BR112013011815B1

BR112013011815B1 - Cepa de saccharomyces cerevisiae, e método de produção de etanol

Info

Publication number: BR112013011815B1
Application number: BR112013011815-6A
Authority: BR
Inventors: Eva Albers; Lisbeth Olsson; Rakesh Koppram
Original assignee: Scandinavian Technology Group Ab
Priority date: 2010-11-15
Filing date: 2011-11-15
Publication date: 2021-07-20
Also published as: CA2817707A1; US20130295620A1; CN103403155B; EP2640837A4; EP2640837A1; CN103354836B; US8962289B2; WO2012067572A1; CN103354836A; BR112013011815A2; BR112013011817B1; ZA201304233B; BR112013011817A2; CA2817714C; CN103403155A; EP2640836A4; EP2640837B1; EP2640836B1; US9115376B2; CA2817707C

Abstract

método para produzir uma cepa de saccharomyces cerevisiae com genes introduzidos que codificam xilose redutase, xilitol desidrogenase e xiluloqui-nase e com produção de etanol aprimorada, conver-são de xilose aprimorada e produção de xilitol redu-zida, cepa de saccharomyces cerevisiae com genes introduzidos que codificam xilose redutase, xilitol desidrogenase e xiluloquinase e com produ-ção de etanol aprimorada, conversão de xilose apri-morada e produção de xilitol reduzida, cepa de sa-ccharomyces cerevisiae com produção de etanol aprimorada, con-versão de xilose aprimorada, pro-dução de xilitol reduzida e tolerância a inibidor aumentada e uso de uma cepa trata-se de um método para produzir uma cepa de saccharomyces cerevisiae com genes introduzidos que codificam xilose redutase, xilitol desidrogenase e xiluloquinase e comprodução de etanol apri-morada, conversão de xilose aprimorada, produção de xilitol redu-zida e tolerância a inibidor aprimorada. o método compreende culti-var uma cepa de sacharomyces cerevisiae em um modo con-tinuo com um meio que compreende essencialmente apenas xilose como fonte de carbono compreende essencialmente apenas xilose como fonte de carbono a uma temperatura de 25 a 38 ºc, preferencial-mente 30 a 35 ºc e um fluxo de ar de 0,040 a 0,055 vvm e aumen-tar a taxa de diluição para manter um nível celular constante, sendo que o dito nível celular está na faixa de 1,5 a 3,0 determinada pela densidade óptica ou média analítica equivalente e adicionada pelo menos um inibidor às células e aumenta gradual-mente a adi-ção do dito inibidor. além disso, as cepas de saccharo-myces cere-visiae obtidas pelo método de acordo co ma invenção descritas.

Description

CAMPO DA TÉCNICA DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a um método para produzir uma cepa de Saccharomyces cerevisiae com genes introduzidos que codificam xilose redutase, xilitol desidrogenase e xiluloquinase e com produção de etanol aprimorada, conversão de xilose aprimorada, produção de xilitol reduzida assim como uma tolerância a inibidor aprimorada. A presente invenção refere-se ainda a cepas de Saccharomyces cerevisiae obteníveis pelo método de acordo com a presente invenção.

TÉCNICA ANTERIOR

[002] Os problemas ambientais com relação ao uso de petróleo como um combustível de automóvel e também ao risco de que os poços de óleo atuais no futuro estarão secos têm levado a uma pesquisa intensa com relação a uma alternativa ao uso de petróleo. Foi revelado que o etanol é uma boa alternativa ao petróleo já que o mesmo em uma grande extensão pode ser usado ao invés de petróleo sem maiores mudanças em motores de combustão. O etanol pode ser usado atualmente para substituir alguns dos combustíveis com poucos ou mesmo sem qualquer ajuste aos motores.

[003] As cepas do gênero Saccharomyces são usadas amplamente na indústria para fermentação, destilação, cozedura e várias outras aplicações. Saccharomyces cerevisiae é um dos micro-organismos mais amplamente usados em aplicações industriais em vista de sua capacidade de converter açúcares tal como glicose e sacarose em biomassa e fermentação desses açúcares em etanol. As cepas de Saccharomyces cerevisiaesão usadas na indústria de combustível em vista de sua capacidade de um tanto rapidamente converter açúcares em etanol e já que Saccharomyces cerevisiae tem tolerância melhor a inibidores de fermentação e etanol em comparação a bactérias e outras leveduras. O documento WO2005/111214 revela cepas de Saccharomyces cerevisiae que têm uma capacidade aumentada de produzir etanol na presença de inibidores tal como furfural e 5-metóxi furfural.

[004] Diferente de bactérias e diversas espécies de levedura, Saccharomyces cerevisiae do tipo selvagem não é capaz de usar pentoses tal como xilose e arabinose como fonte de carbono. A capacidade de Saccharomyces cerevisiae de crescer em fontes de carbono abundantes tais como correntes laterais e material residual de outros processos, tal como material residual agrícola de, por exemplo, maís e bagaço, e material residual de, por exemplo, fabricação de papel, é de grande valor ambiental, mas também econômico. Os resíduos agrícolas compreendem uma fração um tanto grande de hemicelulose, que contém muitos monômeros de açúcar diferentes. Por exemplo, além de glicose, esses monômeros de açúcar podem incluir xilose, manose, galactose, ramnose e arabinose. Xilose é o monômero de açúcar que está presente na maior quantidade e assim representa uma fonte de carbono importante para a fabricação de etanol com o uso de leveduras, fornecendo uma enorme economia e vantagem ambiental.

[005] Os genes que encodificam enzimas que geral a capacidade de usar xilose como fonte de carbono foram previamente introduzidos em Saccharomyces cerevisiae. A EP 1 282 686 revela cepas de Saccharomyces cerevisiae recombinantes que têm genes incorporados para as enzimas xilose redutase, xilitol desidrogenase e xiluloquinase assim como que foram submetidas a uma mutação específica. Ditas cepas têm a capacidade de fermentar materiais crus de lignocelulose em etanol. A cepa depositada em Ep 1 282 686 é CBS 102679 (TMB3400, Taurus 01) e é em geral reconhecida pode ser eficaz na técnica anterior. O etanol produzido pela cepa CBS 102679 tem sido considerado muito bom em comparação a outras leveduras recombinantes da técnica anterior, mas há também uma produção do subproduto indesejável xilitol. Sendo assim, há ainda uma necessidade dentro da técnica de fornecer novas cepas de Saccharomyces cerevisiae que tenham uma produção ainda melhor de etanol, conversão de xilose melhor assim como produção de xilitol menor em vista dos aspectos ambientais crescente da sociedade atual. Além disso, é desejável fornecer cepas que tenham uma tolerância a inibidor ainda melhor.

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[006] O objetivo da presente invenção é, portanto, solucionar os problemas acima e fornecer cepas inovadoras de cepas de Saccaromycese cerevisiae que têm conversão de xilose melhor, produção de etanol melhor, produção menor do subproduto xilitol assim como uma tolerância de inibidor aprimorada, sendo que as ditas cepas de Saccharomyces cerevisiae têm a capacidade de produzir etanol com o uso de essencialmente apenas xilose como fonte de carbono.

[007] De acordo com um primeiro aspecto da presente invenção, esse problema é solucionado com o uso de um método para produzir uma cepa de Saccharomyces cerevisiae com genes introduzidos que codificam xilose redutase, xilitol desidrogenase e xiluloquinase e com produção de etanol aprimorada, conversão de xilose aprimorada e produção de xilitol reduzida que compreende as etapas de: a) cultivar células de Saccharomyces cerevisiae com genes introduzidos que codificam xilose redutase, xilitol desidrogenase e xiluloquinase em um modo contínuo com um meio que compreende essencialmente apenas xilose como fonte de carbono a uma temperatura de 25 a 38 °C, preferencialmente 30 °C a 35 °C e um fluxo de ar de 0,01 a 0,06 vvm e aumentar a taxa de diluição para manter um nível celular constante, sendo que o dito nível celular está na faixa de 1,5 a 3,0 determinada pela densidade óptica ou média analítica equivalente, b) e adicionar pelo menos um inibidor às células e gradualmente aumentar a adição do dito inibidor.

[008] A etapa importante é manter o nível celular constante no biorreator. Quando as células aprimoradas tiverem evoluído, as quais podem utilizar melhor o substrato na taxa de crescimento específica definida pela taxa de diluição, mais células serão formadas como um resultado do aprimoramento. Isso significa que, para manter a pressão de seleção, um aumento na taxa de crescimento é necessária, que é obtida por aumento da taxa de diluição.

[009] De acordo com uma modalidade da presente invenção, o meio da etapa a) compreende 15 a 25 g/l de xilose, preferencialmente cerca de 20 g/l.

[010] Em uma modalidade adicional, o método compreende ainda a etapa de c) aumentar a temperatura a 35 a 45 °C e/ou aplicar radiação UV durante a cultura, por exemplo, após ou a etapa a) ou b).

[011] Um aumento de temperatura melhora o número de células com uma tolerância mais alta contra estresse.

[012] O fluxo de ar usado depende das propriedades da cepa de levedura que é usada. No caso de um metabolismo respiratório, mais ar é necessário, por exemplo, no caso de metabolismo de xilose. Assim que a produção de etanol começa, menos ar é necessário e pode ser diminuído a fim de aumentar a pressão de seleção para o metabolismo de etanol ao invés disso.

