CZ412997A3

CZ412997A3 - Způsob selektivní redukce ketoskupin

Info

Publication number: CZ412997A3
Application number: CZ974129A
Authority: CZ
Inventors: Christopher David Reeve
Original assignee: Zeneca Limited
Priority date: 1995-06-23
Filing date: 1996-06-17
Publication date: 1998-03-18
Also published as: EP0833938A1; JPH11507204A; AU6230696A; DK0833938T3; EP0833938B1; WO1997000968A1; CA2221800A1; US6001615A; JP3580825B2; DE69626820T2; CA2221800C; DE69626820D1; ATE234935T1; ES2194995T3; CZ291886B6; GB9512837D0

Description

Způsob selektivní redukce ketoskupin

Oblast techniky

Vynález se týká redukce ketoskupin.

Dosavadní stav techniky

Z práce, kterou uveřejnili Brower a kol., Tetrahedron Letters 1992, str. 2279 - 2282, je známá syntéza sloučeniny vzorce I

pomocí diastereoselektivní redukce sloučeniny obecného vzorce II

OH 0 0 za použití způsobu, který popsali Chen a kol., Tetrahedron Letters 1987, 28, 155 a Chem Lett 1987, 1923, s následujícím chráněním ve formě acetonidu. Byla popsána rovněž příprava sloučeniny I pomocí Claisenovy reakce. Při provádění těchto způsobů však bylo nutné používání teplot -90° C, v důsledku čehož jsou nákladné a složité.

Sloučeninu I lze použít jako meziprodukt při_ syntéze CI-981, inhibitoru HMG-CoA-reduktasy, který snižuje celkový obsah cholesterolu v plazmě a obsah nízkohustotního lipoproteinu u člověka. Jeho základní strukturní prvek lze získat rovněž ze sloučeniny obecného vzorce III

OH OH 0

0R (III) ©

Ve skupinu, výhodněj i výše uvedených vzorcích R představuje alkylovou výhodně obsahující 1 až 6 atomů uhlíku, a ještě představuje terč.butylovou skupinu.

Podstata vynálezu

Nyní bylo zjištěno, že sloučeninu obecného vzorce III lze připravit redukcí sloučeniny obecného vzorce II se střední až vysokou selektivitou a při příhodných teplotách za použití keton-reduktasy běžně se nacházející v druzích rodů Beauveria, Pichia, Candida, Kluyveromyces a Torulaspora, že se však u každého rodu mohou vyskytovat výjimky doprovázen dalším možné, že je enzym stereospecificitou.

enzymem s nebo je opačnou

Vynález tudíž vzorce III selektivní zahrnuj e redukcí přípravu sloučeniny obecného

OH

NC o o

sloučeniny obecného vzorce II (II)

OR vykazující vlastnosti za použití reduktasy produkovaných mikroorganismy vybranými ze skupiny mikroorganismy rodu Beauveria, výhodně Beauveria Pichia, výhodně Pichia pastoris, haplophila nebo faciens, Candida, výhodně Candida humicola, diddensiae nebo friedrichii, Kluyveromyces, výhodně Kluyveromyces drosophilarum, a Torulaspora, výhodně Torulaspora hansenii, a výhodně Pichia angusta. ’ reduktas zahrnuj ící bassiana, membrane. solani, zahrnuje přípravu sloučeniny obecného redukcí sloučeniny obecnéhovzorce II za nebo extraktů z uvedených mikroorganispastoris, Pichia haplophila, humicola, Candida solani, friedrichii, Kluyveromyces

Vynález rovněž vzorce III selektivní použití celých buněk mu, výhodně Beauveria bassiana, Pichia membranefaciens, Candida Candida diddensiae, Candida drosophilarum, Torulaspora hansenii, nebo výhodně Pichia angusta.

Vynález se výhodně realizuje za použití celých buněk uvedených organismů, jelikož tak není nutné separovat požadovaný enzym a jsou zajištěny kofaktory nutné pro reakci.

