CN103627644B

CN103627644B - 一种酿酒酵母变异菌株及其应用

Info

Publication number: CN103627644B
Application number: CN201310513453.XA
Authority: CN
Inventors: 龚大春; 李小娟; 肖玲玲; 郭金玲; 吕育财; 田毅红; 李德莹; 陈卫峰
Original assignee: China Three Gorges University CTGU
Current assignee: Bee Production Yichang Biotechnology Co ltd
Priority date: 2013-10-26
Filing date: 2013-10-26
Publication date: 2015-09-30
Anticipated expiration: 2033-10-26
Also published as: CN103627644A

Abstract

本发明提供了一种酿酒酵母变异菌株GDC01（Saccharomyces Cerevisiae Drugtolerant），于2013年9月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO：M2013411。提供多级驯化选育方法，选择具有耐毒性的酿酒酵母变异菌株，将该酿酒酵母变异菌株用于生产纤维素乙醇，结果表明，糖醇转化率达85%以上，耐毒酵母经连续传代5次，其产乙醇性能基本维持在100g/L，产乙醇性能基本保持稳定。

Description

一种酿酒酵母变异菌株及其应用

技术领域

本发明涉及一种具有耐毒酿酒酵母变异株的选育方法、选育得到的菌株的应用，属于生物技术和微生物技术领域。

背景技术

随着化石燃料资源的日益枯竭和使用过程中产生的一系列环境污染问题，纤维素乙醇以木质纤维素来源广泛，可再生，被认为是最具有发展前景的新型能源之一。但是在木质纤维素的预处理的过程中，会不可避免地产生一些对酿酒酵母生长和发酵有抑制作用的物质，这些抑制因子主要是甲酸、乙酸、糠醛，它们能延长一般用于淀粉质发酵中的酿酒酵母生长的延滞期，严重减少乙醇产量，成为木质纤维素开发为燃料乙醇的关键难题。

研究发现，传统用于淀粉质的酿酒酵母（Saccharomyces Cerevisiae）在经过预处理后的木质纤维素糖化液中，糖醇率仅为50%左右。为了促进纤维素乙醇的工业化进程，人们对水解液进行脱毒处理，但是此方法会增加生产成本，而且在脱毒处理过程中也会损失部分糖类。而通过驯化选育耐毒酿酒酵母，不仅成本低廉，而且相比较基因重组的菌种而言，具有稳定的遗传性，因此寻找耐毒的高产酒精酵母对纤维素乙醇的可持续发展具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种酿酒酵母变异菌株（Saccharomyces Cerevisiae drugtolerant），该酿酒酵母变异菌株经驯化选育后对乙酸、甲酸、糠醛具有一定的耐毒性。

所述的酿酒酵母变异菌株GDC01（Saccharomyces Cerevisiae Drugtolerant），于2013年9月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTTCC NO：M 2013411，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。

本发明的另一目的在于提供一种耐毒性酿酒酵母变异菌株的驯化选育方法，所述的耐毒酿酒酵母变异菌株是以淀粉质糖化液发酵良好的酿酒酵母为原始出发菌株，为淀粉质乙醇发酵行业目前普遍使用的酿酒酵母（Saccharomyces Cerevisiae）菌株，该菌株乙醇发酵性能优良（安琪酵母股份有限公司生产赠送）。

按照逐级驯化的培养方法，经逐级驯化后，筛选出来的菌株接种到含有0-4g/L乙酸0.1-0.5甲酸和0-1g/L糠醛的斜面培养基中，保持菌株的耐毒能力。图1为耐毒性酿酒酵母菌株选育及性能评价流程图，具体步骤为：

1）将在4℃冰箱保藏的斜面酿酒酵母菌种在室温下活化4-6小时后，接种至250mL装有100mL培养基的三角瓶中，在3℃、150rpm条件下摇瓶培养24小时后，可以用于转接；

