KR20050014453A - 호노키올 또는 매그놀올을 함유하는 간 보호용 또는,간섬유화 및 간경화 치료용 또는 예방용 조성물 - Google Patents

호노키올 또는 매그놀올을 함유하는 간 보호용 또는,간섬유화 및 간경화 치료용 또는 예방용 조성물

Info

Publication number
KR20050014453A
KR20050014453A KR1020030053093A KR20030053093A KR20050014453A KR 20050014453 A KR20050014453 A KR 20050014453A KR 1020030053093 A KR1020030053093 A KR 1020030053093A KR 20030053093 A KR20030053093 A KR 20030053093A KR 20050014453 A KR20050014453 A KR 20050014453A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
liver
honokiol
magnool
treatment
magnolol
Prior art date
Application number
KR1020030053093A
Other languages
English (en)
Inventor
손동환
박은전
김영호
Original Assignee
학교법인 원광학원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 학교법인 원광학원 filed Critical 학교법인 원광학원
Priority to KR1020030053093A priority Critical patent/KR20050014453A/ko
Publication of KR20050014453A publication Critical patent/KR20050014453A/ko

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/045—Hydroxy compounds, e.g. alcohols; Salts thereof, e.g. alcoholates
    • A61K31/05—Phenols
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/57—Magnoliaceae (Magnolia family)
    • A61K36/575—Magnolia

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

본 발명은 호노키올 또는 매그놀올을 함유하는 간 보호용 또는, 간섬유화 및 간경화 치료용 또는 예방용 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 간세포의 자가사멸 및 괴사를 억제하고 각종 산화적 또는 비산화적 원인물질에 의한 간세포의 손상을 억제함으로써 간세포를 보호하는 효능이 있고, 결합조직을 과다 생성함으로써 간섬유화 및 간경화 유발의 직접적 원인이 되는 간성상세포의 자가사멸을 촉진하는 효능이 있는 호노키올 또는 매그놀올 성분을 유효성분으로 함유함으로써 간 보호 효과 또는 간섬유화 또는 간경화의 치료 또는 예방 효과가 뛰어난 약제학적 조성물에 관한 것이다.