Lze použít libovolný z výše uvedených druhů, ale pro dosažení vysokého stupně přeměny a vysoké selektivity je výhodné použít enzym nebo celé buňky Pichia haplophila, nebo ještě výhodněji Pichia angusta.

Pro pohánění reakce se obecně spolu s enzymem používá kofaktor, obvykle NAD(P)H (nikotinamidadenindinukleotid nebo nikotinamidadenindinukleotidfosfát) a systém pro regeneraci kofaktoru, například glukosa a glukosa-dehydrogenasa. Jelikož vhodné kofaktory a redukční mechanismy jsou přítomné v celých buňkách, je výhodné použít celé buňky v živném médiu, které výhodně obsahuje vhodný zdroj uhlíku, který může zahrnovat jednu nebo více z následujících složek: cukr, například maltosu, sacharosu nebo výhodně glukosu, polyol, například glycerol nebo sorbitol, kyselinu citrónovou nebo nižší alkohol, například methanol nebo ethanol.

Pokud mají celé buňky v průběhu reakce růst, měly by v médiu být přítomné zdroje dusíku a fosforu a stopové prvky. Přitom lze použít zdroje a stopové prvky běžně používané při kultivaci těchto organismů.

Způsob podle vynálezu lze provádět přidáním sloučeniny obecného vzorce II do kultury rostoucího organismu v médiu schopném podporovat růst nebo do suspenze živých buněk v médiu, které výhodně obsahuje zdroj uhlíku, které však postrádá jednu nebo více živin nutných pro růst. Použít lze rovněž mrtvé buňky, pokud jsou přítomny nutné enzymy a kofaktory. Pokud je to nutné, mohou být k mrtvým buňkám přidávány.

i

Pokud je to žádoucí, lze buňky imobilizovat na nosiči, který je ve styku se sloučeninou obecného vzorce II, výhodně za přítomnosti vhodného zdroje uhlíku, jak je popsán výše.

Hodnota pH je vhodně 3,5 až 9, například 4 až 9, výhodně nejvýše 6,5 a ještě výhodněji nejvýše 5,5. Velmi vhodné je použít pH v rozmezí 4 až 5. Způsob podle vynálezu lze vhodně provádět při teplotě 10 až 50° C, výhodně 20 až 40° Ca ještě výhodněji 25 až 35° C. Pokud jsou přítomné živé celé buňky výše uvedených organismů, je výhodné provádět tento způsobu za aerobních podmínek. Vhodně se za výše uvedeného pH a teploty používá rychlost provzdušňování odpovídající 0,01 až 1,0 objemům kyslíku, měřeno při standardní teplotě a tlaku, na jednotku objemu kultivačního média za minutu, je však třeba vzít v úvahu, že možné jsou značné odchylky. Kyslík lze dodávat ve vzduchu. Podobné pH, teplotu a provzdušňování lze použít během růstu organismů, pokud se tento růst provádí odděleně od způsobu podle vynálezu.

Purifikované enzymy lze izolovat pomocí známých způsobů vhodně centrifugací suspenze desintegrovaných buněk a separací čirého roztoku od zbytků buněk, oddělením požadovaného enzymu z roztoku například chromatografií na iontoměničích vhodně za použití eluce z kolony pomocí kapaliny se zvyšující se iontovou silou nebo/a selektivní precipitací pomocí přidání iontového materiálu, například síranu amonného. Pokud je to žádoucí, lze pro zvýšení čistoty tyto operace opakovat.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Příprava sloučeniny obecného vzorce III

Mikroorganismy se uchovávají na agarových deskách YM (Oxoid Company) připravených rozpuštěním 41 g agaru pro kvasinky a plísně (yeast and mold agar) vil destilované vody a sterilizací v autoklávu.

