KR101400063B1

KR101400063B1 - 티오레독신 산생 촉진제

Info

Publication number: KR101400063B1
Application number: KR1020087024889A
Authority: KR
Inventors: 하지메 나카무라; 준지 요도이; 유마 호시노
Original assignee: 니폰 조키 세야쿠 가부시키가이샤; 고쿠리츠 다이가쿠 호진 교토 다이가쿠
Priority date: 2006-03-30
Filing date: 2007-03-29
Publication date: 2014-05-26
Also published as: US20100021431A1; EP2011505A1; CN101410124B; CA2647968A1; AU2007232971A1; EP2011505A4; TW200744617A; JP5043828B2; US8338108B2; KR20080113409A; AU2007232971B2; CN101410124A; WO2007114230A1; EP2011505B1; JPWO2007114230A1; TWI406664B

Abstract

(과제) 본 발명의 목적은 항산화, 항염증 및 세포 보호 작용을 갖고, 세포 내의 산화 환원 제어 인자로서 중요한 역할을 하는 티오레독신의 산생을 촉진하는 물질을 제공하는 것에 있다. 또한, 상기 물질을 유효 성분으로서 함유하고, 만성 폐색 폐질환의 예방 또는 치료에 있어서 유효하고, 또한, 안전성이 높은 의약을 제공하는 것에 있다.

(해결 수단) 본 발명은 백시니아 바이러스 접종 염증조직 추출물의 신규 의약 용도에 관한 것이고, 상기 추출물을 유효 성분으로서 함유하는 티오레독신 산생 촉진제에 관한 것이다. 상기 추출물은 흡연 추출 물질, 과산화 수소 등의 자극에 의한 산화 스트레스에 대하여 우수한 티오레독신 산생 촉진 작용을 갖고, 현저한 폐세포 보호 효과를 나타낸다. 따라서, 상기 추출물을 유효 성분으로 하는 본 발명의 의약은 만성 흡연 등의 지속적인 산화 스트레스가 주원인이 되는 만성 폐색성 폐질환의 예방 또는 치료제로서, 부작용이 적고 안전성이 높은 의약으로서 유용성이 높은 것이다.

티오레독신 산생 촉진제

Description

티오레독신 산생 촉진제{THIOREDOXIN PRODUCTION PROMOTING AGENT}

본 발명은 백시니아 바이러스 접종 염증조직 추출물의 신규 의약 용도에 관한 것으로서, 구체적으로는 백시니아 바이러스 접종 염증조직 추출물을 유효 성분으로서 함유하는 티오레독신 산생 촉진제에 관한 것이다.

생체는 자외선이나 미립자 등의 환경 유해 물질로의 폭로(曝露), 바이러스나 세균 감염에 의해 야기되는 염증 등 각종 스트레스에 노출됨으로써 세포 내에서 활성 산소종이 산생되어 단백질이나 유전자가 산화되어 장애를 받는다. 그래서, 생체는 활성 산소종에 대한 방어 기구로서 산화 환원(레독스) 응답을 기본으로 하는 시스템을 구비하고 있고, 그 대표적인 것의 하나로서 티오레독신 시스템이 열거된다.

티오레독신은 대장균의 DNA 합성에 필수적인 효소인 리보뉴클레오티드 환원 효소에 수소 이온을 공여하는 조효소로서 발견되었다. 티오레독신은 -Cys-Gly-Pro-Cys-라고 하는 활성 부위를 갖고 있어 2개의 시스테인 잔기의 사이에서 디술피드(S-S) 결합을 만드는 산화형과 디티올(-SH-SH)을 만드는 환원형이 존재하는 세포 내의 산화 환원 제어 인자이다.

티오레독신은 자외선, 방사선, 산화제, 바이러스 감염, 허혈 재관류 상해, 및 항암제 투여 등에 의해 유도되는 것이 밝혀지고 있다. 각종 스트레스에 의해 유 도된 티오레독신은 단독으로 일중항 산소나 히드록실 라디칼을 소거하는 것 이외에, 퍼옥시레독신과의 협조 작용에 의해서 활성 산소종을 소거하는 항산화 물질로서 생체 내에서 작용하는 것이 보고되고 있고, 각종 유전자 발현을 조절하는 전사 인자나 세포 내의 시그널 전달 분자의 활성을 제어하고 있다. 따라서, 티오레독신을 유도하면 세포 내에서 야기되는 각종의 산화 환원 현상에 근거하는 병리 상태 또는 그 이전 단계의 상태로부터 세포, 조직, 기관 등을 보호할 수 있는 것이 기대되는 것으로부터, 티오레독신 유도 물질의 연구가 진척되고, 예를 들면, 그러한 유도 물질로서 이소프레노이드계 화합물이 개시되어 있다. (특허 문헌 1 참조)

