KR20030071731A - 미생물에 의한 라세믹 테트랄론의 입체선택적 환원 방법 - Google Patents

미생물에 의한 라세믹 테트랄론의 입체선택적 환원 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 하기 반응식 1에 나타낸 화학식 1의 화합물을 미생물, 또는 이 미생물로부터 유래한 효소 및 이 효소에 대한 보조 인자를 포함하여 하기 반응식 1의 미생물에 의한 입체선택적 환원(stereoselective microbial reduction)을 수행할 수 있는 효소 환원 시스템과 접촉시키는 단계; 및 생성된 혼합물을 항온 처리하여 화학식 2의 (4R) 테트랄롤을 생성시키고 화학식 5의 (4S) 테트랄론 또는 "키랄(chiral) 테트랄론"을 실질적으로 미반응 상태로 놔두는 단계를 포함하는, 하기 반응식 1에 따라 미생물에 의한 라세믹 테트랄론의 입체선택적 환원을 수행하는 방법에 관한 것이다:
상기 키랄 테트랄론은 서트랄린을 합성하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 선택적으로 화학식 2의 (4R) 테트랄롤로부터 화학식 5의 (4S) 테트랄론을 분리시킴을 포함한다. (4R) 테트랄롤은 화학식 1의 화합물로서 재순환될 수 있으며, 본 발명의 방법은 원하는 화학식 5의 (4S) 테트랄론을 보다 많이 생성하도록 반복될 수 있다.

Description

미생물에 의한 라세믹 테트랄론의 입체선택적 환원 방법{STEREOSELECTIVE MICROBIAL REDUCTION OF A RACEMIC TETRALONE}
본 발명은 4-(3,4-디클로로페닐)-3,4-디하이드로-1(2H)-나프탈레논의 (4S) 거울상이성체(이후, "키랄(chiral) 테트랄론" 또는 "(4S) 테트랄론"이라고도 함)의 신규한 제조 방법에 관한 것이며, 더욱 구체적으로는 라세믹 4-(3,4-디클로로페닐)-3,4-디하이드로-1(2H)-나프탈레논(이후, "라세믹 테트랄론"이라고도 함)을 키랄 테트랄론으로 미생물에 의해 입체선택적으로 환원시키는(stereoselective microbial reduction) 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법에 의해 제조되는 키랄 테트랄론은 더욱 반응하여 흔히 서트랄린이라고 하는 순수한 시스-(1S)(4S)-N-메틸-4-(3,4-디클로로페닐)-1,2,3,4-테트라하이드로-1-나프탈렌아민을 제조할 수 있다. 서트랄린은, 예컨대 항우울제 및 식욕감퇴제로서 유용하고, 또한 화학약품 중독증, 불안 관련 장애, 조루, 암 및 후방 심근경색증의 치료에 유용한 것으로서 잘 알려져 있다.
서트랄린을 제조하기 위한 방법이 당해 분야에 공지되어 있으며, 예컨대 미국 특허 제 4,536,518 호, 제 4,777,288 호, 제 4,839,104 호, 제 4,855,500 호, 제 4,940,731 호, 제 4,962,128 호, 제 5,082,970 호, 제 5,130,338 호, 제 5,196,607 호, 제 5,248,699 호, 제 5,442,116 호, 제 5,463,126 호, 제 5,466,880 호, 제 5,597,826 호 및 제 5,750,794 호, 및 웰츠(W. M. Welch, Jr) 등의 문헌[Journal of Medicinal Chemistry, Vol.27, 번호 11, p. 1508 (1984)]에 기재되어 있다.
전술한 특허중 몇몇은 라세믹 N-메틸-4-(3,4-디클로로페닐)-1,2,3,4-테트라하이드로-1-나프탈렌아민의 시스-이성체 및 트랜스-이성체의 혼합물을 합성하는 방법에 관한 것이다. 상기 특허에 기재된 바와 같이, (S) 및 (R) 거울상이성체 뿐만 아니라 시스-이성체 및 트랜스-이성체는 분별 결정 또는 크로마토그래피를 비롯하여 당해 분야의 숙련자들에게 공지된 방법에 의해 분리될 수 있다.
또한, 서트랄린의 합성시에 궁극적으로 원하는 키랄성을 초기에 선택하는 것이 공지되어 있다. 예컨대, 전술한 미국 특허 제 5,750,794 호는 라세믹 테트랄론을 비대칭 케톤 환원제와 반응시켜 사용되는 비대칭 시약의 키랄성에 따라 상응하는 시스-알코올 또는 트랜스-알코올을 수득한 후, 이어서 알코올들을 분리하고, (1S,4S) 및/또는 (1R,4S) 알코올을 (4S)-테트랄론으로 산화시킴으로써 키랄 테트랄론을 제조하는 방법을 개시하고 있다.
또한, 당해 분야에는 키랄 화합물이 미생물, 예컨대 진균류(예: 효모)를 사용하여 합성될 수 있음이 공지되어 있다. 예컨대, 케톤을 키랄 알코올로 환원시키기 위해 효모를 사용하는 방법이 충분히 공지되어 있다. 그러나, 관련 분야의 숙련자들에게 인지된 바와 같이, 이러한 미생물에 의한 환원의 화학적 및 광학적 수율(예컨대, 특정한 거울상이성체와 그의 양)은 일반적으로 선택된 특정한 미생물 뿐만 아니라 출발 물질의 치환기에 따라 상당히 다양하다.
미국 특허 제 5,049,497 호는 높은 거울상이성체 순도의 케톤 및 알코올의 혼합물을 제공하기에 충분한 조건하에 비사이클로[4.2.0]옥탄의 라세믹 유도체를 베이커 이스트(Baker's Yeast)와 접촉시킴으로써 상기 유도체를 분할하는 방법을 개시하고 있다. 상기 특허에 기재된 바와 같이, 상기 라세믹 케톤중 단 하나의 거울상이성체가 환원되어 알코올을 제공한다.
미국 특허 제 5,580,764 호는 완전한 미생물 또는 그의 분해된 세포 제조물을 사용하여 환상 케톤을 상응하는 키랄 알코올로 전환시키는 비대칭 환원 방법을 개시하고 있다.
미국 특허 제 5,618,707 호는 케톤 기질을 자이고사카로마이시스 바일리(Zygosaccharomyces bailii) ATCC(아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션: American Type Culture Collection) 번호 38924 또는 시조사카로마이시스 옥토스포러스(Schizosaccharomyces octosporus) ATCC 번호 2479의 배양액에 첨가하고, 생성된 혼합물을 항온 처리한 후, 이후에 혈청 콜레스테롤 강하제의 제조에 중간체로서 사용하기 위해, 예컨대 유기 용매를 사용하는 추출, 수지로의 흡착 또는 크로마토그래피와 같은 통상적인 수단에 의해 하이드록시 화합물을 단리시킴으로써, 케톤 기질을 입체선택적으로 환원시키는 방법을 제공한다. 상기 특허에 기재된 단리된 하이드록시 화합물은 키랄 고성능 액상 크로마토그래피(HPLC), 역상HPLC 또는 이들 둘다에 의해 분석된다. 관련 분야의 숙련자들에게 이해되고 있는 바와 일치하게, 상기 특허에 기재된 바에 따르면, 선택된 기질의 케톤 그룹을 환원시킬 수 있는 능력에 대해 연구된 많은 미생물중 다수는 원하는 특이성 또는 생산성으로 케톤 그룹을 환원시키지 못하였다.
예상치 않게, 효모와 같은 진균류 및 방선균류를 비롯한 특정 미생물들이 라세믹 테트랄론을 입체선택적으로 환원시킴이 본 발명에 의해 밝혀졌다. 더욱 구체적으로, 본 발명의 미생물에 의한 입체선택적 환원 방법은 라세믹 혼합물의 (4R) 테트랄론을 선택적으로 환원시키는 반면 (4S) 테트랄론은 실질적으로 미반응 상태로 둔다. 또한, 본 방법에 의해 생성된 원하지 않는 (4R) 테트랄롤은 산화되고 이어서 라세믹 테트랄론으로 라세미화될 수 있으며, 본 발명의 방법은 보다 많은 (4S) 테트랄론을 생성하도록 반복될 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 생성된 (4S) 테트랄론은 서트랄린 합성에서 사용될 수 있다.
