JPH1014589A - キャンディダ・リポリティカhna−110株及び2,6−ジヒドロキシ−3−ナフトエ酸の製造方法 - Google Patents

キャンディダ・リポリティカhna−110株及び2,6−ジヒドロキシ−3−ナフトエ酸の製造方法

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JPH1014589A
JPH1014589A JP17768696A JP17768696A JPH1014589A JP H1014589 A JPH1014589 A JP H1014589A JP 17768696 A JP17768696 A JP 17768696A JP 17768696 A JP17768696 A JP 17768696A JP H1014589 A JPH1014589 A JP H1014589A
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JP
Japan
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naphthoic acid
dihydroxy
strain
hna
candida
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JP17768696A
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Satoshi Kawanaka
聡 川中
Kazutsugu Kitahata
千嗣 北畠
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Unitika Ltd
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Unitika Ltd
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 優れた2,6−ジヒドロキシ−3−ナフトエ
酸産生能を有するキャンディダ・リポリティカ(Candid
a lipolytica)に属する新規な酵母及び2,6−ジヒド
ロキシ−3−ナフトエ酸を高収率で、かつ、高純度で製
造することのできる2,6−ジヒドロキシ−3−ナフト
エ酸の製造方法を提供する。 【解決手段】 2,6−ジヒドロキシ−3−ナフトエ酸
産生能を有すること特徴とするキャンディダ・リポリテ
ィカ(Candida lipolytica)HNA−110株(FER
M P−15613)。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、2−ヒドロキシ−
3−ナフトエ酸(以下、2H3NAと略す)から2,6
−ジヒドロキシ−3−ナフトエ酸(以下、2,6DH3
NAと略す)を産生する能力を有する酵母キャンディダ
・リポリティカ(Candida lipolytica)HNA−110
株及び2,6DH3NAの製造方法に関するものであ
る。
【0002】
【従来の技術】2,6DH3NAは、医薬品前駆体、農
薬、顔料分散体、感熱記録体、金属防食体として有用な
化合物であり、さらに、特開平4−364156号公報
には、そのアミド化された化合物がロイコトリエン類の
産生抑制作用、ヒスタミン拮抗作用を有することから、
優れた抗アレルギー活性化合物であることが報告されて
いる。従来、2,6DH3NAは公知の有機合成法によ
り、ナフタレンあるいは2H3NAを原料として、複雑
な反応条件下で合成及び製造されていた。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】しかし、有機合成法で
は、位置選択的に合成することができないため、精製収
率が非常に低く、また、純度的にも満足できるものでは
なかった。本発明は、優れた2,6DH3NA産生能を
有するキャンディダ・リポリティカ(Candida lipolyti
ca)に属する新規な酵母を提供することを目的とするも
のである。また、本発明は2,6DH3NAを高収率
で、かつ、高純度で製造することのできる2,6DH3
NAの製造方法を提供することを目的とするものであ
る。
【0004】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、このよう
な状況に鑑み、既知及び未知の微生物を京都府下の土壌
からスクリーニングした結果、キャンディダ・リポリテ
ィカ(Candida lipolytica)に属する酵母が2H3NA
から2,6DH3NAを高収率で産生するということを
見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、第一の
発明は、2,6DH3NA産生能を有することを特徴と
するキャンディダ・リポリティカ(Candida lipolytic
a)HNA−110株(FERM P−15613)を
要旨とするものである。また、第二の発明は、2H3N
Aにキャンディダ(Candida )属に属する酵母を作用さ
せることを特徴とする2,6DH3NAの製造方法を要
旨とするものである。
【0005】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
まず、本発明のキャンディダ・リポリティカ(Candida
lipolytica)HNA−110株について説明すると、こ
の菌株は京都府下の土壌から分離されたもので、以下の
ような菌学的性質を有している。
【0006】(a)培養的・形態的性質 栄養細胞の形態は球〜卵形で、増殖形式は多極出芽であ
る。25℃で3日間の振盪液体培養においては、細胞の
沈澱及び培地表面に皮膜の形成が確認できた。偽菌糸及
び真菌糸の形成は認められた。
【0007】(b)胞子の形成 子嚢胞子はアダムス、ゴロドバ、麦芽、YM、V−8、
ポテトデキストロースの各培地で形成は認められなかっ
た。