상술한 바와 같은 산화/항산화, 즉, 레독스 상태의 불균형이 초래하는 질환·병태의 하나로서, 만성 폐색성 폐질환(COPD) 등을 포함하는 폐질환이 열거된다. COPD는 유해 미립자의 흡입에 의해 기도나 말초 폐조직에 만성적인 염증이 일어나고, 가래끼는 느낌이나 기관지의 부기(만성 기관지염), 폐포의 파괴(폐기종)에 의해 일어나는 지속적인 기도의 폐색 상태를 병태로 하는 질환이고, 그 최대의 원인은 흡연이다. 담배 연기 중에는 옥시던트(산화제)가 다량 포함되어 있어, 폐는 산화 스트레스에 노출된 상태에 빠진다. 따라서, 항산화, 항염증 및 세포 보호 작용을 갖는 것이 알려져 있는 티오레독신은 흡연에 의한 조직 장애 및 염증을 억제하는 것이 시사된다. 실제로, 통상 흡연자에서는 비흡연자에 비해 혈중 티오레독신 농도가 유의하게 높은 수치인 것이 보고되고 있어, 티오레독신의 산생 증가가 만성 흡연이라고 하는 지속적인 산화 스트레스 대한 방어 기구로서 작용하고 있는 것으로 생각된다. 이러한 관점으로부터, 이것을 치료 전략으로서 사용하는 것은 타당하 여 만성 폐색성 폐질환의 예방 또는 치료제로서 티오레독신이 유효한 것으로 개시되어 있다. (특허 문헌 2 참조)

본 발명의 의약의 유효 성분인 백시니아 바이러스 접종 염증조직 추출물에 대해서는 진통 작용, 진정 작용, 항스트레스 작용, 항알레르기 작용(특허 문헌 3 참조), 면역 촉진 작용, 항암 작용, 간경변 억제 작용(특허 문헌 4 참조), 특발성 혈소판 감소성 자반병에 대한 치료 효과(특허 문헌 5 참조), 대상 포진후 신경통, 뇌부종, 치매, 척수 소뇌 변성증 등으로의 치료 효과(특허 문헌 6 참조), 레이노 증후군, 당뇨병성 신경 장애, 스몬 후유증 등으로의 치료 효과(특허 문헌 7 참조), 칼리크레인 산생 저해 작용, 말초 순환 장애 개선 작용(특허 문헌 8 참조), 골 위축 개선 작용(특허 문헌 9 참조), 패혈증이나 엔도톡신 쇼크의 치료에 유효한 일산화 질소 산생 억제 작용(특허 문헌 10 참조), 골 조송증에 대한 치료 효과(특허 문헌 11 참조), Nef 작용 억제 작용이나 케모카인 산생 억제 작용에 근거하는 에이즈 치료 효과(특허 문헌 12, 13), 뇌경색 등의 허혈성 질환에 대한 치료 효과(특허 문헌 14), 섬유 근육 통증에 대한 치료 효과(특허 문헌 15), 감염증에 대한 치료 효과(특허 문헌 16) 등이 개시되어 있다. 그러나, 상기 추출물이 티오레독신의 산생을 촉진시키거나, 폐세포를 보호하고, 만성 폐쇄 폐질환의 예방 또는 치료에 유효하다라는 의약 용도에 관한 발표나 보고는 아직 없다.

특허 문헌 1: 일본 특허 공개 2001-322929호 공보

특허 문헌 2: 일본 특허 공개 2005-60408호 공보

특허 문헌 3: 일본 특허 공개 소 53-101515호 공보

특허 문헌 4: 일본 특허 공개 소 55-87724호 공보(제 3, 5, 6쪽)

특허 문헌 5: 일본 특허 공개 평 1-265028호 공보(제 1, 2쪽)

특허 문헌 6: 일본 특허 공개 평 1-319422호 공보(제 3, 4쪽)

특허 문헌 7: 일본 특허 공개 평 2-28119호 공보(제 3쪽)

특허 문헌 8: 일본 특허 공개 평 7-97336호 공보(제 4쪽)

특허 문헌 9: 일본 특허 공개 평 8-291077호 공보

특허 문헌 10: 일본 특허 공개 평 10-194978호 공보

특허 문헌 11: 일본 특허 공개 평 11-80005호 공보(제 2, 3쪽)