Pro růst v kapalném médiu se mikrobiální buňky bakteriologickou kličkou asepticky přenesou z agarové desky do baňky s vtlačenými hranami o objemu 1 1, obsahující 200 ml média obsahujícího minerální soli s následujícím složením (na litr) ; 1,9 g hydrogenfosforečnanu draselného, 2,02 g dihydrá.tu dihydrogenfosforečnanu sodného, 1,8 g síranu amonného, 0,2 g heptahydrátu síranu horečnatého, 0,97 mg chloridu železitého a 1 ml roztoku stopových prvků. Roztok stopových prvků tvoří (na litr): 0,02 g pentahydrátu síranu měďnatého, 0,1 g tetrahydrátu síranu manganatého, 0,1 g heptahydrátu síranu zinečnatého a 1,8 g uhličitanu vápenatého. Minimální médium bylo doplněno 0,2 % (hmotnost/objem) kvasničného extraktu a 2,25 % (hmotnost/objem) glukosy.

Mikroorganismy se nechají růst při teplotě 28° C na třepačce s cirkulárním pohybem při 150 otáčkách za minutu po dobu 24 - 48 hodin.

Mikrobiální buňky se sklidí. centrifugací při 7000 otáčkách za minutu po dobu 20 minut při teplotě 10° C, Buněčná peleta se resuspenduje ve 100 ml 50mM natriumfosfátového pufru o pH 6,4 a buňky se promyjí centrifugací jako je popsána výše. Výsledná buněčná peleta se resuspenduje v 50 ml výše uvedeného pufru.

K 50 ml buněčné suspenze v baňce s vtlačenými hranami o objemu 250 ml se přidá glukosa v množství 10 g na litr a sloučenina vzorce II v množství 2 g na litr. Buňky se inkubuj í při teplotě 28° C na rotační třepačce při 150 otáčkách za minutu po dobu 18 - 24 hodin.

Celá reakční suspenze se extrahuje dvakrát vždy stejným objemem ethylacetátu. V mnoha případech se vytvoří emulze, která se rozruší centrifugací při 10000 otáčkách za minutu po dobu 5 minut při teplotě 28° C. Spojené ethylacetátové

Podmínky

HPLC:

kolona:

extrakty se vysuší nad bezvodým síranem sodným a rozpouštědlo se odstraní vakuovou destilací, čímž se získá zlatě zbarvený olej .

Rozsah přeměny sloučeniny vzorce II na sloučeninu vzorce III a enantiomerní složení sloučeniny vzorce III se stanoví pomocí vysokotlaké kapalinové chromatografie (HPLC).

HPLC jsou následující:

programovatelná pumpa Waters 590

Chiralcel OJ (250 mm x 4,6 mm) (Chiracel je ochranná známka firmy Diacel Chemical Industries Ltd) s ochrannou kolonou 50 mm x 4,6 mm s velikostí části 10 pm rozpouštědlo: směs hexanu a ethanolu v poměru 95 : 5 rychlost průtoku: 1 ml.min*¹teplota: teplota místnosti detekce: refrakční index, diferenciální refraktometr

Waters R401

Retenční Sasy sloučenin vzorců II, III a diastereoisomeru sloučeniny III, jímž je sloučenina IV, činí 43 minut, 27 minut a 21 minut.

Získané výsledky jsou shrnuty v tabulce 1.