Description

호노키올 또는 매그놀올을 함유하는 간 보호용 또는, 간섬유화 및 간경화 치료용 또는 예방용 조성물 {Composition for protecting liver or, for treating or preventing liver fibrosis and liver cirrhosis containing honokiol or magnolol}
본 발명은 호노키올 또는 매그놀올을 함유하는 간 보호용 또는, 간섬유화 및 간경화 치료용 또는 예방용 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 간세포의 자가사멸 및 괴사를 억제하고 각종 산화적 또는 비산화적 원인물질에 의한 간세포의 손상을 억제함으로써 간세포를 보호하는 효능이 있고, 결합조직을 과다 생성함으로써 간섬유화 및 간경화 유발의 직접적 원인이 되는 간성상세포의 자가사멸을 촉진하는 효능이 있는 호노키올 또는 매그놀올 성분을 유효성분으로 함유함으로써 간 보호 효과 또는 간섬유화 또는 간경화의 치료 또는 예방 효과가 뛰어난 약제학적 조성물에 관한 것이다.
간은 소화기계와 전신순환계 사이에 위치함으로써 소화기계로 들어온 생체외 물질로부터 전신을 방어하는 기능을 수행하고 있는 매우 중요한 장기이다. 일단 생체내로 들어온 생체외 물질이 간을 통과하는 까닭에 간은 영양소외에도 많은 독성물질에 노출될 위험이 다른 장기보다 많아 그만큼 손상당할 확률도 다른 장기에 비해 높다.
간조직중에는 영양물질 흡수 및 대사, 저장, 혈장단백질 합성 등과 같은 간의 주요기능을 수행하는 간세포(hepatocyte), 간 내 대식세포(macrophage)인 쿠퍼세포(Kupffer cell), 간 손상 시 결합조직을 과다 합성함으로써 간섬유화를 초래하는 간성상세포(hepatic stellate cell; HSC) 및 내피 세포(Endothelial cell), 오목 세포(Pit cell) 등이 존재한다. 이중 간세포는 간조직을 구성하는 전체 세포의 약 90%이상을 차지하며, 간의 주요기능을 수행하는 실질 세포(parenchymal cell)로써 간질환시 간기능 저하는 바로 이 간세포 손상으로 인해 초래되는 것이다.
간은 재생 능력이 우수한 장기로 간세포가 약간 손상된 경우에는 충분히 정상으로 회복된다. 그러나 지속적으로 손상될 경우 간세포가 완전히 파괴되면서 파괴된 부분이 정상적으로 회복되지 못하고 결합조직이 과다축적되면서 간조직에scar가 형성되고 간 기능이 정상으로 회복되지 못하는 상태가 되는 것이다(Lissooset al., 1992).
이러한 간 손상의 원인은 알코올, 담즙, 바이러스 등 다양하지만 손상이 지속되어 만성 간질환(chronic liver disease; CLD) 상태가 되면 그 원인과는 상관없이 염증상태 지속, 세포외 기질(extra cellular matrix ; ECM)의 질적 및 양적 변화가 유발되게 된다. 세포수준의 변화에는 활성화된 간성상세포, 대식세포와 쿠퍼 세포가 관여하게 되며 분자적 수준의 변화에는 여러 생장 인자(growth factor), 사이토카인(cytokine), 케모카인(chemokine), ECM 조직(organization) 및 구성 (composition)의 변화 그리고 산화적 스트레스-관련성 분자(oxidative stress-related molecule)가 주요한 역할을 담당하게 된다.
이중, 원인 및 간섬유화 진행 정도가 각기 다른 만성 간질환 및 실험적 만성 간질환 모델 모두 공통적으로 산화적 스트레스(oxidative stress)가 유발되는 것으로 보고되고 있는데, 산화적 스트레스가 관측되는 간질환으로는 임상에서는 만성 HCV 감염(chronic HCV infection), 알코올성 간질환(alcohol liver disease), 유전적 혈색증(genetic hemochromatosis), 윌슨씨병(Wilson's disease), 원발성 담즙 간경변(primary biliary cirrhosis), 기타 담즙 분비장애성 질환(cholestatic disease)이 있으며, 실험동물 모델로는 담관 결찰(bile duct ligation), 사염화탄소 투여(CCl4administration), 에탄올 투여(ethanol administration), 철 과부하 (iron overload) 모델, 구리 과부하(copper overload) 모델 등에서 관측되고 있다.산화적 스트레스란 산화적 스트레스-관련성 분자가 세포의 항산화 방어 (cellular anti-oxidant defence)를 능가함으로 인하여 세포내 단백질, 지질, 탄수화물 또는 핵산 등에 산화적 손상이 가해지는 현상이다. 세포내/외로부터 유래되는 산화적 스트레스-관련성 분자로는 (1) 과산화수소(hydrogen peroxide) 및 수퍼옥사이드 음이온(superoxide anion)과 같은 반응성 산소 매개자(reactive oxygen intermediates ; ROI) 및 (2) 지질과산화에 의한 알데히드성 최종 산물 (aldehydic end-products) 등이 있다.
간세포 손상은 간질환에서는 일반적 현상으로, 산화적 스트레스의 정도에 따라 간세포 괴사(hepatocyte necrosis) 또는 간세포 사멸(hepatocyte apoptosis)이 유도된다. 급성 간손상(acute liver injury)과 같이 산화적 스트레스가 심한 상태에서는 주요 세포 구조(미토콘드리라와 세포골격 단백질), 거대분자(DNA, 지방, 효소성 단백질) 및 대사 경로가 손상되어 결국 괴사가 초래되게 된다. 산화적 스트레스가 상대적으로 약한 경우 즉, 미토콘드리아의 기능을 비가역적으로 완전히 손상시킬 수 없는 경우에는 간세포가 괴사보다는 사멸로 유도되는 것으로 보고되고 있다. CLD 상태에서는 대부분 중등도의 산화적 스트레스가 유지되는 것으로 생각되며 간섬유화 상태에서도 중등도의 산화적 스트레스가 유지되는 것으로 알려져 있다.
아폽토시스(또는 자가사멸, apoptosis, programmed cell death)는 1972년 Kerr에 의해 소개된 명칭으로 1980년대 중반 이후 많이 연구되기 시작한 분야이다. 아폽토시스는 조직 항상성(tissue homeostasis)을 유지하기 위한 필수 과정으로,정상조직에서 세포의 신생과 균형을 유지하고 있는 세포의 손실 과정이다. 아폽토시스 유도시 세포는 온전한 세포기관(intact organelle)과 원형질막의 막-결합 (membrane-bound) 소체로 분리된다. 명령된(ordered) DNA 단편화는 아폽토시스의 대표적인 특징으로 아폽토시스 유도에 의해 활성화된 엔도뉴클레아제 (endonuclease)는 DNA를 먼저 50-에서 300-kb의 크기로 절단한 후 다시 180-200 base pair의 단편으로 조각낸다. 이러한 DNA 단편화(DNA laddering)는 아폽토틱 세포(apoptotic cell) 대부분에서 관찰된다. 아폽토시스가 완전히 진행된 세포는 아폽토시스 소체(apoptotic body)라 지칭되며 이러한 아폽토시스 소체는in vivo에서 식세포(phagocytes)에 의해 제거된다. 일반적으로, 아폽토틱 세포는 세포내 구성요소(intracellular constituent)가 세포내에 그대로 존재하는 상태로, 세포내 구성요소사 세포 외부로 유출되는 괴사와는 달리 염증반응을 유발하지 않고 제거되는 것이다. 즉, 염증의 유발 없이 세포를 제거할 수 있다는 점에서 아폽토시스가 암세포 제거방법으로 각광받고 있다.
아폽토시스에 의해 염증반응이 유발되지 않으므로 세포의 아폽토시스는 생리적 변화에 미치는 영향이 크지 않은 것이 일반적이지만, 간세포의 아폽토시스는 이러한 일반적인 상태와는 많이 다른 것으로 보고되고 있다. 즉, 간세포의 아폽토시스가 심각한 경우 간세포 내 여러 효소의 수치가 혈중 증가되며, 식세포에 의한 제거가 충분하지 못한 상태가 되어 결국에는 염증반응이 유발되며 간조직의 정상적인 구조가 파괴된다. 예전에 괴사에 의해서 유도된다고 알려졌던 많은 질환들에서도 아폽토시스가 중요한 역할을 하는 것으로 보고되고 있으며, 알코올, 바이러스 또는담즙정체 등으로 인한 간질환에서도 심각한 간손상 및 간기능 저하는 간세포의 아폽토시스에 의한 것임이 보고되고 있다.
담즙정체(cholestasis)는 여러 만성 진행형 간질환(chronic progressive liver disease)에서 발견되는 특징으로, 결국에는 간손상 및 경화(cirrhosis)를 유발하며 결국 사망까지 초래한다. 담즙정체시 케노디옥시콜레이트 (chenodeoxycholate) 및 디옥시콜레이트(deoxycholate)와 같은 소수성 담즙산염 (hydrophobic bile salt)이 간세포 내 축적됨으로써 간손상이 유도된다. 담즙정체에 의한 간손상시 임상에서의 조직관찰 결과 간세포 괴사보다 간세포의 아폽토시스가 더 중요한 역할을 하는 것으로 보고되었다. 1차 배양한 간세포에 20∼100 μM의 글리코케노디옥시콜레이트(glycochenodeoxycholate ; GCDC)와 같은 친수성 담즙산염을 처리함으로써 간세포의 아폽토시스를 유도하는in vitro실험모델은 내인성 독성물질에 의한 간세포 아폽토시스의 연구에 유용하게 사용되고 있다. GCDC와 같은 친수성산은 Fas 올리고머리제이션(Fas oligomerization)을 유도함으로써 아폽토시스를 유발시킨다. Fas 올리고머리제이션에 의해 프로캐스파제-8(procaspase-8)이 캐스파제-8(caspase-8)로 분열 및 활성화되어 다운스트림 캐스파제 (downstream caspase)(effector caspase; caspase-3,-6,-7)를 활성화시킴으로써 아폽토시스가 유도된다. 또 GCDC는 단백질 키나아제(protein kinase C ; PKC)의 활성화 및 자리바꿈(translocation)에 의해 세포내 마그네슘이 증가되어 Mg2+-의존성 엔도뉴클레아제가 활성화됨으로써 DNA 분열이 유발된다고도 보고되고 있다.
