JP2001054397A - ラセミのテトラロンの微生物を使用する立体選択的還元 - Google Patents
ラセミのテトラロンの微生物を使用する立体選択的還元Info
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 ラセミのテトラロンのキラルなテトラロンへ
の微生物を使用する立体選択的な還元のための新規方法
の提供。 【解決手段】 ラセミのテトラロンの以下の微生物を使
用して立体選択的な還元を実施するための方法であっ
て、 式（Ｉ）で表される化合物を、微生物より得られる酵素
及びその酵素についての補因子を含む主題の還元を達成
することのできる酵素還元システムと接触させ；式（Ｉ
Ｉ）で表される（４Ｒ）テトラロンを生成し、式（Ｖ）
で表される（４Ｓ）テトラロン又は“キラルなテトラロ
ン”を実質的に未反応のまま残すのに十分な条件下で、
生じた混合物をインキュベートすることを含む方法。
の微生物を使用する立体選択的な還元のための新規方法
の提供。 【解決手段】 ラセミのテトラロンの以下の微生物を使
用して立体選択的な還元を実施するための方法であっ
て、 式（Ｉ）で表される化合物を、微生物より得られる酵素
及びその酵素についての補因子を含む主題の還元を達成
することのできる酵素還元システムと接触させ；式（Ｉ
Ｉ）で表される（４Ｒ）テトラロンを生成し、式（Ｖ）
で表される（４Ｓ）テトラロン又は“キラルなテトラロ
ン”を実質的に未反応のまま残すのに十分な条件下で、
生じた混合物をインキュベートすることを含む方法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、４−（３，４−ジクロ
ロフェニル）−３，４−ジヒドロ−１（２Ｈ）−ナフタ
レノンの（４Ｓ）エナンチオマー（以降、“キラルなテ
トラロン”または“（４Ｓ）テトラロン”とも称す。）
を製造するための新規な方法に関し、さらに詳しくは、
ラセミの４−（３，４−ジクロロフェニル）−３，４−
ジヒドロ−１（２Ｈ）−ナフタレノン（以降、“ラセミ
のテトラロン”とも称す。）のキラルなテトラロンへの
微生物を使用する立体選択的な還元に関する。
ロフェニル）−３，４−ジヒドロ−１（２Ｈ）−ナフタ
レノンの（４Ｓ）エナンチオマー（以降、“キラルなテ
トラロン”または“（４Ｓ）テトラロン”とも称す。）
を製造するための新規な方法に関し、さらに詳しくは、
ラセミの４−（３，４−ジクロロフェニル）−３，４−
ジヒドロ−１（２Ｈ）−ナフタレノン（以降、“ラセミ
のテトラロン”とも称す。）のキラルなテトラロンへの
微生物を使用する立体選択的な還元に関する。
【０００２】
【従来の技術】本発明の方法によって製造されるキラル
なテトラロンは、純粋なｃｉｓ−（１Ｓ）（４Ｓ）−Ｎ
−メチル−４−（３，４−ジクロロフェニル）−１，
２，３，４−テトラヒドロ−１−ナフタレンアミン（一
般に、セルトラリンと称される。）を製造するためにさ
らに反応させられる。セルトラリンは、例えば、抗うつ
薬および食欲抑制剤として、また、薬品依存症、不安関
連疾患、早漏、癌および心筋梗塞後（post-mycardial i
nfraction）の処置において有効であることが周知であ
る。
なテトラロンは、純粋なｃｉｓ−（１Ｓ）（４Ｓ）−Ｎ
−メチル−４−（３，４−ジクロロフェニル）−１，
２，３，４−テトラヒドロ−１−ナフタレンアミン（一
般に、セルトラリンと称される。）を製造するためにさ
らに反応させられる。セルトラリンは、例えば、抗うつ
薬および食欲抑制剤として、また、薬品依存症、不安関
連疾患、早漏、癌および心筋梗塞後（post-mycardial i
nfraction）の処置において有効であることが周知であ
る。
【０００３】セルトラリンを製造するための方法は、当
分野で公知であり、例えば、米国特許No. 4,536,518；
4,777,288；4,839,104；4,855,500；4,940,731；4,962,
128；5,082,970；5,130,338；5,196,607；5,248,699；
5,442,116；5,463,126；5,466,880；5,597,826；および
5,750,794に記載されているもの、および、W. M. Welc
h, Jr. et al.のJournal of Medicinal Chemistry, Vo
l. 27, No. 11, p. 1508 (1984)の論文に記載されてい
るものが挙げられる。
分野で公知であり、例えば、米国特許No. 4,536,518；
4,777,288；4,839,104；4,855,500；4,940,731；4,962,
128；5,082,970；5,130,338；5,196,607；5,248,699；
5,442,116；5,463,126；5,466,880；5,597,826；および
5,750,794に記載されているもの、および、W. M. Welc
h, Jr. et al.のJournal of Medicinal Chemistry, Vo
l. 27, No. 11, p. 1508 (1984)の論文に記載されてい
るものが挙げられる。
【０００４】前述の特許のいくつかは、ラセミのＮ−メ
チル−４−（３，４−ジクロロフェニル）−１，２，
３，４−テトラヒドロ−１−ナフタレンアミンのｃｉｓ
−およびｔｒａｎｓ−異性体の混合物の合成に関する。
その中で記載されているように、ｃｉｓ−およびｔｒａ
ｎｓ−異性体ならびにそれらの（Ｓ）および（Ｒ）エナ
ンチオマーは、例えば、分別結晶またはクロマトグラフ
ィーを含む、当業者公知の方法によって分離することが
できる。
チル−４−（３，４−ジクロロフェニル）−１，２，
３，４−テトラヒドロ−１−ナフタレンアミンのｃｉｓ
−およびｔｒａｎｓ−異性体の混合物の合成に関する。
その中で記載されているように、ｃｉｓ−およびｔｒａ
ｎｓ−異性体ならびにそれらの（Ｓ）および（Ｒ）エナ
ンチオマーは、例えば、分別結晶またはクロマトグラフ
ィーを含む、当業者公知の方法によって分離することが
できる。
【０００５】セルトラリンの合成において、それよりも
早く最終的に所望されるキラリテイについて選択するこ
ともまた公知である。例えば、前述の米国特許No. 5,75
0,794は、ラセミのテトラロンを不整ケトン還元剤と反
応させて、使用する不整試薬のキラリテイに応じて、対
応するｃｉｓ−またはｔｒａｎｓ−アルコールを生成さ
せ、ついで、そのアルコールを分離し、（１Ｓ，４Ｓ）
および／または（１Ｒ，４Ｓ）アルコールを（４Ｓ）−
テトラロンへと酸化することによってキラルなテトラロ
ンを製造するための方法を開示している。
早く最終的に所望されるキラリテイについて選択するこ
ともまた公知である。例えば、前述の米国特許No. 5,75
0,794は、ラセミのテトラロンを不整ケトン還元剤と反
応させて、使用する不整試薬のキラリテイに応じて、対
応するｃｉｓ−またはｔｒａｎｓ−アルコールを生成さ
せ、ついで、そのアルコールを分離し、（１Ｓ，４Ｓ）
および／または（１Ｒ，４Ｓ）アルコールを（４Ｓ）−
テトラロンへと酸化することによってキラルなテトラロ
ンを製造するための方法を開示している。
【０００６】真菌類のような微生物、例えば、酵母を使
用して、キラルな化合物を合成することもまた公知であ
る。例えば、ケトン類をキラルなアルコール類へと還元
するための酵母の使用が周知である。しかし、当業者で
あれば理解されるであろうが、このような微生物を使用
する還元の化学的および光学的収率、例えば、特定のエ
ナンチオマーおよびその量は、概して、例えば、選択さ
れる特定の微生物および出発物質の置換基に依存して実
質的に変化する。
用して、キラルな化合物を合成することもまた公知であ
る。例えば、ケトン類をキラルなアルコール類へと還元
するための酵母の使用が周知である。しかし、当業者で
あれば理解されるであろうが、このような微生物を使用
する還元の化学的および光学的収率、例えば、特定のエ
ナンチオマーおよびその量は、概して、例えば、選択さ
れる特定の微生物および出発物質の置換基に依存して実
質的に変化する。
【０００７】米国特許No. 5,049,497は、高エナンチオ
マー純度のケトンおよびアルコールの混合物を与えるた
めに十分な条件下で、ラセミのビシクロ［４．２．０］
オクタンの誘導体をベーカーの酵母(Baker's Yeast)と
接触させることによってそのラセミのビシクロ［４．
２．０］オクタン誘導体を分割するための方法を開示し
ている。その中に記載されているように、主題のラセミ
のケトンの一方のエナンチオマーのみが還元されてアル
コールを与える。
マー純度のケトンおよびアルコールの混合物を与えるた
めに十分な条件下で、ラセミのビシクロ［４．２．０］
オクタンの誘導体をベーカーの酵母(Baker's Yeast)と
接触させることによってそのラセミのビシクロ［４．
２．０］オクタン誘導体を分割するための方法を開示し
ている。その中に記載されているように、主題のラセミ
のケトンの一方のエナンチオマーのみが還元されてアル
コールを与える。
【０００８】米国特許No. 5,580,764は、環状ケトンを
対応するキラルなアルコールへと転化するために、無傷
な微生物またはその破壊した細胞調製物を使用する不整
還元法を開示している。
対応するキラルなアルコールへと転化するために、無傷
な微生物またはその破壊した細胞調製物を使用する不整
還元法を開示している。
【０００９】米国特許No. 5,618,707は、ケトン基質
を、ジゴサッカロマイセス・ベイリー（Zygosaccharomy
ces bailii） ＡＴＣＣ（American Type Culture Coll
edtion） Ｎｏ．３８９２４またはシゾサッカロマイセ
ス・オクトスポラス（Schizosaccharomyces octosporu
s） ＡＴＣＣ Ｎｏ．２４７９の培養液に加え、生じ
た混合物をインキュベートし、血清コレステロール降下
剤の製造の中間体として続いて使用するために、慣用的
な方法、例えば、有機溶剤による抽出、樹脂への吸着ま
たはクロマトグラフィーによりヒドロキシ化合物を単離
することによるケトン基質を立体選択的に還元するため
の方法を開示している。その中に記載されている単離さ
れるヒドロキシ化合物は、キラルな高性能液体クロマト
グラフィー（ＨＰＬＣ）、逆相ＨＰＬＣまたはその双方
によって分析されている。その中に記載されているよう
に、当業者であれば一致して理解されるであろうが、選
択された基質のケトン基を還元するそれらの能力につい
て検討された大多数の微生物の多くは、所望される特異
性または生産性を有しつつ、ケトン基を還元することが
できなかった。
を、ジゴサッカロマイセス・ベイリー（Zygosaccharomy
ces bailii） ＡＴＣＣ（American Type Culture Coll
edtion） Ｎｏ．３８９２４またはシゾサッカロマイセ
ス・オクトスポラス（Schizosaccharomyces octosporu
s） ＡＴＣＣ Ｎｏ．２４７９の培養液に加え、生じ
た混合物をインキュベートし、血清コレステロール降下
剤の製造の中間体として続いて使用するために、慣用的
な方法、例えば、有機溶剤による抽出、樹脂への吸着ま
たはクロマトグラフィーによりヒドロキシ化合物を単離
することによるケトン基質を立体選択的に還元するため
の方法を開示している。その中に記載されている単離さ
れるヒドロキシ化合物は、キラルな高性能液体クロマト
グラフィー（ＨＰＬＣ）、逆相ＨＰＬＣまたはその双方
によって分析されている。その中に記載されているよう
に、当業者であれば一致して理解されるであろうが、選
択された基質のケトン基を還元するそれらの能力につい
て検討された大多数の微生物の多くは、所望される特異
性または生産性を有しつつ、ケトン基を還元することが
できなかった。
【００１０】さて、予想だにしえなかったことに、真菌
類、例えば、酵母および放線菌類を含むある範囲の微生
物がラセミのテトラロンを実質的に立体選択的に還元す
ることが見いだされた。さらに詳しくは、主題の立体選
択的な微生物を使用する還元は、実質的に未反応の（４
Ｓ）テトラロンを残しつつ、ラセミ混合物の（４Ｒ）テ
トラロンを選択的に還元する。さらに、主題の方法によ
って生成する所望されない（４Ｒ）テトラロンは、酸化
し、ついで、ラセミのテトラロンへとラセミ化し、主題
の方法を繰り返して、さらに多量の（４Ｓ）テトラロン
を生成することができる。主題の方法によって製造され
る（４Ｓ）テトラロンは、セルトラリンの合成において
使用することができる。
類、例えば、酵母および放線菌類を含むある範囲の微生
物がラセミのテトラロンを実質的に立体選択的に還元す
ることが見いだされた。さらに詳しくは、主題の立体選
択的な微生物を使用する還元は、実質的に未反応の（４
Ｓ）テトラロンを残しつつ、ラセミ混合物の（４Ｒ）テ
トラロンを選択的に還元する。さらに、主題の方法によ
って生成する所望されない（４Ｒ）テトラロンは、酸化
し、ついで、ラセミのテトラロンへとラセミ化し、主題
の方法を繰り返して、さらに多量の（４Ｓ）テトラロン
を生成することができる。主題の方法によって製造され
る（４Ｓ）テトラロンは、セルトラリンの合成において
使用することができる。
【００１１】本明細書で参考とする文献類は、前述した
ものを含め、全て、それら全体を参考とすることによっ
て本明細書に組み込む。
ものを含め、全て、それら全体を参考とすることによっ
て本明細書に組み込む。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明は、カルボニル基
の微生物学的還元方法であって、ケトン化合物、具体的
には、式（Ｉ）で表されるラセミのテトラロンを、微生
物；または、前記微生物から得られる酵素およびその酵
素についての補因子を含む主題の還元を達成することの
できる酵素還元システムと接触させ；生じた混合物を適
当な条件下でインキュベートし、ヒドロキシ基を有する
化合物、具体的には、式（ＩＩ）で表される（４Ｒ）テ
トラロールを培地中で形成および集積し、所望される立
体化学を有する化合物、具体的には、以下、式（Ｖ）で
表される（４Ｓ）テトラロンを実質的に未反応のまま残
す方法に係る。以下の式（Ｖ）で表される（４Ｓ）テト
ラロン、すなわち、キラルなテトラロンは、ついで、い
ずれかの適当な方法、例えば、クロマトグラフィーまた
は結晶化によって単離することができる。また、式（Ｉ
Ｉ）で表される（４Ｒ）テトラロールは、式（ＩＩＩ）
−式（Ｖ）で表される化合物から分離し、酸化し、ラセ
ミのテトラロンへとラセミ化し、主題の立体選択的な微
生物を使用する還元方法を繰り返し、さらに多量の所望
されるキラルなケトンを生成させることができる。
の微生物学的還元方法であって、ケトン化合物、具体的
には、式（Ｉ）で表されるラセミのテトラロンを、微生
物；または、前記微生物から得られる酵素およびその酵
素についての補因子を含む主題の還元を達成することの
できる酵素還元システムと接触させ；生じた混合物を適
当な条件下でインキュベートし、ヒドロキシ基を有する
化合物、具体的には、式（ＩＩ）で表される（４Ｒ）テ
トラロールを培地中で形成および集積し、所望される立
体化学を有する化合物、具体的には、以下、式（Ｖ）で
表される（４Ｓ）テトラロンを実質的に未反応のまま残
す方法に係る。以下の式（Ｖ）で表される（４Ｓ）テト
ラロン、すなわち、キラルなテトラロンは、ついで、い
