CN105358701A - 溶剂生产 - Google Patents
溶剂生产 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105358701A CN105358701A CN201480036838.4A CN201480036838A CN105358701A CN 105358701 A CN105358701 A CN 105358701A CN 201480036838 A CN201480036838 A CN 201480036838A CN 105358701 A CN105358701 A CN 105358701A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- solvent
- culture vessel
- cell
- clostridium
- nutrient medium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
- C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
- C12P7/16—Butanols
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
- C09K3/00—Materials not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
- C12M1/12—Apparatus for enzymology or microbiology with sterilisation, filtration or dialysis means
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M21/00—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses
- C12M21/12—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses for producing fuels or solvents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
- C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
- C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
- C12P7/065—Ethanol, i.e. non-beverage with microorganisms other than yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/24—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group
- C12P7/26—Ketones
- C12P7/28—Acetone-containing products
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/145—Clostridium
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
本发明涉及一种用于在单阶段工艺中使用单相产溶剂梭菌生产溶剂的工艺和系统。更具体而言,所述工艺和系统涉及使用培养容器来培养单相产溶剂梭菌,其中,通过增加控制量的培养基和/或去除控制量的溶剂,监控和优化所述梭菌的细胞生长。所述工艺和系统尤其可用于生产丁醇、丙酮以及乙醇等溶剂。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于在单阶段工艺中使用单相产溶剂梭菌(solventogenicclostridia)生产溶剂的工艺和系统。更具体而言,所述工艺和系统涉及使用培养容器来培养单相产溶剂梭菌,其中,通过增加控制量的培养基和/或去除控制量的溶剂,监控和优化所述梭菌的细胞生长。所述工艺和系统尤其可用于生产丁醇、丙酮以及乙醇等溶剂。
背景技术
丁醇发酵工艺使用基于可再生生物基原料,并且通常称为在其主要化学产品之后的丙酮、丁醇以及乙醇(ABE)发酵。发酵于1916年在英国首先商业化,并且于第一次和第二次世界大战期间在全球传播,主要用于生产军需品的丙酮和涂料漆的丁醇。在20世纪50年代努力在成本上与石油衍生的等同物竞争时,该工艺在美国和欧洲失宠,但是在中国、俄罗斯以及南非依然存在,直到20世纪80年代。如今,由于更高的油价、对石油供应的关注以及对温室气体(GHG)排放的环境关注,所以ABE发酵可能再次商业化。具有更廉价、更具可持续性以及环保的化学品的发酵路线,具有代替石油衍生的丁醇、丙酮以及氢气的可能。实际上,在中国投资新工厂,刺激了对生物丁醇的全球需求。迄今为止,投入了超过$200m,产生了0.3Mt/yr装机溶剂容量,计划扩大为1Mt/yr。
几十年来,实践了用于发酵糖蜜和/或淀粉的传统的批式工艺(batchprocesses),以生产ABE(Jones,D.T.andWoods,D.R.(1986)Microbiol.Rev.50:484-524)。通常,批式发酵在72个小时内产生约18g/L溶剂。发酵时间比较长,因为其在两个不同的阶段(双相)中发生:第一相是造成产生酸和pH降低的生长阶段;第二阶段是生存阶段,在该阶段,酸再次吸入溶剂内,以中和pH。细胞也准备用于孢子形成。在新陈代谢内的切换(switchinmetabolism)由在发酵液内的酸浓度和/或pH的降低触发。与酵母乙醇发酵相比,最终的溶剂滴定度较低,并且这造成低体积生产力(18/72,其等于约0.25g溶剂/L/hr)。溶剂滴定度由可以发酵的较低量的糖限制。低溶剂生产力是传统批式工艺的主要缺点,并且进行了多次尝试,来克服这个限制。已经开发了对批式培养工艺的改进,包括尝试提高溶剂滴定度或者减少发酵时间的分批补料工艺,但收效甚微。
由于通过批式发酵获得的低生产力,所以提出了单阶段连续工艺(例如,JonesandWoods(1986),supra),其目的在于提供供料培养基(feedmedia)的连续流,以便长达在几周的时间内实现接近最大生长率的生长率,从而提供改进的溶剂生产率以及减少的停机时间。然而,实际上,这难以通过双相产溶剂梭菌实现,这是因为溶剂生产不与生长直接链接,并且培养物通过较低的稀释率洗掉。在实验室规模演示了使用细胞循环和/或固定以便从而在反应器内保持高细胞浓度的方法,但是这些方法难以在商业规模上实现(例如,e.g.Qureshi&Maddox(1987),Enz.Microb.Technol.9(11),668-67;Maddox(1989)Gen.Eng.Rev.,7,189-220;Maddoxetal.(1993)In:Theclostridiaandbiotechnology,(eds)D.R.Woods,Butterworth-Heinemann,Boston.343-369;Gapesetal.(1996)Appl.Env.Microbiol.62:3210-3219)。
已经提出了基于双阶段或多阶段容器的其他连续配置,从而试图分离和控制双相发酵,但是由于难以控制流速和相应的稀释率以尽可能增大溶剂生产力,所以尚无成功的例子(见下文)。产酸和产溶剂细胞(acidogenicandsolventogeniccells)的混合的细胞群体在第一和第二阶段快速增强,在生长和溶剂形成中提供振荡。对于游离细胞悬液,如果不控制流速,那么这通常造成培养物洗掉(如果生长减速)或者在低流速表现次佳。此外,培养物往往快速退化,失去产生溶剂的能力(WoolleyandNorris(1990)J.Appl.Bacteriol.69:718-728;JonesandWoods,(1986)supra;KashketandCao(1995),FEMSMicrobiol.Rev.,17,307-315;Afschar(1990)DE3905624A1)。Afschar(1990)提出了用于生产丁醇和丙酮的双阶段糖蜜发酵工艺,该工艺的特征在于在第一阶段使用具有底物限制的恒化器,以产生细胞。Mutschlechner等人(J.Mol.Microbiol.Biotechnol.(2000)2(1):101-105)也提出了梭菌的双阶段连续培养。在这个工艺中,系统设计为模仿批式培养物生长的两个阶段(通过使用第一阶段以便尽可能快速地产酸地(acidogenically)生长细胞,然后,在“酸转折点(acidbreakpoint)”上将细胞转移给第二阶段。第二容器更大,以提供充足的驻留时间,来完成溶剂生产。在这两个实例中,进入第一和第二阶段的流速保持恒定,并且不响应于任何生长相关的信号(例如,pH或细胞密度的变化)来调节。
也描述了双阶段连续培养,使用固定化生物体或细胞滞留(例如,Maddoxetal.(1993),supra;Gapesetal.(1996),supra)。这些作者使用固定的稀释率,并且描述了固定方法,以在反应器内保持微生物,并且防止洗掉微生物。这些培养可以通过高稀释率和生产力运行,但是相对于具有成本效益的回收,最终的溶剂浓度往往太低。而且,在这两个实例中,溶剂滴定度和生产力广泛地振荡。固定的主要缺点是昂贵并且难以规模化。由于支持基质(supportmatrices)的堵塞以及污染,所以长时间和/或使用具有微粒的原料的操作具有问题。此外,这些系统易于污染并且难以保持无菌。
