KR20090021561A - 호노키올을 유효성분으로 함유하는 지방간 질환의 예방 및치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 호노키올을 유효성분으로 함유하는 지방간 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 호노키올은 알코올에 의해 저해된 지방산 분해 조절 전사인자(PPAR-α)를 전사 활성화하고 알코올에 의해 활성화된 지방산 생합성 조절전사인자(SREBP-1)를 전사 억제함으로서 간 조직 내의 중성지방 축적을 억제하여 지방간 질환의 예방 및 치료용 조성물 및 건강기능식품으로 유용하게 이용될 수 있다.

호노키올, 후박, 지방간, 중성지방

Description

호노키올을 유효성분으로 함유하는 지방간 질환의 예방 및 치료용 조성물{Composition for the prevention and treatment of fatty liver diseases containing honokiol as an active ingredient}

본 발명은 호노키올을 유효성분으로 함유하는 지방간 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

우리나라 간질환 사망률은 인구 십만명 당 23.5명(남자 37.8명, 여자 9.0명)으로 매우 높으며, 40대 사망원인 1위(41.1명/10만명), 50대 사망원인 2위(72.4명/10만명), 30대 사망원인 3위(10명/10만명)를 차지하는 등 간질환은 한국 중년층 인구의 주요 사망원인이다. 특히 알콜성 간질환은 만성과다 음주자의 대부분에서 나타날 수 있는 질환이다.

상기 알콜성 간질환으로는 지방간, 급성간염, 만성간염, 간경변증과 간암이 있는데 이중 지방간은 가장 가벼운 증상을 보이는 동시에 가장 높은 발생빈도를 나타낸다.

알콜성 지방간이란, 간세포 속에 지방이 축적된 상태인데, 지방자체는 간세포에 큰 독성이 없어 심하지 않은 경우에는 증상이 없는 경우가 많고 간기능검사를 해 보아도 간기능이 정상이거나 조금 저하되는 경우가 대부분이다. 그러나, 지방간이 심하거나 간염 또는 간경변증에 지방간이 겹치면 간기능이 심히 저하되어 치명적인 상태가 되기도 한다.

구체적으로, 지방간이 악화되어 간세포 속의 지방 덩어리가 커지면 핵을 포함한 세포의 중요한 구성성분이 한쪽으로 밀려 간세포의 기능이 저하되며, 세포내에 축적된 지방으로 인하여 팽창된 간세포들이 간세포 사이에 있는 미세혈관과 임파선을 압박하여 간내의 혈액과 임파액의 순환에 장애가 생기게 된다. 이렇게 되면 간세포는 산소와 영양공급을 적절히 받을 수 없어 간기능이 저하되는 것이다.

상기 지방간은 만성적인 음주벽, 과식에 의한 비만증과 당뇨병이 주요 원인으로 꼽히며, 그밖에 독성이 강한 약제의 복용, 임신중에 항생제를 잘못 복용하였을 경우, 어린아이에게서의 발열성 감염질환이 있을 경우에 해열목적으로 아스피린을 함부로 남용하였을 경우에도 지방간은 생길 수 있다.

이러한 지방간은 면역상태 등의 신체적 여건이 좋으면 간세포의 재생으로 쉽게 회복되지만 그렇지 못할 경우에는 간경변증까지 진행될 수가 있다.

지방간 환자가 10년 내 간경변증으로 이행할 가능성은 30%, 알콜성 간염환자가 계속 음주할 경우 7년 생존율은 50%, 알콜성 간경변 환자가 계속 음주할 경우 5년 생존율은 40% 이하로 알콜에 의한 만성간질환은 우리나라 전체 간질환 사망률의 중요한 부분을 차지한다. 더구나 우리나라는 B형 간염의 만연 지역으로서 만성 간 질환 및 간암에 의한 사망률이 총 사망원인의 10%를 차지할 정도로 국민 건강에 심각한 문제가 되고 있다.

따라서 우리나라의 독특한 음주문화를 고려할 때 간질환 사망률을 줄이기 위해서는 초기에 알콜성 간질환을 적절히 치료해야 하지만 아직 우리나라에는 알콜성 간질환 치료제가 개발되어있지 않은 실정이다.

알코올성 간질환의 원인은 다양하고 아직 정확히 밝혀지지 않았지만 알코올에 의해 다양한 전사인자들의 전사활성이 영향을 받는데 이는 지방산대사 이상을 일으킨다고 보고되어 있다. 구체적으로 지방의 합성과 산화에 관여하는 수많은 유전자들은 특정된 전사인자들의 조절을 받는데 여기에는 지방의 산화에 관여하는 PPAR-α 및 지방의 생합성에 관여하는 SREBP-1 등이 포함된다[Laura E.Nagy:Molecular aspects of alchol metabolism: Trasncription factors involved in early ethanol-induced liver injury, Annu.Rev.Nutr 24:55-78, 2004]. 간에서 PPAR-α는 지방의 산화에 관여하는 중요한 전사조절인자로서 리간드에 의해 활성화 되면 RXRα와 이중체를 형성하여 지방의 산화에 관여하는 다양한 유전자들의 발현을 유도한다[Reddy JK: Nonalcoholic steatosis and steatohepatitis. II. Peroxisomal beta-oxidation, PPAR-α,and steatohepatitis. AM.J.Physiol.Gastrointest.Liver Physiol,281:G1333-29, 2001]. 그러나 알콜이 몸 속에 들어오면 이러한 지방 산화에 관여하는 PPAR-α 등의 전사인자의 활성을 억제하여 지방이 산화되어 분해되는 것을 방해함으로써 간 내 지방이 쌓여 지방간의 형 성이 촉진된다. 그러므로 PPAR-α의 활성이 증가되면 지방의 산화가 증가되면서 지방간의 형성을 방지할 수 있다. 예를 들어 쥐에게 알코올을 4주간 투여하면 PPAR-α의 전사활성이 떨어지면서 지방간이 형성되지만 PPAR-α를 활성화 시키는 물질을 알코올과 같이 투여하면 지방간이 형성되지 않는다[Fischer M et al: Peroxisome proliferator-activated receptor αagnoist treatment reverse PPARα dysfunction and abnormalities in hepatic lipid metabolism in ethanol-fed mice, J.Biol.Chem. 278: 27997-8004, 2003]. 또한 SREBP-1은 간에서 중성지방의 형성에 관여하는 여러 유전자들의 발현을 조절하는 중요한 인자로서 SREBP-1의 전사활성이 증가되면 지방합성이 촉진되면서 지방간이 형성된다. 알코올은 SREBP-1의 발현을 증가시키는데 이는 지방 생합성에 관여하는 여러 유전자들을 발현되게 함으로서 지방의 합성이 증가되게 된다. 따라서 SREBP-1의 발현을 감소시키면 지방간의 형성을 방지할 수 있다. 그 예로 SREBP-1이 발현되지 않는 유전자형의 쥐에서는 알코올에 투여에 의한 지방간이 현저하게 감소하는 것이 관찰되었다[Cheng Ji et al: Predominant role of sterol response element binding proteins (SREBP) lipogenic pathways in hepatic steatosis in the murine intragastric ethanol feeding model, Journal of Hepatology 45:717-724, 2006].

