CN112877273B - 一种分解半乳糖、甘露糖等杂糖的酵母菌 - Google Patents

Abstract

本公开一种高效分解杂糖的菌种，所述菌种为酿酒酵母，经中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCCNo.20692。本公开还涉及一种木糖的制备方法，将上述菌种接种到造纸废液中得到杂糖含量降低的溶液。本公开提供了一种泼辣、耐高渗透压的菌种，其对半乳糖和甘露糖等杂糖有较强发酵能力，而且对复杂料液有较强的适应能力；此外发酵法提高木糖纯度，属于木糖行业内的首例。

Description

一种分解半乳糖、甘露糖等杂糖的酵母菌

技术领域

本公开涉及生物技术领域，尤其涉及一种高效分解半乳糖、甘露糖糖等杂糖的酵母菌及其用途。

背景技术

木糖在我国已有40多年的生产历史，经几代人的共同努力，生产规模不断扩大，技术上达到国际领先水平，我国木糖生产能力已超过2.6万吨，是世界木糖生产和出口大国。我国生产木糖的主要原料为玉米芯，甘蔗渣等，主要利用其中的半纤维素。玉米芯中半纤维素(多缩戊糖)占35％-40％,木质素占17-20％,纤维素32-36％，其次还含有少量的灰分等,其中多缩戊糖的主要成分为木聚糖。玉米芯是制造木糖的重要原料之一，其在酸性条件下水解成木糖，之后加氢还原生成木糖醇。在生产过程中产生大量的废渣和酸性水。

阔叶木是一种资源丰富的可再生资源，制浆造纸每年都要消耗大量的阔叶木，除纤维素以纸浆的形式被有效利用外，占到质量分数20％-25％的半纤维素大部分以木片水解液形式与制浆黑液混合进入到碱回收系统被烧掉，半纤维素的热值仅仅是木质素的一半，浓缩燃烧时极易结垢，造成资源和能源浪费。把半纤维素水解后(以后称为水解液)除去木质素和其他杂质，木糖含量小于70％，木糖含量相比于玉米芯产生的水解液小许多(玉米芯水解液中木糖纯度一般75％左右)，不利于结晶，达不到木糖工业化生产的工艺要求。

水解液主要成分是：木糖约62％、葡萄糖约6.5％、半乳糖和鼠李糖约14.5％、阿拉伯糖约4％、甘露糖约8％，另外还有其他杂糖和水解不彻底的一些二糖三糖、盐类、还有有机酸、醛类、酚类等其他副产物。特别是其中的有机酸，糠醛含量较高。

为了达到工业生产要求必须提高水解液里的木糖含量，也就是说水解液里的除木糖以外的其他杂糖含量越低越好，葡萄糖很容易通过发酵去除，而半乳糖、甘露糖、鼠李糖较难通过发酵除去，再加上料液的成分比较复杂，尤其是还有大量的乙酸、糠醛、酚类等料液质量较差，抑制酵母活性的物质较多，严重影响发酵的正常进行。

现在一般采用色谱分离的方法，去除里面其他的杂糖，主要是多糖及少量单糖，而且只截取所需要的木糖组分。另外，这种分离方法往往设备投资较大，况且色谱分离木糖方面的技术本身目前仍然不太成熟，特别是目前的截取分离技术中，还未有成熟的用于工业生产的能够有效将半乳糖、甘露糖与木糖分离的色谱技术。分离木糖的树脂的价格也较高，此外，分离过程中其他组分中也存在木糖，造成木糖的损失，极大的降低了木糖的收率。

现有的发酵技术对半乳糖和甘露糖的发酵研究的较少，尤其是在复杂料液中很多微生物无法存活或者活性降低，导致这两种糖的发酵更加困难。

发明内容

本公开提供了一种高效分解杂糖的菌种，所述菌种为酿酒酵母，经中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCCNo.20692，所述杂糖为半乳糖、甘露糖、葡萄糖、鼠李糖中的一种或多种。

本公开还提供了一种上述菌种的驯化方法，包括以下步骤：

(1)菌株活化：取酿酒酵母接种并扩大培养；

(2)将菌种在含有3-5质量％净化液的麦芽汁培养基平板上画线培养，直到长出菌落，待菌落形成，挑选菌落饱满光滑的独立菌株分别接种活化并扩大培养；

(3)将所得菌株分别发酵并检测发酵产物，挑选其中耐高渗透压的菌株；

(4)将步骤(3)所得耐高渗透压的菌株接种到含有6-10质量％净化液的麦芽汁培养基平板上画线培养，直到长出菌落，待菌落形成，挑选菌落饱满光滑的独立菌株分别接种活化并扩大培养；