Tabulka 1

mikroorganismus	přeměna (%)	poměr sloučenin
III :	IV
Beauveria bassiana ATCC 7159	34		1
Candida humicola CBS 1897	8	> 20 :	1*
Candida diddensiae ATCC 20213	2	> 20 :	1*
Candida frieddrichii ATCC 22970	3	> 20 :	1*
Candida solani CBS 1908	7	12 :	1
Hansenula nonfermentans CBS 5764	75	1,8 :	1

• · « 9 ·

mikroorgani smus	přeměna (%)	poměr sloučenin III : IV
Kluyveromyces drosophilarum CBS 2105	5	6 :	1
Pichia angusta NCYC 495	100	110	: 1
Pichia angusta NCYC R320	98	> 100	: 1*
Pichia nagusta NCYC R322 ’	98	> 100	: 1*
Pichia haplophila CBS 2028	97	33	: 1
Pichia membranefaciens DSM 70366	4	> 20	: 1*
Pichia pastoris BPCC 260	20	> 20	: 1*
Pichia pastoris BPCC 443	17	> 20	: 1*
Pichia pastoris NCYC R321 *	20	> 20	: 1*
Torulaspora hansenii ATCC 20220	17	> 20	: 1*

Legenda k tabulce 1:

* sloučenina IV nebyla zdetekována. Výsledky jsou založeny na detekčním limitu sloučeniny IV.

+ uloženo podle Budapešťské smlouvy 18. května 1995

Příklad 2

Příprava sloučeniny IV, diastereoisomeru sloučeniny vzorce III

Mikroorganismy se uchovávají a kultivují jak je popsáno v příkladu 1. Biotransformace a analýza se rovněž provádí stejně jako je popsáno v příkladu 1.

Výsledky jsou shrnuty v tabulce 2.

• · · ·

Tabulka 2

mi kroorgani smus	přeměna (%)	poměr sloučenin
IV :	III
Candida pelliculosa ATCC 2149	98	9	1
Hansenula anomola CBS 2230	85	37	: 1
Neurospora crassa ATCC 9277	58	10	: 1
Pichia trehalophila CBS 5361	65	3	1

Z výše uvedených výsledků je vidět, že určití příslušníci jak rodu Candida tak rodu Pichia produkují oba diastereoisomery. Specificita například Pichia angusta na jedné straně a Hansenula anomola na druhé straně pro odlišné diastereoisomery svědčí o existenci dvou enzymu s opačnou stereospecificitou, přičemž v některých druzích mohou být přítomny oba enzymy nebo/a další enzym s nižší stereospecificitou.

Příklad 3

Růst Pichia angusta NCYC R3 2 0 ve fermentoru a in šitu příprava sloučeniny obecného vzorce III (R = terč.butylová skupina)

Pichia angusta NCYC R320 se kultivuje jak v dávkové kultuře (batch culture) tak přikrmované dávkové kultuře (fed-batch culture) ve fermentoru Braun Biostat ED/ER5 5L.

Růst v dávkové kultuře se provádí v' 5 1 média následujícího složení (na litr): 40 g glukosy, 1,2 g heptahydrátu síranu hořečnatého, 0,21 g síranu draselného, 0,69 g dihydrogenfosforečnanu draselného, 1 ml 17M kyseliny orthofosforečné, 2 g kvasničného autolyzátu, 0,05 g heptahydrátu síranu železnatého, 0,3 ml polypropylenglykolového činidla proti pěnění a 2 ml roztoku stopových prvků. Roztok stopových prvků obsahuje (na litr): 10 g heptahydrátu síranu zineč• · · · •β · » ·« · > » «» • · · · · « » « • · · 9 9 · · « «* ·9 • · 9'99 »j «·♦ »· ··· ···· «ι♦· natého, 10 g tetrahydrátu síranu manganatého, 1 g pentahydrátu síranu měďnatého a 1 ml 11,6M kyseliny orthofosforečné. Médium se připraví ve vodovodní vodě. Hodnota pH média se upraví a udržuje na požadované hodnotě přidáním 7M hydroxidu amonného.

Růst v přikrmované dávkové kultuře se provádí jak je popsáno výše pro dávkovou kulturu, s tím rozdílem, že když se koncentrace glukosy sníží pod 10 g/1, asepticky se odstraní 1 1 fermentační směsi a přidává se 1 1 média následujícího složení (na litr): 240 g glukosy, 7 g kvasničného autolyzátu, 0,175 g heptahydrátu síranu železnatého, 1 ml polypropylenového činidla proti pěnění a 7 ml roztoku stopových prvků, rychlostí dostatečnou pro udržování koncentrace glukosy v rozmezí 2 až 5 g/1.

