CN103403155B - 新型酿酒酵母菌株 - Google Patents

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Abstract

描述一种用于产生酿酒酵母菌株的方法，这种酿酒酵母菌株具有被引入的编码木糖还原酶、木糖醇脱氢酶以及木酮糖激酶的基因并且具有改进的乙醇产量、改进的木糖转化率以及降低的木糖醇产量。该方法包括：在一种木糖浓度约15g/l-25g/l的培养基中以及在约28°C-32°C的温度下，以一种重复分批系列的方式培养这些细胞；并且此后在约28°C-32°C的温度下，在至少一个步骤中降低该木糖浓度以获得一种用于改进的木糖发酵、改进的乙醇产量以及降低的木糖醇产量的增加的选择压力；并且以所述的重复分批系列的方式继续培养这些细胞。此外，描述通过根据本发明的方法所获得的多种酿酒酵母菌株。

Description

新型酿酒酵母菌株
本发明技术领域
本发明涉及一种用于产生酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌株的方法，这种酿酒酵母菌株具有被引入的编码木糖还原酶、木糖醇脱氢酶以及木酮糖激酶的基因并且具有改进的乙醇产量、改进的木糖转化率以及降低的木糖醇产量。本发明另外涉及通过根据本发明的方法可获得的多种酿酒酵母菌株。
背景技术
关于使用石油作为汽车燃料的环境问题以及还有当今油井将来将被耗尽的危险已引起了关于使用石油的替代方案的深入研究。已发现乙醇是一种石油的良好替代物，因为它在很大程度上可以代替石油使用而不会引起内燃机的重大改变。现今可以在对发动机作非常小的调节或甚至在根本不对发动机作任何调节的情况下使用乙醇代替一些燃料。
酵母菌属（Saccharomyces）菌株广泛用于供酿造、蒸馏、烘烤以及不同的其他应用的工业中。鉴于酿酒酵母将糖（如葡萄糖和蔗糖）转化为生物质并且将这些糖发酵为乙醇的能力，酿酒酵母是工业应用中使用最广泛的微生物之一。鉴于酿酒酵母菌株相当迅速地将糖转化成乙醇的能力并且由于酿酒酵母与细菌和其他酵母相比对发酵抑制剂和乙醇具有更佳耐受性，酿酒酵母菌株被用于燃料工业中。
与细菌和若干个酵母种类不同，野生型酿酒酵母不能使用戊糖（如木糖和阿拉伯糖）作为碳源。酿酒酵母利用丰富碳源（如来自其他工艺的侧流和废料，如来自例如玉米和甘蔗渣的农业废料以及来自例如造纸的废料）生长的能力具有巨大的环境价值以及还有经济价值。农业废弃物包含相当大部分的半纤维素，这种半纤维素包含许多不同的糖单体。举例来说，除葡萄糖以外，这些糖单体还可以包括木糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖以及阿拉伯糖。木糖是含量最大的糖单体并且因此代表一种用于使用酵母制造乙醇的重要碳源，提供了巨大的经济和环境优点。
提供使用木糖作为碳源的能力的基因编码酶先前已被引入酿酒酵母中。EP1282686披露了具有被并入的针对酶类木糖还原酶、木糖醇脱氢酶以及木酮糖激酶的基因并且已经受特异性突变的重组酿酒酵母菌株。所述菌株具有将木质纤维素原料发酵为乙醇的能力。Ep1282686中所保藏的菌株是CBS102679（TMB3400，Taurus01）并且在现有技术中总体上被认为是有效的。由菌株CBS102679产生的乙醇已被认为与其他现有技术重组酵母相比是非常好的，但还产生所不希望的副产物木糖醇。因此，鉴于当今社会逐渐增加的环境问题，在本领域内仍需要提供具有甚至更佳乙醇产量、更佳木糖转化率以及更低木糖醇产量的新型酿酒酵母菌株。
发明概述
因此，本发明的目的是解决上述问题并且提供具有更佳木糖转化率、更佳乙醇产量以及更低副产物木糖醇产量的新颖酿酒酵母菌株，所述酿酒酵母菌株具有基本上仅使用木糖作为碳源来产生乙醇的能力。
根据本发明的一个第一方面，使用一种用于产生酿酒酵母菌株的方法来解决这一问题，这种酿酒酵母菌株具有被引入的编码木糖还原酶、木糖醇脱氢酶以及木酮糖激酶的基因，并且具有改进的乙醇产量、改进的木糖转化率以及降低的木糖醇产量，其中这些细胞要经受以下步骤：
a)在一种木糖浓度约15g/l-25g/l的培养基中以及在约28℃-32℃的温度下，以一种重复分批系列培养这些细胞，
b)在约28℃-32℃的温度下，在至少一个步骤中降低该木糖浓度以获得一种用于改进的木糖发酵、改进的乙醇产量以及降低的木糖醇产量的增加的选择压力，
c)以所述的重复分批系列的方式继续培养这些细胞。
