CN106029878B

CN106029878B - 用于产生β-葡聚糖聚合物的方法及用于此方法的遗传修饰微生物

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Publication number: CN106029878B
Application number: CN201480075823.9A
Authority: CN
Inventors: A·赫鲁贝克; B·布罗克曼; A·赫罗尔德; M·格兰斯特罗姆; C·弗莱克
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 2013-12-19
Filing date: 2014-12-12
Publication date: 2021-06-29
Anticipated expiration: 2034-12-12
Also published as: KR102263796B1; CA2933955A1; BR112016013850A2; MX2016008103A; EP3083951B1; CN106029878A; EP3083951A1; RU2016129208A; WO2015091231A1; ZA201604767B; BR112016013850B1; KR20160103037A

Abstract

用于产生聚合物的方法，该聚合物由β‑D‑(1‑3)‑吡喃葡糖基单元的线性主链组成，该线性主链具有(1‑6)连接至线性主链的β‑D‑吡喃葡糖基单元的单一β‑D‑吡喃葡糖基单元，平均分支度为约0.3，该方法包括以下步骤：(i)在允许遗传修饰微生物产生聚合物的条件下，在培养基中培养能够产生该聚合物的该微生物，该聚合物由β‑D‑(1‑3)‑吡喃葡糖基单元的线性主链组成，该线性主链具有(1‑6)连接至线性主链的β‑D‑吡喃葡糖基单元的单一β‑D‑吡喃葡糖基单元，平均分支度为约0.3，其中与相同菌株的未修饰对照微生物相比，该修饰赋予选自以下的至少两种基因产物的提高的活性：(a)己糖激酶；(b)葡糖磷酸变位酶；(c)UTP‑葡糖‑1‑磷酸尿苷酰转移酶；(d)1,3‑β‑葡聚糖合酶；(e)分支酶；(ii)可选地从培养基回收该聚合物。

Description

用于产生β-葡聚糖聚合物的方法及用于此方法的遗传修饰微生物

本发明涉及能够产生beta-葡聚糖(本文中也称为β-葡聚糖)的遗传修饰微生物，及用于产生β-葡聚糖聚合物的方法。

背景技术

已知β-葡聚糖是几种微生物(尤其是真菌和酵母)细胞壁中非常保守的成分。

大量密切相关的β-葡聚糖显示相似的分支模式，如裂褶菌素、小核菌聚糖、pendulan、cinerian、昆布多糖、蘑菇多糖和pleuran，它们全都显示β-D-(1-3)-吡喃葡糖基(glucopyranosyl)单位的线性主链，单一β-D-吡喃葡糖基单元(1-6)连接至线性主链的β-D-吡喃葡糖基单元，平均分支度为约0.3。

PCT/EP2013/064024涉及能够产生聚合物的遗传修饰微生物，该聚合物由β-D-(1-3)-吡喃葡糖基单元的线性主链组成，该线性主链具有(1-6)连接至线性主链的β-D-吡喃葡糖基单元的单一(single)β-D-吡喃葡糖基单元，平均分支度为约0.3，其特征在于，与对应的相同菌株的未修饰对照微生物相比，该遗传修饰微生物过量表达(i)编码具有1,3-β-D-葡聚糖合酶活性的多核苷酸和/或(ii)具有1,3-β-D-葡聚糖合酶活性的多肽。

发明描述

在第一实施方案中，本发明涉及能够产生聚合物的遗传修饰微生物，该聚合物由β-D-(1-3)-吡喃葡糖基单元的线性主链组成，该线性主链具有(1-6)连接至线性主链的β-D-吡喃葡糖基单元的单一β-D-吡喃葡糖基单元，平均分支度为约0.3，其中与相同菌株的未修饰对照微生物相比，该修饰赋予选自以下的至少两种基因产物的提高的活性：

(a)己糖激酶；

(b)葡糖磷酸变位酶；

(c)UTP-葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶；

(d)1,3-β-葡聚糖合酶；

(e)分支酶。

基因产物(a)己糖激酶意指磷酸化己糖(六碳糖)形成磷酸己糖的酶。己糖激酶催化的反应是：

ATP+D-己糖＝ADP+D-己糖-6-磷酸

己糖激酶的IUBMB酶命名是EC 2.7.1.1。

己糖激酶的优选多肽序列在SEQ ID NO:45中公开；以及优选多肽序列是与SEQ IDNO:45至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％和99％同一，且具有至少50％、优选80％、90％、100％和最优选超过100％、超过120％、超过150％SEQ ID NO:45的多肽的酶活性的多肽序列。

己糖激酶的另一优选多肽序列在SEQ ID NO:51中公开；以及优选多肽序列是与SEQ ID NO:51至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％和99％同一，且具有至少50％、优选80％、90％、100％和最优选超过100％、超过120％、超过150％SEQ ID NO:51的多肽的酶活性的多肽序列。

基因产物(b)葡糖磷酸变位酶意指将α-D-葡萄糖单体上的磷酸基团按正向从1'位转移至6'位或按反向从6'位转移至1'位的酶。

己糖激酶的IUBMB酶命名是EC 5.4.2.2。

己糖激酶的优选多肽序列在SEQ ID NO:29中公开；以及优选多肽序列是与SEQ IDNO:29至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％和99％同一，且具有至少50％、优选80％、90％、100％和最优选超过100％、超过120％、超过150％SEQ ID NO:29的多肽的酶活性的多肽序列。

基因产物(c)UTP-葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶也称为葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶(或UDP-葡糖焦磷酸化酶)，是与糖原生成相关的酶。它从葡糖-1-磷酸和UTP合成UDP-葡糖。它所催化的反应是：

葡糖-1-磷酸+UTP->UDP-葡糖+焦磷酸

UTP-葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的IUBMB酶命名是EC 2.7.7.9。

UTP-葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的优选多肽序列在SEQ ID NO:33、37和41中公开；以及优选多肽序列是与SEQ ID NO:33、37和41至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％和99％同一，且具有至少50％、优选80％、90％、100％和最优选超过100％、超过120％、超过150％SEQ ID NO:33、37和41的多肽的酶活性的多肽序列。

基因产物(d)1,3-β-葡聚糖合酶意指催化形成真菌细胞壁的主要成分β-1,3-葡聚糖聚合物的糖基转移酶。所催化的反应是：

UDP-葡糖+{(1,3)-β-D-葡糖基}(N)＝UDP+{(1,3)-β-D-葡糖基}(N+1)