[013] A capacidade de consumo de xilose pode ser vista como composta de dois componentes, a taxa de importação e em qual concentração a importação pode ser eficazmente feita, isto é, a afinidade à xilose. A taxa de importação está estreitamente conectada à taxa de crescimento quando a xilose é a única fonte de carbono, isto é, quão rápido o gráfico de xilose é diminuído. A afinidade à xilose é boa se o gráfico de xilose chegar próximo a zero, isto é, toda a xilose foi usada.

[014] Para uma capacidade de conversão de xilose eficaz, adicionalmente o carbono de xilose importado deve ser canalizado ao etanol não ao xilitol e, o mínimo possível, para formação celular. Ambas essas cepas da invenção aprimoraram a taxa de importação e afinidade à xilose.

[015] Em outra modalidade, a produção de etanol aprimorada, conversão de xilose aprimorada e produção de xilitol reduzida são em comparação à cepa depositada como CBS 102679 (TMB3400, Taurus 01). Em outra modalidade, as células conforme usadas na etapa a) do método acima são células das cepas conforme depositadas CBS 102679. As ditas células de Saccharomyces cerevisiae que são usadas como material de partida na etapa a) têm genes introduzidos para as enzimas xilose redutase, xilitol desidrogenase e xiluloquinase a fim de que a levedura seja capaz de fermentar xilose. Esses genes podem ser obtidos de qualquer fonte da qual tais genes possam ser isolados. Por exemplo, os genes que codificam xilose redutase, xilitol desidrogenase podem ser obtidos de Pichia stipitis e xiluloquinase pode ser obtida de Saccharomyces cerevisiae.

[016] Em uma modalidade, o método compreende ainda a etapa de d) seleção de células, da etapa b) ou da etapa c), com capacidade de conversão de xilose e tolerância a inibidor.

[017] De acordo com outra modalidade, a seleção é conduzida em uma placa de ágar com xilose como essencialmente a única fonte de carbono e/ou o dito pelo menos um inibidor ou qualquer outro inibidor. É também possível que a seleção é conduzida em uma placa de ágar com qualquer fonte de carbono e o dito pelo menos um inibidor ou qualquer outro inibidor. Assim, a cepa pode lidar com um ambiente com tipos diferentes de inibidores, não apenas aquela específica usada no método da invenção para produzir a cepa tolerante a inibidor.

[018] Para obter uma cepa de levedura que fermenta xilose tolerante a inibidor aprimorada, é importante continuar a pressão de seleção para conversão de xilose e tolerância a inibidor. Como a glicose é uma fonte de carbono preferencial de Saccharomyces cerevisiae, a presença desse açúcar inibe a pressão de seleção para xilose. Isso foi percebido em alguns dos experimentos em que a capacidade de conversão de xilose foi reduzida enquanto se ganha tolerância a inibidor. Assim, a maioria dos tipos de hidrolisados, que tipicamente contêm grandes quantidades de glicose, não pode ser usada no método de acordo com a invenção. Assim, a fim de produzir uma cepa da presente invenção, um meio de laboratório (mínimo oi definido) deve ser fornecido, que tem xilose como essencialmente a única fonte de carbono, na presença de inibidores tais como uma mistura sintética ou como um hidrolisado amplamente degradado, que tem alto teor de inibidores e baixo teor de açúcares, de modo relevante o nível de glicose e manose deve ser bem baixo.

[019] Em uma modalidade da presente invenção, o inibidor é escolhido dentre furanos tais como HMF e furfural, ácidos orgânicos tais como ácido acético e ácido fórmico e compostos fenólicos. Exemplos adicionais de inibidores são dados na parte exemplificativa do presente relatório descritivo.

[020] A presente invenção refere-se ainda a uma cepa de Saccharomyces cerevisiae com produção de etanol aprimorada, conversão de xilose aprimorada e produção de xilitol reduzida, em que a dita cepa é Taurus Taurus03 com número de deposição CBS128138.

[021] Em outra modalidade, a presente invenção também se refere a uma cepa de Saccharomyces cerevisiae com produção de etanol aprimorada, conversão de xilose aprimorada e produção de xilitol reduzida e tolerância a inibidor aprimorada, em que a dita cepa é Taurus04 com número de deposição CBS128139.

[022] Em uma modalidade, a presente invenção também se refere a uma cepa de Saccharomyces cerevisiae com produção de etanol aprimorada, conversão de xilose aprimorada e produção de xilitol reduzida e tolerância a inibidor aprimorada, em que a dita cepa é Taurus07 com número de deposição CBS128140.

[023] Todas as cepas da invenção foram depositadas em Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS), Uppsalalaan 8, 3584 CT Utrecht, Países Baixos

[024] Saccharomyces cerevisiae Taurus03 com número de depósito CBS128138 foi depositada em 17 de outubro de 2011.

[025] Saccharomyces cerevisiae Taurus04 com número de depósito CBS128139, Saccharomyces cerevisiae Taurus07 com número de depósito CBS128140 foram depositadas em 26 de outubro de 2010. Saccharomyces cerevisiae Taurus 10 CBS 128141, que é também mencionada no presente documento, foi depositada em 2 de novembro de 2010.

[026] Outra modalidade da invenção é o uso de uma cepa obtida pelo método inventado para fermentar materiais crus de lignocelulose em etanol. O material cru de lignocelulose que é usado pode ser de qualquer tipo disponível. Os exemplos são resíduos agrícolas, incluindo palha de milho e bagaço de cana-de-açúcar, resíduos de madeira, incluindo descartes de serraria e fábrica de papel, e refugo de papel municipal.

[027] Outra modalidade da invenção é o uso de uma cepa obtida pelo método inventado em um processo de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF).

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[028] A presente invenção será agora descrita em detalhes por exemplos com referência aos desenhos anexos.

[029] Figura 1: Aprimoramento nas propriedades de crescimento refletido pela taxa de diluição durante a adaptação em culturas contínuas com meio mínimo descrito no exemplo 1. Na primeira parte (linha azul, início em taxa de diluição de 0,025, h-1), xilose foi usada como a única fonte de carbono e na segunda parte (linha vermelha, início em taxa de diluição de 0,05, h-1), a temperatura foi aumentada a 35 °C e bagaço (linha verde, início em taxa de diluição de 0,h- 1) misturado no meio em níveis aumentados.

[030] Figura 2: Aprimoramento na taxa de crescimento específica máxima durante a adaptação em culturas de frasco de agitação repetitiva com meio mínimo descrito no exemplo 2. Primeira parte (losangos) com 20 g/l de xilose e segunda parte (quadrados) com 5 g/l. Na segunda parte do ciclo 10, a série D é mostrada.

[031] Figura 3: Consumo de xilose (quadrados) e formação de etanol (cruzes) e célula (losangos) em culturas de frasco de agitação com meio mínimo e xilose como a única fonte de carbono. A concentração celular é estimada como a densidade óptica a 650 nm (OD). A Figura 3a para Taurus 02, Figura 3b para Taurus 03, Figura 3c para Taurus 07, Figura 3d para Taurus 04, Figura 3e para Taurus 08, Figura 3f para Taurus 09, Figura 3g para Taurus 10.

[032] Figura 4: Consumo de glicose (quadrados) e xilose (triângulos) e formação de biomassa (losangos), etanol (cruzes) e xilitol (estrelas) em cultivos de biorreator anaeróbico com meio mínimo. As culturas representativas são mostradas e duplicatas. Figura 4a para Taurus 01, Figura 4b para Taurus 03, Figura 4c para Taurus 09, Figura 4d para Taurus 10.

[033] Figura 5: Consumo de xilose em culturas de frasco de agitação anaeróbicas com licor de espiga de milho pela primeira geração de cepas de xilose, Taurus03 (losangos) e Taurus09 (triângulos), em comparação à segunda geração de cepas de xilose desenvolvidas dessas, Taurus04 (quadrados) e Taurus10 (cruzes), respectivamente.

[034] Figura 6: Perfis de concentração de substratos, glicose (losangos), xilose+manose+galactose (quadrados, Xil-Man-Gal), produtos, etanol (círculos), xilitol (cruzes) e inibidores de furano, HMF (estrelas) e furfural (triângulos) em experimento de SSF em pasta fluida de bétula a 7,5% de WIS e 5 FPU/g de WIS de enzimas que degradam celulose. Figura 6a para Taurus 01 e 6b para Taurus 03.

[035] Figura 7: Perfis de quantidades totais, glicose (losangos), galactose (triângulos), xilose (quadrados), etanol (círculos pretos) e xilitol (círculos laranja), em fermentação por batelada alimentada de licor de espigas de milho com Taurus04 e com a alimentação de glicose iniciada após 2 horas.

[036] Figura 8: Séries de diluição em série testadas em placa de ágar YPD com mistura de 12 inibidores. Cada círculo corresponde a uma diluição e quanto mais diluído à direita.

[037] Figura 9: Fermentação anaeróbica de hidrolisado de bagaço nas culturas de frasco de agitação com S. cerevisiae Taurus 03, 04, 07 e 10.

[038] Figura 10: Experimentos de SSF (sacarificação e fermentação simultâneas) com Taurus 07 em pasta fluida de palha de trigo.

