CN107536854A - 具有化疗药物辅助剂功效的牛樟芝活性组成物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种具有化疗药物辅助剂功效的牛樟芝活性组成物及其应用，其中所述的牛樟芝活性组合物由50%至99%重量百分比(W/W)的牛樟芝菌丝体的水及乙醇与1%至50%的重量百分比(W/W)的牛樟段木栽培牛樟芝子实体的水及乙醇萃取物所组成。本发明的牛樟芝组合物活性经证实合并化疗药物后，对癌细胞的增生具有明显的抑制的作用，同时也可降低化疗药物所引起的毒性与副作用，可应用于制备抗肿瘤药物及化疗药物辅助剂。

Description

具有化疗药物辅助剂功效的牛樟芝活性组成物及其应用

技术领域

本发明关于一种具有化疗药物辅助剂功效的牛樟芝活性组成物及其应用。更特别地，本发明关于一种由50%至99%重量百分比(W/W)的固态培养牛樟芝菌丝体的水及乙醇萃取物与1%至50%之重量百分比(W/W)的牛樟段木栽培牛樟芝子实的水及乙醇萃取物所组成的牛樟芝组成物，以及其用于制备化疗药物辅助剂的应用。

背景技术

癌症是现今世界上致死率最高的疾病之一，根据世界卫生组织的统计数据显示，2012年全球癌症的发生人数为1409万、死亡人数为820万。由于人口结构逐渐老化，癌症的发生率将逐渐增加。估计至2030年发生人数将会上升至2126万、死亡人数将达1266万，全球癌症负担不断增加。

目前癌症的治疗主要采用手术、放疗及化疗三种方法，但这种传统的癌症治疗方法存在着诸多缺陷：一是只有早期病人才能进行手术治疗，然而手术无论是成功还是失败，都有可能造成转移；化疗则是进行全身性的治疗，化学治疗能成功地缩小许多实体肿瘤的负荷，消灭快速增殖的细胞化学疗法所用抗肿瘤药物均缺乏理想的选择性作用，所以在抑制癌细胞的同时，往往对机体增殖旺盛的细胞如骨髓、胃肠和生殖细胞及中枢神经系统具有一定影响，有的还对肝、肾、心脏功能及内分泌系统有影响。尤其是肿瘤的耐药性被视为化学治疗中的最大障碍。鉴于化疗副作用的产生会造成癌症患者身体不适，进而影响癌症患者是否能持续完成整个疗程，因此在进行化疗同时，搭配辅助治疗的介入，可以让癌症患者在进行化疗，同时可以减轻及改善化疗所造成的副作用。

牛樟芝（Antrodia cinnamomea，又名Antrodia camphorata或 Taiwanofunguscamphoratus)是中国台湾本省独有的药用真菌，在菌学分类上属于非裙菌目（Aphyllophorales)、多孔菌科(Polyporaceae)的多年生蕈菌类。中国台湾的原著民早期用牛樟芝来缓解宿醉和酒精相关的症状缓解。在中国台湾民间医药中，牛樟芝的子实体被认为对炎症、肝病和胃肠不适有效。牛樟芝如同一般食药用的蕈菇类，具有许多复杂的成分，已知的生理活性成分中，如三萜类化合物、多醣体、腺苷、维生素、蛋白质、核酸、固醇类等。许多研究证实牛樟芝具有抗肿瘤、增加免疫能力、抗过敏、抗病菌、抗高血压、降血糖及降胆固醇等多种功效，且有助于护肝及肝脏相关疾病的治疗。

研究指出，牛樟芝子实体及菌丝体萃取物可能具有清除自由基及抗氧化能力、降低酒精所诱发的急性肝损伤、保护四氯化碳诱发的急慢性肝损伤、增强免疫力，以及抑制肿瘤细胞生长等功能。

近几年来，产业界也大量投入牛樟段木人工植菌技术的研究，由实验结果可知，若以植菌成功率及子实体成长速率当指针，人工栽培牛樟芝与天然生长的牛樟芝生长相差不大，只要经过适当的处理，牛樟段木也可以培育出相当不错的牛樟芝子实体。但若进一步分析其次级(二次)代谢物含量及生理活性，则可看出中间的差异。根据实验结果显示，通常牛樟段木上长出的牛樟芝，经过连续三次萃取，仍可得到相当量的次级(二次)代谢物。这结果代表牛樟段木上培育出的牛樟芝拥有较高的次级(二次)代谢物含量。另外，生长于不同宿主的牛樟芝，其次级(二次)代谢物的组成也有很大的不同。由牛樟段木长出的牛樟芝，其中低极性的次级(二次)代谢物含量比其他树种长成的牛樟芝含量明显高很多，而这个范围内的次级(二次)代谢物通常具有最明显的抑癌活性。