1,3-β-葡聚糖合酶的IUBMB酶命名是EC 2.4.1.34。

1,3-β-葡聚糖合酶的优选多肽序列在SEQ ID NO:47和49中公开；以及优选多肽序列是与SEQ ID NO:47和49至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％和99％同一，且具有至少50％、优选80％、90％、100％和最优选超过100％、超过120％、超过150％SEQ IDNO:47和49的多肽的酶活性的多肽序列。

基因产物(e)分支酶意指催化形成真菌细胞壁的主要成分β-D-(1-3)-吡喃葡糖基单元的糖基转移酶、分支酶、葡糖苷酶、转葡糖苷酶，该β-D-(1-3)-吡喃葡糖基单元具有(1-6)连接至线性主链的β-D-吡喃葡糖基单元的单一β-D-吡喃葡糖基单元，平均分支度为约0.3。所催化的反应是：

UDP-葡糖+{(1,3)-β-D-葡糖基}(N)＝UDP+{(1,3:1,6)-β-D-葡糖基}(N+1)

分支酶的IUBMB酶命名是EC 2.4.1。

分支酶的优选多肽序列在SEQ ID NO:2、11、18和26中公开；以及优选多肽序列是与SEQ ID NO:2、11、18和26至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％和99％同一，且具有至少50％、优选80％、90％、100％和最优选超过100％、超过120％、超过150％SEQ IDNO:2、11、18和26的多肽的酶活性的多肽序列。

具有赋予至少一种、或两种、或三种、或四种或五种上述基因产物(a)至(e)的提高的活性的修饰的遗传修饰微生物意指通过內源或外源因子处理以最终提高对应的基因产物活性的微生物。

这可能在不同水平进行，例如在DNA水平、在RNA水平和在蛋白质水平。

在DNA水平，可以通过将多个拷贝的各基因产物的基因，或一个或多个拷贝的编码具有更高酶活性的基因产物，或编码不像未突变的基因产物那样在微生物中快速降解的更稳定的基因产物酶的突变基因引入微生物，来达到各基因产物的提高的活性。各基因的这些附加拷贝可以引入微生物的基因组中或以染色体外的方式引入。它们还可以以持久或瞬时的方式引入。

在RNA水平，可能通过使用遗传元件来提高基因表达，如有效的启动子、增强子、终止子和其他调节元件，其允许各基因更高的或持久的基因表达。

另一种可能性是稳定化各基因产生的RNA转录物，以实现每单位时间内更高数目的转录物可用于翻译。

另一种可能性是通过改变多核苷酸位点(如操纵子)上或多肽位点(如阻抑蛋白)上的调节元件来使强烈受调节的基因表达(例如反馈抑制)失调。通过这种手段，可使高度受调节的基因表达(“瓶颈”)失调，以允许更高的基因产物活性。

在蛋白质方面干扰的另一种可能性是基因的密码子选择。针对各宿主生物优化的密码子选择允许高翻译速率，导致活性蛋白质增加。

干扰的可能性可以以多种方式组合，例如可以在强启动子下表达多个拷贝的密码子优化基因。

在本发明的背景中，术语“遗传修饰微生物”应以广义理解；不仅“基因”和“遗传元件”(如启动子)为术语“遗传修饰微生物”所涵盖，通过使用紧密结合阻抑蛋白从而失活阻抑蛋白的分子来去阻抑基因调节也理解为本发明的遗传修饰微生物。

在本发明的背景中，还使用基因产物的组合。为了以缩写形式描述这类基因产物组合，将术语(a)、(b)、(c)、(d)和(e)用于以下基因产物：

(a)用于己糖激酶；

(b)用于葡糖磷酸变位酶；

(c)用于UTP-葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶；

(d)用于1,3-β-葡聚糖合酶；

(e)用于分支酶。

具有上述基因产物之一的至少一种提高的活性的遗传修饰微生物是具有例如以下基因产物的提高的活性的这类微生物：

(a)

(b)

(c)

(e)

具有上述基因产物的组合的遗传修饰微生物是具有例如以下两种基因产物的提高的活性的这类微生物：

(a)和(b)

(a)和(c)

(a)和(d)

(a)和(e)

(b)和(c)

(b)和(d)

(b)和(e)

(c)和(d)

(c)和(e)

(d)和(e)

具有上述基因产物的组合的遗传修饰微生物是具有例如以下三种基因产物的提高的活性的这类微生物：

(a)和(b)和(c)

(a)和(b)和(d)

(a)和(b)和(e)

(a)和(c)和(d)

(a)和(c)和(e)

(a)和(d)和(e)

(b)和(c)和(d)

(b)和(c)和(e)

(b)和(d)和(e)

(c)和(d)和(e)

具有上述基因产物的组合的遗传修饰微生物是具有例如以下四种基因产物的提高的活性的这类微生物：

(a)和(b)和(c)和(d)

(a)和(b)和(c)和(e)

(a)和(b)和(d)和(e)

(a)和(c)和(d)和(e)

(b)和(c)和(d)和(e)

具有上述基因产物的组合的遗传修饰微生物是具有例如(a)和(b)和(c)和(d)和(e)五种基因产物的提高的活性的这类微生物。

本发明的另一实施方案是使用一个基因产物组(a)至(e)内的若干不同基因，例如在(c)UTP-葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶组中，使用编码SEQ ID NO33的基因和编码SEQ ID NO37的基因。

本发明的及在本发明背景中提到和利用的微生物(后文中称为“本发明背景中的微生物”)优选是本身(即天然地，处于本发明背景中的未修饰状态)能够合成β-葡聚糖聚合物的微生物，该β-葡聚糖聚合物尤其是由β-D-(1-3)-吡喃葡糖基单元的线性主链组成的那些聚合物，其具有(1-6)连接至线性主链的β-D-吡喃葡糖基单元的单一β-D-吡喃葡糖基单元，平均分支度为约0.3。

适合用作本发明的遗传修饰的起始生物的微生物的非限制性实例是以下属的微生物：裂褶菌属(Schizophyllum)，尤其是裂褶菌(Schizophyllum commune)；菌核属(Sclerotium)，尤其是齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)、Sclerotium glucanicum、翠雀小核菌(Sclerotium delphinii)；小盘孔菌属(Porodisculus)，尤其是悬垂小盘孔菌(Porodisculus pendulus)；葡萄孢属(Botrytis)，尤其是灰葡萄孢(Botrytis cinerea)；昆布属(Laminaria)，尤其是昆布属物种(Laminaria sp.)；Lentinula，尤其是Lentinulaedoles；及链核盘菌属(Monilinia)，尤其是果生链核盘菌(Monilinia fructigena)。