이상에서 설명한 바와 같이, 여러 원인에 의한 만성 간손상은 공통적으로 간섬유화를 초래하게 되며 그 기전을 요약하면 다음과 같다. 여러 원인에 의해 간세포가 손상되고, 간 내 대식세포(macrophage)인 쿠퍼 세포(Kupffer cell)가 활성화되어 여러 사이토카인(cytokine)을 분비하게 되면 이에 의해 간성상세포가 활성화되어 결합조직을 생성한다. 간 손상이 지속되게 되면 손상당한 간세포가 결합조직으로 대치되는 간질 복구(stromal repair)가 유발되어 간조직 내 결합조직 과다축적으로 인한 scar가 형성되고 간세포 손상으로 인해 간기능이 저하되면서 간섬유화 및 간경화가 초래되는 것이다(Rojkindet al.,clinical Hepatology., 1983; Rubinet al.,Essential pathology., second, 339-41, 1995).
간섬유화 치료제는 간섬유화 시 가장 문제가 되는 과다한 결합조직을 생성하는 간성상세포(hepatic stellate cell, HSC)에 초점이 모아지고 있다. 기존에는 간섬유화 치료제의 개발을 위하여 페니실라민, 16,16-디메틸 프로스타글란딘 E2, 콜키친, 글루코코티코이드, 말로틸산(malotilate), 감마 인터페론, 펜톡시필린 (pentoxifylline), 피리딘-2,4-디카르복실릭-디에틸아미드, 피리딘-2,4-디카르복실릭-디(2-메톡시에틸) 아미드 등의 약물과 같이 간성상세포 활성 억제 또는 결합조직 합성 억제 및 분해 촉진에 초점을 맞추어 연구하였으나(Bokeret al.,J. Hepatol., 13, s35, 1991; Tamayoet al.,ibid, 3, 112, 1983; Jenkinset al.,ibid, 1, 489, 1985; Kershenobichet al.,ibid, 7, 1104, 1987; Svegliatiet al., 18, 209A, 1993; Guzelianet al., Gastro., 86, 897, 1984; Ala-Kokkoet al.,J.Lab.Clin.Med., 113, 177, 1989), 최근 실험적 간섬유화 모델에서 간섬유화회복시 HSC의 아폽토시스가 보고되면서 새로운 간섬유화 치료법으로서 HSC 아폽토시스 촉진에 대한 관심이 모아지고 있다(Kweonet al.,J.Hepatol.2003; Iredale, Sem Liv Dis.2001).
그러나 많은 연구에도 불구하고 아직까지 독성 없이 임상에서 확실한 효과를 나타내는 간섬유화 치료제는 개발되지 않은 실정이다. 간은 침묵의 장기로 완충작용이 탁월하여 간의 일부가 손상을 당해 그 기능을 수행하지 못하여도 남은 일부가 그 기능까지 수행함으로써 간 질환시 초기에 자각증상을 거의 느끼지 못하여 조기진단이 어렵고 말기에서야 발견되기 때문에 그 치료가 쉽지 않으며, 적당한 치료제도 없는 실정으로 사망률 또한 높아 사회적인 문제를 야기하고 있다.
이에, 본 발명자들은 간을 보호하고 간섬유화 또는 간경화를 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있는 효능의 물질을 찾고자 연구를 거듭한 결과, 후박으로부터 분리되는 호노키올(honokiol) 또는 매그놀올(magnolol) 성분이 간세포의 아폽토시스(apoptosis)를 억제하고 각종 독성 물질에 의한 간세포의 괴사(necrosis) 및 손상을 방지하는 등의 간 보호 효과가 있고, 간섬유화 또는 간경화의 새로운 치료법으로 대두되고 있는 간성상세포의 자가사멸을 촉진함으로써 간섬유증 및 간경화증 치료에 이용될 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
따라서 본 발명의 목적은 호노키올 또는 매그놀올의 신규한 효능으로써 간보호 또는, 간섬유화 및 간경화 치료 또는 예방 효능을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기와 같은 효능의 호노키올 또는 매그놀올을 유효성분으로 함유하는 간 보호용 및, 간섬유화 또는 간경화 치료용 또는 예방용 조성물을 제공하는데 있다.
도 1은 본 발명에 따른 호노키올(honokiol) 또는 매그놀올(manolol)이 담즙산염에 의한 간세포 손상시 유도되는 DNA 단편화(fragmentation)를 억제하는 효과가 있음을 보이는 도면이다.
도 2는 본 발명에 따른 호노키올 또는 매그놀올에 의해 자가사멸되고 있는 간성상세포의 현미경 관찰 도면이다.
도 3은 본 발명에 따른 호노키올 또는 매그놀올에 의해 간성상세포가 자가사멸되어 유도된 DNA 단편화를 보이는 도면이다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 간보호 또는 간섬유증 및 간경화의 치료 또는 예방 효능이 있는 호노키올(honokiol) 또는 매그놀올(magnolol)을 유효성분으로 함유하는 약제학적 조성물을 제공하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 기존에 항-헬리코박터 파이로리 활성, 항알러지, 항박테리아, 항균, 항염증 및 신경보호, 일산화질소 생성 및 TNF-α발현 활성 억제 또는 항암 등의 효능이 있는 것으로 밝혀진 호노키올 또는 매그놀올의 신규한 효능으로써 간보호 효능 및 간섬유화 또는 간경화 치료 또는 예방 효능이 있음을 밝힌 데 그 특징이 있다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.
본 발명에 따른 호노키올 또는 매그놀올은 후박(Magnolia obovataTHUNBERG 및M. officinalisRehder et Wilson)으로부터 분리되는 네오리그난스(neolignans)계 성분으로, 이성질체(isomer) 관계의 성분이다. 호노키올은 3',5-디-프로페닐-[1,1'-바이페닐]-2,4'디올 (3',5-Di-2-prophenyl-[1,1'-biphenyl]-2,4'diol), 매그놀올은 5,5'-디-2-프로페닐-[1,1'-바이페닐]-2,4'디올(5,5'-Di-2-prophenyl-[1,1'-biphenyl]-2,4'diol)의 화학명을 갖고 있으며, 그 화학적 구조는 다음 화학식 1(호노키올) 및 화학식 2(매그놀올)와 같다.
현재까지 보고된 호노키올 및 매그놀올의 작용으로는 평활근 이완(smooth muscle relaxation)(Koet al.,Planta Med. 2003), 중추 억제제 효과(a central depressant effect)(Kuribaraet al.,J.Pharm.Pharmacol. 2000), 항-헬리코박터 파이로리 활성(anti-Helicobacter pylori activity)(Baeet al.,Biol.Pharm. Bull. 1998), 항알러지 효과(antiallergic effect)(Ikarashiet al.,Planta Med. 2001), 항박테리아 효과(antibacterial effect)(Hoet al.,Phytother.Res. 2001), 항균 효과(anti-fungal effect)(Banget al.,Arch.Pharm.Res. 2000), 항염증 및 신경보호 효과(anti-inflammatory and neuroprotective effect)(Leeet al.,Chin. J.Physiol.2000), 일산화질소 생성 및 TNF-α발현 활성의 억제 효과(inhibition of nitric oxide production and inhibition of TNF-alpha expression activity)(Sonet al.,Planta Med.2000), 항암 효과(anti-cancer effect)(Baiet al.,J. Biol.Chem., 2003; Zhonget al.,Anticancer drugs2003; Yanget al.,Br.J. Pharmacol., 2003; Linet al.,J.Cell.Biochem. 2002) 등이 알려져 있다. 또한, 호노키올 및 매그놀올이 허혈성-재관류(ischemic-reperfusion)에 의한 소장의 손상을 억제하며(Loonget al.,Transplant Proc. 2003), 허혈성-재관류에 의한 과산화(peroxidative) 손상시 간 손상을 방지하는 효과가 있어 간 이식 수술시 이식할 간의 보관액으로 사용할 수 있음을 보고한 논문(Chiuet al.,J.Surg.Res.1999; Chiuet al.,Life Sci. 1997)이 발표된 바 있다.
본 발명에 따른 호노키올 또는 매그놀올은 본 발명 기술분야에서 널리 알려진 방법에 의하여 추출된 것 또는 시판중인 것을 적의 선택하여 사용할 수 있으며, 그 방법 또는 물질은 특별히 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 호노키올 또는 매그놀올의 분리방법의 구체적인 예를 들면 다음과 같으나, 본 발명의 권리범위가 이에 한정하는 것은 아니다. 후박(M. obovata)의 줄기껍질 건조물의 70% 에탄올 추출액을 물에 분산한 다음 에틸아세테이트로 분배하여 획득한 에틸아세테이트 가용부분을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피를 걸은 다음 hexane:EtOAc gradient (10:10:1)로 용출하고, 상기 용출물을 박층 크로마토그래피(TLC 실리카 겔)의 패턴에 따라 7개 분획으로 나눈 다음 그 중 분획 3을 이동상을 CHCl3MeOH (10:1)로 사용하여 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피를 반복함으로써 매그놀올과 호노키올을 분리하는 것이다(Banget al.,Arch.Pharm.Res.2000).