牛樟芝应用在癌症治疗的研究很多，包括牛樟芝萃取物、分离物与其中所含成分，对于肿瘤细胞生长抑制作用的探讨。例如，中国台湾专利I484954揭露一种包含4-乙酰基-安卓奎诺尔B (4-acetyl-antroquinonol B)的癌症治疗剂；中国台湾专利I379678揭露一种由牛樟芝萃取物中分离纯化而得的4-羟基-2,3-二甲氧基-6-甲基-5(3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯)-2-环己烯酮，该环己烯酮化合物的组合物可应用于抑制淋巴癌肿瘤细胞的生长，同时可应用于抑制胃癌肿瘤细胞TSGH-9201的生长药物。中国台湾专利I363631揭示一种由牛樟芝萃取物所分离制得的去氢硫色多孔菌酸(dehydrosulphurenic acid)，可应用于抑制白血病与胰脏癌肿瘤细胞的生长。专利公开案20081111描述一种4,7-二甲氧基-5-甲基-1,3-苯并二氧环，可应用于抑制乳癌、肝癌与摄护腺癌肿瘤细胞的生长。然而，现有关于牛樟芝抗癌功效的研究主要着重于，牛樟芝子实体或菌丝体萃取物的单独的抗癌作用，以及其所含组成对于癌细胞增生抑制作用。

中国专利CN 103300421揭露一种含有牛樟芝菌丝体的一种辅助治疗癌症的药膳食品，是由多种药食兼具的中草药提取物与有针对性的食物相组合，对晚期的肝癌、肺癌、肠癌、胃癌和急慢性白血病患者，以食疗方式辅助治疗的一种汤剂食品。美国专利US 9,044,467 B2 开发一种液态发酵牛樟芝，具有改善含铂(platinum-based) 或含蒽环类抗生素(anthracycline-based)的抗癌药物引起的副作用，如疼痛、疲倦、忧郁以及有效时间的减短与体能下降等。US 20130089627则揭露给予一种含有4-乙酰基-安卓奎诺尔B (4-acetyl-antroquinonol B)的牛樟芝液态发酵乙酸乙酯萃取物，具有治疗因癌症干细胞所诱发的癌症的作用，且与化疗药物顺铂(Cisplatin)或紫杉醇(Taxol)，或放射线治疗组合，可增加对于癌细胞的抑制。但截至目前，尚无有关结合特定比例的固态培养菌丝体与子实体的水及乙醇萃取物的组成物，且已揭露可应用于作为协助化疗药物的癌症抑制作用，并降低化学药物治疗时造成的副作用的抗癌辅助剂。

发明内容

本发明基于以上的目的提供一种具有化疗药物辅助剂功效的牛樟芝活性组成物及其应用，所述具有化疗药物辅助剂功效的牛樟芝活性组成物，由50%至99% (W/W) 的牛樟芝固态培养菌丝体水及乙醇萃取物与1%至50% (W/W)的牛樟段木栽培牛樟芝子实体水及乙醇萃取物所组成的牛樟芝活性组成物，有效用于辅助化疗药物增进其抑制癌细胞增殖的效果，而且可用于减缓化疗药物的所引发的副作用，尤其是减缓化疗药物造成骨髓中巨噬细胞系集落(CFU-GM)下降，以及减缓化疗药物所引起白血球、红血球与淋巴球与对嗜中性白血球数目下降。

于是，本发明的一方面关于，一种具有抗癌药物辅助剂功效的牛樟芝活性组成物，由50%至99% (W/W)的牛樟芝固态培养菌丝体水及乙醇萃取物与1%至50% (W/W)的牛樟段木栽培牛樟芝子实体水及乙醇萃取物所组成。所述的牛樟芝活性组成物由60%至95% (W/W)的牛樟芝固态培养菌丝体水及乙醇萃取物与5%至40% (W/W)的牛樟段木栽培牛樟芝子实体水及乙醇萃取物所组成。