后续发酵工艺在中国也商业化了,其中,利用链接在一起的8个发酵罐,连续或循序批式工艺得到使用。前两个容器(容器1和2)是生物质发生器(biomassgenerator),并且每24个小时连续再次播种新鲜的培养物(通过传统的种子培养)。一旦播种,生物质发生器就连续供有底物(原料),在装满时,液体流向前进入(平行工作的)容器3和4。然后,这两个容器供料(feed)发酵培养的剩余部分(restofthefermentationtrain),该发酵培养由一系列依次连接的容器(通常是4个)构成,在这8个发酵容器内提供72h的总工艺驻留时间。这个复杂的工艺围绕与丙酮丁醇梭杆菌相关联的双相性质(&限制)而设计,这通常需要连续反复播种,以避免微生物退化(由于溶剂质粒的损失)。这个工艺通过手动控制,对工艺波动快速作出反应的范围很小。在Ni&Sun(2009),Appl.Microbiol.Biotechnol.,83,415–423中描述了连续的中国工艺。
迄今为止,开发了发酵工艺技术,用于双相溶剂生产梭菌。新陈代谢的特征在于快速生长和酸的形成以及然后的过渡(在该过渡期间,生长减速,重新吸收酸,并且溶剂生产开始)。这造成较长的发酵时间。
然而,依然需要提供一种工艺,该工艺提供溶剂的早发、更短的发酵时间以及连续的或更长的溶剂生产(如果连续供料)用于超过50个小时的周期。
发明内容
因此,本发明的一个目的在于,提供分批补料式或连续发酵工艺,该工艺可选地整合溶剂去除和细胞以及水循环操作,并且在超过50个小时的周期内能够保持高溶剂生产率。发明人发现,这种集成系统可以用于在更长的时间段内以最小的底物抑制以及以高产率将高浓度糖或其他碳原料转换成溶剂(丙酮、丁醇以及乙醇),。
本发明基于以下惊人的发现:某些产溶剂梭菌实际上不是双相的;而是单相的。在批式发酵中,单相溶剂生产的特征在于同时生长和溶剂生产,在主要生长阶段,没有明显从酸到溶剂生产的新陈代谢的的切换或者变化。实际上,酸和溶剂同时生产,并且酸不易于在培养基内累积。在这些梭菌中,不需要在生产溶剂之前等待第二阶段。对于这种梭菌,可以在单个容器内发生生长和溶剂生产。通过监控细胞生长或与生长相关的特征(例如,气体的生产、糖利用或酸的生产)并且优化细胞生长的条件,可以控制溶剂生产,从而获得高细胞密度和溶剂滴定度。这种方法与先前的方法形成对比,其中,已经优化了培养条件,用于在产酸阶段中的生长或者在产溶剂的第二阶段中的溶剂生产。
在图2和图3中显示了单相和双相产溶剂梭菌的批式发酵的概况。
在一个实施方式中,因此,本发明提供了一种用于生产溶剂的单阶段工艺,所述工艺包括以下步骤:
(a)在培养容器内的液体培养基内培养单相产溶剂梭菌细胞;
(b)监控所述单相产溶剂梭菌细胞在所述培养容器内的细胞生长;
(c)将新鲜的培养基和/或营养素连续地或者半连续地引入所述培养容器内;
(d)从所述培养容器连续地或者半连续地去除包括溶剂的液体培养基的流或部分,并且将所述液体培养基传送至溶剂去除器;
(e)在所述培养容器内保持或增大细胞密度;
其中,通过控制如下因素来调节和/或优化在所述培养容器内的细胞生长:
(i)引入所述培养容器内的新鲜的培养基或营养素的量或速率;和/或
(ii)从所述培养容器中去除的,包括溶剂的液体培养基的量或速率。
优选地,所述单相梭菌:
i)在批式发酵的主要生长阶段,自然地显示同时生长和溶剂生产;
ii)在生长期间,已经在化学上突变以生产溶剂;或者
iii)在生长期间,已经被遗传修饰以生产溶剂。
优选地,所述梭菌是单相糖丁酸梭状芽胞杆菌(C.saccharoperbutylacetonicum)。
最优选地,所述梭菌是单相糖丁酸梭状芽胞杆菌N1菌株,例如N1-4(HMT)或N1-504。
优选地,步骤(b)包括通过以下步骤中的一个或多个监控细胞生长:
(i)监控一个或多个气体(例如,氢气和/或CO2)的生产;
(ii)监控一个或多个酸类的生产;
(iii)监控所述培养基的pH;
(iv)监控糖的使用;
(v)监控细胞密度;以及
(vi)监控一个或多个溶剂的生产。
优选地,步骤(d)包括从所述培养容器中连续地或者半连续地去除所述液体培养基的流或部分,并且通过细胞分离器将所述流/部分传送至溶剂去除器,其中:
(i)在所述细胞分离器中从所述液体培养基中去除细胞,并且所述细胞返回所述培养容器(可选地经由细胞接种器);和/或
(ii)其中,在所述溶剂去除器中从所述液体培养基中去除溶剂,并且残余的液体培养基返回所述培养容器。
优选地,通过以下步骤在所述培养容器内保持或增大所述细胞密度:
(i)将从包括溶剂的液体培养基中去除的细胞循环回所述培养容器;和/或
(ii)连续地或半连续地将细胞从细胞播放机中供料到所述培养容器内;和/或
(iii)在所述培养容器内固定所述细胞的一些或全部。
本发明的工艺可通过任何合适的方式操作。例如,可作为分批补料式工艺或者任何形式的连续工艺或灌注工艺操作;或者作为这些类型的工艺的混合操作。
在一些实施方式中,工艺在分批补料模式中操作。在这个实施方式中,在期望的生长条件下以批式模式培养微生物适当的时间,例如,大约20个小时,直到消耗大约一半的糖(例如,25-30g/L)。微生物的细胞繁殖并且生产酸和溶剂。该工艺的第一分批阶段的初始体积应优选地为在容器内的总工作容量的约70%(例如,65%-75%)并且包含足够的糖(例如,55-65g/L)和营养素,以维持生长和良好的溶剂产量(例如,大约0.3g溶剂/g糖)。向发酵罐提供料浓糖溶液和营养素,所述浓糖溶液和营养素的体积等于培养容器的工作容量的约30%(例如,25%-35%),并且以设计的速率进行供料以便持续有限数量的小时(例如,在10-75个小时之间)的速率供料。所述微生物在适合于最佳生长并且生产溶剂的条件下(例如,温度、pH、氧化还原剂)保持。
本发明的工艺优选地在连续培养条件下操作。正如本文中所使用的,术语“连续培养条件”表示一种工艺,其中,在培养容器内的微生物的培养能够通过原料(营养素)连续的或者基本上连续的流保持在稳态条件(由高的糖吸收率和溶剂生产率限定)长达更长的时间段(例如,>75个小时)。在这种情况下,需要一些血来在培养容器内保持恒定的体积。
产溶剂梭菌是能够生产丙酮、丁醇以及乙醇等溶剂的细菌。通常,在双相发酵中,首先产生酸,然后,酸再次吸入溶剂内。
本发明的工艺是单阶段工艺。正如在本文中使用的,术语“单阶段”表示在相同的培养容器内共同产生酸和溶剂。这可以与双阶段工艺形成对比,其中,(双阶段工艺)在第一生长阶段产生酸,随后在第二阶段产生溶剂,通常在两个培养容器中执行。
在大部分产溶剂梭菌(例如,丙酮丁醇梭菌)中,发酵是双相:第一阶段的特征在于细胞生长、酸生产以及培养的pH下降;在第二阶段中,酸转换成溶剂,并且培养的pH增大。在新陈代谢内的切换由在发酵液内的酸浓度和/或低培养pH值触发。
然而,本发明涉及单相梭菌。正如在本文中使用的,术语“单相梭菌”表示梭菌没有不同的酸和溶剂生产阶段。单相溶剂生产的特征在于同时的生长和溶剂生产;新陈代谢中没有明显的切换或者变化。酸不易于在培养基内累积。
优选地,微生物是单相产溶剂梭菌。
优选地,微生物是双相梭菌,所述双相梭菌已经通过化学突变或特定的遗传修饰或这两者的组合转换以显示单相发酵。
更优选地,微生物自然显示单相新陈代谢,无需改造。
更优选地,梭菌是单相糖丁酸梭状芽胞杆菌(Clostridiumsaccharoperbutylacetonicum)。
更优选地,梭菌是单相糖丁酸梭状芽胞杆菌N1菌株,例如,N1-4(HMT)或N1-504、或其变体或衍生物。这种变体/衍生物也是单相产溶剂梭菌。优选地,在相同的条件下,与获得变体/衍生物的梭菌相比,变体/衍生物产生相同或更多的丙酮、乙醇和/或丁醇。
例如,这种变体可通过随机突变或者通过重组方法产生。重组方法包括通过使用II型内含子(例如,Targetron(Sigma)和Clostron(例如,WO2007/148091)插入失活基因,并且通过使用‘等位基因耦合交换’(ACE,例如,WO2009/101400)整合新基因。也可以使用随机突变,如前面所示的用于生成更耐乙酸的菌株(Yang,S.,Land,M.L.,Klingeman,D.M.,Pelletier,D.A.,Lu,T.Y.,Martin,S.L.,Guo,H.B.,Smith,J.C.,&Brown,S.D.(2010).ParadigmforindustrialstrainimprovementidentifiessodiumacetatetolerancelociinZymomonasmobilisandSaccharomycescerevisiae.ProcNatlAcadSciUSA.,107(23),10395-400.2010.),用于生成更耐乙醇的菌株(Shao,X.,Raman,B.,Zhu,M.,Mielenz,J.R.,Brown,S.D.,Guss,A.M.,&Lynd,L.R.(2011).Mutantselectionandphenotypicandgeneticcharacterizationofethanol-tolerantstrainsofClostridiumthermocellum.ApplMicrobiolBiotechnol.92(3),641-52.2011.以及:Brown,S.D.,Guss,A.M.,Karpinets,T.V.,Parks,J.M.,Smolin,N.,Yang,S.,Land,M.L.,Klingeman,D.M.,Bhandiwad,A.,Rodriquez,M.Jr.,Raman,B.,Shao,X.,Mielenz,J.R.,Smith,J.C.,Keller,M.,&Lynd,L.R.(2011).MutantalcoholdehydrogenaseleadstoimprovedethanoltoleranceinClostridiumthermocellum.ProcNatlAcadSciUSA.,108(33),13752-7.2011.),并且用于生成更加使淀粉分解的菌株(Annous,B.A.,&Blaschek,H.P.(1991).IsolationandcharacterizationofClostridiumacetobutylicummutantswithenhancedamylolyticactivity.Appl.Environ.Microbiol.,57(9),2544-8.1991.)。