优选的微生物是可从公共保藏中心获得的裂褶菌，例如：

DSM-1024、DSM-1025、DSM-1026、DSM-11223；

编号204191、

编号MYA-2104、

编号26890、

编号26892、

编号62873、

编号38229；

编号32746、

编号MYA-4819、

编号52396；

编号MYA-1128、

编号42093、

编号18246；

编号MYA-1124、

编号38230、

编号26889；

编号26262、

编号52398、

编号MYA-1123。

在另一实施方案中，本发明涉及用于产生聚合物的方法，该聚合物由β-D-(1-3)-吡喃葡糖基单元的线性主链组成，该线性主链具有(1-6)连接至线性主链的β-D-吡喃葡糖基单元的单一β-D-吡喃葡糖基单元，平均分支度为约0.3，该方法包括步骤：

(i)在允许遗传修饰微生物产生聚合物的条件下，在培养基中培养能够产生该聚合物的该微生物，该聚合物由β-D-(1-3)-吡喃葡糖基单元的线性主链组成，该线性主链具有(1-6)连接至线性主链的β-D-吡喃葡糖基单元的单一β-D-吡喃葡糖基单元，平均分支度为约0.3，其中与相同菌株的未修饰对照微生物相比，该修饰赋予选自以下的至少两种基因产物的提高的活性：

(a)己糖激酶；

(b)葡糖磷酸变位酶；

(c)UTP-葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶；

(d)1,3-β-葡聚糖合酶；

(e)分支酶；

(ii)可选地从培养基回收该聚合物。

在另一实施方案中，本发明涉及用于通过培养上文公开的任意遗传修饰微生物，来产生上文公开的聚合物的方法。

本发明的遗传修饰微生物可以通过已知的重组DNA技术产生，如描述于例如Sambrook等,Molecular Cloning─A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,Cold Spring Harbor,New York(1989)或Current Protocols in MolecularBiology 1-3卷,John Wiley&Sons,Inc.(1994-1998))中的重组DNA技术。用于构建遗传修饰微生物的其他实例在实验部分中公开。

用于培养微生物的方法如发酵方法为本领域已知，且还在本文中描述和示例(Kumari,Bioresource Technol(2008),99:1036-1043；Reyes,J Natural Studies(2009),7(2),1月-6月)。在本发明的背景中，这类方法允许各微生物生长，并产生本文所描述和示例的希望得到的β-葡聚糖。适宜的培养基可以包括例如Reyes,上文中所述的椰子水。此外，如本领域已知，存在几种尤其适合用于具体微生物的培养基。

例如，同样在本发明的背景中，适合用于培养裂褶菌的培养基包括CYM培养基(每升水25g琼脂(Difco)、20g葡萄糖(Sigma)、2g胰化酪蛋白胨(trypticase peptone,Roth)、2g酵母提取物(Difco)、0.5g MgSO₄x 7H₂O(Roth)、0.5g KH₂PO₄和1g K₂HPO₄(都来自Riedel-de

))(尤其用于固体支持物上的培养)，或也在本文中描述和示例的每升水包含30g葡萄糖(Sigma)、3g酵母提取物(Difco)、1g KH₂PO₄(Riedel-de

)、0.5g MgSO₄x 7H₂O(Roth)的培养基(尤其用于液体培养物)。

在本发明的背景中，术语“平均分支度约0.3”可以指10个β-D-(1-3)-吡喃葡糖基单元中平均约有3个(1-6)连接至单一β-D-吡喃葡糖基单元。在此背景中，术语“约”可以指平均分支度可以在0.1至0.5、优选0.2至0.4、更优选0.25至0.35、更优选0.25至0.33、更优选0.27至0.33、最优选0.3至0.33的范围内。它还可以是0.3或0.33。裂褶菌素、小核菌聚糖、pendulan、cinerian、昆布多糖、蘑菇多糖和pleuran全都具有0.25至0.33之间的平均分支度；例如，小核菌聚糖和裂褶菌素具有0.3至0.33的平均分支度(Survase,上文；Novak,上文)。β-葡聚糖的平均分支度可以通过本领域已知的方法测定，例如通过定期氧化分析、甲基化糖分析和NMR(Brigand,Industrial Gums,Academic Press,New York/USA(1993),461-472)。

在本发明的一个实施方案中，要产生的聚合物选自裂褶菌素、小核菌聚糖、pendulan、cinerian、昆布多糖、蘑菇多糖和pleuran。例如，该聚合物可以是裂褶菌素或小核菌聚糖，尤其是裂褶菌素。

从发酵产物回收聚合物可以通过生物技术中已知的许多常规技术(如沉淀和离心)来进行。

用于制备β-葡聚糖的方法包括培养和发酵能够合成这类生物聚合物的微生物。例如，EP 271 907A2、EP 504 673A1和DE 40 12 238A1公开了制备方法，即通过伴随搅拌和通气分批发酵真菌裂褶菌来实现制备。培养基主要包含葡萄糖、酵母提取物、磷酸二氢钾、硫酸镁和水。EP 271 907A2描述了用于分离多糖的方法，其中首先离心培养物悬液，并用异丙醇从上清沉淀多糖。第二种方法包括加压过滤后超滤所获得的溶液，方法详情未公开。“UdoRau,“Biosynthese,Produktion und Eigenschaften von

Pilz-Glucanen”,Habilitationsschrift,Technical University of Brunswick,1997,70至95页”和"Udo Rau,Biopolymers,Editor A.Steinbüchel,6卷,63至79页,WILEY-VCHPublishers,New York,2002"描述了通过连续或分批发酵制备裂褶菌素。“GITFachzeitung Labor 12/92,1233-1238页”描述了用细胞再循环连续制备分支的β-1,3-葡聚糖。WO03/016545A2公开了用齐整小核菌制备小核菌聚糖的连续方法。

此外，出于经济原因，β-葡聚糖水溶液的浓度应尽可能高，以确保用于将葡聚糖水溶液从生产地点运输至使用地点的运输工作(effect)尽可能少。为了此目的，通常在运输前通过干燥、冷冻干燥和/或沉淀来浓缩β-葡聚糖溶液，以减小其重量。

与对应的未修饰对照微生物相比，本发明的遗传修饰微生物能够产生至少1.5倍、更优选至少多1.8倍、更优选至少多2.0倍和最优选至少多2.2倍的β-葡聚糖聚合物。在此背景中，产生例如“多”1.5倍的β-葡聚糖聚合物可以指，与对应的未修饰对照微生物在相同条件下在相同时间内产生的β-葡聚糖聚合物的量相比，遗传修饰微生物产生的β-葡聚糖聚合物的量高1.5倍。备选地，产生例如“多”1.5倍的β-葡聚糖聚合物可以指，遗传修饰微生物在相同条件下产生与对应的未修饰对照生物相同量的β-葡聚糖聚合物，但快1.5倍。产生的β-葡聚糖聚合物的量可以通过本领域已知且还在本文中描述的方法来测量。