根据本发明的一个实施例，步骤a)的该培养基包含15g/l-25g/l的木糖，优选地约20g/l的木糖。在另一个实施例中，该木糖浓度的降低步骤b)在2-5个步骤中进行到木糖浓度约1g/l-7g/l，优选地3g/l-5g/l。为了进一步改进对木糖的亲和力，进行木糖浓度的降低步骤b)。
重要步骤是维持生物反应器中的细胞浓度恒定。当已进化出改进的细胞时，这些改进的细胞可以以通过稀释率设定的特定生长速率更佳地利用底物，改进的结果是将形成更多个细胞。这意味着为保持选择压力，需要生长速率增加，生长速率增加是通过增加稀释率来获得的
在又一个实施例中，该方法另外包括步骤
d)在培养期间，例如在步骤b)或c)之后，将温度增加到35℃-45℃和/或施加紫外辐射。
温度的增加丰富了针对应力具有更高耐受性的细胞的数目。
木糖消耗能力可能被视为由两种组成部分构成，输入速率以及在何种浓度下可以有效地进行输入，即对木糖的亲和力。当木糖为唯一碳源时，输入速率与生长速率紧密相关，即木糖曲线降低的有多快。如果木糖曲线到达接近于零，即所有木糖均已被使用，那么木糖亲和力为良好的。对于有效的木糖转化能力，另外应将所输入的木糖的碳导入乙醇中而不是木糖醇中并且尽可能少的导向细胞形成。本发明的菌株出人意料地既具有改进的输入速率又具有改进的木糖亲和力。
在另一个实施例中，将改进的乙醇产量、改进的木糖转化率以及降低的木糖醇产量与以CBS102679（TMB3400，Taurus01）保藏的菌株相比。在另一个实施例中，如上述方法的步骤a)中所用的这些细胞为如所保藏的CBS102679的菌株的细胞。在步骤a)中用作起始材料的所述酿酒酵母细胞具有被引入的针对酶类木糖还原酶、木糖醇脱氢酶以及木酮糖激酶的基因，以使这种酵母能够发酵木糖。这些基因可以从可以分离这些基因的任何来源获得。举例来说，编码木糖还原酶、木糖醇脱氢酶的基因可以从树干毕赤酵母（Pichia stipitis）获得，而编码木酮糖激酶的基因可以从酿酒酵母获得。
在一个实施例中，该方法另外包括步骤
e)从步骤b)或从步骤c)，或从步骤d)选择具有木糖转化能力的细胞。
根据另一个实施例，在具有木糖作为基本上唯一碳源的一个琼脂板上或一种液体培养基中进行该选择。
在又一个实施例中，这些细胞的培养继续进行直到与至少前一代相比在所观察的代中基本上不再观察到表型变化。
在一个实施例中，该方法另外包括以下步骤：使步骤b)、c)或d)的这些细胞经受氧气有限的条件和/或紫外光处理。
本发明另外涉及一种保藏号为CBS128138的Taurus03酿酒酵母菌株。
在又一个实施例中，本发明还涉及一种保藏号为CBS128141的Taurus10酿酒酵母菌株
本说明书的所有菌株均已保藏在荷兰3584CT乌特勒支市乌普萨拉8号的真菌生物多样性中心（CBS）（Centraalbureau voor Schimmelcultures(CBS),Uppsalalaan8,3584CT Utrecht,the Netherlands）。
在此也提到的保藏号为CBS128138的酿酒酵母Taurus03已于2010年10月26日保藏。在此还提到的保藏号为CBS128139的酿酒酵母Taurus04、保藏号为CBS128140的酿酒酵母Taurus07已都于2010年10月26日保藏。酿酒酵母Taurus10CBS128141已于2010年11月2日保藏。
本发明的另一个实施例是通过本发明方法获得的一种菌株用于将木质纤维素原料发酵为乙醇的用途。所用的木质纤维素原料可以是可供使用的任何类别。实例为农业残余物，包括玉米秸秆和甘蔗渣；木材残余物，包括锯木厂和造纸厂丢弃物；以及城市用纸废弃物。
本发明的另一个实施例是通过本发明方法获得的一种菌株在同时糖化和发酵（simultaneous saccharification and fermentation，SSF）工艺中的用途。
附图简要说明
现将通过实例参考所附图式详细描述本发明。
图1：实例1中描述的在使用基本培养基的连续培养中在适应期间由稀释率反映的生长特性的改进。在第一部分（蓝线，起始于0.025稀释率，h-1）中使用木糖作为唯一碳源，而在第二部分（红线，起始于0.05稀释率，h-1）中将温度增加到35℃并且以增加的水平将甘蔗渣（绿线，起始于0稀释率，h-1）掺混到培养基中。
图2：实例2中描述的在使用基本培养基的反复摇瓶培养中在适应期间最大特定生长速率的改进。第一部分（菱形）具有20g/l的木糖而第二部分（方形）具有5g/l。在来自第10轮的第二部分中，展示系列D。