ずれかの適当な方法、例えば、クロマトグラフィーまた
は結晶化によって単離することができる。また、式（Ｉ
Ｉ）で表される（４Ｒ）テトラロールは、式（ＩＩＩ）
−式（Ｖ）で表される化合物から分離し、酸化し、ラセ
ミのテトラロンへとラセミ化し、主題の立体選択的な微
生物を使用する還元方法を繰り返し、さらに多量の所望
されるキラルなケトンを生成させることができる。
【００１３】したがって、本発明は、以下の微生物を使
用して立体特異的な還元を実施するための方法であっ
て、
用して立体特異的な還元を実施するための方法であっ
て、
【００１４】
【化２】 式（Ｉ）で表される化合物を、微生物；または、前記微
生物から得られる酵素およびその酵素についての補因子
を含む主題の還元を達成することのできる酵素還元シス
テムと接触させ；式（ＩＩＩ）で表される化合物よりも
多量の式（ＩＩ）で表される化合物を生成させるのに十
分な条件下で、生じた混合物をインキュベートし、かく
して、未反応の式（ＩＶ）で表される化合物よりも多量
の未反応の式（Ｖ）で表される化合物を残すことを含む
方法を提供する。
生物から得られる酵素およびその酵素についての補因子
を含む主題の還元を達成することのできる酵素還元シス
テムと接触させ；式（ＩＩＩ）で表される化合物よりも
多量の式（ＩＩ）で表される化合物を生成させるのに十
分な条件下で、生じた混合物をインキュベートし、かく
して、未反応の式（ＩＶ）で表される化合物よりも多量
の未反応の式（Ｖ）で表される化合物を残すことを含む
方法を提供する。
【００１５】主題の立体特異的な還元は：
【００１６】
【化３】 式（Ｉ）で表される化合物を、微生物；または、前記微
生物から得られる酵素およびその酵素についての補因子
を含む主題の還元を達成することのできる酵素還元シス
テムと接触させ；式（ＩＩ）で表される（４Ｒ）テトラ
ロールを生成し、式（Ｖ）で表される（４Ｓ）テトラロ
ンを実質的に未反応で残すのに十分な条件下で、生じた
混合物をインキュベートすることを含む方法によって表
すこともできる。
生物から得られる酵素およびその酵素についての補因子
を含む主題の還元を達成することのできる酵素還元シス
テムと接触させ；式（ＩＩ）で表される（４Ｒ）テトラ
ロールを生成し、式（Ｖ）で表される（４Ｓ）テトラロ
ンを実質的に未反応で残すのに十分な条件下で、生じた
混合物をインキュベートすることを含む方法によって表
すこともできる。
【００１７】本立体選択的な還元は、さらに、所望によ
り、式（ＩＩ）で表される（４Ｒ）テトラロールからの
式（Ｖ）で表される（４Ｓ）テトラロンの分離を含む。
（４Ｒ）テトラロールは、ついで、（４Ｒ）テトラロン
を生成させるために酸化され、（４Ｒ）テトラロンは、
ついで、例えば、塩基と反応させて、式（Ｉ）で表され
るラセミのテトラロンを生成させ、微生物を使用して本
立体選択的還元を繰り返し、式（Ｖ）で表される所望さ
れる（４Ｓ）テトラロン、すなわち、式（Ｉ）で表され
るラセミのテトラロンの（４Ｓ）エナンチオマーをさら
に多量に生成させることができる。
り、式（ＩＩ）で表される（４Ｒ）テトラロールからの
式（Ｖ）で表される（４Ｓ）テトラロンの分離を含む。
（４Ｒ）テトラロールは、ついで、（４Ｒ）テトラロン
を生成させるために酸化され、（４Ｒ）テトラロンは、
ついで、例えば、塩基と反応させて、式（Ｉ）で表され
るラセミのテトラロンを生成させ、微生物を使用して本
立体選択的還元を繰り返し、式（Ｖ）で表される所望さ
れる（４Ｓ）テトラロン、すなわち、式（Ｉ）で表され
るラセミのテトラロンの（４Ｓ）エナンチオマーをさら
に多量に生成させることができる。
【００１８】本発明は、式（Ｉ）で表される化合物を式
（ＩＩ）で表される化合物へと微生物を使用して立体選
択的に還元することを含む方法であって、式（Ｉ）で表
される化合物を、微生物；または、前記微生物から得ら
れる酵素およびその酵素についての補因子を含む主題の
還元を達成することのできる酵素還元システムと接触さ
せ；式（ＩＩ）で表される化合物を生成するのに十分な
条件下で、生じた混合物をインキュベートし、それによ
って、式（ＩＶ）で表される化合物より実質的に多量の
式（Ｖ）で表される化合物が未反応のまま残り、式（Ｉ
ＩＩ）で表される化合物よりも実質的に多量の式（Ｉ
Ｉ）で表される化合物が生成する方法を提供する。
（ＩＩ）で表される化合物へと微生物を使用して立体選
択的に還元することを含む方法であって、式（Ｉ）で表
される化合物を、微生物；または、前記微生物から得ら
れる酵素およびその酵素についての補因子を含む主題の
還元を達成することのできる酵素還元システムと接触さ
せ；式（ＩＩ）で表される化合物を生成するのに十分な
条件下で、生じた混合物をインキュベートし、それによ
って、式（ＩＶ）で表される化合物より実質的に多量の
式（Ｖ）で表される化合物が未反応のまま残り、式（Ｉ
ＩＩ）で表される化合物よりも実質的に多量の式（Ｉ
Ｉ）で表される化合物が生成する方法を提供する。
【００１９】好ましい実施態様において、式（Ｉ）で表
される化合物の接触は、酵素還元システムと接触され
る。もう１つの好ましい実施態様において、式（Ｉ）で
表される化合物の接触は、酵素が固定化された酵素還元
システムと接触される。特に好ましい実施態様におい
て、式（Ｉ）で表される化合物の接触は、ハンセヌラ・
ポリモルファ（Hansenula polymorpha） ＡＴＣＣ Ｎ
ｏ．２６０１２から得られる酵素還元システムと接触さ
れる。
される化合物の接触は、酵素還元システムと接触され
る。もう１つの好ましい実施態様において、式（Ｉ）で
表される化合物の接触は、酵素が固定化された酵素還元
システムと接触される。特に好ましい実施態様におい
て、式（Ｉ）で表される化合物の接触は、ハンセヌラ・
ポリモルファ（Hansenula polymorpha） ＡＴＣＣ Ｎ
ｏ．２６０１２から得られる酵素還元システムと接触さ
れる。
【００２０】もう１つの好ましい実施態様において、微
生物は、その破壊された細胞調製物である。なおもう１
つの好ましい実施態様において、微生物は、そのアセト
ン粉末化酵素調製物である。
生物は、その破壊された細胞調製物である。なおもう１
つの好ましい実施態様において、微生物は、そのアセト
ン粉末化酵素調製物である。
【００２１】本発明のとりわけ好ましい実施態様におい
て、無傷な微生物が使用される。微生物が無傷な微生物
である好ましい実施態様において、式（Ｉ）で表される
化合物は、微生物を含む発酵培地、培養液または溶剤と
接触される。微生物が無傷な微生物であるもう１つの好
ましい実施態様において、式（Ｉ）で表される化合物
は、洗浄した無傷な微生物と接触させられる。微生物が
無傷であるなおもう１つの好ましい実施態様において、
式（Ｉ）で表される化合物は、固定化された無傷な微生
物と接触させられる。
て、無傷な微生物が使用される。微生物が無傷な微生物
である好ましい実施態様において、式（Ｉ）で表される
化合物は、微生物を含む発酵培地、培養液または溶剤と
接触される。微生物が無傷な微生物であるもう１つの好
ましい実施態様において、式（Ｉ）で表される化合物
は、洗浄した無傷な微生物と接触させられる。微生物が
無傷であるなおもう１つの好ましい実施態様において、
式（Ｉ）で表される化合物は、固定化された無傷な微生
物と接触させられる。
【００２２】本発明のとりわけ好ましい実施態様におい
て、微生物は、発酵培地内で生育される無傷な微生物で
あり、その接触は、式（Ｉ）で表される化合物をそれに
添加することによって生ずる。
て、微生物は、発酵培地内で生育される無傷な微生物で
あり、その接触は、式（Ｉ）で表される化合物をそれに
添加することによって生ずる。
【００２３】本発明のもう１つのとりわけ好ましい実施
態様において、微生物は、生育培地内で約４８時間生育
された無傷な微生物であり、その接触は、式（Ｉ）で表
される化合物のそれへの添加によるようにして生じさ
せ、そのインキュベーションは、約５日間である。
態様において、微生物は、生育培地内で約４８時間生育
された無傷な微生物であり、その接触は、式（Ｉ）で表
される化合物のそれへの添加によるようにして生じさ
せ、そのインキュベーションは、約５日間である。
【００２４】本発明のもう１つの好ましい実施態様にお
いて、微生物は、立体選択的な還元を行うことのできる
真菌、例えば、酵母、または、放線菌、あるいは、それ
らの変異体である。
いて、微生物は、立体選択的な還元を行うことのできる
真菌、例えば、酵母、または、放線菌、あるいは、それ
らの変異体である。
【００２５】本発明のなおもう１つの好ましい実施態様
において、微生物は、真菌である。微生物が真菌である
なおもう１つの好ましい実施態様において、その真菌
は、アビシディア・コエルレア（Absidia coerulea）
ＡＴＣＣ Ｎｏ．２０１３７である。
において、微生物は、真菌である。微生物が真菌である
なおもう１つの好ましい実施態様において、その真菌
は、アビシディア・コエルレア（Absidia coerulea）
ＡＴＣＣ Ｎｏ．２０１３７である。
【００２６】本発明の特に好ましい実施態様において、
微生物は、酵母である。微生物が酵母である本発明のと
りわけ好ましい実施態様において、酵母は、ハンセヌラ
・ポリモルファ（Hansenula polymorpha） ＡＴＣＣ
Ｎｏ．２６０１２であり、また、ＡＴＣＣ Ｎｏ．７４
４４９として寄託されたものである。
微生物は、酵母である。微生物が酵母である本発明のと
りわけ好ましい実施態様において、酵母は、ハンセヌラ
・ポリモルファ（Hansenula polymorpha） ＡＴＣＣ
Ｎｏ．２６０１２であり、また、ＡＴＣＣ Ｎｏ．７４
４４９として寄託されたものである。
【００２７】ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula po
lymorpha） ＡＴＣＣ Ｎｏ．２６０１２、また、ＡＴ
ＣＣ Ｎｏ．７４４４９として寄託されたものが、微生
物として使用される場合、主題の微生物を使用する立体
選択的な還元は、式（Ｉ）で表される化合物の一方のみ
のエナンチオマーをかなりの程度還元して、対応するア
ルコール、すなわち、式（ＩＩ）で表される化合物を与
え、他方、式（Ｉ）で表される化合物の他方のエナンチ
オマー、すなわち、式（Ｖ）で表される化合物を実質的
に未反応のまま残す。
lymorpha） ＡＴＣＣ Ｎｏ．２６０１２、また、ＡＴ
ＣＣ Ｎｏ．７４４４９として寄託されたものが、微生
物として使用される場合、主題の微生物を使用する立体
選択的な還元は、式（Ｉ）で表される化合物の一方のみ
のエナンチオマーをかなりの程度還元して、対応するア
ルコール、すなわち、式（ＩＩ）で表される化合物を与
え、他方、式（Ｉ）で表される化合物の他方のエナンチ
オマー、すなわち、式（Ｖ）で表される化合物を実質的
に未反応のまま残す。
【００２８】先に考察したように、本発明の方法は、さ
らに、所望により、例えば、結晶化またはクロマトグラ
フィーを使用して実施される、式（ＩＩ）−式（ＩＶ）
で表される化合物から式（Ｖ）で表される化合物の分
離；および、いずれか公知の方法を使用するセルトラリ
ンの合成における式（Ｖ）で表されるこのように分離さ
れた化合物の使用を含む。
らに、所望により、例えば、結晶化またはクロマトグラ
フィーを使用して実施される、式（ＩＩ）−式（ＩＶ）
で表される化合物から式（Ｖ）で表される化合物の分
離；および、いずれか公知の方法を使用するセルトラリ
ンの合成における式（Ｖ）で表されるこのように分離さ
れた化合物の使用を含む。
【００２９】また先に考察したように、式（ＩＩ）で表
される単離される（４Ｒ）テトラロールを式（ＩＶ）で
表される（４Ｒ）テトラロンへと酸化することが好まし
い。その時、好ましくは、（４Ｒ）テトラロンを塩基と
反応させ、式（ＩＶ）で表される（４Ｒ）テトラロンを
式（Ｉ）で表されるラセミのテトラロンへと転化するこ
とによってラセミ化することがさらに好ましい。酸化お
よびラセミ化は、本発明の方法に従い微生物を使用する
立体選択的な還元のもう１つの循環のために所望されな
い（４Ｒ）テトラロールをリサイクルする。所望されな
い（４Ｒ）テトラロールのリサイクリングは、所望され
る（４Ｓ）テトラロンの量を増大し、廃棄される所望さ
れない（４Ｒ）テトラロールの量を減少させる。酸化お
よび酸化された生成物のラセミ化は、そのためのいずれ
か適した公知の方法を使用して実施することができる。
される単離される（４Ｒ）テトラロールを式（ＩＶ）で
表される（４Ｒ）テトラロンへと酸化することが好まし
い。その時、好ましくは、（４Ｒ）テトラロンを塩基と
反応させ、式（ＩＶ）で表される（４Ｒ）テトラロンを
式（Ｉ）で表されるラセミのテトラロンへと転化するこ
とによってラセミ化することがさらに好ましい。酸化お
よびラセミ化は、本発明の方法に従い微生物を使用する
立体選択的な還元のもう１つの循環のために所望されな
い（４Ｒ）テトラロールをリサイクルする。所望されな
い（４Ｒ）テトラロールのリサイクリングは、所望され
る（４Ｓ）テトラロンの量を増大し、廃棄される所望さ
れない（４Ｒ）テトラロールの量を減少させる。酸化お
よび酸化された生成物のラセミ化は、そのためのいずれ
か適した公知の方法を使用して実施することができる。
【００３０】
【発明の実施の形態】当業者であれば、本発明を説明す
るための本明細書の用語を十分に理解されるであろう
が；にもかかわらず、本明細書で使用する以下の用語を
このすぐ後に説明する。
るための本明細書の用語を十分に理解されるであろう
が；にもかかわらず、本明細書で使用する以下の用語を
このすぐ後に説明する。
【００３１】“補因子（Co-factor)”とは、酵素還元シ
ステム、例えば、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ＦＡＤＨ、Ｆ
ＭＮＨおよび／またはＰＱＱを含むいずれかの適当な補
因子、または、微生物において、酵素とともに生ずるい
ずれかの適当な補因子を意味する。
ステム、例えば、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ＦＡＤＨ、Ｆ
ＭＮＨおよび／またはＰＱＱを含むいずれかの適当な補
因子、または、微生物において、酵素とともに生ずるい
ずれかの適当な補因子を意味する。
【００３２】“酵素還元システム（Enzyme reduction s
ystem）”とは、適当な微生物オキシドレダクターゼ酵
素およびオキシドレダクターゼ酵素についての補因子の
還元された形を意味し、補因子が選択される微生物から
得られるか、または、いずれかの適当な源から得られ
る。酵素還元システムを含む酵素は、遊離；または、例
えば、カラム内またはビーズに付着させて固定化された
形である。
ystem）”とは、適当な微生物オキシドレダクターゼ酵
素およびオキシドレダクターゼ酵素についての補因子の
還元された形を意味し、補因子が選択される微生物から
得られるか、または、いずれかの適当な源から得られ
る。酵素還元システムを含む酵素は、遊離；または、例
えば、カラム内またはビーズに付着させて固定化された
形である。
【００３３】“微生物を使用する還元（Microbial redu
ction）”とは、酵素還元システムによって達成される
本発明の立体選択的な還元を意味し、微生物レダクター
ゼは、酵素還元システム、無傷な微生物またはそのいず
れかの調製物等を含む。
ction）”とは、酵素還元システムによって達成される