Fermentace prováděné jak v dávkové kultuře tak v přikrmované dávkové kultuře se zahájí přidáním inokula Pichia angusta NCYC R320. Inokulum se připraví ve 200 ml média obsahujícího minerální soli, popsaného v příkladu 1, a nechá se růst při teplotě 28° C na třepačce s cirkulárním pohybem při 150 otáčkách za minutu po dobu 18 - 20 hodin. Před inokulací fermentoru se inokulum desetkrát naředí ve sterilním médiu stejného složení.

Fermentace se provádí za následujících podmínek pH, teploty, provzdušňování a třepání, až se dosáhne sušiny buněk v rozmezí 10 až 15 g/1:

teplota: 28, 34, 40° C pH: 4,5,5,5,6,5 provzdušňování: 0,1, 1,0 vvm (objemu vzduchu na objem média za minutu) třepání: 600 otáček za minutu

Příprava sloučeniny obecného vzorce III (ve kterém R představuje terč.butylovou skupinu) se iniciuje přidáním sloučeniny obecného vzorce II (ve kterém R představuje

• · · · · · ·

terč.butylovou skupinu) v surové formě v koncentraci přibližně 65 % (hmotnost/hmotnost), přičemž zbytek tvoří v podstatě terč.butylacetoacetát. Sloučenina obecného vzorce II (ve kterém R představuje terč.butylovou skupinu) se přidává kontinuálně rychlostí dostatečnou pro udržení její koncentrace typicky mezi 1 až 5 g/1, výhodně 2 g/1. K fermentační směsi se jako kosubstrát přidává pevná glukosa, přičemž se její koncentrace udržuje mezi 1 až 5 g/1. V každém pokusu se příprava sloučeniny obecného vzorce III (ve kterém R představuje terč.butylovou skupinu) provádí za stejných podmínek pokud jde o teplotu, pH, provzdušňování a třepání jako za kterých probíhá růstové stádium mikroorganismu.

Koncentrace sloučenin obecného vzorce II (ve kterém R představuje terč.butylovou skupinu) a III (ve kterém R představuje terč.butylovou skupinu) ve fermentační směsi se měří pomocí vysokotlaké kapalinové chromatografie (HPLC) s obrácenými fázemi. Podmínky této HPLC jsou popsány níže:

HPLC: Hewlett Packard HP 1050 kolona: C₁₈-sloupec Waters Nova-Pak® o rozměrech 3,9 x x 300 mm a velikosti částic 4 μτη. Nova-Pak je registrovaná ochranná známka společnosti Millipore Corporation.

rozpouštědlo: 0,02M kyselina orthofosforečná ve směsi vody a acetonitrilu v poměru 60 : 40 rychlost průtoku: 1 ml/min detektor: detektor refrakčního indexu Hewlett Packard HP . 1047A........... __ __........__ __ _ teplota: teplota místnosti

Retenční časy sloučenin obecného vzorce II (ve kterém R představuje terč.butylovou skupinu) a obecného vzorce III (ve kterém R představuje terč.butylovou skupinu) činí 4,0 minut respektive 3,1 minuty.

Po dokončení biofermentačního stupně se fermentační směs centrifuguje při 5000 otáček za minutu po dobu 20 minut při teplotě 20 - 22° C. Sloučenina obecného vzorce III (ve kterém R představuje terč.butylovou skupinu) se izoluje ze supernatantu extrakcí vhodným organickým rozpouštědlem, jako je toluen, isoamylacetát, 2-pentanon, ethylacetát nebo 4-methyl-2-pentanon, výhodně ethylacetát nebo 2-pentanon. Tento extrakt se vysuší nad bezvodým síranem sodným a rozpouštědlo se odstraní vakuovou destilací, čímž se získá surový produkt obecného vzorce III (ve kterém R představuje terč.butylovou skupinu) ve formě zlatě zbarveného oleje.