[039] Figura 11: Fermentação com cepa de S. Cerevisae, Taurus 04, em uma usina de fermentação de escala de demonstração industrial demo no hidrolisado de pasta fluida residual de espiga de milho (Figura 11a) e em uma pasta fluida residual de espiga de milho em combinação com um processo de SSF (Figura 11b).

[040] Figura 12: Tolerância a acetato e HMF em concentrações diferentes durante o crescimento em xilose pelas cepas Taurus, 01, 03, 04, 07, 09 e 10.

[041] Figura 13: Consumo de açúcar em fermentação C5 com Taurus 04, Figura 13a, perfis de consumo/produção em fermentação de sólidos C6 hidrolisados com Taurus 04, Figura 13b, e perfis de consumo/produção em fermentação de sólidos C6 hidrolisados com Taurus 04, Figura 13c.

[042] Figura 14: Sacarificação e fermentação simultâneas de material C5 e sólidos C6 com cepa Taurus 04

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES PREFERENCIAIS

[043] Quando se conduz os experimentos da presente invenção, os processos microbianos convencionais são usados, a não ser que indicado de outra forma. Tais processos são conhecidos por um versados na técnica e são completamente explicados na literatura.

[044] Além disso, todos os termos técnicos usados no presente pedido têm o significado conforme são comumente entendido por um versado.

[045] A abundância de xilose em, por exemplo, biomassa de planta e a possibilidade de usar leveduras, tal como Saccharomyces cerevisiae, para produzir etanol com o uso de xilose como fonte de carbono levaram a uma pesquisa intensa dentro desse campo de tecnologia. A conversão de xilose tem sido, no entanto, pobre, resultando em uma produção de etanol pobre. Além disso, a produção do subproduto xilitol tem sido, ao contrário, grande.

[046] Os inventores da presente invenção tendo em vista dos problemas acima desenvolveram de modo surpreendente cepas aprimoradas de Saccharomyces cerevisiae com uma conversão de xilose mais eficaz e como resultado disso, uma produção de etanol melhor. Além disso, uma produção menor do subproduto xilitol foi observada. Além disso, as cepas aprimoradas têm uma tolerância melhor contra inibidores que são encontrados em muitos hidrolisados lignocelulósicos.

[047] Deve-se perceber que as cepas que são capazes de usar xilose como essencialmente a única fonte de carbono são também capazes de crescer em outros açúcares. O significado da expressão “essencialmente única fonte de carbono” significa que quantidades residuais de outros açúcares podem também estar presentes. Glicose pode estar presente e é usualmente convertida primeiro pela Saccharomyces cerevisiaejá que é um açúcar preferencial para levedura. Sendo assim, a xilose é usada como a fonte de carbono.

[048] Essas características desejáveis para Saccharomyces cerevisiae foram atingidas com o uso da cepa já conhecida de Saccharomyces cerevisiae conhecida como XYLUSM125, TMB3400 ou Taurus 01, que tem o número de depósito CBS 102679. Nessa cepa, os genes que codificam enzimas que geram a capacidade de usar xilose como essencialmente a única sole fonte de carbono já foram introduzidos. Como uma alternativa, outras cepas de Saccharomyces cerevisiae com a capacidade de usar xilose como essencialmente a única fonte de carbono podem se usadas de acordo com a presente invenção. As cepas da invenção podem ser apresentadas em cepas industriais assim como cepas de laboratório, ainda que as cepas industriais sejam preferenciais. Uma cepa industrial é menos bem definida que as cepas de laboratório já que tem diversas cópias de cada cromossomo. Assim, manipular cepas industriais, conforme foi realizado de acordo com a presente invenção, é um desafio maior que manipular cepas de laboratório.

[049] As cepas com produção de etanol aprimorada, conversão de xilose aprimorada e produção de xilitol reduzida e tolerância a inibidor aprimorada de acordo com a presente invenção são obtidas com o uso de métodos não recombinantes. Isso significa que a tecnologia de DNA recombinante não é utilizada para atingir cepas com produção de etanol aprimorada, conversão de xilose aprimorada e produção de xilitol reduzida e tolerância a inibidor aprimorada. A tecnologia de DNA recombinante é, no entanto, usada para atingir, por exemplo, a cepa TMB3400 (Taurus01), que pode ser usada como um material de partida de acordo com a presente invenção. As técnicas de DNA recombinante de acordo com a presente invenção referem-se a técnicas em que as informações genéticas são manipuladas in vitro, enquanto métodos não recombinantes não utilizam essa manipulação in vitro.

[050] De acordo com a presente invenção, as características desejáveis foram atingidas nessas mutações, que normalmente ocorreram durante o crescimento e possivelmente elevadas por irradiação UV, são selecionadas e melhoradas durante condições específicas em cultivos de Saccharomyces cerevisiae, isto é, evolução/adaptação direta ou engenharia evolucionária. O procedimento de evolução direcionada pode ser dividido em três etapas: primeiramente permitir que mutações ocorram, sendo assim, a seleção de traços desejáveis por aplicação de uma pressão de seleção em cultura e finalmente triagem/caracterização de cepas obtidas para mapear propriedades.

[051] As mutações surgem durante o crescimento normal já que alguns erros no código genético podem ocorrer durante o processo de replicação, em que o DNA é copiado e transferido à geração seguinte. A probabilidade de que mutações ocorram pode ser aumentada por certas substâncias químicas ou irradiação UV. As mutações podem mudar as propriedades das proteínas celulares de modo que a possibilidade de o organismo sobreviver seja aumentada ou diminuída.

[052] O termo "seleção” refere-se ao processo, a “adaptação", em que as células com as características desejadas aprimoradas são melhoradas em população. Isso é atingido por aplicação de uma pressão de seleção, que poderia ser escolhida de um grande número de condições diferentes, no cultivo por projeto das condições de crescimento de modo que as propriedades desejadas sejam benéficas para a sobrevivência e desempenho do micro-organismo. A pressão de seleção, quanto à presente invenção, pode ser atingida tendo- se a xilose como essencialmente a única fonte de carbono, tendo-se inibidores presente ou aumentando-se a temperatura. Adicionalmente, pressões de seleção diferentes são atingidas pelo modo de cultivo. Um aumento na temperatura pode melhorar as células com uma tolerância a estresse geral mais alta. É muito importante selecionar e aplicar a pressão de seleção que permita a propriedade desejada para se desenvolver. Certas pressões de seleção podem ser aplicadas jutas na mesma adaptação ou em cultivos subsequentes. Tipicamente, de acordo com a presente invenção, o cultivo pode ser realizado em meio líquido ou em placas de ágar. Em cultura líquida, a proporção de células aprimoradas é aumentada durante o progresso da adaptação e é vista como um aprimoramento no desempenho da população misturada, quanto à presente invenção, refletido pela produção de etanol aprimorada, conversão de xilose aprimorada e produção de xilitol reduzida.

[053] De modo relevante, a adaptação deve preceder durante muitas gerações para permitir que mutações surjam e melhoramento na população celular. Quando se realiza a seleção em placas de ágar, as células são tipicamente incubadas durante um tempo suficiente para permitir que as células tenham a capacidade de crescer e formar colônias. Colônias maiores que aparecem na placa de ágar são indicativas de células com uma capacidade aprimorada de crescer nas condições aplicadas em comparação às colônias menores que mostram uma capacidade inferior.

[054] No presente contexto, a expressão “nova geração” significa, conforme é entendido por um versado na técnica, que uma célula foi dividida em duas novas células e que as duas novas células representam a nova geração. No presente contexto, as células continuam a crescer por muitas gerações e até não poder ser observada nenhuma mudança fenotípica na nova geração em comparação com as gerações anteriores, isto é, as mudanças fenotípicas permanecem constantes. Os exemplos de mudanças fenotípicas são, por exemplo, a taxa de crescimento específica máxima das células. Isso pode ser medido por medição da densidade óptica. Outras mudanças fenotípicas que podem ser observadas são, por exemplo, a produtividade de etanol, a conversão de xilose e a produção do subproduto xilitol. Não há mais mudanças fenotípicas observadas quando esses componentes são mantidos em um nível constante.

[055] Além disso, o termo "triagem” refere-se a um processo em que o desempenho das células é caracterizado de uma forma comparável. O método de triagem deve mostrar o desempenho que reflete as propriedades desejadas das células e pode ser realizado em placas de ágar ou em meio líquido. As células com as características desejadas apropriadas podem ser assim identificadas e tomadas para uma caracterização adicional de outras propriedades.

[056] De acordo com a presente invenção, é assim fornecido um método para produzir uma cepa de Saccharomyces cerevisiae com genes introduzidos que codificam xilose redutase, xilitol desidrogenase e xiluloquinase e com produção de etanol aprimorada, conversão de xilose aprimorada e produção de xilitol reduzida e uma tolerância a inibidor aprimorada.

[057] Além disso, são fornecidas cepas de Saccharomyces cerevisiaeobteníveis pelo método de acordo com a presente invenção.