通过在小规模发酵中筛选变体,可测试这种变体,即寻找变体,所述变体保持单相性能,并且在相同的条件下与获得所述变体的梭菌相比,产生相同或更多的丙酮、乙醇和/或丁醇。
可从ATCC存放号27021中获得糖丁酸梭状芽胞杆菌N1菌N1-4(HMT)。可从ATCC存放号27022中获得糖丁酸梭状芽胞杆菌N1-504。
在本发明的一些实施方式中,梭菌并非糖丁酸梭状芽胞杆菌N1菌N1-4。糖丁酸梭状芽胞杆菌N1菌N1-4先前可用于作为ATCC存放号13564。然而,这个存放不再可用。
术语“酸产生”或“产酸”表示梭菌将基于糖和/或淀粉的底物转换成RCOOH(其中,R如下所定义)的能力,例如,转换成乙酸和/或丁酸。
术语“溶剂产生”或“产溶剂”表示梭菌将基于糖和/或淀粉的底物转换成溶剂的能力,优选地转换成丙酮、乙醇和/或丁醇中的一个或多个。
在本文中使用的术语“一个溶剂”或“多个溶剂”表示低沸点有机溶剂或其共沸混合物,其能够在液体发酵培养基中由产溶剂微生物产生。这种溶剂的实例包括公式R-OH的醇类,其中,R是脂肪族C1-C8烷基或脂肪族C2-C8烯基。R族可能是分支或线性,优选地是线性。R族可能饱和或不饱和,优选地饱和。
公式R-OH的醇类的优选实例包括甲醇、乙醇、2-甲基-丙醇-1-醇、1,3-丙二醇、1-丁醇、2-丁醇、2-甲基丙醇-2-醇、戊醇、己醇、庚醇以及辛醇。溶剂的进一步实例具有公式R-CO,包括丙酮((CH3)2CO)。
优选地,溶剂包括ABE溶剂(即丙酮)、1-丁醇以及乙醇。最优选地,溶剂包括1-丁醇或基本上1-丁醇。
梭菌可能是需氧或厌氧微生物,优选地是厌氧或耐氧的梭菌,最优选地是耐氧梭菌。
在一些实施方式中,培养容器可接种而无需采取特别的预防措施来排除氧气或者无需厌氧净化。而且,培养容器可通过培养基上方的顶部空间内的(正常大气成分的)空气操作。
在本发明的一些实施方式中,在非无氧的条件下,执行工艺。
在培养容器内使用的产生酸和溶剂的梭菌可来自单菌株或者来自共培养,优选地来自单菌株。
在一些实施方式中,梭菌耐酸。梭菌可优选地耐受高浓度COOH。在这个背景下,高浓度COOH可表示高达15g/L的乙酸和/或高达10g/L的乳酸和/或高达6g/L的甲酸。
在一些实施方式中,梭菌细胞一些或所有可在培养容器内固定。在其他实施方式中,梭菌细胞是非固定的或者处于自由悬浮中。
培养容器可能是任何形式的培养容器,其适合于在本发明的工艺中培养梭菌细胞。优选类型的培养容器包括传统的搅拌式生物反应器。
如在本文中使用的,术语“培养容器”包括两个或多个培养容器,其可以流体通信的方式连接或不连接。任何多个培养容器可并行或串行连接。
然而,在本发明的背景下,酸和溶剂两者在单个培养容器中共同(即,在混合物中)产生。并非以下情况:在第一培养容器中产生一个或多个酸,然后,在第二培养容器中,酸转换成一个或多个溶剂。
合适的培养基在本领域中众所周知。根据正在使用的梭菌,选择这些。通常,培养基是水培养基。
在包括分批补料式工艺的本发明的实施方式中,发酵以批式模式继续约20个小时,填充约70%的反应器容积。培养基应包含足够的糖和营养素,用于微生物最佳生长并且产生酸和一些溶剂。
在其他实施方式中,可以一开始填充并且仅接种约反应器工作容积的10%。可在细胞生长期间,填充剩余的约60%。
分批补料式工艺的培养基可能是包含比在批式阶段期间培养容器内存在的浓度的更高糖和/或营养素浓度更高的营养素原料。在原料上的糖的典型浓度可在250g.L-1与450g.L-1之间变化。这可通过恒定的流速供料,或者根据细胞生长(或相关的特征)、或在培养容器内的糖或溶剂水平,由反馈系统控制。在其他实施方式中,可使用单独触发开始添加其他的营养培养基,而非溶剂提取的触发;例如,这可以在糖浓度降低为在限定的水平(例如,低于30g/L)之间时或者在检测生长速率减速时进行。
附加的糖溶液的供料速率应优选地与培养物的吸收率保持同步。例如,这可以是通过供料阶段的大约2-5g.L-1.h-1,以便在培养容器内保持稳定的糖浓度(例如,在5-30g.L-1的范围内)。
在适合于产生酸和溶剂的条件下,在培养容器内保持梭菌。所述条件包括提供营养培养基,包括合适的碳源,例如,可吸收的碳水化合物。
可吸收的碳水化合物的实例是糖,例如,C5和C6单体、C5和C6糖二聚体、糖低聚物以及糖聚合物。优选的糖是阿拉伯糖、木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖、半乳糖、蔗糖、乳糖,麦芽糖、纤维二糖。优选的聚合物是淀粉、木聚糖、果胶、果聚糖、纤维素以及甘露糖醇。另一个合适的碳源是甘油。
优选地,糖是源自木质纤维素原料的水解产物,例如,农业废弃物(玉米&糖)、木质残留物、能源作物或城市垃圾。
碳水化合物还可能是基于葡萄糖的多糖,例如,淀粉或基于淀粉的材料。最优选地,碳水化合物是淀粉或基于淀粉的材料,例如,玉米、玉米淀粉、玉米醪、土豆、土豆淀粉、土豆泥、土豆皮、土豆片、木薯、木薯淀粉、木薯片、西米、西米淀粉、糊精或可溶性淀粉,例如,由Fisher/Sigma销售的。
在一些实施方式中,本发明允许使用大于200g/L的糖或者具有最小底物或溶剂抑制的其他碳原料,同时在供应碳料的基础上,保持产品产率大于30%。
通过从单独的碱性原料中或者从pH低于培养容器的pH(通常是1-2pH单位)的原料培养基的添加物中自动添加碱,可控制培养容器的pH。
培养容器的pH优选地是pH5.5-7.0,更优选地是pH5.5-6.5。
pH还可由pH-auxostat控制。优选地,pH-auxostat具有单独的碱性原料,并且泵连接至控制培养基供料的泵。通过改变碱性原料和培养基供料泵的比率或相对速度,可控制在培养容器内的细胞密度。
温度选择为微生物最佳生长的温度。例如,对于嗜温梭菌,温度优选地为30-37℃,更优选地为31-33℃,例如,约32℃。
在步骤(b)中,监控在培养容器内的单相产溶剂梭菌细胞的生长。这样做,以便获得用于通过添加新鲜的培养基或营养素和/或去除培养基,在培养容器内保持良好的生长率和高细胞密度的信息。
虽然监控在培养容器内的梭菌的细胞生长,但是可在培养容器内进行或者不进行实际监控,例如,可在外面或者在从培养容器中去除的样本上进行监控。
优选地,步骤(b)包括由以下中的一个或多个监控细胞生长:
(i)监控一种或多种气体(例如,氢气和/或CO2)的产生;
(ii)监控一个或多个酸类的产生;
(iii)监控所述培养基的pH;
(iv)监控糖的使用;
(v)监控细胞密度;以及
(vi)监控一种或多种溶剂的生产。
在本发明的工艺中,可由梭菌生产一种或多种气体。这些气体可包括氢气和/或二氧化碳。
可使用流量计监控气体的总量,并且使用特定的气体分析仪量化单独气体。
还可监控气体的比率,并且用于通过调整培养基、营养素的添加速率和/或溶剂的去除速率,控制生长和溶剂生产。
梭菌将基于糖和/或淀粉的底物转换成酸(例如,RCOOH,其中,R如上所定义)。示例性算包括乙酸和/或丁酸。酸浓度可由气相色谱法(GC)监控。
这些酸的生产可由培养物pH的变化监控。在这种情况下,监控设备可能是pH计。
细胞密度可由光学装置监控,例如,确定光学密度(OD)是600nm。
在其他实施方式中,细胞密度的变化可与新鲜的培养基/营养供料的速率变化或者包括溶剂的培养基的移除的速率变化连接,例如,使用恒浊器。
一种或多种溶剂(例如,乙醇、丁醇、丙酮)的生产可由气相色谱法(GC)和/或高效液相色谱(HPLC)监控。
优选地,在培养容器内的丁醇的浓度应不超过10g丁醇L-1。
一种或多种糖(例如,葡萄糖、木糖、果糖、阿拉伯糖、蔗糖、纤维二糖或者酌情根据原料的其他糖)的使用可由HPLC监控。
优选地,在培养容器内的糖浓度应不超过30g糖L-1。
步骤(b)包括从所述培养容器中连续地或者半连续地去除液体培养基的流或部分,并且将所述液体培养基传送给溶剂去除器。在溶剂去除器中,一个或多个溶剂优选地与液体培养基分离,并且可选地隔离。
优选地,步骤(d)包括从所述培养容器中连续地或者半连续地去除所述液体培养基的流或部分,并且经由细胞分离器将所述流/部分传送给溶剂去除器,其中:
(i)在所述细胞分离器中从所述液体培养基中去除细胞,并且所述细胞返回所述培养容器(可选地通过细胞接种器);和/或
(ii)其中,在所述溶剂去除器中从所述液体培养基中去除溶剂,并且残余的液体培养基返回所述培养容器。
来自培养容器的液体培养基可直接或间接传送给细胞分离器。
残余的液体培养基可直接或间接传送给培养容器,例如,可暂时储存在(例如)储存器内。
为了减少培养容器的细胞的损失,细胞分离器可位于溶剂去除器的上游。在细胞分离器中,从穿过细胞分离器的液体培养基的流或部分中去除所有或者大部分细胞。例如,细胞分离器可从穿过细胞分离器的液体培养基中去除至少50%、优选地至少70%并且最优选地至少80%或至少90%的细胞。
细胞分离器的实例包括空心纤维分离器、薄膜分离器以及离心分离器。
在与液体培养基分离之后,细胞返回培养容器(优选地通过一些液体培养基),可选地通过细胞接种器。
然后,剩余的液体传送给溶剂去除器。
在步骤(d)(ii)中,通过溶剂去除器从液体培养基中去除溶剂,并且残余的液体培养基(即,去除了一些或所有溶剂的液体培养基)返回培养容器。
从培养容器中去除的液体培养基富含由产溶剂梭菌生产的一种或多种溶剂。
优选地,一旦在培养容器内产生的溶剂到达预先定义的浓度点(例如,8-10g丁醇L-1液体培养基),液体培养基就开始从培养容器中去除。
液体培养基应优选地以将液体培养基内的溶剂浓度保持为低于期望的溶剂浓度点的速率,传送给溶剂去除器。例如,这个浓度点可以是所使用的特定产溶剂梭菌的毒性阈值。
通常,通过液体-液体提取、离子-液体提取、气体剥离、真空蒸发、常压或真空蒸馏、全蒸发、离子交换吸附、逆流溶剂提取和/或蒸馏而从液体培养基(发酵液)中回收溶剂。可替换地,可使用疏水膜,例如,通过空气通量或惰性气体载体或真空(全蒸发),以帮助分离(优选地,在连续工艺中)。