전술한 문헌을 비롯한 본원에 기재된 모든 문헌은 본원에서 그 전체가 참고문헌으로 인용된다.
본 발명자들은 원하지 않는 (4R) 테트랄론을 다시 출발물질로 만들어 재순환시키고 원하는 (4S) 테트랄론만을 미반응 상태로 놔두어 결과적으로 원하는 광학 이성체만을 높은 광학적 수율로 얻을 수 있는 미생물에 의한 라세믹 혼합물의 입체선택적 환원 방법을 개발하여 본 발명에 이르게 되었다.
본 발명은 케톤 화합물, 즉 하기 반응식 2에 나타낸 화학식 1의 라세믹 테트랄론을 미생물, 또는 이 미생물로부터 유래한 효소 및 이 효소에 대한 보조 인자를 포함하여 하기 반응식 2의 본 환원을 수행할 수 있는 효소 환원 시스템과 접촉시키는 단계; 및 생성된 혼합물을, 하이드록시 그룹을 갖는 화합물, 구체적으로 화학식 2의 (4R) 테트랄롤이 형성되고 배지에서 축적될 수 있으며 원하는 입체화학성을 갖는 화합물, 즉 화학식 5의 (4S) 테트랄론이 실질적으로 미반응 상태로 남아있도록 하는 적합한 조건하에 항온 처리하는 단계를 포함하는, 미생물에 의한 카보닐 그룹의 환원 방법에 관한 것이다. 이어서, 화학식 5의 (4S) 테트랄론, 즉 키랄 테트랄론은 임의의 적합한 방법, 예컨대 크로마토그래피 또는 결정화에 의해 단리될 수 있다. 또한, 화학식 2의 (4R) 테트랄롤은 화학식 3 내지 5의 화합물로부터 분리되고, 산화되어 라세믹 테트랄론으로 라세미화될 수 있으며, 본 발명의 미생물에 의한 입체선택적 환원을 원하는 키랄 케톤이 보다 많이 생성되도록 반복할 수 있다.
따라서, 본 발명은 하기 반응식 2에 나타낸 화학식 1의 화합물을 미생물, 또는 이 미생물로부터 유래한 효소 및 이 효소에 대한 보조 인자를 포함하여 하기 반응식 2의 본 환원을 수행할 수 있는 효소 환원 시스템과 접촉시키는 단계; 및 생성된 혼합물을, 화학식 3의 화합물보다는 화학식 2의 화합물을 보다 많이 생성시켜 화학식 4의 화합물보다는 화학식 5의 화합물을 보다 많이 미반응 상태로 놔두기에 충분한 조건하에 항온 처리하는 단계를 포함하는, 미생물에 의한 입체특이적 환원을 수행하기 위한 방법을 제공한다:
본 발명의 입체특이적 환원은 또한 화학식 1의 화합물을 미생물, 또는 이 미생물로부터 유래한 효소 및 이 효소에 대한 보조 인자를 포함하여 본 환원을 수행할 수 있는 효소 환원 시스템과 접촉시키는 단계; 및 생성된 혼합물을 항온 처리하여 화학식 2의 (4R) 테트랄롤을 생성시키고 화학식 5의 (4S) 테트랄론을 실질적으로 미반응 상태로 놔두는 단계를 포함하며, 하기 반응식 1로서 나타낼 수 있다:
반응식 1
입체선택적 환원은 또한 선택적으로 화학식 2의 (4R) 테트랄롤로부터 화학식 5의 (4S) 테트랄론을 분리시킴을 포함한다. 이어서, (4R) 테트랄롤을 산화시켜서 (4R) 테트랄론을 생성시킬 수 있으며, 이 (4R) 테트랄론을 이어서 예컨대 염기와반응시켜 화학식 1의 라세믹 테트랄론으로 형성시킨 후, 본 발명의 미생물에 의한 입체선택적 환원을 반복하여 원하는 화학식 5의 (4S) 테트랄론, 즉 화학식 1의 라세믹 테트랄론중 (4S) 거울상이성체를 보다 많이 생성시킬 수 있다.
본 발명은 화학식 1의 화합물을 미생물, 또는 이 미생물로부터 유래한 효소 및 이 효소에 대한 보조 인자를 포함하여 본 환원을 수행할 수 있는 효소 환원 시스템과 접촉시키고, 생성된 혼합물을, 화학식 2의 화합물을 생성시키기에 충분한 조건하에 항온 처리하여 화학식 4의 화합물에 비해 화학식 5의 화합물이 실질적으로 보다 많이 미반응 상태로 존재하고 화학식 3의 화합물에 비해 화학식 2의 화합물이 실질적으로 보다 많이 생성되도록 함으로써, 화학식 1의 화합물을 화학식 2의 화합물로 미생물에 의해 입체선택적으로 환원시킴을 포함하는 방법을 제공한다.
바람직한 양태에서, 화학식 1의 화합물은 효소 환원 시스템과 접촉한다. 또 다른 바람직한 양태에서, 화학식 1의 화합물은 효소가 고정되어 있는 효소 환원 시스템과 접촉한다. 특히 바람직한 양태에서, 화학식 1의 화합물은 한세눌라 폴리모파(Hansenula polymorpha) ATCC 번호 26012로부터 유래한 효소 환원 시스템과 접촉한다.
또 다른 바람직한 양태에서, 미생물은 그의 분해된 세포 제조물이다. 또 다른 바람직한 양태에서, 미생물은 아세톤 분말 효소 제조물이다.
특히 바람직한 본 발명의 양태에서, 완전한 미생물이 사용된다. 미생물이 완전한 미생물인 바람직한 양태에서, 화학식 1의 화합물은 미생물을 포함하는 발효 배지, 배양액 또는 용매와 접촉한다. 미생물이 완전한 미생물인 또 다른 바람직한양태에서, 화학식 1의 화합물은 세척된 완전한 미생물과 접촉한다. 미생물이 완전한 미생물인 또 다른 바람직한 양태에서, 화학식 1의 화합물은 고정된 완전한 미생물과 접촉한다.
본 발명의 특히 바람직한 양태에서, 미생물은 발효 배지에서 증식된 완전한 미생물이며, 화학식 1의 화합물을 이러한 발효 배지에 첨가함으로써 접촉이 이루어진다.
본 발명의 또 다른 특히 바람직한 양태에서, 미생물은 약 48시간동안 증식 배지에서 증식된 완전한 미생물이고, 화학식 1의 화합물을 이러한 증식 배지에 첨가함으로써 증식 배지에서 접촉이 이루어지며, 약 5일동안 항온 처리한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 양태에서, 미생물은 진균류, 예컨대 효모이거나 또는 방선균류, 또는 입체선택적 환원을 수행할 수 있는 이들의 변종이다.
본 발명의 또 다른 바람직한 양태에서, 미생물은 진균류이다. 미생물이 진균류인 또 다른 바람직한 양태에서, 진균류는 압시디아 코에룰레아(Absidia coerulea) ATCC 번호 20137이다.
본 발명의 특히 바람직한 양태에서, 미생물은 효모이다. 미생물이 효모인 본 발명의 특히 바람직한 양태에서, 효모는 ATCC 번호 74449로도 기탁되어 있는 한세눌라 폴리모파 ATCC 번호 26012이다.
ATCC 번호 74449로도 기탁되어 있는 한세눌라 폴리모파 ATCC 번호 26012가 미생물로서 사용되는 경우, 본 발명의 미생물에 의한 입체선택적 환원은 화학식 1의 화합물중 단 하나의 거울상이성체만을 두드러지게 환원시켜서 상응하는 알코올,즉 화학식 2의 화합물을 제공하는 반면, 화학식 1의 화합물의 다른 거울상이성체, 즉 화학식 5의 화합물은 실질적으로 미반응 상태로 둔다.