Poměr sloučeniny obecného vzorce III (ve kterém R představuje terč.butylovou skupinu) k jejímu diastereoisomeru obecného vzorce IV (ve kterém R představuje terč.butylovou skupinu) se měří bud' vysokotlakou kapalinovou chromatografií surového produktu postupem popsaným v příkladu 1 nebo se pomocí vysokotlaké kapalinové chromatografie měří poměr odpovídajícího isopropylidenového derivátu vzorce I a jeho diastereoisomeru vzorce V •i f

*

\z ⁰ ? » L·	(V)

za použití	následujících podmínek:
HPLC:	Hewlett Packard HP 1050
kolona:	YMC ODS AQ303 o rozměrech 4,6	x 250 mm a

velikosti částic 5 μσι. K dispozici od firmy Hichrom Limited.

rozpouštědlo: směs methanolu a vody v poměru 50 : 50 rychlost průtoku: 1 ml/min detektor: detektor refrakčního indexu Hewlett Packard HP

1047A teplota: teplota místnosti

Retenční časy sloučenin vzorce I a V činí 31,0 minut respektive 35,5 minuty.

Příklad 4

Příprava isopropylidenového derivátu vzorce I a jeho diastereoisomeru vzorce V

Vzorky sloučeniny obecného vzorce III (ve kterém R představuje terč.butylovou skupinu), IV (ve kterém R představuje terč.butylovou skupinu) a surového produktu z bioredukce sloučeniny obecného vzorce II (ve kterém R představuje terč.butylovou skupinu) se přemění na odpovídající isopropylidenový derivát reakcí s 2,2-dimethoxypropanem v suchém acetonu za přítomnosti katalytického množství methansulfonové kyseliny. Při typické reakci se 3 g surového produktu bioredukce nechají reagovat se 7 ml 2,2-dimethoxypropanu v 5 ml suchého acetonu s obsahem 5 μΐ methansulfonové kyseliny po dobu 2 hodin při teplotě místnosti. Roztok se poté vylije do 15 ml 2% (hmotnost/objem) vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a směs se míchá po dobu dalších 5 ml ethylacetátu. Ethyl15 ml n-hexanu a destilované vody, síranem čímž minut. Výsledná směs acetátový extrakt se tato organická Organická fáze rozpouštědlo se tmavě oranžový olej, směs se s ml se extrahuje 30 oddělí, smíchá se promyje 30 se vysuší nad bezvodým odstraní vakuovou destilací, který chlazením tuhne.

sodným a se získá

Příklady 5 - 13

Příprava sloučeniny obecného vzorce III (ve kterém R představuje terč.butylovou skupinu) za různých podmínek pH, teploty a provzdušňování a za růžných režimů fermentace

Příklady 5 až 13 včetně slouží k ilustraci provádění způsobu podle vynálezu za použití vždy Pichia angusta NCYC R320 s počáteční sušinou buněk v rozmezí 10 až 15 g/1 pro přípravu sloučeniny obecného vzorce III (ve kterém R představuje terč.butylovou skupinu) ze sloučeniny obecného vzorce II (ve kterém R představuje terč.butylovou skupinu).

Φ· ···· ·· · · ·· φ · φ φ

9 9 9 Φφφφ • · Φ Φ · · φ φ ΦΦΦΦ • Φ Φ Φ Φ' Φ·

- 13 - *·· ·’ ··· ···· ·· ·

Tento postup se provádí jak je popsáno v příkladu 3 s rozdíly uvedenými v tabulce 3.

Výsledky tohoto postupu za podmínek specifikovaných v tabulce 3 jsou shrnuty v tabulce 4.