优选地,通过常压或真空蒸馏、全蒸发、液体-液体提取和/或气体剥离从液体培养基中回收溶剂。
优选地,连续执行溶剂提取。
在本发明的一些实施方式中,可在超过60个小时的周期内以至少0.8g.L-1.h-1的速率或者在100个小时的周期内以0.6g.L-1.h-1的速率,产生溶剂。
在一些更优选的实施方式中,溶剂提取通过连续的常压或真空蒸馏。
一旦从液体培养基中去除溶剂,一些或所有残余的液体培养基就返回培养容器。这将最大限度地使用来自液体培养基的营养素并且尽可能减少水损失。
本发明还涉及一种由本发明的工艺获得的溶剂。
在步骤(e)中,优选通过控制以下因素保持或增大所述培养容器中的细胞密度:
(i)将从包括溶剂的液体培养基中去除的细胞循环回所述培养容器;和/或
(ii)连续地或半连续地将细胞从细胞接种器中供料到所述培养容器内;和/或
(iii)在所述培养容器内固定所述细胞的一些或全部。
在步骤(e)(ii)中,连续地或半连续地将细胞从细胞接种器中供料到所述培养容器内。
在最简单版本的发酵工艺中,5-10%v/v的单批种子可用于在发酵的开始接种发酵。然而,还可以在发酵期间,以不同的时间间隔使用多批5-10%v/v的接种,以便保持高细胞密度和溶剂生产率。可替换地,连续培养可用于将新鲜细胞的连续供应提供给生产发酵罐。优选的实施方式是pH-auxostat,所述pH-auxostat从蒸馏釜底部供料并且使用设定的pH值自动调节,以控制原料和/或新鲜的营养素和糖的添加。
在步骤(e)(iii)中,在所述培养容器内固定所述细胞的全部或一些。
细胞可以通过主动固定技术固定,据此,通过共价连接至表面、细胞与表面交联、陷入凝胶或薄膜限制内,固定游离的悬浮细胞;或者通过被动固定,利用细胞的自然趋势,来粘合至固体多孔表面(由于静电相互作用),或者通过其在支撑材料周围或之内形成薄膜或集合体的能力。
在本申请中用于固定梭菌的优选方法是:
(i)在自然发生的聚合物(例如,藻酸盐、k型卡拉胶、胶原、明胶、纤维素等)或合成凝胶(聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、光可交联树脂预聚合物、氨基甲酸酯预聚合物、聚乙二醇以及聚乙烯醇等)制成的凝胶基质内,陷入细胞;
(ii)通过在障阻之后固定,进行细胞的薄膜限制,障阻可以是在有机溶剂或半渗透性薄膜内乳化的细胞-水悬浮液的液滴。
在本发明的工艺中,通过控制以下因素来调节在所述培养容器内的细胞生长(或细胞生长的速率)。:
(i)引入所述培养容器内的新鲜的培养基或营养素的量或速率;和/或
(ii)从所述培养容器中去除的包括溶剂的液体培养基的量或速率。
本发明的工艺的目的在于,考虑到尽可能增大糖利用和溶剂生产,在培养容器内保持细胞生长并且优化细胞密度。
通过在培养容器内监控梭菌的细胞生长,可检测次佳生长。然后,可通过将新鲜的培养基或营养素引入培养容器内和/或去除包括抑制溶剂的一些液体培养基,寻求或获得最佳生长。
优选地,因此,在培养容器内的细胞的生长保持在最佳水平。
在其他实施方式中,如果检测到细胞的次佳生长,那么将新鲜的培养基或营养素引入培养容器内和/或从培养容器中去除包括溶剂的液体培养基。
在其他实施方式中,将细胞生长的监控水平与参考水平比较,并且如果监控水平低于参考水平,那么将新鲜的培养基或营养素引入培养容器内和/或从培养容器中去除包括溶剂的液体培养基。
本发明还提供了一种用于生产溶剂的系统,所述系统(例如,如图1中所示)包括:
(i)培养容器,用于在液体培养基内培养产溶剂梭菌;
(ii)监控设备,用于在所述培养容器内监控细胞的生长;
(iiia)细胞接种器,与所述培养容器流体联通并且设置为提供梭菌细胞至所述培养容器;和/或(iiib)细胞分离器,与所述培养容器流体联通并且设置为从所述培养容器接收液体培养基并且从所述液体培养基分离产溶剂梭菌细胞以及进一步设置为将分离的细胞返回所述培养容器;
(iv)溶剂去除器,与所述培养容器流体联通并且设置为接收液体培养基,细胞可选地已经通过所述细胞分离器从所述液体培养基中去除,所述溶剂去除器进一步设置为从液体培养基中去除一种或多种溶剂,并且进一步设置为将残余的液体培养基返回所述培养容器;
(v)一个或多个流量调节器,与所述培养容器流体联通,用于控制待引入所述培养容器内的新鲜的培养基的速率或量和/或待传送至所述细胞分离器的液体培养基的速率或量;以及
(vi)一个或多个控制器,用于根据从所述监控设备接收的输入控制所述一个或多个流量调节器。
所述系统可选地还包括以下中的一个或多个:
(vii)蒸馏釜,其中当工艺结束时所述培养基被引导至所述蒸馏釜,以从所述溶剂中去除大部分水,
(viii)一个或多个精馏塔,用于将所述溶剂净化为期望的产品规格;
(ix)釜馏物处理,用于降低COD/BOD(化学需氧量/生物化学需氧量),可选地也从最终培养基中回收能量;以及
(x)一个或多个糖溶液和/或营养素的储存器,与所述培养容器流体联通。
在本发明的一些实施方式中,培养容器包括在液体培养基内的单相产溶剂梭菌。
系统可另外包括容器,该容器包含或者适合于包含碱;和/或容器,该容器包含或者适合于包含新鲜的培养基(营养素)。这些后面的容器可与第一培养容器液体联通。
用于液体联通的装置优选地包括管体。
系统可另外一个或多个附加的溶剂去除器(例如,一个或多个精馏塔、一个或多个蒸馏釜等),所述去除器与培养容器流体联通并且设置为从液体培养基中去除溶剂,其中所述液体培养基是从培养容器中去除的。
上面在本发明的工艺的背景下讨论的本发明的所有特征同样适用于以上系统,加上必要的变更。
附图说明
图1示出了本发明的整合分批补料式工艺概念的实例;
图2是双相产溶剂梭菌的批式发酵概况,该图示出了在生长减速并且细胞进入稳定期时溶剂生产开始,发酵时间较长,最终溶剂滴定度低,因此,在整个发酵期间的溶剂生产力低(实例1);
图3是单相产溶剂梭菌的批式发酵概况,该图示出了在生长期间发生溶剂生产,并且在生长减速并且细胞进入稳定期时,溶剂生产减速,发酵时间减少,并且在整个发酵期间的溶剂生产力比在实例1中更高(实例2);
图4是单相产溶剂梭菌的批式发酵概况,该图示出了在溶剂生产期间使用糖,并且在用完糖时,溶剂生产停止,发酵时间较短(实例3);
图5是利用单相产溶剂梭菌的分批补料式发酵,气体剥离用于去除溶剂,并且糖原料是糖蜜,该图示出了在发酵过程中在溶剂内的累积(困在外面的以及保留在发酵罐内的溶剂的总和),获得的最终溶剂滴定度远远高于在传统的批式发酵(即,实例3)内获得的滴定度(实例4);
图6是利用单相产溶剂梭菌的分批补料式发酵,气体剥离用于去除溶剂,并且糖原料是糖蜜,该图示出了在溶剂生产率与糖吸收之间的关系,并且通过在发酵期间添加附加的糖并且通过在生产时去除溶剂,来扩展峰值溶剂生产力(实例4);
图7是利用单相产溶剂梭菌的分批补料式发酵,气体剥离用于去除溶剂,并且糖原料是糖蜜,该图示出了在细胞生长和密度(由光学密度测量)与溶剂生产率之间的直接相关性(实例4);
图8是利用单相产溶剂梭菌的分批补料式发酵,气体剥离用于去除溶剂,并且糖原料是葡萄糖(实例5),该图示出了在发酵过程中在溶剂内累积;
图9是利用单相产溶剂梭菌的中试规模的分批补料式发酵,该工艺包含在培养容器外面从发酵液中去除细胞的薄膜过滤单元(细胞分离器),细胞循环回培养容器,并且将减去细胞的培养液供料给将溶剂从液体培养基分离的精馏塔(溶剂去除器),蒸馏液返回培养容器,糖原料是葡萄糖,该图示出了高溶剂生产率可保持超过40个小时,并且在糖吸收与溶剂生产量之间具有直接相关性(实例6);
图10是利用单相产溶剂梭菌的中试规模的分批补料式发酵,该工艺包含在培养容器外面从发酵液中去除细胞的薄膜过滤单元(细胞分离器),细胞循环回培养容器,并且将减去细胞的培养液供料给将溶剂从液体培养基分离的精馏塔(溶剂去除器),蒸馏液返回培养容器,糖原料是玉米醪,该图示出了使用基于工业玉米的原料,高糖吸收和溶剂生产率可保持超过40个小时(实例7);
图11是单相产溶剂梭菌的中试规模的分批补料式发酵,该工艺包含在培养容器外面从发酵液中去除细胞的薄膜过滤单元(细胞分离器),细胞循环回培养容器,并且将减去细胞的培养液供料给将溶剂从液体培养基分离的精馏塔(溶剂去除器),蒸馏液返回培养容器,糖原料是糖蜜,该图示出了在发酵期间在糖吸收与溶剂生产率之间的相关性(实例8);
图12是单相产溶剂梭菌的中试规模的分批补料式发酵,该工艺包含在培养容器外面从发酵液中去除细胞的薄膜过滤单元(细胞分离器),细胞循环回培养容器,并且将减去细胞的培养液供料给将溶剂从液体培养基分离的精馏塔(溶剂去除器),蒸馏液返回培养容器,糖原料是糖蜜,该图示出了在发酵期间在气体生产与溶剂生产力之间的相关性(实例8)。
具体实施方式
实例
进一步在以下实例中定义本发明,其中,部分和百分比是摄氏度的重量和度数,除非另有规定。应理解的是,在表示本发明的优选实施方式的同时,仅仅通过说明的方式提供这些实例。从以上讨论和这些实例中,本领域的技术人员可以确定本发明的基本特征,并且在不背离其精神和范围的情况下,可进行本发明的各种变更和修改,以使其适合于各种用途和条件。除了在本文中显示和描述的修改以外,通过以上描述,本发明的各种修改也对于本领域的技术人员显而易见。这种修改也旨在落在所附权利要求的范围内。
在实验规模(1L)实例中,气体剥离用于在主要发酵罐内保持低水平的溶剂。然而,在中试规模(140L)实例(以及优选的商业方法)中,使用具有循环至主发酵罐的营养素和水循环的常压蒸馏执行溶剂去除。
比较实例1:利用双相产溶剂梭菌的批式发酵
目标:
演示使用传统的双相产溶剂梭菌获得的双相批式发酵的概况。
材料和方法
菌株
在32±1℃的厌氧条件下,在100mL的血清瓶内,产溶剂拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckiistrain)BAS/B2(CSC/NCP收集15/06/1945)在标准的厌氧培养基(例如,加强的梭菌培养基(RCM,如在表1中所示))上培养16-18h。