특허 문헌 12: 일본 특허 공개 평 11-139977호 공보

특허 문헌 13: 일본 특허 공개 2000-336034호 공보(제 2, 3쪽)

특허 문헌 14: 일본 특허 공개 2000-16942호 공보

특허 문헌 15: 국제 공개 WO2004/039383호 공보

특허 문헌 16: 일본 특허 공개 2004-300146호 공보

본 발명의 목적은 항산화, 항염증 및 세포 보호 작용을 갖고, 세포 내의 산화 환원 제어 인자로서 중요한 역할을 하는 티오레독신의 산생을 촉진하는 물질을 제공하는 것에 있다. 또한, 상기 물질을 유효 성분으로서 함유하고, 만성 폐색 폐질환의 예방 또는 치료에 있어서 유효하고, 또한, 안전성이 높은 의약을 제공하는 것에 있다.

본 발명자들은 예의 연구를 행한 결과, 백시니아 바이러스 접종 염증조직 추출물이 티오레독신 생산에 있어서 우수한 촉진 작용을 갖고, 폐세포의 보호 작용을 나타내고, 만성 폐색 폐질환의 예방 또는 치료제로서 유용한 것을 발견하여 발명을 완성하였다.

(발명의 효과)

백시니아 바이러스 접종 염증조직 추출물은 만성 흡연 등에 의한 산화 스트레스 등에 대하여 티오레독신 산생을 촉진시켜 폐세포 보호 효과를 나타낸다고 하는 우수한 약리 작용을 가지므로, 이것을 유효 성분으로서 함유하는 본 발명 약제는 부작용 등의 문제점이 없는 안전한 의약으로서 유용성이 높은 것이다.

도 1은 과산화 수소 자극 및 무혈청 자극에 대한 본 발명의 백시니아 바이러스 접종 염증조직 추출물의 세포 보호 작용을 조사한 결과이다.

도 2는 흡연 추출 물질 자극에 대한 본 발명의 백시니아 바이러스 접종 염증조직 추출물의 세포 보호 작용을 조사한 결과이다.

도 3은 과산화 수소 자극 및 무혈청 자극에 대한 본 발명의 백시니아 바이러스 접종 염증조직 추출물의 항아포토시스 작용을 조사한 현미경 사진이다.

도 4는 본 발명의 백시니아 바이러스 접종 염증조직 추출물의 티오레독신 산생 촉진 작용(유전자 레벨)을 조사한 결과이다.

도 5는 본 발명의 백시니아 바이러스 접종 염증조직 추출물의 티오레독신 산생 촉진 작용(단백질 레벨)을 조사한 결과이다.

도 6은 흡연 노출한 마우스의 폐조직에 있어서, 본 발명의 백시니아 바이러 스 접종 염증조직 추출물에 의한 조직 보호 작용을 조사한 현미경 사진이다.

도 7은 흡연 폭로된 마우스의 기관지 폐포 세정액 중의 염증 세포수를 계측하고, 본 발명의 백시니아 바이러스 접종 염증조직 추출물에 의한 염증 세포 침윤 억제 작용을 조사한 결과이다.

본 발명의 의약에 사용하는 백시니아 바이러스 접종 염증조직 추출물에 관해서, 백시니아 바이러스를 접종한 염증조직에 있어서 산생되는 생리 활성 물질, 상기 물질을 병태 조직으로부터 추출하는 방법 및 그들의 약리 활성 등에 관해서는 상술한 바와 같이 여러가지로 보고되어 있다(상기 특허 문헌 3~16 등).

또한, 시판되고 있는 의약품으로서는 백시니아 바이러스 접종 집토끼 염증 피부 추출액 제제가 있다. 이 제제는 의료약 일본 의약품집[2006년판, 재단 법인 일본 의약 정보 센터 편집·발행]의 2585-2587쪽에 기재되어 있는 것과 같이, 백시니아 바이러스를 접종한 집토끼의 염증 피부 조직으로부터 추출 분리한 비단백질성의 활성 물질을 함유하는 약제이고, 요통증, 경견완 증후군, 증후성 신경통, 견관절 주위염, 변형성 관절증, 피부 질환(습진, 피부염, 두드러기)에 수반하는 가려움증, 알레르기성 비염, 스몬 후유 증상의 냉감·이상 지각·통증, 대상 포진 후 신경통 등에 대한 적응이 확인되고 있어 피하, 근육 주사, 정맥 주사용의 주사제 및 정제가 의료용 의약품으로서 제조 승인을 받아서 시판되고 있다.