[058] Abaixo seguem exemplos para atingir as cepas aprimoradas de Saccharomyces cerevisiae de acordo com a presente invenção. Todo o trabalho foi iniciado com a cepa TMB3400 (Taurus 01), que previamente mostrou desempenho muito bom com relação á capacidade de conversão de xilose e rendimento de xilitol um tanto baixos (Sonderegger, et al., 2006, Hahn-Hãgerdal, et al., 2007) . No entanto, conforme previamente citado, outra cepas de Saccharomyces cerevisiae podem ser usadas contanto que essas tenham a capacidade de fermentar xilose. Pela presente invenção, foi de modo surpreendente possível produzir cepas ainda mais eficazes de Saccaromyces cerevisiae com relação à conversão de xilose e produção de etanol. Uma produção menor do subproduto xilitol foi também observada. Assim, as cepas conforme obtidas de acordo com a presente invenção podem ser usadas na fermentação de diferentes materiais lignocelulósicos ou materiais residuais de maís ou bagaço que compreendem, adicionalmente à glicose, quantidades consideráveis o açúcar xilose. Cepas mais eficazes a serem usadas em tais processos de fermentação serão de grande valor econômico e ambiental.

[059] Conforme será visto na parte experimental, as cepas da invenção mostraram serem superiores em comparação às cepas da técnica anterior com relação à produção de etanol, consumo de xilose, produção de xilitol assim como tolerância a inibidor.

EXEMPLO 1 Aprimoramento de capacidade de conversão de xilose e tolerância a inibidor e temperatura com o uso de culturas contínuas

[060] A série de adaptação direcionada foi iniciada com a cepa Taurus01 e realizada em culturas contínuas em um biorreator (aproximadamente 750 ml de volume de trabalho def 1 l, Belach Bioteknik AB, Suécia) com meio mínimo (Verduyn, et al., 1992) com teor solução de metal residual 2 vezes mais alto que o usado de acordo com Verduyn e 0,1 ml/l de PEG P2000 como antiespumante (em cultivos de biorreator). O pH foi controlado a 5,0 com NaOH a 2 M e a velocidade de agitador foi definida em 350 rpm. Para iniciar a cultura, um inóculo de 50 ml com 20 g/l de xilose e 20 g/l de glucose (em frasco de agitação com reentrâncias de 250 ml, incubado por 24 a 36 horas, 30 °C, agitação de 180 rpm) foi adicionado ao biorreator (com meio mínimo e 20 g/l de xilose e 20 g/l de glicose, volume total de 800 ml, sem fluxo de entrada de gás). A cultura foi executada por 15 a 20 horas antes de o modo contínuo ser iniciado com meio de fluxo de entrada que tem apenas 20 g/l de xilose como fonte de carbono e um tubo de fluxo de saída que determina o fluxo de saída. O volume de cultura preciso foi determinado ao final da cultura e foi 740 a 780 ml. A densidade óptica a 650 nm (OD) foi medida a cada dia de trabalho como uma medida da densidade celular. As amostras para a medição de metabólitos extracelulares (também do frasco de meio) e alíquotas de células a serem guardadas congeladas (1 ml de suspensão celular foi adicionado a 0,5 ml de glicerol a 60% estéril, armazenado a -80 °C) foram tomadas regularmente. HPLC (Dionex, Ultimatum 3000, detecção de RI a 35 °C, detecção de UV a 210 nm, colunas a 45 °C da BioRad; AminexHPX-87H e 30 x 4,6 mm de micro-guarda de Cátion-H , eluente H2SO4 a 5 mM a um fluxo de 0,6 ml/min) foram usados para determinar os metabólitos. A contaminação da cultura foi regularmente verificada, visualmente com o uso de um microscópio, como não presente.

[061] A primeira parte da adaptação foi executada a 30 °C e fluxo de ar de 35 ml/min. A intenção ou manter a OD a um valor de 2 a 2,5. Um aumento no nível de OD é uma indicação do aprimoramento de propriedades de crescimento e assim a taxa de fluxo poderia ser aumentada para aplicar uma pressão de seleção mais alta. De modo correspondente, se uma diminuição no nível de OD for vista, a pressão de seleção foi muito alta e dessa forma taxa de fluxo precisa ser diminuída. Assim, o aumento na taxa de fluxo (ou recalculada para a taxa de diluição) é uma medida do desempenho aumentado das células. Após 15 gerações, a temperatura no reator foi aumentada a 35 a 45 °C por 24 horas e as células foram recuperadas da cultura tanto se guardando uma alíquota congelada quanto se estriando uma amostra em uma placa de ágar e xilose (20 g/l de xilose, 20 g/l de peptona, 10 g/l de extrato de levedura e 20 g/l de ágar). Uma cepa que foi obtida após tal tratamento de temperatura foi nomeada Taurus02. As células da placa de ágar foram usadas para iniciar uma nova cultura contínua. A cultura foi executada por 77 gerações durante as quais um aumento na taxa de diluição foi vista (Figura 1) e a cepa final foi nomeada Taurus03. Essa cepa assim pertence à primeira geração de cepas de xilose.

[062] A segunda parte da série de adaptação foi executada a um fluxo de ar de 13 ml/min e pressões de seleção adicionais forma aplicadas. Em primeiro lugar, a temperatura no biorreator foi aumentada a 35 °C (tanto para lote quanto fases contínuas) e, em segundo lugar, um bagaço tóxico foi misturado no meio em níveis aumentados. Esse hidrolisado de bagaço foi preparado (em SEKAB E-technology, Suécia) com o uso de um pré-tratamento (com SO2 a 2%, a aproximadamente 190 °C) que foi executado por muito tempo (tempo de permanência de 13 a 15 minutos) resultando de um hidrolisado um pouco degradado com baixos níveis de açúcares (4 g/l de glicose, 5 g/l de xilose, 0,4 g/l de galactose) e alto teor de inibidor. O pH do hidrolisado para a alíquota a ser usada foi ajustado a 5,0 com NaOH a 5 M no tempo de cada preparação de meio. A cultura foi primeiramente executada para 21 gerações em meio mínimo com apenas xilose para permitir que as células se adaptassem à temperatura mais alta. A cultura foi então, no total, executada por 120 gerações. Um aumento na taxa de diluição foi visto durante o progresso da cultura, mas quando se aumentou o teor do bagaço no meio, o crescimento foi mais lento e foi consequentemente necessário diminuir a taxa de diluição (Figura 1). No entanto, conforme as gerações progrediam em um certo teor de bagaço, um aprimoramento na taxa de diluição foi visto (Figura 1).

[063] Ao final do regime de evolução direcionada, a segunda geração de cepas de xilose foi obtida e adicionalmente caracterizada. A terceira última cepa foi nomeada Taurus04 e as duas últimas cepas, que foram nomeadas Taurus05 e Taurus06, foram usadas para selecionar clones tolerantes a inibidor especiais da população celular heterogênea obtida durante a adaptação. As amostras das células foram diluídas em uma série de diluição dez vezes com água estéril. 10 μl de cada diluição foram gotejados em uma placa de ágar (20 g/l de glicose, 20 g/l de peptona, 10 g/l de extrato de levedura, 20 g/l de ágar) com uma mistura sintética de 12 inibidores selecionados. Os inibidores estavam presentes em concentrações de 2,5 g/l de hidroximetilfurfural, 0,82 g/l de furfural, 4,7 g/l de ácido acético, 0,9 g/l de ácido fórmico, 1,8 g/l de ácido levulínico, 0,10 g/l de vanilina, 0,03 g/l de coniferil aldeído, 0,75 mg/l de ácido cinâmico, 15 mg/l de hidroquinona, 82 mg/l de siringaldeído, 15 mg/l de ácido 4- hidroxibenzoico e 15 mg/l de 4-hidroxi-3-metoxifenil acetona (guaiacil acetona). As placas foram incubadas até algumas colônias maiores serem vistas. As células dessas colônias (uma colônia de Taurus05, 3 a 4 colônias de Taurus06) foram estriadas novamente em placas de bagaço (50% de bagaço tóxico, 20 g/l de glicose, 20 g/l de peptona, 10 g/l de extrato de levedura, 20 g/l de ágar) e incubadas dois dias a 30 °C e quatro duas à temperatura ambiente. Diversas das colônias maiores foram estriadas novamente em novas placas de bagaço e incubadas por mais 2+4 dias. Dessas placas, as seis maiores colônias para cada cepa foram separadamente estriadas em placas de meio mínimo de xilose. Após incubação a 30 °C por diversos dias, as 9 ou 10 maiores colônias de cada cepa foram usadas para iniciar culturas pequenas (10 ml em tubo falcon de 50 ml) em meio rico em xilose (20 g/l de xilose, 20 g/l de peptona, 10 g/l de extrato de levedura) que foi cultivado de um dia para o outro e subsequentemente usados para preparar o estoque congelado de células, resultando nas cepas nomeadas Taurus07 e Taurus08.