상기에서 언급한 바와 같이, 본 발명의 방법은 또한 선택적으로 화학식 2 내지 4의 화합물로부터 화학식 5의 화합물을, 예컨대 결정화 또는 크로마토그래피를 사용하여 분리시키는 방법과 임의의 공지된 방법을 이용하여 서트랄린 합성에서 상기 분리된 화학식 5의 화합물을 사용함을 포함한다.
상기에서 언급한 바와 같이, 화학식 2의 단리된 (4R) 테트랄롤을 화학식 4의 (4R) 테트랄론으로 산화시키는 것이 바람직하다. 이어서, 바람직하게는 (4R) 테트랄론을 염기와 반응시켜서 화학식 4의 (4R) 테트랄론을 화학식 1의 라세믹 테트랄론으로 라세미화시키는 것이 또한 바람직하다. 산화 및 라세미화에 의해, 원하지 않는 (4R) 테트랄롤을 본 발명의 방법에 따른 미생물에 의한 입체선택적 환원의 또 다른 주기로 재순환시킬 수 있다. 원하지 않는 (4R) 테트랄롤을 재순환시킴으로써, 원하는 (4S) 테트랄론의 양을 증가시키고, 원하지 않는 (4R) 테트랄롤의 폐기량을 감소시킬 수 있다. 산화된 생성물의 산화 및 라세미화는 임의의 적합한 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다.
당해 분야의 숙련자들은 본 발명을 기재하기 위해 본원에 사용된 용어를 충분히 이해할 것이나, 본원에서 사용되는 하기의 용어는 바로 아래에 기재된 바와 같다.
"보조 인자"는, 예컨대 NADH, NADPH, FADH, FMNH 및/또는 PQQ와 같은 효소 환원 시스템을 구성하는 임의의 적합한 보조 인자 및 미생물에서 효소와 함께 생성되는 임의의 적합한 보조 인자를 의미한다.
"효소 환원 시스템"은 적합한 미생물 산화환원 효소 및 이 산화환원 효소에 대한 보조 인자의 환원된 형태를 의미하고, 이때 보조 인자는 선택된 미생물로부터 유래하거나 또는 임의의 적합한 공급원에서 유래할 수 있다. 효소 환원 시스템을 구성하는 효소는 유리된 형태이거나 또는 예를 들어 컬럼에 고정되거나 또는 비드(bead)에 부착되어 있는 고정된 형태일 수 있다.
"미생물에 의한 환원"은 효소 환원 시스템, 효소 환원 시스템을 구성하는 미생물 환원효소, 완전한 미생물, 또는 이들의 임의의 제조물 등에 의해 수행되는 본 발명의 입체선택적 환원을 의미한다.
"미생물"은 임의의 완전한 미생물 또는 그의 제조물, 예컨대 미생물의 분해된 세포 제조물; 미생물의 탈수된 제조물(예: 아세톤 분말 효소 제조물); 예컨대 발효 배지, 배양액 등을 함유하지 않은 세척된 미생물; 및 예컨대 컬럼에 고정되거나 비드에 부착되어 고정된 미생물을 포함한다.
본 발명에 의해 제공되는 방법은 하기 반응식 2에 나타낸 화학식 1의 화합물을 미생물, 또는 이 미생물로부터 유래한 효소 및 이 효소에 대한 보조 인자를 포함하여 하기 반응식 2의 본 환원을 수행할 수 있는 효소 환원 시스템과 접촉시키고, 생성된 혼합물을, 화학식 2의 화합물을 생성시키기에 충분한 조건하에 항온 처리하여 화학식 4의 화합물에 비해 실질적으로 보다 많은 화학식 5의 화합물이 환원되지 않고 남아있고 화학식 3의 화합물에 비해 실질적으로 보다 많은 화학식 2의 화합물이 생성되도록 함으로써, 화학식 1의 화합물을 화학식 2의 화합물로 미생물에 의해 입체선택적으로 환원시킴을 포함한다:
반응식 2
당해 분야의 숙련자들에게 인지된 바와 같이, 라세믹 테트랄론인 화학식 1의 화합물은 하기 화학식 5의 (4S) 테트랄론과 하기 화학식 4의 (4R) 테트랄론의 혼합물이다:
상기 화합물, 보다 구체적으로 화학식 2의 테트랄롤은 하기 화학식 6과 7의 화합물들의 혼합물이다:
상기 화합물, 보다 구체적으로 화학식 3의 테트랄롤은 하기 화학식 8과 9의화합물들의 혼합물이다:
화학식 2와 3의 화합물들은 전술한 미국 특허 제 5,750,794 호에 기재되어 청구되고 있다.
원하는 화학식 5의 화합물은, 하기에 기재한 바와 같이 화학식 2의 원하지 않는 화합물 및 예를 들어 선택된 미생물 또는 항온 처리 조건에 따라 생성되거나 또는 미반응 상태로 존재할 수 있는 화학식 3 또는 4의 임의의 화합물로부터 단리될 수 있다.
화학식 2의 화합물은, 예컨대 산화 및 라세미화에 의해 화학식 1의 화합물로 전환될 수 있고, 미생물에 의한 입체선택적 환원에 의해 추가량의 화학식 5의 (4S)테트랄론을 생성시킬 수 있다.
본 발명의 방법은 쉽게 수행된다. 즉, 미생물은 화학식 1로 표시되는 라세믹 테트랄론의 존재하에 발효되거나(완전한 미생물) 또는 항온 처리되어서(미생물의 분해된 세포 제조물, 탈수된 제조물, 또는 그밖의 임의의 적합한 미생물 제조물), 라세믹 테트랄론을 변형시키고, 더욱 구체적으로는 라세믹 케톤의 원하지 않는 (4R) 거울상이성체를 화학식 2로 표시되는 상응하는 알코올로 환원시키는 반면, 화학식 5로 표시되는 원하는 (4S) 거울상이성체를 실질적으로 미반응 상태로 남아있도록 함으로써 일단계 공정으로 (4S) 거울상이성체를 광학적으로 풍부하게 생성시킨다. 이어서, (4S) 거울상이성체는, 예컨대 전술한 미국 특허 제 4,536,518 호, 제 4,777,288 호, 제 4,839,104 호, 제 4,855,500 호, 제 4,940,731 호, 제 4,962,128 호, 제 5,082,970 호, 제 5,130,338 호, 제 5,196,607 호, 제 5,248,699 호, 제 5,442,116 호, 제 5,463,126 호, 제 5,466,880 호, 제 5,597,826 호 및 제 5,750,794 호; 및 웰츠 등의 전술한 문헌에 기재된 바와 같이 관련 분야의 숙련자들에게 충분히 공지된 방법에 의해 추가로 반응되어서 최종적으로 서트랄린을 생성시킬 수 있다.
서트랄린에 관한 활성, 활성 시험 방법, 복용량, 복용 형태, 투여 방법 및 배경 정보는, 예컨대 전술한 미국 특허 제 4,536,518 호, 제 4,777,288 호 및 제 4,839,104 호; 및 전술한 웰츠 등의 문헌에 기재되어 있다.
임의의 적합한 미생물이 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 전술한 바와 같이, 본 발명의 방법에서 사용되는 미생물은 완전한 미생물, 그의 임의의 적합한제조물, 예컨대 분해된 세포 제조물 및 탈수된 제조물일 수 있고, 유리되거나 고정될 수 있다. 그러나, 예컨대 분해된 세포 제조물(예: 세포 추출물, 아세톤 분말 효소 제조물 또는 이로부터 유래한 효소)과 같은 불완전한 미생물이 본 발명에서 사용되는 경우, 당해 분야의 숙련자들은 효소에 대한 적합한 보조 인자가 또한 포함됨을 이해할 것이다.
당해 분야의 숙련자들은 본원에 제공된 상세한 설명 및 관련 정보로부터, 예컨대 파텔(R. N. Patel) 등의 문헌[Oxidation of Secondary Alcohols to Methyl Ketones by Yeasts",Applied and Environmental Microbiology,38(2): 219-223, (1979)]에 기재된 바와 같은 적합한 미생물의 분해된 세포 제조물을 제조하는 방법을 이해할 것이다.