实验部分

实施例1a

克隆葡糖苷酶2表达质粒(pBE_2.1)并转化入裂褶菌

在裂褶菌的基因组中，通过使用BLAST分析鉴定出两个编码假定的葡糖苷酶的基因。在本发明的背景中，证明在裂褶菌中过量表达葡糖苷酶之一(葡糖苷酶2)导致裂褶菌素的产率提高。

产生了两个表达质粒(pBE_2.1)和(pBE_2.2)(具有pBluescript II作为骨架)，其携带细菌选择标记盒(amp^R)、强组成型启动子(Tef1启动子)、葡糖苷酶2基因序列和终止子序列(Tef1终止子)。pBE_2.1携带真菌选择标记ura1，pBE_2.2携带真菌选择标记clonnat。

本文所述的所有多核苷酸序列均源自裂褶菌，用PCR技术分离，通过已建立的微生物学流程(Sambrook,上文；Current Protocols in Molecular Biology,2012年5月9日更新,Print ISSN:1934-3639,在线ISSN:1934-3647)制备。

所有质粒分离均用HiSpeed Maxi Kit(Quiagen/德国)按照厂家说明书进行。为此，在含有50mg/ml氨苄青霉素(Sigma-Aldrich)的Luria-Bertoni(LB)培养基(Sigma-Aldrich)中培养含有最终表达质粒或中间质粒之一的大肠杆菌(Escherichia coli)XL10细胞(Stratagene)。

对于葡糖苷酶2基因(SEQ ID NO:1)的扩增，50μl PCR反应包含25μl PfuMastermix(Stratagene)、22μl H₂O、1μl正向引物BE2_forw(Sto 378,SEQ ID NO:3)和1μl反向引物BE2_rev(Sto380,SEQ ID NO:4)、1μl模板(裂褶菌菌株Lu15523的基因组DNA)。在来自PE Applied Biosystems的Gene

PCR System 9700Thermal Cycler中进行反应。用以下程序进行扩增：至多95℃3分钟的初始加热步骤，然后是95℃变性30秒、58℃30秒退火步骤、72℃2分钟延伸步骤的30个循环，然后是72℃10分钟的一个循环。

对于Tef终止子(SEQ ID NO:5)的扩增，50μl PCR反应包含25μl Pfu Mastermix(Stratagene)、22μl H₂O、1μl正向引物(Sto 379,SEQ ID NO:6)和1μl反向引物BE2_rev(Sto229,SEQ ID NO:7)、1μl模板(裂褶菌菌株Lu15523的基因组DNA)。在来自PE AppliedBiosystems的Gene

在下一个PCR反应步骤中，在50μl PCR反应中进行两种PCR产物Tef1终止子(SEQID NO:5)和葡糖苷酶2基因的融合，该PCR反应包含25μl Pfu Mastermix、21μl H₂O、1μl各引物((Sto229,SEQ ID NO:7)、(Sto378,SEQ ID NO:3))和1μl两种模板。在来自PE AppliedBiosystems的Gene

PCR System 9700Thermal Cycler中进行反应。用以下程序进行两种序列的融合：至多95℃3分钟的初始加热步骤，然后是95℃变性30秒、58℃30秒退火步骤、72℃2.5分钟延伸步骤的30个循环，然后是72℃10分钟的一个循环。

按照厂家说明书用EcoRI和XhoI限制酶(Roche)处理融合PCR的产物，用相同的限制酶线性化已经携带Tef启动子和质粒选择标记的载体(pBluescript 2KSP,StratageneCloning Systems)，随后按照厂家说明书用碱性磷酸酶(Roche)处理。按照厂家说明书用T4DNA连接酶(New England Biolabs,Inc.,Beverly,MA/USA)连接经消化的PCR产物和线性化的载体二者，并转化入大肠杆菌XL10细胞(Stratagene)。

为了用葡糖苷酶2表达质粒(pBE_2.1)转化裂褶菌，按以下进行质粒制备。在含有50mg/ml氨苄青霉素(Sigma-Aldrich)的Luria-Bertoni(LB)培养基(Sigma-Aldrich)中培养含有葡糖苷酶2表达质粒的大肠杆菌XL10细胞，用HiSpeed Maxi Kit(Quiagen)按照厂家说明书进行质粒分离。

为了制备裂褶菌原生质体，将菌株Lu 15527的新鲜培养物接种在含有复合培养基(CYM)的平板上。26℃孵育2-3天，用石蜡膜密封平板。

为了接种液体预培养物(50ml工作体积)，用T 25数字ULTRA-

(IKA)按13500转/分钟浸解来自平板的生物量1分钟，接种在含有液体CYM培养基的摇瓶中，并在30℃、220转/分钟再孵育3天。用15ml预培养物在200ml CYM培养基中接种主培养物，并在30℃、220转/分钟再孵育3天。完成培养物生长后，将主培养物分为四份50ml样品，并离心(4000转/分钟，15分钟)。获得的沉淀用1M MgSO₄(50ml)(Roth)洗涤两次。洗涤后，将四份样品合并，并溶解在50ml 1M MgSO₄中。

为了使得能够裂解细胞壁，将100mg Caylase(Cayla,Toulouse,法国)溶解在1mL1M MgSO₄中，并加至沉淀悬液。样品在轻微震荡(70转/分钟)下30℃过夜孵育。随后，向样品中加入蒸馏水(按1:1比例)，然后在轻微震荡(70转/分钟)下再孵育5分钟。此步骤后，不震荡孵育10分钟，随后离心(1100转/分钟，20分钟，4℃)。用Miracloth膜过滤上清后，加入1体积冷的1M山梨糖醇，然后使样品平衡10分钟。随后，离心样品(2000转/分钟，20分钟，2℃)。通过小心地重悬在1M山梨糖醇中来洗涤沉淀，并重复离心步骤。最后，将原生质体按每毫升10⁸个原生质体的浓度重悬在1M山梨糖醇和50mM CaCl₂中。

用于转化的DNA为环状质粒，在裂褶菌基因组中的整合为异位整合。为了用DNA转化原生质体，轻轻混合100μl原生质体和10μl DNA(5-10μg)，并在冰上孵育60分钟。随后，加入1体积的PEG 4000(40％)，并在冰上孵育样品5至10分钟。加入2.5ml再生培养基(含0,1μg/ml腐草霉素和0.5M MgSO₄的完全培养基)后，30℃、70转/分钟过夜孵育样品。