图3：图3.在使用基本培养基以及木糖作为唯一碳源的摇瓶培养中的木糖消耗（方形）以及乙醇（叉号）和细胞（菱形）形成。细胞浓度以650nm下的光学密度（OD）形式评估。图3a为Taurus02，图3b为Tarurus03，图3c为Taurus07，图3d为Taurus04，图3e为Taurus08，图3f为Taurus09，图3g为Taurus10。
图4：在使用基本培养基的厌氧生物反应器培养中的葡萄糖（方形）和木糖（三角形）消耗以及生物质（菱形）、乙醇（叉号）和木糖醇（星形）的形成。代表性培养一式两份展示。图4a为Taurus01，图4b为Tarurus03，图4c为Taurus09，图4d为Taurus10。
图5：在使用玉米芯液的厌氧摇瓶培养中由第一代木糖菌株（Taurus03（菱形）和Taurus09（三角形））进行的木糖消耗，分别与由这些菌株进化的第二代木糖菌株（Taurus04（方形）和Taurus10（叉号））相比较。
图6：在摇瓶培养中使用酿酒酵母Taurus03、Taurus04、Taurus07以及Taurus10的甘蔗渣水解产物的厌氧发酵。
图7：在菌株Taurus01、Taurus03、Taurus04、Taurus07、Taurus09以及Taurus10利用木糖生长期间对不同浓度的乙酸盐和HMF的耐受性。
优选实施方式的详细描述
当进行本发明的实验时，除非另外指明，否则使用常规微生物工艺。此类工艺为本领域普通技术人员已知的并且在文献中已有充分解释。
此外，本申请中使用的所有技术术语均具有普通技术人员通常所理解的含义。
在例如植物生物质中木糖丰富以及使用酵母（如酿酒酵母）利用木糖作为碳源产生乙醇的可能性已引起这一技术领域内的深入研究。然而，木糖转化率有时不良，从而导致不良的乙醇产量。此外，副产物木糖醇的产量已相当大。
本发明的诸位发明人已鉴于上述问题出人意料地开发出具有更有效的木糖转化以及因此更佳乙醇产量的改进的酿酒酵母菌株。此外，一种更低的副产物木糖醇产量是所希望的。
应注意，能够使用木糖作为基本上唯一碳源的菌株也能够利用其他糖生长。短语“基本上唯一碳源”的含义意味着还可以存在痕量的其他糖。可以存在葡萄糖并且它通常首先被酿酒酵母转化，因为它对酵母来说是优选的糖。此后，使用木糖作为碳源。
已使用已获专利的保藏号为CBS102679的称为XYLUSM125、TMB3400或Taurus01的酿酒酵母菌株实现了酿酒酵母的这些所希望的特征。在这一菌株中，已引入了编码提供使用木糖作为基本上唯一碳源的能力的酶类的基因。作为一个替代方案，根据本发明可以使用具有使用木糖作为基本上唯一碳源的能力的其他酿酒酵母菌株。本发明的这些菌株可以以工业菌株以及实验室菌株的形式执行功能，即使工业菌株为优选的。工业菌株与实验室菌株相比更不好确定，因为它具有每一染色体的若干个拷贝。因此，如已根据本发明进行的操作工业菌株与操作实验室菌株相比是一项更大的挑战。
根据本发明的具有改进的乙醇产量、改进的木糖转化率以及降低的木糖醇产量的菌株是使用非重组方法获得的。这意味着不利用重组DNA技术来获得具有改进的乙醇产量、改进的木糖转化率以及降低的木糖醇产量的菌株。然而，使用重组DNA技术来获得例如可以用作根据本发明的起始材料的菌株TMB3400（Taurus01）。根据本发明的重组DNA技术是指活体外操作遗传信息的多种技术，而非重组方法并不利用这种活体外操作。
根据本发明，已实现了所希望的特征，因为在酿酒酵母的培养中在特定条件期间突变被选择（通常在生长期间发生并且可能因紫外辐射而增加）并且富集，即定向进化/适应或进化工程。定向进化的程序可以划分成三个步骤：首先使突变发生，此后通过在培养中施加选择压力来选择所希望的性状，以及最后根据图谱特性筛选/表征所获得的菌株。
在正常生长期间出现突变，因为在DNA被复制并且转移到下一代中的复制过程期间在遗传密码中可能发生一些错误。突变发生的机率可以因某些化学品或紫外辐射而增加。这些突变可以改变细胞蛋白的特性，使得有机体存活的可能性增加或降低。
术语“选择”是指“适应”过程，在该过程中，具有改进的所希望的特征的细胞在群体中富集。这是通过在培养中通过设计生长条件使得所希望的特性对微生物的存活和性能有益来施加选择压力而实现的，这种选择压力可以选自大量不同的条件。至于本发明，选择压力可以通过使木糖作为基本上唯一碳源、使抑制剂存在或增加温度来实现。另外，通过培养模式实现不同的选择压力。温度增加可以使具有更高整体应力耐受性的细胞富集。非常重要的是选择和施加允许逐渐形成所希望的特性的适当选择压力。在相同适应中或在后续培养中，可以一起施加某些选择压力。典型地，根据本发明，可以在液体培养基中或在琼脂板上进行培养。在液体培养中，在适应进展期间改进的细胞的比例增加并且被视为混合群体的性能的改进，至于本发明，这种改进由改进的乙醇产量、改进的木糖转化率以及降低的木糖醇产量来反映。