당해 분야의 숙련자들은 본원에 제공된 상세한 설명 및 관련 정보로부터, 예컨대 나카무라(K. Nakamura) 등의 문헌[Asymmetric Reduction of Ketones by the Acetone Powder ofGeotrichum candidum,Tetrahedron Letters,37(10): 1629-1632(1996)]에 기재된 바와 같은 적합한 미생물의 아세톤 분말 효소 제조물을 제조하는 방법을 이해할 것이다.
또한, 임의의 적합한 미생물의 효소(예: 산화환원 효소)가 또한 본 발명의 방법에서 사용될 수 있으며, 이 효소는 당해 분야의 숙련자들에게 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 미생물로부터 단리될 수 있으며, 완전한 미생물의 경우 유리된 형태 또는 고정된 형태로 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 당해 분야의 숙련자들은 본원에 제공된 상세한 설명 및 관련 정보로부터, 예컨대 와다(M. Wada) 등의 문헌[Purification and Characterization of NADPH-Dependent Carbonyl Reductase, Involved in Stereoselective Reduction of Ethyl 4-Chloro-3-oxobutanoate fromCandida magnoliae,Biosci.Biotechnol.Biochem,62(2): 280-285, 1998], 트로스트(P. Trost) 등의 문헌[Purification and Properties of NAP(P)H: (quinone-acceptor) oxidoreductase of sugarbeet cells",Eur. J. Biochem,234: 452-458, 1995], 마댜스타(K. M. Madyastha) 및 구루라자(T. L. Gururaja)의 문헌[Purification and Some of the Properties of a Novel Secondary Alcohol Dehydrogenase fromAlcaligenes eutrophus",Biochemical and Biophysical Research Communications,211(2): 540-546(1995)], 보톨리니(O. Bortolini) 등의 문헌[Kinetic resolution ofvic-diols byBacillus stearothermophilusdiacetyl reductase",Tetrahedron:Asymmetry,9: 647-651 (1998)], 파텔 등의 문헌[Stereospecific microbial reduction of 4,5-dihydro-4-(4-methoxyphenyl)-6-(trifluoromethyl-1H-1)-benzazepin-2-one",Enzyme Microb. Technol.,3: 906-912 (1991)] 및 파텔 등의 문헌[Stereoselective microbial/enzymatic oxidation of (exo, exo)-7-oxabicyclo[2.2.1]heptane-2,3-dimethanol to the corresponding chiral lactol and lactone",Enzyme Microb. Technol.,14: 778-784(1992)] 및 미국 특허 제 5,523,223 호 및 전술한 미국 특허 제 5,580,764 호에 일반적으로 기재된 바와 같이 적합한 미생물의 효소를 단리시키고 정제하는 방법을 이해할 것이다.
적합한 미생물은 한세눌라 폴리모파 ATCC 번호 26012, 한세눌라 폴리모파ATCC 번호 74449, 압시디아 코에룰레아 ATCC 번호 20137, 지오트리쿰 칸디둠(Geotrichum candidum) ATCC 번호 34614, 지오트리쿰 칸디둠 ATCC 번호 62401, 모티에렐라 이사벨리나(Mortierella isabellina) ATCC 번호 42613, 모티에렐라 이사벨리나 ATCC 번호 38063, 모티에렐라 비나세아(Mortierella vinacea) ATCC 번호 09515, 페니실리움 노타툼(Penicillium notatum) ATCC 번호 36740, 블라스토시조마이시스 카피타투스(Blastoschizomyces capitatus) ATCC 번호 28575, 모노스포리움 올리바세움 변종 메이저(Monosporium olivaceumv.major) ATCC 번호 36300, 아우레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullulans) ATCC 번호 16623, 데바리오마이시스 폴리모푸스(Debaryomyces polymorphus) ATCC 번호 20280, 사카로마이시스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) ATCC 번호 15248, 칸디다 사타비(Candida schatavii) ATCC 번호 24409, 피치아 파비아니(Pichia fabianii) ATCC 번호 16755 및 스트렙토마이시스 리모수스 아종 리모수스(Streptomyces rimosus ss. rimosus) ATCC 번호 10970, 및 관련 분야의 숙련자들에게 공지되어 있거나 달리 수득할 수 있으며 변이에도 불구하고 본원에 기재된 미생물에 의한 입체선택적 환원을 수행할 수 있는 이들의 변이체를 포함한다.
바람직한 완전한 미생물은 (4S) 테트랄론을 실질적으로 반응하지 않은 상태로 두고 (4R) 테트랄론을 실질적으로 환원시키는 것이다(여기서, 반응이란 본 발명의 방법의 임의의 단계에서 원하는 (4S) 테트랄론을 분해하거나 또는 달리 부정적으로 영향을 주는 환원 또는 임의의 다른 내재 활성을 포함한다). 본원의 기재로부터 당해 분야의 숙련자들에게 인지된 바와 같이, 이러한 원하지 않는 (4S) 테트랄론의 반응은, 예컨대 완전한 미생물에 비해 선택된 미생물로부터 유래한 효소를 사용함으로써 실질적으로 방지될 수 있다.
본 발명의 미생물에 의한 입체선택적 환원에서 사용하기에 적합한 미생물은 관련 분야의 숙련자들에게 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 제조될 수 있다. 시판되는 원료로부터 미생물을 제조하기에 적합한 방법의 예가 하기에 제공되어 있다. 하기에 제공된 방법은 본 발명의 방법에서 사용하기에 적합한 임의의 미생물에 대해 사용할 수 있고, 당해 분야의 숙련자들은 이러한 절차중 일부, 예컨대 유리되거나 또는 고정된 완전한 미생물 또는 그의 제조물(예: 분해된 세포 제조물 또는 탈수된 제조물)의 제조 방법; 상기 미생물로부터 유래한 적합한 효소를 제조하는 방법; 라세믹 테트랄론을 미생물 또는 이로부터 유래한 효소 환원 시스템을 구성하는 효소와 접촉시키는 방법; 증식 배지 성분 및 조건(예: 온도, pH 등); 또는 항온 처리 조건을 변형시켜서 임의의 특정한 공정에서 원하는 결과를 얻을 수 있음을 이해할 것이다.
당해 분야의 숙련자들은 본원에 기재된 상세한 설명 및 관련 정보로부터, 바우어(A. Bauer) 등의 문헌["Polyvinyl alcohol-immobilized whole-cell preparations for biotransformation of nitriles",Biotechnology Letters.18(3): 343-348(3월, 1996)]에 기재된 바와 같은 적합한 고정된 완전한 미생물을 제조하는 방법을 이해할 것이다.
화학식 1의 화합물을 미생물 또는 효소 환원 시스템과 접촉시키기에 적합한 임의의 방법이 본 발명에서 사용될 수 있다. 화학식 1의 화합물은 임의의 적합한순서로 미생물 또는 효소 환원 시스템과 접촉될 것이다. 예컨대, 화학식 1의 화합물을 고정되거나 고정되지 않은 미생물 또는 이들의 혼합물을 포함하는 배양액과 같은 배지에 첨가하거나; 또는 화학식 1의 화합물을 포함하는 배지에 미생물을 첨가하거나; 또는 화학식 1의 화합물 및 미생물을 함께 배지에 첨가하거나; 또는 화학식 1의 화합물을 미생물의 분해된 세포 제조물에 첨가하거나; 또는 화학식 1의 화합물을 미생물의 탈수된 제조물에 첨가하거나; 또는 화학식 1의 화합물 또는 미생물 또는 효소 환원 시스템을 그밖의 물질을 포함하는 적합한 용매에 첨가할 수 있다. 당해 분야의 숙련자들은 본원에 기재된 상세한 설명으로부터 본 발명의 방법의 임의의 부분을 원하는 대로 변형시키는 방법을 이해할 것이다.