在PEG介导的转化之后，将再生的原生质体涂布在包含40ml固化基本培养基(每升2g天冬氨酸(Roth)、20g葡萄糖(Sigma)、0.5g MgSO₄(Roth)、0.5g KH₂PO₄、1g K₂HPO₄(都来自Riedel-de

)、120μg盐酸硫胺素(Roth)，pH 6,3，含有1％低熔点琼脂糖(Sigma))的培养皿上。30℃孵育选择平板5天。

实施例1b(104)

克隆葡糖苷酶2表达质粒(pBE_2.2)并转化入裂褶菌

产生了(pBE_2.2)(具有pBluescript II作为骨架)，其携带细菌选择标记盒(amp^R)、强组成型启动子(Tef1启动子)、葡糖苷酶2基因序列(基因组序列)和终止子序列(Tef1终止子)及真菌选择标记clonnat。

基于来自实施例1a的pBE_2.1制备葡糖苷酶2(SEQ ID NO:10)的表达质粒pBE_2.1。

用EcoRI和SpeI从质粒切出Ura标记和Tef启动子，用碱性磷酸酶去磷酸化线性化的骨架。

作为启动子序列tef1(SEQ ID NO:17)的来源；使用与实施例1中相同的PCR产物。

对于Tef终止子(SEQ ID NO:5)的扩增，50μl PCR反应包含25μl Pfu Mastermix(Stratagene)、22μl H₂O、1μl正向引物BE2_forw(Sto 658,SEQ ID NO:12)和1μl反向引物BE2_rev(Sto659,SEQ ID NO:13)、1μl模板(裂褶菌菌株Lu15523的基因组DNA)。在来自PEApplied Biosystems的Gene

用EcoRI和SpeI切割PCR片段，用Rapid Ligation Kit(Roche)与线性化质粒骨架连接，并按厂家说明书转化入大肠杆菌XL10细胞(Stratagene)。

所得到的质粒作为中间克隆构建体。按上文所述从大肠杆菌分离它，并用NotI和SpeI线性化。

对于clonnat抗性盒(SEQ ID NO:14)的扩增，50μl PCR反应包含25μl PfuMastermix(Stratagene)、22μl H₂O、1μl正向引物(Sto 656,SEQ ID NO:15)和1μl反向引物(Sto671,SEQ ID NO:16)、1μl模板DNA。在来自PE Applied Biosystems的Gene

PCRSystem 9700Thermal Cycler中进行反应。用以下程序进行扩增：至多95℃3分钟的初始加热步骤，然后是95℃变性30秒、58℃30秒退火步骤、72℃2分钟延伸步骤的30个循环，然后是72℃10分钟的一个循环。用NotI和SpeI切割所得到的PCR片段，并与线性化质粒连接。

按上文所述进行转化和从大肠杆菌分离。

为了制备裂褶菌原生质体，将新鲜培养物接种在含有复合培养基(CYM)的平板上。26℃孵育2-3天，用石蜡膜密封平板。

为了接种液体预培养物(50ml工作体积)，用T 25数字ULTRA-

(IKA)按13500转/分钟浸解来自平板的生物量1分钟，接种在含有液体CYM培养基的摇瓶中，并在30℃、220转/分钟再孵育3天。用15ml预培养物在200ml CYM培养基中接种主培养物，并在30℃、220转/分钟再孵育4天。完成培养物生长后，用2.5％葡聚糖酶(

GeisenheimAG)在40℃预处理主培养物2h，然后分为四份50ml样品，并离心(4000转/分钟，15分钟)。获得的沉淀用0.9M NaCl洗涤两次，并重悬在0.9M NaCl(50ml)中。

为了使得能够裂解细胞壁，将100mg Caylase(Cayla,Toulouse,法国)加至沉淀悬液。样品在轻微震荡(70转/分钟)下30℃过夜孵育，然后用Miracloth膜过滤。随后，离心样品(2500转/分钟，15分钟)。通过小心地重悬在10ml 0.9M NaCl中来洗涤沉淀，再次离心(2500转/分钟，15分钟)，并重悬在2ml的1M山梨糖醇+50mM CaCl₂中。

DNA作为用于异位整合在裂褶菌基因组中的环状质粒转化。为了用DNA转化原生质体，轻轻混合200μl原生质体和10μl DNA(5-20μg)，并在冰上孵育60分钟。随后，加入1体积的PEG 4000(40％)，并在冰上孵育样品5至10分钟。加入2.5ml再生培养基(含0,1μg/ml腐草霉素和0.8M山梨糖醇的完全培养基)后，30℃、70转/分钟过夜孵育样品。

)、120μg盐酸硫胺素(Roth)，pH 6,3，含有1％低熔点琼脂糖(Sigma))的培养皿上进行尿嘧啶选择。对于Clonnat选择，使用以下平板：2g胰蛋白胨、2g酵母提取物、20g葡萄糖(Sigma)、0.5g MgSO₄(Roth)、0.5g KH₂PO₄、1g K₂HPO₄(都来自Riedel-de

)、100mg/ml Clonnat。30℃孵育选择平板5天。

实施例1c)

克隆葡糖苷酶1表达质粒(pBE_1)并转化入裂褶菌

在裂褶菌的基因组中，通过使用BLAST分析鉴定出两个编码假定的葡糖苷酶的基因。

产生了一个表达质粒(pBE_1)(具有pBluescript II作为骨架)，其携带细菌选择标记盒(amp^R)、强组成型启动子(Tef1启动子)、葡糖苷酶1基因序列(基因组序列，SEQ IDNO:17)和终止子序列(Tef1终止子)及真菌选择标记ura1。

单个元件(Tef1启动子、Tef1终止子和ura1)分离自裂褶菌的基因组DNA，使用PCR技术，通过已建立的微生物学流程(Sambrook,上文；Current Protocols in MolecularBiology,2012年5月9日更新,Print ISSN:1934-3639,在线ISSN:1934-3647)制备。

SEQ ID NO 17所示多核苷酸(Lu15523的葡糖苷酶1基因)分离自裂褶菌菌株Lu15523的基因组DNA，使用PCR技术，按上文所述制备。

所有质粒分离均用HiSpeed Maxi Kit(Quiagen/德国)按照厂家说明书进行。为此，在含有50mg/ml氨苄青霉素(Sigma-Aldrich)的Luria-Bertoni(LB)培养基(Sigma-Aldrich)中培养含有最终表达质粒或中间质粒之一的大肠杆菌XL10细胞(Stratagene)。

