CZ379099A3

CZ379099A3 - Stereoselektivní mikrobiální redukce racemického tetralonu

Info

Publication number: CZ379099A3
Application number: CZ19993790A
Authority: CZ
Inventors: Brook Knight Morse; Susan Jane Truesdell; John Wing Wong
Original assignee: Pfizer Products Inc.
Priority date: 1998-10-29
Filing date: 1999-10-25
Publication date: 2000-05-17
Also published as: PT997535E; KR20030071731A; KR100432306B1; ZA996786B; RS49702B; EP0997535B1; HUP9903941A3; US6589777B1; IN191494B; EP0997535A3; KR100432309B1; CZ293579B6; CA2287560C; EP0997535A2; CA2287560A1; RU2235784C2; ES2264244T3; JP2001054397A; ATE328107T1; DK0997535T3

Description

Oblast techniky

Předložený vynález se týká nových způsobů přípravy (4S)-enantiomeru 4-(3,4-dichlorfenyl)-3,4-dihydro-1(2H)-naftalenonu (zde také označovaného jako chirální tetralon nebo (4S)-tetralon a zejména se týká stereoselektivní mikrobiální redukce racemického 4(3,4-dichlorfenyl)-3,4-dihydro-l(2H)naftalenonu (zde také označovaného jako racemický tetralon na chirální tetralon.

Dosavadní stav techniky

Chirální tetralon připravený způsoby předloženého vynálezu může být dále reagován k přípravě čistého cis-(1S)(4S)N-methyl-4-(3,4-dichlorfenyl)-1,2,3,4-tetrahydro-l-naftalenaminu, běžně označovaného jako sertralin. Sertralin je dobře znám jako užitečný například jako antidepresant a anorektický prostředek a při léčení chemických závislostí, poruch spojených s úzkostí, předčasné ejakulace, rakoviny a postmyokardinálního infarktu.

V dosavadním stavu techniky jsou známy metody přípravy sertralinu jako jsou například ty, které jsou popsány v US patentech č. 4 536 518, 4 777 288

940 731, 4 962 128, 5 082 970,

248 699, 5 442 116, 5 463 126,

750 794 a v článku W.M.Welcha, , 4 839 104, 4 855 500, 5 130 338, 5 196 607,

466 880, 5 597 826, a jr., a j který se objevil v Journal of Medicinal Chemistry, sv. 27, č. 11, str. 1 508, (1984) .

Některé z výše zmíněných patentů se týkají syntézy směsí cis- a trans-isomerů racemického N-methyl-4-(3,4-dichlorfenyl)-1,2,3,4-tetrahydro-l-naftalenaminu. Jak je tam popsáno, cis- a trans-isomery, stejně jako jejjich (S) a (R) enantiomery mohou být odděleny způsoby známými odborníkům v oboru včetně například frakční krystalizace nebo chromatografie.

Je také známo vybrat pro konečně požadovanou chiralitu dřívější postupy při syntéze sertralinu. Například výše zmíněný US patent č. 5 750 794 zveřejňuje způsob přípravy chirálního tetralonu reakcí racemického tetralonu s asymetrickým ketonovým redukčním prostředkem, čímž se získají cis- nebo trans-alkoholy v závislosti na chiralitě a symetrického použitého reagentu a pak se rozdělí alkoholy a oxidují se (1S,4S) a/nebo (1R,4S) alkoholy na (4S)-tetralon.

Je také známo v dosavadním stavu techniky, že chirální sloučeniny mohou být syntetizovány pomocí mikroorganizmů, jako jsou houby, například kvasinky. Například použití kvasinek k redukci ketonu na chirální alkoholy je dobře známo. Avšak jak ocení odborníci v příslušném oboru, chemické a optické výtěžky, například příslušné enantiomery a jejich množství z takovýchto mikrobiálních redukcí obecně kolísají značně v závislosti například na příslušném zvoleném mikroorganizmu, stejně jako na substituentech výchozí látky.

US patent č. 5 049 497 zveřejňuje způsob rozložení racemického derivátu bicyklo|4,2,0joktanu stykem tohoto derivátu s Bakerovými kvasinkami za podmínek dostatečných k poskytnutí směsi ketonu a alkoholu vysoké enantiomerní čistoty. Jak je tam popsáno, jenom jeden enantiomer příslušného racemického ketonu se redukuje, aby poskytl alkohol.

• * · ·

- 3 US patent č. 5 580 764 zveřejňuje asymetrický redukční způsob, který používá intaktního mikroorganizmu nebo přípravku z jeho rozrušených buněk k převedení cyklického ketonu na odpovídající chirální alkohol.

US patent č. 5 618 707 zveřejňuje způsob stereoselektiv ní redukce ketonových substrátů přídavkem těchto substrátů do kultivačního bujónu bučí Zigcsaccharomyces bailii, ATCC, (Americká sbírka typových kultur) č. 38924 nebo Schizosaccharomyces octosporus ATCC č. 2479, inkubací výsledné směsi a izolací hydroxysloučeniny konvenčními prostředky jako je například extrakce organickými rozpouštědly, adsorpce na pryskyřice nebo chromatografie, pro následující použití jako meziproduktu při přípravě prostředku snižujícího sérový cholesterol.

Izolovaná hydroxysloučenina, která je zde popsána byla analýzována chirální vysokovýkonnostní kapalinovou chromatografií (HPLC), HPLC s reversními fázemi nebo oběma. Konzistentně s tím by odborníci v relevantním oboru měli porozumět jak je zde popsáno, mnoho z velkého počtu mikroorganizmů, které byly zkoumány pro jejich schopnost redukovat ketonovou skupinu vybraného substrátu, selhalo při redukci ketonové skupiny s požadovanou specifitou nebo produktivitou.

Nyní bylo neočekávaně zjištěno, že oblast mikroorganizmů, včetně hub, například kvasinek a aktinomycet, podstatně stereoselektivně redukuje racaemický tetralon. Specifičtěji předmětná stereoselektivní mikrobiální redukce selektivně redukuje (4R)-tetralon z racemické směsi, přičemž ponechává (4S)-tetralon v podstatě nezreagovaný. Navíc nežádoucí (4R)tetralol vytvořený předmětným způsobem může být oxidován a pak racemizován na racemický tetralon a předmětný způsob opakován k dosažení dokonce více (4S)-tetralonu.

- 4 (4S)-Tetralon vytvořený předmětným způsobem může být použit při syntéze sertfelinu.

Všechny zde citované dokumenty, včetně předcházejícíh, jsou zde začleněny jejich odkazem v jejich celistvostech.

Podstata vynálezu

Předložený vynález se týká mikrobiální redukce karbony lových skupin, která zahrnuje styk ketonové sloučeniny, racemickěho tetralonu vzorce I s mikroorganizmem nebo enzymovým redukčním systémem schopným provést předmětnou redukci zahrnujícím enzym odvozený z uvedeného mikrooganizmu a kofaktor pro uvedený enzym, a inkubaci výsledné směsi za vhodných podmínek takových, že sloučenina mající hydroxyskupinu, specificky (4R)-tetralol vzorce II může být vytvořena a akumulována v médiu a sloučenina mající požadovanou stereochemii, (4S)tetralon vzorce V uvedeného dále, zůstává v podstatě nezreagovaná .

(4S)-Tetralon vzorce V uvedeného dále, to je chirální tetralon, pak může být izolován jakýmkoli vhodným způsobem, například chromatografií nebo krystalizací. Navíc (4R)-tetralol vzorce II může být separován od sloučenin vzorců III až V, oxidován a racemizován na racemický tetralon a předmětná stereoselektivní mikrobiální redukce může být opakována, čímž se získá ještě více požadovaného chirálního ketonu.