EXEMPLO 2 Aprimoramento de capacidade de conversão de xilose com o uso de culturas de frasco de agitação repetitivas

[064] A cepa Taurus02, que é desenvolvida a partir de TMB3400 (Taurus01) foi usada como a cepa de partida para um esquema de adaptação direcionada com o uso de culturas de lote repetitivas. Os cultivos foram feitos em culturas de frasco de agitação a 30 °C com uma agitação de 180 rpm em frascos de 100 ml com 50 ml de meio de xilose mínimo (Verduyn, et al., 1992) com pH 5,5 e teor de solução de metal residual 2 vezes mais alto que o usado de acordo com Verduyn. A primeira parte do esquema de adaptação foi feita com 20 g/l de xilose no meio. Cada cultura foi executada até a densidade óptica a 650 nm (OD) alcançar um valor de 1,8 a 3 quando o crescimento começou a cessar e então uma alíquota de células foi transferida para o frasco de ciclo seguinte com meio fresco para gerar uma OD de início de 0,07. No ciclo 7, o desempenho foi aprimorado em tal grau que a OD de início foi diminuída a 0,06 para o ciclo 8, 0,05 para os ciclos 9 e 10 e aproximadamente 0,02 para os ciclos 11 a 13. No total, 13 cultivos foram feitos permitindo 73 gerações durante o regime de adaptação e células de 7 dos ciclos foram guardadas congeladas (1 ml de suspensão celular foi adicionado a 0,5 ml de glicerol a 60% estéril, armazenado a -80 °C). As culturas foram seguidas por medição de OD e a partir dessas calculou- se a taxa de crescimento específica (Figura 2) e por medição de metabólitos extracelulares para cada cultura no início e na transferência ao ciclo seguinte. HPLC (Dionex, Ultimatum 3000, detecção de RI a 35 °C, detecção de UV a 210 nm, colunas a 45 °C da BioRad; AminexHPX-87H e 30 x 4,6 mm de micro-guarda de Cátion-H, eluente H2SO4 a 5 mM a um fluxo de 0,6 ml/min) foram usados para determinar os metabólitos e esses resultados mostraram que o nível de xileno na transferência foi bem alto, aproximadamente 12 a 16 g/l, e assim a adaptação foi levada à próxima parte. A última cepa foi nomeada Taurus09 e é assim outra cepa de xilose de primeira geração juntamente com Taurus03. Essa cepa teve uma taxa de crescimento específica máxima cerca de três vezes nas condições de adaptação (Figura 2).

[065] A concentração de xilose na segunda parte da adaptação foi selecionada como 5 g/l, com base no desempenho fraco da cepa Taurus 09 em meio com 5 g/l de xilose em comparação com 10 g/l ambos feitos em cultivos separados. Nessa adaptação, a transferência de células foi feita a OD 2,8 a 3 e a OD de início foi 0,1 (exceto pelos quatro primeiros ciclos quando uma OD de início de 0,01 foi usada) e OD e metabólitos foram seguidos como anteriormente. A adaptação progrediu durante 9 ciclos, correspondendo a 47 gerações. Devido ao aprimoramento limitado em taxa de crescimento específica vista nesse ponto (Figura 2), a cultura foi dividida em quatro partes. Duas partes foram iluminadas com luz UV para aumentar o número de mutações e duas partes firam transferidas para o ciclo seguinte sem qualquer tratamento. Para o tratamento de UV, as placas de ágar com meio de xilose mínimo foram usadas e as células foram difundidas por 4 placas de ágar que foram secas. Duas placas foram expostas à luz UV, com o uso de um transiluminador TFM-26V, P/N 95-0422-02, UV de Alto Desempenho de 25 Watts da Ultra-Violet Products Ltd. com um comprimento de onda de 302 nm, definido em Alta Intensidade, por 60 segundos e dois por 90 segundos. As células foram imediatamente coletadas das placas e usadas para iniciar novas culturas na série de adaptação. As células expostas tanto a 60 quanto a 90 segundos foram usadas juntas em uma cultura de frasco de agitação. As células tratadas por UV e não tratadas foram ambas usadas para iniciar culturas em condições normais e condições de oxigênio limitado, consulte a tabela.

[066] As condições de oxigênio limitado foram atingidas com o uso de um frasco de agitação especial. Esse frasco com oxigênio limitado foi construído a partir de um frasco de agitação com defletores e dois braços. Um filtro de ar (filtro 21978 da INFORS HT) foi conectado a um dos braços de uma tubulação de borracha com uma seringa na extremidade externa foi conectado ao outro braço para amostragem. Todas as aberturas foram vedadas com parafilme. Essas séries de adaptação foram seguidas por 14 e 15 ciclos, exceto pela série B em que as células morreram no segundo ciclo. O número de gerações atingiu durante essa última parte foi 83 para a série A, 68 para a série C e 89 para a série D. As células foram regularmente guardadas congeladas (preparadas conforme descrito acima) durante o prosseguimento da adaptação. A última cepa da série D mostrou o melhor desempenho e foi selecionada como uma cepa de xilose de segunda geração e nomeada Taurus10. Essa cepa teve uma taxa de crescimento específica máxima aprimorada por cerca de 5 vezes nos níveis de xilose baixos na adaptação (Figura 2).

EXEMPLO 3 Caracterização de cepas com relação à capacidade de fermentação de xilose em condições diferentes a) Culturas de frasco de agitação com meio mínimo e xilose como única fonte de carbono

[067] O primeiro tipo de caracterização aplicado foi cultura de frasco de agitação com meio mínimo e apenas xilose como fonte de carbono. Os cultivos foram realizados em 50 ml de meio em frascos de 100 ml e iniciados por adição de células de um estoque congelado para obter uma OD de 0,01. As culturas foram incubadas a 30 °C e 180 rpm, que resulta em condições semi-aeróbicas nos frascos e as células e concentrações de metabólicos foram seguidas.

[068] Cepas em que esse tipo de caracterização foi conduzida: • Taurus02 • Taurus03 • Taurus07 • Taurus08 • Taurus09 • Taurus10

[069] Uma taxa de crescimento específica máxima mais rápida foi atingida já para a primeira geração de cepas de xilose de ambos os tipos de esquemas de evolução direcionada, Taurus03 e Taurus09, e foi apenas marginalmente aprimorada para a segunda geração de cepas de xilose (Tabela 1, Figura 3). As cepas trocaram tipos de metabolismo para produção de etanol e consequentemente menos células foram formadas. Assim, pode ser concluído que a fermentação de xilose foi mais eficaz também levando em conta que todas as cepas aprimoradas poderiam usar uma porção maior da xilose. As melhoras cepas, a esse respeito Taurus10, poderiam usar mais de 90% da xilose e consequentemente essa cepa produziu o nível mais alto de etanol 4,2 g/l. Nenhuma diferença na fermentação de xilose foi vista entre as cepas tolerantes a inibidor Taurus07 e Taurus08. Tabela 1. Taxas de crescimento, rendimentos, níveis residuais de xilose e concentrações de etanol máximas durante cultivos de frasco de agitação com meio mínimo e xilose como única fonte de carbono. Taurus02, 07, 10 foi feita em culturas duplicadas, Taurus03 em triplicatas e os resultados desses são dados como uma faixa.

[070] Xilitol foi, para todas as cepas, formada em níveis baixos (<0,06 g/g de xilose consumida)

b) Culturas de biorreator anaeróbico com meio mineral e glicose e xilose como fontes de carbono

[071] Em uma definição industrial, o desempenho anaeróbico é muito importante e assim a caracterização em tais tipos de culturas foi realizada. Como de modo anaeróbico, as células não podem crescer apenas em xilose como fonte de carbono (Figura 4), uma mistura de glicose e xilose foi usada.

[072] Pré-culturas foram preparadas por adição de 100 μl de células congeladas de cultura de estoque a 100 ml de meios mínimos contendo 20 g/l de glicose e 20 g/l de xilose. A cultura foi então incubada de modo aeróbico a 30 °C por 48 horas antes da inoculação dos biorreatores. O meio no biorreator cultivos anaeróbicos foi complementado com 0,1 ml/l de antiespumante (Polipropilenglicol P2000), 10 mg/l de ergosterol e 0,42 g/l de Tween 80. Biorreatores com um volume de trabalho de dois litros foram usados (Belach Bioteknik AB, Suécia) e as condições anaeróbicas foram atingidas por inundação de gás nitrogênio através do fermentador a 0,4 l/min. A temperatura foi controlada a 30 °C, o pH a 5,0 com NaOH a 2 M e a velocidade do agitador a 500 rpm. As células da pré-cultura foram então adicionadas para alcançar uma OD650 de partida de 0,01 no biorreator. Tanto a OD quanto o peso celular seco foram medidos e as amostras de metabólito extracelular foram colocadas regularmente durante o curso da fermentação. Culturas duplicadas de cada cepa forma feitas, que geraram resultados similares.

[073] Cepas em que esse tipo de caracterização foi conduzida: • Taurus01 • Taurus03 • Taurus09 • Taurus10

[074] Além disso, durante a condição anaeróbica, a fermentação de xilose foi mais eficaz para todas as cepas aprimoradas (Tabela 2, Figura 4). Foi visto que tanto como uma taxa aumentada de consumo de xilose e toda a xilose poderia ser consumida pelas cepas aprimoradas. Especialmente, a cepa Taurus10 mostrou um consumo rápido. Acompanhada pela formação de etanol por essas cepas, também uma formação reduzida de subproduto xilitol foi vista. Para Taurus03, a redução no rendimento de xilitol foi tanto quanto 40%. Tabela 2. Rendimentos e consumo de xilose em cultivos anaeróbicos em meio mínimo com xilose e glicose como fontes de carbono. O desvio máximo de culturas duplicadas é dado.

[075] As cepas da invenção (Taurus 03, 09 e 10) tiveram uma concentração de etanol mais alta assim como produção de xilitol mais baixa em comparação a Taurus 01 bem conhecida.

c) Fermentação anaeróbica de licor de espigas de milho em culturas de frasco de agitação

[076] Para a etapa seguinte na caracterização, o desempenho em substratos industriais reais foi avaliado por investigação da fermentação em hidrolisado de espiga de milho. As espigas de milho foram pré-tratadas por ácido diluído adicionado como SO2 e produzidas pela SEKAB Etechnology, Suécia. A pasta fluida pré-tratada foi filtrada para obter a parte de licor.