2）取斜面培养基上的一环菌种接种到活化培养基中，28°C、150 r/min培养24h，取10 mL活化后的菌液接种到90mL驯化培养基中，保证最初的生物量为0.1g/L，每隔6-12h测量样品中的生物量和葡萄糖含量；

3）当培养液中的葡萄糖含量小于起始葡萄糖含量的百分之九十时，摇床停止晃动，静止15min，使培养基中的菌体自然沉淀在摇瓶底部，在无菌的条件下，把摇瓶底部的10mL菌液接种到下一个批次90mL的驯化培养基中，摇床恢复晃动，此时作为下一个批次驯化的起始位点，重复以上操作，完成逐级驯化，在驯化菌种的过程中，当培养液中的葡萄糖含量小于起始葡萄糖含量的百分之九十时，要迅速更换培养基，每个抑制剂在逐级驯化中至少重复8次。

所述的斜面培养基的组分为：葡萄糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母浸粉3 g/L，麦芽浸粉3 g/L，琼脂20 g/L；活化培养基的组分为：葡萄糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母浸粉3 g/L，麦芽浸粉3 g/L；驯化培养基的组分为：葡萄糖25g/L，酵母浸粉1g/L，KH₂PO₄1 g/L，(NH₄)₂SO₄ 0.4g/L，MgSO₄.7H₂O 0.08 g/L，抑制剂。

所述的抑制剂为乙酸或甲酸或糠醛，所述的乙酸的浓度为0.8~4.0g/L，甲酸的浓度为0.1~0.5g/L，糠醛的浓度为0.2~1.0g/L。

所述的乙酸的逐级驯化培养浓度分别为0.8 g/L、1.6 g/L、2.4 g/L、3.2 g/L、4.0 g/L；甲酸的逐级驯化培养浓度分别为0.1 g/L、0.2 g/L、0.3 g/L、0.4 g/L、0.5 g/L；糠醛的逐级驯化培养浓度分别为0.2 g/L、0.4 g/L、0.6 g/L、0.8 g/L、1.0 g/L。

耐毒能力：变异株在毒性环境下也能生长旺盛。抑制剂浓度在乙酸3.2g/L，糠醛0.8g/L，甲酸0.4g/L时，在18h后，耐毒酵母就进入对数生长期，生物量随着时间的增加而缓慢增长，而且原始菌株一直处于延滞期，生物量一直没有明显的变化，细胞密度低于10⁶个。图2为耐毒酿酒酵母与传统淀粉质酿酒酵母生物量在抑制剂乙酸3.2g/L，糠醛0.8g/L，甲酸0.4g/L时的培养基中的生长差异曲线图。

细胞膜的完整性：通过对胞外镁离子含量的测定，原始出发菌株胞外镁离子含量为1.0257 ug/mL，而耐毒酵母外泄的镁离子含量为0.3976 ug/mL，说明耐毒酵母在专利所要求的范围内抑制剂浓度下，细胞膜基本完好。如图3为耐毒酵母与传统淀粉质酿酒酵母在耐毒环境下（即，抑制剂乙酸3.2g/L，糠醛0.8g/L,甲酸0.4g/L）细胞膜完整性差别。

本发明的又一目的在于提供一种经驯化选育的酿酒酵母变异菌株在生产纤维素乙醇上的应用。

本发明的耐毒酿酒酵母能够将纤维素质来源的可发酵性糖转化成乙醇和二氧化碳，所述的纤维素乙醇按照有关国家标准，与汽油或柴油配混后，可用于机动车、船等的燃料。

本发明的再一目的在于提供一种经驯化选育的酿酒酵母变异菌株生产纤维素乙醇的方法。具体为：

原料粉碎：将木质纤维素首先粉碎成1.0-3.0mm的粉料。

预处理：并将粉碎的纤维质原料与水以质量比为1：1-1：3混合，在温度180-230℃、压力为0.5-1MPa下，保温1-5min，快速卸料，收集料液，去除了大部分木质素，以利于纤维素酶的酶解糖化。