따라서, 지방의 산화에 관여하는 효소의 합성을 조절하는 PPAR-α의 전사활성을 증가시키고 지방의 생합성에 관여하는 SREBP-1의 전사활성을 억제하면 알코올성 지방간의 형성을 유효하게 방지할 수 있다.

한편, 호노키올(honokiol)은 일반적으로 후박에서 추출되며, 클로로헥시딘과 같은 기존의 항생물질보다 더욱 안전하고 뛰어난 항생 효과를 가진다는 사실이 입증된 바 있다(대한민국 특허공개 제1999-1000001호). 대한민국 특허공개 제1999-1000001호에서는 항균제로, 대한민국 특허공개 제2000-61656호에서는 암치료용 조성물의 성분으로, 대한민국 특허공개 제1990-1377호에서는 결핵 치료제 조성물의 성분으로 사용되었다. 그 밖에도 후천성 면역 결핍증(대한민국 특허공개 제1993-122호), 발모제(대한민국 특허공개 제2001-30194호)로서의 다양한 용도가 알려져 있으며, 평활근 이완(smooth muscle relaxation), 항-헬리코박터 파일로리 활성(anti-Helicobacter pylori activity), 항알러지 효과(anti-allergic effect), 항암 효과(anti-cancer effect), 허혈성-재관류(ischemic-reperfusion)에 의한 소장 손상 억제 효과 등이 있는 것으로 알려져 있다. 또한 대한민국 특허공개 제2005-0014453호에서는 상기 호노키올이 간세포사멸을 유발하는 화학물질에 의한 간손상을 억제하거나, 간경화시 활성화되는 간성상세포의 사멸을 촉진하는 것으로 나타났다. 그러나 상기 호노키올이 지방 산화 또는 지방 생합성에 영향을 미치는 것은 아직 보고된 바 없다.

이에 본 발명자들은 섭취가 용이하고 인체에 안전하며 지방간을 치료할 수 있는 물질을 찾고자 연구 노력한 결과, 호노키올(Honokiol)이 지방의 산화에 관여하는 효소의 합성을 조절하는 PPAR-α의 전사활성을 증가시키고 지방의 생합성에 관여하는 SREBP-1의 전사활성을 억제하여 지방간 형성을 감소시킴으로써 지방간 질 환 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 호노키올을 유효성분으로 함유하는 지방간 질환의 예방 및 치료용 조성물 및 건강기능식품을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 호노키올을 유효성분으로 함유하는 지방간 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 호노키올을 유효성분으로 함유하는 지방간 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명에 따른 호노키올은 지방의 산화에 관여하는 효소의 합성을 조절하는 PPAR-α의 전사활성을 증가시키고 지방의 생합성에 관여하는 효소의 합성을 조절하는 SREBP-1의 전사활성을 억제하여 간 조직 내에서의 중성지방 축적 억제함으로써, 지방간 질환의 예방 및 치료용 조성물 및 건강기능식품으로 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 본 발명에 관하여 상세히 설명한다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 호노키올을 유효성분으로 함유하는 지방간 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

바람직하게는 상기 호노키올은 후박나무로부터 분리, 정제된 것이다.

상기 후박나무[Magnolia obovata Thunberg (Magnoliaceae)]는 목련과(Magnoliaceae)에 속하는 다년생 초본으로서, 행기조습(行氣燥濕), 항역평천(降逆平喘)의 효능을 가진다고 알려져 있다. 한방에서는 이를 건조하여 건위소화, 사하, 지해 거담제로서 방향성 건위 및 복통, 복부팽만, 급성장염, 해수(咳嗽) 등의 치료에 사용하며, 위령탕, 과항정기산, 소승기탕, 박하후박탕, 평위산, 마자인환 등의 제제 성분으로 사용된다. 지금까지 알려져 있는 후박나무의 성분으로는 β-유데스몰(β-eudesmol), 마그놀올(magnolol), 호노키올(honokiol), 마그노쿠라린(magnocurarine), 탄닌(tannin) 등이 있으며, 상기 성분 중 마그놀올(magnolol) 및 호노키올(honokiol)은 클로로헥시딘과 같은 기존의 항생물질보다 더욱 안전하고 뛰어난 항생 효과를 가진다는 사실이 입증된 바 있다(대한민국 특허공개 제1999-1000001호). 전술한 후박의 약리 작용에 기초하여 다양한 연구가 수행되어 왔는 데, 대한민국 특허공개 제1999-1000001호에서는 항균제로, 대한민국 특허공개 제2000-61656호에서는 암치료용 조성물의 성분으로, 대한민국 특허공개 제1990-1377호에서는 결핵 치료제 조성물의 성분으로 사용되었다. 그 밖에도 후천성 면역 결핍증(대한민국 특허공개 제1993-122호), 발모제(대한민국 특허공개 제2001-30194호)로서의 다양한 용도가 알려져 있으며, 평활근 이완(smooth muscle relaxation), 항-헬리코박터 파일로리 활성(anti-Helicobacter pylori activity), 항알러지 효과(anti-allergic effect), 항암 효과(anti-cancer effect), 허혈성-재관류(ischemic-reperfusion)에 의한 소장 손상 억제 효과 등이 있는 것으로 알려져 있다. 그러나 상기 호노키올이 지방간에 효과가 있는 것을 아직 알려진 바가 없다.