[077] Na pré-cultura, as células foram cultivadas em meio mínimo com glicose e xilose, conforme descrito em b, após 24 horas parte do licor de espigas de milho foi suplementado aos frascos de agitação e deixados para incubação mais 18 horas. As células foram colhidas por centrifugação. Para fermentação, licor de espigas de milho suplementadas com 0,5 g/l de (NH4)2HPO4 foi usado como meio e o pH foi ajustado a 6,0. As células colhidas (por centrifugação) da pré-cultura foram adicionadas para gerar uma densidade celular de partida aproximada a 3 g de peso seco/l. A incubação das culturas foi feita com 50 ml de meio em frascos de agitação de 100 ml a 30 °C e 180 rpm e condições anaeróbicas foram obtidas com o uso de tampões de ar preenchidos com glicerol. As amostras para metabólitos foram tomadas após 0, 2, 4, 6, 8, 24, 48, 72 e 96 horas.

[078] Cepas em que esse tipo de caracterização foi conduzida: • Taurus03 • Taurus04 • Taurus09 • Taurus10

[079] Os dados na Tabela 3 e na Figura 5 claramente mostram que as cepas de xilose de segunda geração, Taurus04 e Taurus10, geraram uma concentração de etanol final mais alta e conversão de xilose após 96 horas em comparação a suas respectivas cepas precursoras, Taurus03 e Taurus09. A pesar da grande conversão de xilose, o rendimento do subproduto, xilitol, é mantido em um nível baixo (Figura 5). Tabela 3. Rendimentos de produtos, consumo de xilose e níveis finais de etanol em culturas de frasco de agitação anaeróbicas em licor de espigas de milho Cultivos únicos foram feitos.

d) Experimentos de SSF (sacarificação e fermentação simultâneas) em pastas fluidas de espiga de milho e bétula

[080] Outro processo típico para produção de etanol é o processo de SSF. Nesse processo, as enzimas hidrolíticas são adicionadas juntamente cm levedura para atingir uma quebra simultânea da celulose na pasta fluida pré-tratada e a fermentação de açúcares monoméricos. No processo, o substrato e etapas do processo foram usados para assemelhar-se o máximo possível a uma situação industrial. A propagação celular foi feita em cultura de batelada alimentada ventilada. A pré-cultura para a propagação foi feita em 50 ml de meio mínimo (pH 6,0) com 20 g/l de glicose e 20 g/l de xilose em frascos de agitação de 150 ml. A pré- cultura foi iniciada com uma pequena porção; 100 μl de células congeladas e executada em um agitador giratório a 30 °C por idealmente 24 horas (18 a 36 horas) . O meio (500 ml) na batelada continha 50 g/l de melaço com 23,5 g/l de (NH4)2SO4, 3,0 g/l de KH2PO4, 2,25 g/l de MgSO4^7H2O e 99 μg/l de biotina, 360 ppm de Vitahop (extrato de lúpulo para suprimir bactérias) e 1,2 ml/l de antiespumante (à base de silício, Nopcomaster ENA-309, Nopco Paper Technology AB). Toda a pré-cultura foi adicionada para iniciar o cultivo (em Labfors bioreactor, Infors AS), que foi executada com aeração a 1 vvm, ajuste de pH a 5,0 com NaOH a 3 M e velocidade de agitação a 700. A batelada foi executada até o açúcar ter terminado (aproximadamente 8 a 10 horas) e então a alimentação foi iniciada. A alimentação continha hidrolisado do material usado na SSF seguinte (pH ajustado a 5, diluído de modo correspondente a 7,5% de WIS) e melaço foi incluído gerando uma concentração de açúcares hexose total de 75 g/l. Quando a fase de batelada alimentada iniciou, a velocidade do agitador foi aumentada a 1.000 rpm e a aeração aumentou a 1,0 vvm com base no volume final. A alimentação foi adicionada a uma taxa constante de 0,1 h-1e executada por 20 horas gerando o volume final de 1,5 l. As células foram colhidas por centrifugação (8 minutos a 1.800 xg) e suspensas novamente em NaCl a 0,9% estéril. A parte de SSF (meio total 1,5 kg) foi executada em pasta fluida de material lignocelulósico pré-tratado (pH 5,0, ajustado com NaOH) a 7,5% WIS e suplementado com 0,5 g/l de (NH4)2HPO4, Vitahop a 125 ppm e 0,4 ml/l de antiespumante (o mesmo que na propagação). As células novamente suspensas em NaCl a 0,9% foram adicionadas para gerar uma concentração celular final de 3 g de peso seco/l e enzimas (NS-22074 ou Cellic C-tec2, Novozymes) fora adicionadas para gerar 5 FPU/g de WIS para iniciar o processo. O fermentador (sem abafadores, Labfors) foi controlado 35 °C, ajuste de pH com NaOH a 3 M a 5,0, velocidade de agitador a aproximadamente 300 a 400 rpm e todas as entradas foram fechadas e a saída através do condensador foi aberta. As amostra para análise de metabólito foram tomadas pelo menos a: 0, 2, 4, 6, 8, 24, 48, 72 e 96 horas.

[081] Cepas em que esse tipo de caracterização foi conduzida: • Taurus01 • Taurus03 • Taurus04 • Taurus10

[082] Nos processos de SSF em 7,5% de WIS de pasta fluida de espiga de milho (a pasta fluida completa descrita na parte c), foi também claramente visto que a capacidade de consumo de xilose aprimorada das cepas da invenção foi vista também em tal processo (Tabela 4). Além disso, a formação de subproduto xilitol foi reduzida conforme também visto em outros tipos de caracterizações (Figura 6). Tabela 4. Consumo de xilose e formação de xilitol em experimentos de SSF em pasta fluida de espiga de milho a 7,5% de WIS e 5 FPU/g de WIS de enzimas que degradam celulose. As culturas duplicadas foram realizadas e seguidas por 96 horas.

[083] A caracterização de SSF foi também realizada com o uso de outro tipo de material, bétula, que tem um material lignocelulósico que contém alto teor de xilose. Lascas de madeira de bétula foram pré-tratadas por ácido diluído (aproximadamente 1% de SO2, 190 °C e tempo de permanência de 5 min, feito na SEKAB E-technolgy). A pasta fluida pré-tratada foi executada a 7,5% de WIS e também com esse material o consumo de xilose aprimorado foi visto (Figura 6).

e) Fermentação a batelada alimentada de espigas de milho

[084] Como o consumo de xilose está sob repressão de glicose (consulte também a Figura 4, consumo de xilose se inicia após a depleção de glicose), outra configuração para a fermentação de hidrolisado foi projetada. O licor de espiga de milho (descrito na parte c) foi usada em uma fermentação e após a depleção de glicose uma alimentação de glicose foi iniciada.

[085] As células foram produzidas da mesma maneira que para um processo de SSF descrito acima. As células foram carregadas em 800 ml de meio concentrado que consiste em licor de espiga de milho e nutrientes como para um processo de SSF. As concentrações de licor de espiga de milho, nutrientes e células ao final da batelada alimentada correspondem a um processo de SSF similar. No experimento, o licor de espiga de milho foi diluído para corresponder a um teor de WIS de 7,5%. As células foram adicionadas e após 2 horas a solução de glicose foi iniciada a ser alimentada no reator a 5,53 ml/h durante o resto do cultivo. As amostras para metabólitos foram tomadas após 0, 2, 4, 6, 8, 24, 48, e 72 horas.

[086] Cepas em que esse tipo de caracterização foi conduzido: • Taurus04

[088] Essa configuração foi muito bem sucedida, quase toda a xilose foi consumida (Figura 7) e mais de 25 g de etanol foram formados durante 72 horas e a produção não cessou nesse ponto. f) Tete de tolerância a inibidor em placas de ágar

[089] As cepas da segunda parte do esquema de evolução direcionada com o uso de culturas contínuas foram adaptadas para aumentar sua tolerância a inibidor. Assim, a tolerância a inibidor dessas cepas foi avaliada com o uso de ensaios de placa.

[090] Uma amostra de células das amostras congeladas foi diluída com água destilada estéril para render uma OD de 1. A partir dessa diluição, uma série de diluições de dez vezes foi feita com o uso de água destilada e 10 μl de cada diluição foram gotejados em um YPD (meio rico, extrato de levedura, peptona, glicose) placa de ágar com a mistura de inibidor de 12 compostos descrita acima no exemplo 1. As placas foram incubadas pelo menos 2 dias a 30 °C para permitir que as células se proliferem e seja claramente visto.

[091] Cepas em que esse tipo de caracterização foi conduzida: • Taurus03, Taurus04, Taurus05, Taurus06

[092] Conforme visto na Figura 8, as cepas adaptadas exibiram um crescimento melhor nas amostras diluídas (coluna 2) em comparação à cepa precursora Taurus03.

g) Fermentação anaeróbica de hidrolisado de bagaço em culturas de frasco de agitação

[093] O desempenho em substratos industriais reais foi também investigado em fermentação com hidrolisado de bagaço.