(5)将步骤(4)所得耐高渗透压的菌株接种到含有11-20质量％净化液的麦芽汁培养基平板上画线培养，直到长出菌落，待菌落形成，挑选菌落饱满光滑的独立菌株分别接种活化并扩大培养；

(6)将所得菌株分别发酵并检测发酵产物，挑选其中泼辣、耐高渗透压的菌株，编号为TY-1。

在一个优选的实施方式中，将木片预水解，然后加入硫酸进行连续高压酸水解，得到水解液；然后过滤除去木质素，中和、脱色、离子交换、浓缩后，得到净化液。所述净化液可用于发酵。

在一个优选的实施方式中，步骤(1)中所述接种是在含5质量％麦芽汁的麦芽汁培养基中进行的。

在一个优选的实施方式中，步骤(2)中所述接种是在含6-10质量％麦芽汁，3-5质量％净化液，净化液与麦芽汁配比1:2，0.7质量％玉米浆粉，pH5.6的培养基中进行的。

在一个优选的实施方式中，步骤(4)中所述接种是在含3-5质量％麦芽汁，6-10质量％净化液，净化液与麦芽汁配比2:1，0.7质量％玉米浆粉，pH5.6的培养基中进行的。

在一个优选的实施方式中，步骤(5)中所述接种是在含有11-20质量％净化液，0.7质量％玉米浆粉，pH5.6的培养基中进行的。

本公开还提供了一种所述菌种在利用造纸废液发酵制备木糖中的用途。

本公开还提供了一种木糖的制备方法，包括以下步骤：

(1)将木片预水解，加入硫酸，调节pH至1.3-1.5之间，水解温度为130-160℃，得到水解液，过滤除去木质素；

(2)将(1)所得的液体转移至中和罐中，添加粉末碳酸钙至pH2.8-3.2之间；

(3)中和、离子交换、浓缩，得到净化液；

(4)向所述净化液中加入玉米浆粉，添加氢氧化钠调节pH至5.5-6.0；

(5)接种权利要求1所述的菌种，在温度28℃，180rpm摇床里发酵20-28小时得到木糖含量升高的溶液。

在一个优选的实施方式中，相比于水解液的总量，所述硫酸的添加量为0.5-1.0质量％。

在一个优选的实施方式中，相比于水解液的总量，所述粉末碳酸钙的添加量为1.0-2.0质量％。

在一个优选的实施方式中，相比于水解液的总量，所述玉米浆粉的添加量为0.4-0.7质量％。

在一个优选的实施方式中，所述脱色是通过活性炭进行的。

在一个优选的实施方式中，所述离子交换是通过离子交换树脂进行的。优选地，所述离子交换树脂使用阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。

在一个优选的实施方式中，所述浓缩是通过加热蒸发进行的。优选地，所述浓缩使用多效蒸发器进行。

有益效果

本公开通过菌种发酵将复杂料液中的半乳糖、甘露糖、葡萄糖、鼠李糖等杂糖转化分解，提高了木糖的收率，有效地减少了发酵过程中代谢物的产生及其对产物合成的阻碍作用；避免了使用色谱分离木糖，减少了分离树脂及分离设备的投入，降低了生产成本，提供了木糖生产和制备木糖醇原料的新途径。

本公开提供了一种泼辣、耐高渗透压的菌种，其对半乳糖和甘露糖等杂糖有较强发酵能力的菌株，而且对复杂料液有较强的适应能力。

本公开首次通过使用发酵法来提高发酵液中的木糖纯度，是木糖行业内的首例。

具体实施方式

下面结合实施方式对本公开作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于解释相关内容，而非对本公开的限定。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本公开中的实施方式及实施方式中的特征可以相互组合。下面将结合实施方式来详细说明本公开。