酶解：控制上述纤维素料液含量在20%(w/w)以上，按纤维素酶滤纸酶活 30-45(U/g)，β-葡萄糖苷酶 15-25(U/g)，木聚糖酶200-400(U/g)添加酶制剂，混合搅拌，并往搅拌罐通入蒸汽和水后，水解，可得到糖浓度在100g/L以上的糖化液。

发酵：将酿酒酵母变异株的种子液依次接种至一级种子罐中、二级种子罐，培养至还原糖浓度降低到0.2%（w/v），再接种到纤维素糖化液中进行发酵其中糖化液中添加浓度为0.15g/L的KH₂PO₄。

分离：发酵终止后经板框过滤除渣，滤液经蒸馏得到乙醇液。

所述的酶解过程中控制搅拌罐的温度为50+2℃，搅拌速度为80-150rpm，pH为4.6+2，水解时间为144-150h。

所述的发酵过程中二级种子罐体积是一级种子罐体积的8-12倍，种子罐内温度为30+2℃，pH 4.2 + 0.2，转速280 -350rpm、通气量0.1vvm，发酵罐内的温度为30+2℃，发酵pH值为4.2+0.3，转速为80-100 rpm。

所述的木质纤维素原料为作物秸秆、废气林木、草本植物秆。

糖醇转化率：对工业生产所用的木质纤维素糖化液，其糖醇转化率可达到85%以上。

产乙醇稳定性能：耐毒酵母经连续传代5次，其产乙醇性能稳定，基本维持在100 g/L，结果如表1所示。

表1耐毒酵母产乙醇性能稳定性测试

传代次数	1	2	3	4	5
						糖醇转化率（%）	85.4 9	85.6	85.5	85.4	85.4

本发明人利用在淀粉质中发酵性能优良的酿酒酵母采用逐渐增加抑制剂的浓度连续驯化方法，找到一株适用于纤维素水解液发酵生产乙醇的耐毒酿酒酵母菌株GDC01，该菌株在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC M 2013411。该耐毒酵母变异菌株糖醇转化率高，稳定性强，对开发利用新型燃料提供了一种新的路径。

附图说明

图1为耐毒性酿酒酵母菌株选育及性能评价流程图。

图2为耐毒酿酒酵母与传统淀粉质酿酒酵母生物量在相同培养基下的差异。

图3耐毒酵母与传统淀粉质酿酒酵母在耐毒环境下细胞膜完整性差别。

具体实施方式

实施例1

出发菌株及各种培养基的制备

本实施例的出发菌株之一为淀粉质乙醇发酵行业目前普遍使用的酿酒酵母（Saccharomyces Cerevisiae）菌株，该菌株乙醇发酵性能优良（安琪酵母股份有限公司生产赠送）。

4℃冰箱保藏的斜面菌种在室温下活化4-6小时后，接种至250mL装有100mL培养基的三角瓶中，在3℃、150rpm条件下摇瓶培养24小时后，可以用于转接。

三种培养基的组成如下：

斜面培养基：葡萄糖10 g/L,蛋白胨5 g/L，酵母浸粉3 g/L，麦芽浸粉3 g/L，琼脂20 g/L。

活化培养基：葡萄糖10 g/L,蛋白胨5 g/L，酵母浸粉3 g/L，麦芽浸粉3 g/L

驯化培养基：葡萄糖25g/L，酵母浸粉1g/L，KH₂PO₄1 g/L，(NH₄)₂SO₄ 0.4g/L，MgSO₄.7H₂O 0.08 g/L，一定的抑制剂浓度，即分别得到A、B、C、D、E五种抑制剂浓度逐渐升高的逐级驯化培养基，如表2所示。

表2 显示所设计的五种驯化的培养基

抑制剂种类	A	B	C	D	E
						乙酸(g/L)	0.8	1.6	2.4	3.2	4.0
甲酸(g/L)	0.1	0.2	0.3	0.4	0.5
						糠醛(g/L)	0.2	0.4	0.6	0.8	1.0