본 발명에서는 미생물 또는 효소 환원 시스템이 한세눌라 폴리모파 ATCC 번호 26012로부터 유래하는 것이 특히 바람직하다. 한세눌라 폴리모파 ATCC 번호 26012의 동결 건조된 샘플(본래 레빈(D. W. Levine)에 의해 기탁됨)은 1988년 6월 26일자의 부다페스트 협약하에 미국 20110-2209 버지니아주 매나새스 유니버시티 불레바드 10801에 위치한 ATCC에 기탁되었다. 그의 최근 기탁된 배양물은 새로운 기탁 번호 ATCC 번호 74449를 부여받았다. 따라서, 본 발명에서는 한세눌라 폴리모파 ATCC 번호 74449인 것이 특히 바람직하다. 이와 같이 기탁된 미생물 배양물을 대중이 이용하는 것에 대한 모든 제한은 본 발명의 명세서로부터 특허 허여시에 번복되지 않게 없어질 것이다.
한세눌라 폴리모파 ATCC 번호 26012의 배양물은 ATCC로부터 수득할 수 있으며, 시판되는 원료로부터 상기의 적합한 제조 방법의 예가 바로 아래에 기재되어있다. 이와 같이 수득된 배양물을 적합한 증식 배지에 첨가하고, 증식할 때까지 진탕시키며 항온 처리하는데, 상기 두 단계는 당해 분야의 숙련자들에게 인지되어 있다. 이와 같이 제조된 배양물은 슬란트(slant)를 접종시키는데 사용될 수 있으며, 상기 슬란트의 일부는 마스터 원액으로서 냉동된다. 다르게는, 액체 원료 배양물은 약 10 내지 약 20%의 글리세롤이 첨가되어 제조될 수 있으며, 이어서 바람직하게는 작은 크라이오튜브(cryotube)에서 약 -80℃로 동결시킨다.
임의의 선택된 미생물에 대해 당해 분야의 숙련자들이 이해하고 있는 바와 같이, 또한 압시디아 코에룰레아 ATCC 번호 20137, 특히 바람직한 한세눌라 폴리모파 ATCC 번호 26012 또는 ATCC 번호 74449에 대한 실시예에서 이후에 상세히 제공되는 바와 같이, 미생물을 제조하기에 적합한 방법은 하기와 같다: 조성이 이하에 보다 상세히 설명된 바와 같은 증식 배지(트윈(Tween: 등록상표) 80, 글리세롤 및 증류수를 포함하는 멸균액으로부터의 분취량을 함유함)를 함유하는 금속 뚜껑달린 플라스크 또는 유리 시험관에 전술한 바와 같은 동결된 원액 배양물(약 17% 글리세롤 원액)로부터의 미생물을 접종시켰다. 약 22 내지 약 32℃, 바람직하게는 약 29℃에서 발효를 실시하고, 이때 바람직하게는 약 200 내지 약 220rpm, 가장 바람직하게는 약 210rpm으로 진탕시키는 것이 적합하다. 필요시에는 증식 배지의 pH를 발효 배지에 혼입되는 적합한 완충액을 사용하여 유지시키고/시키거나 필요시에는 염기 또는 산을 첨가하여 주기적으로 조정할 수 있다.
미생물 증식, 미생물과 화학식 1의 화합물의 접촉 및 미생물과 화학식 1의 화합물의 항온 처리에 적합한 임의의 시간이 본 발명에서 이용될 수 있다. 미생물의 적합한 증식은, 예컨대 약 24시간 이내에 이루어질 수 있으며, 이때에 적합한 용매, 바람직하게는 에탄올중에서 라세믹 테트랄론 용액의 적합한 분취량을 배양물에 첨가할 수 있다. 이어서, 발효는 예컨대 약 2 내지 약 6일동안 지속될 수 있으며, 바람직하게는 약 5일동안 지속될 수 있고, 이때 발효액은 임의의 적합한 추출 방법을 사용하여 추출될 수 있어서, 적합한 용매, 예컨대 에틸 아세테이트, 메틸 이소부틸케톤, 메틸 에틸케톤, 메틸렌 클로라이드 등, 바람직하게는 에틸 아세테이트가 발효액으로부터 유기 성분을 제거할 수 있다. 발효액을 추출하고 유기 상과 수성 상을 분리시킨 후에, 유기 잔기를 포함하는 화합물이 임의의 적합한 방법, 예컨대 크로마토그래피, 바람직하게는 키랄 HPLC를 이용하여 결정될 수 있다.
임의의 적합한 증식 배지를 본 발명의 방법에 사용할 수 있으며, 적합한 증식 배지는 동화가능한 탄소원, 동화가능한 질소원, 및 필수 무기질을 함유한 무기 염의 공급원(들)을 함유한다. 일반적으로 다수의 탄수화물, 예컨대 글루코즈, 말토즈, 만노즈, 수크로즈, 전분, 글리세린, 조(millet) 젤리, 당밀, 대두 등이 동화가능한 탄소원으로서 사용될 수 있다. 동화가능한 질소원은 예컨대 효모 및 카제인 가수분해물, 일차 효모, 효모 추출물, 목화씨 분말, 대두 고형물, 맥아, 고기 추출물, 펩톤, 옥수수 담금액 및 암모늄 염과 같은 물질을 포함한다. 본 발명의 배양 배지에서 사용하기에 적합한 무기염 자양물은 예컨대 나트륨, 철, 마그네슘, 칼륨, 코발트, 포스페이트 등을 함유하는 통상적인 염을 포함한다. 더욱 구체적으로, 본 발명에서 사용하기에 적합한 증식 배지는, 예컨대 (a) 덱스트로즈(약 20g),효모 추출물(약 5g), 콩 분말(약 5g), NaCl(약 5g), K2HPO4(약 5g) 및 증류수(약 1ℓ)(H2SO4(수용액)에 의해 pH 약 7.0으로 조정함); (b) 덱스트린(약 10g), 소고기 추출물(약 3g), 아다민 pH(약 5g), NZ 아민 E형(약 5g), MgSO4·7H2O(약 0.5g), KH2PO4(약 0.37g), CaCO3(약 0.5g) 및 증류수(약 1ℓ) (HCl(수용액)을 사용하여 pH 약 7.1로 조정함) 및 이어서 제 2 단계에서 글루코즈(약 10g), 하이-카제(Hi-Case) SF(등록상표)(약 2g), 소고기 추출물(약 1g), 옥수수 담금액(약 3g) 및 증류수(약 1ℓ)(pH 약 7.0으로 조정됨); (c) 글루코즈(약 10g), 옥수수 담금액(약 6g), KH2PO4(약 3g), CaCO3(약 3.5g), 대두유(조질, 약 2.2㎖), 효모 추출물(약 2.5g) 및 증류수(약 1ℓ)(HCl(수용액)에 의해 pH 약 7.0 내지 약 7.3으로 조정함); (d) 맥아 시럽(약 20g), 대두 가루(약 5g), 카제인(약 1g), 건조 효모(약 1g), NaCl(약 5g) 및 증류수(약 1ℓ); (e) 락토즈(약 75g), 파마미디아(Pharmamedia: 등록상표)(효모 추출물을 대신함, 약 40g), CaCO3(약 10g), Na2SO4(약 4g) 및 증류수(약 1ℓ); (f) ISP #2(파크스(L. C. Parks)가 편집한 아틀라스(R. M. Atlas)의 문헌[Handbook of Microbial Media, CRC Press, Inc. 1993, 이하 "Handbook"이라 칭함, p460]을 참고한다); (g) ISP #3(["Handbook", p460]을 참조한다); (h) ISP #4(["Handbook", p461]을 참조한다); (i) ISP #5(["Handbook", p461-462]을 참조한다) 등을 포함한다.
특히 바람직한 증식 배지는 상기에서 제공된 (a)의 2X이다.
구체적인 완충액, 배지, 시약, 접촉 또는 배양 조건 등의 언급은 제한되지 않으며, 당해 분야의 숙련자들이 본원에 제공된 논의와 구체적으로 관련하여 관심있거나 가치있는 것으로 간주하는 관련 사항을 모두 포함하는 것으로 파악해야 한다. 예컨대, 완충 시스템 또는 배양 배지를 다른 것으로 대체함으로써, 제시된 방법, 물질 또는 조성물을 사용하여 수득할 수 있는 바와 동일한 목적을 종종 다르지만 공지된 방법을 사용하여 수득할 수 있다. 또한, 본 발명은 상업적 목적을 위해 본 발명의 방법의 규모 증가를 포함하는 것으로 이해해야 한다.