实施例

实施例1酿酒酵母的驯化

驯化酵母的获得过程，驯化过程其实也是一种筛选过程，菌种驯化一般是指通过人工措施使微生物逐步适应某一条件，而定向选育微生物的方法。通过驯化可以取得具有较高耐受力及活动能力的菌株。

a.菌株活化，取市售酿酒酵母(购自安琪酵母股份有限公司，货号80000040)一株接种到装有5ml麦芽汁培养基(120℃，20分钟高温杀菌，麦芽汁浓度5质量％，pH5.6)的小试管里，在生化培养箱里培养24小时(培养温度28℃)；从活化好的小试管里取1m l菌液接种到装有9ml麦芽汁培养基(120℃，20分钟高温杀菌，麦芽汁浓度5质量％，pH5.6)的大试管里，放在生化培养箱里培养12小时(培养温度28℃)；

b.将培养好的菌种在麦芽汁平板上划线培养(培养基含6.6质量％麦芽汁，3.3质量％净化液，0.7质量％玉米浆粉，pH5.6，120℃灭菌20分钟)培养基中，放在28℃生化培养箱中培养，直到长出菌落，待菌落形成；

c.在斜面上挑选菌落饱满光滑独立菌株活化(活化方法按照a、b步骤进行，但是培养基配方按照含6.6质量％净化液，3.3质量％麦芽汁，0.7质量％玉米浆粉，pH5.6，120℃灭菌20分钟)，再接到麦芽汁斜面(6.6质量％净化液、3.3％麦芽汁，0.7质量％玉米浆粉，pH5.6)培养基中，放在28℃生化培养箱中培养，直到长出菌落，待菌落形成：

d.再在斜面上挑选菌落饱满光滑独立菌株；

e.选择d中耐高渗透压的菌株活化(活化方法按照a步骤进行，但是培养基配方按照含11质量％净化液，0.7质量％玉米浆粉，pH5.6，120℃灭菌20分钟)，再接到斜面(11质量％净化液，0.7质量％玉米浆粉，用氢氧化钠调整pH至5.6)培养基中，放在28℃生化培养箱中培养，直到长出菌落，待菌落形成挑选菌落饱满光滑独立菌株1、2、3、4、5株分别接种到5只编号为1、2、3、4、5的5ml试管里活化、扩培(培养基配方:净化液17质量％，玉米浆粉0.7质量％，氢氧化钠调整pH5.6)，按1:10扩培比例逐级扩大培养直到100ml；

f.然后发酵20-28小时，进行高效液相色谱检测，挑选其中杂糖含量较低、木糖含量较高的培养液中的菌株。经过多次反复试验选择出泼辣、耐高渗透压的菌株备用。菌株编号：TY-1。

实施例2木糖的制备

(1)将木片预水解，加入硫酸进行连续高压酸水解，硫酸的添加量为预水解液以pH值在1.3-1.5之间，水解温度为130-160℃，不需要额外加热，得到水解液，过滤除去木质素；

(2)将(1)得到的液体转移至中和罐添加粉末碳酸钙中和至pH2.8-3.2；

(3)中和、离子交换、浓缩，得到净化液；

(4)接种实施例1筛选得到的泼辣、耐高渗透压、对半乳糖和甘露糖等杂糖有较强发酵能力的菌株；

(5)发酵后经离子交换、浓缩、结晶分离得到木糖。

实施例3菌株对比实验

取净化液68ml，加入4.2克玉米浆粉，加入自来水使净化液终含量为17％，用氢氧化钠调节pH至5.5-6.0，分装到4个250ml三角烧瓶里，每瓶装入100ml，分别加入10ml扩培啤酒酵母(含有0.02克啤酒酵母)、0.02克清真酵母、0.02克英联玛丽酵母、10ml本公开驯化的扩培酿酒酵母(以下简称为驯化酵母，含有0.02克驯化酵母)，依次编号1、2、3、4；将上述四个三角烧瓶置于28℃，180rpm摇床条件下发酵，分别在12h、24h时进行高效液相色谱检测。

高效液相色谱条件为：高效液相色谱仪为岛津U3000(购自岛津(中国)有限公司)，色谱柱为铅离子交换色谱柱(购自昭和电工科学仪器上海有限公司)，色谱柱温为75℃，检测器为示差折光检测器(购自日本岛津公司)，流动相为双蒸水，流速0.6ml/min，每次进样量为20μl。