본 발명에 있어서, 상기 후박은 중국후박나무(Magnolia officinalis REHD. et WILS) 또는 일본후박나무(M. obovata THUNB.)를 모두 포함하며, 바람직하게는 중국후박나무의 줄기껍질을 포함한다.

본 발명에 따른 호노키올은 본 발명 기술분야에서 널리 알려진 방법에 의하여 추출된 것 또는 상업적으로 구입한 것을 적절히 선택하여 사용할 수 있으며, 그 방법 또는 물질은 특별히 한정되지 않는다.

본 발명에 따른 호노키올의 분리방법의 구체적인 예를 들면 후박(M. obovata)의 줄기껍질 건조물의 70% 에탄올 추출액을 물에 분산한 다음 에틸아세테 이트로 분배하여 획득한 에틸아세테이트 가용부분을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행한 다음 헥산:에틸아세테이트(hexane:EtOAc)를 농도구배(10:1)하여 용출하고, 상기 용출물을 박층 크로마토그래피(TLC 실리카 겔)의 패턴에 따라 7개 분획으로 나눈 다음 그 중 분획 3을 이동상을 트리클로로메탄:메탄올(CHCl₃:MeOH=10:1)로 사용하여 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피를 반복함으로써 호노키올을 분리한다[Bang et al., Arch.Pharm.Res. 2000].

본 발명에 따른 호노키올을 유효성분으로 함유하는 조성물은 알콜성 지방간 질환, 비알콜성 지방간 질환, 영양성 지방간 질환, 기아성 지방간 질환, 비만성 지방간 질환, 당뇨병성 지방간 질환, 지방간염 등과 같은 지방간 질환의 예방 및 치료용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

바람직하게는 본 발명에 따른 조성물은 알콜성 지방간 질환 또는 지방간염의 예방 및 치료용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 호노키올을 에탄올 투여한 랫트에 관하여 실험한 결과, 호노키올을 투여한 실험군에서는 생체 내에서 혈중 ALT(S-GPT) 효소의 활성을 억제하여 혈중 TNF-α 함량을 저하시키고(실시예 7 참조), 에탄올에 의한 지방간이 현저히 감소하고(도 1 및 도 2 참조), 간 조직의 중성 지방 농도가 현저하게 감소하고(실시예 9 참조), 에탄올에 의해 저하된 간 조직 내 에스-아데노실메티오닌(SAM)의 농도를 증가시켜 간 손상을 억제하고(실시예 10 참조), 간 속에서 주요한 항산화작용을 하는 글루타치온의 농도를 증가시켜 에탄올에 의한 간독성을 억제시키고(실시예 11 참조), 에탄올에 의해서 증가되는 지방합성 전사인자인 SREBP-1의 변화를 유효하게 억제하고 에탄올에 의해서 감소되는 지방분해 전사인자인 PPAR-α의 변화를 유효하게 증가시키는 결과(실시예 12 참조)를 나타내었다. 이로부터 본 발명에 따른 조성물은 알콜성 지방간 질환의 예방 및 치료에 특히 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.

상기 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있으며, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose) 또는 락토오스(Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 호노키올은 조성물 총 중량에 대하여 0.1~50 중량%로 포함되는 것이 바람직하다. 그러나 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태, 질환의 종류 및 진행 정도에 따라 변할 수 있다.

본 발명에 따른 호노키올의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 1일 0.01 mg/kg 내지 10 g/kg으로, 바람직하게는 1 mg/kg 내지 1 g/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명에 따른 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 지방간 질환의 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 지방간 질환의 예방 및 개선 효과를 나타내는 호노키올 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 지방간의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명에 따른 호노키올을 포함하는 조성물은 지방간 질환의 예방 및 개선을 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명에 따른 호노키올을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들면 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료의 형태로 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 호노키올 자체는 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.

본 발명에 따른 호노키올은 지방간 질환의 예방 및 개선을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당 알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 제조예 1> 호노키올의 분리

후박(M. obovata)의 줄기껍질 건조물 1.5 kg의 70% 에탄올 추출액 280 g을 물에 분산한 후 에틸아세테이트로 분배하여 에틸아세테이트 가용부분 120 g을 얻었 다. 상기 에틸아세테이트 가용부분을 실리카겔 컬럼크로마토그래피를 걸고 n-hexane:EtOAc 용리액으로 용출하였다. 7개 분획으로 나눈 다음 그 중 분획 3(15.2g)을 이동상을 트리클로로메탄:메탄올(CHCl₃:MeOH=10:1)로 사용하여 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피를 반복함으로써 호노키올(0.21g)을 분리하였다[Bang et al., Antifungal Activity of Magnolol and Honokiol: Arch Pharm. Res. 23:46-49, 2000].

< 실시예 1> RAW 264.7 세포 생존율 측정

<1-1> RAW 264.7 세포 배양

설치류 대식세포인 RAW264.7 세포는 ATTC(American Type Culture Collection)사에서 구입하여 사용하였다. RAW264.7 세포는 10% FBS, 100 U/ml 페니실린, 100 mg/ml 스트렙토마이신이 포함된 RPMI1640 배지로 배양하였다. 세포는 37 ℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였고 배양된 세포는 24-웰 또는 48-웰, 일정한 수의 세포를 분주하여 실험하였다.

24-웰에 세포를 1 ml (2×10⁵/ml)씩 분주한 후 세포가 24-웰에 완전히 붙어 세포의 모양을 제대로 갖출 때까지 12~16시간 이상 CO₂ 세포배양기 안에서 안정화시켰다. 다음으로 상기 세포에 LPS 또는 에탄올 처리를 하였다. 구체적으로 LPS 처리로는 25 ng/ml의 LPS를 세포에 처리하거나 LPS와 1 ㎍/ml, 5 ㎍/ml, 10 ㎍/ml, 50 ㎍/ml의 호노키올을 같이 처리하였으며, 에탄올 처리로는 125 mM의 에탄올을 세 포에 처리하거나 에탄올과 1 ㎍/ml, 5 ㎍/ml, 10 ㎍/ml, 50 ㎍/ml의 호노키올을 같이 처리하였다.