V souhlase s tím předložený vynález vytváří způsoby provádění následující stereospecifické mikrobiální redukce:

- 5 (I) (II) (lil)

(4R), (4S) (4R) (4S)

který zahrnuje styk sloučeniny vzorce I s mikroorganizmem nebo enzymovým redukčním systémem schopným provést předmětnou redukci, zahrnujícím enzym odvozený z uvedeného mikroorganizmu a kofaktor pro uvedený enzym, a inkubaci výsledné směsi za podmínek dostatečných k získání většího množství sloučeniny vzorce II než sloučeniny vzorce III, čímž se nechá větší množství sloučeniny vzorce V nezreagované než nezreagované sloučeniny vzorce IV.

Předmětná stereospecifická redukce může být také představena způsobem (l) o

Cl (4R). (4S)

Cl (4R)

Cl

- 6 který zahrnuje styk sloučeniny vzorce I s mikroorgamizmem nebo enzymovým redukčním systémem schopným dosáhnout předmětné redukce, obsahujícím enzym odvozený z uvedeného mikroorganizmu a kofaktor pro uvedený enzym, a inkubaci výsledné směsi za podmínek dostatečných k získání (4R)-tetralolu vzorce II a ponechání v podstatě nezreagovaného (4S)-tetralonu vzorce V.

Stereoselektivní redukce dále případně zahrnuje separaci (4S)-tetralonu vzorce V od (4R)-tetralolu vzorce II.

(4R)-Tetralol může pak být oxidován k vytvoření (4R)-tetralonu, který se pak nechá reagovat například s bází, čímž se vytvo ří racemický tetralon vzorce I a předmětná stereoselektivní mikrobiální redukce může být opakována, aby se získalo ještě více požadovaného (4S)-tetralonu vzorce V, to je (4S)-enantiomeru racemického tetralonu vzorce I.

Předložený vynález vytváří způsoby, které zahrnují stereoselektivní mikrobiální redukci sloučeniny vzorce I na sloučeninu vzorce II stykem sloučeniny vzorce I s mikroorganizmem nebo enzymovým redukčním systémem schopným dosáhnout předmětné redukce, zahrnuujícím enzym odvozený z uvedeného mikroorganizmu a kofaktor pro uvedený enzym, a inkubaci výsledné směsi za podmínek dostatečných k získání sloučeniny vzorce II, čímž zůstává podstatně více sloučeniny vzorce V nezreagováno než sloučeniny vzorce IV a podstatně více sloučeniny vzorce II se vytvoří oproti sloučenině vzorce III.

Ve výhodném provedení se provede styk sloučeniny vzorce II s enzymovým redukčním systémem.

V dalším výhodném provedení styku sloučeniny vzorce I se provede tento styk s enzymovým redukčním systémem, kde je enzym immobilizován.

Ve zvlášť výhodném provedení styku sloučeniny vzorce I je enzymový redukční systém odvozen z Hansenula polymorp ha ATCC č. 26012.

V dalším výhodném provedení mikroorganizmu je přípravek z jeho rozrušených buněk. V ještě dalším výhodném provedení mikroorganizmu je jeho acetonový práškový enzymatický přípravek.

Ve zvlášť výhodném provedení předloženého vynálezu se použije intaktní mikroorganizmus. Ve výhodném provedení, kde je mikroorganizmem intaktní mikroorganizmus, se sloučenina vzorce I uvede do styku s fermentačním mediem, kultivačním bujónem nebo rozpouštědlem obsahujícím mikroorganizmus.

V dalším výhodném provedení, kde je mikroorganizmus intaktním mikroorganizmem, se sloučenina vzorce I uvede do styku s promytým intaktním mikroorganizmem. V ještě dalším výhodném provedení, kde je mikroorganizmus intaktní, se sloučenina vzorce I uvede do styku s immobilizovaným intaktním mikroorganizmem.

Ve zvlášť výhodném provedení předloženého vynálezu je mikroorganizmus intaktní mikroorganizmu, který je vypěstován ve fermentačním mediu a styk se uskuteční přídavkem sloučeniny vzorce I do tohoto fermentačního media.

V dalším zvlášť výhodném provedení tohoto vynálezu je mikroorganizmus intaktní organizmus, který je vypěstován v růstovém mediu po dobu asi 48 hodin a styk se uskuteční v tomto růstovém mediu přídavkem sloučeniny vzorce I do něho a inkubace probíhá asi po dobu 5 dnů.

V ještě dalším výhodném provedení tohoto vynálezu je mikroorganizmem buS houba, například kvasinka nebo aktťomyceta nebo jejich mutant, který je schopen provedení stereoselektivní redukce.

V ještě dalším výhodném provedení tohoto vynálezu je mikroorganizmem houba. V ještě dalším výhodném provedení, kde mikroorganizmem je houba, je houbou Absidia coerulea ATCC č. 20137 .

Ve zvlášt výhodném provedení tohoto vynálezu je mikroorganizmem kvasinka. Ve zvlášt výhodném provedení tohoto vynálezu, kde je mikroorganizmem kvasinka, je kvasinkou Ilansenula polymorpha ATCC č. 26012, také uložená jako ATCC č. 74449.

Kde Hansenula polymorpha ATCC č. 26012, také uložená jako ATCC č. 74449, je použita jako mikroorganizmus, předmětná stereoselektivní mikrobiální redukce ocenitelně redukuje jen jeden enantiomer sloučeniny vzorce I, čímž se získá odpovídající alkohol, to je sloučenina vzorce II, přičemž se ponechá vá další enantimer sloučeniny vzorce I, to je sloučenina vzorce V v podstatě nezreagována.

Jak bylo diskutováno dříve, způsoby předloženého vynálezu dále případně zahrnují separaci, například provedenou použitím krystalizace nebo chromatografíe, sloučeniny vzorce V od sloučenin vzorců II až IV a použití takovéto separované sloučeniny vzorce V při syntéze sertralinu za použití jakýchkoli známých způsobů.

Jak bylo také diskutováno dříve, je výhodné oxidovat izolovaný (4R)-tetralol vzorce II na (4R)-tetralon vzorce IV. Pak je dále výhodné racemizovat, výhodně reakcí (4R)-tetralonu s bází, (4R)-tetralon vzorce IV na racemický tetralon vzorce I. Oxidace a racemizace recykluje nežádaný (4R)-tetralol pro další kolo stereoselektivní mikrobiální redukce podle způsobů předloženého vynálezu.

Recyklace nežádaného (4R)-tetralolu zvyšuje množství požadovaného (4S)-tetralonu a snižuje množství nežádaného vypouštěného (4R)-tetralolu. Oxidace a racemizace oxidovaného produktu se může provádět pomocí jakékoli vhodné známé metody k tomu určené.

Detailní popis vynálezu

Odborníci v oboru plně rozumějí výrazům zde použitým k popsání předloženého vynálezu, nicméně následující zde použité výrazy jsou zde dále popsány.

Kofaktor znamená jakýkoli vhodný kofaktor zahrnující enzymový redukční systém jako je například NADH, NADPH, FADH, FMNH a/nebo PQQ, nebo jakýkoli vhodný kofaktor, který se vysky tuje s enzymem v mikroorganizmu.

Enzymový redukční systém znamená vhodný mikrobiální oxidoreduktasový enzym a redukovanou formu kofaktoru pro oxidoreduktasový enzym, kde tento kofaktor může být bučí odvozen z vybraného mikroorganizmu nebo může být z jakéhokoli vhodného zdroje. Enzym zahrnující enzymový redukční systém může být bu5 ve volné nebo immobilizované formě, například v koloně nebo vázaný do zrn.

Mikrobiání redukce znamená stereoselektivní redukci předloženého vynálezu jak se provádí enzymovým redukčním sys10 témem, přičemž mikrobiální reduktasa zahrnuje enzymový redukční systém, intaktní mikroorganizmus nebo jakýkoli jeho přípravek a podobně.

Mikroorganizmus zahrnuje jakýkoli intaktní mikroorganizmus nebo přípravek z něj, včetně například přípravku z rozrušených buněk mikroorganizmu, dehydratovaný přípavek z mikroorganizmu, například acetonový práškový enzymatický přípravek, mikroorganizmus promytý volný z například fermentačního media, kultivačního bujónu a podobně, mikroorganizmus immobilizovaný, například v koloně, vázaný do zrn a podobně.

Způsoby vytvořené předloženým vynálezem zahrnují stereo selektivní mikrobiální redukci sloučeniny vzorce I na sloučeninu vzorce II

stykem sloučeniny vzorce I s mikroorganizmem nebo enzymovým redukčním systémem schopným uskutečnit předmětnou redukci, zahrnujícím enzym odvozený z uvedeného mikroorganizmu a kofaktor pro uvedený enzym, a inkubací výsledné směsi za podmínek dostatečných pro získání sloučeniny vzorce II, přičemž pod• · · · · · • · ·· * ·· · • · · · · · • · · ··· ··· • · · · ··· · ·· ·· · · statně více sloučeniny vzorce V zůstává nezreagováno, než sloučeniny vzorce IV a podstatně více sloučeniny vzorce II se vytvoří oproti sloučenině vzorce III.

Jak je známo odborníkům v oboru, sloučenina vzorce I, racemický tetralon, je směs (4S)-tetralonu a (4R)-tetralonu jak je uvedeno níže:

(4R) tetralom

Sloučeniny, nebo specifičtěji tetraloly,vzorce II jsou:

(trans) (1S, 4R) (cis) (1R,4R) • ·

- 12 Sloučeniny, nebo specifičtěji, tetraloly vzorce III jsou:

(cis)(1S,4S) (trans) (1R.4S)

Sloučeniny vzorců II a III jsou zveřejněny a nárokovány v dříve zmíněném US patentu č. 5 750 794.

Požadovaná sloučenina vzorce V může být izolována jak je popsáno dále, od nežádoucích sloučenin vzorce II, a jakýchkoli sloučenin vzorců III nebo IV, které mohou být bučí produkovány nebo zůstat nezreagovány v závislosti na, například, vybraném mikroorganizmu a podmínkách inkubace.

Sloučeniny vzorce II mohou být převedeny na sloučeninu vzorce I například oxidací a racemizací a proběhnout předmětnou stereoselektivní mikrobiální redukcí, čímž se získá ještě další množství (4S)-tetralonu vzorce V.

Způsob předloženého vynálezu se snadno provádí. Tak je mikroorganizmus bučí fermentován (intaktní mikroorganizmus) nebo inkubován (přípravek z rozrušených buněk, dehydratovaný přípravek nebo jakýkoli vhodný přípravek z mikroorganizmu) v přítomnosti racemického tetralonu představeného vzorcem I, k modifikaci racemického tetralonu -a zejména k redukci * · · » · · • · • · 9 9 nežádaného (4R)-enantiomerů racemického ketonu na jeho odpovídající alkohol představený vzorcem II, přičemž se nechává požadovaný (4S)-enantiomer představený vzorcem V v podstatě nezreagovaný, čímž v jednom stupni se získá opticky obohacený (4S)-enantiomer.

(4S)-enantiomer může pak být dále reagován způsoby dobře známými odborníkům v odpovídajícím oboru, jak je popsán například v dříve uvedených

777 288, 4 839 104, 4 855

130 338, 5 196 607, 5 248 5 597 826 a 5 750 794 a ve

US patentech č.	4	536	518,
500, 4 940 731,	2	962	128,	5	082	970,
699, 5 442 116,	5	453	126,	5	466	880,

výše uvedeném článku W.I-l.Welcha jr.

a j. ke konečnému získání sertralinu.

Aktivita, způsoby pro testování aktivit,dávky/dávkovači formy, způsoby podávání a základní informace týkající se sertralinu jsou uvedeny například ve výše uvedených US patentech č. 4 535 518, 4 777 288 a 4 839 104 a ve výše zmíněném článku W.M.Welcha jr. a j.

Jakýkoli vhodný mikroorganizmus může být použit ve způsobu předloženého vynálezu. Jak je popsáno dříve, použitý mikroorganizmus v předmětném způsobu může být intaktní, jakýkoli jeho vhodný přípravek, například jeho přípravek z rozrušených buněk, jeho dehydratovaný přípravek a bud volný nebo imobilizovaný. Avšak kde se použije neintaktní mikroorganizmus v předloženém vynálezu jako je například přípravek z rozrušených buněk, například buněčný extrakt, acetonový práškový enzymatický přípravek nebo enzym z něj odvozený, odborníci v oboru by měli vědět, že je také zahrnut vhodný kofaktor pro tento enzym.

Odborníci v oboru rozumějí ze zde uvedeného popisu a z jejich odpovídajících znalostí jak připravit vhodný pří• « · · • ·

- 14 fc* fc* • · « * · fc · « • · < f • · · ·· fc··· « pravěk z rozrušených buněk jak je popsáno například R.N.Patelem a j. v článku Oxidace sekundárních alkoholů na methylketony kvasinkami, publikovaném v Applied and Environmental Microbiology, 38(2):219-223 (1979).

Odborníci v oboru porozumějí z popisu zde uvedeného a jejich odpovídajících vlastností jak připravit vhodný acetonový práškový enzymatický přípravek jak je popsáno například

K. Nakamurou a j. v článku Asymetrická redukce ketonů acetonovým práškem Geotrichum candidum, publikovaném v Tetrahedron Letters, 37(10):1629-1632 (1995).

Navíc enzym (např. oxidoreduktasa) jakéhokoli vhodného mikroorganizmu může být také použit v předmětném způsobu a tento enzym může být izolován z mikroorganizmu jakoukoli vhodnou metodou známou odborníkům v oboru a pokud jde o intaktní mikroorganizmus, může být použit v předmětném způsobu v buá volné nebo imobilizované formě.

Odborníkům v oboru bude zřejmé z popisu zde uvedeného a jejich odpovídajících znalostí jak izolovat a čistit enzym vhodného mikroorganizmu jak je obecně popsáno například v článcích od tl.Wady a j. Čištění a charakterizace NADPH-závislé karbonylreduktasy zahrnuté v stereoselektivní redukci ethyl4-chlor-3-oxobutanoatu, z Candida magnoliae, publikovaném v Biosci.Biotechnol.Biochem., 62(2):280-285 (1998), P.Trošty a j., Čištění a vlastnosti NAP(P)H: (chinonakceptorové)oxidoreduktasy řepných buněk, publikovaném v Eur.J.Biochem., 234:452-458(1995), Κ .II.Madyasthy a T.L.Gururaji, Čištění a některé z vlastností nové sekundární alkoholové dehydrogenasy z Alcaligenes Eutrophus, publikovaném v Biochemical and Biophysical Resear/ch Communications, 211(2):540-546 (1995), O.Bortoliniho a j., Kinetické štěpení vic-diolů pomocí Bacillus stearothermophylus diacetylreduktasy, publikovaném v Tetra hedron:Asymmetry, 9:647-651 (1998), R.M.Patela a j. Stereo- 15 specifická mikrobiální redukce 4,5-dihydro-4-(4-methoxyfenyl)5-(trifluormethyl-lH-1)benzazepin-2-onu, publikovaném v Enzyme Microb.Technol., 3:905-912 (1991) a R.N.Patela a j., Stereoselektivní mikrobiální/enzymatická oxidace (exo,exo)7-oxabicykloj2,2,1jheptan-2,3-dimethanolu na odpovídající chirální laktol a lakton, publikovaném v Enzyme Microb.Technol., 14:778-784 (1992) a v US patentech č. 5 523 223 a výše zmíněném 5 580 764.

Vhodné mikroorganizmy zahrnují Hansenula polymorpha ATCC č. 26012, Hansenula polymorpha ATCC č. 74449, Absidia coerulea ATCC č. 20137, Geotrichum candidum ATCC č. 34514, Geotrichum candidum ATCC č. 62401, Mortierella isabellina ATCC č. 42613, Mortierella isabellina ATCC č. 38063, Mortieralla vinacea ATCC č. 09515, Penicillium notatum ATCC č. 36740, Blastoschizomyces capitatus ATCC č. 28575, Monosporium olivaceurn v. major ATCC č. 36300, Aureobasidium pullulans ATCC č. 16623, Debaryomyces polymorphus ATCC č. 20280, Saccharomyces cerevisiae ATCC č. 15248, Candida schatavii ATCC č. 24409, Pichia fabianii ATCC č. 16755 a Streptomyces rimosus ss. rimosus ATCC č. 10970, a jejich mutanty, které jsou známy nebo jinak získatelné odborníky v odpovídajícím oboru a jsou schopné, navzdory takovéto mutace, uskutečnit stereoselektivní mikro biální redukci zde uvedenou.

Výhodné intaktní mikroorganizmy budou ty, které podstat ně redukují (4R)-tetralon, přičemž nechávají (4S)-tetralon v podstatě nezreagovaný, kde zreagovaný zahrnuje redukci nebo jakoukoli jinou vlastní aktivitu, ktrerá by mohla degradovat nebo jinak negativně ovlivnit požadovaný (4S)-tetralon v jakémkoli stadiu předmětného způsobu.

Jak bude oceněno odborníky v oboru, z uvedeného popisu takováto nežádaná reakce (4S)-tetralonu může být v podstatě

- 16 zabráněna například použitím enzymu odvozeného z vybraného mikroorganizmu oproti intaktnímu mikroorganizmu.

Mikroorganizmy vhodné pro použití při předmětné sterospecifické mikrobiální redukci mohou být připraveny jakýmkoli vhodným způsobem známým odborníkům v odpovídajícím oboru.

Například vhodným způsobem pro přípravu mikroorganizmu z komerčně dostupného původu je uveden dále.

Způsob vytvořený dále může být použit pro j akýí ;oli mikroorganizmus vhodný pro použití při předloženém způsobu tohoto vynálezu a odborníci v oboru by měli ze zde uvedeného popisu vědět, jak modifikovat jakoukoli část postupu, například metody přípravy mikroorganizmu, intaktního nebo přípravku, napříkad rozrušených buněk nebo dehydratovaného, volného nebo imobilizovaného, způsobu přípravy vhodného enzymu odvozeného z takovéhoto mikroorganizmu, způsobu kontaktu racemického tetralonu s mikroorganizmem nebo enzymem obsahujícím enzymový redukční systém z něj odvozený, komponenty růstového media a podmínky, například teplotu, plí a podobně, nebo inkubační podmínky, aby se dosáhlo požadovaného výsledku v kterémkoli příslušném postupu.

Odborníci v oboru budou vědět z popisu, který je zde uveden a z jejich odpovídajících znalostí, jak připravit vhodný imobilizovaný intaktní mikroorganizmus jak je popsán například A. Bauerem a j. v článku Polyvinylalkoholem imobilizované celobuněčné přípravky pro biotransformaci nitrilů publikovaném v Biotechnology Letters, 18(3): 343-348 (březen 1396).

Jakákoli vhodná metoda styku sloučeniny I s mikroorganizmem nebo enzymovým redukčním systémem může být použita v tomto vynálezu. Sloučenina vzorce I může být kontaktována * · f « · · · · · ······ v · · · · · · »· ···· ··· · · · ·· ··

- 17 s mikroorganizmem nebo enzymovým redukčním systémem v jakémkoli vhodném pořádku.

Například sloučenina vzorce I může být přidána do media jako je kultivační bujón obsahující mikroorganizmus volný nebo imobilizovaný nebo určitou jeho kombinaci, nebo medium může obsahovat sloučeninu vzorce I a mikroorganizmus může pak být přidán do tohoto media, nebo sloučenina vzorce I a mikroorganizmus mohou být přidány společně do takovéhoto media, nebo sloučenina vzorce I může být přidána do přípravku z jeho rozrušených buněk, neabo sloučenina vzorce I může být přidána do dehydratovaného přípravku mikroorganizmu, nebo buá sloučenin vzorce I nebo mikroorganizmus nebo enzymový redukční systém mohou být přidány do vhodného rozpouštědla obsahujcího ty druhé a podobně. Odborníkům v oboru bude jasné ze zde uvedeného popisu jak modifikovat jakoukoli část předmětného způsobu, pokud je to třeba.

Je zvlášt výhodné předloženém vynálezu, že mikroorganizmus nebo enzymový redukční systém je odvozen z Hansenula polymorpha ATCC č. 26012. Lyofilizovaný vzorek Hansenula polymorpha ATCC č. 25012 (původně přispěním od D.VJ.Levina) byl uložen s ATCC lokalizovaným jako 10801 v University Boulevard Manassas, Virginia, 20110-2209, USA za podmínek Budapešťské smlouvy 25. června 1998. Této nově uložené kultuře bylo dáno nové depozitní číslo ATCC č. 74449.

Tudíž je zvlášt výhodné v předloženém vynálezu, že mikroorganizmem je Hansenula polymorpha ATCC č. 74449. Všechny restrikce na dostupnost veřejnosti této kultury mikroorganizmu takto uložené budou neodvolatelně odstraněny po vydání patentu na přihlášku tohoto vynálezu.

• · ·

- 18 Kultury Hansenula polymorpha ATCC č. 26012 mohou být získány z ATCC a příklad vhodného způsobu pro jejich přípravu z komerčně nabytého výrobku je uveden bezprostředně dále.

Kultura takto získaná se přidá do vhodného růstového media a inkubuje se za třepání až nastane růst, kteréžto dva stup» ně jsou oceněny odborníky v oboru. Kultura takto připravená může být použita k inokulaci sikmin s částmi těchto šikmin zmrazenými jako základní zásoby. Alternativně kapalné zásobní kultury mohou být připraveny přidáním glycerolu na asi 10 % až asi 20 %, které jsou pak zmrazený na asi -30 °C, výhdně v malých kryozkumavkách.

Jak vědí odborníci v oboru, jakýkoli vybraný organizmus a jak je zde vytvořeno dále v příkladech pro Absidia coe rulea ATCC č. 20137 a zejména výhodný Hansenula polymorpha ATCC č. 26012 nebo ATCC č. 7444S, vhodná metoda pro přípravu mikroorganizmu je následující: mikroorganizmus se inokuluje ze zmrazené zásobní kultury jak je popsáno výše (asi 17%ní glycerolová zásoba) do baňky nebo skleněné zkumavky nebo s kovovým uzávěrem, obsahující růstové medium (obsahující alikvot ze sterilního roztoku, který zahrnuje Twsen 80, glycerol a destilovanou vodu), kterážto kompozice je popsána dále detaině ji.

°C až asi 32 °C

Fermentace se provádí při teplotách v rozmezí asi a výhodně při asi 29 °C za vhodného třepání, výhodně od asi 200 otáček za minutu do asi 220 otáček za minutu a nejvýhodněji při asi 210 otáčkách za minutu. Kde je to žádáno, pH růstového media může být udržováno použitím vhodných pufrů začleněných do fermentačního media a/neabo periodicky nastavováno přídavkem bučí báze nebo kyseliny jak je třeba.

Jakékoli vhodné trvání růstu mikroorganizmu, styk mikro organizmu se sloučeninou vzorce I a inkubace sloučeniny

vzorce I s mikroorganizmem mohou být použity v předloženém vynálezu. Vhodný růst mikroorganizmů se může dosáhnout například během 24 hodin, v kteréžto době vhodný alikvot roztoku racemického tetralonu ve vhodném rozpouštědle, výhodně ethanolu, může být přidán do kultury.

Fermentace pak může pokračovat například od asi 2 do asi 6 dnů a výhodně například po dobu asi 5 dnů, v kteréžto době může být fermentační bujón extrahován pomocí vhodné extrakční metody při níž vhodné rozpouštědlo, jako je napříklade ethylacetat, methylisobutylketon, methylethylketon, methy lenchlorid a podobně, výhodně ethylacetat, odstraní organické sloučeniny z fermentačního bujónu. Po extrakci fermentačního bujónu a separaci organické a vodné fáze mohou být sloučeniny obsahující organický zbytek určeny pomocí vhodné metody jako je například chromatografie, výhodně chirální HPLC.

Ve způsobu tohoto vynálezu může být použito jakékoli vhodné růstové medium a vhodné růstové medium bude obsahovat zdroj nebo zdroje asimilovatelného uhlíku, asilmilovatelného dusíku a anorganické soli obsahující esenciální minerály.

Obecně mnoho cukrů jako je například glukosa, maltosa, mannosa, sacharosa, škrob, glycerin, prosné želé, melasy, sojové oříšky a podobně, může být použito jako zdroje asimilovatelného uhlíku.

Zdroje asimilovatelného dusíku zahrnují například látky jako jsou kvasnice a kaseinové hydrolyzáty, primární kvasnice, kvasnicové extrakty, mouka z bavlníkových semen, tuhé látky ze sojových oříšků, pšeničné klíčky, masové extrakty, pepton, kukuřičný výluh a amonné soli.

Vhodné nutriční látky z anorganických solí pro použití v kultivačním mediu tohoto vynálezu zahrnují například běžné soli obsahující sodík, železo, hořčík, draslík, kobalt, fosforečnan a podobně.

Zejména růstová media vhodná pro použití v předloženém vynálezu zahrnují například (a) dextrosu (asi 20 g), kvasnicový extrakt (asi 5 g), sojovou mouku (asi 5 g), NaCl (asi 5 g), K/íPO^ (asi 5 g) a destilovanou vodu (asi 1 1), pH se nastaví na asi 7,0 pomocí vodného roztoku H SO^, (b) dextrin (asi 10 g), hovězí extrakt (asi 3 g), ardamin pH (asi 5 g), LIZ amin typ E (asi 5 g), MgSO^^í^O (asi 0,5 g), KÍ^PO^. (asi 0,37 g), CaCO^ (asi 0,5 g) a destilovanou vodu (asi 1 litr), pH se nastaví na asi pH 7,1 pomocí vodného rozto ku ÍIC1, načež následuje druhé stadium z glukosy (asi 10 g), Hy-Case SF (asi 2 g), hovězího extraktu (asi 1 g), výluh z kukuřičných stvolů (asi 3 g), a destilované vody (asi 1 litr), pil se nastaví na asi píl 7,0, (c) glukosu (asi 10 g), kukuřičný výluh (asi 6 g), KI-^PO^ (3 g), CaCO^ (3,5 g), sojový olej (surový, asi 2,2 ml), kvasnicového extraktu (asi 2,5 g) a destilované vody (asi 1 1), pH se nastaví od asi 7,0 do asi 7,3 pomocí vodného roztoku IICl (d) sladový sirup (asi 20 g), sojovou mouku (asi 5 g), kasein (asi 1 g), sušená kvasnice (asi 1 g), NaCl (asi 5 g) a deštilo vanou vodu (asi 1 1), (e) laktosu (asi 75 g), Pharmamedia (nahrazuje kvasnicový extrakt (asi 40 g), CaCO^ (asi 10 g), Na2SO^ (asi 4 g) a deštilo vanou vodu (asi 1 1),

- 21 (f) ISP č. 2 (viz například strana 460 Handbook of Microbial Media od R.M.Atlase, vydaná L.C.Parksem, CRC Press, lne., 1993 (Handbook)),

(g)	ISP	č.	3	(viz	str.	460	Handbook),
(h)	ISP	č.	4	(viz	str.	461	Handbook),
(i)	ISP	č.	5	(viz	str.	461·	-462 Handbook) a podobně

Zvlášt výhodné růstové medium je 2krát (a) uvedené výše.

Odkaz na jednotlivé pufry, media, reagenty, styk nebo podmínky kultivace a podobně není určen k omezení, ale je třeba ho číst tak, Se zahrnuje všechny takovéto příslušné látky, které odborníci v oboru znají jako zajímavé nebo hodnotné v příslušném kontextu, ve kterém se zde provádí diskuze. Například je možné substituovat jeden pufrový systém nebo kultivační medium za jiné, takže rozdílné, ale známé způsoby se použijí k dosažení stejných cílů jako jsou ty, ke kterým se používá navrhované metody materiálu nebo složení. Navíc by mělo být zřejmé, že předložený vynález zahrnuje zvětšení předmětného postupu pro komerční účely.

Tudíž jak vědí odborníci v oboru, růstové medium, podmínky fermentace a/nebo množství racemického tetralonu, mohou být měněny k řízení výtěžku výsledných sloučenin a jejich relativních rychlostí produkce.

Obecně použité technologie v předloženém vynálezu budou zvoleny s ohledem na průmyslovou účinnost. Růstová media, podmínky fermentace a relativní množství mikroorganizmu nebo enzymového redukčního systému a racemického tetralonu, které • · • · « * « · • · · * « · · · · · • · • · · ·

- 22 jsou zde popsány, jsou pouze ilustrativní ze široké palety medií, fermentačních podmínek a množství výchozích látek, které mohou být vhodně využity v předloženém vynálezu jak je zřejmé odborníkům v oboru, a nejsou určeny k jakýmkoli způsobem k omezení.

Jakékoli vhodné metody izolace a/nebo čištění, kterýchkoli produktů předloženého způsobu mohou být použity v předloženém vynálezu včetně filtrace, extrakce, krystalizace, sloupcové chromatografíe, tenkovrstvé chromatografíe, preparativní nízkotlaké kapalinové chromatografíe nebo HPLC, nebo jakékoli vhodné kombinace těchto metod.

Dále odborníkovi z oboru je zřejmé, že nežádaný odpovídající alkohol z (4R)-tetralonu, sloučenina vzorce II, produkovaný zde uvedenými postupy, může být recyklován, napříkad oxidován a racemizován jak bylo dříve diskutováno, jakoukoli známou vhodnou metodou na racemický tetralon vzorce I a postupy předloženého vynálezu mohou být opakovány, aby vedly znovu k požadovanému (4Ξ)-tetralonu vzorce V. Oxidace (4R)-tetralolu na (4R)-keton může být provedena způsoby známými odborníkům v oboru.

Racemizační reakce se může provádět jakýmkoli vhodným způsobem, ale obecně se provádí při teplotě oda si 0 °C do asi 100 °C, výhodně od asi 25 °C do asi 55 °C. (4R)-Tetralon se nechá reagovat s bází při teplotě od asi 25 °C do asi 85°C, výhodně od asi 50 °C do asi 65 °C. Vhodné báze pro racemizační reakci zahrnují t-butoxid draselný, hydroxid sodný, methoxid sodný a hydroxid draselný. Výhodná báze je t-butoxid draselný.

Detailní příklady uvedené dále, ukazují, že řada mikroorganizmů zahrnující houby, například kvasinky a aktinomycety, • *

- 23 stereoselektivně redukuje racemický tetralon, čímž se získá požadovaný (4S)-tetralon vzorce V, to je chirální tetralon, který pak může být separován z nežádoucích sloučenin a dále reagován postupy dobře známými v dosavadním stavu techniky pro získání sertralinu.

Příklady provedení vynálezu

Předložený vynález je ilustrován následujícími příklady provedení. Předcházející a následující popis předloženého vynálezu a různá provedení nejsou určeny k omezení vynálezu, ale pouze jsou jeho ilustrací. Tudíž je třeba rozumět, že vynález není omezen na specifické detaily těchto příkladů.

Příklad I

Redukce racemického tetralonu pomocí Hansenula polymorpha ATCC č. 26012

A. Fermentace kvasinek Hansenula polymorpha ATCC č. 26012

Jedna kontrolní kultura (Cl) a jedna zkušební kultura (Tl) byly připraveny následovně: asi 2,5 ml sterilního růstového media (asi 40 g/1 dextrosy, asi 10 g/1 nutrisojové mouky, asi 10 g/1 kvasnicového extraktu, asi 10 g/1 NaCl a asi 10 g/1 s pH nastaveným na asi 7,0 pomocí F^SO^) bylo přidáno do každé ze dvou 16 x 125 mm skleněných zkumavek, z nichž každá měla kovový uzávěr (Cl, Tl) načež následoval přídavek asi 0,2 ml roztoku A (asi 25 g Tween 80, asi 100 g glycerolu a asi 250 ml destilované vody, filtračně sterilizované) do každé ze dvou kultur.

• · ·

- 24 Asi 25 mikrolitrů asi 17%ní zmrazené glycerolové zásoby Hansenula polymorpha ATCC č. 26012 bylo inokulováno do Tl. Tyto dvě zkumavkové kultury byly inkubovány při asi 29 ° za třepání při asi 210 otáčkách za minutu. Po 24 hodinách asi 50 mikrolitrů zásobního roztoku (asi 5 mg/ml v asi 100%ním ethanolu, finální koncentrace asi 100 mikrogramů/ml) racemického tetralonu (sloučenina vzorce I obsahující sloučeniny vzorců IV a V, v asi 5 mg/ml v ethanolu) bylo přidáno do Cl a Tl.

Po asi 5 dnech byl 1 ml nasyceného roztoku NaCl přidán do každé ze dvou zkumavkových kultur. Permentační bujón z každé zkumavkové kultury (asi 3,6 ml) byl extrahován stejným objemem ethylacetátu (nezředčncno): ethylacetát byl přtián, zkumavková kultura byla rozvířena a pak odstředěna při asi 2000 otáčkách za minutu (IEC Centrifugo, 300 Second Avenue, Needham Heights, Ilassachusets, 02194). Ethylacetatová vrstva byla odstraněna a vodná vrstva extrahována po druhé. Sloučené organické extrakty byly vysušeny pod atmosférou dusíku ve vodní lázni při asi 50 °C.

B. Konfigurace zbytkového ketonu: sloučeniny vzorců IV a V

Každý z extraktů připravených jak je výše popsáno, byl resuspendován v asi 1 ml ethanolu a asi 20 mikrolitrů každého resuspendovaného extraktu bylo analýzováno injekcí na HPLC sloupec: Chiralcel OK ochranná kolona (4,5 x 50 mm, Diacel Chemical Industries, Ltd., 730, Springdale, Drive, PO box 564, Exton, Pennsylvania 19341) připojená k Chiralcel OK koloně (4,6 x 250 mm, Diacel). Sloučeniny obsažené v každém injektovaném resuspendovaném extraktu byly odděleny isokraticky v asi 0,8 ml za minutu v mobilní fázi (ethanol:ethylacetát 85:15) a sloučeniny zahrnující extrakty byly detekovány pomocí 996 PDA detektoru (Waters, 34 Maple Stree, Milford, Massachusets, 01757) seřízeného při 254 nm.

« v • · « · · * ♦ · ·· ···· « · · · · · · · · • · · · * · * ···«·· • · 9 · · » · • a a··* a·· * · a »· * a

- 25 Jak je znázorněno údaji pro Cl a Tl v následující tabulce I, chirální HPLC analýza ukazuje, že začleněné mikroorganizmu, to je Hansenula polymorpha ATCC č. 26012 vede k poměru 16:1 (( 4Ξ)-tetralon vzorce V nezreagovaný oproti (4R)tetralon vzorce IV nezreagovaný), což dále ilustruje stereospecif itu předmětného mikrobiálního redukčního postupu.

Dále uvedené výsledky jsou založeny na známém množství každého přidaného enantiomerů (asi 50 mikrogramů/ml každé ze sloučenin vzorců IV a V). Jak je zmíněno výše, výchozí racemický tetralon vzorce I má koncentraci asi 100 mikrogramů/ml.

Tabulka I

Kultura	(4S)-tetralon (yUg/ml)	(4R)-tetralon (jag/ml)	4S:4R
Cl	42,63	43,04	1
Tl	37,92	2,37	16

Výsledky z chirální analýzy ukazují, že Hansenula polymorpha ATCC č. 26012 kultura (Tl) podstatně snižuje (4R)-tetralon, přičemž ponechává v podstatě nezreagovaný (4S)-tetralon (asi 4,7 % (4R)-tetralonu zůstává oproti asi 75 % (4S)tetralonu). (4S)-Tetralon byl určen, že je přítomen v asi 88%ním ee (procentní množství enantiomerního přebytku) touto chirální HPLC. Jak je také znázorněno údaji v tabulce I, specificky poměrem (4S):(4R), to je 16, podstatně více (4S)— tetralonu zůstává nezreagováno oproti (4R)-tetralonu.

V souhlase s tím začlenění intaktního mikroorganizmu to je Hansenula polymorpha ATCC č. 26012 vede ke stereospeci« ·

- 26 fické redukci podstatně více výchozího (4R)-tetralonu vzorce IV než výchozího (4S)-tetralonu vzorce V ((4S):(4R), a získá se většinou (4R)-tetralol vzorce II oproti (4S)-tetralolu vzorce III (údaje nejsou uvedeny)). Většina (4R)-tetralolu, který byl získán, byla (1S,4R)-tetralol a většina malého množství (4S)-tetralolu, který byl získán, byla (1S,4S)-tetralol.

Příklad II

Redukce racemického tetralonu za použití Absidia coerulea ATCC č. 20137

A. Fermentace houby Absidia coerulea ATCC č. 20137

Jedna kontrolní kultura (C2) a jedna zkušební kultura (T2) byly připraveny následovně: asi 2,5 ml sterilního růstového media (asi 2 g/l dextrosy, asi 5 g/l nutrisojové mouky, asi 5 g/l kvasnicového extraktu, asi 5 g/l NaCl a asi 5g/l K^IIPO^, s pil nastaveným na asi 7,0 pomocí H₂SO^) byly přidány do každé ze dvou 16 x 125 mm skleněných zkumavek, přičemž každá měla kovový uzávěr (C2,T2).

Asi 25 mikrolitrů asi 17%ní zmrazené glycerolové zásoby Absidia coerulea ATCC č. 20137 bylo inokulováno do T2. Tyto dvě zkumavkové kultury byly inkubovány při asi 29 °C za třepání při asi 210 otáčkách za minutu. Po asi 48 hodinách asi 50 mikrolitrů (asi 5 mg/ml v ethanolu, finální koncentrace asi 100 mikrog/ml) racemického tetralonu (jak je popsáno v příkladu I, při asi 5 mg/ml v asi 100%ním ethanolu bylo přidáno do C2 a T2.

Po asi 5 dnech byl přidán 1 ml nasyceného roztoku NaCl do každé z těchto dvou zkumavkových kultur.

• ·

- 27 Fermentační bujón každé zkumavkové kultury (asi 3,6 ml) byl extrahován asi 3 ml ethylaeetátu (nezředěného): byl přidán ethylacetat, zkumavková kultura byla rozvířena a pak odstředěna při asi 2000 otáčkách za minutu (IEC Centrifuge). Ethylacetatová vrstva byla odstraněna a vodná vrstva byla extrahována podruhé. Sloučené organické extrakty byly vysušeny pod atmosférou dusíku ve vodní lázni při asi 50 °C.

E. Konfigurace zbylého ketonu: sloučeniny vzorce IV a V

Každý z extraktů, připravených jak je výše popsáno, byl resuspendován v asi 1 ml ethanolu a asi 20 mikrolitrů každého resuspendovaného extraktu bylo analyzováno vstříknutím na MPLC sloupec: Chiralcel OK ochranná kolona (4,6 x 50 mm, spojená s Chiralcel OK kolonou (4,5 x 250 mra). Sloučeniny obsažená v každém vstříknutém resuspendovaném extraktu byly separovány isokraticky při asi 0,8 ml za minutu v mobilní fázi (ethanol:ethylacetat, 85:15) a tyto sloučeniny obsahující extrakty byly detekovány pomocí 99 6 PDA detektoru (Katers) seřízeného při 254 nm.

Jak je znázorněno HPLC údaji pro C2 a T2 uvedenými níže, začlenění mikroorganizmu, to je Absidia coerulea ATCC č. 20137 vedlo ke stereospecifické redukci více výchozího (4R)-tetralonu vzorce IV než výchozího (4S)-tetralonu vzorce

V.

Specifičtěji výsledky z chirální analýzy ukazují, že Absidia coerulea ATCC č. 20137 kultura snižuje (4R)-tetralon přičemž nechává v podstatě nezreagovaný (4S)-tetralon (asi 13,6 % (4R)-tetralonu zůstává oproti asi 40,5 % (4S)-tetralonu) (4S)-tetralon byl určen, že je přítomen v asi 50%ní ee touto chirální HPLC.

Jak je znázorněno údaji pro C2 a T2 z tabulky II, která

- 28 následuje, chirální HPLC analýza ukazuje, že začlenění mikroorganizmu, to je Absidia coerulea ATCC č. 20137 (T2), vede k poměru alespoň dvojnásobnému pokud jde o (4S)-tetralon ponechaný nezreagovaný oproti nezreagovanému (4R)-tetralonu, přičemž je dále zřejmá stereospecifita předmětného mikrobiálního redukčního postupu.

Dále uvedené výsledky jsou založeny na známém množství každého přidaného enantiomeru (asi 50 mikrogramů/ml každého jak je popsáno zde v příkladu I). Jak je výše zmíněno, výchozí racemický tetralon měl koncentraci asi 100 mikrogramů/ml.

Tabulka II

kultura	(43)-tetralon (jig/ml)	(4R)-tetralon (jig/ml)	4S:4R
C2	30,53	39,47	1
T2	20,24	6,81	3

Příklad III

Redukce racemického tetralonu za použití hub, kvasinek a aktinomycet

Jak je porozuměno odborníkům v odpovídajícím oboru, mikroorganizmy uvedené v tabulce III, které byly použity v předmětné redukci, Geotrichum candidum ATCC č. 62401, Mortierella isabellina ATCC č. 38063, Mortierella vinacea ATCC • · · · • ·

č. 09515, Penicillium notatum ATCC č. 36740, Blastoschizomyces capitatus ATCC č. 28575, Ilonosporium olivacaeum v.major ATCC č. 36300, Aureobasidium pullulans ATCC č. 16623, Pichia fabianii ATCC č. 16755 a Streptomyces rimosus ss. rimosus ATCC č. 10970 byly připraveny jak je popsáno v příkladu II, Geotrichum candidum ATCC č. 34614, Mortierella isabellina ATCC č. 42613, Debaryomyces polymorphus ATCC č. 20280 a Saccharomyces cerevisiae .ATCC č. 15248 byly připraveny jak je popsáno v příkladu II s výjimkou toho, že extrakce byla opakována a Candida schatavii ATCC 24409 byly připraveny jak je uvedeno dále.

Candida schatavii ATCC č. 24409 byla připravena a použita podle tohoto vynálezu následovně: asi 2,5 ml sterilního růstového media (asi 20 g/1 dextrosy, asi 5 g/1 nutrisojové mouky, asi 5 g/1 kvasnicového extraktu, asi 5 g/1 NaCl a asi 5 g/1 K_HPO ,, s pil nastaveným na asi 7,0 pomocí 11,,30,) bylo přidáno do 15 x 125 mm skleněné zkumavky mající kovový uzávěr, načež následoval přídavek asi 0,1 ml filtračně sterilizovaného roztoku asi 25 g Tween 80, asi 100 g glycerolu a asi 250 ml destilované vody do kultury.

Dále asi 25 mikrolitrů asi 17%ní zmrazené glycerolové zásoby Candida schatavii ATCC č. 24409 bylo inokulováno do kultury. Kultura byla pěstována při asi 29 °C za třepání při asi 210 otáčkách za minutu. Po asi 48 hodinách asi 50 mikrolitrů zásobního roztoku (asi 5 mg/ml v asi 100%ním ethanolu, finální koncentrace asi 100 mikrogramů/ml) racemického tetralonu (sloučenina vzorce I obsahující sloučeniny vzorců IV a V, v asi 5 mg/ml v asi 100%ním ethanolu) bylo přidáno do kultury.

Po dalších 4 dnech byl fermentační bujón kultury (asi

2,5 ml) extrahován stejným objemem ethylacetátu (nezředěného), kultura byla rozvířena a pak odstředěna při asi 2000 otáčkách za minutu (IEC Centrifug“).

« · * * · ♦ ·· ·· » · ♦ » »» · · · ·»·♦ • » * · · · · ······ • · · · ’ * * « · ···· ··· ··· » · ··

- 30 Extrakce byla opakována. Extrakty byly vysušeny po dusíkem ve vodní lázni při asi 50 °C. Extrakty pak byly resuspendovány v asi 1 ml ethanolu a asi 5 mikrol resuspendovaného extraktu bylo analyzována vstřikem na HPLDC sloupec: Chiralcel OD ochranná kolona (4,6 x 50 mm, Diacel Chemical Industries, Ltd.) připojená na Chiralcel OD kolonu (4,6 x 250 mm, Diacel). Obsažené sloučeniny Vinjektovaném resuspcndovaném extraktu byly odděleny isokraticky při asi 0,9 ml za minutu v mobilní fázi (hexan:isopropanol, 95:5) a sloučeniny obsahující extrakt byly dokázány pomocí 996 PDA detektoru (Uaters) seřízeném při 210 nm.

Jak se ukázalo při chirální HPLC (prováděné jako v příkladu I a II), údaje uvedené v tabulce III, každý z uvedených mikroorganizmů v tabulce III stereospecificky redukoval více (4R)-tetralonu než (43)-tetralonu a to vedlo obecně k poměru alespoň dvojnásobnému, pokud jde o (43)-tetralon ponechaný nezreagovaný oproti nezreagovanému (4R)-tetralonu.

- 31 Tabulka III

Kultura , ' ATCC č., typ organizmu	.S-tetralon (jug/ml)	4R-tetra- lon (jag/ml)	4S:4R
Geotrichum candidum-1 34514, houba	18,23	7,85	2,32
Geotrichum candidum-2 52401, houba	12,15	6,17	1,97
Mortierella isabellina-1 42513, houba	3,33	1,35	2,45
Mortierella isabellina-2 33053, houba	2,74	0,95	2,83
Mortierella vinacea 09515, houba	6,01	1,45	4,14
Penicillium notatum 35740, houba	10,33	5,50	1,39
Blastoschizomyces capitatus 23575, houba	3,47	4,5	2,10
ííonosporium olivaceum v.major 35300, houba	10,39	0,71	14,6
Aurcobasidium pullulans 15523, houba	11,76	3,65	3,22
Debaryomyces polymorphus 20280, kvasinka	7,18	3,67	1,96
Saccharomyces cerevisiae 15248, kvasinka	24,33	14,42	1,69
Candida schatavii 24403, kvasinka	7,18	1,03	6,97
Pichia fabianii 16755, kvasinka	17,89	8,97	1,99
Streptomyces rimosus ss. rimosus, 16755, aktinomyceta	3,21	1,68	1,91

• ·

- 32 Je třeba poznamenat, že zatímco intaktní Ilonosporium olivaceum v. major ATCC č. 36300 jak je znázorněno údaji v tabulce III, redukoval podstatně více (4R)-tetralonu oproti (4S)-tetralonu a tak by mohl být preferovaným organizmem pro použití v předmětném postupu, nicméně nežádoucí degradace jako (4R)-tetralonu, tak (4S)-tetralonud byla také zaznamenána pro tuto kulturu. Nežádoucí degradace může být vlivem například jiných enzymů a podobně obsažených v intaktním mikroorganizmu. Tudíž odborníci v oboru ze zde uvedeného popisu vědí, že je výhodné použít enzymu izolovaného z ilonosporium olivaceum v. major ATCC č. 35300 oproti intaktnímu Ilonosporium olivaceum v. major ATCC č. 35300.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob stereoselektivní mikrobiální redukce vzorce I na sloučeniny vzorců II a III sloučeniny vyznačený tím, že se sloučenina vzorce I uvede do styku s mikroorganizmem nebo enzymovým redukčním systémem schopným uskutečnit tuto redukci obsahujícím enzym odvozený od uvedeného mikroorganizmu a kofaktor pro tento enzym a výsledná směs se inkubuje za podmínek dostatečných pro získání většího množství sloučeniny vzorce II než sloučeniny vzorce III, čímž se ponechá větší množství sloučeniny vzorce V nezrea gované než nezreagované sloučeniny vzorce IV, přičemž uvedený mikroorganizmus se vybere ze skupiny zahrnující Hansenula polymorpha ATCC č. 26012, Hansenula polymorpha ATCC č. 74449, Absidia coerulea ATCC č. 20137, Geotrichum candidum ATCC č. 34614, Geotrichum candidum ATCC č. 62401, Mortierella isabellina ATCC č. 42613, Mortierella isabellina ATCC č. 30063, Mortierella vinacea ATCC č. 09515, Penicillium notatum ATCC

č. 35740, Blastoschizomyces capitatus ATCC č. 28575, Monosporium olivaceum v. major ATCC č. 35300, Aureobasidium pullulans ATCC č. 16623, Debaryomyces polymorphus ATCC č. 20280, Saccharomyces cerevisiae ATCC č. 15248, Candida schatavii ATCC č. 24409, Pichia fabianii ATCC č. 15755 a Streptomyces rimosus ss. rimosus ATCC č. 10970, a jejich mutanty schopné provést uvedenou redukci.
2. Způsob podle nároku 1 vyznačený tím, že sloučenina vzorce V se oddělí od sloučenin vzorců II, III a IV.
3. Způsob podle nároku 2 vyznačený tím, Se uvedené oddělení se provede pomocí chromatografie.
4. Způsob podle nároku 2 vyznačený tím, že oddělení se provede pomocí krystalizace.
5. Způsob podle nároku 2 vyznačený tím, že sloučenina vzorce II se oddělí od sloučenin vzorců III a IV.

5. Způsob podle nároku 5 vyznačený tím, že oddělená sloučenina vzorce II se recykluje na sloučeninu vzorce I oxidací této odělené sloučeniny vzorce II a racemizací oxidované sloučeniny na sloučeninu vzorce I.
7. Způsob podle nároku 5 vyznačený tím, že uvedená racemizace zahrnuje reakci oxidované sloučeniny s bází.
8. Způsob podle nároku 1 vyznačený tím, že sloučenina vzorce I se připraví jak je definováno v nároku 5.
9. Způsob podle nároku 1 vyznačený tím, že uvedený styk se provede s uvedeným mikroorganizmem.

···« ·« ·· ···· ·« · · · · · · · • · · · · · · ······ • · · · » · · ·· »··· ··· ·»· ·· »·
10. Způsob podle nároku 1 vyznačený tím, že uvedený styk se provede s enzymovým redukčním systémem.
11. Způsob podle nároku 9 vyznačený tím, že uvedený mikroorganizmus je intaktní mikroorganizmus.
12. Způsob podle nároku 9 vyznačený tím, že uvedeným mikroorganizmem je přípravek z jeho rozrušených buněk.
13. Způsob podle nároku 9 vyznačený tím, že mikroorganizmem je jeho dehydratovaný přípravek.
14. Způsob podle nároku 11 vyznačený tím, že uvedený intaktní mikroorganizmus zahrnuje promyté buňky uvedeného intaktního mikroorganizmu.
15. Způsob podle nároku 14 vyznačený tím, že uvedené promyté buňky jsou imobilizovány.
16. Způsob podle nároku 10 vyznačený tím, že enzym uvedeného enzymového redukčního systému je imobilizován.
17. Způsob podle nároku 13 vyznačený tím, že dehydratovaný přípravek je acetonový práškový enzymatický přípravek.
18. Způsob podle nároku 9 vyznačený tím, že uvedený mikroorganizmus je v kultivačním bujónu.

<
19. Způsob podle nároku 18 vyznačený tím, že uvedený styk se provede přidáním sloučeniny vzorce I do kultivačního bujónu.
20. Způsob podle nároku 10 vyznačený tím, že enzymový redukční systém je v rozpouštědle.
21.

Způsob podle nároku 20 vyznačený tím, že uvedené • · *

- 36 rozpouštědlo jo výhodně organické rozpouštědlo.
22. Způsob podle nároku 10 vyznačený tím, že uvedený styk se provede přidáním sloučeniny vzorce I do tohoto rozpouštědla.
23. Způsob podle nároku 9 vyznačený tím, že mikroorganizmem je Hansenula polymorpha ATCC č. 26012 nebo Hansenula polymorpha ATCC č. 74449 nebo jejich mutanty.
24. Způsob podle nároku 10 vyznačený tím, že enzym zahrnující uvedený enzymový redukční systém je odvozen z Hansenula polymorpha ATCC č. 26012 nebo Hansenula polymorpha ATCC č. 74449, nebo jejich mutantu.
25. Způsob podle nároku 18 vyznačený tím, že mikroorganizmem je Hansenula polymorpha ATCC č. 26012 nebo Hansenula polymorpha ATCC č. 74449 nebo jejich mutanty.

25. Způsob podle nároku 19 vyznačený tím, že mikroorganizmem je Hansenula polymorpha ATCC č. 26012 nebo Hansenula polymorpha ATCC č. 74449, nebo jejich mutanty.
27. Způsob podle nároku 9 vyznačený tím, že mikroorganizmem je Absidia coerulea ATCC č. 20137 nebo jeho mutanty.
28. Způsob podle nároku 10 vyznačený tím, že enzym zahrnující enzymový redukční systém je odvozen z Absidia coerulea ATCC č. 20137 nebo jeho mutantů.
29. Způsob podle nároku 10 vyznačený tím, že enzym zahrnující uvedený enzymový redukční systém je odvozen z Monosporium olivaceum v. major ATCC č. 36300 nebo jeho mutantů.
30. Způsob stereoselektivní mikrobiální redukce sloučeniny vzorce I na sloučeniny vzorců II a III • a vyznačený tím, že zahrnuje styk sloučeniny vzorce I s mikroorganizmem a inkubaci výsledné směsi za podmínek dostatečných k získání více sloučeniny vzorce II než sloučeniny vzorce III, čímž se nechá více sloučeniny vzorce V nezreagované než sloučeniny vzorce IV, přičemž uvedený mikroorganizmus se vybere ze skupiny zahrnující Ilansenula polymorpha ATCC č. 26012, Ilansenula polymorpha ATCC č. 74449 a jejich mutanty schopné provést uvedenou redukci.
31. Způsob podle nároku 30 vyznačený tím, že mikroorganizmus je v kultivačním bujónu.
32. Způsob podle nároku 31 vyznačený tím, že uvedený styk se provede přidáním sloučeniny vzorce I do kultivačního bujónu.
33. Způsob stereoselektivní mikrobiální redukce sloučeniny vzorce I na sloučeniny vzorců II a III » · · · (O (II) (lil) (4R). (4S) <4R) (4S) (4R) (4S)

I uvede do styku s enzyvyznačený tím, že se sloučenina vzorce movým redukčním systémem schopným provést uvedenou redukci, zahrnujícím enzym odvozený z mikroorganizmu a kofaktor pro uvedený enzym a výsledná směs se inkubuje za podmínek dostatečných k dosažení většího výtěžku sloučeniny vzorce II než sloučeniny vzorce III, čímž se zanechá více sloučeniny vzorce V nezreagované než sloučeniny vzorce IV, přičemž uvedený mikroorganizmus se vybere ze skupiny zahrnující Hansenula polymorpha ATCC č. 26012, Hansenula polymorpha ATCC č. 74449 a jejich mutanty schopné provést uvedenou redukci.
34. Způsob podle nároku 33 vyznačený tím, že enzymový redukční systém je v rozpouštědle.
35. Způsob podle nároku 34 vyznačený tím, že styk se provede přidáním sloučeniny vzorce I do tohoto rozpouštědla.

Zastupuje: JUDr. Ing. Milan Hořejš