重要的是，应在许多代期间继续进行适应，以允许出现适合的突变并且在细胞群体中富集。当在琼脂板上进行选择时，典型地在足以使得细胞具有生长并且形成菌落的能力的时间期间培育细胞。在琼脂板上出现的更大的菌落指示具有改进的在所施加的条件下生长的能力的细胞，相比较而言，更小的菌落显示较差的能力。
在本文中，短语“新一代”意味着如本领域普通技术人员所理解的细胞已分成两个新的细胞并且这两个新的细胞代表新一代。在本文中，细胞继续生长许多代并且直到与前几代相比在新一代中不再能观察到任何表型变化，即表型变化保持恒定。表型变化的实例为例如细胞的最大特定生长速率。这可以通过测量光学密度来测量。其他可以观察到的表型变化为例如乙醇生产率、木糖转化率以及副产物木糖醇的产量。当这些组成部分保持在恒定水平时，不再观察到表型变化。
此外，术语“筛选”是指一种以可比较方式将细胞的性能表征的过程。筛选方法应显示反映细胞的所希望特性的性能并且可以在琼脂板上或在液体培养基中进行。因此，可以识别具有改进的所希望特征的细胞并且用于其他特性的进一步表征。
因此，根据本发明，提供了一种用于产生酿酒酵母菌株的方法，这种酿酒酵母菌株具有被引入的编码木糖还原酶、木糖醇脱氢酶以及木酮糖激酶的基因并且具有改进的乙醇产量、改进的木糖转化率以及降低的木糖醇产量。
此外，提供了通过根据本发明的该方法可获得的多种酿酒酵母菌株。
下文为用于获得根据本发明的改进的酿酒酵母菌株的实例。所有工作均以菌株TMB3400（Taurus01）起始，该菌株先前已显示非常好的关于木糖转化能力的性能以及相当低的木糖醇产量（松德雷格（Sonderegger）等人，2006，哈恩-哈格达尔等人，2007）。然而，如先前所陈述，也可以使用其他酿酒酵母菌株，只要它具有发酵木糖的能力即可。通过本发明，已有可能产生关于木糖转化和乙醇产生甚至更有效的酿酒酵母菌株。还已观察到更低的副产物木糖醇产量。因此，如根据本发明所获得的菌株可以用于发酵不同的木质纤维材料或来自玉米或甘蔗渣的废料，这些材料除葡萄糖以外还包含相当大量的木糖。有待于用于此类发酵工艺中的更有效的菌株将具有巨大的经济价值和环境价值。
如在实验部分中将可见，本发明的菌株与现有技术菌株相比已显示出关于乙醇产生、木糖消耗、木糖醇产生以及抑制剂耐受性的优越性。
实例1
从Taurus01向Taurus02以及Taurus03的木糖转化能力的改进。
使用菌株Taurus01起始定向适应系列并且在一个生物反应器（1l中约750ml工作体积，瑞典贝拉奇生物技术公司（Belach Bioteknik AB,Sweden））中在连续培养中进行，这个生物反应器具有与根据威尔顿（Verduyn）所用相比具有2倍高痕量金属溶液以及0.1ml/l的PEG P2000作为消泡剂（在生物反应器培养中）的基本培养基（威尔顿等人，1992）。用2M NaOH将pH值控制在5.0并且将搅拌器速度设定在350rpm。为起始培养，将50ml具有20g/l木糖和20g/l葡萄糖的接种物（在250ml振荡培养瓶（baffled shake flask）中，培育24h-36h，30℃，在180rpm下振荡）添加到生物反应器（具有基本培养基以及20g/l木糖和20g/l葡萄糖，总体积800ml，无气体流入）中。进行培养持续15h-20h，然后起始连续模式，其中使仅具有20g/l木糖作为碳源的培养基流入并且以一根溢流管测定流出量。在培养结束时测定精确培养物体积并且为740ml-780ml。在每一工作日测量650nm下的光学密度（OD）作为细胞密度的一个量度。定期获取用于测量细胞外代谢物的样本（也来自培养基烧瓶）以及有待冷冻保存（添加1ml细胞悬浮液到0.5ml无菌60%甘油中，储存在-80℃下）的细胞的等分试样。使用HPLC（戴安公司（Dionex），Ultimatum3000，在35℃下折射率检测（RI detection），在210nm下紫外检测，在45℃下的来自伯乐公司（BioRad）的管柱；AminexHPX-87H和30mm x4.6mm阳离子-H麦克洛-加德（micro-guard），洗脱剂5mM H2SO4，在0.6ml/min的流速下）测定代谢物。使用一个显微镜用眼睛定期检查培养物，发现不存在污染。