对于葡糖苷酶1基因的扩增，50μl PCR反应包含25μl Herculase Mastermix(Stratagene)、22μl H₂O、1μl正向引物(Sto 381,SEQ ID NO:19)和1μl反向引物(Sto348,SEQ ID NO:20)、1μl模板(裂褶菌菌株Lu15523的基因组DNA)。在来自PE AppliedBiosystems的Gene

PCR System9700Thermal Cycler中进行反应。用以下程序进行扩增：至多95℃3分钟的初始加热步骤，然后是95℃变性30秒、58℃30秒退火步骤、72℃2分钟延伸步骤的30个循环，然后是72℃10分钟的一个循环。

对于Tef终止子的扩增，50μl PCR反应包含25μl Pfu Mastermix(Stratagene)、22μl H₂O、1μl正向引物(Sto 393,SEQ ID NO:21)和1μl反向引物(Sto282,SEQ ID NO:22)、1μl模板(裂褶菌菌株Lu15523的基因组DNA)。在来自PE Applied Biosystems的Gene

在下一个PCR反应步骤中，在50μl PCR反应中进行两种PCR产物Tef1终止子和葡糖苷酶1基因的融合，该PCR反应包含25μl Herculase Mastermix、21μl H₂O、1μl各引物(Sto381(SEQ ID NO:23)和Sto 382(SEQ ID NO:22))和1μl两种模板。在来自PE AppliedBiosystems的Gene

按照厂家说明书用EcoRI和KpnI限制酶(Roche)处理融合PCR的产物，用相同的限制酶线性化已经携带Tef启动子和质粒选择标记的载体(pBluescript 2KSP,StratageneCloning Systems)，随后按照厂家说明书用碱性磷酸酶(Roche)处理。按照厂家说明书用T4DNA连接酶(New England Biolabs,Inc.,Beverly,MA/USA)连接经消化的PCR产物和线性化的载体二者，并转化入大肠杆菌XL10细胞(Stratagene)。

为了接种液体预培养物(50ml工作体积)，用T 25数字ULTRA-

用于转化的DNA为环状质粒(pGS_1)，在裂褶菌基因组中的整合为异位整合。为了用DNA转化原生质体，轻轻混合100μl原生质体和10μl DNA(5-10μg)，并在冰上孵育60分钟。随后，加入1体积的PEG 4000(40％)，并在冰上孵育样品5至10分钟。加入2.5ml再生培养基(含0,1μg/ml腐草霉素和0.5M MgSO₄的完全培养基)后，30℃、70转/分钟过夜孵育样品。

实施例1d)

改造的裂褶菌菌株的功能验证

在摇瓶中针对提高的裂褶菌素产生，测试按照上文所述产生的遗传修饰裂褶菌。为了确保结果的可重复性，应用了三步培养，其包括下文进一步描述的两步预培养物和一步主培养物。

对于遗传修饰的裂褶菌菌株的培养，使用了两种不同培养基。对于固体培养基上的培养，使用了CYM培养基(每升H₂O 25g琼脂(Difco)、20g葡萄糖(Sigma)、2g胰化酪蛋白胨(Roth)、2g酵母提取物(Difco)、0.5g MgSO₄x 7H₂O(Roth)、0.5g KH₂PO₄和1g K₂HPO₄(都来自Riedel-de

))。将菌株接种在包含覆盖了赛璐玢(避免菌丝体生长入琼脂)的CYM培养基的琼脂平板上，并在26℃孵育3至4天。

对于液体培养物，使用了以下培养基(后文中称为“标准培养基”)：每升H₂O 30g葡萄糖(Sigma)、3g酵母提取物(Difco)、1g KH₂PO₄(Riedel-de

)、0.5g MgSO₄x 7H₂O(Roth)。

对于预培养物和主培养物二者，使用装有30ml标准培养基的250ml摇瓶。在27℃和225转/分钟进行培养。每次接种前，用T 25数字ULTRA-

(IKA)按13500转/分钟匀浆生物量1分钟。

用50mg湿生物量接种第一预培养物。孵育培养物72小时。72小时后，起始第二预培养物。用于接种的来自第一预培养物的匀浆湿生物量的浓度为250mg。培养时间为45小时。45小时后，用500mg来自第二预培养物的匀浆湿生物量接种主培养物，并再培养45小时。

培养结束后，应用下文所述的标准分析方法来确定培养基中的生物量浓度、裂褶菌素浓度、乙醇浓度和残余葡萄糖。用3g/l Acticide BW20(Thor)稳定化培养物的50ml整分试样。

用HPLC法估计乙醇和葡萄糖浓度。为此，离心14ml培养物(30分钟，8500转/分钟)。上清进行除菌过滤，注入1ml滤液进行HPLC分析(HPLC阳离子交换剂Aminex HPX-87-H(BIO-RAD)，0.5M H₂SO₄(Roth)作为洗脱液，流速0.5ml/分钟，30℃)。

由于裂褶菌素仅由葡萄糖分子组成的事实，可以用标准葡萄糖分析方法进行此聚合物的定量。混合10ml培养物、20ml H₂O和90μl Acticide BW20。用β-葡聚糖酶(0.3ml)

40℃消化样品24小时。孵育后，离心样品(3400g，30分钟)，用HPLC阳离子交换剂(Aminex HPX-87-H,BIO-RAD)以0.5M H₂SO₄(Roth)为洗脱液和按0.5ml/分钟流速在30℃分析上清的葡萄糖和乙醇含量。

对于生物量测定，用50ml H₂O洗涤沉淀形式(离心β-葡聚糖酶消化样品后)的剩余生物量两次，用Whatman滤纸(过滤前先测定滤纸重量)过滤，用H₂O洗涤两次，并在来自Mettler Toledo的HB43S drying scale中干燥。滤纸的干燥在180℃进行5至10分钟。随后，测定干燥滤纸的重量。

摇瓶中获得的结果的评价显示过量表达葡糖苷酶2对裂褶菌素产生的明显作用。由于表达质粒异位整合入基因组且整合位置对靶基因的表达具有明显影响的事实，在摇瓶实验中测试了20个携带质粒(pBE_2.1)的克隆、20个携带质粒(pBE_2.2)的克隆和10个携带质粒(pBE_1)的克隆。表1中显示与未修饰裂褶菌对照菌株相比，遗传修饰菌株中裂褶菌素产生增加。表1中所示的结果涉及所测试的最好菌株。对于菌株的分类，样品中裂褶菌素的量是决定性的。混合10ml培养物、20ml H₂O和90μl Acticide BW20。用0.3mlβ-葡聚糖酶