【0008】 (C)生理学的・化学分類学的性質 (1)生育至適温度 22〜28℃ (2)硝酸塩の資化 − (3)尿素分解 + (4)ビタミン要求性 − (5)リパーゼ + (6)プロテアーゼ + (7)資化性の有無 資化性 発酵性 L−アラビノース − D−リボース − D−キシロース − グルコース + − ガラクトース − − L−ラムノース − マルトース − − シュークロース − − ラクトース − − メリビオース − セロビオース − トレハロース − ラフィノース − − メレチトース − スターチ − エリスリトール + イノシトール − D−マンニトール + 乳酸塩 + コハク酸塩 + クエン酸塩 + グリセロール + リビトール −
【0009】以上の結果から、エヌ・ジェイ・ダブル・
クレガーバン・リジ(N.J.W.Kreger-van Rij)のザ・イ
ースト1984年(The Yeast 1984,Elsevier Science
Publishers B.V.)を用いて検討したところ、この菌株は
キャンディダ・リポリティカ(Candida lipolytica)で
あると同定した。なお、キャンディダ・リポリティカ
(Candida lipolytica)はサッカロマイコプシス・リポ
リティカ(Saccharomycopsis lipolytica )の不完全世
代であり、サッカロマイコプシス・リポリティカ(Sacc
haromycopsis lipolytica )は1980年にヤロウウィ
ア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica )に移行され
ている。この菌株は、2H3NAから2,6DH3NA
の変換率が90%以上と特に高いことから新菌株と判断
されるため、キャンディダ・リポリティカ(Candida li
polytica)HNA−110株と命名し、工業技術院生命
工学工業技術研究所に寄託した。その寄託番号はFER
M P−15613である。次に、本発明の2,6DH
3NAの製造方法について説明する。
【0010】本発明に用いられる微生物としては、キャ
ンディダ(Candida )属に属し、2H3NAから2,6
DH3NAを産生できる酵母であればいかなる菌株でも
よく、例えばキャンディダ・リポリティカ(Candida li
polytica)IFO−0717、0746、1195、1
209、1457、1542、1548、1549、1
550、1551、1601、1632、1658、1
659、1741、1742、1746、10073株
等が挙げられるが、その中でも2,6DH3NAの産生
能が高い点からキャンディダ・リポリティカ(Candida
lipolytica)HNA−110株を用いることが好まし
い。
【0011】本発明においては、このような微生物を2
H3NAを含む培地で培養することにより2,6DH3
NAを製造することができる。このときの培地中の2H
3NAの濃度としては、10〜50,000mg/リッ
トルであることが好ましく、特に50〜10,000m
g/リットルであることが好ましい。なお、2H3NA
は比較的疎水性であるために、弱酸性あるいは中性の培
地に50mg/リットル以上の濃度で添加すると、培地
表面あるいは培地中に微粒子として浮遊する場合がある
が、変換反応が進むにつれて徐々に溶解し、2,6DH
3NAに変換されるので問題はないが、ツイン80やト
リトンX100のような公知の界面活性剤を培地に添加
して反応を促進させることもできる。
【0012】培地の炭素源としては、グルコース、D−
マンニトールのような炭水化物類、グリセリンのような
有機物類、クエン酸、乳酸、コハク酸のような有機酸が
挙げられるが、好ましくはグルコースのような炭水化物
である。窒素源としては、特に限定されるものではない
が、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモ
ニウム、尿素等の無機窒素源、カゼイン、ポリペプトン
や肉エキスのような有機窒素源が利用できる。また、有
機窒素源は有機炭素源としても利用することができる。
無機塩類としては、各種のリン酸塩、硫酸マグネシウム
等が利用できる。さらに、微量の無機重金属塩(鉄塩、
マンガン塩等)あるいはビタミン類を添加してもよく、
イーストエキスのような有機物を微量金属源、ビタミン
類源として添加してもよい。
【0013】培養方法としては、振盪培養、通気撹拌培
養等の公知の一般的な微生物の培養方法を適用すること
ができる。培養温度としては、15〜35℃が好まし
く、特に好ましくは22〜28℃である。培養時のpH
としては、3〜9が好ましく、特に好ましくは5〜7で
ある。培養日数としては、2,6DH3NAの変換率に
応じて適宜設定すればよいが、8〜15日間が好まし
い。また、本発明においては、菌体をあらかじめ炭水化
物と有機窒素源を含むような培地で大量に培養してお
き、回収した培養菌体を2H3NA水溶液と混合、撹拌
することにより2,6DH3NAを製造することもでき
る。
【0014】さらに、本発明においては、繊維状担体、
プラスチック製担体、FRP担体、シリコン製担体等の
公知の微生物担体に固定化したり、PVA、ポリアクリ
ルアミドゲル、寒天、コラーゲン、アルギン酸塩等の高
分子ゲルに菌体を包括した菌体固定化物を用いることも
可能であり、例えば、菌体固定化物を反応塔に充填し、
2H3NAを含有する培地を通水して回分的あるいは連
続的にバイオリアクターとして使用することも可能であ
る。
【0015】上記の方法で得られた2,6DH3NA
は、酢酸エチル、ジエチルエーテル等の有機溶媒による
抽出、シリカゲルカラムクロマトグラフィーや陰イオン
カラムクロマトグラフィー等の公知の手法によって精製
することができる。
【0016】なお、本発明で使用する2H3NAはナフ
タレンから工業的に製造されている安価な原料であり、
容易に入手することができる。本発明においては、2H
3NAとしては、ジメチルスルホキシド溶液等の形態の
ものも使用することができる。
【0017】
【実施例】次に、本発明を実施例によって具体的に説明
する。 実施例1 無機液体培地(硫酸アンモニウム 2.5g/リット