耐毒酿酒酵母的驯化方案

取斜面培养基上的一环菌种接种到活化培养基中，28°C、150 r/min培养24h。取10 mL活化后的菌液接种到90mL驯化培养基A中，保证最初的生物量为0.1g/L，每隔6-12h测量样品中的生物量和葡萄糖含量。当培养液中的葡萄糖含量小于起始葡萄糖含量的百分之九十时，摇床停止晃动，静止15min，使培养基中的菌体自然沉淀在摇瓶底部。在无菌的条件下，把摇瓶底部的10mL菌液接种到下一个批次90mL的驯化培养基中，摇床恢复晃动，此时作为下一个批次驯化的起始位点，重复以上操作，依次逐级驯化的培养基为B、C、D、E。直到完成所有批次的驯化。在驯化菌种的过程中，当培养液中的葡萄糖含量小于起始葡萄糖含量的百分之九十时，要迅速更换培养基，尽量减少菌体的饥饿时间。为了使菌体能更好的适应抑制剂浓度的变化，每个抑制剂浓度的驯化要重复8次以上。得到的一些优势菌株保藏在4°C以下的冷藏室中待分离纯化检测。

实施例2

纤维素质糖化液的制备

采用蒸汽爆破法处理的木质纤维素，通过纤维素复合酶工艺制备糖化液，糖化过程均在一工容积为20L带夹套的搅拌罐中进行。

木质纤维素经过粉碎爆破后纤维素含量一般在55%以上，抑制剂浓度乙酸在4.0 g/ L以下，甲酸在0.5 g/L以下，糠醛在1g/L以下。

纤维素酶和木聚糖酶购自山东泽生生物科技有限公司。β-葡萄糖苷酶酶活2.5 U/mL自制。

称取4kg木质纤维素粉，与预先加入至约48 ℃的16L自来水以1：4的配料配制成粉浆，然后按每克纤维素滤纸酶活30U，β-葡萄糖苷酶15U，木聚糖酶400U添加酶制剂，搅拌罐夹套通入蒸汽和水后，维持50 ℃，控制pH 值 4.8，搅拌速度根据流体黏度控制在120-150rpm，水解150 h。得到还原糖浓度110g/L，其中葡萄糖浓度在90 g/L以上。

糖化结束后，得到总糖浓度为22-24%（w/v）的糖化液，添加适量KH₂PO₄后，可以用于酵母培养或乙醇发酵。发酵用高糖浓度培养基分装到2000mL三角瓶中，装样量为1200mL，灭菌温度为110 ℃，时间20分钟，以避免糖损耗及抑制物产生。

由于糖液灭菌后被灭酶，发酵过程后糖化作用被破坏，为了发酵过程获得尽可能低的残糖浓度及较高的乙醇浓度，糖液流加前按照糖化时加酶量，直接向糖化液中加入0.2 μm滤膜过滤除菌的糖化液。

发酵过程

将1000mL摇瓶培养的耐毒酿酒酵母悬浮液，接种到1L一级种子罐中，在温度28-32℃、pH 4.2 + 0.2（使用氨水调节）、转速300 rpm、通气量0.1vvm（100mL/分钟）条件下培养至还原糖浓度降低到约0.2%（w/v），再转接到10 L二级种子罐，调节通风量，培养至还原糖浓度降低到0.2%（w/v）。根据发酵罐规模，可以依次进行种子放大培养。然后接种到发酵罐，开始以40 mL/h的速率流总糖浓度22-24%（w/v）的高浓度纤维糖化液，糖化液中添加0.15 g/L的KH₂PO₄，培养18h后，降低搅拌转速80-100 rpm，直到还原糖降到0.2 %以下。可得到乙醇含量在12-13%（v/v）。