表1：裂褶菌对照菌株与携带葡糖苷酶表达质粒(pGS_2.1)或(pGS_2.2)的两种遗传修饰裂褶菌菌株的比较。

除遗传修饰裂褶菌菌株中裂褶菌素产生的产率提高外，还观察到副产物乙醇的合成明显减少。这可以指示，上调的葡糖苷酶活性产生的葡萄糖过量率(excess rate)更直接地在裂褶菌素途径中代谢而不是部分用于乙醇合成。

对于葡糖苷酶1过量表达的作用的分析，由于表达质粒异位整合入基因组且整合位置对靶基因的表达具有明显影响的事实，在摇瓶实验中测试了10个携带质粒(pBE_1.1)的克隆。实验按上文所述进行。

摇瓶中获得的结果的评价显示过量表达葡糖苷酶1对裂褶菌素产生无作用。

产物的结构和构象分析

为确保通过遗传修饰裂褶菌菌株合成的聚合物是裂褶菌素，应用XRD和NMR法来确认分子结构如下。

粉末X射线衍射(XRD)允许快速、非破坏性地分析包括多种成分的物质。此外，样品制备容易。来自该测量的结果显示为衍射图，其中衍射强度(I)显示为散射角2θ的函数。可以通过此测量来测定给定物质的结晶性。通常，结晶物质具有一系列尖峰的反射模式，而无定形物质给出宽信号。许多聚合物显示也可通过XRD检测的半结晶行为(Hammond,Thebasics of chrystallography and diffraction,第3版,Oxford UniversityPress2009)。

从水溶液制备样品

将含有裂褶菌素的水溶液倒入乙醇以沉淀裂褶菌素。过滤沉淀并在真空烘箱中干燥。通过XRD测量干燥的样品。

XRD样品测量和结果

裂褶菌素显示三螺旋结构。这从沉淀并干燥的裂褶菌素样品的衍射图(图2)得到证明。三螺旋可以视为5°2θ处的强衍射，物质的无定形区域在20-25°2θ范围内给出宽衍射(Hisamatsu,Carbohydr Res(1997),298:117)。

NMR样品测量和结果

用¹H和¹³C标准脉冲序列在室温或在50℃下在配有¹³C增强低温探头(倒转配置)的Varian VNMRS 600MHz系统上记录NMR光谱。

已知裂褶菌素在水中具有由通过氢键保持在一起的三条β(1-3)-D-葡聚糖链形成的三螺旋结构。由于刚性、有序的构象，此结构在磁场中被屏蔽。这意味着，在NMR光谱中不能获得裂褶菌素的化学位移(Rinaudo,Carbohydr Polym(1982),2:135；Vlachou,Carbohydr Polym(2001),46:349)(2D NMR)。为了考察裂褶菌素的分子结构而不是由三螺旋组成的大分子结构，并进一步以良好的信噪比记录成功的NMR光谱，必须改变三螺旋构象。还已知可通过加入DMSO来改变裂褶菌素的三螺旋以形成无规卷曲结构。在DMSO浓度超过某些阈值(即87％)时，发生构象变化；因此用氘化[D₆]-DMSO作为溶剂进行测量。在进行裂褶菌素的NMR实验时，考虑此构象问题很重要。因此，在[D₆]-DMSO中进行相同的测量，可以获得分辨率良好的光谱(图X)。

鉴定出来自裂褶菌(pBE2.1)和裂褶菌(pBE2_2)菌株的物质的化学结构是裂褶菌素的正确化学结构。此外，该物质显示三螺旋构象。

来自裂褶菌(pBE1.1)的物质的XRD数据显示，此样品不含裂褶菌素的特征性三螺旋。

实施例2

克隆附加的葡糖苷酶2变体、转化入裂褶菌并分析过量表达时对裂褶菌素产生的作用

在葡糖苷酶2基因中，用Quickchange定位诱变试剂盒(Stratagene)产生了具有氨基酸交换的其他基因变体。

这产生了质粒pBE2_3和pBE2_4。pBE2_3的葡糖苷酶基因序列(SEQ ID NO:25)源自菌株Lu 15634的基因组序列。pBE2_4的葡糖苷酶基因序列包含附加的天冬酰胺作为第二氨基酸(SEQ ID NO:27)。

这些质粒将转化入裂褶菌菌株，并将在摇瓶培养物中就其裂褶菌素生产力测试所得到的转化体。

实施例3

克隆葡糖磷酸变位酶基因、转化入裂褶菌并分析过量表达时对裂褶菌素产生的作用

在裂褶菌基因组中，通过使用BLAST分析鉴定出编码假定的葡糖磷酸变位酶的基因。在本发明的背景中，证明了在裂褶菌中过量表达导致裂褶菌素产率提高。

产生了表达质粒(pPGM_1)(具有pBluescript II作为骨架)，其携带细菌选择标记盒(amp^R)、强组成型启动子(GFD(甘油-3-磷酸脱氢酶)启动子)、葡糖磷酸变位酶基因序列和终止子序列(Tef1终止子)及真菌选择标记clonnat。

对于葡糖磷酸变位酶基因序列(SEQ ID NO:28)的扩增，50μl PCR反应包含25μlPWO Mastermix(Roche)、22μl H₂O、1μl正向引物PGM_forw(Sto 687,SEQ ID NO:30)和1μl反向引物PGM_rev(Sto688,SEQ ID NO:31)、1μl模板(裂褶菌菌株Lu15523的基因组DNA)。在来自PE Applied Biosystems的Gene

PCR System 9700Thermal Cycler中进行反应。用以下程序进行扩增：至多95℃5分钟的初始加热步骤，然后是95℃变性30秒、54℃30秒退火步骤、72℃2分钟延伸步骤的30个循环，然后是72℃5分钟的一个循环。

与实施例1b)中所述的表达质粒pBE_2.2的克隆类似地将PGM的基因组序列克隆入最终表达质粒pPGM_1。

改造的裂褶菌菌株的功能验证

按上文所述(实施例1b)将质粒pPGM_1转化入菌株Lu15523。按上文所述(参见实施例1d)在摇瓶中针对提高的裂褶菌素产生测试遗传修饰裂褶菌菌株。

摇瓶中获得的结果的评价显示过量表达PGM对裂褶菌素产生的明显作用。由于表达质粒异位整合入基因组且整合位置对靶基因的表达具有明显影响的事实，在摇瓶实验中测试了最少20个克隆。显示了与未修饰裂褶菌对照菌株相比，所测试的最好的修饰菌株的裂褶菌素产生的增加。

表2：裂褶菌对照菌株与携带葡糖磷酸变位酶表达质粒的遗传修饰裂褶菌菌株的比较。

实施例4

克隆UTP-葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶基因变体、转化入裂褶菌并分析过量表达时对裂褶菌素产生的作用

