. 그 후 간세포에 대하여 실시간 PCR을 진행한 결과, 진세노사이드 F2는 TO901317에 의해 증가된 지방합성 유전자인 SREBP1c와 FAS의 발현을 억제함을 확인하였다(도 5e).

또한, HepG2A에 진세노사이드 F2를 0 내지 100μM의 농도별로 처리하고 12시간 배양한 결과, SREBP1c, FAS 발현이 감소하였으며, 특히 40μM 이상에서 발현 억제 효과가 우수하게 나타났다(도 5f).

간성상세포에 진세노사이드 F2 30μM을 처리하고 30분 후 TO901317 10μM을 추가로 처리한 후 12시간 동안 배양하였다. 도 5f와 도 5g는 배양된 간성상세포에 대하여 실시간 PCR을 진행하고 웨스턴 블로팅을 진행한 결과를 나타낸 것이다. 그 결과, 지방의 합성을 유도하는 물질인 TO901317 처리 시 글루타메이트 수용체인 mGluR1 또는 5는 거의 발현되지 않았으나, 진세노사이드 F2를 처리한 결과 발현이 유의하게 증가되었음을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 진세노사이드 F2는 간세포, 간성상 세포에서 지방 합성을 억제하는 효과가 우수하며, 이는 진세노사이드 F2가 알코올 매개 엔도카나비노이드 발생을 억제하여 인접한 간세포 내의 CB1R 신호전달을 저하시킴으로써 간에서의 지방형성을 억제하는 기전에 의한 것임을 확인하였다.

실시예 3. 조절 T세포 증가에 의한 간의 염증성 변화 억제

마우스에 2주 동안 매일 정상식이와 함께 에탄올을 개체마다 3g/kg씩 2주 동안 급여하였다. 이 때 1그룹(E+Veh)은 담체를, 2그룹(E+GF2)은 진세노사이드 F2를 급여하였다.

그 후, 간에서 단핵구 세포를 분리하고 대식세포의 마커인 CD11b, F4/80로 염색하여 유세포분석을 시행한 결과, 진세노사이드 F2를 처리하면 대식세포의 비율이 감소하며(도 6a), 중성구의 마커인 CD11b, Gr-1를 염색하여 유세포분석을 시행한 결과, 진세노사이드 F2를 처리하면 중성구의 비율이 감소함을 확인하였다(도 6b). 대식세포와 중성구는 염증반응과 밀접한 관련이 있다고 알려진 세포로, 진세노사이드 F2가 간세포에서 염증반응을 완화시킬 가능성이 있음을 시사하는 것이다.

또한 간 내 염증세포들을, 조절 T세포(Treg)의 마커인 CD4, CD25, Foxp3 로 염색한 결과, 진세노사이드 F2를 처리하면 조절 T세포가 증가하였으며, 염증을 촉진하는 세포들 중 하나인 Th17 세포 (IL-17 및 CD4 양성)는 진세노사이드 F2에 의해 감소하였다. 그러나 도 6c에 도시된 것과 같이 CD4, CD8 T세포, NK세포, NKT세포 등의 비율에는 진세노사이드 F2가 유의한 영향을 미치지 않는 것을 확인했다.

또한, 상기 분리된 단핵구를 대상으로 실시간 PCR을 시행한 결과, 알코올에 의하여 증가된 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-6, IL-17의 발현을 진세노사이드 F2가 억제시키며 항염증 사이토카인인 IL-10의 발현은 증가시키는 것을 확인하였다(도 6d). 이러한 효과는 마우스의 혈청에 대하여 ELISA를 실시한 결과에서도 동일하게 나타났다(도 6e).

따라서, 본 발명의 진세노사이드 F2는 알코올 매개 간염에서 대식구 또는 호중구와 같은 염증세포의 활성을 억제하는 조절 T 세포의 분포를 증가키며, 조절 T 세포에서 항염증성 싸이토카인인 IL-10의 발현을 증가시킴으로써 간 염증을 완화함을 확인하였다. 따라서 진세노사이드 F2는 간 질환에 대한 예방 또는 치료용도로 사용할 수 있다.

실시예 4. 미접촉 T세포의 IL -17 생산하는 Th17 세포로의 분화 억제

마우스에서 미접촉 T세포(naive T cell)를 분리하여 TGF-β1 5ng/ml, IL-6 20ng/ml을 처리하고, CD3/28 항체가 코팅된 디시에서 3.5일 동안 배양하여 염증유발세포인 Th17 세포(T helper 17 cell)로 분화시켰다. 이때, 다양한 농도(0 내지 30 μM)의 진세노사이드 F2도 함께 처리하고 Th17 세포의 마커를 관찰한 결과를 도 7a 내지 도 7c에 나타내었다. N은 TGF-β1 , IL-6, 진세노사이드 F2를 모두 처리하지 않은 미접촉 T세포를 나타낸 것이다.