适应的第一部分是在30oC以及35ml/min的气流下进行。目的是将OD保持在2-2.5的值。OD水平增加指示生长特性的改进并且因此可以增加流速以施加更高的选择压力。相对应地，如果见到OD水平降低，那么选择压力过高并且因此需要降低流速。因此，流速增加（或根据稀释率重新计算）是细胞性能增加的一个量度。15代之后，将反应器中的温度增加到35℃-45℃持续24h，并且从培养物中回收细胞，保存冷冻的等分试样并且将一个样本在一个木糖琼脂板（20g/l木糖、20g/l蛋白胨、10g/l酵母提取物以及20g/l琼脂）上划线。将该温度处理后所获得的一个菌株命名为Taurus02。使用来自琼脂板的细胞起始新的连续培养。进行培养持续77代，在这期间可见稀释率增加（图1）并且将最后的菌株命名为Taurus03。因此，这一菌株属于第一代木糖菌株。
实例2
使用反复摇瓶培养的木糖转化能力的改进
使用从TMB3400（Taurus01）发展成的Taurus02菌株作为使用重复分批培养的定向适应方案的起始菌株。在摇瓶培养中，在30℃以及180rpm的搅拌下在具有50ml基本木糖培养基（威尔顿等人，1992）的100ml烧瓶中进行培养，该基本木糖培养基具有pH5.5以及与根据威尔顿所用相比2倍高痕量的金属溶液。适应方案的第一部分是在培养基中使用20g/l木糖进行。进行每一次培养直到当生长开始停止时650nm下的光学密度（OD）达到1.8-3的值，接着将细胞的等分试样转移到下一轮的具有新鲜培养基的烧瓶中，得到0.07的起始OD。在第7轮中，性能被改进到一定程度，使得第8轮的起始OD降低到0.06，第9-10轮为0.05并且第11-13轮为约0.02。总共进行13次培养，在适应方案期间允许73代并且将这些轮中7轮的细胞冷冻保存（将1ml细胞悬浮液添加到0.5ml无菌60%甘油中，储存在-80℃下）。在这些培养之后测量OD并且由这些OD计算最大特定生长速率（图2）并且测量每一次培养在开始时以及在转移到下一轮时的细胞外代谢物。使用HPLC（戴安公司，Ultimatum3000，在35℃下折射率检测，在210nm下紫外检测，在45℃下的来自伯乐公司的管柱；AminexHPX-87H和30mm x4.6mm阳离子-H麦克洛-加德，洗脱剂5mMH2SO4，在0.6ml/min的流速下）测定代谢物，并且这些结果显示转移时木糖水平相当高，约12g/l-16g/l，并且因此对下一部分进行该适应。将最后的菌株命名为Taurus09并且因此与Taurus03一起为另一种第一代木糖菌株。这一菌株在适应条件下具有改进约三倍的最大特定生长速率（图2）。
根据菌株Taurus09在具有5g/l木糖的培养基中差的性能，与在独立培养中均选择为10g/l相比，在适应的第二部分中将木糖浓度选择为5g/l。在这一适应中，在OD2.8-3下进行细胞转移并且起始OD为0.1（除了起始OD为0.01的最初四轮）并且如前所述追踪OD和代谢物。在对应于47代的9轮期间继续进行适应。因为在此时看到的特定生长速率改进有限（图2），所以将培养物分成四个部分。两个部分用紫外光照射以增加突变数，并且两个部分不经任何处理就转移到下一轮中。对于紫外处理，使用具有基本木糖培养基的琼脂板，并且将细胞铺展于4个经过干燥的琼脂板上。使用来自紫外线产品有限公司（Ultra-Violet Products Ltd.）的一个TFM-26V、P/N95-0422-02、25瓦高效紫外透照器使两个板暴露于紫外光，其中波长为302nm，设定于高强度，持续60秒并且两个板持续90秒。立即从这些板中收集细胞并且用于起始适应系列中的新的培养。将暴露60秒与90秒的细胞一起用于新的摇瓶培养中。将紫外处理和未经处理的细胞均用于在正常条件和氧气有限的条件下起始培养，参见下表。
这些氧气有限的条件是通过使用一个特殊摇瓶来实现的。这种氧气有限的烧瓶是由一个具有多个档板以及两个臂的250ml摇瓶构成。一个空气过滤器（来自伊孚森公司（INFORS HT）的过滤器21978）与这些臂之一连接，并且一根在外部末端具有一个注射器的橡胶管与另一个臂连接用于取样。所有开口均以石蜡膜密封。将这些适应系列进行14-15轮，除了在第二轮中细胞死亡的系列B。在这一最后部分期间所获得的代的数目为系列A83，系列C68以及系列D89。在适应继续进行期间定期冷冻保存细胞（如上文所描述制备）。系列D的最后的菌株显示最佳性能并且被选择为第二代木糖菌株并且命名为Taurus10。这一菌株在适应中在低木糖水平下具有改进约5倍的最大特定生长速率（图2）。