따라서, 당해 분야의 숙련자들에게 이해되고 있는 바와 같이, 증식 배지, 발효 조건 및/또는 라세믹 테트랄론의 양은 생성되는 화합물의 수율 및 상대적인 생성 속도를 조절하도록 변형될 수 있다. 일반적으로, 본 발명에 사용되는 기술은 산업적 효율과 관련하여 선택될 것이다. 본원에 기재된 증식 배지, 발효 조건, 미생물 또는 효소 환원 시스템의 상대적인 양, 및 라세믹 테트랄론의 상대적인 양은 본 발명의 숙련자들이 인지하고 있는 바와 같이 본 발명에서 적합하게 사용될 수 있는 다양한 배지, 발효 조건 및 출발물질의 양을 단순히 예시하는 것이며, 어떠한 방식으로도 제한하기 위한 것이 아니다.
여과, 추출, 결정화, 컬럼 크로마토그래피, 박막 크로마토그래피, 예비 저압 액상 크로마토그래피 또는 HPLC, 또는 이러한 방법의 임의의 적합한 조합을 비롯한, 본 발명의 방법의 임의의 생성물을 단리시키고/시키거나 정제하기 위한 임의의 적합한 방법이 본 발명에서 사용될 수 있다.
또한, 당해 분야의 숙련자들은 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 (4R) 테트랄론의 원하지 않는 상응하는 알코올, 즉 화학식 2의 화합물이 임의의 적합한 방법에 의해 화학식 1의 라세믹 테트랄론으로 재순환, 예컨대 본원에서 상기 기재된 바와 같이 산화 및 라세미화될 수 있으며, 본 발명의 방법은 화학식 5의 원하는 (4S) 테트랄론을 생성하기 위해 한번 더 반복될 수 있다. (4R) 테트랄롤의 (4R) 케톤으로의 산화는 당해 분야의 숙련자들에게 공지된 방법에 의해 실시될 수 있다. 라세미화 반응은 임의의 적합한 방식으로 수행될 수 있으나, 일반적으로는 약 0 내지 약 100℃, 바람직하게는 약 25 내지 약 65℃의 온도에서 수행된다. (4R) 테트랄론은 약 25 내지 약 85℃, 바람직하게는 약 50 내지 약 65℃의 온도에서 염기와 함께 반응한다. 상기 라세미화 반응에 적합한 염기는 칼륨 t-부톡사이드, 수산화나트륨, 나트륨 메톡사이드 및 수산화칼륨을 포함한다. 바람직한 염기는 칼륨 t-부톡사이드이다.
하기에 제공된 상세한 실시예는 진균류(예: 효모) 및 방선균류를 비롯한 특정 미생물이 라세믹 테트랄론을 입체선택적으로 환원시켜서 화학식 5의 원하는 (4S) 테트랄론, 즉 키랄 테트랄론을 생성시키며, 이어서 이는 원하지 않는 화합물로부터 분리될 수 있고 당해 분야에 충분히 공지된 방법에 따라 더 반응시켜 서트랄린을 생성시킬 수 있다.
본 발명은 하기의 실시예에 의해 예시된다. 본 발명의 전술한 상세한 설명 및 하기의 상세한 설명과 각종 양태는 본 발명을 제한하고자 하는 것이 아니며 단지 예시하기 위한 것이다. 따라서, 본 발명은 이들 실시예의 구체적인 설명에 의해 제한되지 않는다.
실시예 1
한세눌라 폴리모파 ATCC 번호 26012를 사용하는 라세믹 테트랄론의 환원
A. 효모 한세눌라 폴리모파 ATCC 번호 26012의 발효
H2SO4로 pH 약 7.0으로 조정한 멸균 증식 배지(덱스트로즈 약 40g/ℓ, 뉴트리소이(nutrisoy) 가루 약 10g/ℓ, 효모 추출물 약 10g/ℓ, NaCl 약 10g/ℓ 및 K2HPO4약 10g/ℓ) 약 2.5㎖를 금속 뚜껑이 있는 2개의 16 x 125㎜ 유리 시험관(C1, T1) 각각에 첨가하고, 이어서 A 용액 (트윈 80 약 25g, 글리세롤 약 100g 및 여과 멸균된 증류수 약 250㎖) 약 0.2㎖를 2개의 배양물 각각에 첨가함으로써 하나의 "대조" 배양물(C1)과 하나의 "시험" 배양물(T1)을 제조하였다.
한세눌라 폴리모파 ATCC 번호 26012의 약 17% 냉동된 글리세롤 원액 약 25㎕를 T1에 넣었다. 2개의 시험관 배양물을 약 210rpm으로 진탕시키면서 약 29℃에서 항온 처리하였다. 약 24시간후에 라세믹 테트랄론(화학식 4의 화합물과 화학식 5의 화합물을 포함하는, 에탄올중 약 5㎎/㎖의 화학식 1의 화합물)의 원액 약 50㎕(약 100% 에탄올중 약 5㎎/㎖, 약 100㎍/㎖의 최종 농도)를 C1과 T1에 첨가하였다.
약 5일후에, NaCl(포화됨) 1㎖을 2개의 시험관 배양물 각각에 첨가하였다. 각각의 시험관 배양물의 발효액(약 3.6㎖)을 동량의 에틸 아세테이트(무수)로 추출하였다: 에틸 아세테이트를 첨가하고, 시험관 배양물을 와동시킨 후, 약 2,000rpm으로 원심분리하였다(IEC(등록상표) 원심분리기, 미국 매사츄세츠주 02194 니드함 하이츠 세컨드 애비뉴 300에 소재). 에틸 아세테이트 층을 제거하고, 수성 층을두 번째로 추출하였다. 유기 추출물을 합하여 질소하에 수욕에서 약 50℃로 건조시켰다.
B. 잔류 케톤(화학식 4의 화합물과 화학식 5의 화합물)의 원심분리
전술한 바와 같이 제조된 추출물 각각을 에탄올 약 1㎖에 재현탁시키고, 각각의 재현탁된 추출물 약 20㎕를 HPLC 컬럼, 즉 키랄셀 OK 컬럼(4.6 x 250㎜: 미국 펜실베니아주 19341 엑스톤 피.오.박스 564 스프링데일 드라이브 730 소재의 디아셀 케미칼 인더스트리즈(Diacel Chemical Industries)사)에 커플링된 키랄셀 OK 가드 컬럼(4.6 x 50㎜, 디아셀 케미칼 인더스트리즈사)상에 주입시켜 분석하였다. 각각에 주입된 재현탁된 추출물내에 함유된 화합물을 이동상 (85:15의 에탄올:에틸 아세테이트)중 분당 약 0.8㎖로 고르게(isocratically) 분리시키고, 화합물을 함유한 추출물을 254nm로 설정된 996 PDA 검출기(워터스(Waters: 등록상표), 미국 매사츄세츠주 01757 밀포드 메이플 스트리트 34)를 사용하여 검출하였다.
하기 표 1의 C1과 T1에 대한 데이타에 의해 예시되는 바와 같이, 키랄 HPLC 분석은 미생물, 즉 한세눌라 폴리모파 ATCC 번호 26012에서, 미반응 화학식 5의 (4S) 테트랄론 : 미반응 화학식 4의 (4R) 테트랄론의 비가 16:1로 나타났고, 이는 본 발명의 미생물에 의한 환원 방법의 입체특이성을 증명하는 것이다. 하기에 기록된 결과는 첨가된 각각의 거울상이성체의 공지된 양(화학식 4의 화합물과 화학식 5의 화합물 각각이 약 50㎍/㎖)을 기준으로 한다. 전술한 바와 같이, 화학식 1의 출발 라세믹 테트랄론은 약 100㎍/㎖의 농도를 가졌다.