本発明の立体選択的な還元を意味し、微生物レダクター
ゼは、酵素還元システム、無傷な微生物またはそのいず
れかの調製物等を含む。
【００３４】“微生物（Microorganism）”としては、
無傷な微生物；または、それからの調製物が挙げられ；
例えば、微生物の破壊された細胞調製物；微生物の脱水
された調製物、例えば、アセトン粉末化酵素調製物；例
えば、発酵培地、培養液等から取り出した洗浄した微生
物；例えば、カラム内、ビーズ等に付着させた固定化さ
れた微生物が含まれる。
無傷な微生物；または、それからの調製物が挙げられ；
例えば、微生物の破壊された細胞調製物；微生物の脱水
された調製物、例えば、アセトン粉末化酵素調製物；例
えば、発酵培地、培養液等から取り出した洗浄した微生
物；例えば、カラム内、ビーズ等に付着させた固定化さ
れた微生物が含まれる。
【００３５】本発明によって提供される方法は、式
（Ｉ）で表される化合物の式（ＩＩ）で表される化合物
への微生物を使用する立体選択的な還元であって、
（Ｉ）で表される化合物の式（ＩＩ）で表される化合物
への微生物を使用する立体選択的な還元であって、
【００３６】
【化４】 式（Ｉ）で表される化合物を、微生物；または、前記微
生物から得られる酵素およびその酵素についての補因子
を含む主題の還元を達成することのできる酵素還元シス
テムと接触させ；式（ＩＩ）で表される化合物を生成す
るのに十分な条件下で、生じた混合物をインキュベート
し、それにより式（ＩＶ）で表される化合物よりも実質
的に多量の式（Ｖ）で表される化合物を未反応のまま残
し、式（ＩＩＩ）で表される化合物よりも実質的に多量
の式（ＩＩ）で表される化合物を生成することを含む還
元を含む。
生物から得られる酵素およびその酵素についての補因子
を含む主題の還元を達成することのできる酵素還元シス
テムと接触させ；式（ＩＩ）で表される化合物を生成す
るのに十分な条件下で、生じた混合物をインキュベート
し、それにより式（ＩＶ）で表される化合物よりも実質
的に多量の式（Ｖ）で表される化合物を未反応のまま残
し、式（ＩＩＩ）で表される化合物よりも実質的に多量
の式（ＩＩ）で表される化合物を生成することを含む還
元を含む。
【００３７】当業者であれば理解されるであろうが、式
（Ｉ）で表される化合物、ラセミのテトラロンは、以下
に示すように、（４Ｓ）テトラロンおよび（４Ｒ）テト
ラロンの混合物である：
（Ｉ）で表される化合物、ラセミのテトラロンは、以下
に示すように、（４Ｓ）テトラロンおよび（４Ｒ）テト
ラロンの混合物である：
【００３８】
【化５】 化合物、さらに詳しくは、式（ＩＩ）で表されるテトラ
ロールは：
ロールは：
【００３９】
【化６】 である。
【００４０】化合物、さらに詳しくは、式（ＩＩＩ）で
表されるテトラロールは：
表されるテトラロールは：
【００４１】
【化７】 である。
【００４２】式（ＩＩ）および式（ＩＩＩ）で表される
化合物は、前述の米国特許No. 5,750,794に開示され、
特許請求されている。式（Ｖ）で表される所望される化
合物は、以下に記載するようにして、式（ＩＩ）で表さ
れる所望されない化合物；および、それぞれ、例えば、
選択される微生物およびインキュベーションの条件に依
存して、生成されるかまたは未反応のまま残りうる式
（ＩＩＩ）または式（ＩＶ）で表されるいずれかの化合
物から単離することができる。
化合物は、前述の米国特許No. 5,750,794に開示され、
特許請求されている。式（Ｖ）で表される所望される化
合物は、以下に記載するようにして、式（ＩＩ）で表さ
れる所望されない化合物；および、それぞれ、例えば、
選択される微生物およびインキュベーションの条件に依
存して、生成されるかまたは未反応のまま残りうる式
（ＩＩＩ）または式（ＩＶ）で表されるいずれかの化合
物から単離することができる。
【００４３】式（ＩＩ）で表される化合物は、例えば、
酸化およびラセミ化により、式（Ｉ）で表される化合物
へと転化することができ、主題の微生物を使用する立体
選択的な還元を通して、式（Ｖ）で表される（４Ｓ）テ
トラロンのなおさらなる量を生成する。
酸化およびラセミ化により、式（Ｉ）で表される化合物
へと転化することができ、主題の微生物を使用する立体
選択的な還元を通して、式（Ｖ）で表される（４Ｓ）テ
トラロンのなおさらなる量を生成する。
【００４４】本発明の方法は容易に実施される。かくし
て、微生物は、ラセミのテトラロンの存在で、式（Ｉ）
によって表されるように、発酵する（無傷な微生物）
か、または、インキュベート（破壊された細胞調製物、
脱水された調製物または微生物のいずれか適当なその他
の調製物）して、式（ＩＩ）によって表されるように、
ラセミのテトラロンを幾分変化させ、さらに詳しくは、
ラセミのケトンの所望されない（４Ｒ）エナンチオマー
をその対応するアルコールに還元し、他方、式（Ｖ）に
よって表されるように、所望される（４Ｓ）エナンチオ
マーを実質的に未反応のまま残し、それにより、１工程
で、光学的に濃縮された（４Ｓ）エナンチオマーを生成
する。（４Ｓ）エナンチオマーは、ついで、例えば、前
述の米国特許Nos. 4,536,518；4,777,288；4,839,104；
4,855,500；4,940,731；4,962,126；5,082,970；5,130,
338；5,196,607；5,248,699；5,442,116；5,463,128；
5,466,880；5,597,826および5,750,794、および、W. M.
Welch, Jr. et al.の最終的にセルトラリンを生成する
ための前述の論文に記載されたようにして、当業者公知
の方法によってさらに反応させることができる。
て、微生物は、ラセミのテトラロンの存在で、式（Ｉ）
によって表されるように、発酵する（無傷な微生物）
か、または、インキュベート（破壊された細胞調製物、
脱水された調製物または微生物のいずれか適当なその他
の調製物）して、式（ＩＩ）によって表されるように、
ラセミのテトラロンを幾分変化させ、さらに詳しくは、
ラセミのケトンの所望されない（４Ｒ）エナンチオマー
をその対応するアルコールに還元し、他方、式（Ｖ）に
よって表されるように、所望される（４Ｓ）エナンチオ
マーを実質的に未反応のまま残し、それにより、１工程
で、光学的に濃縮された（４Ｓ）エナンチオマーを生成
する。（４Ｓ）エナンチオマーは、ついで、例えば、前
述の米国特許Nos. 4,536,518；4,777,288；4,839,104；
4,855,500；4,940,731；4,962,126；5,082,970；5,130,
338；5,196,607；5,248,699；5,442,116；5,463,128；
5,466,880；5,597,826および5,750,794、および、W. M.
Welch, Jr. et al.の最終的にセルトラリンを生成する
ための前述の論文に記載されたようにして、当業者公知
の方法によってさらに反応させることができる。
【００４５】セルトラリンに関する活性、活性を試験す
るための方法、投薬、剤形、投与方法および背景情報
は、例えば、前述の米国特許Nos. 4,536,518；4,777,28
8および4,839,104、および、W. M. Welch, Jr. et al.
による前述の論文に記載されている。
るための方法、投薬、剤形、投与方法および背景情報
は、例えば、前述の米国特許Nos. 4,536,518；4,777,28
8および4,839,104、および、W. M. Welch, Jr. et al.
による前述の論文に記載されている。
【００４６】本発明の方法においては、いずれかの適し
た微生物を使用することができる。先に記載したよう
に、主題の方法において使用される微生物は、無傷な微
生物、微生物のいずれか適当な調製物、例えば、微生物
の破壊された細胞調製物、微生物の脱水された調製物で
あってもよく、遊離であってもまたは固定化されていて
もいずれであってももよい。しかし、不完全な微生物、
例えば、破壊された細胞調製物、例えば、細胞抽出物、
アセトン粉末化された酵素調製物またはそれより得られ
る酵素が本発明で使用される場合には、当業者であれ
ば、酵素についての適当な補因子もまた含まれることが
理解されるであろう。
た微生物を使用することができる。先に記載したよう
に、主題の方法において使用される微生物は、無傷な微
生物、微生物のいずれか適当な調製物、例えば、微生物
の破壊された細胞調製物、微生物の脱水された調製物で
あってもよく、遊離であってもまたは固定化されていて
もいずれであってももよい。しかし、不完全な微生物、
例えば、破壊された細胞調製物、例えば、細胞抽出物、
アセトン粉末化された酵素調製物またはそれより得られ
る酵素が本発明で使用される場合には、当業者であれ
ば、酵素についての適当な補因子もまた含まれることが
理解されるであろう。
【００４７】当業者であれば、本明細書で提供される記
載；および、それらの関連知識、例えば、R. N. Patel
et al.によってApplied and Environmental Microbiolo
gy,38(2); 219-223 (1979)で公開された“Oxidation of
Secondary Alcohols to Methyl Ketones by Yeasts”
と題する論文に記載された知識より、適当に破壊された
細胞調製物を製造する方法を理解することができるであ
ろう。
載；および、それらの関連知識、例えば、R. N. Patel
et al.によってApplied and Environmental Microbiolo
gy,38(2); 219-223 (1979)で公開された“Oxidation of
Secondary Alcohols to Methyl Ketones by Yeasts”
と題する論文に記載された知識より、適当に破壊された
細胞調製物を製造する方法を理解することができるであ
ろう。
【００４８】当業者であれば、本明細書で提供される記
載；および、それらの関連知識、例えば、K. Nakamura
et al.によってTetrahedron Letters, 37(10); 1629-16
32 (1996)で公開された“Asymmetric Reduction of Ket
ones by the Acetone Powderof Geotrichum candidum”
と題する論文に記載された知識より、適当なアセトン粉
末化酵素調製物を調製する方法を理解することができる
であろう。
載；および、それらの関連知識、例えば、K. Nakamura
et al.によってTetrahedron Letters, 37(10); 1629-16
32 (1996)で公開された“Asymmetric Reduction of Ket
ones by the Acetone Powderof Geotrichum candidum”
と題する論文に記載された知識より、適当なアセトン粉
末化酵素調製物を調製する方法を理解することができる
であろう。
【００４９】また、いずれかの適当な微生物の酵素（例
えば、オキドレダクターゼ）も、また、主題の方法に使
用することができ、この酵素は、当業者公知のいずれか
の適当な方法によって、微生物から単離することがで
き、無傷な微生物については、主題の方法において、遊
離または固定化された形で使用することができる。当業
者であれば、本明細書で提供される記載；および、Bios
ci. Biotechnol. Biochem, 62(2): 280-285 (1998)で公
開されたM. Wada et al.による“Purification and Cha
racterization of NADPH-Dependent Carbonyl Reductas
e, involved in Stereoselective Reduction of Ethyl
4-Chloro-3-oxobutanoate, from Candidamagnoliae”；
Eur. J. Biochem., 234: 452-458 (1995)で公開された
P. Trost et al.による“Purification and Properties
of NAP(P)H:(quinone-acceptor) oxidoreductase of s
ugarbeet cells”；Biochemical and Biophysical Rese
archCommunications, 211(2): 540-546 (1995)で公開さ
れたK. M. Madyastha and T. L. Gururajaによる“Puri
fication and Some of the Properties of a NovelSeco
ndary Alcohol Dehydrogenase from Alcaligenes eutro
phus”；Tetrahedron: Asymmetry, 9: 647-651 (1998)
で公開されたO. Bortolini et al., “Kinetic resolut
ion of vic-diols by Bacillus stearothermophilus di
acetyl reductase”；Enzyme Microb. Technol., 3: 90
6-912 (1991)で公開されたR. N. Patelet al.による“S
tereospecific microbial reduction of 4,5-dihydro-4
-(4-methoxyphenyl)-6-(trifluoromethyl-1H-1)-benzaz
epin-2-one”および、Enzyme Microb. Technol, 14: 77
8-784 (1992)で公開されたR. N. Patel et al.による
“Stereoselective microbial/enzymatic oxidation of
(exo, exo)-7-oxabicyclo[2.2.1]heptane-2,3-dimetha
nol to the corresponding chiral lactol and lacton
e”；ならびに、米国特許Nos.5,523,223および前記5,58
0,764によって概説された知識から、適した微生物の酵
素を単離および精製する方法を理解することができるで
あろう。
えば、オキドレダクターゼ）も、また、主題の方法に使
用することができ、この酵素は、当業者公知のいずれか
の適当な方法によって、微生物から単離することがで
き、無傷な微生物については、主題の方法において、遊
離または固定化された形で使用することができる。当業
者であれば、本明細書で提供される記載；および、Bios
ci. Biotechnol. Biochem, 62(2): 280-285 (1998)で公
開されたM. Wada et al.による“Purification and Cha
racterization of NADPH-Dependent Carbonyl Reductas
e, involved in Stereoselective Reduction of Ethyl
4-Chloro-3-oxobutanoate, from Candidamagnoliae”；
Eur. J. Biochem., 234: 452-458 (1995)で公開された