본 발명에 따른 호노키올 또는 매그놀올은 간세포에서 담즙산염에 의하여 유도되어 활성이 증대되는 캐스파제-3(caspase-3)의 활성을 유의적으로 감소시키고 DNA 단편화(fragmentation)의 유도를 억제함으로써 담즙산염에 의한 간세포의 자가 사멸을 억제하는 효능이 있고, 3차 부틸 하이드로페록사이드(tertiary-butyl hydroperoxide ; tBH)에 의한 산화적 간 손상 또는 D-갈락토사민(D-Galactosamine) 등에 의한 간 손상시 세포 괴사의 지표로써 배양액 중으로 유출이 증대되는 락테이트 디하이드로게나제(Lactate dehydrogenase ; LDH) 및 아스파테이트 트랜스아미나제(aspartate transaminase ; AST)의 유출을 억제하고 간세포의 사멸을 억제하는 효능이 있고, 세포내 자유기(free radical) 생성을 억제하고 과산화지질의 생성을 억제하며 세포내 글루타티온(glutathione ;GSH)(reduced form)의 고갈을 방지함으로써 간의 손상을 방지하는 효능이 있다.
또한, 본 발명에 따른 호노키올 또는 매그놀올은 간 손상시 결합조직을 과다생성함으로써 간섬유화 또는 간경화 유발의 결정적 원인이 되는 간성상세포를 자가사멸시킴으로써 간섬유화 또는 간경화 치료용 또는 예방용 성분으로도 이용될 수 있는 효능이 있다.
본 발명에 따른 호노키올 또는 매그놀올은 상기와 같은 효능이 있으므로, 간보호용 조성물의 유효성분으로 이용될 수 있고, 간섬유화 또는 간경화 치료용 또는예방용 조성물의 유효성분으로 이용될 수 있다.
상기 조성물 중에서 유효성분으로 이용되는 호노키올 또는 매그놀올의 유효량은 투여방법, 제제형태, 환자의 나이, 환자의 체중, 환자의 감수성 및 질환의 상태에 따라 적절하게 선택되어질 수 있으며, 구체적으로 제한되는 것은 아니지만, 일반적으로 호노키올 또는 매그놀올을 1∼2,000㎎/㎏체중의 농도로 투여되도록 제형화될 수 있다. 물론, 유효성분의 투여량이 상기 범위에 한정되는 것은 아니고, 상기 범위를 벗어난 양일 수도 있다.
본 발명에 따른 호노키올 또는 매그놀올을 상기한 범위 내로 투여하기 위한 제제는 통상의 형태를 가질 수 있으며, 예를 들면 알약, 캅셀 형태나 드링크제, 의약품 등의 형태로 사용할 수 있다. 이들은 경구 또는 각종의 비경구 투여경로를 간보호 및 간섬유화 또는 간경화 치료 또는 예방을 위해 투여될 수 있으며, 투여제형에 따라 적합한, 그리고 당업자에게 이미 주지되어 있으며 당업자가 용이하게 선정할 수 있는 각종의 부형제, 담체 또는 희석제 등을 더 함유할 수 있다.
이하, 참고예 및 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 권리범위가 이에 한정되는 것은 아니고, 당업자에 의해서 용이하게 실시될 수 있는 삽입, 삭제 및 수정 등의 변형도 본 발명의 범위 내에 포함되는 것이다.
[참고예 1] 흰쥐로부터 간세포 분리 및 배양
새글랜(Seglen) 등의 방법에 따라 흰쥐로부터 간세포를 분리하였다.
흰쥐를 마취하여 복부를 절개한 후, 간문맥에 삽관하여 5% CO2및 95% O2의 혼합기체를 불어넣은 37℃의 Ca2+, Mg2+-없는 행크의 균형염 용액(Ca2+, Mg2+-free Hank's balanced salt solution)을 관에 흘려보내 간 내 혈액을 제거하였다. 그런 다음, 0.05% Ⅳ형 콜라겐나아제(collagenase type IV) 및 1mM CaCl2용액을 흘려보냈다. 간 조직을 몸체로부터 떼어낸 다음 간세포 현탁액을 만들어 50×g에서 2분간 원심분리하고 침전된 간세포를 취해 Ca2+, Mg2+-없는 행크의 균형염 용액으로 2회 세척한 다음 1형 콜라겐으로 코팅된 배양용기에 10%(v/v) 우태아 혈청(fetal bovine serum; FBS, GibcoBRL), 10-8M 인슐린, 50 U/㎖의 페니실린 및 50 ㎍/㎖의 스트렙토마이신(Sigma)이 첨가된 윌리암스 배지 E(Williams'Medium E; WME, GibcoBRL, USA)를 배양액으로 하여 세포수가 1×106 세포수/㎖ 되도록 한 후, 5% CO2, 37℃의 조건에서 배양하였다. 2시간 배양 후 세포를 행크의 균형염 용액으로 세척하여 붙지 않은 간세포는 제거하고 새 배양액으로 교체한 다음 5% CO2, 37℃의 조건에서 16시간동안 배양시킨 다음 실험에 사용하였다.
[참고예 2] 호노키올 및 매그놀올의 분리
후박(M. obovata)의 줄기껍질 건조물 1.5㎏의 70% 에탄올 추출액 280g을 물에 분산한 다음 에틸아세테이트로 분배하여 에틸아세테이트 가용부분 120g을 획득하였다. 상기 에틸아세테이트 가용부분을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(940㎝, 70230 mesh)를 걸고 hexane:EtOAc gradient(10:10:1)로 용출하였다. 박층 크로마토그래피(TLC 실리카 겔)의 패턴에 따라 7개 분획으로 나누었으며, 그 중 분획 3 (15.2 g)을 이동상을 CHCl3MeOH(10:1)로 사용하여 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (530㎝, 230400 mesh)를 반복함으로써 매그놀올[1.6 g, colorless plates, m.p. 102103 C, []: 6.6 (c 0.2, CHCl3)]과 호노키올[0.21 g, colorless plates, m.p. 8788 C, []: 4.9 (c 0.2, CHCl3)]을 각각 분리하였다(Banget al.,Arch.Pharm.Res.2000).
상기 분리한 호노키올 및 매그놀올을 이용하여 하기 실험을 실시하였다.
[참고예 3] 1차 배양 간세포에서 담즙산염에 의한 간세포 아폽토시스 (아폽토시스) 유도 및 호노키올 또는 매그놀올 처리
참고예 1에서와 같이 분리 배양한 간세포의 GGCDC에 의한 아폽토시스를 유발하기 위하여, 100 μM 글리코케노디옥시콜레이트(glycochenodeoxycholate ; GCDC)와 호노키올 또는 100 μM GCDC와 매그놀올을 함유한 배양액에서 간세포를 4시간 동안 배양하였다. GCDC는 HBSS에 용해한 다음 0.22 ㎛ 필터로 여과한 다음 사용하였으며, 호노키올 또는 매그놀올은 DMSO에 100 mM의 농도가 되도록 용해한 다음 사용하였다. 실험군은 다음과 같이 설정하였다.
1군 정상 배양액 처리
2군 100 μM GCDC 함유 배양액 처리
3군 100 μM GCDC와 호노키올 (40 μM) 함유 배양액 처리
4군 100 μM GCDC와 호노키올 (20 μM) 함유 배양액 처리
5군 100 μM GCDC와 호노키올 (5 μM) 함유 배양액 처리
6군 100 μM GCDC와 매그놀올 (40 μM) 함유 배양액 처리
7군 100 μM GCDC와 매그놀올 (20 μM) 함유 배양액 처리
8군 100 ??M GCDC와 매그놀올 (5 μM) 함유 배양액 처리
[참고예 4] 1차 배양 간세포에서 3차 부틸 하이드로페록사이드에 의한 간손상 유도 및 호노키올 또는 매그놀올 처리
참고예 1에서와 같이 분리 배양한 간세포에 산화적 손상을 유발하기 위하여 1.5 mM 3차 부틸 하이드로페록사이드(tBH, Sigma, USA)를 처리하였다. 간세포에 호노키올 또는 매그놀올을 함유하는 배양액을 가한 다음 1.5 mM tBH를 1.0시간 동안 처리하였다. tBH는 150 mM이 되도록 HBSS로 희석한 다음 배양액에 가하여 1.5 mM이 되도록 준비한 것을 사용하였다. 실험군은 다음과 같이 설정하였다.
1군 정상 배양액 처리
2군 1.5 mM tBH 함유 배양액 처리
3군 1.5 mM tBH와 호노키올 (40 μM) 함유 배양액 처리
4군 1.5 mM tBH와 호노키올 (20 μM) 함유 배양액 처리
5군 1.5 mM tBH와 호노키올 (5 μM) 함유 배양액 처리
6군 1.5 mM tBH와 매그놀올 (40 μM) 함유 배양액 처리
7군 1.5 mM tBH와 매그놀올 (20 μM) 함유 배양액 처리
8군 1.5 mM tBH와 매그놀올 (5 μM) 함유 배양액 처리
[참고예 5] 1차 배양 간세포에서 D-갈락토사민(D-galactosamine)에 의한 간손상 유도 및 호노키올 또는 매그놀올 처리
호노키올 또는 매그놀올의 간세포 보호효과가 산화적 손상이 아닌 다른 기전에 의한 손상에 대해서도 유효한지 여부를 알아보기 위하여 D-갈락토사민(GalN, Sigma, USA)으로도 간세포 손상을 유도하여 그 보호효과를 확인하였다. GalN은 사람에서의 바이러스성 간염과 유사한 간 손상을 유도하는 것으로 알려져 있으며, 우리딘 뉴클레오티드(uridine nucleotide)를 고갈시킴으로써 원형질막 단백질(plasma membrane protein)과 RNA 합성을 저해함으로써 간세포 손상을 유발하는 것으로 알려져 있다(Wuet al., Hepatology. 1996).
참고예 1에서와 같이 분리 배양한 간세포에 손상을 유발하기 위하여 30 mM tBH를 처리하였다. 간세포에 호노키올 또는 매그놀올을 함유하는 배양액을 가하여 30분 동안 전처리한 후 30 mM GalN를 가하여 24시간 동안 처리하였다. GalN는 HBSS에 용해한 다음 배양액에 가하여 30 mM이 되도록 준비한 것을 사용하였다. 실험군은 다음과 같이 설정하였다.
1군 정상 배양액 처리
2군 30 mM GalN 함유 배양액 처리