배양물 4S 테트랄론(㎍/㎖) 4R 테트랄론(㎍/㎖)
4S:4R
C1 42.63 43.04
1
T1 37.92 2.37
16
키랄 분석으로부터의 결과는 한세눌라 폴리모파 ATCC 번호 26012 배양물(T1)이 (4R) 테트랄론을 실질적으로 환원시키는 반면 (4S) 테트랄론은 실질적으로 미반응 상태로 남겨둠을 보여준다(약 4.7%의 (4R) 테트랄론이 약 76%의 (4S) 테트랄론에 대해 남아있다). (4S) 테트랄론은 상기 키랄 HPLC에 의해 약 88%의 ee("거울상이성체 과량")로 존재함이 측정되었다. 표 1의 데이타, 구체적으로는 (4S):(4R)의 비, 즉 16에 의해 나타나는 바와 같이, (4R) 테트랄론에 비해 실질적으로 많은 (4S) 테트랄론이 미반응 상태로 남아있다.
따라서, 완전한 미생물, 즉 한세눌라 폴리모파 ATCC 번호 26012를 포함시키면, 화학식 5의 출발 (4S) 테트랄론에 비해 실질적으로 보다 많은 화학식 4의 출발 (4R) 테트랄론(즉, (4S):(4R))이 입체선택적으로 환원되고, 화학식 3의 (4S) 테트랄롤에 비해 화학식 2의 (4R) 테트랄롤이 주로 생성된다(데이타는 제시되어 있지 않다). 생성된 (4R) 테트랄롤의 대부분은 (1S,4R) 테트랄롤이었고, 생성된 소량의 (4S) 테트랄롤의 대부분은 (1S,4S) 테트랄롤이었다.
실시예 2
압시디아 코에룰레아 ATCC 번호 20137을 사용하는 라세믹 테트랄론의 환원
A. 균주 압시디아 코에룰레아 ATCC 번호 20137의 발효
H2SO4로 pH 약 7.0으로 조정한 멸균 증식 배지(덱스트로즈 약 20g/ℓ, 뉴트리소이 가루 약 5g/ℓ, 효모 추출물 약 5g/ℓ, NaCl 약 5g/ℓ 및 K2HPO4약 5g/ℓ) 약 2.5㎖를 금속 뚜껑이 있는 2개의 16 x 125㎜ 유리 시험관(C2, T2) 각각에 첨가하여서 하나의 "대조" 배양물(C2)과 하나의 "시험" 배양물(T2)을 제조하였다.
압시디아 코에룰레아 ATCC 번호 20137의 약 17% 냉동된 글리세롤 원액 약 25㎕을 T2에 넣었다. 2개의 시험관 배양물을 약 29℃에서 약 210rpm으로 진탕시키면서 항온 처리하였다. 약 48시간후에 라세믹 테트랄론(본원 실시예 1에 기재된 바와 같음, 약 100% 에탄올중 약 5㎎/㎖) 약 50㎕(에탄올중 약 5㎎/㎖, 약 100㎍/㎖의 최종 농도)를 C2와 T2에 첨가하였다.
약 5일후에, NaCl(포화) 1㎖를 2개의 시험관 배양물 각각에 첨가하였다. 각각의 시험관 배양물의 발효액(약 3.6㎖)을 에틸 아세테이트(무수) 약 3㎖로 추출하였다: 에틸 아세테이트를 첨가하고, 시험관 배양물을 와동시킨 후, 약 2,000rpm으로 원심분리하였다(IEC 원심분리기). 에틸 아세테이트 층을 제거하고, 수성 층을 두 번째로 추출하였다. 유기 추출물을 합하여 질소하에 수욕에서 약 50℃로 건조시켰다.
B. 잔류 케톤(화학식 4의 화합물과 화학식 5의 화합물)의 원심분리
전술한 바와 같이 제조된 추출물 각각을 에탄올 약 1㎖에 재현탁시키고, 각각의 재현탁된 추출물 약 20㎕를 HPLC 컬럼, 즉 키랄셀 OK 컬럼(4.6 x 250㎜)에 커플링된 키랄셀 OK 가드 컬럼(4.6 x 50㎜)상에 주입시켜 분석하였다. 각각에 주입된 재현탁된 추출물내에 함유된 화합물을 이동상(85:15의 에탄올:에틸 아세테이트)중 분당 약 0.8㎖로 고르게 분리시키고, 화합물을 함유한 추출물을 254nm로 설정된 996 PDA 검출기(워터스)를 사용하여 검출하였다.
하기에 기재된 C2와 T2에 대한 HPLC 데이타에 의해 예시되는 바와 같이, 미생물, 즉 압시디아 코에룰레아 ATCC 번호 20137에 의해 화학식 5의 출발 (4S) 테트랄론에 비해 화학식 4의 출발 (4R) 테트랄론이 보다 많이 입체특이적으로 환원되었다.
더욱 구체적으로, 키랄 분석으로부터의 결과는 압시디아 코에룰레아 ATCC 번호 20317 배양물이 (4R) 테트랄론을 환원시키는 반면, (4S) 테트랄론은 실질적으로 미반응 상태로 남겨둠을 보여준다(약 40.5%의 (4S) 테트랄론에 비해 약 13.6%의 (4R) 테트랄론이 남아있다). (4S) 테트랄론은 상기 키랄 HPLC에 의해 약 50%의 ee로 존재함이 측정되었다.
하기 표 2의 C2와 T2에 대한 데이타에 의해 예시되는 바와 같이, 키랄 HPLC 분석은 미생물, 즉 압시디아 코에룰레아 ATCC 번호 20137(T2)에서, 환원되지 않은 (4R) 테트랄론에 비해 2배 이상 많은 비의 (4S) 테트랄론이 환원되지 않은 상태로 존재함을 나타냈고, 이는 본 발명의 미생물에 의한 환원 방법의 입체특이성을 증명하는 것이다. 하기에 기록된 결과는 첨가된 각각의 거울상이성체의 공지된 양(본원의 실시예 1에 기재된 바와 같이 각각 약 50㎍/㎖)을 기준으로 한다. 전술한 바와 같이, 출발 라세믹 테트랄론은 약 100㎍/㎖의 농도를 가졌다.
배양물 4S 테트랄론(㎍/㎖) 4R 테트랄론(㎍/㎖)
4S:4R
C2 39.53 39.47
1
T2 20.24 6.81
3
실시예 3
진균류, 효모 및 방선균류를 사용하는 라세믹 테트랄론의 환원
관련 분야의 숙련자들에게 이해되고 있는 바와 같이, 본 발명의 환원에서 사용되는 하기 표 3에 기재된 미생물로는 지오트리쿰 칸디둠 ATCC 번호 62401, 모티에렐라 이사벨리나 ATCC 번호 38063, 모티에렐라 비나세아 ATCC 번호 09515, 페니실리움 노타툼 ATCC 번호 36740, 블라스토시조마이시스 카피타투스 ATCC 번호 28575, 모노스포리움 올리바세움 변종 메이저 ATCC 번호 36300, 아우레오바시디움 풀루란스 ATCC 번호 16623, 피치아 파비아니 ATCC 번호 16755 및 스트렙토마이시스 리모수스 아종 리모수스 ATCC 번호 10970이 실시예 2에 기재된 바와 같이 제조되었으며, 지오트리쿰 칸디둠 ATCC 번호 34614, 모티에렐라 이사벨리나 ATCC 번호 426123, 데바리오마이시스 폴리모푸스 ATCC 번호 20280 및 사카로마이시스 세레비지에 ATCC 번호 15248이 추출을 반복하는 것을 제외하고는 실시예 2에 기재된 바와 같이 제조되었고, 칸디다 사타비 ATCC 번호 24409는 하기에 기재된 바와 같이 제조되었다.