본 발명의 의약에 사용하는 백시니아 바이러스 접종 염증조직 추출물은 상술한 바와 같은 백시니아 바이러스 접종 염증조직으로부터 추출한 비단백질성의 생체 기능 조정 물질이고, 상기의 의료약 일본 의약품집에도 게재되어 있는 백시니아 바이러스 접종 집토끼 염증 피부 추출액 제제는 의약품의 제조 승인을 받아 시판되고 있어 입수 가능하다. 또한, 상술한 특허 문헌에 기재되어 있는 각종 백시니아 바이러스 접종 염증조직 추출물을 본 발명 물질로서 이용할 수 있고, 그들의 제조 방법이나 바람직한 투여량 등도 문헌 중에 설명되어 있다.

본 발명의 의약에 사용하는 백시니아 바이러스 접종 염증조직 추출물은 백시니아 바이러스를 접종해서 발두한 염증조직을 파쇄하고, 추출 용매를 가해서 조직편을 제거한 후, 제단백질 처리를 행하고, 이것을 흡착제에 흡착시키고, 이어서, 유효 성분을 용출함으로써 얻을 수 있다.

백시니아 바이러스 접종 염증조직 추출물은 예를 들면, 이하의 공정으로 제조된다.

(a) 백시니아 바이러스를 접종해 발두시킨 토끼, 마우스 등의 피부 조직 등을 채취하고, 발두 조직을 파쇄하고, 물, 페놀수, 생리 식염액 또는 페놀 첨가 글리세린수 등의 추출 용매를 가한 후, 여과 또는 원심 분리함으로써 추출액(여액 또는 상청)을 얻는다.

(b) 상기 추출액을 산성의 pH로 조정해서 가열하고, 제단백질 처리한다. 이어서, 제단백질한 용액을 알칼리성으로 조정해서 가열한 후에 여과 또는 원심 분리한다.

(c) 얻어진 여액 또는 상청을 산성으로 하여 활성탄, 카올린 등의 흡착제에 흡착시킨다.

(d) 상기 흡착제에 물 등의 추출 용매를 가하여 알칼리성의 pH로 조정하고, 흡착 성분을 용출함으로써 백시니아 바이러스 접종 염증조직 추출물을 얻을 수 있다. 그 후, 소망에 따라서 적당 용출액을 감압 하에 증발 건고 또는 동결 건조함으로써 건고물로 할 수도 있다.

백시니아 바이러스를 접종해 염증조직을 얻기 위한 동물로서는, 토끼, 소, 말, 양, 염소, 원숭이, 래트, 마우스 등 백시니아 바이러스가 감염되는 각종 동물을 사용할 수 있고, 염증 조직으로서는 토끼의 발두 피부 조직이 바람직하다.

이들 염증 조직을 채취해서 파쇄하고, 그것의 1~5배량의 추출 용매를 가해서 유화 현탁액이라고 한다. 추출 용매로서는 증류수, 생리 식염수, 약산성~약염기성의 완충액 등을 사용할 수 있고, 글리세린 등의 안정화제, 페놀 등의 살균·방부제, 염화 나트륨, 염화 칼륨, 염화 마그네슘 등의 염류 등을 적당하게 첨가하여도 좋다. 이 때, 동결 융해, 초음파, 세포막 용해 효소 또는 계면활성제 등의 처리에 의해 세포 조직을 파괴해서 추출을 용이하게 할 수도 있다.

얻어진 유상 추출액을 여과 또는 원심 분리 등에 의해 조직편을 제거한 후, 제단백질 처리를 행한다. 제단백질 조작은 통상 행해지고 있는 공지의 방법에 의해 실시할 수 있고, 가열 처리, 단백질 변성제, 예를 들면, 산, 염기, 요소, 구아니딘, 아세톤 등의 유기 용매 등에 의한 처리, 등전점 침전, 염석 등의 방법을 적용할 수 있다. 이어서, 불용물을 제거하는 통상의 방법, 예를 들면, 여지(셀룰로오스, 니트로셀룰로오스 등), 글래스 필터, 셀라이트, 자이츠(Seitz) 여과판 등을 사용한 여과, 한외여과, 원심 분리 등에 의해 석출할 수 있는 불용 단백질을 제거한 다.