Reakční profil, kterého se dosáhne prováděním postupu za podmínek specifikovaných v příkladu 13 je znázorněn na obrázku 1. Na tomto obrázku je na ose x znázorněn čas v hodinách (označeno t), na ose y pak koncentrace sloučeniny II a III v g/1 (označeno c) . Koncentrace sloučeniny II jsou zakresleny pomocí čtverců, koncentrace sloučeniny III pomocí kosočtverců. Počáteční sušina buněk v tomto případě činila 12,67 g/1.

Tabulka 3

příklad	pH	teplota (°C)	provzdušňování (wm)	typ kultury
5	5,5	28	1	dávková
6	5,5	34	1	dávková
7	5,5	40	1	dávková
8	5,5	28	0,1	dávková
9	6,5	28	1	dávková
10	4,5	28	1	dávková
11	4,5	34	1	dávková
12	5,5	28	1	přikrmovaná dávková
13	4,5	28	1	přikrmovaná dávková

Legenda k tabulce 3 :

vvm znamená objem vzduchu (měřený při standardní teplotě a tlaku) na objem kultivačního média za minutu • · φφ φφφφ

Tabulka

LD

Μ<

φ υ ι—I β Λ

Φ

4J

Λ!

Φ TJ β

φ tn φ Í4” c 'ίΰ -U Ή >υ ο

Λ >

S Γ—ι

S Λ

Ό Φ

I------1 ω '>ι >

λ:

ο

Ν >

Λ υ β φ >

Φ

L α ·γ| >L &

Ν

ο β Φ > ο β φ 4J ω <υ β

Ο

4-) (Ο Ε Ο Li Λ υ '<υ > ο β •Η t—I

ÍÚ Οι Φ '(1) λ: φ

I------1

4J ο λ: ο ω >

4-) -Η >Ν β Ο &

- 15 *=řT<-> 4Χ·. *»»’

Příklad 14

Charakterizace sloučeniny obecného vzorce III (ve kterém R představuje terč.butylovou skupinu)

Surový produkt obecného vzorce III (ve kterém R představuje terč.butylovou skupinu) získaný postupem popsaným v příkladu 5 se přemění na jeho isopropylidenový derivát vzorce I pomocí postupu popsaného níže:

Surový produkt (145 g obsahujících 65 g (0,28 mol) sloučeniny vzorce III) se vnese do baňky s kulatým dnem o objemu 1 1 vybavené magnetickým míchadlem. Do baňky se přidá 200 ml suchého acetonu, 294 ml (2,39 mol) 2,2-dimethoxypropanu a 1,5 ml methansulfonové kyseliny. Hodnota pH roztoku se z-kontroluje přenesením malého vzorku na vlhký pH-indikátorový papírek pro ověření, že je roztok kyselý. Reakční směs se míchá při teplotě místnosti a mizení sloučeniny vzorce III se monitoruje vysokotlakou kapalinovou chromatografií za použití postupu popsaného v příkladu 3. Reakce je dokončená během 3 hodin, a po uplynutí této doby se přidá 550 ml 2% (hmotnost/objem) vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného. Hodnota pH se znovu zkontroluje jak je popsáno výše, pro zajištění, že je v rozmezí 7-9. Směs se přenese do dělicí nálevky a extrahuje se 400 ml ethylacetátu. Ethylacetát se odstraní a vodná část se znovu extrahuje dalšími 200 ml ethylacetátu. Ethylacetátové extrakty se smíchají a přidá se 1 1 n-hexanu. Tento zkombinovaný ethylacetátový a n-hexanový roztok se promyje třikrát vždy 1 1 destilované vody a organická fáze se oddělí a vysuší nad bezvodým síranem sodným. Rozpouštědlo se odstraní vakuovou destilací, čímž se získá červený olej, který ochlazením tuhne.