H2SO4로 pH 약 7.0으로 조정한 멸균 증식 배지(덱스트로즈 약 20g/ℓ, 뉴트리소이 가루 약 5g/ℓ, 효모 추출물 약 5g/ℓ, NaCl 약 5g/ℓ 및 K2HPO4약 5g/ℓ) 약 2.5㎖를 금속 뚜껑이 있는 2개의 16 x 125㎜ 유리 시험관에 첨가하고, 이어서 트윈 80 약 25g, 글리세롤 약 100g 및 증류수 약 250㎖로 이루어진 여과 멸균된 용액 약 0.1㎖를 배양물에 첨가함으로써 칸디다 사타비 ATCC 번호 24409를 제조하고 본 발명에 따라 사용하였다. 이어서, 칸디다 사타비 ATCC 번호 24409의 약 17% 냉동된 글리세롤 원액 약 25㎕를 배양물에 접종시켰다. 배양물을 약 29℃에서 약 210rpm으로 진탕시키면서 증식시켰다. 약 48시간후에 라세믹 테트랄론(화학식 4의 화합물과 화학식 5의 화합물을 포함하는 화학식 1의 화합물, 약 100% 에탄올중 약 5㎎/㎖)의 원액 약 50㎕(약 100% 에탄올중 약 5㎎/㎖, 약 100㎍/㎖의 최종 농도)를 배양물에 첨가하였다.
4일이 더 지난 후에, 배양물의 발효액(약 2.6㎖)을 동량의 에틸 아세테이트(무수)로 추출하고, 배양물을 와동시킨 후, 약 2,000rpm으로 원심분리하였다(IEC 원심분리기). 추출을 반복하였다. 추출물을 질소하에 수욕에서 약 50℃로 건조시켰다. 이어서, 추출물을 에탄올 약 1㎖에 재현탁시키고, 재현탁된 추출물 약 5㎕을 HPLC 컬럼, 즉 키랄셀 OD 컬럼(4.6 x 250㎜: 디아셀 케미칼 인더스트리즈 리미티드)에 커플링된 키랄셀 OD 가드 컬럼(4.6 x 50㎜, 디아셀 케미칼 인더스트리즈 리미티드)상에 주입시켜 분석하였다. 주입된 재현탁된 추출물내에 함유된 화합물을이동상(95:5의 헥산:이소프로판올)중 분당 약 0.9㎖로 고르게 분리시키고, 화합물을 함유한 추출물을 210nm로 설정된 996 PDA 검출기(워터스)를 사용하여 검출하였다.
하기 표 3에 기록된 키랄 HPLC(실시예 1과 2에 기재된 바와 같이 실시됨) 데이타에 의해 예시되는 바와 같이, 하기 표 3에 기재된 미생물 각각은 (4S) 테트랄론에 비해 (4R) 테트랄론을 실질적으로 보다 많이 입체특이적으로 환원시키고, 일반적으로 미반응 (4R) 테트랄론에 비해 약 2배 이상 많은 비의 (4S) 테트랄론을 미반응 상태로 남겨둔다.
표1 3의 데이타에 의해 예시된 바와 같이 완전한 모노스포리움 올리바세움 변종 메이저 ATCC 번호 36300은 (4S) 테트랄론에 비해 (4R) 테트랄론을 실질적으로보다 많이 환원시키고 이는 본 발명의 방법에서 사용하기에 바람직한 미생물인 반면, (4R) 테트랄론과 (4S) 테트랄론 둘다의 바람직하지 않은 분해도 상기 배양물에 대해 보고되었음을 유념해야 한다. 바람직하지 않은 분해는, 예컨대 완전한 미생물에 포함되는 그밖의 효소 등에 기인할 수 있다. 따라서, 본원에 제공된 상세한 설명으로부터 당해 분야의 숙련자들이 이해하고 있는 바와 같이, 완전한 모노스포리움 올리바세움 변종 메이저 ATCC 번호 36300에 비해 모노스포리움 올리바세움 변종 메이저 ATCC 번호 36300으로부터 단리된 효소를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 의해, 라세믹 화합물중 원하지 않는 (4R) 테트랄론만을 미생물 또는 효소 환원 시스템에 의해 입체선택적으로 환원시킨 후 이를 다시 출발물질로 만들어 재순환시킴으로써 원하는 (4S) 테트랄론 이성체를 생성시키는데 사용될 수 있으며, 원하는 (4S) 테트랄론은 미생물에 의해 환원되지 않은 상태로 남겨둠으로써, 결과적으로 원하는 (4S) 테트랄론이 높은 광학적 수율로 생성될 수 있다.

Claims (11)

  1. (a) 하기 반응식 2에 나타낸 화학식 1의 화합물을, 한세눌라 폴리모파(Hansenula polymorpha) 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC) 번호 26012, 한세눌라 폴리모파 ATCC 번호 74449, 압시디아 코에룰레아(Absidia coerulea) ATCC 번호 20137, 지오트리쿰 칸디둠(Geotrichum candidum) ATCC 번호 34614, 지오트리쿰 칸디둠 ATCC 번호 62401, 모티에렐라 이사벨리나(Mortierella isabellina) ATCC 번호 42613, 모티에렐라 이사벨리나 ATCC 번호 38063, 모티에렐라 비나세아(Mortierella vinacea) ATCC 번호 09515, 페니실리움 노타툼(Penicillium notatum) ATCC 번호 36740, 블라스토시조마이시스 카피타투스(Blastoschizomyces capitatus) ATCC 번호 28575, 모노스포리움 올리바세움 변종 메이저(Monosporium olivaceumv.major) ATCC 번호 36300, 아우레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullulans) ATCC 번호 16623, 데바리오마이시스 폴리모푸스(Debaryomyces polymorphus) ATCC 번호 20280, 사카로마이시스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) ATCC 번호 15248, 칸디다 사타비(Candida schatavii) ATCC 번호 24409, 피치아 파비아니(Pichia fabianii) ATCC 번호 16755 및 스트렙토마이시스 리모수스 아종 리모수스(Streptomyces rimosus ss. rimosus) ATCC 번호 10970으로 구성된 군에서 선택된 미생물로부터 수득된 효소 및 이 효소에 대한 보조 인자를 포함하여 하기 반응식 2의 미생물에 의한 입체선택적 환원(stereoselective microbial reduction)을 수행할 수 있는 효소 환원 시스템과 접촉시키는 단계; 및
    (b) 생성된 혼합물을 항온 처리하여 하기 반응식 2에 나타낸 화학식 5의 화합물을 50% 이상의 거울상이성체 과량(ee)으로 수득하는 단계
    를 포함하는, 하기 반응식 2에 따라 화학식 1의 화합물을 화학식 2의 화합물과 화학식 3의 화합물로 미생물 환원효소에 의해 입체선택적으로 환원시키는 방법:
    반응식 2
  2. 제 1 항에 있어서,
    효소 환원 시스템의 효소가 고정되어 있는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    효소 환원 시스템이 용매중에 존재하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    용매가 적합한 유기 용매인 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    화학식 1의 화합물을 용매에 첨가함으로써 접촉시키는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    효소 환원 시스템을 구성하는 효소가 한세눌라 폴리모파 ATCC 번호 26012 또는 한세눌라 폴리모파 ATCC 번호 74449로부터 수득되는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    효소 환원 시스템을 구성하는 효소가 압시디아 코에룰레아 ATCC 번호 20137로부터 수득되는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    효소 환원 시스템을 구성하는 효소가 모노스포리움 올리바세움 변종 메이저 ATCC 번호 36300으로부터 수득되는 방법.
  9. (a) 하기 반응식 2에 나타낸 화학식 1의 화합물을, 한세눌라 폴리모파 ATCC 번호 26012 및 한세눌라 폴리모파 ATCC 번호 74449로 구성된 군에서 선택된 미생물로부터 수득된 효소 및 이 효소에 대한 보조 인자를 포함하여 하기 반응식 2의 미생물에 의한 입체선택적 환원을 수행할 수 있는 효소 환원 시스템과 접촉시키는 단계; 및
    (b) 생성된 혼합물을 항온 처리하여 하기 반응식 2에 나타낸 화학식 5의 화합물을 50% 이상의 ee로 수득하는 단계
    를 포함하는, 하기 반응식 2에 따라 화학식 1의 화합물을 화학식 2의 화합물과 화학식 3의 화합물로 미생물 환원효소에 의해 입체선택적으로 환원시키는 방법:
    반응식 2
  10. 제 9 항에 있어서,
    효소 환원 시스템이 용매중에 존재하는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    화학식 1의 화합물을 용매에 첨가함으로써 접촉시키는 방법.
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