表1:以g.L-1为单位的RCM半固体培养基成分
*根据需要调整,以满足性能标准,在121℃下通过高压灭菌法灭菌
发酵培养基
糖蜜是发酵培养基的主要碳源。在0.95L的初始体积中进行实验,在发酵容器内,开始的糖蜜糖浓度是60g.L-1并且补充5g.L-1玉米醪、5g.L-1CaCO3以及2g.L-1(NH4)2SO4。初始pH通过20%(w/v)的NaOH调整为6.7±0.2,然后,不控制pH。所有矿物盐都是实验室等级(FisherScientific)。
培养条件
在1L发酵罐内进行发酵,初始工作体积是0.95L。发酵罐装有排气口、搅拌器、采样口、pH和温度探头。它们通过具有最终体积(1L)的1%v/v种子培养的接种来启动。温度保持在32±3℃。
细胞生长、产品以及底物的分析
使用具有1cm光路的比色皿的Jenway6300分光光度计在600nm监控生长。需要时,稀释培养物,以便吸收率不超过0.6个单位。
在具有网络取样器的Agilent气相色谱系统上,通过将来自离心分离的发酵样本的上清液应用于气体气相色谱法中,测量乙酸盐、丁酸盐、乙醇、丙酮以及正丁醇的浓度。该设备装有毛细管柱(Agilent19091F115EHP-FFAP),柱温度从80℃上升为200℃。载体气体是N2,流速在0.8mL.min-1与1.3mL.min-1之间。通过50mL.min-1的氢气流、400mL.min-1的空气流以及30mL.min-1的补给流(N2),控制FID探测器温度(300℃)。异丁醇(99.5%)和异丁酸(99.5%)用作内部标准物,均在HPLC等级水中以浓度10g.L-1制备。
通过使用装有ASI00auto取样器以及ShodexRI101差折光检测器和UV探测器的DionexHPLC,利高压液相色谱法确定发酵样本的糖含量。分离柱是在85℃下操作的PhenomonexRezex-Pb2+。HPLC等级水作为0.6mL/min流速的移动相使用。样本注射容积是10μl。通过积分来自色谱图的峰值区域,产生校准曲线,所述色谱图是从糖浓度为1、5、10、15以及20g.L-1的蔗糖、麦芽糖、葡萄糖或果糖(酌情,根据所使用的特定糖源)的溶液中生成的。
结果
在图2中显示结果。该图示出了在生长减速时溶剂生产开始,并且细胞进入稳定期。发酵时间较长(55个小时),最终溶剂滴定度低,因此,在整个发酵期间的溶剂生产力低。
比较实例2:利用单相产溶剂梭菌的批式发酵
目标:
演示使用单相产溶剂梭菌获得的单相批式发酵的概况。
材料和方法
菌株
在32±1℃的厌氧条件下,在100mL的血清瓶内,产溶剂糖丁酸梭状芽胞杆菌N1-4(HMT)(ClostridiumsaccharoperbutylacetonicumstrainN1-4(HMT))在标准的厌氧培养基(例如,加强的梭菌培养基(RCM,如在表1中所示))上培养16-18h。
发酵培养基
与在实例1中一样:糖蜜是发酵培养基的主要碳源。在0.95L的初始体积中进行实验,在发酵容器内,开始的糖蜜糖浓度是60g.L-1并且补充5g.L-1玉米醪、5g.L-1CaCO3以及2g.L-1(NH4)2SO4。初始pH通过20%(w/v)的NaOH调整为6.7±0.2,然后,不控制pH。
培养条件
与实例1一样:在1L发酵罐内进行发酵,初始工作体积是0.95L。发酵罐装有排气口、搅拌器、采样口、pH和温度传感器。它们通过具有最终体积(1L)的1%v/v种子培养的接种来启动。温度保持在32±3℃。
产品和底物的分析
如在实例1中所述。
结果
在图3中显示结果。该图示出了在生长期间发生溶剂生产,并且在生长减速时,溶剂生产减速,并且细胞进入稳定期。发酵时间减少(45个小时),并且在整个发酵期间的溶剂生产力比在实例1中高。
比较实例3:利用单相产溶剂梭菌的批式发酵
目标:
针对使用单相产溶剂梭菌的批式发酵演示在糖使用与ABE生产之间的关系。
材料和方法
菌株
如在实例2中所述,培养产溶剂糖丁酸梭状芽胞杆菌N1-4(HMT)(ClostridiumsaccharoperbutylacetonicumstrainN1-4(HMT))。
发酵培养基
与在实例2中一样:糖蜜是发酵培养基的主要碳源。在0.95L的初始体积中进行实验,在发酵容器内,开始的糖浓度是55g.L-1并且补充2.5g.L-1酵母提取物、2.5g.L-1胰蛋白胨、0.025g.L-1FeSO4以及0.5g.L-1(NH4)2SO4。
培养条件
与实例2一样:在1L发酵罐内进行发酵,初始工作体积是0.8L。发酵罐装有排气口、搅拌器、采样口、pH和温度传感器。它们通过具有最终体积(1L)的7.5%v/v种子培养的接种来启动。温度保持为32±3℃。20%w/v的NaOH用于将初始pH调整为在6与6.5之间,并且在发酵期间需要时,保持5.0-5.5的pH设定点。所有矿物盐都是实验室等级(FisherScientific)。
产品和底物的分析
如在实例1中所述。
在图4中显示结果。该图示出了在溶剂生产期间使用糖,并且在用完糖时,溶剂生产停止。发酵时间较短(44个小时)。
实例4:糖蜜中的分批补料式发酵
目标:
演示一种用于通过高生产率培养单相产溶剂梭菌的方法;使用分批补料式系统,与在液体培养基内保持低溶剂浓度(使用气体剥离)的传统批式发酵相比,该系统关注于以等于或接近其最大糖吸收和溶剂生产率在延长的时间内以指数方式生长细胞群体的方法。
材料和方法
菌株
如在实例2中所述,培养产溶剂糖丁酸梭状芽胞杆菌N1-4(HMT)(ClostridiumsaccharoperbutylacetonicumstrainN1-4(HMT))。
发酵培养基
糖蜜是发酵培养基的主要碳源。在1.5L的初始体积中进行实验,在发酵容器内,开始的糖蜜糖浓度是50g.L-1并且补充2.5g.L-1酵母提取物、2.5g.L-1胰蛋白胨、0.5g.L-1(NH4)2SO4、0.025g.L-1FeSO4以及3g.L-1CaCO3。在需要时,在灭菌之前利用20%w/v的NaOH,将pH调整为6.5的pH。所有矿物盐都是实验室等级(FisherScientific)。
原料培养基
具有营养素的浓度为350g.L-1的葡萄糖溶液的500mL其他原料,营养素包括3.8g.L-1酵母提取物、3.8g.L-1胰蛋白胨、0.8g.L-1(NH4)2SO4、3g.L-1CaCO3以及0.05g.L-1FeSO4。
培养条件
在发酵罐内进行发酵,发酵罐装有排气口、搅拌器、采样口、pH和温度传感器。它们通过具有7.5%v/v种子培养的接种启动。
在接种之后,供料容器(1L)立即连接至发酵罐(图1)。在6小时之后,在丁醇浓度是1g/L时,以2vvmN2的气体流速,使用氮气通过气体剥离开始产品去除。分批补料式模式操作大约在接种之后的大约15h开始。链接培养基储存器泵,并且一旦糖浓度在容器内下降为低于设定值(26g.L-1),就启动培养基储存器泵。培养基存储器供应新鲜的糖和营养素。根据糖吸收率和培养生长,供料泵自动并且间断地运行。配备控制系统,以保持32±3℃的温度以及最小搅拌(50-70rpm)。不控制pH。
产品和底物的分析
如在实例1中所述。
结果
图5示出了在发酵过程中溶剂的累积(限制在外面的以及保留在发酵罐内的溶剂的总和)。获得的最终溶剂滴定度远远高于在传统的批式发酵(即,实例3)内获得的滴定度。
图6示出了在溶剂生产力与糖吸收之间的关系,并且通过在发酵期间增加附加的糖以及通过在生产时去除溶剂,来延长峰值溶剂生产力(绘图数据是累计平均值)。
图7示出了在细胞生长和密度(由光学密度测量)与溶剂生产力之间的直接相关性(绘图数据是累计平均)。
人们发现发酵受到控制的溶剂浓度值对生长率具有明显影响,因此,对糖吸收和溶剂生产速率具有明显影响。高溶剂生产速率保持了更长的时间段,在供料阶段的始终,建议培养物以其最大生长速率或接近其最大生长速率生长。发酵运行164个小时,其中的53.5h伴随着供料。溶剂*生产力在供料阶段是0.90g/L/h并且在整个发酵阶段是0.79g/L/h;糖吸收率在供料和整个发酵阶段分别是2.9和2.7g/L/h;并且产量(yield)在供料和整个发酵阶段分别是0.32和0.30g溶剂*/g使用的糖(*注释:基于收集的溶剂的“溶剂”数据-所产生的溶剂的显著的部分未被限制,因此,所产生的溶剂的实际值会更高)。
实例5:葡萄糖中的分批补料式发酵
目标:
演示用于以高生产率培养单相产溶剂梭菌的上述分批补料式系统(实例4)也使用不同的糖源(例如,结晶葡萄糖)运转。
材料和方法
菌株
如在实例2中所述,培养产溶剂糖丁酸梭状芽胞杆菌N1-4(HMT)。
发酵培养基
结晶葡萄糖是发酵培养基的主要碳源。以1.55L的初始体积进行实验,在发酵容器内,开始的糖浓度是53g.L-1并且补充2.5g.L-1胰蛋白胨、2.5g.L-1酵母提取物、0.5g.L-1(NH4)2SO4、0.025g.L-1FeSO4以及3g.L-1CaCO3。
原料培养基
具有浓度492g.L-1的650mL葡萄糖溶液,具有这些营养素包括3.8g.L-1酵母提取物、3.8g.L-1胰蛋白胨、0.8g.L-1(NH4)2SO4、0.05g.L-1FeSO4以及3g.L-1CaCO3。
糖溶液和营养素基础培养基分别分批和灭菌。
培养条件
在2L发酵罐内进行发酵,发酵罐装有排气口、搅拌器、采样口、pH和温度传感器。它们通过具有7.5%v/v种子培养的接种启动。每48h重复7.5%v/v种子培养的接种。
供料容器(1L)连接至发酵罐。一旦初始糖浓度下降为低于~25g/L,开始供料的添加(浓缩糖加上营养素),并且也开始进行通过气体剥离(≥2vvm)的产品移除。根据糖吸收率和培养生长,供料泵自动并且间断地运行。配备控制系统,以保持32±1℃的温度以及最小搅拌(50-70rpm)。
产品和底物的分析
如在实例1中所述。
结果