이로써 얻어진 유효 성분 함유 추출액을 염산, 황산, 브롬화 수소산 등의 산을 이용하여 산성, 바람직하게는 pH3.5~5.5로 조정하고, 흡착제로의 흡착 조작을 행한다. 사용 가능한 흡착제로서는 활성탄, 카올린 등을 들 수 있고, 추출액 중에 흡착제를 첨가해 교반하거나, 추출액을 흡착제 충전 컬럼에 통과시켜서, 상기 흡착제에 유효 성분을 흡착시킬 수 있다. 추출액 중에 흡착제를 첨가했을 경우에는 여과나 원심 분리 등에 의해 용액을 제거하고, 유효 성분을 흡착시킨 흡착제를 얻을 수 있다.

흡착제로부터 유효 성분을 용출(탈리(脫離))시키기 위해서는 상기 흡착제에 용출 용매를 가하여 실온 또는 적당하게 가열하거나, 또는 교반해서 용출하고, 여과나 원심 분리 등의 통상의 방법으로 흡착제를 제거해서 달성할 수 있다. 사용되는 용출 용매로서는 염기성의 용매, 예를 들면, 염기성의 pH로 조정한 물, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올 등 또는 이들의 적당한 혼합 용액을 사용할 수 있고, 바람직하게는 pH9~12로 조정한 물을 사용할 수 있다.

이로써 얻어진 추출물(용출액)은 제제용 원체나 의약품 제제로서 바람직한 형태로 적당하게 조제할 수 있다. 예를 들면, 용액의 pH를 중성 부근으로 조정해서 제제용 원체로 할 수도 있고, 또한, 농축·희석에 의해 소망의 농도로 합성할 수도 있다. 또한, 주사용 제제로서 염화 나트륨을 가해서 생리 식염액과 등장의 용액으로 조제할 수도 있다. 또한, 이들 용액을 농축 건고 또는 동결 건조함으로써, 정제 등의 원료로서 이용할 수 있는 고형물의 형태로 조제하여도 좋다.

환자로의 투여 방법으로서는 경구 투여 이외에 피하, 근육 내, 정맥 내 투여 등이 열거되고, 투여량은 백시니아 바이러스 접종 염증조직 추출물의 종류에 의해 적당하게 설정될 수 있다. 시판 제제로 인정을 받고 있는 투여량은 상기의 의료약 일본 의약품집(2585쪽)에 의하면, 기본적으로 내복으로는 1일 16NU, 주사제로는 1일 3.6~7.2NU를 투여하도록 의료용 의약품으로서는 나타내어져 있지만, 질환의 종류, 중상도, 환자의 개인차, 투여 방법, 투여 기간 등에 의해 적당하게 증감 가능하다(NU: 노이로트로핀 단위. 노이로트로핀 단위란 동통 역치가 정상 동물보다 저하된 만성 스트레스 동물인 SART 스트레스 마우스를 사용하고, Randall-Selitto 변법에 준해서 시험을 행하고, 진통 효력의 ED₅₀치로서 규정한다. 1NU은 ED₅₀치가 100mg/kg일 때의 노이로트로핀 제제의 진통 활성 함유 성분 1mg을 나타내는 활성이다.).

이하에, 백시니아 바이러스 접종 염증조직 추출물의 제조 방법의 예, 및 본 발명의 추출물의 신규 약리 작용, 즉, 티오레독신 산생 촉진 작용 및 COPD 예방·치료 작용에 관한 약리 시험 결과를 나타내지만, 본 발명은 이들의 실시예의 기재에 의해 하등 제한되지 않는다.

실시예 1

건강한 성숙 집토끼의 피부에 백시니아 바이러스를 접종하고, 발두한 피부를 박출하고, 이것을 파쇄해서 페놀수를 가하였다. 이어서, 이것을 가압 여과하고, 얻어진 여액을 염산으로 pH5로 조정한 후, 90~100℃에서 30분간 가열 처리하였다. 여 과하여 제단백질한 후, 수산화 나트륨으로 pH9로 하여 90~100℃에서 15분간 더 가열 처리한 후 여과하였다. 여액을 염산으로 약 pH4.5로 조정하고, 2%의 활성탄을 가해서 2시간 교반한 후, 원심 분리하였다. 채취한 활성탄에 물을 가해 수산화 나트륨으로 pH10으로 하여 60℃에서 1.5시간 교반한 후, 원심 분리 여과하여 상청을 얻었다. 채취한 활성탄에 다시 물을 가하여 수산화 나트륨으로 pH11로 하고 60℃에서 1.5시간 교반한 후, 원심 분리하여 상청을 얻었다. 양 상청을 합하고, 염산으로 중화하여 백시니아 바이러스 접종 집토끼 염증 피부 추출물을 얻었다. 이하의 약리 시험에서는 실험에 알맞은 농도로 적당하게 조정해서 사용하였다.