ル、硫酸マグネシウム7水和物 250mg/リット
ル、リン酸二水素カリウム 500mg/リットル、塩
化カルシウム2水和物 10mg/リットル、塩化ナト
リウム 500mg/リットル、pH6.5)400ミ
リリットルに、2H3NAのジメチルスルホキシド溶液
(20mg/ミリリットル)2ミリリットルを添加した
後、あらかじめサブロー培地(グルコース 4重量%、
ペプトン 1重量%)で培養しておいたキャンディダ・
リポリティカ(Candida lipolytica)HNA−110株
(FERM P−15613)菌体500mgを添加し
て、28℃で20日間振盪培養した。この間の培地中の
2H3NA及び2,6DH3NAを高速液体クロマトグ
ラフィー(以下、HPLCと略す)により定量した。H
PLCの分析条件としては、カラムはC18μBondapack
(ウォーターズ社製)を用い、溶出は7mMのリン酸水
溶液からメタノールへのリニアグラジェント溶出を流速
1ミリリットル/分で行い、検出はUV254 の吸収によ
り行った。
【0018】その結果を図1に示す。図1は、2,6D
H3NAの生成量及び2H3NAの残存量の経時変化を
示す図であり、縦軸に2,6DH3NA及び2H3NA
の量を、横軸に培養時間を示している。図1からわかる
ように培養20日後には2H3NAの99.9%が2,
6DH3NAに変換されていた。このときの純度は9
6.2%であった。
【0019】さらに、この培養液400ミリリットルを
塩酸によりpHを4.0付近に調整し、酢酸エチル40
0ミリリットルにより、3回抽出し、ロータリーエバポ
レーター(30℃)で溶媒を除去することにより2,6
DH3NAの乾固物43.2mgを得た。このときの回
収率は98.0%であった。
【0020】実施例2〜7 本発明のキャンディダ・リポリティカ(Candida lipoly
tica)HNA−110株(実施例2)、キャンディダ・
リポリティカ(Candida lipolytica)IFO−0717
株(実施例3)、1195株(実施例4)、1457株
(実施例5)、1658株(実施例6)、10073株
(実施例7)を用いて、2H3NAから2,6DH3N
Aを以下のようにして製造した。
【0021】無機液体培地40ミリリットルに2H3N
Aのジメチルスルホキシド溶液(20mg/ミリリット
ル)を0.5ミリリットル添加し、これに、あらかじめ
サブロー培地において2日間培養しておいた湿菌体10
0mgを添加し、28℃で振盪培養した。培養8日後、
培地中の2,6DH3NAを実施例1と同様にして定量
した。その結果を表1に示す。
【0022】
【表1】
【0023】表1からわかるように、キャンディダ属に
属する酵母を用いることにより2H3NAから2,6D
H3NAを製造することができた。さらに、本発明のキ
ャンディダ・リポリティカ(Candida lipolytica)HN
A−110株を用いることにより最も効率よく2,6D
H3NAを製造することができた。
【0024】実施例8 約2重量%のアルギン酸ナトリウム溶液50ミリリット
ルにあらかじめサブロー培地で培養しておいたキャンデ
ィダ・リポリティカ(Candida lipolytica)HNA−1
10株菌体5gと水25ミリリットルとを混合し、均一
になるまで攪拌した。次いで、5重量%の塩化カルシウ
ム溶液400ミリリットルに上記菌液を少量づつゆっく
りと滴下し、一晩4℃で放置した後、ろ過してアルギン
酸ゲル包括菌体を得た。このアルギン酸ゲル包括菌体を
筒上のプラスチック製カラム200ミリリットル内に生
体触媒充填率20〜40容量%で充填した。そこに、2
H3NA50mg/リットルを含む無機液体培地液を滞
留時間20時間で約1ヶ月間通水した。この結果、平均
変換率95.3%、純度92.4%で2,6DH3NA
を得ることができた。
【0025】
【発明の効果】本発明の菌株は、優れた2,6DH3N
A産生能を有している。このため、2,6DH3NAの
製造に有用である。また、本発明の製造方法によれば、
複雑な反応や精製方法を用いることなく、温和な条件下
において高収率で、かつ、高純度で2H3NAから2,
6DH3NAを製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明のキャンディダ・リポリティカ(Candid
a lipolytica)HNA−110株を用いて2,6DH3
NAを製造したときの、2,6DH3NAの生成量及び
2H3NAの残存量の経時変化を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12R 1:73)

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 2,6−ジヒドロキシ−3−ナフトエ酸
    産生能を有することと特徴とするキャンディダ・リポリ
    ティカ(Candida lipolytica)HNA−110株(FE
    RM P−15613)。
  2. 【請求項2】 2−ヒドロキシ−3−ナフトエ酸にキャ
    ンディダ(Candida)属に属する酵母を作用させること
    を特徴とする2,6−ジヒドロキシ−3−ナフトエ酸の
    製造方法。
JP17768696A 1996-07-08 1996-07-08 キャンディダ・リポリティカhna−110株及び2,6−ジヒドロキシ−3−ナフトエ酸の製造方法 Pending JPH1014589A (ja)

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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2003016544A1 (fr) * 2001-08-10 2003-02-27 Meiji Dairies Corporation Procede d'elaboration d'acide 1,4-dihydroxy-2-naphtoique
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