在图8中显示了结果。该图示出了在发酵过程中溶剂的累积。发酵运行216.5个小时,其中191h伴随着供料。在供料期间的溶剂*生产力是0.57g/L/h并且在整个发酵期间是0.53g/L/h;糖吸收率在供料和整个发酵期间分别是2.1和2.0g/L/h;并且产量在供料和整个发酵期间分别是0.21和0.20g溶剂*/g使用的糖(*注释:未捕获基于所收集的溶剂的‘溶剂’数据(基于收集的溶剂的“溶剂”数据-所产生的溶剂的显著的部分未被限制,因此,所产生的溶剂的实际值会更高)。
实例6:葡萄糖中的中试规模的分批补料式发酵
目标:
演示这个分批补料式发酵工艺在中试规模上运行,将葡萄糖用作主要糖源。这个实例系统包含从位于培养容器外面的发酵液中去除细胞的薄膜过滤单元(细胞分离器)。所述细胞循环回培养容器中,并且将减去所述细胞的培养液供料给从液体培养基分离溶剂的精馏塔(溶剂去除器),蒸馏液返回培养容器(参照图1)。
菌株
在32±1℃的厌氧条件下,在38g.L1DifcoRCM培养基上,培养产溶剂糖丁酸梭状芽胞杆菌N1-4(HMT)长达16-18小时。其中的150mL用于接种5L种子酸瓶,所述种子酸瓶包含丰富的葡萄糖培养基/种子(葡萄糖40g/L、酵母提取物5g/L、肉蛋白胨5g/L、(NH4)2SO42g/L、FeSO40.05g/L以及三水醋酸钠3g/L)。这被接种长达5.25h,以生成5L种子。
发酵培养基
葡萄糖用作发酵培养基的主要碳源。如下制备105L的以下培养基:葡萄糖60g/L、酵母提取物2.5g/L、肉蛋白胨2.5g/L、(NH4)2SO42g/L、FeSO40.05g/L、玉米油0.1%v/v、止泡剂(抑制物2343)0.03g/L。
原料培养基
50L浓缩糖原料包含450g/L葡萄糖。
16L营养素添加溶液包括:葡萄糖酵母提取物58g/L、肉蛋白胨58g/L、(NH4)2SO417g/L、FeSO40.4g/L以及玉米油0.4%v/v。
糖溶液和营养素基础培养基分开地分批配置和灭菌。
培养条件
在140L发酵罐内进行发酵,一开始组合105L发酵培养基和5L种子。
温度保持在30.5±0.3℃。在接种之后,pH快速降低,直到使用10-25%w/vNaOH,在pH5.3开始pH调节。
产品和底物的分析
如在实例1中所述。
结果
在图9中显示了结果。绘图值是5个点平均值。该图示出了高溶剂生产力可以保持约50个小时,并且在糖吸收与溶剂产量之间具有直接相关性。在整个102.5小时发酵内的平均生产率是0.68g/L/h,在52h分批补料阶段的生产率是1.11g/L/h,在整个102.5小时发酵内的糖消耗是1.91g/L/h,在52h分批补料阶段的糖消耗是2.77g/L/h,基于120L最终容量的溶剂产量是70g/L,与消耗的糖相关的ABE产量是35.7%,并且丁醇比率是76%。
实例7:澄清的玉米醪中的中试规模的分批补料式发酵
目标:
演示这个分批补料式发酵工艺在中试规模上运行,将澄清的玉米醪用作主要糖源。这个实例系统包含在培养容器的外侧从发酵液中去除细胞的薄膜过滤单元(细胞分离器)。所述细胞循环回培养容器中,并且将一些无细胞的培养液供料给从液体培养基分离溶剂的精馏塔(溶剂去除器),蒸馏液返回培养容器(参照图1)。
菌株
在32±1℃的厌氧条件下,在38g.L1DifcoRCM培养基中培养产溶剂糖丁酸梭状芽胞杆菌N1-4(HMT)长达16-18小时。其中的150mL用于接种5L富含澄清的玉米醪的培养基/种子(澄清的玉米醪相当于糖40g/L、酵母提取物5g/L、肉蛋白胨5g/L、(NH4)2SO42g/L、FeSO40.05g/L以及三水醋酸钠3g/L)。这被接种长达5.25小时,以生成5L种子。
发酵培养基
澄清的玉米醪用作发酵培养基的主要碳源。制备105L的以下培养基:澄清的玉米醪相当于糖60g/L、酵母提取物2.5g/L、(NH4)2SO42g/L以及FeSO40.05g/L。
原料培养基
75L浓缩糖原料包含相当于糖270g/L的澄清的玉米醪。
8L的营养素添加溶液包括:酵母提取物95g/L、(NH4)2SO465g/L以及FeSO41.7g/L。
糖溶液和营养素基础培养基分开地分批配置和灭菌。
培养条件
在140L发酵罐内进行发酵,一开始组合100L发酵培养基和5L种子。
温度保持在30.5±0.3℃。在接种之后,pH快速降低,直到使用10-25%w/vNaOH,在pH5.3开始pH调节。
产品和底物的分析
如在实例1中所述。
结果
在图10中显示了结果。绘图值是5个点平均。该图示出了使用基于工业玉米的原料,高的糖吸收和溶剂生产力可保持约50个小时。
在110个小时发酵周期(97.75h发酵+CIP(原位清洗)时间+周转时间)内的平均生产力是0.87g/L/h,在52h分批补料阶段的生产率是1.51g/L/h,在110个小时发酵周期内的糖消耗是2.84g/L/h,在52个小时的分批补料阶段的糖消耗是5.25g/L/h,基于105L最终体积的溶剂产量是96g/L,在消耗的糖上的ABE产量是30.6%,并且丁醇比率是61.5%。
实例8:糖蜜中的中试规模的分批补料式发酵,监控气体生成
目标:
演示这个分批补料式发酵工艺在中试规模上运行,将糖蜜用作主要糖源。这个实例系统包含在培养容器外从发酵液中去除细胞的薄膜过滤单元(细胞分离器)。所述细胞循环回培养容器,并且将减去细胞的培养液供料给从液体培养基分离溶剂的精馏塔(溶剂去除器),蒸馏液返回培养容器(参照图1)。此外,监控来自发酵的气体。
菌株
在32±1℃的厌氧条件下,在38g.L1DifcoRCM培养基中,培养产溶剂糖丁酸梭状芽胞杆菌N1-4(HMT)长达16-18小时。其中的150mL用于接种5L富含糖蜜的培养基/种子(糖蜜相当于糖35g/L、酵母提取物5g/L、肉蛋白胨5g/L、(NH4)2SO42g/L、FeSO40.05g/L以及三水醋酸钠3g/L)。这被接种长达5.25小时,以生成5L种子。
发酵培养基
蔗糖蜜用作发酵培养基的主要碳源。制备105L的以下培养基:蔗糖蜜相当于糖50g/L、酵母提取物2.5g/L、肉蛋白胨2.5g/L、(NH4)2SO42g/L、FeSO40.05g/L、玉米油0.1%v/v以及止泡剂(抑制物2343)0.03g/L。
原料培养基
50L浓缩糖原料包含相当于350g/L糖的蔗糖蜜。
16L营养素添加溶液包括:酵母提取物34g/L、肉蛋白胨34g/L、(NH4)2SO420g/L、FeSO40.5g/L以及玉米油0.6%。
糖溶液和营养素基础培养基分开地分批配置和灭菌。
培养条件
在140L发酵罐内进行发酵,一开始组合105L发酵培养基和5L种子。
温度保持在30.5±0.3℃。不添加碳酸钙或其他缓冲剂。在接种之后,pH快速降低,直到使用10-25%w/vNaOH,在pH5.3开始pH调节。
在供料期间,在培养容器内的丁醇浓度保持低于6g/l,并且在培养容器内的糖浓度保持在20与30g/L之间。
产品和底物的分析
如在针对实例1所述。
结果
在图11和12中显示了结果。绘图值是5个点平均。图11示出了在发酵期间糖吸收与溶剂生产率之间的相关性,表示使用基于工业糖蜜的原料,高的糖吸收和溶剂生产率可保持更长的时间段。图12示出了在发酵期间在气体生产与溶剂生产率之间的相关性。
在67个小时发酵内的平均生产率是0.60g/L/h,在30个小时的分批补料阶段的生产率是0.95g/L/h,在67个小时发酵内的糖消耗是1.67g/L/h,在30小时的分批补料阶段的糖消耗是2.74g/L/h,与消耗的糖相关的ABE产量是35.8%,并且丁醇比率是75%。
Claims (14)
1.一种用于生产溶剂的单阶段工艺,所述工艺包括以下步骤:
(a)在培养容器内的液体培养基内培养单相产溶剂梭菌细胞;
(b)在所述培养容器内监控所述单相产溶剂梭菌细胞的细胞生长;
(c)将新鲜的培养基和/或营养素连续地或者半连续地引入所述培养容器内;
(d)从所述培养容器中连续地或者半连续地去除包括溶剂的液体培养基的流或部分,并且将所述液体培养基传送给溶剂去除器;
(e)在所述培养容器内保持或增大细胞密度;
其中,通过控制以下因素,来调节和/或优化在所述培养容器内的细胞生长:
(i)引入所述培养容器内的新鲜的培养基或营养素的量或速率;和/或
(ii)从所述培养容器中去除的包括溶剂的液体培养基的量或速率。
2.根据权利要求1所述的工艺,其中,所述单相梭菌:
(a)在批式发酵的主要生长期间,自然地显示同时的生长和溶剂生产;
(b)在生长期间,已经被化学突变以生产溶剂;或者
(c)在生长期间,已经被遗传修饰改造以生产溶剂。
3.根据权利要求1或2所述的工艺,其中,所述梭菌是单相糖丁酸梭状芽胞杆菌。
4.根据权利要求3所述的工艺,其中,所述梭菌是单相糖丁酸梭状芽胞杆菌N1菌株,优选地是N1-4(HMT)或N1-504、或其变体或衍生物。
5.根据前述权利要求中任一项所述的工艺,其中,步骤(b)包括通过以下中的一个或多个监控细胞生长:
(i)监控一种或多种气体的产生;
(ii)监控一个或多个酸类的产生;
(iii)监控所述培养基的pH;
(iv)监控糖的利用;
(v)监控细胞密度;以及
(vi)监控一种或多种溶剂的生产。
6.根据前述权利要求中任一项所述的工艺,其中,步骤(b)包括从所述培养容器中连续地或者半连续地去除所述液体培养基的流或部分,并且经由细胞分离器将所述流/部分传送至溶剂去除器,优选地,其中:
(i)在所述细胞分离器中从所述液体培养基中去除细胞,并且所述细胞返回所述培养容器(可选地经由细胞接种器);和/或
(ii)其中,在所述溶剂去除器中从所述液体培养基中去除溶剂,并且残余的所述液体培养基返回所述培养容器。
7.根据前述权利要求中任一项所述的工艺,其中,连续执行溶剂提取。
8.根据前述权利要求中任一项所述的工艺,其中,通过以下步骤在所述培养容器内保持或增大所述细胞密度:
(i)将从包括溶剂的所述液体培养基中去除的细胞循环回所述培养容器;和/或
(ii)连续地或半连续地将细胞从细胞播放机中供料至所述培养容器内;和/或
(iii)在所述培养容器内固定所述细胞的一些或全部。
9.根据前述权利要求中任一项所述的工艺,其中,所述工艺是分批补料工艺、连续工艺或灌注工艺,优选地是连续工艺。
10.根据前述权利要求中任一项所述的工艺,其中,在所述培养容器内的所述液体培养基中培养所述单相产溶剂梭菌细胞,而不提前进行厌氧净化。