실시예 2

건강한 성숙 집토끼의 피부에 백시니아 바이러스를 접종해 감염시킨 후, 발두한 피부를 무균적으로 박출하여 이것을 세절한 후, 페놀 첨가 글리세린수를 가하여 호모게나이저로 마쇄하여 유상으로 하였다. 이어서, 이것을 여과하여 얻은 여액을 염산으로 약산성(pH4.5~5.5)으로 조정한 후, 100℃에서 가열 처리하여 여과하였다. 여액을 수산화 나트륨으로 약알칼리성(pH8.5~10.0)으로 하고, 100℃에서 더 가열 처리한 후 여과하였다. 여액을 염산으로 약 pH4.5로 하여 약 1.5%의 활성탄을 가해서 1~5시간 교반한 후, 여과하였다. 여과 수집한 활성탄에 물을 가해 수산화 나트륨으로 pH9.4~10으로 조정하고, 3~5시간 교반한 후, 여과한 여액을 염산으로 중화하였다.

실시예 3

건강한 성숙 집토끼의 피부에 백시니아 바이러스를 접종하고, 활성화시킨 후, 활성화한 피부를 무균적으로 박출하여 이것을 세절해서 물을 가해 호모게나이저로 마쇄하여 유상물로 하였다. 이어서, 이것을 가압 여과하여 얻어진 여액을 염산으로 pH5.0으로 조정한 후, 유통 증기 하에서 100℃로 가열 처리하였다. 여과하여 제단백질한 후, 수산화 나트륨으로 pH9.1로 하여 100℃에서 더 가열 처리한 후 여과하였다. 여액을 염산으로 pH4.1로 조정하고, 활성탄 2%를 가해서 2시간 교반한 후 여과하였다. 여액은 활성탄 5.5%를 더 가해서 2시간 교반한 후 여과하였다. 최초에 여과 수집한 활성탄에 물을 가하여 수산화 나트륨으로 pH9.9로 하여 60℃에서 1.5시간 교반한 후 여과하였다. 최초의 활성탄 및 다음 활성탄에 물을 가하여 수산화 나트륨으로 pH10.9로 하고 60℃에서 1.5시간 교반한 후 여과하였다. 여액을 합하여 염산으로 중화한 후, 분자량 100의 막을 사용한 전기 투석법으로 탈염 처리를 행하고, 감압 하에 건고하였다.

이어서, 상기 실시예 1에서 얻어진 본 발명의 백시니아 바이러스 접종 염증조직 추출물을 피검 물질로서 사용한 티오레독신 산생 촉진 작용에 관한 약리 시험의 결과의 일례를 게시한다.

약리 시험 1: 과산화 수소(H₂O₂) 장애에 대한 세포 보호 작용

인간 폐포 상피 유래의 세포주 A549 세포를 티올 제거 DMEM 배지(이하, 특별하게 명기하지 않는 경우에는 상기 배지는 무혈청 배지이다) 하에서, 피검 물질을 첨가하여 16시간 전배양하였다. 또한, 0.3mM H₂O₂(최종 농도)를 첨가하여 6시간 배양한 후, LDH assay(Roche Diagnostics사)로 배양 상청 중의 LDH(락트산 탈수소 효 소)를 측정하고, 세포의 viability의 지표로 하였다. 과산화 수소 장애에 대한 본 발명의 추출물의 세포 보호 효과를 조사한 결과의 일례를 도 1에 나타낸다.

A549 세포에 무혈청 배지 하에서 H₂O₂ 자극을 가하면 세포 상해를 야기하지만, 본 발명의 추출물을 첨가하고 전배양함으로써 세포 상해가 농도 의존성에 유의하게 억제되었다. 또한, 동시에 무혈청 자극에 의한 세포 상해에 대해서도 억제 효과가 확인되었다.

약리 시험 2: 흡연 추출 물질 자극에 대한 세포 보호 작용

A549 세포를 티올 제거 DMEM 배지 하에서, 피검 물질(0.01U/mL)을 첨가해 16시간 전배양하였다. 또한, 흡연 추출 물질을 첨가해 6시간 배양한 후, LDH assay로 배양 상청 중의 LDH를 측정하고, 세포의 viability의 지표로 하였다. 또한, 흡연 추출 물질(cigarette smoke extract, CSE)은 담배 연기 발생 장치 SG-200(SHIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY LTD.)을 이용하여 제작하였다. 즉, 담배(Kentucky·Research Cigarette 2R4F) 10개분의 연기를 10mL의 티올 제거 DMEM(10% HEPES 첨가)에 통과시킨 것을 100% CSE라고 하여 실험에 알맞은 농도로 적당하게 희석해서 사용하였다. 흡연 추출 물질 자극에 대한 본 발명의 추출물의 세포 보호 효과를 조사한 결과의 일례를 도 2에 나타낸다.