[094] Para pré-cultura, 100 μl de células congeladas de cultura de estoque foram adicionadas a 100 ml de meios mínimos contendo 20 g/l de glicose e 20 g/l de xilose. A cultura foi incubada de modo aeróbico a 30 °C e após 24 horas um pouco de hidrolisado de bagaço foi suplementado aos frascos de agitação e deixado para incubação mais 6,5 horas. As células foram colhidas por centrifugação. Para testes de fermentação, diferentes concentrações de hidrolisado de bagaço (20%, 50% e 75%) foram suplementadas com extrato de levedura (10 g/l) e o pH foi definido a 6,0. As células colhidas da pré-cultura foram adicionadas para gerar uma densidade celular de partida aproximada a 3 g de peso seco/l. Os testes de fermentação foram realizados com 50 ml de meio em frascos de agitação de 100 ml a 30 °C e 180 rpm e condições anaeróbicas foram obtidas com o uso de tampões de ar preenchidos com glicerol. OD de fermentação com 20% de hidrolisado foi seguida ao longo do processo e medida a 650 nm.

[095] Cepas em que esse tipo de caracterização foi conduzida: • Taurus03, Taurus04, Taurus07, Taurus10

[096] As Tabelas 5, 6 e 7, assim como a Figura 9, mostram que as cepas de xilose de segunda geração,

[097] Taurus04 e Taurus07, cresceram mais rápido e geraram rendimento de etanol mais alto, conversão de xilose mais alta e menos formação de xilitol em comparação a suas cepas precursoras Taurus03. Além disso, Taurus10 obtida da cepa precursora Taurus09 foi também comparada. Apesar da grande conversão de xilose, o rendimento do subproduto, xilitol, foi mantido a um nível baixo em todos os casos. Quando o hidrolisado foi diluído a 20%, a conversão de xilose foi em todos os casos maior que 99%, consulte a Figura 9. Tabela 5. Rendimento de etanol, consumo de xilose e concentração final de etanol em culturas de frasco de agitação anaeróbicas em 20% de hidrolisado de bagaço. Cultivos únicos foram feitos.

Tabela 6. Rendimento de etanol, consumo de xilose e concentração final de etanol em culturas de frasco de agitação anaeróbicas em 50% de hidrolisado de bagaço. Cultivos únicos foram feitos.

Tabela 7. Rendimento de etanol, consumo de xilose e concentração final de etanol em culturas de frasco de agitação anaeróbicas em 75% de hidrolisado de bagaço. Cultivos únicos foram feitos.

h) Experimentos de SSF (sacarificação e fermentação simultâneas) em pasta fluida de palha de trigo

[098] Outro processo típico para produção de etanol é o processo de SSF. Nesse processo, as enzimas hidrolíticas são adicionadas juntamente cm levedura para atingir uma quebra simultânea da celulose na pasta fluida pré-tratada e a fermentação de açúcares monoméricos. No processo, o substrato e etapas do processo foram usados para assemelhar-se o máximo possível a uma situação industrial.

[099] A propagação celular foi feita em cultura de batelada alimentada ventilada. A pré-cultura para a propagação foi feita em 50 ml de meio mínimo (pH 6,0) com 20 g/l de glicose e 20 g/l de xilose em frascos de agitação de 150 ml. A pré-cultura foi iniciada com uma pequena porção; 100 μl de células congeladas e executada em um agitador giratório a 30 °C por idealmente 24 horas (18 a 36 horas). O meio (500 ml) na batelada continha 50 g/l de melaço com 23,5 g/l de (NH4)2SO4, 3,0 g/l de KH2PO4, 2,25 g/l de MgSO4-7H2O e 99 μg/l de biotina, 360 ppm de Vitahop (extrato de lúpulo para suprimir bactérias) e 1,2 ml/l de antiespumante (à base de silício, Nopcomaster ENA-309, Nopco Paper Technology AB). Toda a pré-cultura foi adicionada para iniciar o cultivo (em Labfors bioreactor, Infors AS), que foi executada com aeração a 1 vvm, ajuste de pH a 5,0 com NaOH a 3 M e velocidade de agitação a 700. A batelada foi executada até o açúcar ter terminado (aproximadamente 8 a 10 horas) e então a alimentação foi iniciada. A alimentação continha hidrolisado do material usado na SSF seguinte (pH ajustado a 5, diluído de modo correspondente a 5% de WIS) e melaço foi incluído gerando uma concentração de açúcares hexose total de 75 g/l. Quando a fase de batelada alimentada iniciou, a velocidade do agitador foi aumentada a 1.000 rpm e a aeração aumentou a 1,0 vvm com base no volume final. A alimentação foi adicionada a uma taxa constante de 0,1 h-1e executada por 20 horas gerando o volume final de 1,5 l. As células foram colhidas por centrifugação (8 minutos a 1.800 xg) e suspensas novamente em NaCl a 0,9% estéril.

[0100] A parte de SSF (meio total 1,5 kg) foi executada em pasta fluida de material lignocelulósico pré- tratado (pH 5,0, ajustado com NaOH a 3M) a 5% WIS e suplementado com 0,5 g/l de (NH4)2HPO4, Vitahop a 125 ppm e 0,4 ml/l de antiespumante (o mesmo que na propagação). As células novamente suspensas em NaCl a 0,9% foram adicionadas para gerar uma concentração celular final de 3 g de peso seco/l e enzimas (Cellic C-tec2, Novozymes) fora adicionadas para gerar 10 FPU/g de WIS para iniciar o processo. O fermentador (sem abafadores, Labfors) foi controlado 35 °C, ajuste de pH com NaOH a 3 M a 5,0, velocidade de agitador a aproximadamente 300 a 400 rpm e todas as entradas foram fechadas e a saída através do condensador foi aberta. As amostra para análise de metabólito foram tomadas pelo menos a: 0, 2, 4, 6, 8, 24, 48, 72, 96 e 137 horas.

[0101] Cepas em que esse tipo de caracterização foi conduzida: • Taurus07

[0102] No processo de SSF em 5% de WIS de pasta fluida de palha de trigo, foi bem claramente visto que a capacidade de consumo de xilose aprimorada das cepas da invenção foi vista também em tal processo. Além disso, a formação de subproduto xilitol foi reduzida como também visto nos outros tipos de caracterizações, consulte a Figura 10. Tabela 8. Porcentagem de consumo de xilose solúvel e formação de xilitol em experimentos de SSF em pastas fluidas de palha de trigo a 5% de WIS e 10 FPU/g de WIS de enzimas que degradam celulose.

i) Avaliação e fermentação com cepa de Saccharomyces Cerevisae, Taurus 04, em uma usina de fermentação em escala demonstrativa industrial Cultura de levedura

[0103] A cultura de levedura Taurus 04 foi propagada em três etapas com volume de cultura crescente. A levedura foi propagada na terceira etapa em um tanque de cultura a 10m3. A propagação foi feita em batelada alimentada com meio à base de melaço. A propagação forneceu biomassa de levedura em uma quantidade suficiente para ser usada no processo de SSF e a fermentação de hidrolisado descrita abaixo.

[0104] O rendimento da etapa de propagação foi 0,25 g/g durante a batelada e 0,36 g/g durante a batelada alimentada. A concentração de etanol foi 0 g/l durante toda a propagação, que é ideal de uma perspectiva de fermentação, Se etanol for encontrado no meio, o rendimento de células de levedura diminui, o que é indesejável. Assim, a levedura Taurus 04 é propagada bem em grande escala. Pré-tratamento de espiga de milho

[0105] O material cru foi resíduo de espiga de milho fornecida pela Hungary. O material tinha um peso seco de cerca de 85%. O material cru foi pré-tratado com ácido sulfúrico diluído como catalisador nos parâmetros de processo mostrados abaixo a fim de fornecer uma pasta fluida.

[0106] Em ambos os experimentos menos que 200 kg de filtrado/pasta fluida foram adicionados no início. Inicialmente, também água e pasta fluida foram adicionados a cada fermentador. Algumas substâncias químicas adicionais forma também adicionadas, que são mostradas abaixo juntamente com os parâmetros de processo.

[0107] No primeiro experimento (fermentação de hidrolisado), a pasta fluida foi filtrada e apenas a fração líquida foi usada. 2.840 litros de filtrado e cerca de 1.144 litros de líquido adicional foram totalmente adicionados durante o experimento. O filtrado foi continuamente adicionado durante as primeiras 24 horas do experimento.

[0108] As enzimas correspondentes a 5,3 FPU/g de WIS (sólidos insolúveis em água) foram adicionadas inicialmente para hidrolisar carboidratos oligoméricos. A concentração de levedura foi cerca de 5 g/l (calculada sobre o peso seco, DS). Resultados: Um consumo completo de xilose foi observado. 10% da xilose são convertidos em ácido láctico e xilitol e os restantes 90% da xilose foram convertidos em etanol. A concentração final de etanol é 10,9 g/l, consulte a Figura 11a.

[0109] Os inibidores HMF e furfural foram desintoxicados pela levedura e essas concentrações são a 0 g/l por todo o experimento. É também observado que tanto glicose quanto xilose foram consumidos na mesma taxa que a alimentação de pasta fluida durante as primeiras 24 horas e que o etanol produzido, sendo assim, deve se originar da xilose já que as hexoses já foram consumidas.