实例3
在不同条件下菌株关于木糖发酵能力的表征
a)使用基本培养基并且木糖作为唯一碳源的摇瓶培养
所应用的第一类型的表征是使用基本培养基并且仅木糖作为碳源的摇瓶培养。在100ml烧瓶中的50ml培养基中进行培养并且通过添加来自冷冻的储备液的细胞起始，获得0.01的OD。在30℃以及180rpm（这在这些烧瓶中产生半好氧条件）下培育培养物，并且追踪细胞和代谢物浓度。
进行这种类型表征的菌株：
·   Taurus02
·   Taurus03
·   Taurus07
·   Taurus08
·   Taurus09
·   Taurus l0
来自两种类型的定向进化方案的第一代木糖菌株（Taurus03和Taurus09）已实现了更快的最大特定生长速率，而第二代木糖菌株仅稍有改进（表1，图3）。这些菌株具有向乙醇产生偏移的代谢类型并且因此形成更少的细胞。因此，可以推断出，另外考虑到所有改进的菌株均可以使用更大部分的木糖，木糖发酵更有效。在这方面的最佳菌株Taurus10可以使用超过90%的木糖并且因此这一菌株产生最高乙醇水平4.2g/l。在抑制剂耐受性菌株Taurus07与Taurus08之间未发现木糖发酵差异。
表1.在使用基本培养基并且木糖作为唯一碳源的摇瓶培养期间的生长速率、产量、木糖的残余水平以及最大乙醇浓度。Taurus02、Taurus07、Taurus10以一式两份培养形式进行，Taurus03为一式三份，并且这些培养的结果以一个范围的形式给出。
所有菌株均以低水平（每消耗一克木糖<0.06g）形成木糖醇因此，Taurusl10显示出非常好的醇产量以及木糖转化率。另外，产生的木糖醇相当低。
b)使用矿质培养基并且葡萄糖和木糖作为碳源的厌氧生物反应器培 养
在一种工业设置中，厌氧性能非常重要并且因此在此类型的培养中进行表征。因为细胞不能以厌氧方式仅仅利用木糖作为碳源来生长（图4），所以使用葡萄糖与木糖的混合物。
通过将100μl来自储备培养物的冷冻细胞添加到包含20g/l葡萄糖和20g/l木糖的100ml基本培养基中来制备预培养物。接着在30℃下以好氧方式培育培养物48h，然后对生物反应器进行接种。将生物反应器中用于厌氧培养的培养基补充以0.1ml/l消泡剂（聚丙二醇P2000）、10mg/l麦角固醇以及0.42g/l吐温80（Tween80）。使用工作体积为两升的生物反应器（瑞典贝拉奇生物技术公司）并且通过以0.4l/min将氮气通过发酵器来实现厌氧条件。将温度控制在30℃，用2M NaOH使pH值为5.0，并且搅拌器速度为500rpm。接着添加来自预培养物的细胞，以在生物反应器中达到0.01的起始OD650。在发酵过程期间定期测量OD与干细胞重量两者并且收集细胞外代谢物样本。每一菌株进行一式两份培养，这些培养得到非常类似的结果。
进行这种类型表征的菌株：
·   Taurus01
·   Taurus03
·   Taurus09
·   Taurus l0
还是在厌氧条件期间，对于所有改进的菌株来说木糖发酵均更有效（表2，图4）。两者均可见木糖消耗速率增加并且所有木糖均可以被本发明改进的菌株消耗。特别是，菌株Taurus10显示快速消耗。伴随由这些菌株实现的改进的乙醇形成还可见降低的副产物木糖醇的形成。对于Taurus03，木糖醇产量降低多达40%（图4）。
表2.在厌氧培养中在具有木糖和葡萄糖作为碳源的基本培养基上的产量和木糖消耗。给出一式两份培养的最大偏差。
c)在摇瓶培养中玉米芯液的厌氧发酵
关于表征中的下一步骤，通过研究在玉米芯水解产物中的发酵来评估实际工业底物中的性能。通过以SO2形式添加的稀酸预处理并且由瑞典SEKAB E-技术公司制成玉米芯。过滤预处理的浆料以获得液体部分。
在预培养中，如b中所描述使细胞在具有葡萄糖和木糖的基本培养基上生长，24h后将一些玉米芯液补充到摇瓶中并且使其再培育18h。通过离心收集细胞。为进行发酵，使用补充有0.5g/l(NH4)2HPO4的玉米芯液作为培养基并且将pH值设定为6.0。添加从预培养物中收集（通过离心）的细胞，得到每升3g干重的近似起始细胞密度。使用50ml培养基在100ml摇瓶中在30℃以及180rpm下进行培养物的培育，并且通过使用以甘油填充的气塞获得厌氧条件。在0h、2h、4h、6h、8h、24h、48h、72h以及96h后获取代谢物样本。进行这种类型表征的菌株：