본 발명의 추출물을 첨가하고 전배양함으로써 CSE에 의한 세포 상해가 유의하게 억제되고, 그 효과는 NAC(N-아세틸시스테인, 0.1mM)와 동등하였다.

약리 시험 3: 항아포토시스 작용

Chamber slide 상에 배양한 A549 세포에 대하여 티올 제거 DMEM 배지 하에서 피검 물질을 첨가해 10시간, 전배양한 후, H₂O₂를 더 첨가해 24시간 배양하였다. 또한, 비교하기 위해서 소 태아 혈청(FCS) 첨가 배지 하에서도 마찬가지로 A549 세포를 배양하였다. Hoechst 33342 및 요오드화 프로피디늄으로 염색하고, 형광 현미경으로 세포사를 평가하였다. 본 발명의 추출물의 항아포토시스 작용을 조사한 결과의 일례를 도 3에 나타낸다.

본 발명의 추출물은 무혈청 자극 및 H₂O₂ 자극에 의한 아포토시스를 억제하였다. (도 3의 형광 현미경 사진 중 고휘도의 소형의 핵을 갖는 세포가 아포토시스이다.)

약리 시험 4: 항산화 작용

A549 세포를 티올 제거 DMEM 배지 하에서, 피검 물질(0.01U/mL)을 첨가해 16시간 전배양하고, 0.3mM H₂O₂(최종 농도)를 더 첨가해 3시간 배양하였다. 이어서, 트립신 처리 후, 옥시던트 반응성 형광 기질 CM-H2DCFDA(Molecular Probe사)를 첨가해 20분간 배양하였다. 플로우 사이토메트리(flow cytometry)(FACSCalibur, BD bioscience사)로 녹색 형광을 측정하였다. 산화 스트레스에 의해 형광 휘도가 상승한 세포를 양성 세포로 하고, 결과를 양성 세포율로 판정하였다. 본 발명의 추출물의 항산화 작용을 조사한 결과의 일례를 표 1에 나타낸다.

무혈청 및 H₂O₂ 자극 등의 산화 스트레스에 의한 세포의 양성 세포율 상승이 본 발명의 추출물에 의해 유의하게 억제되었다.

약리 시험 5: 티오레독신 산생 촉진 작용(유전자 레벨)

A549 세포를 티올 제거 DMEM 배지 하에서, 피검 물질을 첨가해 9시간 배양하였다. RNA를 추출하고, RT-PCR법에 의해서 티오레독신의 mRNA 발현을 측정하였다(ABI사 7300 리얼타임 PCR 시스템). 본 발명의 추출물의 유전자 레벨에서의 티오레독신 산생 촉진 작용을 조사한 결과의 일례를 도 4에 나타낸다.

본 발명의 추출물의 티오레독신 산생 촉진 효과는 유전자 레벨에 있어서 농도 의존적으로 확인되었다.

약리 시험 6: 티오레독신 산생 촉진 작용(단백질 레벨)

A549 세포를 티올 제거 DMEM 배지 하에서, 피검 물질을 첨가해 배양하였다. 세포 용해물 중의 티오레독신 발현량을 웨스턴 블롯팅(Western blotting)법에 의해 측정하였다. 본 발명의 추출물의 단백질 레벨에서의 티오레독신 산생 촉진 작용을 나타내는 결과의 일례를 도 5에 나타낸다.

본 발명의 추출물의 티오레독신 산생 촉진 효과는 단백질 레벨에 있어서 농도의존성이 확인되었다.

또한, 인간 폐섬유 아세포주의 WI38을 사용했을 경우에도 A549 세포와 같은 세포 보호 작용, 티오레독신 산생 촉진 작용 등이 본 발명의 추출물에서 확인되었다.

약리 시험 7: 조직 보호 작용(in vivo)

C57BL/6J 수컷 마우스(8주령)를 3일간 흡연 폭로해(day 1-3), 피검 물질 투여(day O-3, 100NU/kg/day, i.p.)의 효과를 검토하였다. 흡연 폭로는 담배 연기 발생 장치 SG-200(SHIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY LTD.)을 사용하여 행하고, 1일 1시간 전신 폭로하였다. 최종 흡연 24시간 후에 마우스를 사혈치사시켜 10% 중성 완충 포르말린으로 신전 고정 폐표본을 제작하였다. 폐표본은 HE 염색 및 ssDNA 면역 염색하고, 염증·상해를 평가하였다. 본 발명의 추출물의 조직 보호 작용(in vivo)을 조사한 결과의 일례를 도 6에 나타낸다.

흡연 폭로에 의해 (1) 세기관지의 세포사, 혈관 주위 간질의 부종·염증 세포 침윤(HE 염색), (2) 세기관지, 폐포, 소혈관의 아포토시스(ssDNA 면역 염색)가 야기되지만, 본 발명의 추출물의 투여에 의해 이들의 폐렴증·상해가 억제되는 경향이 확인되었다(도 6의 ssDNA 면역 염색의 현미경 사진 중 흑색으로 농염되는 핵을 갖는 세포가 아포토시스이다).

약리 시험 8: 염증 세포 침윤 억제 작용(in vivo)

상기 약리 시험 7과 같이, 8주령의 C57BL6 마우스에 대하여 담배 연기를 1일 1시간 계 3일간, 담배 연기 발생 장치 SG-200(SHIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY LTD.)을 이용하여 폭로하였다. 마우스는 피검 물질 투여군(n=3, 흡연 30분 전에 1NU/kg 복강 내 투여)과 생리 식염수 투여군(n=3)으로 나누고, 최종 흡연 폭로 24시간 후에 기관지 폐포 세정(BAL)을 시행하고, BAL액 중의 호중구수를 비교 검토하였다. BAL은 생리 식염수 1mL로 계 5회 행하고, 얻어진 세포로부터 사이트 스핀 표본을 제작하고, DiffQuik 염색 후, 세포수를 카운트하였다. 본 발명의 추출물의 염증 세포 침윤 억제 작용(in vivo)을 조사한 결과의 일례를 도 7에 나타낸다. 본 발명의 추출물의 투여에 의해 흡연 폭로에 의한 염증 세포(호중구)의 침윤이 유의하게(p＜0.05) 억제되었다.

상기의 약리 시험 결과에서 분명하게 나타나 있는 바와 같이, 본 발명의 백시니아 바이러스 접종 염증조직 추출물은 흡연 추출 물질, 과산화 수소, 무혈청 등의 자극에 의한 산화 스트레스에 대하여 우수한 티오레독신 산생 촉진 작용을 가짐과 아울러, 항산화 작용, 아포토시스 억제 작용 등의 현저한 폐세포 보호 효과를 나타냈다. 따라서, 본 발명의 백시니아 바이러스 접종 염증조직 추출물은 레독스 상태의 불균형이 초래하는 질환·병태에 유효하고, 예를 들면, 만성 흡연 등의 지속적인 산화 스트레스가 주원인이라고 하는 만성 폐색성 폐질환(COPD)의 예방 또는 치료제로서도 유용하다. 시판의 백시니아 바이러스 접종 집토끼 염증 피부 추출액 제제는 오랜 세월에 걸쳐서 사용되어 대단히 안정성이 높은 약제로서 인정을 받고 있다. 이렇게, 본 발명의 추출물은 티오레독신 산생 촉진제, 폐세포 보호제 또는 폐기종이나 만성 기관지염 등의 만성 폐색성 폐질환의 예방·치료제로서 신규인 약제이고, 부작용도 거의 발현되지 않는 안정성이 높은 의약으로서 유용성이 높은 것 이다.

Claims

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백시니아 바이러스 접종 염증조직 추출물을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 폐세포 보호제.
백시니아 바이러스 접종 염증조직 추출물을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 만성 폐색성 폐질환의 예방 또는 치료제.
제 2 항에 있어서,

염증 조직이 토끼의 피부 조직인 것을 특징으로 하는 폐세포 보호제.
제 2 항 또는 제 4 항에 있어서,

주사제인 것을 특징으로 하는 폐세포 보호제.
제 2 항 또는 제 4 항에 있어서,

경구제인 것을 특징으로 하는 폐세포 보호제.
제 3 항에 있어서,

염증 조직이 토끼의 피부 조직인 것을 특징으로 하는 만성 폐색성 폐질환의 예방 또는 치료제.
제 3 항 또는 제 7 항에 있어서,

주사제인 것을 특징으로 하는 만성 폐색성 폐질환의 예방 또는 치료제.
제 3 항 또는 제 7 항에 있어서,

경구제인 것을 특징으로 하는 만성 폐색성 폐질환의 예방 또는 치료제.