P. Trost et al.による“Purification and Properties
of NAP(P)H:(quinone-acceptor) oxidoreductase of s
ugarbeet cells”；Biochemical and Biophysical Rese
archCommunications, 211(2): 540-546 (1995)で公開さ
れたK. M. Madyastha and T. L. Gururajaによる“Puri
fication and Some of the Properties of a NovelSeco
ndary Alcohol Dehydrogenase from Alcaligenes eutro
phus”；Tetrahedron: Asymmetry, 9: 647-651 (1998)
で公開されたO. Bortolini et al., “Kinetic resolut
ion of vic-diols by Bacillus stearothermophilus di
acetyl reductase”；Enzyme Microb. Technol., 3: 90
6-912 (1991)で公開されたR. N. Patelet al.による“S
tereospecific microbial reduction of 4,5-dihydro-4
-(4-methoxyphenyl)-6-(trifluoromethyl-1H-1)-benzaz
epin-2-one”および、Enzyme Microb. Technol, 14: 77
8-784 (1992)で公開されたR. N. Patel et al.による
“Stereoselective microbial/enzymatic oxidation of
(exo, exo)-7-oxabicyclo[2.2.1]heptane-2,3-dimetha
nol to the corresponding chiral lactol and lacton
e”；ならびに、米国特許Nos.5,523,223および前記5,58
0,764によって概説された知識から、適した微生物の酵
素を単離および精製する方法を理解することができるで
あろう。
【００５０】適当な微生物としては、ハンセヌラ・ポリ
モルファ（Hansenula polymorpha)ＡＴＣＣ Ｎｏ．２
６０１２、ハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula polym
orpha) ＡＴＣＣ Ｎｏ．７４４４９、アビシディア・
コエルレア(Absidia coerulea) ＡＴＣＣ Ｎｏ．２０
１３７、ゲオトリキューム・カンディダム(Geotrichum
candidum) ＡＴＣＣ Ｎｏ．３４６１４、ゲオトリキ
ューム カンディダム(Geotrichum candidum) ＡＴＣ
Ｃ Ｎｏ．６２４０１、モルティエレラ・イサベリナ(M
ortierella isabellina) ＡＴＣＣ Ｎｏ．４２６１
３、モルティエレラ・イサベリナ(Mortierella isabell
ina) ＡＴＣＣ Ｎｏ．３８０６３、モルティエレラ・
ビナセア(Mortierella vinacea) ＡＴＣＣ Ｎｏ．０
９５１５、ペニシリウム・ノタツム(Penicillium notat
um) ＡＴＣＣ Ｎｏ．３６７４０、ブラストシゾマイ
セス・カピタツス(Blastoschizomyces capitatus) Ａ
ＴＣＣ Ｎｏ．２８５７５、モノスポリウム・オリバセ
ウム・ブイ・メージャー(Monosporium olivaceum v. ma
jor) ＡＴＣＣ Ｎｏ．３６３００、オウレオバシディ
ウム・プルランス(Aureobasidium pullulans) ＡＴＣ
Ｃ Ｎｏ．１６６２３、デバリョマイセス・ポリモルフ
ァス(Debaryomyces polymorphus) ＡＴＣＣＮｏ．２０
２８０、サッカロマイセス・セレビシアエ(Saccharomyc
es cerevisiae) ＡＴＣＣ Ｎｏ．１５２４８、カンデ
ィーダ・シャタビー(Candida schtavii) ＡＴＣＣ Ｎ
ｏ．２４４０９、ピッツィア・ファビアニ(Pichia fabi
anii)ＡＴＣＣ Ｎｏ．１６７５５およびストレプトマ
イセス・リモスス・エスエス・リモスス(Streptomyces
rimosus ss. rimosus) ＡＴＣＣ Ｎｏ．１０９７０；
ならびに、当業者公知であるか；または、このような変
異体であるにもかかわらず、本明細書で開示する微生物
を使用して立体選択的な還元を達成しうる当業者であれ
ば得ることの可能なそれらの変異体が挙げられる。
モルファ（Hansenula polymorpha)ＡＴＣＣ Ｎｏ．２
６０１２、ハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula polym
orpha) ＡＴＣＣ Ｎｏ．７４４４９、アビシディア・
コエルレア(Absidia coerulea) ＡＴＣＣ Ｎｏ．２０
１３７、ゲオトリキューム・カンディダム(Geotrichum
candidum) ＡＴＣＣ Ｎｏ．３４６１４、ゲオトリキ
ューム カンディダム(Geotrichum candidum) ＡＴＣ
Ｃ Ｎｏ．６２４０１、モルティエレラ・イサベリナ(M
ortierella isabellina) ＡＴＣＣ Ｎｏ．４２６１
３、モルティエレラ・イサベリナ(Mortierella isabell
ina) ＡＴＣＣ Ｎｏ．３８０６３、モルティエレラ・
ビナセア(Mortierella vinacea) ＡＴＣＣ Ｎｏ．０
９５１５、ペニシリウム・ノタツム(Penicillium notat
um) ＡＴＣＣ Ｎｏ．３６７４０、ブラストシゾマイ
セス・カピタツス(Blastoschizomyces capitatus) Ａ
ＴＣＣ Ｎｏ．２８５７５、モノスポリウム・オリバセ
ウム・ブイ・メージャー(Monosporium olivaceum v. ma
jor) ＡＴＣＣ Ｎｏ．３６３００、オウレオバシディ
ウム・プルランス(Aureobasidium pullulans) ＡＴＣ
Ｃ Ｎｏ．１６６２３、デバリョマイセス・ポリモルフ
ァス(Debaryomyces polymorphus) ＡＴＣＣＮｏ．２０
２８０、サッカロマイセス・セレビシアエ(Saccharomyc
es cerevisiae) ＡＴＣＣ Ｎｏ．１５２４８、カンデ
ィーダ・シャタビー(Candida schtavii) ＡＴＣＣ Ｎ
ｏ．２４４０９、ピッツィア・ファビアニ(Pichia fabi
anii)ＡＴＣＣ Ｎｏ．１６７５５およびストレプトマ
イセス・リモスス・エスエス・リモスス(Streptomyces
rimosus ss. rimosus) ＡＴＣＣ Ｎｏ．１０９７０；
ならびに、当業者公知であるか；または、このような変
異体であるにもかかわらず、本明細書で開示する微生物
を使用して立体選択的な還元を達成しうる当業者であれ
ば得ることの可能なそれらの変異体が挙げられる。
【００５１】好ましい無傷な微生物は、（４Ｒ）テトラ
ロンを実質的に還元し、他方、（４Ｓ）テトラロンを実
質的に未反応のまま残すものであり、（４Ｓ）テトラロ
ンが反応する場合には、主題の方法のいずれかの段階
で、所望される（４Ｓ）テトラロンを分解するかまたは
所望される（４Ｓ）テトラロンにマイナスの影響を及ぼ
しうる還元またはいずれかのその他の固有の活性が含ま
れる。本明細書の開示より当業者であれば理解できるで
あろうが、このような（４Ｓ）テトラロンの望ましくな
い反応は、例えば、無傷な微生物に対し、選択された微
生物から得られる酵素を使用することによって実質的に
防止することができる。
ロンを実質的に還元し、他方、（４Ｓ）テトラロンを実
質的に未反応のまま残すものであり、（４Ｓ）テトラロ
ンが反応する場合には、主題の方法のいずれかの段階
で、所望される（４Ｓ）テトラロンを分解するかまたは
所望される（４Ｓ）テトラロンにマイナスの影響を及ぼ
しうる還元またはいずれかのその他の固有の活性が含ま
れる。本明細書の開示より当業者であれば理解できるで
あろうが、このような（４Ｓ）テトラロンの望ましくな
い反応は、例えば、無傷な微生物に対し、選択された微
生物から得られる酵素を使用することによって実質的に
防止することができる。
【００５２】主題の微生物を使用する立体特異的な還元
に使用するのに適した微生物は、当業者公知のいずれか
の適当な方法によって調製することができる。市販の株
から微生物を調製するのに適した方法の例を以下に示
す。以下に示す方法は、本発明の方法に使用するのに適
したいずれの微生物についても使用することができ、当
業者であれば、本明細書で提供する記載から、いずれか
の特定の方法において所望される結果を達成するため
に、処理法のいずれかの部分を改良する方法、例えば、
無傷な微生物または微生物調製物、例えば、遊離もしく
は固定化された破壊された細胞もしくはその脱水された
細胞を調製する方法；このような微生物から得られる適
当な酵素を調製する方法；ラセミのテトラロンを微生物
またはそれより得られる酵素還元システムを含む酵素と
接触させる方法；生育培地の構成成分および条件、例え
ば、温度、ｐＨ等；または、インキュベーション条件を
改良する方法等を理解することができるであろう。
に使用するのに適した微生物は、当業者公知のいずれか
の適当な方法によって調製することができる。市販の株
から微生物を調製するのに適した方法の例を以下に示
す。以下に示す方法は、本発明の方法に使用するのに適
したいずれの微生物についても使用することができ、当
業者であれば、本明細書で提供する記載から、いずれか
の特定の方法において所望される結果を達成するため
に、処理法のいずれかの部分を改良する方法、例えば、
無傷な微生物または微生物調製物、例えば、遊離もしく
は固定化された破壊された細胞もしくはその脱水された
細胞を調製する方法；このような微生物から得られる適
当な酵素を調製する方法；ラセミのテトラロンを微生物
またはそれより得られる酵素還元システムを含む酵素と
接触させる方法；生育培地の構成成分および条件、例え
ば、温度、ｐＨ等；または、インキュベーション条件を
改良する方法等を理解することができるであろう。
【００５３】当業者であれば、本明細書で提供する記
載；および、それらの関連する知識、例えば、Biotechn
ology Letters, 18(3); 343-348 (March 1996)で公開さ
れたA.Bauer et al.による“Polyvinyl Alcohol-immobi
lized whole-cell preparations for biotransformatio
n of nitriles”と題する論文に記載されたような知識
から、適当に固定化された無傷な微生物を調製する方法
を理解することができるであろう。
載；および、それらの関連する知識、例えば、Biotechn
ology Letters, 18(3); 343-348 (March 1996)で公開さ
れたA.Bauer et al.による“Polyvinyl Alcohol-immobi
lized whole-cell preparations for biotransformatio
n of nitriles”と題する論文に記載されたような知識
から、適当に固定化された無傷な微生物を調製する方法
を理解することができるであろう。
【００５４】式（Ｉ）で表される化合物を微生物または
酵素還元システムと接触させるいずれの適した方法もま
た本発明において使用することができる。式（Ｉ）で表
される化合物は、いずれかの適した順序で、微生物また
は酵素還元システムと接触させることができる。例え
ば、式（Ｉ）で表される化合物を遊離もしくは固定化さ
せるかあるいはその幾つかの組み合わせの微生物を含む
培地、例えば、培養液に加えてもよく；もしくは、培地
が式（Ｉ）で表される化合物を含み、ついで、そのよう
な培地に微生物を加えてもよく；または、式（Ｉ）で表
される化合物および微生物を一緒にこのような培地に加
えてもよく；あるいは、式（Ｉ）で表される化合物を破
壊された細胞調製物に加えてもよく；または、式（Ｉ）
で表される化合物を微生物の脱水された調製物に加えて
もよく；式（Ｉ）で表される化合物または微生物もしく
は酵素還元システムのいずれかをその他方を含む適当な
溶剤に加えてもよい等である。当業者であれば、本明細
書に提供した記載から、主題の方法のいずれかの部分を
所望どおりに改良する方法を理解することができるであ
ろう。
酵素還元システムと接触させるいずれの適した方法もま
た本発明において使用することができる。式（Ｉ）で表
される化合物は、いずれかの適した順序で、微生物また
は酵素還元システムと接触させることができる。例え
ば、式（Ｉ）で表される化合物を遊離もしくは固定化さ
せるかあるいはその幾つかの組み合わせの微生物を含む
培地、例えば、培養液に加えてもよく；もしくは、培地
が式（Ｉ）で表される化合物を含み、ついで、そのよう
な培地に微生物を加えてもよく；または、式（Ｉ）で表
される化合物および微生物を一緒にこのような培地に加
えてもよく；あるいは、式（Ｉ）で表される化合物を破
壊された細胞調製物に加えてもよく；または、式（Ｉ）
で表される化合物を微生物の脱水された調製物に加えて
もよく；式（Ｉ）で表される化合物または微生物もしく
は酵素還元システムのいずれかをその他方を含む適当な
溶剤に加えてもよい等である。当業者であれば、本明細
書に提供した記載から、主題の方法のいずれかの部分を
所望どおりに改良する方法を理解することができるであ
ろう。
【００５５】本発明において、微生物または酵素還元シ
ステムをハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymor
pha) ＡＴＣＣ Ｎｏ．２６０１２から得られることが
特に好ましい。ハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula p
olymorpha) ＡＴＣＣ Ｎｏ．２６０１２（最初に、D.
W. Levineによって寄託された。）の減圧凍結乾燥した
試料は、10801 University Boulevard, Manassas, Virg
inia, 20110-2209, USAに所在のＡＴＣＣで１９９８年
６月２６日にブダペスト条約に基づき寄託された。この
新しく寄託された培養菌は、新たな寄託番号ＡＴＣＣ
Ｎｏ．７４４４９を付与された。したがって、本発明に
おいて、微生物がハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula
polymorpha) ＡＴＣＣ Ｎｏ．７４４４９であること
もまた特に好ましい。かく寄託された微生物培養菌の公
的な使用についての制約は、全て、本発明の明細書から
の特許の発効に際し、取り消しの利かないものとして排
除されるであろう。
ステムをハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymor
pha) ＡＴＣＣ Ｎｏ．２６０１２から得られることが
特に好ましい。ハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula p
olymorpha) ＡＴＣＣ Ｎｏ．２６０１２（最初に、D.