도 7a 및 도 7b는 분화시킨 미접촉 T세포를 FACS 분석한 것으로, 진세노사이드 F2의 농도 의존적으로 IL-17을 발현하는 Th17세포가 감소한 반면, 항염증성 싸이토카인인 IL-10은 진세노사이드 F2의 농도 의존적으로 증가하는 경향을 보였다.

또한, 상기 분화시킨 세포에 대하여 실시간 PCR 분석을 진행한 결과, 도 7c와 같이, 중성지방은 높이지 않고 HDL 콜레스테롤만 선택적으로 감소시키는 단백질인 Abca1의 발현이 진세노사이드 F2의 농도 의존적으로 감소하였으며, Th17 세포의 전사인자인 RORγt(ROR gamma t), STAT3 또한 진세노사이드 F2 처리에 따라 감소하였다.

따라서, 본 발명의 진세노사이드 F2는 미접촉 T세포가 염증유발세포인 Th17 세포로 분화되는 것을 억제함으로써 알코올 외의 원인으로 인한 간의 염증을 완화하여 간 질환 치료 용도로 사용할 수 있음을 확인하였다.

실시예 5. IL-10 결핍 마우스에서의 GF2의 간 보호효과 소멸

8주령의 IL-10 결핍 수컷 마우스(무게 25-28g)를 대상으로 2주 동안 매일 정상 식이와 함께 3g/kg의 에탄올에 50mg/kg의 진세노사이드 F2를 경구로 투여하였다(E+GF2). 대조군에는 진세노사이드 F2 대신 동량의 에탄올과 담체를 급여하였다(E+Veh). 2주 후 마우스를 부검하여 혈청, 간 조직, 간 단핵구를 획득하였다. 그 후, 실시예1. (1)에 기재된 방법과 동일하게 혈청 내 ALT, AST, TG, 콜레스테롤을 측정하였고, 간 조직에서는 괴사된 군집(necrotic foci)을 관찰하고, 2개로 분리된 간에서 괴사된 군집의 수를 계산하였다. 간 단핵구에서는 F4/80 또는 Gr1 항원 표지자를 이용하여 대식세포 및 중성구의 발현 정도를 유세포 분석하였다.

그 결과, IL-10 결핍 마우스에 진세노사이드 F2를 투여하더라도 ALT, TG, 콜레스테롤 양 등에는 유의한 영향을 주지 않았으며(도 8a), 간 조직의 괴사된 부분(necrotic foci) 또한 크게 변화가 없는 것으로 나타났다(도 8b 및 도 8c). 또한 대식세포와 중성구의 발현(도 8d 및 도 8e) 및 다른 면역세포(도 8f)에 있어서 진세노사이드 F2는 유의한 영향을 주지 않은 것으로 나타났다.

그러나, CD4+CD25+Foxp3+를 나타내는 조절 T세포는 진세노사이드 F2 투여한 그룹에서 증가하는 양상을 나타내었으며(도 8g), 단핵구를 이용하여 실시간 PCR을 시행한 결과, 도 8h와 같이 진세노사이드 F2를 투여한 그룹에서 IL-6, IL-17 등의 염증성 사이토카인의 발현뿐만 아니라 Foxp3 발현도 같이 증가하였다.

따라서 IL-10 결핍 마우스에서는 진세노사이드 F2의 간 보호효과가 거의 나타나지 않음을 확인하였는바, 진세노사이드 F2가 조절 T세포(Treg)와 항염증성 사이토카인인 IL-10의 생산을 증가시키는 과정을 통하여 간 보호 효과를 나타냄을 유추할 수 있다.

한편 상기 실시예에 대한 통계는 평균±SEM으로 표시하였으며, 대응되는 대조군과 비교하여 *P < 0.05, **P < 0.01 으로 유의성을 표시하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (11)

1. 진세노사이드 F2를 포함하는 간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 간 질환은 알코올성 간 질환인 것인, 약학 조성물.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 간 질환은 간염, 간경변, 지방간, 간부전, 및 간암을 포함하는 군으로부터 선택되는 것인, 약학 조성물.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 진세노사이드 F2는 간에서의 지방 축적을 억제하는 것인, 약학 조성물.
   
5. 제1항에 있어서,
   상기 진세노사이드 F2는 조절 T 세포(Treg)의 분포를 증가시켜 간의 염증을 억제하는 것인, 약학 조성물.
   
6. 제1항에 있어서,
   상기 진세노사이드 F2는 항염증 사이토카인 IL-10의 발현을 증가시키는 것인, 약학 조성물.
   
7. 제1항에 있어서,
   상기 진세노사이드 F2는 미접촉 T세포(Naive T cell)의 Th17 세포로의 분화를 억제하는 것인, 약학 조성물.
   
8. 제1항에 있어서,
   상기 진세노사이드 F2는 LXR(liver X receptor)의 활성을 억제하는 것인, 약학 조성물.
   
9. 진세노사이드 F2를 포함하는 간 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품.
   
10. 진세노사이드 F2를 포함하는 간 질환 예방 또는 개선용 사료 조성물.
    
11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 조성물을 인간을 제외한 간 질환 의심 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 간 질환의 예방 또는 치료 방법.

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