11.一种用于生产溶剂的系统,所述系统包括:
(i)培养容器,用于在液体培养基内培养产溶剂梭菌;
(ii)监控设备,用于在所述培养容器内监控细胞的生长;
(iiia)细胞接种器,与所述培养容器流体联通并且设置为提供梭菌细胞至所述培养容器;和/或(iiib)细胞分离器,与所述培养容器流体联通,设置为从所述培养容器接收液体培养基并且从所述液体培养基分离产溶剂梭菌细胞,以及进一步设置为将分离的细胞返回所述培养容器;
(iv)溶剂去除器,与所述培养容器流体联通并且设置为接收液体培养基,其中细胞可选地已经通过所述细胞分离器从所述液体培养基中去除,所述溶剂去除器进一步设置为从液体培养基中去除一种或多种溶剂,并且进一步设置为将残余的液体培养基返回所述培养容器;
(v)一个或多个流量调节器,与所述培养容器流体联通,用于控制引入所述培养容器内的新鲜的培养基的速率或量,和/或传送至所述细胞分离器的液体培养基的速率或量;以及
(vi)一个或多个控制器,用于根据从所述监控设备接收的输入,控制所述一个或多个流量调节器。
12.根据权利要求11所述的系统,其中,所述系统另外包括以下中的一个或多个:
(vii)蒸馏塔,在其中,其中当工艺结束时所述培养基被引导至所述蒸馏塔,以从所述溶剂中去除大部分水,
(viii)一个或多个精馏塔,用于将所述溶剂净化为期望的产品规格;
(ix)釜馏物处理,用于降低COD/BOD,可选地也从最终培养基中回收能量;以及
(x)一个或多个糖溶液和/或营养素的储存器,与所述培养容器流体联通。
13.根据权利要求11或12所述的系统,其中,所述培养容器包括在液体培养基内的单相产溶剂梭菌细胞。
14.根据权利要求13所述的系统,其中,所述梭菌是单相糖丁酸梭状芽胞杆菌N1菌株,优选地是N1-4(HMT)或N1-504、或其变体或衍生物。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201361841077P | 2013-06-28 | 2013-06-28 | |
US61/841,077 | 2013-06-28 | ||
GBGB1315475.2A GB201315475D0 (en) | 2013-08-30 | 2013-08-30 | Solvent production |
GB1315475.2 | 2013-08-30 | ||
PCT/GB2014/051972 WO2014207480A2 (en) | 2013-06-28 | 2014-06-27 | Solvent production |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN105358701A true CN105358701A (zh) | 2016-02-24 |
Family
ID=49397064
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201480036838.4A Pending CN105358701A (zh) | 2013-06-28 | 2014-06-27 | 溶剂生产 |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10150974B2 (zh) |
EP (1) | EP3013965A2 (zh) |
KR (1) | KR20160025023A (zh) |
CN (1) | CN105358701A (zh) |
BR (1) | BR112015031531A2 (zh) |
CA (1) | CA2915990A1 (zh) |
GB (2) | GB201315475D0 (zh) |
MY (1) | MY183015A (zh) |
WO (1) | WO2014207480A2 (zh) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB201716845D0 (en) | 2017-10-13 | 2017-11-29 | Green Biologics Ltd | Process |
US20240067994A1 (en) | 2022-08-24 | 2024-02-29 | Braskem S.A. | Process for the recovery of low-boiling point components from an ethanol stream |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2009106835A2 (en) * | 2008-02-28 | 2009-09-03 | Green Biologics Limited | Production process |
CN101932716A (zh) * | 2007-12-24 | 2010-12-29 | 利莱恩斯生命科学有限公司 | 高产量生物丁醇的生产和定量方法 |
CN102618479A (zh) * | 2012-04-24 | 2012-08-01 | 中南林业科技大学 | 一种能耐受高浓度丁醇的梭菌及其构建方法与应用 |
Family Cites Families (22)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2583060B1 (fr) | 1985-06-06 | 1987-09-18 | Inst Francais Du Petrole | Production de butanol et d'acetone par fermentation avec recyclage de la biomasse par ultrafiltration |
DE3905624A1 (de) | 1989-02-23 | 1990-09-13 | Biotechnolog Forschung Gmbh | Verfahren zur kontinuierlichen vergaerung von melasse mit hilfe von butanol, aceton und ethanol als gaerungsprodukte bildenden bakterien |
US20050089979A1 (en) | 2003-09-18 | 2005-04-28 | Ezeji Thaddeus C. | Process for continuous solvent production |
JP2005328801A (ja) | 2004-05-21 | 2005-12-02 | Yanmar Co Ltd | ブタノールの生産方法 |
CA2568658A1 (en) | 2004-06-04 | 2005-12-15 | Kam Biotechnology Ltd. | Methods and bacterial strains for producing hydrogen from biomass |
RU2394913C2 (ru) | 2005-10-26 | 2010-07-20 | Е.И.Дюпон Де Немур Энд Компани | Ферментативное получение четырехуглеродных спиртов |
GB0612301D0 (en) | 2006-06-21 | 2006-08-02 | Morvus Technology Ltd | DNA molecules and methods |
MY153731A (en) | 2007-12-27 | 2015-03-13 | Gevo Inc | Recovery of higher alcohols from dilute aqueous solutions |
GB0802842D0 (en) | 2008-02-15 | 2008-03-26 | Univ Nottingham | Synthetic operon construction in clostridia |
CN101397576A (zh) | 2008-10-13 | 2009-04-01 | 中国科学院广州能源研究所 | 一种以提取谷朊粉后的小麦淀粉浆或小麦淀粉为主要原料发酵生产丙酮丁醇的方法 |
CN102482690A (zh) | 2009-06-26 | 2012-05-30 | 钴技术有限公司 | 生物产物生产的集成系统和方法 |
US8968522B2 (en) | 2009-07-15 | 2015-03-03 | Butamax Advanced Biofuels Llc | Recovery of butanol isomers from a mixture of butanol isomers, water, and an organic extractant |
CN102286549A (zh) | 2011-06-21 | 2011-12-21 | 中国科学院广州能源研究所 | 一种以纤维二糖、戊糖和己糖共发酵生产丙酮丁醇方法 |
WO2013027282A1 (ja) * | 2011-08-24 | 2013-02-28 | 住友商事株式会社 | ブタノールの新規な生産方法 |
WO2013086458A1 (en) | 2011-12-09 | 2013-06-13 | Optinol, Inc. | Method for producing butanol and isopropanol |
EP2794896B1 (en) | 2011-12-22 | 2019-05-22 | Xyleco, Inc. | Method for producing butanol from glucose via fructose |