所述的抗癌药物辅助剂用于增进抗癌药物的抑制癌细胞增殖的功效。所述的抗癌药物辅助剂用于减缓抗癌药物所引发的副作用。所述的抗癌药物辅助剂用于，尤其是减缓化疗药物造成骨髓中巨噬细胞系集落(CFU-GM)数目下降。所述的抗癌药物辅助剂用于减缓及回复化疗药物所引起的血液血球数目，包括白血球、红血球与淋巴球与对嗜中性白血球的数目下降。

于本发明，所述的抗癌药物包括(但不限定于)化疗药物，例如抗病毒剂、基因治疗剂、标靶治疗剂等。所述的化疗药物包括(但不限定于)抗代谢药物、烷化剂、蒽环类、抗生素、抗有丝分裂剂、蛋白酶体抑制剂及铂类化疗药物。所述的化疗药物包含(但不限定于)5-氟尿嘧啶(5-FU)、表柔比星(Epirubicin)、奥克赛铂(oxaliplatin)或其组合。所述的癌症选自肺癌、肠癌、胃癌及乳癌，较佳为胃癌。

附图说明

图1为不同比例的牛樟段木栽培牛樟芝子实体水及乙醇萃取物与固态培养菌丝体水及乙醇萃取物对MKN-45胃癌荷瘤小鼠肿瘤在喂食三周后肿瘤重量的影响。

图2显示牛樟段木栽培牛樟芝子实体水及乙醇萃取物与固态培养菌丝体水及乙醇萃取物对于辅助化疗药物5-FU具有明显的抑制肿瘤增生的作用。

图3显示牛樟段木栽培牛樟芝子实体水及乙醇萃取物与固态培养菌丝体水及乙醇萃取物降低化疗药物5-FU所引起骨髓细胞中的CFU-GM的减少。

图4A、图4B、图4C、图4D分别显示牛樟段木栽培牛樟芝子实体水及乙醇萃取物与固态培养菌丝体水及乙醇萃取物降低，化疗药物5-FU所引起白血球(white blood cell,WBC)、红血球(Red blood cell,RBC)、淋巴球、对嗜中性白血球数目下降的副作用。

图5显示牛樟段木栽培牛樟芝子实体水及乙醇萃取物与固态培养菌丝体水及乙醇萃取物改善化疗药物5-FU及奥克赛铂(oxaliplatin) 造成的骨髓抑制(CFU-GM及落数目降低)现象。*，相较于对照组，p<0.05；#，相较于5-FU+oxa组，p<0.05。

图6显示牛樟段木栽培牛樟芝子实体水及乙醇萃取物与固态培养菌丝体水及乙醇萃取物回复化疗药物5-FU及奥克赛铂(oxaliplatin) 造成的白血球降低现象。*，相较于对照组，p<0.05；#，相较于5-FU+oxa组，p<0.05。

图7显示牛樟段木栽培牛樟芝子实体水及乙醇萃取物与固态培养菌丝体水及乙醇萃取物缓解化疗药物5-FU及奥克赛铂(oxaliplatin) 造成的红血球降低现象。*，相较于对照组，p<0.05；#，相较于5-FU+oxa组，p<0.05。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例一、牛樟芝活性组成物的制备

制备牛樟段木栽培牛樟芝子实体的水及乙醇萃取物：将牛樟段木栽培牛樟芝子实体鲜品于 45 ℃烘箱低温烘干两天，取干燥粉末加入10倍体积（w：v = 1:10）的95%乙醇，以超音波震荡30 min后，再浸泡萃取隔夜。将萃取液以No.1滤纸抽气过滤，将过滤出的萃渣再重复一次上述的95%乙醇萃取过滤步骤。接着将经过滤得的萃渣以10倍体积（w：v = 1:10）的水煎煮两小时进行水萃取步骤，重复萃取两次。将上述的乙醇萃取物及水萃取物合并，浓缩至浸膏(所得产物以下简称FB)。

制备牛樟芝固态培养菌丝体水及乙醇萃取物：将牛樟芝固态培养菌丝体干燥粉末，加入10倍体积（w：v = 1:10）的95%乙醇，以超音波震荡60 min后，浸泡萃取隔夜；以No.1滤纸抽气过滤；过滤出的萃渣再重复两次萃取过滤步骤；萃渣再以10倍体积（w：v = 1: 10）的水煎煮两小时，重复萃取两次。合并乙醇萃取物及水萃取物，浓缩至浸膏(所得产物以下简称SC)。

将上述所得的牛樟芝固态发酵菌丝体萃取物(SC)与牛樟段木栽培牛樟芝子实体萃取物(FB)，以不同的比例(子实体萃取物/固态发酵萃取物，%w/w)混合，配置成四种牛樟芝活性组成物：40% FB/SC、20% FB/SC、10% FB/SC及5% FB/SC。