<1-2> MTT 측정

이후, MTT 용액(5 mg/ml in PBS)을 최종농도가 100μg/ml이 되도록 넣어주었다. 생존율의 판정은 MTT 처리 4시간 후에 살아있는 세포에 의해 생성된 불용성의 보라색 포마잔(formazan)을 용해시키기 위하여 DMSO를 첨가하여 15분 동안 진탕한 후 ELISA 분석기로 540 nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 결정하였다[Monks, A.et al. Feasibility of a high-flux anticancer drug screen using a diverse panel of cultured human tumor cell lines. J. Natl.Cancer Inst. 83, 1991]. 측정 결과를 표 1 내지 표 2에 나타내었다.

LPS 처리

실험군	세포 생존율 (%)
대조군	104.5±3.2
LPS 처리군	54.0±0.4 a
LPS + 호노키올 (1 ㎍/㎖)	59.5±0.8 b
LPS + 호노키올 (5 ㎍/㎖)	81.8±0.5 c
LPS + 호노키올 (10 ㎍/㎖)	101.8±1.5 c
a: P<0.001 ; 대조군에 비하여 통계적으로 유의미한 차이가 있음. b: P<0.05 ; LPS 처리군에 비하여 통계적으로 유의미한 차이가 있음. c: P<0.001 ; LPS 처리군에 비하여 통계적으로 유의미한 차이가 있음.

에탄올 처리

실험군	세포 생존율 (%)
대조군	104.49±2.5
에탄올 처리군	43.8±4.4
에탄올 + 호노키올 (1 ㎍/㎖)	44.5±1.4
에탄올 + 호노키올 (5 ㎍/㎖)	65.7±1.4 b
에탄올 + 호노키올 (10 ㎍/㎖)	87.6±3.1 c
a: P<0.01 ; 대조군에 비하여 통계적으로 유의미한 차이가 있음. b: P<0.01 ; 에탄올 처리군에 비하여 통계적으로 유의미한 차이가 있음. c: P<0.001 ; 에탄올 처리군에 비하여 통계적으로 유의미한 차이가 있음.

표 1 및 표 2에 나타낸 바와 같이, 호노키올을 처리한 RAW 264.7 세포의 생존율이 LPS만 처리한 군의 54%에서 101.8%(P<0.001)로 에탄올만 처리한 군의 43.8%에서 87.6%(P<0.001)로 나타나 세포의 사멸을 감소시킴을 확인할 수 있었다.

< 실시예 2> RAW 264.7 세포의 TNF -α생성 억제율 측정

본 발명에 따른 호노키올이 TNF-α 생성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

상기 실시예 <1-1>에서 LPS 및 에탄올과 여기에 호노키올이 처리된 RAW 264.7 세포를 R&D사의 TNF-α 키트를 이용하여 TNF-α 생성 억제율을 측정하여 표 3 및 표 4에 나타내었다.

LPS 처리

실험군	TNF-α 생성 억제율 (%)
대조군	-
LPS 처리군	-
LPS + 호노키올 (1 ㎍/㎖)	40.9±2.1 a
LPS + 호노키올 (5 ㎍/㎖)	38.4±0.4 a
LPS + 호노키올 (10 ㎍/㎖)	60.3±1.5 a
a: P<0.001 ; LPS 처리군에 비하여 통계적으로 유의미한 차이가 있음.

에탄올 처리

실험군	TNF-α 생성 억제율 (%)
대조군	-
에탄올 처리군	-
에탄올 + 호노키올 (1 ㎍/㎖)	32.6±0.7 a
에탄올 + 호노키올 (5 ㎍/㎖)	50.8±0.7 a
에탄올 + 호노키올 (10 ㎍/㎖)	70.1±1.8 a
a: P<0.001 ; 에탄올 처리군에 비하여 통계적으로 유의미한 차이가 있음.

표 3 및 표 4에 나타나는 바와 같이, 호노키올을 처리한 RAW 264.7 세포의 TNF-α생성 억제율이 LPS와 같이 처리한 군에서는 60.3±1.5%(P<0.001) 및 에탄올과 같이 처리한 군에서는 70.1±1.8(P<0.001)로 나타나 TNF-α생성을 유의적으로 억제하여 LPS 및 에탄올에 의한 간 손상을 억제시킴을 확인할 수 있었다.

< 실시예 3> RAW 264.7 세포의 활성산소( ROS ) 생성 억제율 측정

본 발명에 따른 호노키올이 활성산소 생성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

상기 실시예 <1-1>에서 LPS 및 에탄올과 여기에 호노키올이 처리된 RAW 264.7 세포를 일정한 수로 48웰 플레이트에 시딩(seeding)한 후 1 mM 디클로로플루오레신 디아세테이트 (DCFH-DA)로 처리하였다. 이후, 37 ℃에서 30분간 방치한 후 부동 농도의 TNF-α로 처리한 후 일정한 시간간격을 두고 Elisa reader에서 exicitation filter 485nm 와 emission filter 530nm , chamber 내 온도 37 ℃를 정하여 형광을 측정하였다[Rosenkranz AR, et al. A microplate assay for the detection of oxidative products using 20,70- dichlorofluorescin-diacetate. J Immunol Methods. 156:39-45, 1992]. 측정 결과를 표 5 및 표 6에 나타내었다.

LPS 처리

실험군	활성산소 생성 억제율 (%)
대조군	-
LPS 처리군	-
LPS + 호노키올 (1 ㎍/㎖)	28.0±0.4 a
LPS + 호노키올 (5 ㎍/㎖)	32.9±0.3 a
LPS + 호노키올 (10 ㎍/㎖)	60.8±1.4 a
a: P<0.001 ; LPS 처리군에 비하여 통계적으로 유의미한 차이가 있음.

에탄올 처리

실험군	활성산소 생성 억제율 (%)
대조군	-
에탄올 처리군	-
에탄올 + 호노키올 (1 ㎍/㎖)	29.5±0.6 a
에탄올 + 호노키올 (5 ㎍/㎖)	43.1±0.1 a
에탄올 + 호노키올 (10 ㎍/㎖)	50.9±0.3 a
a: P<0.001 ; 에탄올 처리군에 비하여 통계적으로 유의미한 차이가 있음.

표 5 내지 표 6에 나타나는 바와 같이, 호노키올을 처리한 RAW 264.7 세포의 활성산소 (ROS) 생성 억제율이 LPS와 같이 처리한 군에서는 60.8±1.4%(P<0.001) 및 에탄올과 같이 처리한 군에서는 50.9±0.3%(P<0.001)로 나타나 활성산소 생성을 유의적으로 억제하여 LPS 및 에탄올에 의한 간 손상을 억제시킴을 확인할 수 있었다

< 실시예 4> RAW 264.7 세포의 일산화질소( NO ) 생성 억제율 측정

본 발명에 따른 호노키올이 일산화질소 생성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

상기 실시예 <1-1>에서 LPS과 여기에 호노키올이 처리된 RAW 264.7 세포를 문헌에 기재된 방법을 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다. NO 생성량은 세포로부터 유리된 아질산(nitrite) 량으로 측정하였다. 배지에 Griess 시약(1% sulfanilamide, 0.1% N-1-naphthylenediamine dihydrochloride, 2.5% phosphoric acid)을 동량 혼합하여 10분 동안 반응시킨 후에 540 nm에서 흡광도를 측정하였다[Ridnour LA, et al . A spectrophotometric method for the direct detection and quantitation of nitric oxide, nitrite, and nitrate in cell culture media. Anal Biochem. 281:2000, 223-9]. 측정 결과를 표 7에 나타내었다.

실험군	일산화질소 생성 억제율 (%)
대조군	-
LPS 처리군	-
LPS + 호노키올 (1 ㎍/㎖)	32.8±0.6 a
LPS + 호노키올 (5 ㎍/㎖)	61.6±0.2 a
LPS + 호노키올 (10 ㎍/㎖)	82.0±0.2 a
a: P<0.001 ; LPS 처리군에 비하여 통계적으로 유의미한 차이가 있음.

표 7에 나타나는 바와 같이, 호노키올을 처리한 RAW 264.7 세포의 일산화질소(NO) 생성 억제율이 82.0±0.2%(P<0.001)로 나타나 일산화질소 생성을 유의적으로 억제하여 LPS에 의한 간 손상을 억제시킴을 확인할 수 있었다.

< 실시예 5> RAW 264.7 세포의 NADPH 산화효소 활성 억제율 측정

본 발명에 따른 호노키올이 NADPH 산화효소 활성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

상기 실시예 <1-1>에서 LPS 및 에탄올과 여기에 호노키올이 처리된 RAW 264.7 세포를 문헌에 기재된 방법을 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다. 시약 처리 후 세포들을 완충용액 A(5 μM lucigenin, Protease inhibitor)를 이용하여 용해시킨 다음 단백질을 정량하여 일정한 양을 완충용액 B(500 μM lucigenin, 100μM NADPH, Protease inhibitor)와 반응시켜 측정하였다[Konjeti R, et al. NADPH Oxidase Activity Is Essential for Keap1/Nrf2-mediated Induction of GCLC in Response to 2-Indol-3-yl-methylenequinuclidin-3-ols. Cancer Research 63, 5636-5645, September 1, 2003]. 측정 결과를 표 8 및 표 9에 나타내었다.

LPS 처리

실험군	NADPH 산화효소 활성 억제율 (%)
대조군	-
LPS 처리군	-
LPS + 호노키올 (1 ㎍/㎖)	17.1±0.5 a
LPS + 호노키올 (5 ㎍/㎖)	33.1±0.3 a
LPS + 호노키올 (10 ㎍/㎖)	63.1±0.6 a
a: P<0.001 ; LPS 처리군에 비하여 통계적으로 유의미한 차이가 있음.

에탄올 처리

실험군	NADPH 산화효소 활성 억제율 (%)
대조군	-
에탄올 처리군	-
에탄올 + 호노키올 (1 ㎍/㎖)	1.5±1.1 a
에탄올 + 호노키올 (5 ㎍/㎖)	34.2±0.6 a
에탄올 + 호노키올 (10 ㎍/㎖)	76.4±3.6 a
a: P<0.001 ; 에탄올 처리군에 비하여 통계적으로 유의미한 차이가 있음.

표 8 내지 표 9에 나타나는 바와 같이, 호노키올을 처리한 RAW 264.7 세포의 NADPH 산화효소 활성 억제율이 LPS와 같이 처리한 군에서는 63.1±0.6%(P<0.001) 및 에탄올과 같이 처리한 군에서는 76.4±3.6%(P<0.001)로 나타나 산화효소 활성을 유의적으로 억제하여 LPS 및 에탄올에 의한 간 손상을 억제시킴을 확인할 수 있었다.

< 실시예 6> RAW 264.7 세포의 과산화 음이온 생성 억제율 측정

본 발명에 따른 호노키올이 과산화 음이온 생성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

상기 실시예 <1-1>에서 LPS 및 에탄올과 여기에 호노키올이 처리된 RAW 264.7 세포를 문헌에 기재된 방법을 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다. 시약 처리 후 세포 배양액에 시토크롬(cytochrome c)이 포함되어 있는 용액을 첨가하여 시토그롬이 환원되는 양을 마이크로 플레이트 리더(microplate reader)로 측정하여 과산화 음이온 생성 양을 계산하였다[Zsuzsa Varga, et al. Inhibition of the Superoxide Anion Release and Hydrogen Peroxide Formation in PMNLs by Flavonolignans. Phytother. Res. 15, 608-612, 2001]. 측정 결과를 표 10 및 표 11에 나타내었다.

LPS 처리

실험군	과산화 음이온 생성 억제율 (%)
대조군	-
LPS 처리군	-
LPS + 호노키올 (1 ㎍/㎖)	-7.3±1.2
LPS + 호노키올 (5 ㎍/㎖)	7.7±0.3
LPS + 호노키올 (10 ㎍/㎖)	61.2±0.1 a
a: P<0.01 ; LPS 처리군에 비하여 통계적으로 유의미한 차이가 있음.

에탄올 처리

실험군	과산화 음이온 생성 억제율 (%)
대조군	-
에탄올 처리군	-
에탄올 + 호노키올 (1 ㎍/㎖)	6.9±0.9 a
에탄올 + 호노키올 (5 ㎍/㎖)	42.2±2.6 b
에탄올 + 호노키올 (10 ㎍/㎖)	75.0±0.7 b
a: P<0.05 ; 에탄올 처리군에 비하여 통계적으로 유의미한 차이가 있음. b: P<0.001 ; 에탄올 처리군에 비하여 통계적으로 유의미한 차이가 있음.

표 10 내지 표 11에 나타나는 바와 같이, 호노키올을 처리한 RAW 264.7 세포의 과산화 음이온 생성 억제율이 LPS와 같이 처리한 군에서는 61.2±0.1%(P<0.01) 및 에탄올과 같이 처리한 군에서는 75.0±0.7%(P<0.001)로 나타나 과산화 음이온 생성을 유의적으로 억제하여 LPS 및 에탄올에 의한 간 손상을 억제시킴을 확인할 수 있었다.

< 실시예 7> 에탄올 투여 랫트의 혈중 ALT (s- GPT ) 효소 활성 및 TNF -α 함량에 미치는 영향

<7-1> 실험 동물의 분류

수컷 위스터 랫트(wistar rat, 170-190g)는 중앙실험동물(서울, 대한민국)에서 구입하였다. 실험 전에는 물과 표준사료를 자유로이 섭취시키고 실험 중에는 미국 다이에츠(Dyets)사에서 구입한 식이(Lieber-Decarli) 액체사료를 사용하였다. GLP 시설기준에 부합되는 사육실에서 조명시간 12 시간(오전 8 시 점등∼오후 8 시 소등)을 유지하였으며, 동물사육 표준 가이드라인에 따라 관리하였다.

이후, 체중 180 g 내외의 건강한 위스터 랫트를 선정하여 실험실 내 환경적응을 위하여 1주일간의 안정시간을 두고 시료처리를 시작하였으며, 먹이는 알콜의 열량 때문에 각 실험군의 열량을 맞추어 주면서 영양학적으로 적절한 식이(Standard Lieber-Decarli) 액체사료를 사용하였다. 군 분류와 투여는 하기와 같이 6개 군으로 나누어 진행하였다.

1군 (정상군): 식이(Standard Lieber-Decarli Control Diet)만 주었다.

2군 (정상군에 호노키올 시료 투여한 군): 식이(Standard Lieber-Decarli Control Diet)만 주면서 호노키올 시료를 20 mg/kg 되게 10% PEG400 용액에 현탁 시켜 마지막 2주 동안 투여하였다.

3군 (에탄올 투여 군): 에탄올이 전체 열량 중에서 36% 차지하는 식이(Standard Lieber-Decarli Ethanol Diet)를 4주 동안 주었다.

4군 (에탄올 투여 군에 호노키올 시료 10mg/kg 투여한 군): 에탄올의 전체 열량 중에서 36% 차지하는 식이(Standard Lieber-Decarli Ethanol Diet)를 4주간 주면서 호노키올 시료를 10 mg/kg 농도로 10% PEG400 용액에 현탁 시켜 마지막 2주간 경구 투여하였다.

5군 (에탄올 투여 군에 호노키올 시료 20mg/kg 투여한 군): 에탄올의 전체 열량 중에서 36% 차지하는 식이(Standard Lieber-Decarli Ethanol Diet)를 4주간 주면서 호노키올 시료를 20 mg/kg 농도로 10% PEG400 용액에 현탁시켜 마지막 2주간 경구 투여하였다.

6군 (양성 투여 군): 에탄올의 전체 열량 중에서 36% 차지하는 식이(Standard Lieber-Decarli Ethanol Diet)를 주면서 4주 동안 먹이로 주면서 SAM을 20 mg/kg으로 마지막 2주간 근육 주사하였다.

<7-2> 랫트의 혈중 ALT (s- GPT ) 효소 활성 및 TNF -α 함량 측정

상기와 같이 분류된 랫트의 복대동맥에서 채혈한 혈액을 실온에서 한 시간 동안 방치한 후, 3000 rpm에서 15분 원심 분리하여 혈청을 얻었으며 실험에 사용하기 전까지 영하 70 ℃에 보관하였다. ALT는 영동제약 키트를 사용하여 라이트만-프란켈(Reitman-Frankel)의 방법에 의하여 측정하였다[Reitman, S. et al, . Colorimetric method for determination of serum glutamic oxaloacetic and glutamic pyruvic transaminases. American Journal of Clinical Pathology 28, 56.63.1957; T. Chard, Book: An Introduction to Radioimmunoassay & Related Techniques, 4th Ed., Amsterdam:Elsevier.1990]. 측정 결과를 표 12에 나타내었다.

군 번호	ALT(s-GPT) 효소 활성 (μ/l)	혈중 TNF-α 함량 (pg/㎖)
1	36.2±2.2	1.1±0.2
2	34.3±0.7	1.7±0.3
3	52.5±1.6 a	4.3±0.3 a
4	36.8±2.5 b	2.7±0.1 b
5	37.8±1.3 a	3.2±0.2 c
6	41.3±1.1 b	2.9±0.5 c
a: P<0.01 ; 1군에 비하여 통계적으로 유의미한 차이가 있음. b: P<0.01 ; 3군에 비하여 통계적으로 유의미한 차이가 있음. c: P<0.05 ; 3군에 비하여 통계적으로 유의미한 차이가 있음.

표 12에 나타나는 바와 같이, 에탄올 투여군의 ALT는 52.5 μ/l로 대조군에 비해 45%(P<0.01) 상승하였으며 TNF-α 함량은 4.3 pg/ml로 대조군에 비해 291%(P<0.01) 상승하였다. 에탄올과 함께 10 mg/kg(저농도)의 호노키올을 투여한 군에서는 ALT는 36.8u/l로 감소하였으며 TNF-α 함량은 2.7 pg/ml로, 20 mg/kg(고농도)의 호노키올 투여군에서는 ALT가 37.8u/l, TNF-α 함량은 2.7 pg/ml로 감소하여 호노키올이 알콜성 지방간 질환 또는 지방간염에 의해 발생하는 간 손상을 치료하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

< 실시예 8> 호노키올이 만성 에탄올 투여 랫트의 지방간 형성에 미치는 영향

본 발명에 따른 호노키올이 만성 에탄올 투여 랫트의 지방간 형성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

상기 실시예 <7-1>에서 분류한 호노키올을 투여하거나 투여하지 않은 랫트의 간을 추출하여 일부분을 4% 포름알데히드에 담근 후, 파라핀 절편을 만들어 H&E 염색을 하여 그 결과를 도 1에 나타내었다.

또한, 상기 실시예 <7-1>에서 분류한 호노키올을 투여하거나 투여하지 않은 랫트의 간을 추출하여 일부분을 동결샘플보존액(OST compound)에 담근 후, 바로 얼려 동결절편을 만든 후 지방을 특이적으로 염색시키는 Oil Red O 염색을 수행하여 도 2에 나타내었다. 상기 Oil Red O 염색은 서울대 실험동물센터에서 진행하였다.

도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 병리학전문가의 판독 결과 에탄올 투여군에서는 선명한 지방간 소견이 관찰되었으나, 호노키올 투여군에서는 에탄올에 의한 지방간 소견이 현저히 감소한 것을 확인하였다. 따라서 호노키올이 알콜성 지방간 질환을 치료하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

< 실시예 9> 호노키올이 만성 에탄올 투여 랫트의 간 조직의 중성지방( Triglyceride ) 축적에 미치는 영향

본 발명에 따른 호노키올이 만성 에탄올 투여 랫트의 간 조직의 중성지방 축적에 미치는 영향을 알아보기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

상기 실시예 <7-1>에서 분류한 호노키올을 투여하거나 투여하지 않은 랫트의 간을 추출하여 간 속의 중성지방 농도를 시그마 케미칼사(sigma)의 키트(cat# TR0100)를 사용하여 측정하여, 그 결과를 표 13에 나타내었다.

군 번호	중성지방 농도 (mg/g)
1	31.7±1.8
2	34.2±1.2
3	63.2±1.7
4	32.2±2.9 b
5	30.2±3.4 b
6	19.5±1.8 b
a: P<0.001 ; 1군에 비하여 통계적으로 유의미한 차이가 있음. b: P<0.001 ; 3군에 비하여 통계적으로 유의미한 차이가 있음.

표 13에서 나타나는 바와 같이, 에탄올 투여군에서 간 조직의 중성지방 농도는 63.2mg/g으로 투여군에 비해 99%(P<0.0001) 증가하였으나, 호노키올을 에탄올과 함께 10mg/kg(저농도) 투여한 군에서는 32.2mg/kg으로 알콜 투여군에 비해 49.9% 감소하였고, 20mg/kg(고통도)으로 투여한 군에서는 30.2mg/kg으로 알콜 투여 군에 비해 52.2% 감소하였다. 따라서, 호노키올이 알콜성 지방간 질환의 치료효과가 있음을 확인할 수 있었다.

< 실시예 10> 호노키올이 만성 에탄올 투여 랫트의 간 내의 에스 -아데노실메티오닌( S-adenosyl-L-methionine; SAM)의 변화 측정

본 발명에 따른 호노키올이 만성 에탄올 투여 랫트의 간 내의 에스-아데노실메티오닌(S-adenosyl-L-methionine; SAM)의 변화에 미치는 영향을 알아보기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

상기 실시예 <7-1>에서 분류한 호노키올을 투여하거나 투여하지 않은 랫트의 간을 4배 양의 1 M의 과염소산(perchloric acid)에 진탕한 후, 10000 g에서 10분 동안 원심 분리하였고, 상층 액을 분리하여 She 등의 방법[She QB, et al. A simple HPLC method for the determination ofS-adenosylmethionine and S-adenosylhomocysteine in rat tissues: the effect of vitamin B6 deficiency on these concentrations in rat liver. Biochem Biophys Res Commun. 205:1748-1754.1994]으로 HPLC의 UV 디텍터를 이용하여 측정하고, 그 결과를 표 14에 나타내었다.

군 번호	SAM (nmol/g)
1	82.0±1.4
2	94.3±2.3
3	69.4±1.9 a
4	78.3±1.0 b
5	76.1±1.3 c
6	90.2±2.3 d
a: P<0.05 ; 1군에 비하여 통계적으로 유의미한 차이가 있음. b: P<0.01 ; 3군에 비하여 통계적으로 유의미한 차이가 있음. c: P<0.05 ; 3군에 비하여 통계적으로 유의미한 차이가 있음. d: P<0.001 ; 3군에 비하여 통계적으로 유의미한 차이가 있음.

표 14에 나타나는 바와 같이, 에탄올 투여에 의해 간조직 중 SAM의 농도는 69.4 nmol/g으로서 투여군에 비해 15.3%(P<0.018) 감소하였으나, 호노키올을 에탄올과 10 mg/kg(저농도)으로 함께 투여한 군에서는 12.8% 증가하였고, 20 mg/kg(고농도)를 투여한 군에서는 에탄올만 투여한 군에 비해 9.7% 증가하였다. 따라서 호노키올은 에탄올에 의해 저하된 간 조직 내 SAM의 농도를 증가시켜 간 손상을 억제하는 효능을 나타냄을 확인할 수 있었다.

< 실시예 11> 호노키올이 만성 에탄올 투여 랫트의 간 내의 글루타치온(Gluthathione)의 변화 측정

본 발명에 따른 호노키올이 만성 에탄올 투여 랫트의 간 내의 글루타치온(Gluthathione)의 변화에 미치는 영향을 알아보기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

상기 실시예 <7-1>에서 분류한 호노키올을 투여하거나 투여하지 않은 랫트의 간을 4배 양의 1M의 과염소산(perchloric acid)에 진탕한 후, 10000 g에서 10분 동안 원심 분리하였고, 상층액을 분리하여 Kim(2002)의 방법[Kim, et al. Attenuation of bacterial lipopolysaccharide-induced hepatotoxicity by betaine or taurine in rats. Food and Chemical Toxicology. 40, .545-549,2002]에 따라 HPLC 분리(separation)/플루오르메트릭 검출 방법(fluorometric detection)을 사용하여 측정하고, 그 결과를 표 15에 나타내었다.

군 번호	글루타치온 (mg/g)
1	7.1±0.2
2	8.3±0.2
3	3.0±0.4 a
4	7.5±0.4 b
5	6.6±0.6 b
6	11.3±0.5 b
a: P<0.001 ; 1군에 비하여 통계적으로 유의미한 차이가 있음. b: P<0.001 ; 3군에 비하여 통계적으로 유의미한 차이가 있음.

표 15에 나타나는 바와 같이, 에탄올의 투여는 간 조직 중의 글루타치온 농도를 투여군에 비해 57.4% (P<0.0001) 감소시켰으나, 에탄올과 호노키올을 함께 투여한 군에서는 에탄올만 투여한 군에 비하여 글루타치온 농도가 10mg/kg(저농도)투여군에서는 1.64배 증가하였으며, 20mg/kg(고농도)투여군에서는 알콜 투여 군에 비해 1.62배 증가하여 호노키올은 에탄올에 의한 간독성을 억제할 수 있음을 확인할 수 있었다.

< 실시예 12> 호노키올이 만성 에탄올 투여 랫트의 간 내의 지방대사 지표의 변화 측정

본 발명에 따른 호노키올이 만성 에탄올 투여 랫트의 간 내의 지방대사 지표의 변화에 미치는 영향을 알아보기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

상기 실시예 <7-1>에서 분류한 호노키올을 투여하거나 투여하지 않은 랫트의 간을 일부분 채취하여 핵 분획 단백질을 추출 한 후 특수 단백질 검출 검사법(western blot)을 이용하여 SREBP-1 및 PPAR-α의 발현양의 변화에 대한 호노키올의 영향을 평가하였으며 또한 간의 일부분을 채취하여 인트론사(intron)의 키트를 사용하여 리보핵산(RNA) 추출 후 중합효소 연쇄반응(PCR)을 진행하여 Srebf1 및 RXR-α의 변화를 측정하였다[You et al. Ethanol Induces Fatty Acid Synthesis Pathways by Activation of Sterol Regulatory Element-binding Protein (SREBP). THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY. 277(32)293429347, 2002; Fischer et al. Peroxisome Proliferator-activated Receptor (PPAR) Agonist Treatment Reverses PPARDysfunction and Abnormalities in Hepatic Lipid Metabolism in Ethanol-fed Mice. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY. 278(30). 279978004, 2003]. 그 결과를 도 3 내지 도 6에 나타내었다.

도 3은 상기 지방대사 지표 타겟이 Srebf1일 때, 도 4는 SREBP-1일 때, 도 5는 PPAR-α일 때, 도 6은 RXR-α일 때를 나타낸다.

도 3 내지 도 6에 나타낸 바와 같이, 호노키올의 투여는 에탄올에 의해서 증가되는 SREBP-1의 변화를 유효하게 억제하였으며 에탄올에 의해서 감소되는 PPAR-α 및 RXR-α의 발현을 증가시켜 호노키올이 에탄올에 의한 지방 대사를 조절함으로서 알코올성 지방간 질환에 치료효능이 있음을 확인하였다.

< 제제예 1> 산제의 제조

호노키올 20 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

<제제예 2> 정제의 제조

호노키올 10 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

< 제제예 3> 캡슐제의 제조

호노키올 10 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

< 제제예 4> 주사제의 제조

호노키올 10 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na₂HPO_{4 ,}12H₂O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

< 제제예 5> 액제의 제조

호노키올 20 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

< 제제예 6> 건강 식품의 제조

호노키올 1000 ㎎

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 B1 0.13 ㎎

비타민 B2 0.15 ㎎

비타민 B6 0.5 ㎎

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄산마그네슘 25.3 ㎎

제1인산칼륨 15 ㎎

제2인산칼슘 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

< 제제예 7> 건강 음료의 제조

호노키올 1000 ㎎

구연산 1000 ㎎

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수 전체 900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 호노키올 투여시 간 조직을 나타내는 도면이다(H&E 염색).

도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 호노키올 투여시 간 조직을 나타내는 도면이다(Oil Red O 염색).

도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 호노키올이 지방대사(지방산 생합성) 관련 전사인자 유전자(Srebflc mRNA) 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.

도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 호노키올이 지방대사(지방산 생합성) 관련 전사인자 단백질(nSREBP-1) 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.

도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 호노키올이 지방대사(지방산 산화) 관련 전사인자 단백질(PPAR-α) 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.

도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 호노키올이 지방대사(지방산 산화) 관련 전사인자 유전자(RXR-α) 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.

Claims (10)

1. 하기 화학식 1로 표기되는 호노키올을 유효성분으로 함유하는 지방간 질환의 예방 및 치료용 조성물.

   <화학식 1>

   
2. 제1항에 있어서, 상기 호노키올은 후박나무로부터 분리, 정제된 것을 특징으로 하는 호노키올을 유효성분으로 함유하는 지방간 질환의 예방 및 치료용 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 호노키올은 지방의 산화에 관여하는 효소의 합성을 조절하는 인자(PPAR-α)의 전사활성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 호노키올을 유효성분으로 함유하는 지방간 질환의 예방 및 치료용 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 호노키올은 지방의 생합성에 관여하는 효소의 합성을 조절하는 인자(SREBP-1)의 전사활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 호노키올을 유효성분으로 함유하는 지방간 질환의 예방 및 치료용 조성물.
5. 제1항에 있어서, 상기 지방간 질환은 알콜성 지방간 질환, 비알콜성 지방간 질환, 영양성 지방간 질환, 기아성 지방간 질환, 비만성 지방간 질환, 당뇨병성 지방간 질환 또는 지방간염인 것을 특징으로 하는 호노키올을 유효성분으로 함유하는 지방간 질환의 예방 및 치료용 조성물.
6. 제5항에 있어서, 상기 지방간 질환은 알콜성 지방간 질환인 것을 특징으로 하는 호노키올을 유효성분으로 함유하는 지방간 질환의 예방 및 치료용 조성물.
7. 제5항에 있어서, 상기 지방간 질환은 지방간염인 것을 특징으로 하는 호노키올을 유효성분으로 함유하는 지방간 질환의 예방 및 치료용 조성물.
8. 제1항에 있어서, 상기 호노키올은 조성물 총 중량에 대하여 0.1~50 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 호노키올을 유효성분으로 함유하는 지방간 질환의 예방 및 치료용 조성물.
9. 제1항의 화학식 1로 표기되는 호노키올을 유효성분으로 함유하는 지방간 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품.
10. 제9항에 있어서, 상기 건강기능식품은 음료, 껌, 비타민 복합제 또는 건강보조식품인 것을 특징으로 하는 호노키올을 유효성분으로 함유하는 지방간 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품.

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