[0110] No segundo experimento (o processo de SSF), toda a pasta fluida foi adicionada. 2.844 kg de pasta fluida e 1.092 litros de líquido foram adicionados. Adicionalmente, a enzima correspondente a uma atividade de enzima de 15 FPU/g de WIS foi também adicionada. A concentração de levedura foi 5,0 g/l (TS). Resultados: No segundo experimento, a concentração de glicose e manose é próxima a 0 g/l durante todo o experimento assim como a concentração de ácido láctico. A levedura consome a xilose constantemente a cerca de 100 horas. Uma fermentação eficaz tanto de hexoses quanto de xilose leva a uma concentração final de etanol de 39,4 g/l, que corresponde a uma conversão de xilose em etanol de cerca de 40%, consulte a Figura 11b.

j) Tolerância a acetato e HMF durante crescimento em xilose pelas cepas TaurusOl, 03, 04, 07, 09 e 10 Detalhes do experimento:

[0111] Meio com xilose em ou 50 ou 100 g/l e pH 5,0 foi preparado contendo 10 g/l de extrato de levedura, ftalato de potássio a 100 mM com acetato e HMF em diferentes níveis. Acetato foi adicionado como acetato de sódio rendendo um nível de ácido acético a 0, 4, 7, ou 10 g/l (zero, baixo, médio e alto). HMF foram adicionados a 0, 2, ou 5 g/l (zero, baixo e alto). Todos os compostos foram dissolvidos em alguma quantidade de água, o pH foi ajustado antes da diluição até o volume final e a solução foi esterilizada por filtro. O pH foi medido nos meios estéreis e estavam na faixa entre 4,94 a 5,15. Todas as combinações resultaram em 24 diferentes tipos de meios. Os meio foram identificados como 1 a 12 para 50 g/l de xilose e 13 a 24 para 100 g/l de xilose. Os níveis de acetato foram colocados em grupos de três números 1 a 3, 4 a 6, 7 a 9, 10 a 12 para níveis zero, baixo, médio e alto respectivamente (e correspondente para alto teor de xilose). Dentro de cada grupo de três, o nível de HMF foi aumentada de zero para baixo e alto (por exemplo, 1, 2, 3). O anterior pode ser visto na Figura 10. No entanto, a figura não mostra a situação quando não há concentração ou de HMF ou acetato. Além disso, os gráficos para teste 11 e 12 não são mostrados na Figura 10 devido a um ambiente muito tóxico para as cepas.

[0112] Culturas inóculas foram feitas com meio YPDX e cultivadas por aproximadamente 24 horas. As células foram colhidas por centrifugação e suspensas novamente em água mQ estéril. A concentração de biomassa foi determinada e uma suspensão células a aproximadamente 3 g de peso seco /l foi preparada por diluição com água mQ estéril.

[0113] As fermentações foram feitas em tréplicas com 170 μl de meios e 30 μl de suspensão celular gerando uma concentração celular de partida a 0,46 g de peso seco/l no BioScreen (Growth Curves OY, Finlândia) a 30 °C por 72 horas com agitação contínua. A condição do BioScreen é semiaeróbica. Ao final do cultivo, os meios das culturas triplicadas foram misturados e filtrados para análise de HPLC (em xoluna BioRad HPX87H) para determinação dos produtos de fermentação, HMF, acetato e xilose.

Resultados:

[0114] O consumo de xilose, produção de etanol e propriedades de crescimento foram determinadas e a cepa Taurus07 mostrou melhor desempenho em condições mais desafiadoras com níveis de HMF mais altos e níveis de acetatos mais altos, consulte a Figura 12.

[0115] Os níveis de xilose altos impõem estresse extra para a célula que têm problemas em níveis de HMF mais altos.

k) Fermentação em material C5 com a cepa Taurus04

[0116] O licor C5 foi diluído a uma concentração de xilose de 50 a 60 g/l. A diluição foi feita com base na concentração de xilose no licor. O pH foi ajustado do licor a 5,5 (com KOH). O licor foi disperso em frascos de Erlenmeyer de 125 ml com 60 ml de licor por frasco. Antibiótico (penicilina G ou virginiamicina) foi adicionado a 5 ppm para impedir a contaminação bacteriana. Ureia foi adicionada a 0,06 g/l (1 mM) e extrato a 0,5 g/l (para nutrição). Levedura foi inoculada a 0,5 g de levedura seca/l. Os frascos foram incubados a 32 °C (em banho de água com agitação a 125 rpm).

[0117] A xilose foi consumida de modo eficaz, menos que 20 % de xilose permaneceram após 48 horas. O etanol foi produzido durante a maior parte da fermentação alcançando 10,1 g/l como o nível máximo após 64 horas. Isso gera um rendimento de etanol de 0,34 g de etanol/g de açúcares consumidos (do início até 64 horas). O rendimento de etanol durante apenas a fase de xilose, isto é, do tempo 17 horas até 64 horas, foi 0,30 g de etanol/g de xilos consumidos, consulte a Figura 13a.

l) Fermentação de sólidos C6 hidrolisados com Taurus 04

[0118] Para adaptação inicial das células no inóculo, 30 ml de hidrolisado C6 centrifugado e filtrado estéril foram adicionados à cultura (da mesma forma que para a fermentação C5, tempo de incubação de 5horas). Como para a fermentação C5, o pH foi ajustado com KOH a 10 M e a ureia e extrato de levedura foram dissolvidos no hidrolisado com pH ajustado para diluir o hidrolisado o mínimo possível (partículas remanescentes após a hidrólise não foram tiradas). A concentração celular de partida na cultura principal foi de 0,5 g de peso seco/l.

[0119] Os açúcares foram consumidos de modo eficaz. Toda a glicose foi finalizada após menos de 24 horas e após mais 48 horas mais de 85% da xilose foram consumidos. O etanol foi principalmente produzido durante as 48 horas iniciais alcançando 22,8 g/l como o nível máximo após 46 horas. Isso gera um rendimento de etanol de 0,39 g de etanol/g de açúcares consumidos (do início até 46 horas). O rendimento de etanol durante apenas a fase de xilose, isto é, do tempo 22 horas até 46 horas, foi 0,34 g de etanol/g de xilose consumidos, consulte a Figura 13b.

m) Sacarificação e fermentação simultâneas de material C5 e sólidos C6 com cepa Taurus 04

[0120] A propagação celular foi realizada como cultivo em batelada alimentada em meio YP com 20 g/l de glicose e 20 g/l de xilose. A alimentação consistiu em licor C5 ajustado ao pH 5,0 com KOH a 5 M e 40 g/l de sacarose suplementada. As células foram colhidas por centrifugação e suspensas novamente em água.

[0121] O meio para o experimento de SSF foi preparado em volume final de 1.500 g de pasta fluida com 15% de sólidos C6 totais. Como o material C6 continha 30% de sólidos e 70% de umidade, 750 g de material C6 foram misturados com 750 g de fração C5 e o pH foi ajustado a 5,5 com KOH a 10 M. Como os níveis de xilose e ácido acético no material foram muito baixos para presentar as condições apropriadas, 64,5 g de xilose e 3 g de ácido acético foram dissolvidos na pasta fluida para render concentrações totais de aproximadamente 57 g/l e 4 g/l, respectivamente. Ureia foi adicionada a 0,06 g/l, penicilina a 5 ppm e antiespumante (polietilenoglicol) a 0,2 ml/l. As condições do cultivo de SSF em fermentador Labfors (Infors HT) foram: temperatura 32 °C, pH controlado a 5,5 com NaOH a 5 M, velocidade de agitador a 600 rpm e entrada de gás fechada. O cultivo foi iniciado por adição de células para gerar 1 g de peso seco/l e 50 mg de extrato bruto/g de celulose de enzimas Cellic Ctec2 (Novozymes). O cultivo foi seguido por 120 horas por amostragem de meio extracelular (centrifugado a 14.500 rpm, 2 minutos, antes de ser filtrado e analisado conforme descrito acima).

[0122] Conforme mostrado na Figura 14, 20 g/l de xilose permaneceram após 120 horas de processo, que corresponde a que 70% da xilose solubilizada foram consumidos pela levedura. concentração de xilitol ao final da fermentação foi de 9 g/l e assim parte da xilose não foi convertida em etanol. A glicose foi ligeiramente aumentada durante as primeiras 6 horas de processo, devido à ação de enzimas celulolíticas, mas nenhuma acumulação de glicose foi encontrada depois no processo. Esse fato sugere que a levedura está consumindo glicose bem e a hidrólise enzimática poderia ser um fator limitante. A concentração final de etanol foi de 38,1 g/l. Do carregamento inicial de 15% sólidos totais, 228,75 g de açúcares totais estavam potencialmente disponíveis em 1,5 l de pasta fluida. Assim, o etanol produzido corresponde a um rendimento de 48% do rendimento teórico com base nos açúcares disponíveis totais, Figura 14.

Claims

1. CEPA DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE pela dita cepa ser Taurus 03 com número de deposição CBS128138.

2. CEPA DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE pela dita cepa ser Taurus 04 com número de deposição CBS128139.

3. CEPA DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE pela dita cepa ser Taurus 07 com número de deposição CBS128140.

4. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE ETANOL, caracterizado por compreender cultivar a cepa, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em uma cultura compreendendo materiais lignocelulósicos.

5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 4,caracterizado pela cultura compreender adicionalmente uma enzima hidrolítica adequada para utilização em um processo simultâneo de sacarificação e fermentação (SSF).