W. Levineによって寄託された。）の減圧凍結乾燥した
試料は、10801 University Boulevard, Manassas, Virg
inia, 20110-2209, USAに所在のＡＴＣＣで１９９８年
６月２６日にブダペスト条約に基づき寄託された。この
新しく寄託された培養菌は、新たな寄託番号ＡＴＣＣ
Ｎｏ．７４４４９を付与された。したがって、本発明に
おいて、微生物がハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula
polymorpha) ＡＴＣＣ Ｎｏ．７４４４９であること
もまた特に好ましい。かく寄託された微生物培養菌の公
的な使用についての制約は、全て、本発明の明細書から
の特許の発効に際し、取り消しの利かないものとして排
除されるであろう。
【００５６】ハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula pol
ymorpha) ＡＴＣＣ Ｎｏ．２６０１２の培養菌は、Ａ
ＴＣＣより入手することができ、このような市販入手さ
れる株からのその調製のために適した方法の例を以下記
載する。かくして得られた培養菌を適当な生育培地に加
え、生育が起こるまで振盪してインキュベートするが、
この両工程は、当業者であれば、理解されるであろう工
程である。かくして調製した培養菌は、斜面培養基（sl
ants）に接種するために使用することができ、これら斜
面培養基の部分部分を代表株（master stocks）として
凍結する。これとは別に、液体株培養菌を調製し、それ
に、グリセロールを約１０％〜約２０％加え、ついで、
それを約−８０℃で、好ましくは、小さな冷凍チューブ
（cryotubes）内で凍結する。
ymorpha) ＡＴＣＣ Ｎｏ．２６０１２の培養菌は、Ａ
ＴＣＣより入手することができ、このような市販入手さ
れる株からのその調製のために適した方法の例を以下記
載する。かくして得られた培養菌を適当な生育培地に加
え、生育が起こるまで振盪してインキュベートするが、
この両工程は、当業者であれば、理解されるであろう工
程である。かくして調製した培養菌は、斜面培養基（sl
ants）に接種するために使用することができ、これら斜
面培養基の部分部分を代表株（master stocks）として
凍結する。これとは別に、液体株培養菌を調製し、それ
に、グリセロールを約１０％〜約２０％加え、ついで、
それを約−８０℃で、好ましくは、小さな冷凍チューブ
（cryotubes）内で凍結する。
【００５７】当業者であれば、選択されるいずれかの微
生物について理解できるであろうし、アビシディア・コ
エルレア(Absidia coerulea) ＡＴＣＣ Ｎｏ．２０１
３７およびとりわけ好ましいハンセヌラ・ポリモルファ
(Hansenula polymorpha) ＡＴＣＣ Ｎｏ．２６０１２
またはＡＴＣＣ Ｎｏ．７４４４９について、以降、実
施例において詳細に示すが、微生物を調製するための適
した方法は、以下の通りである：微生物を、例えば、上
記したような凍結株培養菌（約１７％グリセロール株）
から、生育培地［ツィーン（Tween）（登録商標;以降、
Ｒとも略記する）80、グリセロールおよび蒸留水を含む
滅菌溶液からのアリコートを容れる］を容れる金属囲い
を有するフラスコまたはガラスチューブに接種する。生
育培地の組成は、以下に、さらに詳細に説明する。約２
２℃〜約３２℃の範囲の温度、好ましくは、約２９℃
で、好ましくは、約２００rpm〜約２２０rpm、最も好ま
しくは、約２１０rpmで適当に振盪しつつ、発酵を行
う。所望される場合には、生育培地のｐＨは、発酵培地
に配合され、および／または、必要に応じて、塩基また
は酸を添加することによって周期的に調整される適当な
緩衝液の使用によって維持することができる。
生物について理解できるであろうし、アビシディア・コ
エルレア(Absidia coerulea) ＡＴＣＣ Ｎｏ．２０１
３７およびとりわけ好ましいハンセヌラ・ポリモルファ
(Hansenula polymorpha) ＡＴＣＣ Ｎｏ．２６０１２
またはＡＴＣＣ Ｎｏ．７４４４９について、以降、実
施例において詳細に示すが、微生物を調製するための適
した方法は、以下の通りである：微生物を、例えば、上
記したような凍結株培養菌（約１７％グリセロール株）
から、生育培地［ツィーン（Tween）（登録商標;以降、
Ｒとも略記する）80、グリセロールおよび蒸留水を含む
滅菌溶液からのアリコートを容れる］を容れる金属囲い
を有するフラスコまたはガラスチューブに接種する。生
育培地の組成は、以下に、さらに詳細に説明する。約２
２℃〜約３２℃の範囲の温度、好ましくは、約２９℃
で、好ましくは、約２００rpm〜約２２０rpm、最も好ま
しくは、約２１０rpmで適当に振盪しつつ、発酵を行
う。所望される場合には、生育培地のｐＨは、発酵培地
に配合され、および／または、必要に応じて、塩基また
は酸を添加することによって周期的に調整される適当な
緩衝液の使用によって維持することができる。
【００５８】微生物の生育のいずれかの適当な期間、微
生物を式（Ｉ）で表される化合物と接触させ、式（Ｉ）
で表される化合物を微生物とインキュベーションするこ
とを本発明において使用することができる。微生物の適
当な生育は、例えば、約２４時間以内に、達成すること
ができ、その時点で、ラセミのテトラロンの適当な溶
剤、好ましくは、エタノール溶液の適当なアリコートを
培養菌に加えることができる。ついで、発酵を約２日〜
約６日、好ましくは、例えば、約５日継続し、その時点
で、適当な溶剤、例えば、酢酸エチル、メチルイソブチ
ルケトン、メチルエチルケトン、塩化メチレン等、好ま
しくは、酢酸エチルによるいずれかの適当な抽出方法を
使用し、発酵培養液を抽出し、発酵培養液から有機成分
を取り出すことができる。発酵培養液の抽出および有機
相と水相との分離後、いずれかの適当な方法、例えば、
クロマトグラフィー、好ましくは、キラルＨＰＬＣを使
用して、有機残渣に含まれる化合物を測定する。
生物を式（Ｉ）で表される化合物と接触させ、式（Ｉ）
で表される化合物を微生物とインキュベーションするこ
とを本発明において使用することができる。微生物の適
当な生育は、例えば、約２４時間以内に、達成すること
ができ、その時点で、ラセミのテトラロンの適当な溶
剤、好ましくは、エタノール溶液の適当なアリコートを
培養菌に加えることができる。ついで、発酵を約２日〜
約６日、好ましくは、例えば、約５日継続し、その時点
で、適当な溶剤、例えば、酢酸エチル、メチルイソブチ
ルケトン、メチルエチルケトン、塩化メチレン等、好ま
しくは、酢酸エチルによるいずれかの適当な抽出方法を
使用し、発酵培養液を抽出し、発酵培養液から有機成分
を取り出すことができる。発酵培養液の抽出および有機
相と水相との分離後、いずれかの適当な方法、例えば、
クロマトグラフィー、好ましくは、キラルＨＰＬＣを使
用して、有機残渣に含まれる化合物を測定する。
【００５９】いずれの適当な生育培地もまた本発明の方
法において使用することができ、その適した生育培地
は、同化されうる炭素源、同化されうる窒素源および必
須無機物を含む無機塩類源を含むであろう。概して、多
くの炭水化物、例えば、グルコース、マルトース、マン
ノース、シュクロース、澱粉、グリセリン、ミレットジ
ェリー（millet jelly）、糖蜜、大豆等は、同化されう
る炭素源として使用することができる。同化しうる窒素
源としては、例えば、酵母およびカゼイン加水分解物の
ような物質、１次酵母、酵母エキス、綿実粉、大豆固形
物、小麦の麦芽、肉エキス（meat extract）、ペプト
ン、トウモロコシ滲出液およびアンモニウム塩類が挙げ
られる。本発明の培養培地に使用される適した無機塩栄
養物としては、例えば、ナトリウム、鉄、マグネシウ
ム、カリウム、コバルト、リン酸塩等を含有する慣用的
な塩類が挙げられる。さらに詳しくは、本発明において
使用するのに適した生育培地としては、例えば： （ａ） デキストロース（約２０g）、酵母エキス（約
５g）、大豆粉（約５g）、ＮａＣｌ（約５g）、Ｋ2ＨＰ
Ｏ4（約５g）および蒸留水（約１リットル）、ｐＨは、
Ｈ2ＳＯ4(aq.)で約ｐＨ７．０に調整した； （ｂ） デキストリン（約１０g）、牛肉エキス（約３
g）、アルダミンｐＨ（約５g）、ＮＺアミンタイプＥ
（約５g）、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ（約０．５g）、ＫＨ2
ＰＯ4（約０．３７g）、ＣａＣＯ3（約０．５g）および
蒸留水（約１リットル）、ｐＨは、ＨＣｌ(aq.)で約ｐ
Ｈ７．１に調整した；続いて、グルコース（約１０
g）、Ｈｙ−Ｃａｓｅ ＳＰR（約２g）、牛肉エキス
（約１g）、トウモロコシ滲出液（約３g）および蒸留水
（約１リットル）、ｐＨは、約ｐＨ７．０に調整した第
２段階； （ｃ） グルコース（約１０g）、トウモロコシ滲出液
（約６g）、ＫＨ2ＰＯ4（約３g）、ＣａＣＯ3（約３．
５g）、大豆油（粗製、約２．２ml）、酵母エキス（約
２．５g）および蒸留水（約１リットル）、ｐＨは、Ｈ
Ｃｌ(aq.)で約ｐＨ７．３に調整した； （ｄ） 麦芽シロップ（約２０g）、大豆ミール（約５
g）、カゼイン（約１g）、乾燥した酵母（約１g）、Ｎ
ａＣｌ（約５g）および蒸留水（約１リットル）； （ｅ） ラクトース（約７５g）、ファルマメディア［P
harmamedia（登録商標）（代替酵母エキス、約４０
g）、ＣａＣＯ3（約１０g）、Ｎａ2ＳＯ4（約４g）およ
び蒸留水（約１リットル）； （ｆ） ＩＳＰ＃２［例えば、Handbook of Microbial
Media by R. M. Atras, edited by L. C. Parks CRC Pr
ess, Inc., 1993, (以降、“Handbook"と略称す）の４
６０頁を参照。］； （ｇ） ＩＳＰ＃３（Handbookの４６０頁を参照。）； （ｈ） ＩＳＰ＃４（Handbookの４６１頁を参照。）； （ｉ） ＩＳＰ＃５（Handbookの４６１−４６２頁を参
照。）；等が挙げられる。
法において使用することができ、その適した生育培地
は、同化されうる炭素源、同化されうる窒素源および必
須無機物を含む無機塩類源を含むであろう。概して、多
くの炭水化物、例えば、グルコース、マルトース、マン
ノース、シュクロース、澱粉、グリセリン、ミレットジ
ェリー（millet jelly）、糖蜜、大豆等は、同化されう
る炭素源として使用することができる。同化しうる窒素
源としては、例えば、酵母およびカゼイン加水分解物の
ような物質、１次酵母、酵母エキス、綿実粉、大豆固形
物、小麦の麦芽、肉エキス（meat extract）、ペプト
ン、トウモロコシ滲出液およびアンモニウム塩類が挙げ
られる。本発明の培養培地に使用される適した無機塩栄
養物としては、例えば、ナトリウム、鉄、マグネシウ
ム、カリウム、コバルト、リン酸塩等を含有する慣用的
な塩類が挙げられる。さらに詳しくは、本発明において
使用するのに適した生育培地としては、例えば： （ａ） デキストロース（約２０g）、酵母エキス（約
５g）、大豆粉（約５g）、ＮａＣｌ（約５g）、Ｋ2ＨＰ
Ｏ4（約５g）および蒸留水（約１リットル）、ｐＨは、
Ｈ2ＳＯ4(aq.)で約ｐＨ７．０に調整した； （ｂ） デキストリン（約１０g）、牛肉エキス（約３
g）、アルダミンｐＨ（約５g）、ＮＺアミンタイプＥ
（約５g）、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ（約０．５g）、ＫＨ2
ＰＯ4（約０．３７g）、ＣａＣＯ3（約０．５g）および
蒸留水（約１リットル）、ｐＨは、ＨＣｌ(aq.)で約ｐ
Ｈ７．１に調整した；続いて、グルコース（約１０
g）、Ｈｙ−Ｃａｓｅ ＳＰR（約２g）、牛肉エキス
（約１g）、トウモロコシ滲出液（約３g）および蒸留水
（約１リットル）、ｐＨは、約ｐＨ７．０に調整した第
２段階； （ｃ） グルコース（約１０g）、トウモロコシ滲出液
（約６g）、ＫＨ2ＰＯ4（約３g）、ＣａＣＯ3（約３．
５g）、大豆油（粗製、約２．２ml）、酵母エキス（約
２．５g）および蒸留水（約１リットル）、ｐＨは、Ｈ
Ｃｌ(aq.)で約ｐＨ７．３に調整した； （ｄ） 麦芽シロップ（約２０g）、大豆ミール（約５
g）、カゼイン（約１g）、乾燥した酵母（約１g）、Ｎ
ａＣｌ（約５g）および蒸留水（約１リットル）； （ｅ） ラクトース（約７５g）、ファルマメディア［P
harmamedia（登録商標）（代替酵母エキス、約４０
g）、ＣａＣＯ3（約１０g）、Ｎａ2ＳＯ4（約４g）およ
び蒸留水（約１リットル）； （ｆ） ＩＳＰ＃２［例えば、Handbook of Microbial
Media by R. M. Atras, edited by L. C. Parks CRC Pr
ess, Inc., 1993, (以降、“Handbook"と略称す）の４
６０頁を参照。］； （ｇ） ＩＳＰ＃３（Handbookの４６０頁を参照。）； （ｈ） ＩＳＰ＃４（Handbookの４６１頁を参照。）； （ｉ） ＩＳＰ＃５（Handbookの４６１−４６２頁を参
照。）；等が挙げられる。
【００６０】特に好ましい生育培地は、上記示した
（ａ）の２倍の濃度（２Ｘ）である。個々の緩衝液、培
地、試薬、接触または培養条件等を参照することは、本
発明をそれらに限定することを意図するものではなく、
本明細書における考察が示されている個々のコンテキス
トにおいて重要または価値あるものと当業者が認識する
であろうこのような関連資料全てを含むことを読み取る
べきである。例えば、１つの緩衝液システムまたは培養
培地をもう１つの緩衝液システムまたは培養培地と代替
することが可能であり、異なるが公知の方法を使用し
て、示された方法、物質または組成物の使用が導く同一
の目的を達成することができることが多い。さらに、本
発明は、主題の方法を商業的目的のためにスケールアッ
プすることを含むことを理解する必要がある。
（ａ）の２倍の濃度（２Ｘ）である。個々の緩衝液、培
地、試薬、接触または培養条件等を参照することは、本
発明をそれらに限定することを意図するものではなく、
本明細書における考察が示されている個々のコンテキス
トにおいて重要または価値あるものと当業者が認識する
であろうこのような関連資料全てを含むことを読み取る
べきである。例えば、１つの緩衝液システムまたは培養
培地をもう１つの緩衝液システムまたは培養培地と代替
することが可能であり、異なるが公知の方法を使用し
て、示された方法、物質または組成物の使用が導く同一
の目的を達成することができることが多い。さらに、本
発明は、主題の方法を商業的目的のためにスケールアッ
プすることを含むことを理解する必要がある。
【００６１】したがって、当業者であれば理解されるで
あろうが、生育培地、発酵条件、および／または、ラセ
ミのテトラロンの量を変えることにより、生成する化合
物の収率およびそれらの相対的製造速度を調節すること
が可能である。概して、本発明において使用される技術
は、工業的に有効なように選択される。本明細書で記載
する生育培地、発酵条件および微生物または酵素還元シ
ステムの相対量ならびにラセミのテトラロンは、多種多
様な培地、発酵条件および出発物質の量についての単な
る例であって、これらは、当業者であれば理解できるで
あろうが、本発明において適当に使用することができ、
何ら本発明を限定する意図はないものである。
あろうが、生育培地、発酵条件、および／または、ラセ
ミのテトラロンの量を変えることにより、生成する化合
物の収率およびそれらの相対的製造速度を調節すること
が可能である。概して、本発明において使用される技術
は、工業的に有効なように選択される。本明細書で記載
する生育培地、発酵条件および微生物または酵素還元シ
ステムの相対量ならびにラセミのテトラロンは、多種多
様な培地、発酵条件および出発物質の量についての単な
る例であって、これらは、当業者であれば理解できるで
あろうが、本発明において適当に使用することができ、
何ら本発明を限定する意図はないものである。
【００６２】主題の方法の生成物のいずれかを単離およ
び／または精製するためのいずれかの適した方法、例え
ば、濾過、抽出、結晶化、カラムクロマトグラフィー、
薄層クロマトグラフィー、分取用低圧液体クロマトグラ
フィーもしくはＨＰＬＣまたはこのような方法のいずれ
かの適当な組み合わせを含む本発明において使用するこ
とができる。
び／または精製するためのいずれかの適した方法、例え
ば、濾過、抽出、結晶化、カラムクロマトグラフィー、
薄層クロマトグラフィー、分取用低圧液体クロマトグラ
フィーもしくはＨＰＬＣまたはこのような方法のいずれ
かの適当な組み合わせを含む本発明において使用するこ
とができる。
【００６３】さらに、当業者であれば、本明細書に開示
した方法によって製造される、（４Ｒ）テトラロンの所
望しない対応するアルコール、式（ＩＩ）で表される化
合物をリサイクルし、本明細書で先に考察したようにし
て、例えば、いずれかの適当な方法によって、式（Ｉ）
で表されるラセミのテトラロンへと酸化およびラセミ化
し、本発明の方法を繰り返し、再度、式（Ｖ）で表され
る所望される（４Ｓ）テトラロンを生成させることがで
きる。（４Ｒ）テトラロールの（４Ｒ）ケトンへの酸化
は、当業者公知の方法によって行うことができる。ラセ
ミ化反応は、いずれかの適した方法で実施することがで
きるが、概して、約０℃〜約１００℃の温度、好ましく
は、約２５℃〜約６５℃の温度で実施することができ
る。（４Ｒ）テトラロンは、約２５℃〜約８５℃の温
度、好ましくは、約５０℃〜約６５℃の温度で、塩基と
反応させられる。このラセミ化反応に適した塩基として
は、カリウムｔ−ブトキシド、水酸化ナトリウム、ナト
リウムメトキシドおよび水酸化カリウムが挙げられる。
好ましい塩基は、カリウムｔ−ブトキシドである。
した方法によって製造される、（４Ｒ）テトラロンの所
望しない対応するアルコール、式（ＩＩ）で表される化
合物をリサイクルし、本明細書で先に考察したようにし
て、例えば、いずれかの適当な方法によって、式（Ｉ）
で表されるラセミのテトラロンへと酸化およびラセミ化
し、本発明の方法を繰り返し、再度、式（Ｖ）で表され
る所望される（４Ｓ）テトラロンを生成させることがで
きる。（４Ｒ）テトラロールの（４Ｒ）ケトンへの酸化
は、当業者公知の方法によって行うことができる。ラセ
ミ化反応は、いずれかの適した方法で実施することがで
きるが、概して、約０℃〜約１００℃の温度、好ましく
は、約２５℃〜約６５℃の温度で実施することができ
る。（４Ｒ）テトラロンは、約２５℃〜約８５℃の温
度、好ましくは、約５０℃〜約６５℃の温度で、塩基と
反応させられる。このラセミ化反応に適した塩基として
は、カリウムｔ−ブトキシド、水酸化ナトリウム、ナト
リウムメトキシドおよび水酸化カリウムが挙げられる。
好ましい塩基は、カリウムｔ−ブトキシドである。
【００６４】以下に示す詳細な実施例は、真菌類、例え
ば、酵母、および、放線菌類を含むある範囲の微生物が
立体選択的にラセミのテトラロンを還元して、式（Ｖ）
で表される所望される（４Ｓ）テトラロン、すなわち、
キラルなテトラロンを生成し、ついで、この（４Ｓ）テ
トラロンを所望しない化合物から分離し、当分野周知の
方法に従い、さらに反応させて、セルトラリンを生成す
ることを示す。
ば、酵母、および、放線菌類を含むある範囲の微生物が
立体選択的にラセミのテトラロンを還元して、式（Ｖ）
で表される所望される（４Ｓ）テトラロン、すなわち、
キラルなテトラロンを生成し、ついで、この（４Ｓ）テ
トラロンを所望しない化合物から分離し、当分野周知の
方法に従い、さらに反応させて、セルトラリンを生成す
ることを示す。
【００６５】
【実施例】本発明を以下の実施例によって例示する。本
発明および種々の実施態様についての前述および以下の
記載は、本発明を限定する意図のものではなく、むし
ろ、本発明を例示するものである。したがって、本発明
は、これら実施例の具体的な詳細に限定されるべきもの
ではないことが理解されるであろう。
発明および種々の実施態様についての前述および以下の
記載は、本発明を限定する意図のものではなく、むし
ろ、本発明を例示するものである。したがって、本発明
は、これら実施例の具体的な詳細に限定されるべきもの
ではないことが理解されるであろう。
【００６６】実施例 １ ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenura polymorpha）
ＡＴＣＣ Ｎｏ．２６０１２を使用するラセミのテトラ
ロンの還元 Ａ． 酵母ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenura poly
morpha） ＡＴＣＣ Ｎｏ．２６０１２の発酵 １つの“対照”培養（Ｃ１）と１つの“試験”培養（Ｔ
１）とを以下のようにして調整した：各々、金属囲い
（Ｃ１，Ｔ１）を有する２本の１６×１２５mmガラスチ
ューブの各々に、約２．５mlの滅菌生育培地（約４０g/
lのデキストロース、約１０g/lの栄養大豆粉（nutrisoy
flour）、約１０g/lの酵母エキス、約１０g/lのＮａＣ
ｌおよび約１０g/lのＫ2ＨＰＯ4；ｐＨは、Ｈ2ＳＯ4で
約７．０に調整した）を加え、続いて、その２つの培養
の各々に、約０．２mlの溶液Ａ（約２５gのTweenR 80、
約１００gのグリセロールおよび約２５０mlの蒸留水；
滅菌濾過した）を加えた。
ＡＴＣＣ Ｎｏ．２６０１２を使用するラセミのテトラ
ロンの還元 Ａ． 酵母ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenura poly
morpha） ＡＴＣＣ Ｎｏ．２６０１２の発酵 １つの“対照”培養（Ｃ１）と１つの“試験”培養（Ｔ
１）とを以下のようにして調整した：各々、金属囲い
（Ｃ１，Ｔ１）を有する２本の１６×１２５mmガラスチ
ューブの各々に、約２．５mlの滅菌生育培地（約４０g/
lのデキストロース、約１０g/lの栄養大豆粉（nutrisoy
flour）、約１０g/lの酵母エキス、約１０g/lのＮａＣ
ｌおよび約１０g/lのＫ2ＨＰＯ4；ｐＨは、Ｈ2ＳＯ4で
約７．０に調整した）を加え、続いて、その２つの培養
の各々に、約０．２mlの溶液Ａ（約２５gのTweenR 80、
約１００gのグリセロールおよび約２５０mlの蒸留水；
滅菌濾過した）を加えた。
【００６７】ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenura po
lymorpha） ＡＴＣＣ Ｎｏ．２６０１２の約１７％凍
結グリセロール株の約２５μlをＴ１に接種した。２つ
のチューブ培養を、約２９℃で、約２１０rpmで振盪し
つつ、インキュベートした。約２４時間後、ラセミのテ
トラロン（エタノール中約５mg/mlで式（ＩＶ）および
式（Ｖ）で表される化合物を含む式（Ｉ）で表される化
合物）の約５０μlの株溶液（約１００％エタノール中
約５mg/ml；最終濃度約１００μg/ml）をＣ１およびＴ
１に加えた。
lymorpha） ＡＴＣＣ Ｎｏ．２６０１２の約１７％凍
結グリセロール株の約２５μlをＴ１に接種した。２つ
のチューブ培養を、約２９℃で、約２１０rpmで振盪し
つつ、インキュベートした。約２４時間後、ラセミのテ
トラロン（エタノール中約５mg/mlで式（ＩＶ）および
式（Ｖ）で表される化合物を含む式（Ｉ）で表される化
合物）の約５０μlの株溶液（約１００％エタノール中
約５mg/ml；最終濃度約１００μg/ml）をＣ１およびＴ
１に加えた。
【００６８】約５日後、２つのチューブ培養の各々に、
１mlの（飽和）ＮａＣｌを加えた。各チューブ培養の発
酵培養液（約３．６ml）を等体積の酢酸エチル（ニー
ト）で抽出した：酢酸エチルを加え、チューブ培養液を
撹拌し、ついで、約２，０００rpm［ＩＥＣ（登録商
標）Centrifuge, 300 Second Avenue, Needham Height,
Massachusetts 02194］で遠心分離した。酢酸エチル層
を除去し、水層を１秒間抽出した。合わせた有機抽出物
を、水浴中約５０℃で、窒素下、乾燥させた。Ｂ． 残留ケトン：式（ＩＶ）および式（Ｖ）で表され
る化合物の配置 上記のようにして調製した各抽出物を約１mlのエタノー
ルに再懸濁させ、各再懸濁させた抽出物の約２０μl
を、ＨＰＬＣカラム：Chiralcel OK column (4.6× 250
mm, Diacel）と対をなすChiralcel OK guard column
(4.6 × 50 mm, Diacel Chemical Industries, LTD., S
pringdale Drive, P. O. Box 564, Exton, Pennsylvani
a 19341）に注入した。各注入された再懸濁抽出物内に
含まれる化合物は、移動相（エタノール：酢酸エチル，
８５：１５）内で約０．８ml／分で均等に(isocratical
ly）分離され、抽出物に含まれる化合物は、２５４nmに
設定された996 PDA検出器［Waters（登録商標）, 34 Ma
ple Street Milford, Massachusetts 01757］を使用し
て検出した。
１mlの（飽和）ＮａＣｌを加えた。各チューブ培養の発
酵培養液（約３．６ml）を等体積の酢酸エチル（ニー
ト）で抽出した：酢酸エチルを加え、チューブ培養液を
撹拌し、ついで、約２，０００rpm［ＩＥＣ（登録商
標）Centrifuge, 300 Second Avenue, Needham Height,
Massachusetts 02194］で遠心分離した。酢酸エチル層
を除去し、水層を１秒間抽出した。合わせた有機抽出物
を、水浴中約５０℃で、窒素下、乾燥させた。Ｂ． 残留ケトン：式（ＩＶ）および式（Ｖ）で表され
る化合物の配置 上記のようにして調製した各抽出物を約１mlのエタノー
ルに再懸濁させ、各再懸濁させた抽出物の約２０μl
を、ＨＰＬＣカラム：Chiralcel OK column (4.6× 250
mm, Diacel）と対をなすChiralcel OK guard column
(4.6 × 50 mm, Diacel Chemical Industries, LTD., S
pringdale Drive, P. O. Box 564, Exton, Pennsylvani
a 19341）に注入した。各注入された再懸濁抽出物内に
含まれる化合物は、移動相（エタノール：酢酸エチル，
８５：１５）内で約０．８ml／分で均等に(isocratical
ly）分離され、抽出物に含まれる化合物は、２５４nmに
設定された996 PDA検出器［Waters（登録商標）, 34 Ma
ple Street Milford, Massachusetts 01757］を使用し
て検出した。
【００６９】以下、表１のＣ１およびＴ１についてのデ
ータによって示されるように、キラルなＨＰＬＣ分析
は、微生物、すなわち、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ha
nsenura polymorpha） ＡＴＣＣ Ｎｏ．２６０１２が
含まれると、１６：１の比［未反応の式（Ｖ）で表され
る（４Ｓ）テトラロン：未反応の式（ＩＶ）で表される
（４Ｒ）テトラロン］を生じ、これは、さらに、主題の
微生物を使用する還元方法の立体特異性を示す。以下に
報告する結果は、添加した各エナンチオマーの公知の量
［式（ＩＶ）および式（Ｖ）で表される各化合物の約５
０μg/ml］に基づく。上記したように、式（Ｉ）で表さ
れる出発ラセミテトラロンは、約１００μg/mlの濃度を
有した。
ータによって示されるように、キラルなＨＰＬＣ分析
は、微生物、すなわち、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ha
nsenura polymorpha） ＡＴＣＣ Ｎｏ．２６０１２が
含まれると、１６：１の比［未反応の式（Ｖ）で表され
る（４Ｓ）テトラロン：未反応の式（ＩＶ）で表される
（４Ｒ）テトラロン］を生じ、これは、さらに、主題の
微生物を使用する還元方法の立体特異性を示す。以下に
報告する結果は、添加した各エナンチオマーの公知の量
［式（ＩＶ）および式（Ｖ）で表される各化合物の約５
０μg/ml］に基づく。上記したように、式（Ｉ）で表さ
れる出発ラセミテトラロンは、約１００μg/mlの濃度を
有した。
【００７０】
【表１】 キラルな分析よりの結果は、ハンセヌラ・ポリモルファ
（Hansenura polymorpha） ＡＴＣＣ Ｎｏ．２６０１
２培養（Ｔ１）が（４Ｒ）テトラロンを実質的に還元
し、他方、（４Ｓ）テトラロンを実質的に未反応のまま
残す［約７６％の（４Ｓ）テトラロンに対し、約４．７
％の（４Ｒ）テトラロンが残る。］ことを示す。（４
Ｓ）テトラロンは、このようなキラルなＨＰＬＣによっ
て、約８８％ｅｅ（“エナンチオマー過剰のパーセン
ト”）で存在することが測定された。表１のデータによ
っても示されるように、特に、（４Ｓ）：（４Ｒ）の
比、すなわち、１６により、（４Ｒ）テトラロンよりも
実質的に多量の（４Ｓ）テトラロンが未反応のまま残
る。
（Hansenura polymorpha） ＡＴＣＣ Ｎｏ．２６０１
２培養（Ｔ１）が（４Ｒ）テトラロンを実質的に還元
し、他方、（４Ｓ）テトラロンを実質的に未反応のまま
残す［約７６％の（４Ｓ）テトラロンに対し、約４．７
％の（４Ｒ）テトラロンが残る。］ことを示す。（４
Ｓ）テトラロンは、このようなキラルなＨＰＬＣによっ
て、約８８％ｅｅ（“エナンチオマー過剰のパーセン
ト”）で存在することが測定された。表１のデータによ
っても示されるように、特に、（４Ｓ）：（４Ｒ）の
比、すなわち、１６により、（４Ｒ）テトラロンよりも
実質的に多量の（４Ｓ）テトラロンが未反応のまま残
る。
【００７１】したがって、無傷な微生物、すなわち、ハ
ンセヌラ・ポリモルファ（Hansenura polymorpha） Ａ
ＴＣＣ Ｎｏ．２６０１２が含まれると、式（Ｖ）で表
される出発（４Ｓ）テトラロンよりも実質的に多量の式
（ＩＶ）で表される出発（４Ｒ）テトラロン［（４
Ｓ）：（４Ｒ）］の立体特異的な還元を生じ、式（ＩＩ
Ｉ）で表される（４Ｓ）テトラロールに対し、式（Ｉ
Ｉ）で表される（４Ｒ）テトラロールを大部分生成した
（データは示さず）。生成した（４Ｒ）テトラロールの
大部分は、（１Ｓ，４Ｒ）テトラロールであり、生成し
た少量の（４Ｓ）テトラロールの大部分は、（１Ｓ，４
Ｓ）テトラロールであった。
ンセヌラ・ポリモルファ（Hansenura polymorpha） Ａ
ＴＣＣ Ｎｏ．２６０１２が含まれると、式（Ｖ）で表
される出発（４Ｓ）テトラロンよりも実質的に多量の式
（ＩＶ）で表される出発（４Ｒ）テトラロン［（４
Ｓ）：（４Ｒ）］の立体特異的な還元を生じ、式（ＩＩ
Ｉ）で表される（４Ｓ）テトラロールに対し、式（Ｉ
Ｉ）で表される（４Ｒ）テトラロールを大部分生成した
（データは示さず）。生成した（４Ｒ）テトラロールの
大部分は、（１Ｓ，４Ｒ）テトラロールであり、生成し
た少量の（４Ｓ）テトラロールの大部分は、（１Ｓ，４
Ｓ）テトラロールであった。
【００７２】実施例 ２ アビシディア・コエルレア(Absidia coerulea) ＡＴＣ
Ｃ Ｎｏ．２０１３７を使用するラセミのテトラロンの
還元 Ａ． 真菌アビシディア・コエルレア(Absidia coerule
a) ＡＴＣＣ Ｎｏ．２０１３７の発酵 １つの“対照”培養（Ｃ２）と１つの“試験”培養（Ｔ
２）とを以下のようにして調整した：各々、金属囲い
（Ｃ２，Ｔ２）を有する２本の１６×１２５mmガラスチ
ューブの各々に、約２．５mlの滅菌生育培地（約２０g/
lのデキストロース、約５g/lの栄養大豆粉（nutrisoy f
lour）、約５g/lの酵母エキス、約５g/lのＮａＣｌおよ
び約５g/lのＫ2ＨＰＯ4；ｐＨは、Ｈ2ＳＯ4で約７．０
に調整した）を加えた。
Ｃ Ｎｏ．２０１３７を使用するラセミのテトラロンの
還元 Ａ． 真菌アビシディア・コエルレア(Absidia coerule
a) ＡＴＣＣ Ｎｏ．２０１３７の発酵 １つの“対照”培養（Ｃ２）と１つの“試験”培養（Ｔ
２）とを以下のようにして調整した：各々、金属囲い
（Ｃ２，Ｔ２）を有する２本の１６×１２５mmガラスチ
ューブの各々に、約２．５mlの滅菌生育培地（約２０g/
lのデキストロース、約５g/lの栄養大豆粉（nutrisoy f
lour）、約５g/lの酵母エキス、約５g/lのＮａＣｌおよ
び約５g/lのＫ2ＨＰＯ4；ｐＨは、Ｈ2ＳＯ4で約７．０
に調整した）を加えた。
【００７３】アビシディア・コエルレア（Absidia coer
ulea） ＡＴＣＣ Ｎｏ．２０１３７の約１７％凍結グ
リセロール株の約２５μlをＴ２に接種した。２本のチ
ューブ培養を、約２９℃で、約２１０rpmで振盪しつ
つ、インキュベートした。約４８時間後、ラセミのテト
ラロン（本明細書の実施例１で記載したように、約１０
０％エタノール中約５mg/mlで）の約５０μl（エタノー
ル中約５mg/ml；最終濃度約１００μg/ml）をＣ２およ
びＴ２に加えた。
ulea） ＡＴＣＣ Ｎｏ．２０１３７の約１７％凍結グ
リセロール株の約２５μlをＴ２に接種した。２本のチ
ューブ培養を、約２９℃で、約２１０rpmで振盪しつ
つ、インキュベートした。約４８時間後、ラセミのテト
ラロン（本明細書の実施例１で記載したように、約１０
０％エタノール中約５mg/mlで）の約５０μl（エタノー
ル中約５mg/ml；最終濃度約１００μg/ml）をＣ２およ
びＴ２に加えた。
【００７４】約５日後、２本のチューブ培養の各々に、
１mlの（飽和）ＮａＣｌを加えた。各チューブ培養の発
酵培養液（約３．６ml）を約３mlの酢酸エチル（ニー
ト）で抽出した：酢酸エチルを加え、チューブ培養液を
撹拌し、ついで、約２，０００rpm（ＩＥＣ Centrifug
e）で遠心分離した。酢酸エチル層を除去し、水層を１
秒間抽出した。合わせた有機抽出物を、水浴中約５０℃
で、窒素下、乾燥させた。Ｂ． 残留ケトン：式（ＩＶ）および式（Ｖ）で表され
る化合物の配置 上記のようにして調製した各抽出物を約１mlのエタノー
ルに再懸濁させ、各再懸濁させた抽出物の約２０μl
を、ＨＰＬＣカラム：Chiralcel OK column (4.6× 250
mm, Diacel）と対をなすChiralcel OK guard column
(4.6 × 50 mm）に注入した。各注入された再懸濁抽出
物内に含まれる化合物は、移動相（エタノール：酢酸エ
チル，８５：１５）で約０．８ml／分で均等に分離さ
れ、抽出物に含まれる化合物は、２５４nmに設定された
996 PDA検出器（WatersR)を使用して検出した。
１mlの（飽和）ＮａＣｌを加えた。各チューブ培養の発
酵培養液（約３．６ml）を約３mlの酢酸エチル（ニー
ト）で抽出した：酢酸エチルを加え、チューブ培養液を
撹拌し、ついで、約２，０００rpm（ＩＥＣ Centrifug
e）で遠心分離した。酢酸エチル層を除去し、水層を１
秒間抽出した。合わせた有機抽出物を、水浴中約５０℃
で、窒素下、乾燥させた。Ｂ． 残留ケトン：式（ＩＶ）および式（Ｖ）で表され
る化合物の配置 上記のようにして調製した各抽出物を約１mlのエタノー
ルに再懸濁させ、各再懸濁させた抽出物の約２０μl
を、ＨＰＬＣカラム：Chiralcel OK column (4.6× 250
mm, Diacel）と対をなすChiralcel OK guard column
(4.6 × 50 mm）に注入した。各注入された再懸濁抽出
物内に含まれる化合物は、移動相（エタノール：酢酸エ
チル，８５：１５）で約０．８ml／分で均等に分離さ
れ、抽出物に含まれる化合物は、２５４nmに設定された
996 PDA検出器（WatersR)を使用して検出した。
【００７５】以下に示すＣ２およびＴ２についてのＨＰ
ＬＣデータによって示されるように、微生物、すなわ
ち、アビシディア・コエルレア（Absidia coerulea）
ＡＴＣＣ Ｎｏ．２０１３７が含まれると、式（Ｖ）で
表される出発（４Ｓ）テトラロンより多量の式（ＩＶ）
で表される出発（４Ｒ）テトラロンの立体特異的還元を
生じた。
ＬＣデータによって示されるように、微生物、すなわ
ち、アビシディア・コエルレア（Absidia coerulea）
ＡＴＣＣ Ｎｏ．２０１３７が含まれると、式（Ｖ）で
表される出発（４Ｓ）テトラロンより多量の式（ＩＶ）
で表される出発（４Ｒ）テトラロンの立体特異的還元を
生じた。
【００７６】さらに詳しくは、キラルな分析よりの結果
は、アビシディア・コエルレア（Absidia coerulea）
ＡＴＣＣ Ｎｏ．２０１３７培養菌が（４Ｒ）テトラロ
ンを還元し、他方、（４Ｓ）テトラロンを実質的に未反
応のまま残す［約４０．５％の（４Ｓ）テトラロンに対
し、約１３．６％の（４Ｒ）テトラロンを残す。］こと
を示す。このようなキラルなＨＰＬＣにより、（４Ｓ）
テトラロンは、約５０％ｅｅで存在することが測定され
た。
は、アビシディア・コエルレア（Absidia coerulea）
ＡＴＣＣ Ｎｏ．２０１３７培養菌が（４Ｒ）テトラロ
ンを還元し、他方、（４Ｓ）テトラロンを実質的に未反
応のまま残す［約４０．５％の（４Ｓ）テトラロンに対
し、約１３．６％の（４Ｒ）テトラロンを残す。］こと
を示す。このようなキラルなＨＰＬＣにより、（４Ｓ）
テトラロンは、約５０％ｅｅで存在することが測定され
た。
【００７７】以下、表２のＣ２およびＴ２についてのデ
ータにより示されるように、キラルなＨＰＬＣ分析は、
微生物、すなわち、アビシディア・コエルレア（Absidi
a coerulea） ＡＴＣＣ Ｎｏ．２０１３７が含まれる
（Ｔ２）と、未還元の（４Ｒ）テトラロンに対し残され
る未還元の（４Ｓ）テトラロンが少なくとも２倍も多い
比を生ずることを示し、これは、主題の微生物を使用す
る還元方法の立体特異性をさらに立証する。以下に報告
する結果は、添加した各エナンチオマーの公知の量［本
明細書の実施例１で記載したような各々約５０μg/ml］
に基づく。上記したように、出発ラセミテトラロンは、
約１００μg/mlの濃度を有した。
ータにより示されるように、キラルなＨＰＬＣ分析は、
微生物、すなわち、アビシディア・コエルレア（Absidi
a coerulea） ＡＴＣＣ Ｎｏ．２０１３７が含まれる
（Ｔ２）と、未還元の（４Ｒ）テトラロンに対し残され
る未還元の（４Ｓ）テトラロンが少なくとも２倍も多い
比を生ずることを示し、これは、主題の微生物を使用す
る還元方法の立体特異性をさらに立証する。以下に報告
する結果は、添加した各エナンチオマーの公知の量［本
明細書の実施例１で記載したような各々約５０μg/ml］
に基づく。上記したように、出発ラセミテトラロンは、
約１００μg/mlの濃度を有した。
【００７８】
【表２】 実施例 ３ 真菌類、酵母類および放線菌類を使用するラセミのテト
ラロンの還元 当業者であれば理解できるであろうが、主題の還元に使
用される表３に列挙した微生物について、ゲオトリキュ
ーム カンディダム(Geotrichum candidum)ＡＴＣＣ
Ｎｏ．６２４０１、モルティエレラ・イサベリナ(Morti
erella isabellina) ＡＴＣＣ Ｎｏ．３８０６３、モ
ルティエレラ・ビナセア(Mortierellavinacea) ＡＴＣ
Ｃ Ｎｏ．０９５１５、ペニシリウム・ノタツム(Penic
illium notatum) ＡＴＣＣ Ｎｏ．３６７４０、ブラ
ストシゾマイセス・カピタツス(Blastoschizomyces cap
itatus) ＡＴＣＣ Ｎｏ．２８５７５、モノスポリウ
ム・オリバセウム・ブイ・メージャー(Monosporium oli
vaceum v. major) ＡＴＣＣ Ｎｏ．３６３００、オウ
レオバシディウム・プルランス(Aureobasidium pullula
ns) ＡＴＣＣ Ｎｏ．１６６２３、ピッツィア・ファ
ビアニ(Pichia fabianii) ＡＴＣＣ Ｎｏ．１６７５
５およびストレプトマイセス・リモスス・エスエス・リ
モスス(Streptomyces rimosus ss. rimosus) ＡＴＣＣ
Ｎｏ．１０９７０を実施例２におけるようにして調製
し；ゲオトリキューム・カンディダム(Geotrichum cand
idum) ＡＴＣＣ Ｎｏ．３４６１４、モルティエレラ
・イサベリナ(Mortierella isabellina) ＡＴＣＣ Ｎ
ｏ．４２６１３、デバリョマイセス・ポリモルファス(D
ebaryomyces polymorphus) ＡＴＣＣ Ｎｏ．２０２８
０、サッカロマイセス・セレビシアエ(Saccharomyces c
erevisiae) ＡＴＣＣＮｏ．１５２４８を、抽出を繰り
返した以外は、実施例２に記載したようにして調製し；
カンディーダ・シャタビー(Candida schtavii) ＡＴＣ
Ｃ Ｎｏ．２４４０９を以下に示すようにして調製し
た。
ラロンの還元 当業者であれば理解できるであろうが、主題の還元に使
用される表３に列挙した微生物について、ゲオトリキュ
ーム カンディダム(Geotrichum candidum)ＡＴＣＣ
Ｎｏ．６２４０１、モルティエレラ・イサベリナ(Morti
erella isabellina) ＡＴＣＣ Ｎｏ．３８０６３、モ
ルティエレラ・ビナセア(Mortierellavinacea) ＡＴＣ
Ｃ Ｎｏ．０９５１５、ペニシリウム・ノタツム(Penic
illium notatum) ＡＴＣＣ Ｎｏ．３６７４０、ブラ
ストシゾマイセス・カピタツス(Blastoschizomyces cap
itatus) ＡＴＣＣ Ｎｏ．２８５７５、モノスポリウ
ム・オリバセウム・ブイ・メージャー(Monosporium oli
vaceum v. major) ＡＴＣＣ Ｎｏ．３６３００、オウ
レオバシディウム・プルランス(Aureobasidium pullula
ns) ＡＴＣＣ Ｎｏ．１６６２３、ピッツィア・ファ
ビアニ(Pichia fabianii) ＡＴＣＣ Ｎｏ．１６７５
５およびストレプトマイセス・リモスス・エスエス・リ
モスス(Streptomyces rimosus ss. rimosus) ＡＴＣＣ
Ｎｏ．１０９７０を実施例２におけるようにして調製
し；ゲオトリキューム・カンディダム(Geotrichum cand
idum) ＡＴＣＣ Ｎｏ．３４６１４、モルティエレラ
・イサベリナ(Mortierella isabellina) ＡＴＣＣ Ｎ
ｏ．４２６１３、デバリョマイセス・ポリモルファス(D
ebaryomyces polymorphus) ＡＴＣＣ Ｎｏ．２０２８
０、サッカロマイセス・セレビシアエ(Saccharomyces c
erevisiae) ＡＴＣＣＮｏ．１５２４８を、抽出を繰り
返した以外は、実施例２に記載したようにして調製し；
カンディーダ・シャタビー(Candida schtavii) ＡＴＣ
Ｃ Ｎｏ．２４４０９を以下に示すようにして調製し
た。
【００７９】カンディーダ・シャタビー(Candida schta
vii) ＡＴＣＣ Ｎｏ．２４４０９を調製し、本発明に
従い、以下のように使用した：金属囲いを有する１６×
１２５mmガラスチューブに、約２．５mlの滅菌生育培地
（約２０g/lのデキストロース、約５g/lの栄養大豆粉
（nutrisoy flour）、約５g/lの酵母エキス、約５g/lの
ＮａＣｌおよび約５g/lのＫ2ＨＰＯ4；ｐＨは、Ｈ2ＳＯ
4で約７．０に調整した）を加え、続いて、その培養
に、約２５gのTweenR 80、約１００gのグリセロールお
よび約２５０mlの蒸留水の滅菌濾過した溶液約０．１ml
を加えた。次に、カンディーダ・シャタビー(Candida s
chtavii) ＡＴＣＣ Ｎｏ．２４４０９の約１７％凍結
グリセロール株の約２５μlをその培養に接種した。そ
の培養を、約２９℃で、約２１０rpmで振盪しつつ、生
育させた。約４８時間後、ラセミのテトラロン（約１０
０％のエタノール中約５mg/mlで式（ＩＶ）および式
（Ｖ）で表される化合物を含む式（Ｉ）で表される化合
物）の約５０μlの株溶液（約１００％エタノール中約
５mg/ml；最終濃度約１００μg/ml）をその培養に加え
た。
vii) ＡＴＣＣ Ｎｏ．２４４０９を調製し、本発明に
従い、以下のように使用した：金属囲いを有する１６×
１２５mmガラスチューブに、約２．５mlの滅菌生育培地
（約２０g/lのデキストロース、約５g/lの栄養大豆粉
（nutrisoy flour）、約５g/lの酵母エキス、約５g/lの
ＮａＣｌおよび約５g/lのＫ2ＨＰＯ4；ｐＨは、Ｈ2ＳＯ
4で約７．０に調整した）を加え、続いて、その培養
に、約２５gのTweenR 80、約１００gのグリセロールお
よび約２５０mlの蒸留水の滅菌濾過した溶液約０．１ml
を加えた。次に、カンディーダ・シャタビー(Candida s
chtavii) ＡＴＣＣ Ｎｏ．２４４０９の約１７％凍結
グリセロール株の約２５μlをその培養に接種した。そ
の培養を、約２９℃で、約２１０rpmで振盪しつつ、生
育させた。約４８時間後、ラセミのテトラロン（約１０
０％のエタノール中約５mg/mlで式（ＩＶ）および式
（Ｖ）で表される化合物を含む式（Ｉ）で表される化合
物）の約５０μlの株溶液（約１００％エタノール中約
５mg/ml；最終濃度約１００μg/ml）をその培養に加え
た。
【００８０】さらに４日後、その培養菌の発酵培養液
（約２．６ml）を等体積の酢酸エチル（ニート）で抽出
し、培養液を撹拌し、ついで、約２，０００rpmで（Ｉ
ＥＣR Centrifuge）で遠心分離した。抽出を繰り返し
た。抽出物を、水浴中約５０℃で、窒素下、乾燥させ
た。ついで、抽出物を約１mlのエタノールに再懸濁さ
せ、再懸濁させた抽出物の約５μlを、ＨＰＬＣカラ
ム：Chiralcel OD column (4.6 ×250mm, Diacel）と対
をなすChiralcel OD guard column (4.6 × 50 mm, Dia
cel Chemical Industiries, LTD.）に注入することによ
って分析した。注入された再懸濁抽出物内に含まれる化
合物は、移動相（ヘキサン：イソプロパノール，９５：
５）で約０．９ml／分で均等に分離され、抽出物に含ま
れる化合物は、２１０nmに設定された996 PDA検出器（W
atersR)を使用して検出した。
（約２．６ml）を等体積の酢酸エチル（ニート）で抽出
し、培養液を撹拌し、ついで、約２，０００rpmで（Ｉ
ＥＣR Centrifuge）で遠心分離した。抽出を繰り返し
た。抽出物を、水浴中約５０℃で、窒素下、乾燥させ
た。ついで、抽出物を約１mlのエタノールに再懸濁さ
せ、再懸濁させた抽出物の約５μlを、ＨＰＬＣカラ
ム：Chiralcel OD column (4.6 ×250mm, Diacel）と対
をなすChiralcel OD guard column (4.6 × 50 mm, Dia
cel Chemical Industiries, LTD.）に注入することによ
って分析した。注入された再懸濁抽出物内に含まれる化
合物は、移動相（ヘキサン：イソプロパノール，９５：
５）で約０．９ml／分で均等に分離され、抽出物に含ま
れる化合物は、２１０nmに設定された996 PDA検出器（W
atersR)を使用して検出した。
【００８１】表３に報告されたキラルなＨＰＬＣ（実施
例１および２におけるようにして行った。）データによ
って示されるように、以下の表３に列挙した各微生物
は、（４Ｓ）テトラロンよりも多量の（４Ｒ）テトラロ
ンを立体特異的に還元し、概して、未反応の（４Ｒ）テ
トラロンに対し、未反応のままの残された（４Ｓ）テト
ラロンを少なくとも約２倍より多い比で生成した。
例１および２におけるようにして行った。）データによ
って示されるように、以下の表３に列挙した各微生物
は、（４Ｓ）テトラロンよりも多量の（４Ｒ）テトラロ
ンを立体特異的に還元し、概して、未反応の（４Ｒ）テ
トラロンに対し、未反応のままの残された（４Ｓ）テト
ラロンを少なくとも約２倍より多い比で生成した。
【００８２】
【表３】 表３のデータによって示されるように、無傷なモノスポ
リウム・オリバセウム・ブイ・メージャー(Monosporium
olivaceum v. major) ＡＴＣＣ Ｎｏ．３６３００
は、（４Ｓ）テトラロンに対し、実質的に多量の（４
Ｒ）テトラロンを還元し、そのようなものとして、主題
の方法に使用するのに好ましい微生物であるが、それに
もかかわらず、（４Ｒ）テトラロンおよび（４Ｓ）テト
ラロンの望ましくない分解もまたこの培養菌について報
告されていることを見落としてはならない。この望まし
くない分解は、例えば、無傷な微生物に含まれるその他
の酵素によるものでありうる。したがって、本明細書で
提供した記載により、当業者であれば理解できるであろ
うが、無傷なモノスポリウム・オリバセウム・ブイ・メ
ージャー(Monosporium olivaceum v. major) ＡＴＣＣ
Ｎｏ．３６３００に対し、モノスポリウム・オリバセ
ウム・ブイ・メージャー(Monosporium olivaceumv. maj
or) ＡＴＣＣ Ｎｏ．３６３００から単離した酵素を
使用することが好ましい。
リウム・オリバセウム・ブイ・メージャー(Monosporium
olivaceum v. major) ＡＴＣＣ Ｎｏ．３６３００
は、（４Ｓ）テトラロンに対し、実質的に多量の（４
Ｒ）テトラロンを還元し、そのようなものとして、主題
の方法に使用するのに好ましい微生物であるが、それに
もかかわらず、（４Ｒ）テトラロンおよび（４Ｓ）テト
ラロンの望ましくない分解もまたこの培養菌について報
告されていることを見落としてはならない。この望まし
くない分解は、例えば、無傷な微生物に含まれるその他
の酵素によるものでありうる。したがって、本明細書で
提供した記載により、当業者であれば理解できるであろ
うが、無傷なモノスポリウム・オリバセウム・ブイ・メ
ージャー(Monosporium olivaceum v. major) ＡＴＣＣ
Ｎｏ．３６３００に対し、モノスポリウム・オリバセ
ウム・ブイ・メージャー(Monosporium olivaceumv. maj
or) ＡＴＣＣ Ｎｏ．３６３００から単離した酵素を
使用することが好ましい。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:825） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:72） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:84） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:59） (72)発明者 スーザン・ジェーン・トゥルーズデル アメリカ合衆国ロードアイランド州02888, ウォーウィック，メットカーフ・ストリー ト 40 (72)発明者 ジョン・ウィン・ウォン アメリカ合衆国コネチカット州06333，イ ースト・ライム，スプリング・ロック・ロ ード 46
Claims (15)
- 【請求項１】 式（Ｉ）で表される化合物を式（ＩＩ）
および式（ＩＩＩ）で表される化合物へと微生物を使用
して立体選択的に還元するための方法であって、 【化１】 式（Ｉ）で表される化合物を、微生物から得られる酵素
およびその酵素についての補因子を含む前記還元を達成
することのできる酵素還元システムと接触させ；式（Ｉ
ＩＩ）で表される化合物よりも多量の式（ＩＩ）で表さ
れる化合物を生成するのに十分な条件下で、生じた混合
物をインキュベートし、かくして、未反応の式（ＩＶ）
で表される化合物よりも多量の未反応の式（Ｖ）で表さ
れる化合物を残すことを含み；前記微生物が、ハンセヌ
ラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha) ＡＴＣＣ
Ｎｏ．２６０１２、ハンセヌラ・ポリモルファ(Hanse
nula polymorpha) ＡＴＣＣ Ｎｏ．７４４４９、アビ
シディア・コエルレア(Absidia coerulea) ＡＴＣＣ
Ｎｏ．２０１３７、ゲオトリキューム・カンディダム(G
eotrichum candidum) ＡＴＣＣ Ｎｏ．３４６１４、
ゲオトリキューム カンディダム(Geotrichum candidu
m) ＡＴＣＣ Ｎｏ．６２４０１、モルティエレラ・イ
サベリナ(Mortierella isabellina) ＡＴＣＣ Ｎｏ．
４２６１３、モルティエレラ・イサベリナ(Mortierella
isabellina) ＡＴＣＣ Ｎｏ．３８０６３、モルティ
エレラ・ビナセア(Mortierella vinacea) ＡＴＣＣ
Ｎｏ．０９５１５、ペニシリウム・ノタツム(Penicilli
um notatum) ＡＴＣＣ Ｎｏ．３６７４０、ブラスト
シゾマイセス・カピタツス(Blastoschizomyces capitat
us) ＡＴＣＣ Ｎｏ．２８５７５、モノスポリウム・
オリバセウム・ブイ・メージャー(Monosporiumolivaceu
m v. major) ＡＴＣＣ Ｎｏ．３６３００、オウレオ
バシディウム・プルランス(Aureobasidium pullulans)
ＡＴＣＣ Ｎｏ．１６６２３、デバリョマイセス・ポ
リモルファス(Debaryomyces polymorphus) ＡＴＣＣ
Ｎｏ．２０２８０、サッカロマイセス・セレビシアエ(S
accharomyces cerevisiae) ＡＴＣＣ Ｎｏ．１５２４
８、カンディーダ・シャタビー(Candida schtavii) Ａ
ＴＣＣ Ｎｏ．２４４０９、ピッツィア・ファビアニ(P
ichia fabianii) ＡＴＣＣ Ｎｏ．１６７５５および
ストレプトマイセス・リモスス・エスエス・リモスス(S
treptomyces rimosus ss. rimosus) ＡＴＣＣ Ｎｏ．
１０９７０ならびに前記還元を達成しうるそれらの変異
体からなる群より選択される方法。 - 【請求項２】 式（Ｖ）で表される化合物が、式（Ｉ
Ｉ）、式（ＩＩＩ）および式（ＩＶ）で表される化合物
から分離される、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 前記分離が、クロマトグラフィーによっ
て行われる、請求項２に記載の方法。 - 【請求項４】 前記分離が、結晶化によって行われる、
請求項２に記載の方法。 - 【請求項５】 式（ＩＩ）で表される前記化合物が、式
（ＩＩＩ）および式（ＩＶ）で表される前記化合物から
分離される、請求項２に記載の方法。 - 【請求項６】 式（ＩＩ）で表される前記分離された化
合物が、式（ＩＩ）で表される前記分離された化合物を
酸化し、その酸化された化合物を式（Ｉ）で表される前
記化合物へとラセミ化することによって式（Ｉ）で表さ
れる化合物へとリサイクルされる、請求項５に記載の方
法。 - 【請求項７】 前記ラセミ化が、前記酸化された化合物
を塩基と反応させることを含む、請求項６に記載の方
法。 - 【請求項８】 式（Ｉ）で表される前記化合物が、請求
項６に記載したようにして製造される、請求項１に記載
の方法。 - 【請求項９】 前記酵素還元システムの前記酵素が固定
化される、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１０】 前記酵素還元システムが溶剤中にあ
る、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１１】 前記溶剤が、容易に感知できる有機溶
剤である、請求項１０に記載の方法。 - 【請求項１２】 前記接触が、式（Ｉ）で表される前記
化合物を前記溶剤に添加することによる、請求項１に記
載の方法。 - 【請求項１３】 前記酵素還元システムを含む前記酵素
が、前記ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymo
rpha） ＡＴＣＣ Ｎｏ．２６０１２もしくは前記ハン
セヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha） ＡＴ
ＣＣ Ｎｏ．７４４４９または前記それらの変異体から
得られる、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１４】 前記酵素還元システムを含む前記酵素
が、前記アビシディア・コエルレア（Absidia coerule
a） ＡＴＣＣ Ｎｏ．２０１３７または前記その変異
体から得られる、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１５】 前記酵素還元システムを含む前記酵素
が、前記モノスポリウム・オリバセウム・ブイ・メージ
ャー（Monosporium olivaceum v. major）ＡＴＣＣ Ｎ
ｏ．３６３００または前記その変異体から得られる、請
求項１に記載の方法。
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-
1999
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