WO2013111762A1 (ja) | 2012-01-24 | 2013-08-01 | 株式会社日本触媒 | バイオマスの糖化方法 |
CN102703493B (zh) | 2012-06-20 | 2016-08-17 | 中国科学院广州能源研究所 | 一种高产丁醇的重组菌株及其构建方法 |
KR101440381B1 (ko) | 2014-01-24 | 2014-09-18 | 주식회사현대밸브 | 버터플라이밸브의 양방향 메탈시트 실링구조 |
JP6482832B2 (ja) | 2014-11-20 | 2019-03-13 | 株式会社日本触媒 | ブタノール製造方法 |
ES2938623T3 (es) | 2015-09-09 | 2023-04-13 | Univ Kobe Nat Univ Corp | Método para convertir una secuencia del genoma de una bacteria gram-positiva mediante una conversión específica de una base de ácido nucleico de una secuencia de ADN seleccionada como diana y el complejo molecular utilizado en el mismo |
JP6940262B2 (ja) | 2015-09-09 | 2021-09-22 | 株式会社日本触媒 | ゲノム配列が特異的に変換された遺伝子改変クロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム種微生物、その製造方法およびその用途 |
-
2013
- 2013-08-30 GB GBGB1315475.2A patent/GB201315475D0/en not_active Ceased
-
2014
- 2014-06-27 EP EP14735667.9A patent/EP3013965A2/en not_active Withdrawn
- 2014-06-27 US US14/900,302 patent/US10150974B2/en active Active
- 2014-06-27 GB GB1411516.6A patent/GB2520101B/en active Active
- 2014-06-27 CA CA2915990A patent/CA2915990A1/en not_active Abandoned
- 2014-06-27 WO PCT/GB2014/051972 patent/WO2014207480A2/en active Application Filing
- 2014-06-27 BR BR112015031531A patent/BR112015031531A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2014-06-27 CN CN201480036838.4A patent/CN105358701A/zh active Pending
- 2014-06-27 MY MYPI2015704544A patent/MY183015A/en unknown
- 2014-06-27 KR KR1020167002418A patent/KR20160025023A/ko not_active Application Discontinuation
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101932716A (zh) * | 2007-12-24 | 2010-12-29 | 利莱恩斯生命科学有限公司 | 高产量生物丁醇的生产和定量方法 |
WO2009106835A2 (en) * | 2008-02-28 | 2009-09-03 | Green Biologics Limited | Production process |
CN102618479A (zh) * | 2012-04-24 | 2012-08-01 | 中南林业科技大学 | 一种能耐受高浓度丁醇的梭菌及其构建方法与应用 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
HANNO RICHTER等: "Prolonged conversion of n-butyrate to n-butanol with clostridium saccharoperbutylacetonicum in a two-stage continuous culture with in-situ product removal", 《BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING》 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
GB201315475D0 (en) | 2013-10-16 |
GB2520101B (en) | 2017-07-26 |
WO2014207480A2 (en) | 2014-12-31 |
WO2014207480A4 (en) | 2015-04-09 |
KR20160025023A (ko) | 2016-03-07 |
WO2014207480A3 (en) | 2015-03-05 |
EP3013965A2 (en) | 2016-05-04 |
MY183015A (en) | 2021-02-05 |
BR112015031531A2 (pt) | 2017-07-25 |
GB201411516D0 (en) | 2014-08-13 |
GB2520101A (en) | 2015-05-13 |
US20170067082A1 (en) | 2017-03-09 |
CA2915990A1 (en) | 2014-12-31 |
US10150974B2 (en) | 2018-12-11 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN101998997B (zh) | 醇的微生物制备方法 | |
CN103403155B (zh) | 新型酿酒酵母菌株 | |
CN103781912A (zh) | 一种发酵方法 | |
JPS6357039B2 (zh) | ||
KR20110139236A (ko) | 배양체 생존능력을 유지시키는 방법 | |
US20080085536A1 (en) | Production of Cellulose in Halophilic Photosynthetic Prokaryotes (Cyanobacteria) | |
CN102115766B (zh) | 微生物同步发酵正烷烃生产混合长链二元酸的方法 | |
AU2014326730A1 (en) | Production of ethanol and recycle water in a cellulosic fermentation process | |
Taherzadeh et al. | Bioethanol production processes | |
US7803601B2 (en) | Production and secretion of glucose in photosynthetic prokaryotes (cyanobacteria) | |
ES2954747T3 (es) | Proceso de fermentación | |
US20180334691A1 (en) | Two-stage continuous process for producing a solvent | |
US20130059354A1 (en) | Alkanol | |
CN105358701A (zh) | 溶剂生产 | |
JP5249106B2 (ja) | エタノールの連続発酵製造方法 | |
TWI797569B (zh) | 用於生產脂質的醱酵方法 | |
CN102051386A (zh) | 间歇式回流细胞高生产率发酵生产有机酸的方法 | |
US20080124767A1 (en) | Production and Secretion of Sucrose in Photosynthetic Prokaryotes (Cyanobacteria) | |
KR101496503B1 (ko) | 내부필터시스템이 구비된 생물반응기를 이용한 유산균의 고농도 배양 및 대사산물의 생산 방법 | |
CN101643753B (zh) | 一种木糖醇的制备方法 | |
JP5661673B2 (ja) | 多槽式菌体リサイクル発酵方式エタノール連続生産方法 | |
CN102757984A (zh) | 一种生物质发酵耦合渗透汽化分离生产丁醇的方法 | |
Fernández Naveira | Biofuels production (ethanol, butanol, hexanol) from renewable sources | |
Christensem et al. | A multichamber tower fermentor for continuous ethanol fermentation with a self-aggregating yeast mutant | |
CN114807243A (zh) | 一种酵母细胞超高浓度连续乙醇发酵生产的方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20160224 |
|
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |