CN103805642B

CN103805642B - 一种生产长链二元酸的发酵方法

Info

Publication number: CN103805642B
Application number: CN201210439799.5A
Authority: CN
Inventors: 张霖; 师文静; 廖莎; 李晓姝; 王领民
Original assignee: China Petroleum and Chemical Corp; Sinopec Fushun Research Institute of Petroleum and Petrochemicals
Current assignee: China Petroleum and Chemical Corp; Sinopec Fushun Research Institute of Petroleum and Petrochemicals
Priority date: 2012-11-07
Filing date: 2012-11-07
Publication date: 2015-09-02
Anticipated expiration: 2032-11-07
Also published as: CN103805642A

Abstract

本发明公开了一种生产长链二元酸的发酵方法，该方法包括以下内容：将二元酸菌种扩大培养获得种子液，利用种子液对正构烷烃进行发酵产酸，发酵过程中以甘油作为消泡剂，调整体系pH值，并补加正构烷烃，发酵结束后除去菌体蛋白，分离回收获得长链二元酸产品。该方法通过加入适宜的消泡剂，提高了发酵的效率和二元酸产品的质量。

Description

一种生产长链二元酸的发酵方法

技术领域

本发明属于生物化工领域，主要涉及一种生产长链二元酸的发酵方法。

背景技术

长链二元酸（Long chain dicarboxylic acids）是指碳链中含有10个以上碳原子的脂肪族二羧酸（简称DCn），包括饱和及不饱和二羧酸，是一类有广泛工业用途的精细化工产品。在化学工业中，长链二元酸是合成高级香料、高性能尼龙工程塑料、高档尼龙热熔胶、高温电介质、高级油漆和涂料、高级润滑油、耐寒性增塑剂、树脂、医药和农药等的重要原料。

目前长链二元酸主要通过微生物发酵法生产，利用微生物特有的氧化能力和微生物胞内酶的作用，在常温常压下分别通过α、ω-氧化，将长链正构烷烃两端的甲基氧化成为羧基，生成相应链长的长链二元酸。

长链二元酸发酵体系属于典型的气相（空气）—水相（发酵液）—油相（烷烃）—固相（菌体）四相体系，在发酵过程中通常采用机械搅拌和底部通气等方式保持四相体系的均一性。发酵法生产长链二元酸通常采用能利用石油烃类的细菌、霉菌、放线菌以及酵母菌作为发酵菌种，由于微生物代谢反应的复杂性，发酵过程中多元有机酸类副反应产物、菌体蛋白成分较多，从而使发酵体系中起泡现象比较严重，控制不当会出现“喷罐”事故。现阶段长链二元酸的发酵一般采用阶段性提升pH值的诱导产酸模式，由于每次加碱量较多，会在短时间内形成大量的脂肪酸皂等起泡物质，加剧了发酵体系中的起泡现象，增加了“喷罐”的风险。

为了保证长链二元酸发酵过程中发酵体系的稳定性，通常会在发酵体系中加入消泡剂。CN1570124A公开了一种正长链二元酸的生产方法，该方法在发酵培养基中添加了0.005%的消泡剂。CN102115769A公开了一种利用微生物发酵正十八烷和硬脂酸甲酯生产十八碳二元酸的方法，该方法在发酵培养基中添加了400～1000ppm的消泡剂。CN102115768A公开了一种利用微生物同步发酵正十六烷烃高产十六碳二元酸的方法，该方法在发酵培养基中添加了400ppm的消泡剂。

现阶段使用的消泡剂多为聚醚类有机物质，该类消泡剂的加入，一方面会减缓微生物生物量的积累以及微生物活性，实验表明，400～1000ppm的添加量会使种子培养期的生物量降低10%～20%；另一方面会延长发酵周期，影响发酵水平。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种生产长链二元酸的发酵方法。该方法通过加入适宜的消泡剂，提高了发酵的效率和二元酸产品的质量。

本发明生产长链二元酸的发酵方法，包括以下内容：将二元酸菌种扩大培养获得种子液，利用种子液对正构烷烃进行发酵产酸，发酵过程中以甘油作为消泡剂，调整体系pH值，并补加正构烷烃，发酵结束后除去菌体蛋白，分离回收获得长链二元酸产品。

本发明方法中，所述的二元酸菌种选自能利用正烷烃生长的微生物或具有完整α、ω-氧化途径的微生物，优选假丝酵母属、隐球酵母属、内孢霉属、汉逊氏酵母属、毕赤氏酵母属、红酵母属、球拟酵母属或丝孢酵母属等。

本发明方法中，所述的扩大培养，按照7～15倍进行扩大，优选9~12倍扩大培养。

本发明方法中，基本培养基各组分含量如下：蔗糖20～50 g/L，玉米浆1～3g/L，酵母膏1～2g/L，氯化钠0.5～1.5g/L，磷酸二氢钾3～8g/L，硫酸镁1～2g/L，尿素1～5g/L。

本发明方法中，所得的种子液的菌浓为5～15g/L（以细胞干重计），优选6～10g/L。

本发明方法中，发酵条件为：搅拌转速为100～700rpm，通气量为0.6～1.0VVM，发酵温度为29～32℃，发酵时间为138～144小时。

本发明方法中，所述的调整pH值的方式为：发酵开始，控制体系pH值为4～5，15～24小时后，将体系pH值调至6.8～7.2，然后每间隔20～24小时，提高一次pH值，每次提高0.1~0.5，直至发酵结束。

本发明方法中，采用碱液调整体系pH值，所用的碱为氢氧化钠、氢氧化钾、氨水或尿素中的一种或多种，优选氢氧化钠。

本发明方法中，每次调整pH值之前加入甘油，每次加入体积为发酵总体积的0.05%～1%。

本发明方法中，每次调整pH值之后加入烷烃，每次加入体积为发酵总体积的3%～12%。

本发明方法中，所述正构烷烃为碳链中含有10～16个碳原子的烷烃。

本发明方法与现有技术相比，具有如下优点：甘油的加入，可以有效缓解起泡问题，同时甘油不会抑制菌体的正常代谢，随着发酵反应的进行，体系内的甘油也会被发酵菌株利用，进入氧化代谢途径，促进菌体生长，进一步提高产酸水平。另外，甘油不会在发酵体系内过多残留，从而不会对产品提纯精制工艺产生影响。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明发法的具体过程及效果进行说明，但不局限于以下实施例。

本实施例中选用热带假丝酵母（Candida tropicalis）突变株PF-UV-56作为发酵菌株进行长链烷烃发酵生产长链二元酸实验，该突变株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.0356。

实施例1

（1）培养基配制：蔗糖30g/L、玉米浆1g/L、酵母膏1g/L、氯化钠1g/L、磷酸二氢钾5g/L、硫酸镁1g/L、尿素2g/L。

（2）发酵种子液培养：将斜面保藏菌种接种于3000mL摇瓶进行菌种活化培养，活化培养液体积为500mL，培养温度为32℃，摇床转数为120rpm，培养48小时；

（3）二元酸发酵：将活化的菌种种子液1000mL加入6500mL发酵培养基中，并添加500mL十二碳烷烃。发酵过程中以氢氧化钠溶液（30wt%）进行pH调节。初始pH值设为4.3，搅拌转数为600rpm，通气设置为7000mL/min。24小时加入40mL甘油，随后将pH值调至7.2，并添加1000mL十二碳烷烃。于48小时、72小时分别将pH值上调0.2，并添加500mL十二碳烷烃，于96小时、120小时将pH值上调0.2，直至144小时反应结束。48小时、72小时、96小时、120小时上调pH值前，需分别添加20mL甘油。最终发酵体系中十二碳二元酸浓度为143.6g/L。发酵过程正常，液位稳定，发酵液面无明显泡沫积累。

实施例2

（1）培养基配制：蔗糖40 g/L、玉米浆1.5 g/L、酵母膏1.5g/L、氯化钠1g/L、磷酸二氢钾4g/L、硫酸镁1g/L、尿素2g/L。

（2）发酵种子液培养：将斜面保藏菌种接种于3000mL摇瓶进行菌种活化培养，活化培养液体积为500mL，培养温度为32℃，摇床转数为120rpm，培养48小时。

（3）二元酸发酵：将活化的菌种种子液1000mL加入6450mL发酵培养基中，并添加550mL十三碳烷烃。发酵过程中以氢氧化钠溶液（10wt%）进行pH调节。初始pH值设为4.5，搅拌转数为700rpm，通气设置为8000mL/min。24小时加入100mL甘油，随后将pH值调至7.2，并添加1100mL十三碳烷烃。于48小时、72小时分别将pH值上调0.2，并添加550mL十三碳烷烃，于96小时、120小时将pH值上调0.2，直至144小时反应结束。48小时、72小时、96小时、120小时上调pH值前，需分别添加30mL甘油。最终发酵发酵体系中十三碳二元酸浓度为130.2g/L。发酵过程正常，液位稳定，发酵液面无明显泡沫积累。

实施例3

（1）培养基配制：蔗糖50g/L、玉米浆3g/L、酵母膏2g/L、氯化钠1.5 g/L、磷酸二氢钾8g/L、硫酸镁2g/L、尿素5g/L。

（2）发酵种子液培养：将斜面保藏菌种接种于5000mL摇瓶进行菌种活化培养，活化培养液体积为900mL，培养温度为32℃，摇床转数为180rpm，培养48小时。

（3）二元酸发酵：将活化的菌种种子液1000mL加入5400mL发酵培养基中，并添加500mL十六碳烷烃。发酵过程中氢氧化钠溶液（10wt%）进行pH调节。初始pH值为4.3，搅拌转数为700 rpm，通气设置为7000mL/min；24小时加入60mL甘油，随后将pH值调至7.2，并添加1000mL十六碳烷烃。于48小时、72小时分别将pH值上调0.2，并添加500mL十六碳烷烃，于96小时、120小时分别将pH值上调0.2，直至144小时反应结束。48小时、72小时、96小时、120小时上调pH前，需分别添加20mL甘油。最终发酵体系中十六碳二元酸浓度为116.6g/L。发酵过程正常，液位稳定，发酵液面无明显泡沫积累。

比较例1

（1）培养基配制：蔗糖3%、玉米浆0.1%、酵母膏0.1%、氯化钠0.1%、磷酸二氢钾0.5%、硫酸镁0.1%、尿素 0.2%、消泡剂0.03%。

（2）发酵种子液培养：与实施例1步骤（2）完全相同。

（3）二元酸发酵：发酵配比、调控方式与实施例1步骤（3）相同，但过程中各阶段调整pH值前，不加入甘油。最终发酵体系中十二碳二元酸浓度为120.3g/L。在进行pH调节及补加烷烃过程中，出现明显的泡沫积累，发酵体积瞬时膨胀，液位增长较快。

Claims

1.一种生产长链二元酸的发酵方法，其特征在于包括以下内容：将二元酸菌种扩大培养获得种子液，利用种子液对正构烷烃进行发酵产酸，发酵过程中以甘油作为消泡剂，调整体系pH值，并补加正构烷烃，发酵结束后除去菌体蛋白，分离回收获得长链二元酸产品；所述的调整体系pH值的方式为：发酵开始，控制体系pH值为4～5，15～24小时后，将体系pH值调至6.8～7.2，然后每间隔20～24小时，提高一次pH值，每次提高0.1~0.5，直至发酵结束；每次调整pH值之前加入甘油，每次加入体积为发酵总体积的0.05%～1%。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的二元酸菌种选自能利用正烷烃生长的微生物或具有完整α、ω-氧化途径的微生物。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述的二元酸菌种选自假丝酵母属、隐球酵母属、内孢霉属、汉逊氏酵母属、毕赤氏酵母属、红酵母属、球拟酵母属或丝孢酵母属。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的扩大培养，按照7～15倍进行扩大培养。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：二元酸菌种扩大培养使用的基本培养基各组分含量如下：蔗糖20～50 g/L，玉米浆1～3g/L，酵母膏1～2g/L，氯化钠0.5～1.5g/L，磷酸二氢钾3～8g/L，硫酸镁1～2g/L，尿素1～5g/L。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所得的种子液的菌浓为5～15g/L，以细胞干重计。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：发酵条件为：搅拌转速为100～700rpm，通气量为0.6～1VVM，发酵温度为29～32℃，发酵时间为138～144小时。

8.根据权利要求1或7所述的方法，其特征在于：采用碱液调整体系pH值。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所用的碱为氢氧化钠、氢氧化钾、氨水或尿素中的一种或多种。

10.根据权利要求1或7所述的方法，其特征在于：每次调整pH值之后加入正构烷烃，每次加入体积为发酵总体积的3%～12%。

11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述正构烷烃为碳链中含有10～16个碳原子的烷烃。