乙醇的蒸馏

将乙醇发酵液进行板筐过滤，滤液采用粗馏、精馏等常规方法得到95%以上的乙醇。滤渣可以用作肥料或提取木质素产品。

耐毒酿酒酵母发酵产乙醇性能如表3所示。

表3为耐毒酵母与原始菌株发酵参数的比较

菌株	耐毒酵母	原始菌株
			比生长速率（1/h）	0.047	0.028
乙醇生长能力（g/L h）	0.149	0.055
			乙醇产率（g/g）	0.431	0.25
生物量产率（g/g）	0.0108	0.00356

本实例进一步试验上述获得的具有耐毒酿酒酵母的发酵性能和菌株的稳定性。

连续发酵的培养基为上述实例1中的纤维素糖化液，控制抑制剂浓度乙酸在3.8g/L，甲酸0.5g/L，糠醛 0.8g/L，糖流加稀释率为0.05h-1，发酵温度30 + 2 ℃，pH 4.2 + 0.2，通风量 0.05 vvm（50 mL/分钟）。发酵装置连续运行3个月，测定游离细胞密度不低于10⁷个，表明选育得到的耐毒酿酒酵母传代稳定性好。

由于选育得到的耐毒酵母菌株的发酵条件，包括发酵底物、发酵温度、pH等就均与出发菌株淀粉质乙醇发酵工业生产条件相同，其乙醇发酵性能评价指标主要考察发酵过程糖醇收率，按照公式（1）进行计算：

X= （消耗葡萄糖实际产乙醇量）/(所提供葡萄糖理论产乙醇量)………..(1)

乙醇和糖的检测方法按照发酵行通用的监测方法监测，乙醇采用气相色谱监测，糖可以采用液相或紫外分光光度法检测。

结果显示，耐毒酿酒酵母变异株的糖醇收率可以达到85%以上。

Claims

1.酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）GDC01，于2013年9月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO：M 2013411。

2.一种如权利要求1所述的酿酒酵母在生产纤维素乙醇中的应用。

3.如权利要求2所述的酿酒酵母在生产纤维素乙醇中的应用，具体是将木质纤维素首先粉碎成1.0-3.0mm的粉料，并将粉碎的纤维质原料与水以质量比为1：1-3混合，在温度180-230℃、压力为0.5-1MPa下，保温1-5min，快速卸料，收集料液，其特征在于：该方法还包括以下步骤，

1）酶解：控制上述纤维素料液含量在20%(w/w)以上，按纤维素酶滤纸酶活 30-45U/g，β-葡萄糖苷酶 15-25U/g，木聚糖酶200-400U/g添加酶制剂，混合搅拌，并往搅拌罐通入蒸汽和水后，水解，得糖化液；

2）发酵：将酿酒酵母变异株的种子液依次接种至一级种子罐中、二级种子罐，培养至还原糖浓度降低到0.2%（w/v），再接种到纤维素糖化液中进行发酵，其中糖化液中添加浓度为0.15g/L的KH₂PO₄；

3）分离：发酵终止后经板框过滤除渣，滤液经蒸馏得到乙醇液。

4.如权利要求3所述的酿酒酵母在生产纤维素乙醇中的应用，其特征在于：酶解过程中控制搅拌罐的温度为50+2℃，搅拌速度为80-150rpm，pH为4.6+2，水解时间为144-150h。

5.如权利要求3所述的酿酒酵母在生产纤维素乙醇中的应用，其特征在于：发酵过程中二级种子罐体积是一级种子罐体积的8-12倍，种子罐内温度为30+2℃，pH 4.2 + 0.2，转速280 -350rpm、通气量0.1vvm；发酵罐内的温度为30+2℃，发酵pH值为4.2+0.3，转速为80-100 rpm。

6.如权利要求3所述的酿酒酵母在生产纤维素乙醇中的应用，其特征在于：木质纤维素原料为作物秸秆、废弃林木、草本植物秆中的一种或多种。