Isopropyliden vzorce I se vykrystaluje z n-hexanu a překrystaluje z n-heptanu, čímž se získá bílý krystalický produkt s výtěžkem 81 %. Zjistí se, že isopropyliden vzorce I vykazuje chemickou čistotu 98,65 %, neobsahuje sloučeniny vzorců II, III a V (kde R představuje terč.butylovou skupinu) a není ani infračerveou spektroskopií ani ¹H-NMR-spektrometrií při 250 MHz odlišitelný od autentického vzorku sloučeniny vzorce I.

^Γ V tomto textu jsou používány odkazy na následující ' ukládací místa, ve kterých byly uloženy jednotlivé mikroorgaf * nismy:

ATCC Americká sbírka typových kultur; Američan Type Culture Collection, 123031 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 USA

CBS Centraal Bureau Voor Schimmel Cultures, Oosterstraat 1, Postbus 273, NL-3740 AG Baarn, Holandsko

DSM Německá sbírka mikroorganismů a buněčných kultur; Deutsche Sammlung VOn Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, D-330 Braunschweig, SRN

NCYC Národní sbírka kvasinkových kultur; National Collection of Yeast Cultures,' Institute of Food Research, Norwich Laboratory, Norwich Research Park, Colney, Norwich NR4 7UA

BPCC Sbírka kultur bioproduktů; ZENECA Limited, Bioproducts t Culture Collection (není přístupná veřejnosti).

Claims

1. Způsob přípravy sloučeniny obecného vzorce III

OH OH 0

vyznačuj íc í se tím , že se selektivně redukuje sloučenina obecného vzorce II PH ° ? UkA OR (II)

za použití reduktasy vykazující vlastnosti reduktasy produkované mikroorganismem rodu Beauveria, Candida,. Kluyveromyces, Torulaspora nebo Pichia.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se sloučenina obecného vzorce III připravuje selektivní redukcí sloučeniny obecného vzorce II za použití reduktasy vykazující vlastnosti reduktas produkovaných Beauveria bassiana, Pichia pastoris, Pichia haplophila, Pichia membranefaciens, Candida humicola, Candida solani, Candida diddensiae, Candida friedrichii, Kluyveromyces drosophilarum, Torulaspora hansenii nebo Pichia angusta.

3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačuj ící s. e t .i. .m. ~ že,. ._f.s.e_ .po.už.ij.e__i..re.duktasa ..,._.z..í.s.kaná. ...z.mikroorganismu rodu Beauveria, Candida, Kluyveromyces, Torulaspora nebo Pichia.

4. Způsob podle nároku 1, 2 nebo 3, vyznačující se tím, že se reduktasa zajišťuje přítomností celých buněk mikroorganismu rodu Beauveria, Candida,

Kluyveromyces

Torulaspora nebo Pichia během selektivní redukce .

5. Způsob podle libovolného z nároků 1 až 4, vyznačující se tím , že se použije reduktasa produkovaná mikroorganismem rodu Pichia.

-

6. Způsob podle nároku 5. vyznačující se š

c t í m , že se použije reduktasa produkovaná Pichia haplophila 'λ nebo Pichia angusta.

7. Způsob podle libovolného z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že se provádí za přítomnosti celých buněk organismu produkujícího reduktasu v živném médiu, které obsahuje zdroj uhlíku pro tento organismus.

8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že se provádí za přítomnosti zdrojů dusíku a fosforu a stopových prvků.

9. Způsob podle nároku 7 nebo 8, vyznačuj ící se t í m , že se provádí za aerobních podmínek.

10. Způsob přípravy sloučeniny obecného vzorce IV

NC

OH OH 0

A A Λ (IV)

OR v y z n a č u jí c í s e t í m , že se selektivně redukuje sloučenina obecného vzorce II za použití reduktasy vykazující vlastnosti reduktasy produkované Candida pelliculosa, Neurospora crassa, Pichia trehalophila nebo výhodně Hansenula anomola.