·   Taurus03
·   Taurus04
·   Taurus09
·   Taurus l0
表3和图5中的数据清楚地展示第二代木糖菌株Taurus04和Taurus10在96h后与它们各自的亲本菌株Taurus03和Taurus09相比产生更高的最终乙醇浓度和木糖转化率。尽管木糖转化率大，但副产物木糖醇的产量保持在低水平。
表3.在利用玉米芯液的厌氧摇瓶培养中的产物产量、木糖消耗以及最终乙醇水平。进行单一培养。
d)利用玉米芯和桦树浆料的SSF（同时糖化和发酵）实验
乙醇产生的另一种典型工艺为SSF工艺。在这一工艺中，水解酶与酵母一起添加，以同时实现预处理的浆液中的纤维素的分解以及单体糖的发酵。在我们的工艺中，我们已使用底物和工艺步骤来尽可能地模拟一种工业情形。在通气的分批进料培养物中进行细胞繁殖。用于繁殖的预培养是在150ml摇瓶中在具有20g/l葡萄糖和20g/l木糖的50ml基本培养基（pH6.0）中进行。以一小部分（100μl冷冻的细胞）起始该预培养并且在一个旋转振荡器中在30℃下进行最佳24h（18h-36h）。在该批次中，培养基（500ml）包含50g/l糖蜜以及23.5g/l(NH4)2SO4、3.0g/l KH2PO4、2.25g/lMgSO4-7H2O以及99g/l生物素、360ppm维他忽布（用于抑制细菌的蛇麻子提取物）以及1.2ml/l消泡剂（基于硅，诺普科ENA-309，诺普科纸业技术公司）。
添加整个预培养物以起始培养（在莱布孚森生物反应器中，伊孚森公司），这一培养是在以下条件下进行：以1vvm通气，用3M NaOH将pH值调节到5.0，并且搅拌速度为700。进行该批次直到糖被用完（约8h-10h）并且接着起始进料。在即将进行的SSF中使用包含材料的水解产物的进料（pH值调节到5，稀释到对应于7.5%WIS），并且包括糖蜜，从而产生75g/l的总己糖浓度。当分批进料阶段起始时，将搅拌器速度增加到1000rpm并且通气增加到以最终体积体计1.0vvm。进料以0.1h-1的恒定速率增加并且进行20h，从而产生1.5l的最终体积。通过离心（在1800×g下8min）收集细胞并且再悬浮于无菌0.9%NaCl中。
利用7.5%WIS并且补充有0.5g/l(NH4)2HPO4、125ppm维他忽布以及0.4ml/l消泡剂（与繁殖中的相同）的已预处理的木质纤维素材料的浆料（pH5.0，用NaOH调节）进行SSF部分（总培养基1.5kg）。添加已再悬浮于0.9%NaCl中的细胞，得到每升3g干重的最初细胞浓度，并且添加酶（NS-22074或Cellic C-tec2，诺维信（Novozymes）），得到5FPU/g WIS以起始该工艺。将发酵器（不含档板，莱布孚森）控制在35oC，用3M NaOH将pH值调节到5.0，搅拌器速度为约300rpm-400rpm，并且所有入口均被封闭而穿过冷凝器的出口打开。至少在以下时间获取用于代谢物分析的样本：0h、2h、4h、6h、8h、24h、48h、72h以及96h。
进行这种类型表征的菌株：
·   Taurus01
·   Taurus03
·   Taurus04
·   Taurus10
在利用7.5%WIS的玉米芯浆料（在部分c)中所描述的全部浆料）的SSF工艺中，与已知的Taurus01相比，同样清楚地可见在此类工艺中也可见本发明菌株的改进的木糖消耗能力（表4）。此外，也如在其他类型的表征中所见，木糖醇的副产物形成降低（图5）。
表4.在利用7.5%WIS的玉米芯浆料以及5FPU/g WIS的纤维素降解酶的SSF实验中的木糖消耗和木糖醇形成。进行一式两份培养并且追踪96h
SSF表征也是使用另一种类型的材料桦树来进行，桦树是一种木糖含量高的木质纤维材料。将桦树木屑用稀酸（约1%SO2，190℃，并且停留时间为5min，在SEKAB E-技术公司进行）预处理。使预处理浆料在7.5%WIS下运作，并且在这种材料情况下也可见改进的木糖消耗。
e)在摇瓶培养中甘蔗渣水解产物的厌氧发酵
还在甘蔗渣水解产物的发酵中研究在实际工业底物中的性能。