3군 30 mM GalN과 호노키올 (20 μM) 함유 배양액 처리
4군 30 mM GalN과 호노키올 (5 μM) 함유 배양액 처리
5군 30 mM GalN과 호노키올 (1 μM) 함유 배양액 처리
6군 30 mM GalN과 매그놀올 (20 μM) 함유 배양액 처리
7군 30 mM GalN과 매그놀올 (5 μM) 함유 배양액 처리
8군 30 mM GalN과 매그놀올 (1 μM) 함유 배양액 처리
[참고예 6] 간성상세포 분리배양 및 호노키올 또는 매그놀올 처리
간섬유증 간에서 결합조직이 과다하게 축적되는 데에 있어서, 간성상세포는 결정적인 역할을 하며, 정상 간에서는 약 7%의 비율로 존재하는 것으로 밝혀졌다.
프리에드만(Friedman) 등의 방법을 수정하여 흰쥐로부터 간성상세포를 분리하였다.
흰쥐를 마취하여 복부를 절개한 후, 간문맥에 삽관하여 5% CO2및 95% O2의 혼합기체를 불어넣은 37℃의 Ca2+, Mg2+-없는 행크의 균형염 용액(Ca2+, Mg2+-free Hank's balanced salt solution)을 관에 흘려보내 간 내 혈액을 제거하였다. 그런 다음, 0.05% Ⅳ형 콜라겐나아제(collagenase type IV) 및 1mM CaCl2용액을 흘려보냈다. 간 조직을 몸체로부터 떼어낸 다음, 간세포 현탁액을 만들어 50×g에서 2분간 원심분리한 후, 침전된 간세포를 제거한다. 간세포가 제거된 상층액을 11.5%및 17% 메트리자마이드(metrizamide, Sigma)층 위에 쌓고, 1,700×g에서 15분간 원심분리하여 간성상세포층을 획득하였다. 이 간성상세포층을 행크의 균형염 용액으로 세척한 다음, 코팅되지 않은 배양용기에 10%(v/v) 우태아 혈청(fetal bovine serum; FBS, GibcoBRL), 50U/㎖의 페니실린 및 50 ㎍/㎖의 스트렙토마이신(Sigma)이 첨가된 윌리암스 배지 E(Williams' Medium E; WME, GibcoBRL, USA)를 배양액으로 하여 세포수가 5×105 세포수/㎖ 되도록 한 후, 5% CO2, 37℃의 조건에서 배양하였다. 계대배양한 간성상세포를 10% 대신 5%의 FBS가 첨가된 배양액으로 바꿔 호노키올 또는 매그놀올을 처리하였다. 호노키올 또는 매그놀올은 12.5, 25, 50μM로 16시간 처리하였다.
[실시예 1] 담즙산염에 의한 간세포 아폽토시스시 캐스파제-3 활성에 미치는 호노키올 또는 매그놀올의 보호효과 측정
간세포 아폽토시스 과정 중 활성이 증대되는 캐스파제-3의 활성은 시판되는 캐스파제-3 activity colorimetric assay kit(R&D Systems,Inc.,USA)를 이용하여 참고예 3에서와 같이 처리한 간세포 실험군을 대상으로 측정하였으며 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
표 1에서 보는 바와 같이, 호노키올 또는 매그놀올은 100 μM GCDC 처리 시 활성이 증대되는 캐스파제-3의 활성을 유의적으로 감소시키는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
군 번호 캐스파제-3 활성 (%) 군 번호 캐스파제-3 활성(%)
1 26.4±3.2 5 80.5±7.6a
2 100.0±5.6a 6 49.7±8.7a,b
3 46.7±7.5b 7 70.1±8.9a,b
4 62.0±6.6a,b 8 90.3±9.2a
[주]aP< 0.001, 1군에 비해 통계학상 유의적인 차이를 보임bP< 0.001, 2군에 비해 통계학상 유의적인 차이를 보임
[실시예 2] 담즙산염에 의한 간세포 아폽토시스시 DNA 단편화에 미치는 호노키올 또는 매그놀올의 보호효과 측정
아폽토시스에 의한 간세포내 DNA 단편화에 미치는 호노키올 또는 매그놀올의 보호효과를 참고예 3에서와 같이 처리한 간세포 실험군에서 다음과 같이 실시하였다.
간세포 내 DNA를 시판되는 Wizard Genomic DNA purifiction kit (Promega, USA)를 이용하여 추출 및 정량한 다음 30 ㎍의 DNA를 2% 아가로스 겔에서 50 mV, 40분간 전기영동하여 UV 하 DNA 단편화를 확인하였으며 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에서와 같이, 100 μM GCDC 처리시 간세포의 DNA 단편화가 유도되었으나 호노키올과 100 μM GCDC 또는 매그놀올과 100 μM GCDC를 같이 처리한 간세포의 경우 DNA 단편화 유도가 억제됨을 확인하였다.
[실시예 3] tBH에 의한 산화적 손상에 대한 호노키올 또는 매그놀올의 간세포 보호효과 측정
참고예 4에서와 같이 간세포에 tBH를 처리한 다음 산화적 손상에 의해 간세포로부터 배양액 중으로 흘러나온 락테이트 디하이드로게나제(lactate dehydrogenase;LDH) 수치 및 아스파테이트 트랜스아미나제(aspartate transaminase ; AST)를 autodry chemistry analyzer(SPOTCHEMTMSP4410, Arkray, Japan)를 이용하여 측정하였다.
간세포의 생존율을 측정하기 위하여 tBH와 호노키올 또는 매그놀올 함유 배양액을 걷어내고 3-(4,5-디메틸티아졸-1-일)2,5-디페닐 테트라졸리움 브로마이드 (3-(4,5-dimethylthiazol-1-yl)2,5-diphenyl tetrazolium bromide ; MTT)를 0.5 ㎎/㎖ 함유하는 배양액 중에서 2시간 동안 배양한 다음 살아있는 간세포에 의하여 생성된 포마잔(formazan)을 디메칠술폭사이드(dimethylsulfoxide)에 용해하여 540nm에서의 흡광도값를 구하였다. 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
군번호 LDH(IU/L) AST(IU/L) 생존율(1군에 대한 %) 군번호 LDH (IU/L) AST(IU/L) 생존율(1군에 대한 %)
1 108±11 35±1 100±3 5 864±50a,b 153±22a 14±2a
2 1141±112a 195±27a 11±0a 6 556±54a,b 94±6a,b 26±3a,b
3 426±24a,b 71±8a,b 31±2a,b 7 1003±159a 165±27a 13±1a
4 762±51a,b 120±13a,b 19±3a,b 8 1091±121a 188±20a 12±2a
[주]aP< 0.001, 1군에 비해 통계학상 유의적인 차이를 보임bP< 0.001, 2군에 비해 통계학상 유의적인 차이를 보임
표 2의 결과로부터, 본 발명에 따른 호노키올 또는 매그놀올은 산화적 손상에 의한 간세포 손상 유도시 LDH 및 AST 유출 억제 및 세포 사멸(cell death)을 억제함으로써 간세포 보호효과가 있음을 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과는 호노키올 또는 매그놀올을 간세포 보호용 성분으로 사용할 수 있음을 보이는 것이다.
[실시예 4] tBH에 의한 산화적 손상에 대한 호노키올 또는 매그놀올의 간세포 내 ROS 생성 억제, 지질과산화 억제 및 GSH 고갈 억제 효과의 측정
간세포에서의 반응성 산소종(reactive oxygen species ; ROS)의 생성 정도를 2',7'-디클로로플루오레신 아세테이트(2',7'-dichlorofluorecin acetate ; DCFH-DA)를 이용하여 측정하였다. DCFH-DA는 비극성 화합물(nonpolar compound)로, 세포내로 용이하게 유입(uptake)된 후 형광을 띠지 않는 DCFH로 가수분해되어 세포내에 갇히게(trap) 되며, ROS 등의 산화성 물질에 의해 형광을 띠는 2',7'-디클로로플루오레신(2',7'-dichlorofluorescein ; DCF)으로 변환되는 특징을 갖는 물질로, 세포내 ROS의 존재 정도를 측정하는데 사용된다. 참고예 4에서와 같이 호노키올과 tBH 또는 매그놀올과 tBH를 처리한 간세포에 20 μM DCFH-DA를 가하여 15분 동안 배양한 다음 간세포 중 형광강도를 여기(excitation) 파장 485 ㎚, 방출(emission) 파장 530 ㎚에서 형광광도계(RF-5301, Shimadzu, Japan)를 이용하여 측정하였다. 각 실험군의 DCF 생성능은 2군에서의 DCF 형광강도를 100%로 하여 산출하였으며, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
간세포에서의 과산화지질의 생성정도를 티오바르비투르산(thiobarbituric acid ; TBA)법을 이용하여 티오바르비투르산 활성화 물질(thiobarbituric acidreactive substance ; TBARS)을 측정하여 비교하였다. 간세포에서의 과산화지질인 말론디알데히드(malondialedhyde)는 생리학적 pH(physiologic pH)에서는 에놀레이트 음이온(enolate anion) 형인 수용성 상태로 존재하므로 대부분의 말론디알데히드는 배양액에 존재하게 된다. 이에, 과산화지질을 배양액 중에서 다음과 같이 측정하였다. 배양액 1 ㎖에 TBA액(TBA 0.375 g, 12N HCl 2.1 ㎖, 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid) 30 g in 100 ㎖ DDW) 1 ㎖를 가하고 95℃에서 20분간 반응시킨 다음 부탄올 3 ㎖를 가하여 10초간 보텍스(vortex)한 후 3000 rpm에서 10분간 원심분리한 상층액을 취하여 여기 파장 532 ㎚, 방출 파장 553 ㎚에서 형광강도를 측정하였다. 표준물질로는 1,1',3,3'-테트라에톡시프로판(1,1',3,3'- tetraethoxypropane, Sigma, USA)을 사용하였다. 각 실험군에서의 TBARS의 양은 2군에서의 형광강도를 100%로 하여 산출하였으며 그 결과를 표 3에 나타내었다.
간세포내 GSH(reduced form)의 함유량은 colorimetric assay kit (Bioxytech®GSH-400, OXIX International, Portland, USA)를 사용하여 kit의 사용방법에 따라 측정하였으며, 그 결과를 표 3에 나타내었다.
군번호 DCF (%) TBARS(pmole 말론디알데히드/㎎ protein) GSH(nmole/㎎ protein) 군 번호 DCF (%) TBARS(pmole 말론디알데히드/㎎ protein) GSH(nmole/㎎ protein)
1 100±10.3 319.7±68.2 12.3±3.1 5 196±7.8a 4405.0±777.1a,b 4.9±1.1a,b
2 257±10.8a 8834.3±877.1a 2.3±0.5a 6 145±9.2a,b 1930.0±448.5a,b 5.5±0.9a,b
3 117±8.9a,b 1099.0±109.1a,b 6.4±1.1a,b 7 178±10.8a,b 2559.0±285.2a,b 4.2±0.4a
4 168±10.5a,b 1667.7±208.8a,b 6.0±0.8a,b 8 231±12.0a 7692.3±772.5a 3.2±0.7
[주]aP< 0.001, 1군에 비해 통계학상 유의적인 차이를 보임bP< 0.001, 2군에 비해 통계학상 유의적인 차이를 보임
위 결과로부터 호노키올 또는 매그놀올은 간세포 내 산화적 손상의 원인이 되는 ROS를 유의적으로 감소시키고, 지질과산화를 유의적으로 억제하며 세포내 GSH의 고갈을 억제하는 효과가 있음을 확인하였다. 이러한 결과는 호노키올 또는 매그놀올은 간세포의 산화적 손상을 효과적으로 억제함으로써 간세포 보호용 성분으로 사용될 수 있음을 보이는 것이다.
[실시예 5] GalN에 의한 간세포 손상에 대한 호노키올 및 매그놀올의 보호효과 측정
참고예 5에서와 같이 간세포에 30 mM GalN를 처리하여 발생한 손상에 의해 간세포로부터 배양액 중으로 흘러나온 락테이트 디하이드로게나제 수치 및 아스파테이트 트랜스아미나제를 autodry chemistry analyzer(SPOTCHEMTMSP4410, Arkray, Japan)를 이용하여 측정하였다.
간세포의 생존율을 측정하기 위하여 GalN과 호노키올 또는 매그놀올 함유 배양액을 걷어내고 3-(4,5-디메틸티아졸-1-일)2,5-디페닐 테트라졸리움 브로마이드를 0.5 ㎎/㎖ 함유하는 배양액 중에서 2시간 동안 배양한 다음 살아있는 간세포에 의하여 생성된 포마잔을 디메칠술폭사이드에 용해하여 540nm에서의 흡광도값을 구하였다. 그 결과를 표 4에 나타내었다.
군번호 LDH (IU/L) AST(IU/L) 생존율(1군에 대한 %) 군번호 LDH (IU/L) AST(IU/L) 생존율(1군에 대한 %)
1 5169± 20±1 100±9 5 362±44a,b 45±10a,b 36±2a
2 540±45a 95±11a 19±3a 6 252±63a,b 15±6a,b 51±2a,b
3 175±33a,b 11±2a,b 51±4a,b 7 272±58a,b 21±3a,b 45±3a,b
4 201±23a,b 13±2a,b 51±8a,b 8 316±27a,b 39±7a,b 40±2a,b
[주]aP< 0.001, 1군에 비해 통계학상 유의적인 차이를 보임bP< 0.001, 2군에 비해 통계학상 유의적인 차이를 보임
표 4의 결과로부터, 본 발명에 따른 호노키올 또는 매그놀올은 산화적 손상에 의한 간세포 손상 유도시 LDH 및 AST 유출 억제 및 세포 사멸을 억제함으로써 간세포 보호효과가 있음을 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과는 호노키올 또는 매그놀올이 간세포 보호용 성분으로 사용될 수 있음을 보이는 것이다.
[실시예 6] GalN에 의한 간세포 손상에 대한 호노키올 또는 매그놀올의 세포내 GSH 고갈 억제효과 측정
참고예 5에서와 같이 호노키올과 GalN 또는 매그놀올과 GalN를 처리한 간세포내 GSH(reduced form)의 함유량을 colorimetric assay kit(Bioxytech®GSH-400, OXIX International, Portland, USA)를 사용하여 kit의 사용방법에 따라 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
군 번호 GSH(nmole/㎎ protein) 군 번호 GSH(nmole/㎎ protein)
1 13.4±4.2 5 4.1±1.2a
2 3.2±1.2a 6 5.9±0.3a,b
3 8.4±1.3a,b 7 5.8±0.9a
4 6.0±0.4a,b 8 3.6±0.7a
[주]aP< 0.001, 1군에 비해 통계학상 유의적인 차이를 보임bP< 0.001, 2군에 비해 통계학상 유의적인 차이를 보임
위 결과로부터 호노키올 또는 매그놀올은 간세포 손상에 의한 GSH의 고갈을 억제함으로써 간보호제로 사용될 수 있음을 알 수 있다.
[실시예 7] 간성상세포에 대한 호노키올 또는 매그놀올의 자가사멸 효과 검색 Annexin V-FITC/Propidium iodide 염색
간섬유화 유발의 원인인 간성상세포에 대한 호노키올 또는 매그놀올의 자가사멸 효과를 검색하기 위하여 간성상세포를 Annexin V-FITC/PI로 염색한 후 flow cytometry로 측정하였다. Annexin V-FITC/PI 염색은 TACSTMAnnexin V-FITC 아폽토시스 detection kit(R&D Systems, Inc., Minneapolis, USA)를 사용하여 실시하였다. 자가사멸에 의해 세포막의 인지질 비대칭(phospholipid asymmetry)이 발생하게 되고, 이에 따라 포스파티딜세린(phosphatidylserin)이 외부로 노출되게 된다. 밖으로 노출된 포스파티딜세린은 Ca2+존재하에서 Annexin V와 결합하게 된다. 일정시간동안 약물처리한 간성상세포를 수확한 다음 Annexin V-FITC 및 PI와 함께 15분 동안 배양한 후 flow cytometry(FACS Calibur-S System, Becton Dickinson,U.S.A.)로 측정하였다. 자가사멸의 초기단계인 세포는 Annexin V-FITC에, 자가사멸의 말기단계는 Annexin V-FITC와 PI에, 괴사상태의 세포는 PI에 염색되며, 정상세포는 염색되지 않은 상태로 측정된다. 호노키올 또는 매그놀올을 16시간동안 처리한 간성상세포를 염색한 다음 flow cytometer로 분석하였으며, 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.
군 분류 negative(%) Annexin V-FITC positive(%) Annexin V-FITC & PI positive(%) PI positive(%)
정상군 94.05 4.52 1.24 0.19
호노키올 12.5 μM 처리군 85.66 11.17 2.79 0.38
호노키올 25 μM 처리군 76.98 19.17 3.16 0.69
호노키올 50 μM 처리군 15.52 81.24 1.93 1.31
매그놀올 12.5 μM 처리군 83.15 13.35 2.75 0.75
매그놀올 25 μM 처리군 69.91 27.52 1.64 0.93
매그놀올 50 μM 처리군 17.34 78.3 3.12 1.24
Annexin V-FITC에 염색된 세포의 비율은 표 6에서와 같이 호노키올 또는 매그놀올에 의해 유의적으로 증가하였다. 이를 통하여, 호노키올 또는 매그놀올이 간성상세포 자가사멸 효과가 있음을 확인할 수 있었으며 이로부터 간섬유화 치료제로서의 가능성도 타진할 수 있었다. 도 2는 호노키올 25 또는 50 μM을 16시간동안 처리한 후 관찰한 세포의 현미경 사진이다.
[실시예 8] 간성상세포에 대한 호노키올 또는 매그놀올의 캐스파제-3 활성화 및 DNA 단편화 측정
호노키올 또는 매그놀올에 의한 간성상세포의 자가사멸 유도효과를 캐스파제-3 활성유도로 확인하였다. 실시예 1에서와 같이 캐스파제-3 활성 측정시 호노키올 또는 매그놀올 처리에 의해 간성상세포 내 캐스파제-3의 활성이 증가되는 것을 확인하였으며 그 결과를 표 7에 나타내었다.
군 분류 캐스파제-3 활성(%)
정상군 100±8
호노키올 12.5 μM 처리군 1164±4
호노키올 25 μM 처리군 254±53a
호노키올 50 μM 처리군 470±39a
매그놀올 12.5 μM 처리군 174±34
매그놀올 25 μM 처리군 302±53a
매그놀올 50 μM 처리군 536±45a
[주]aP< 0.001, 정상군에 비해 통계학상 유의적인 차이를 보임
참고예 6과 같이 호노키올 또는 매그놀올을 처리한 간성상세포에서 DNA 단편화 유도 여부를 실시예 2에서와 동일한 방법으로 실시하였으며 그 결과를 도 3에 도시하였다.
도 3에서와 같이 호노키올 또는 매그놀올을 16시간 처리한 간성상세포에서는 DNA 단편화가 유도되었음을 확인할 수 있었다. 이상의 결과로부터 호노키올 또는 매그놀올은 간성상세포 사멸을 유도함을 확인할 수 있었으며 이로부터 간섬유화 치료용 성분으로 사용할 수 있음을 확인할 수 있었다.
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 호노키올 또는 매그놀올이 담즙산염에 의한 간세포 자가사멸을 방지하는 효능이 있고, 산화적 손상 또는 그 이외의 원인에 의한 간세포 손상을 방지하는 효능이 있고, 간섬유화 또는 간경화의 새로운 치료방법으로 대두되고 있는 간성상세포의 자가사멸을 유도하는 효능이 있어 간 보호용 또는 간섬유화 및 간경화 치료용 또는 예방용 조성물의 유효성분으로 이용될 수 있음을 밝힌 뛰어난 효능이 있는 발명인 것이다.