在裂褶菌基因组中，通过使用BLAST分析鉴定出三个编码假定的UTP-葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的基因(utp1、utp2和utp3)。在本发明的背景中，证明了在裂褶菌中过量表达导致裂褶菌素产率提高。

产生了表达质粒(pUTP_1、pUTP_2、pUTP_3)(具有pBluescript II作为骨架)，其携带细菌选择标记盒(amp^R)、强组成型启动子(GFD(甘油-3-磷酸脱氢酶)启动子)、各utp基因序列和终止子序列(Tef1终止子)及真菌选择标记clonnat。

对于UTP1基因序列(SEQ ID NO:32)的扩增，50μl PCR反应包含25μl PWOMastermix(Roche)、22μl H₂O、1μl正向引物(Sto 126,SEQ ID NO:34)和1μl反向引物(Sto334,SEQ ID NO:35)、1μl模板(裂褶菌菌株Lu15523的基因组DNA)。在来自PE AppliedBiosystems的Gene

PCR System 9700Thermal Cycler中进行反应。用以下程序进行扩增：至多95℃5分钟的初始加热步骤，然后是95℃变性30秒、47℃30秒退火步骤、72℃2分钟延伸步骤的30个循环，然后是72℃10分钟的一个循环。

与实施例1b)中所述的表达质粒pBE_2.2的克隆类似地将UTP1的基因组序列克隆入最终表达质粒pUTP_1。

对于UTP2基因序列(SEQ ID NO:36)的扩增，50μl PCR反应包含25μl PWOMastermix(Roche)、22μl H₂O、1μl正向引物(Sto 124,SEQ ID NO:38)和1μl反向引物(Sto201,SEQ ID NO:39)、1μl模板(裂褶菌菌株Lu15523的基因组DNA)。在来自PE AppliedBiosystems的Gene

PCR System 9700Thermal Cycler中进行反应。用以下程序进行扩增：至多95℃5分钟的初始加热步骤，然后是95℃变性30秒、65℃30秒退火步骤、72℃2分钟延伸步骤的30个循环，然后是72℃5分钟的一个循环。

与实施例1b)中所述的表达质粒pBE_2.2的克隆类似地将UTP2的基因组序列克隆入最终表达质粒pUTP_2。

对于UTP3基因序列(SEQ ID NO:40)的扩增，50μl PCR反应包含25μl PWOMastermix(Roche)、22μl H₂O、1μl正向引物(Sto 781,SEQ ID NO:42)和1μl反向引物(Sto782,SEQ ID NO:43)、1μl模板(裂褶菌菌株Lu15523的基因组DNA)。在来自PE AppliedBiosystems的Gene

与实施例1b)中所述的表达质粒pBE_2.2的克隆类似地将UTP3的基因组序列克隆入最终表达质粒pUTP_3。

在UTP3基因中，用Quickchange定位诱变试剂盒(Stratagene)产生了具有氨基酸交换的其他基因变体。

这产生了质粒pUTP_3.2(UTP3(D2G,E313K))、pUTP_3.3UTP3(D2G,E313K,D212K)和pUTP_3.4(UTP3(D2G,E313K,D212K,E179K)。

改造的裂褶菌菌株的功能验证

按上文所述(实施例1b)将质粒pUTP_1、pUTP_2、pUTP_3.1、pUTP_3.2、pUTP_3.3转化入菌株Lu15523。按上文所述(参见实施例1d)在摇瓶中针对提高的裂褶菌素产生测试遗传修饰裂褶菌菌株。

摇瓶中获得的结果的评价显示过量表达不同UTP基因变体对裂褶菌素产生的明显作用。由于表达质粒异位整合入基因组且整合位置对靶基因的表达具有明显影响的事实，在摇瓶实验中测试了若干个克隆。显示了与未修饰裂褶菌对照菌株相比，所测试的最好的修饰菌株的裂褶菌素产生的增加。

表3：裂褶菌对照菌株与携带UTP-葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶表达质粒的遗传修饰裂褶菌菌株的比较。

Claims

1.用于产生聚合物的方法，所述聚合物由β-D-(1-3)-吡喃葡糖基单元的线性主链组成，所述线性主链具有(1-6)连接至线性主链的β-D-吡喃葡糖基单元的单一β-D-吡喃葡糖基单元，平均分支度为0.3，所述方法包括以下步骤：

(i)在允许遗传修饰微生物产生聚合物的条件下，在培养基中培养能够产生所述聚合物的所述遗传修饰微生物，所述聚合物由β-D-(1-3)-吡喃葡糖基单元的线性主链组成，所述线性主链具有(1-6)连接至线性主链的β-D-吡喃葡糖基单元的单一β-D-吡喃葡糖基单元，平均分支度为0.3，其中与相同菌株的未修饰对照微生物相比，所述遗传修饰微生物具有选自以下的至少两种基因产物的提高的表达：

(a)SEQ ID NO:29的葡糖磷酸变位酶，或来自裂褶菌(Schizophyllumcommune)的与SEQID NO:29至少99％同一的多肽序列且具有至少100％SEQ ID NO:29的多肽的酶活性的多肽序列；

(b)SEQ ID NO:41的UTP-葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶，SEQ ID NO:41的具有D2G、E313K的变体、或来自裂褶菌的与SEQ ID NO:41至少99％同一的多肽序列且具有至少100％SEQID NO:41的多肽的酶活性的多肽序列；

(c)SEQ ID NO:2的分支酶，或来自裂褶菌的与SEQ ID NO:2至少99％同一的多肽序列且具有至少100％SEQ ID NO:2的多肽的酶活性的多肽序列；

(ii)可选地从培养基回收所述聚合物，其中所述微生物是裂褶菌属，且其中聚合物是裂褶菌素。

2.能够产生聚合物的遗传修饰微生物，所述聚合物由β-D-(1-3)-吡喃葡糖基单元的线性主链组成，所述线性主链具有(1-6)连接至线性主链的β-D-吡喃葡糖基单元的单一β-D-吡喃葡糖基单元，平均分支度为0.3，其中与相同菌株的未修饰对照微生物相比，所述遗传修饰微生物具有选自以下的至少两种基因产物的提高的表达：

(a)SEQ ID NO:29的葡糖磷酸变位酶，或来自裂褶菌的与SEQ ID NO:29至少99％同一的多肽序列且具有至少100％SEQ ID NO:29的多肽的酶活性的多肽序列；

(c)SEQ ID NO:2的分支酶，或来自裂褶菌的与SEQ ID NO:2至少99％同一的多肽序列且具有至少100％SEQ ID NO:2的多肽的酶活性的多肽序列

其中所述微生物是裂褶菌属，且其中聚合物是裂褶菌素。