对于预培养，将100μl来自储备培养物的冷冻的细胞添加到具有20g/l葡萄糖和20g/l木糖的100ml基本培养基中。将培养物在30℃下以好氧方式培育并且24h后补充一些甘蔗渣水解产物到摇瓶中并且使其再培育6,5h。通过离心收集细胞。对于发酵测试，将不同浓度的甘蔗渣水解产物（20%、50%以及75%）补充以酵母提取物（10g/l）并且将pH值设定到6.0。添加从预培养物中收集的细胞，得到每升3g干重的近似起始细胞密度。使用50ml培养基在100ml摇瓶中在30℃以及180rpm下进行发酵测试，并且通过使用以甘油填充的气塞获得厌氧条件。在该工艺期间追踪20%水解产物发酵的OD并且在650nm下测量。
进行这种类型表征的菌株：
·   Taurus03
·   Taurus04
·   Taurus07
·   Taurus10
表5、表6和表7以及图6展示了第二代木糖菌株。
Taurus04和Taurus07与它们的亲本菌株Taurus03相比生长得更快并且提供更高的乙醇产量、更高的木糖转化率以及更少的木糖醇形成。此外，还比较从亲本菌株Taurus09获得的Taurus10。尽管木糖转化率大，但副产物木糖醇的产量在所有情况下均保持在低水平。当水解产物稀释到20%时，在所有情况下木糖转化率均高于99%，参见图6。
表5.在利用20%甘蔗渣水解产物的厌氧摇瓶培养中的乙醇产量、木糖消耗以及最终乙醇浓度。进行单一培养。
表6.在利用50%甘蔗渣水解产物的厌氧摇瓶培养中的乙醇产量、木糖消耗以及最终乙醇浓度。进行单一培养。
表7.在利用75%甘蔗渣水解产物的厌氧摇瓶培养中的乙醇产量、木糖消耗以及最终乙醇浓度。进行单一培养。
a)在利用木糖生长期间菌株Taurus01、Taurus03、Taurus04、Taurus07 、Taurus09以及Taurus10对乙酸盐和HMF的耐受性
实验细节：
制备50g/l或100g/l并且pH值为5.0的木糖培养基，该培养基包含10g/l酵母提取物、100mM邻苯二甲酸钾以及不同水平的乙酸盐和HMF。添加呈乙酸钠形式的乙酸盐，产生0g/l、4g/l、7g/l或10g/l（零、低、中以及高）的乙酸水平。添加0g/l、2g/l或5g/l（零、低以及高）的HMF。将所有化合物均溶解于一定量的水中，调节pH值，然后稀释到最终体积并且将溶液过滤灭菌。对无菌培养基测量pH值并且该pH值介于4.94-5.15之间。所有组合均产生24种不同类型的培养基。将培养基标记为针对50g/l木糖的1-12以及针对100g/l木糖的13-24。将这些乙酸盐水平分为三组针对零、低、中以及高水平分别编号为1-3、4-6、7-9、10-12（并且针对高木糖作相应的编号）。在三组中的每一组内，将HMF水平从零增加到低和高（例如1、2、3）。以上所述可见于图7中。然而，该图不展示不存在HMF或乙酸盐浓度时的情况。此外，测试11和12的图未展示在图7中，因为对于菌株来说环境毒性过大。
使用YPDX培养基进行接种物培养并且生长约24h。通过离心收集细胞并且再悬浮于无菌mQ水中。
测定生物质浓度，并且通过用无菌mQ水稀释来制备每升约3g干重的细胞悬浮液。在生物栅（BioScreen）（芬兰生长曲线公司（Growth CurvesOY,Finland））中在30℃下在连续振荡下，用170μl培养基和30μl细胞悬浮液一式三份进行发酵持续72h，产生每升0.46g干重的起始细胞浓度。该生物栅的条件为半好氧的。在培养结束时，将来自一式三份培养物的培养基混合并且过滤用于HPLC分析（在伯乐HPX87H柱上），以便测定发酵产物、HMF、乙酸盐以及木糖。
结果：
测定这些菌株的木糖消耗、乙醇产量以及生长特性，参见图7。尽管这个特别的菌株在其产生方法期间还没适应特异性抑制剂，但Taurus10很好地处理这些抑制剂的存在。这是本发明的菌株的一个另外的出人意料的特征。

Claims (8)

1.一种具有改进的乙醇产量、改进的木糖转化率以及降低的木糖醇产量的酿酒酵母菌株，其中所述菌株是保藏号为CBS128141的Taurus10。
2.一种根据权利要求1所述的菌株的用途，该菌株用于将木质纤维原料发酵为乙醇。
3.根据权利要求1所述的菌株的用途，用于发酵玉米芯水解产物或甘蔗渣水解产物。
4.根据权利要求2所述的用途，用于发酵玉米芯水解产物或甘蔗渣水解产物。
5.根据权利要求3所述的用途，其中所述甘蔗渣水解物的浓度是20％、50％或75％。
6.根据权利要求4所述的用途，其中所述甘蔗渣水解物的浓度是20％、50％或75％。
7.一种根据权利要求1所述的菌株的用途，该菌株用于同时糖化和发酵(SSF)工艺中。
8.根据权利要求7所述的用途，用于玉米芯浆料或桦树浆料的发酵。
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