实施例二、牛樟芝活性组成物的肿瘤细胞抑制功效

将如实施例一制备的牛樟芝固态发酵菌丝体乙醇及水萃取物(SC)和牛樟段木栽培牛樟芝子实体乙醇及水萃取物(FB)，先用100 % DMSO配置成浓度为50 mg/mL，再混合二者配置成四种不同比例(w/w)的子实体萃取物/固态发酵萃取物。待测物有100 % FB、40 % FB/SC、20% FB/SC、10% FB/SC、5% FB/SC、100% SC总共6个样品，浓度皆为50 mg/mL。待测物先用DMSO稀释8个浓度(40、30、20、10、5、1、0.5、0.25 mg/mL)。再将8个不同浓度待测物用含有5%FBS的细胞培养液稀释20倍 (浓度为2000、1500、1000、500、250、50、25、12.5 μg/mL)，使其在96孔盘中最终浓度为200、150、100、50、25、5、2.5、1.25 μg/mL。以5-FU作为阳性对照组(positive control)。

将八种癌细胞包括：A549(肺癌)、NCI-H460(肺癌)、SW480(肠癌)、Colo205(肠癌)、MKN45(胃癌)、AGS(胃癌)、MDA-MB-231(乳癌)及MCF-7(乳癌))，以6 x 103 cell/well的密度分别植于96孔盘，培养液的体积为180μL/well，培养条件为 37℃、4小时。再加入20μL 含有不同浓度待测物的细胞培养液(5% FBS)，使每孔总体积为 200μL，放入培养箱中培养。经过48小时后，将旧培养液移除后，再加入含有 MTS的5% FBS 细胞培养液，放入培养箱中培养1小时，以 ELISA Reader 读取波长490 nm 的吸光值。再利用 GraphPad Prism 5 软件计算出IC50。结果如下表1。

表1. 不同比例的牛樟段木栽培牛樟芝子实体萃取物与固态培养菌丝体萃取物对 于抑制八种癌细胞 (肺癌、肠癌、胃癌、乳癌各两株)癌细胞增生的影响

细胞	100% FB	40% FB/SC	20% FB/SC	10% FB/SC	5% FB/SC	100% SC
							A549	175.0	165.2	176.6	>200	189.7	189.2
NCI-H460	157.4	139.3	142.6	155.6	158.5	>200
							AGS	133.0	145.5	144.5	144.5	137.7	137.1
MKN45	69.7	105.2	104.0	104.2	103.8	108.9
							SW480	111.2	130.3	151.7	152.8	159.6	157.4
COLO 205	99.8	131.5	167.9	173.4	182.0	187.9
							MDA-MB-231	104.2	150.7	143.5	137.7	138.4	141.9
MCF-7	98.2	166.0	155.2	157.0	150.7	155.2

由表1的结果显示，牛樟段木栽培牛樟芝子实体萃取物与固态培养菌丝体萃取物，对于A549及 NCI-H460肺癌细胞, 最佳比例组别均为40% FB/SC，抑制肿瘤增生的作用比子实体萃取物较佳；乳癌细胞与肠癌细胞与最佳比例组别均为100% FB。在试验中发现，相较于肺癌、肠癌与乳癌，100% SC的组别对于胃癌细胞最为有效(AGS的IC50为137.1μg/mL，MKN45的IC50为108.9μg/mL)。而胃癌细胞株 MKN45，亦为八种癌细胞中对于测试物质最敏感的癌种，所测试的六种样品，其IC50的范围为69.7-108.9μg/mL。

实施例三、牛樟芝活性组成物的活体内抑制胃癌肿瘤生长功效

本实施例进一步通过动物试验评估，本发明牛樟芝活性组成物(由牛樟段木栽培牛樟芝子实体萃取物与固态培养菌丝体萃取物组成)在抑制胃癌肿瘤生长的功效。试验物质包含5% FB/95% SC、10% FB/90% SC、20% FB/80% SC、40% FB/60% SC。动物试验乃利用人类胃癌细胞株(MKN-45)植入免疫缺乏小鼠的模式，于植入癌细胞10天后，开始管喂测试物质(300 mg/kg/天)，经21天后，牺牲动物，取下肿瘤并比较肿瘤重量，以作为评估抑制肿瘤生长的主要指标。

接种MKN-45胃癌肿瘤可导致裸鼠体重下降约3g，但从喂食试验物质的各组别与控制组或5-FU组相比较，其体重并无明显差异。但由此可确认，试验物质不会增加荷瘤小鼠体重下降的幅度。喂食三周后牺牲动物，手术取下肿瘤秤重，证实施打5-FU与喂食含10% FB/90% SC测试物质的组别，可显著减少肿瘤重量( p值分别为0.001与 0.046)。

此外，图1的结果显示，含10% FB/90% SC的牛樟芝萃取物(300 mg/kg/天)已证实可降低肿瘤重量，且不会增加荷瘤小鼠体重下降的幅度，且试验物质10%FB/90%SC的抑制胃癌肿瘤效果，与试验物质40%FB/60%SC的肿瘤抑制效果相近(图1)。

实施例四、牛樟芝活性组成物促进化疗药物的癌细胞增生抑制的作用

牛樟段木栽培牛樟芝子实体萃取物及固态培养菌丝体萃取物单独或合并化疗药物处理对抑制胃癌细胞增生的作用，以MKN45、AGS及HGC27三种细胞株进行测试，合并处理测试药物(牛樟芝子实体萃取物(FB)、固态培养菌丝体萃取物(SC)、及牛樟段木栽培牛樟芝子实体萃取物与固态培养菌丝体萃取物的组合物(FB+SC))及化疗药物5-氟尿嘧啶(5-FU)或表柔比星(Epirubicin)，测试药物与化疗药物配制，须参考测试药物与化疗药物的IC25浓度，单独只含测试药物或化疗药物IC25浓度的组别，为实验稳定与否的参考指标。测试药物与化疗药物协同作用的起始浓度，为其IC25的组合，并依序往下进行对半稀释。

MKN45及AGS 细胞使用含5% FBS的RPMI-1640培养液，HGC27细胞使用含5% FBS的MEM培养液。于 96孔盘中每孔植入6x103个细胞，培养液体积为180μL，37℃培养4小时后每孔加入测试药物20μL，每个浓度三重复实验。于37℃培养48小时后，移除旧培养液，加入含MTS的5% FBS细胞培养液，于37℃反应1小时，以ELISA Reader读取波长490 nm吸光值，并用GraphPad Prism 5软件计算IC25、IC50、IC75及协同作用因子(combination index, CI)数值。结果列示于下表2。

表2.牛樟段木栽培牛樟芝子实体萃取物与固态培养菌丝体萃取物对于化疗药物5-FU及表柔比星(Epi)的协同作用因子(CI)

以协同作用因子(CI)判定，本发明的牛樟芝活性组成物与化疗药物5-FU及表柔比星有无协同作用发生，由内插法得到于合并处理下抑制细胞活性25%的个别药物浓度，分别与原IC25数值相除后二值相加可得CI，理论上CI 等于1为加成作用，CI小于1为协同作用。结果得知，以FB或FB+SC合并表柔比星处理MKN45细胞，可产生协同作用(CI为0.60及0.77)；以SC合并表柔比星的组别为加成作用(CI为1.02)；以FB+SC合并5-FU，则具有加成作用(CI为0.98)。而AGS及HGC27细胞中，以5-FU或表柔比星合并三种测试药物，其CI都趋近或大于1。以FB或FB+SC合并化疗药物表柔比星处理MKN45细胞，可见协同作用产生；而以FB或FB+SC合并化疗药物5-FU时，在抑制癌细胞生长上具有加成性效果。显示，本发明的牛樟芝活性组成物具有促进化疗药物抑制癌细胞增生的作用。

实施例五、牛樟芝活性组成物辅助化疗药物的活体内肿瘤抑制功效

本实例通过动物试验确认，本发明的牛樟段木栽培牛樟芝子实体萃取物与固态培养菌丝体萃取物的组合物对于辅助化疗药物 5-FU的功效。研究使用动物为Balb/c nu/nu裸鼠，购自国家实验动物中心，六周龄。胃癌正控制组使用5-FU，剂量为25 mg/kg，投予药物频率每周三次，采腹腔注射。牛樟段木栽培牛樟芝子实体萃取物与固态培养菌丝体萃取物的牛樟芝活性组成物(L)：一倍剂量为680 mg/kg，0.5倍剂量为340 mg/kg，0.25倍剂量为170mg/kg，0.125倍剂量则为85 mg/kg，投予药物频率为每天一次，采管喂方式。若当日有施打5-FU，则于施打5-FU后4小时进行管喂L。人类胃癌细胞 MKN-45 (细胞数目为 3×10⁶)，植入免疫缺乏小鼠，至肿瘤尺寸达100-200 mm³为基准开始进行投药。动物试验包含对照组、5-FU、5-FU+L、5-FU+0.5L、5-FU+0.25L及5-FU+0.125L六个组别，每个组别8只小鼠。

结果如图2所示。显示，与控制组相比，单独处理5-FU的组别可抑制 MKN-45胃癌细胞肿瘤发育(控制组肿瘤重量为1.60 g，单独处理5-FU组别为0.85 g，p<0.05，已达统计上差异)。而5-FU+L及5-FU+0.5L与单独5-FU处理组相比，皆可加强肿瘤抑制效果，数据具统计意义。(单独处理5-FU组的肿瘤重量为0.85 g，5-FU+L组的肿瘤重量为0.32 g，5-FU+0.5L组的肿瘤重量为0.32 g，后二者分别与前者比较，p<0.05，皆已达统计上差异)。5-FU+0.25L处理组(肿瘤重量为0.59 g)及5-FU+0.125L处理组(肿瘤重量为0.53 g)与单独5-FU(肿瘤重量为0.85 g) 处理组相比，虽未达统计意义，仍可见前二组的肿瘤抑制效果较后者佳。

实施例六、牛樟芝活性组成物回复化疗药物5-FU造成的血球减少

利用培养小鼠骨髓细胞中的CFU-GM，探讨本发明的牛樟芝活性组成物(L)回复因施用5-FU造成的血球减少效果。研究使用动物为C57BL/6鼠，购自国家实验动物中心，八周龄。动物试验包含：对照组、5-FU、5-FU+L、5-FU+0.5L、5-FU+0.25L及5-FU+ Angiotensin II(Aii)六个组别，每个组别6只小鼠。首日以腹腔注射施打5-FU (200 mg/kg)后，第4至10天以管喂方式投予测试药物牛樟芝活性组成物(L)，或是以腹腔注射施打正控制组药物Angiotensin II (Aii，剂量为100 μg/kg)。牛樟段木栽培牛樟芝子实体萃取物与固态培养菌丝体萃取物的组合物(L)：一倍剂量为680 mg/kg，0.5倍剂量为340 mg/kg，0.25倍剂量为170 mg/kg。第11天实验动物牺牲前，以脸颊采血方式收集全血，进行全血细胞计数(Complete Blood Count，CBC)，判定周边血液各血球数目，包括白血球、红血球、淋巴球与嗜中性白血球。第11天实验动物牺牲时手术取下老鼠大腿骨，收集骨髓细胞培养CFU-GM，细胞培养7天观察细胞集落(colony)数目。

图3的结果显示，与控制组相比，单独处理5-FU组别可显著抑制GM-CFC数目(控制组的细胞集落数目为3,061个/10⁶个骨髓细胞，单独处理5-FU组别的细胞集落数目为1,869个/10⁶个骨髓细胞，p<0.05，已达统计上差异)。5-FU+L、5-FU+0.5L及5-FU+0.25L与单独处理5-FU相比，皆可加强肿瘤抑制效果，数据具统计意义。(单独处理5-FU组别细胞集落数目为1,869个/10⁶个骨髓细胞，5-FU+L为2,917个/10⁶个骨髓细胞，5-FU+0.5L为2,778个/10⁶个骨髓细胞，5-FU+0.25L为2,717个/10⁶个骨髓细胞，后三者分别与单独处理5-FU组别比较，p<0.05，皆已达统计上差异)。实验结果显示，本发明的牛樟段木栽培牛樟芝子实体萃取物与固态培养菌丝体萃取物的组合物可有效恢复5-FU造成的骨髓抑制作用。

由全血细胞计数结果(图4A-图4D)显示，5-FU会显著抑制白血球、红血球与淋巴球数目(p<0.05，已达统计上差异)，对嗜中性白血球数目也有抑制。5-FU合并测试物质(L，一倍剂量)与单独处理5-FU相比，合并测试物质L可使白血球数目显著回升(p<0.05，已达统计上差异)，也可使嗜中性白血球与淋巴球数目回升，虽未达统计意义，仍可见明显效果，但对红血球无恢复效果。实验结果显示，本发明的牛樟段木栽培牛樟芝子实体水及乙醇萃取物与固态培养菌丝体水及乙醇萃取物的组合物可有效回复5-FU造成的血球抑制作用。

实施例七、牛樟芝活性组成物改善化疗药物5-FU 及奥克赛铂造成的骨髓抑制与血球减少现象

本实施例利用小鼠骨髓免疫相关细胞造血能力的实验(CFU-GM colony 计数观察)，评估本发明的牛樟芝活性组成物(L)改善化疗药物 5-FU 及奥克赛铂(oxaliplatin)造成的骨髓抑制现象，研究使用动物为C57BL/6 公鼠，购自国家实验动物中心，八周龄。化疗药物使用 5-FU 及奥克赛铂，于第 0 天、第 2 天及第 4 天施打5-FU ( 3 次投药总剂量为100 mg/kg) 及奥克赛铂 ( oxa，3 次投药总剂量为 3 mg/kg)，采腹腔注射。第 0 至 9天以管喂方式投予本发明的牛樟芝活性组成物(L)，频率为每天一次，每日投与剂量为 510mg/kg、340 mg/kg、227 mg/kg 或 151 mg/kg。动物组别分别为控制组、5-FU + 奥克赛铂(5-FU+oxa)、5-FU + 奥克赛铂 + L测试物质 510 mg/kg (5-FU+oxa+L510)、5-FU + 奥克赛铂 + L 测试物质 340 mg/kg (5-FU+oxa+L340)、5-FU + 奥克赛铂 + L 测试物质 227mg/kg (5-FU+oxa+L227) 及 5-FU + 奥克赛铂 + L 测试物质 151 mg/kg (5-FU+oxa+L151)，每组 6 只小鼠，6 组共 36 只。第 10 天实验动物牺牲前，以脸颊采血方式收集全血，以抗凝全血进行全血细胞计数 ( Complete Blood Count，CBC )，判定周边血液各血球数目。第 10 天实验动物牺牲时，利用手术取下小鼠大腿骨，收集骨髓细胞培养CFU-GM(Colony-forming unit-granulocyte, macrophage)，培养 7 天后以显微镜观察并计算CFU-GM 的细胞集落(colony)数目。

由图5的结果显示，控制组的细胞集落数目约为3153 个/10⁶个骨髓细胞，5-FU +奥克赛铂的处理组的细胞集落数目约为1711 个/10⁶个骨髓细胞，兩者已达统计差异，显示5-FU +奥克赛铂的确会造成骨髓抑制。而5-FU +奥克赛铂合并510 mg/kg本发明的牛樟芝活性组成物(L)的处理组，其细胞集落数目为3253 个/10⁶个骨髓细胞，已恢复至和控制组相当，而以5-FU + 奥克赛铂合并340 mg/kg 本发明的牛樟芝活性组成物(L)的处理组，其细胞集落数目为2586 个/10⁶个骨髓细胞。表示5-FU + 奥克赛铂合并340 及510 mg/kg本发明的牛樟芝活性组成物(L)相较于以5-FU +奥克赛铂处理的组别，CFU-GM 的细胞集落(colony)数目皆有显著增加，已达统计差异。5-FU + 奥克赛铂合并较低剂量(227 mg/kg及151 mg/kg)的牛樟芝活性组成物(L)的组别，其细胞集落数目的增加亦呈现随牛樟芝活性组成物(L)浓度上升而有逐渐增加的情形，显示在改善骨髓免疫相关细胞造血能力的实验中，本发明的牛樟芝活性组成物(L)可以剂量依赖型式有效恢复 5-FU +奥克赛造成的骨髓抑制现象。

图 6 为小鼠牺牲前的白血球计数结果，显示 5-FU +奥克赛铂的确会造成周边血液中白血球数目减少。以5-FU +奥克赛铂合并牛樟芝活性组成物(L) (510、340、227 及151 mg/kg)的组别，白血球数目和处理 5-FU +奥克赛铂的组别相比，皆有显著增加且已达统计差異，显示在改善周边血白血球数目的实验中，本发明的牛樟芝活性组成物(L)可以有效恢复 5-FU+ oxaliplatin 造成的白血球低下。

再者，由图 7 的结果亦显示， 5-FU +奥克赛铂的确会造成周边血液中红血球数目减少。而合并牛樟芝活性组成物(L)处理，其红血球数目有随牛樟芝活性组成物(L)浓度上升而增加的情形，尤其以5-FU +奥克赛铂合并510 mg/kg牛樟芝活性组成物(L)处理的组别，和以5-FU +奥克赛铂处理的组别相比，红血球数目皆有显著增加且已达统计差异，显示在改善周边血红血球数目的实验中，合并本发明的牛樟芝活性组成物(L) 可以有效恢复5-FU + oxaliplatin 造成的红血球低下。

综合以上结果，本发明的包含牛樟段木栽培牛樟芝子实体水及乙醇萃取物与固态培养菌丝体水及乙醇萃取物的牛樟芝活性组成物具有促进化疗药物抑制癌细胞增生的作用、辅助化疗药物的肿瘤抑制功效，亦可有效改善与恢复化疗药物造成的骨髓抑制与血球减少现象，可应用于制备抗肿瘤药物及化疗药物辅助剂，减少有害药物的使用剂量并改善药物造成的毒害副作用，亟具产业利用价值。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (15)

1.一种具有化疗药物辅助剂功效的牛樟芝活性组成物，其特征在于，由50%至99% (W/W)的牛樟芝固态培养菌丝体的水及乙醇萃取物与1%至50% (W/W)的牛樟段木栽培牛樟芝子实体的水及乙醇萃取物所组成。

2.根据权利要求1所述的具有化疗药物辅助剂功效的牛樟芝活性组成物，其特征在于，其中该牛樟芝固态培养菌丝体的水及乙醇萃取物经5-15倍 (w/v)的乙醇及5-15倍 (w/v)的水萃取而得。

3.根据权利要求1所述的具有化疗药物辅助剂功效的牛樟芝活性组成物，其特征在于，其中该牛樟段木栽培牛樟芝子实体的水及乙醇萃取物经5-15倍 (w/v)的乙醇及5-15倍(w/v) 的水萃取而得。

4.根据权利要求1所述的具有化疗药物辅助剂功效的牛樟芝活性组成物，其特征在于，其中该牛樟段木栽培牛樟芝子实体的水及乙醇萃取物的组成比例为5%至40%。

5.根据权利要求1所述的具有化疗药物辅助剂功效的牛樟芝活性组成物，其特征在于，该牛樟芝固态培养菌丝体的水及乙醇萃取物的组成比例为60-95%。

6.一种权利要求1所述的具有化疗药物辅助剂功效的牛樟芝活性组成物的应用，其特征在于，该牛樟芝活性组成物用于制备化疗药物辅助剂，其中该牛樟芝活性组成物包含60%至95% (W/W)的牛樟芝固态培养菌丝体的水及乙醇萃取物与5%至40% (W/W)的牛樟段木栽培牛樟芝子实体的水及乙醇萃取物。

7.根据权利要求6所述的具有化疗药物辅助剂功效的牛樟芝活性组成物的应用，其特征在于，其中该化疗药物辅助剂用于增进化疗药物的癌症抑制功效。

8.根据权利要求7所述的具有化疗药物辅助剂功效的牛樟芝活性组成物的应用，其特征在于，其中该癌症选自由肺癌、肠癌、胃癌及乳癌所组成的组群。

9.根据权利要求8所述的具有化疗药物辅助剂功效的牛樟芝活性组成物的应用，其特征在于，其中该癌症为胃癌。

10.根据权利要求6所述的具有化疗药物辅助剂功效的牛樟芝活性组成物的应用，其特征在于，其中该化疗药物辅助剂用于减缓化疗药物所引发的副作用。

11.根据权利要求10所述的具有化疗药物辅助剂功效的牛樟芝活性组成物的应用，其特征在于，其中该化疗药物辅助剂用于减缓化疗药物造成的骨髓造血功能下降的副作用。

12.根据权利要求10所述的具有化疗药物辅助剂功效的牛樟芝活性组成物的应用，其特征在于，其中该化疗药物辅助剂用于减缓化疗药物所引起的血液血球数目下降的副作用。

13.根据权利要求12所述的具有化疗药物辅助剂功效的牛樟芝活性组成物的应用，其特征在于，其中该血液血球选自白血球、红血球与淋巴球及对嗜中性白血球。

14.根据权利要求6所述具有化疗药物辅助剂功效的牛樟芝活性组成物的应用，其特征在于，其中该化疗药物选自抗代谢药物、烷化剂、蒽环类、抗生素、抗有丝分裂剂、蛋白酶体抑制剂及铂类化疗药物。

15.根据权利要求14所述具有化疗药物辅助剂功效的牛樟芝活性组成物的应用，其特征在于，其中该化疗药物选自5-氟尿嘧啶、表柔比星、奥克赛铂及其组合。