结果参见下表1。

表1啤酒酵母、清真酵母、英联玛丽和本公开的驯化酵母发酵在发酵12小时和24小时净化液中各成分含量。

从表1中数据可以看出，四种酵母经12小时的发酵后，葡萄糖有较大幅度的降低，特别是3号英联酵母和本公开酵母，葡萄糖已降为0，24小时后，各样品中已不含葡萄糖，说明各类酵母在该复杂料液中对葡萄糖都有明显的发酵效果。但是葡萄糖在原料液单糖中的占比最少，仅为6.36％。，葡萄糖的发酵不足以有效提高木糖纯度，后续结晶仍很困难。24小时的数据表明，甘露糖有一定程度的降低，其中本公开酵母对甘露糖的降低最为明显。从半乳糖的变化数据看，其他三种较有代表性的酵母在发酵半乳糖方面，没有表现出明显的效果，只有较低幅度的降低。本公开酵母对于半乳糖降低幅度非常明显。半乳糖项的含量由最初的13.61％降低至4.48％。从半乳糖项及甘露糖项的数据综合来看，本公开酵母在该复杂料液中，对该两种糖发酵效果显著，而其他三种代表性的酵母在复杂料液中发酵困难，甘露糖及半乳糖的降低有限，很难达到使料液中木糖结晶的纯度。从木糖的最终纯度看，本公开专利纯度达到80.49％，远优于其他三个酵母，从后续结晶实验及实际生产中明显发现，该提纯后的料液，结晶十分容易，且所得晶粒饱满、规则、成型较好，木糖及母液也易于分离，木糖收率较高，母液中残余木糖较少，结晶损失少，经济性好。24小时之后的发酵数据我们未列出，因随着发酵的持续，副产物的产生逐渐不利于发酵进行。专利中也对比了过滤效果，从实际情况看，本公开酵母较易沉淀及过滤，便于后续酵母的分离，有利于后工序的顺利进行，在实验及生产中，我们发现部分商用酵母较难过滤，即使添加大量硅藻土等助剂情况下也难以过滤，过滤通量较低，堵塞严重，助剂消耗大。严重影响生产效率，增加成本。总之，本公开的驯化酵母能够较好的分解各种杂糖，如葡萄糖、半乳糖和甘露糖，并能较高效率的转化为木糖，提高溶液中木糖的含量，从而有利于木糖的生产制备。并且，使用本公开的驯化酵母能够较好的适应造纸废液，能够耐受较高渗透压，耐受较为严苛的环境。

本公开通过菌种发酵将复杂料液中的半乳糖、甘露糖、葡萄糖等杂糖转化分解，提高了木糖的收率，有效地减少了发酵过程中代谢物的产生及其对产物合成的阻碍作用；避免了使用色谱分离木糖，减少了分离树脂及分离设备的投入，降低了生产成本，提供了木糖生产和制备木糖醇原料的新途径。

本公开提供了一种泼辣、耐高渗透压的菌种，其对半乳糖和甘露糖等杂糖有较强发酵能力的菌株，而且对复杂料液有较强的适应能力。

本公开首次通过使用发酵法来提高发酵液中的木糖纯度，属于木糖行业内的首例。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例/方式”、“一些实施例/方式”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例/方式或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本申请的至少一个实施例/方式或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例/方式或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例/方式或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例/方式或示例以及不同实施例/方式或示例的特征进行结合和组合。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本申请的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。

本领域的技术人员应当理解，上述实施方式仅仅是为了清楚地说明本公开，而并非是对本公开的范围进行限定。对于所属领域的技术人员而言，在上述公开的基础上还可以做出其它变化或变型，并且这些变化或变型仍处于本公开的范围内。

Claims (7)

1.一种分解杂糖的菌种，其特征在于，所述菌种为酿酒酵母，经中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCCNo.20692,所述杂糖选自半乳糖、甘露糖、葡萄糖、鼠李糖中的一种或多种。

2.根据权利要求1所述分解杂糖的菌种在利用造纸废液发酵制备木糖中的用途。

3.一种木糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将木片预水解，然后加入硫酸，调节pH为1.3-1.5之间，水解温度为130-160℃，得到水解液，过滤除去木质素；

(2)将(1)所得的液体转移至中和罐中，添加粉末碳酸钙至pH2.8-3.2之间；

(3)中和、离子交换、浓缩，得到净化液；

(4)向净化液中加入玉米浆粉，添加氢氧化钠调节pH至5.5-6.0；

(5)接种权利要求1所述分解杂糖的菌种，在温度28℃，180rpm摇床里发酵20-28小时得到杂糖含量降低的溶液。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述离子交换是通过离子交换树脂进行的。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，相比于水解液的总量，所述玉米浆粉的添加量为0.4-0.7质量％。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，相比于水解液的总量，所述粉末碳酸钙的添加量为1.0-2.0质量％。

7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述浓缩是通过加热蒸发进行的。