Claims (5)

  1. 하기 화학식 1의 호노키올(honokiol) 또는 하기 화학식 2의 매그놀올 (magnolol)을 간 보호 또는 간섬유화 및 간경화 치료 또는 예방에 유효한 양으로 함유함을 특징으로 하는 간 보호용 또는 간섬유화 및 간경화 치료 또는 예방용 조성물.
    [화학식 1]
    [화학식 2]
  2. 제 1항에 있어서, 상기 호노키올 또는 매그놀올은 간세포의 자가사멸을 억제하는 작용을 가짐을 특징으로 하는 간 보호용 또는 간섬유화 및 간경화 치료 또는 예방용 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 호노키올 또는 매그놀올은 간세포의 손상을 억제하는 작용을 가짐을 특징으로 하는 간 보호용 또는 간섬유화 및 간경화 치료 또는 예방용 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 호노키올 또는 매그놀올은 간성상세포의 자가사멸을 촉진하는 작용을 가짐을 특징으로 하는 간 보호용 또는 간섬유화 및 간경화 치료 또는 예방용 조성물.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간 보호 또는 간섬유화 및 간경화 치료 또는 예방에 유효한 양의 호노키올 또는 매그놀올은 1∼2,000 ㎎/㎏체중의 양으로 함유되는 것을 특징으로 하는 간 보호용 또는 간섬유화 및 간경화 치료 또는 예방용 조성물.
KR1020030053093A 2003-07-31 2003-07-31 호노키올 또는 매그놀올을 함유하는 간 보호용 또는,간섬유화 및 간경화 치료용 또는 예방용 조성물 KR20050014453A (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020030053093A KR20050014453A (ko) 2003-07-31 2003-07-31 호노키올 또는 매그놀올을 함유하는 간 보호용 또는,간섬유화 및 간경화 치료용 또는 예방용 조성물

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020030053093A KR20050014453A (ko) 2003-07-31 2003-07-31 호노키올 또는 매그놀올을 함유하는 간 보호용 또는,간섬유화 및 간경화 치료용 또는 예방용 조성물

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20050014453A true KR20050014453A (ko) 2005-02-07

Family

ID=37225586

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020030053093A KR20050014453A (ko) 2003-07-31 2003-07-31 호노키올 또는 매그놀올을 함유하는 간 보호용 또는,간섬유화 및 간경화 치료용 또는 예방용 조성물

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20050014453A (ko)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100895500B1 (ko) * 2007-08-27 2009-05-06 서울대학교산학협력단 호노키올을 유효성분으로 함유하는 지방간 질환의 예방 및치료용 조성물
KR100920486B1 (ko) * 2007-08-24 2009-10-08 한국화학연구원 네오리그난계 화합물 또는 이를 포함하는 마그놀리아 속식물 추출물을 함유하는 식물병 방제용 조성물 및 이를이용한 식물병 방제방법
CN106176675A (zh) * 2016-07-14 2016-12-07 北京蛋白质组研究中心 靶向肝窦内皮细胞的和厚朴酚纳米颗粒在治疗肝纤维化中的应用

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100920486B1 (ko) * 2007-08-24 2009-10-08 한국화학연구원 네오리그난계 화합물 또는 이를 포함하는 마그놀리아 속식물 추출물을 함유하는 식물병 방제용 조성물 및 이를이용한 식물병 방제방법
KR100895500B1 (ko) * 2007-08-27 2009-05-06 서울대학교산학협력단 호노키올을 유효성분으로 함유하는 지방간 질환의 예방 및치료용 조성물
CN106176675A (zh) * 2016-07-14 2016-12-07 北京蛋白质组研究中心 靶向肝窦内皮细胞的和厚朴酚纳米颗粒在治疗肝纤维化中的应用
CN106176675B (zh) * 2016-07-14 2021-05-11 北京蛋白质组研究中心 靶向肝窦内皮细胞的和厚朴酚纳米颗粒在治疗肝纤维化中的应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Yang et al. Targeting cell death: pyroptosis, ferroptosis, apoptosis and necroptosis in osteoarthritis
Yang et al. Hepatoprotective effects of polyprenols from Ginkgo biloba L. leaves on CCl4-induced hepatotoxicity in rats
Nishida et al. Crosstalk between autophagy and apoptosis in heart disease
JP5486744B2 (ja) ムユヨの花、トゲバンレイシの葉、及びウコンの根の抽出物を含む、肝炎を治療するための組成物
KR101400063B1 (ko) 티오레독신 산생 촉진제
Sun et al. Effects and mechanisms of extract from Paeonia lactiflora and Astragalus membranaceus on liver fibrosis induced by carbon tetrachloride in rats
Chiu et al. Ocimum gratissimum is effective in prevention against liver fibrosis in vivo and in vitro
Ra et al. Effect of lesimarin against thioacetamide-induced liver cirrhosis in rat
Liu et al. Protective effect of Cordyceps polysaccharide on hydrogen peroxide-induced mitochondrial dysfunction in HL-7702 cells
Wang et al. Synthesis and biological evaluation of danshensu and tetramethylpyrazine conjugates as cardioprotective agents
Said et al. Evaluation of hepatoprotective effect of Nebivolol and sodium copper Chlorophyllin on CCL4-induced hepatotoxicity in mice.
Alanazi et al. Protective role of Loranthus regularis against liver dysfunction, inflammation, and oxidative stress in streptozotocin diabetic rat model
Xu et al. Silibinin Schiff base derivatives counteract CCl4-induced acute liver injury by enhancing anti-inflammatory and antiapoptotic bioactivities
US20070072931A1 (en) Pharmaceutical composition and a method for treatment of prostate cancer
Amah et al. Ethyl acetate fraction of Fagara zanthoxyloides root-bark possess antidiabetic property against alloxan-induced diabetes and its complications in Wistar rat model
KR20050014453A (ko) 호노키올 또는 매그놀올을 함유하는 간 보호용 또는,간섬유화 및 간경화 치료용 또는 예방용 조성물
KR100414187B1 (ko) 흰점박이꽃무지 추출물 및 이의 용도
Abd El-Monem et al. Nanocurcumin improves the therapeutic role of mesenchymal stem cells in liver fibrosis rats
TWI444189B (zh) 羊毛甾醇－８，２４－二烯－３β，１５α，２１－三醇抑制腫瘤細胞生長之用途
KR101072247B1 (ko) 간 질환 예방 또는 치료용 가공된 알로에 베라 추출물, 및 가공된 알로에 베라 추출물과 밀크씨슬의 배합요법
KR100549058B1 (ko) 리토스퍼믹에시드 ｂ 메틸에스테르 및 그 유도체, 및 이를함유하는 간 보호 및 간 섬유화/경화 치료제 조성물
CN102727551B (zh) 一种中药有效部位在抗hiv潜伏治疗上的应用
Sameri et al. Sodium Hydrosulfide modification of mesenchymal stem cell-exosomes improves liver function in CCL4-induced hepatic injury in mice
Wu et al. Extracellular vesicles derived from Pinctada martensii mucus regulate skin inflammation via the NF-κB/NLRP3/MAPK pathway
Alfarajat et al. Reno-protective effect of Citrus sinensis by regulating antioxidant capability and gene expression in adenine-induced chronic kidney in rats

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application