ES2264244T3 - Reduccion estereoselectiva microbiana de tetralona racemica. - Google Patents
Reduccion estereoselectiva microbiana de tetralona racemica.Info
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Abstract
La presente invención se refiere a procedimientos para llevar a cabo la siguiente reducción estereoselectiva microbiana de una tetralona racémica, que comprende: poner en contacto un compuesto de fórmula (I) con un microorganismo, o un sistema enzimático de reducción capaz de efectuar la reducción en cuestión que comprende una enzima derivada de dicho microorganismo y un cofactor para dicha enzima e incubar la mezcla resultante en condiciones suficiente para producir el (4R) tetralol de fórmula (II) y dejar sin apenas reaccionar la (4S) tetralona de fórmula (V) o "tetralona quiral". La tetralona quiral se puede utilizar en la síntesis de sertralina. El procedimiento en cuestión comprende también, opcionalmente, la separación de la (4S) tetralona de fórmula (V) del (4R) tetralol de fórmula (II). El (4R) tetralol se puede reciclar para producir el compuesto de fórmula (I) y el procedimiento en cuestión se puede repetir para dar como resultado mayor cantidad de la (4S) tetralona de fórmula (V).
Description
Reducción estereoselectiva microbiana de
tetralona racémica.
La presente invención se refiere a nuevos
procedimientos para la preparación del enantiómero (4S) de
4-(3,4-diclorofenil)-3,4-dihidro-1(2H)-naftalenona
(denominado aquí igualmente más adelante como "tetralona
quiral" o "(4S) tetralona") y, más específicamente, se
refiere a la reducción microbiana estereoselectiva de
4-(3,4-diclorofenil)-3,4-dihidro-1(2H)-naftalenona
racémica (denominada aquí igualmente más adelante como "tetralona
racémica") a tetralona quiral.
La tetralona quiral preparada mediante los
procedimientos de la presente invención puede hacerse reaccionar
además para preparar
cis-(1S)(4S)-N-metil-4-(3,4-diclorofenil)-1,2,3,4-tetrahidro-1-naftalenoamina
pura, comúnmente denominada como sertralina. La sertralina es bien
conocida por ser útil, por ejemplo, como agente antidepresivo y
anoréctico, y en el tratamiento de dependencias químicas, trastornos
relacionados con la ansiedad, eyaculación prematura, cáncer e
infarto post-miocardial.
Son conocidos en la técnica procedimientos para
la preparación de sertralina, tales como, por ejemplo, los
descritos en las Patentes de EE.UU. Nos. 4.536.518; 4.777.288;
4.839.104; 4.885.500; 4.940.731; 4.962.128; 5.082.970; 5.130.338;
5.196.607; 5.248.699; 5.442.116; 5.463.126; 5.466.880; 5.597.826; y
5.750.794; y en el artículo de W.M. Welch, Jr., y otros, aparecido
en el Journal of Medicinal Chemistry, vol. 27, No. 11, pág.
1508, (1984).
Varias de las patentes anteriormente mencionadas
se refieren a la síntesis de mezclas de cis- y
trans-isómeros de
N-metil-4-(3,4-diclorofenil)-1,2,3,4-tetrahidro-1-naftalenoamina
racémica. Tal como se describe aquí, los cis- y
trans-isómeros, así como sus enantiómeros (S) y (R),
pueden separarse mediante procedimientos conocidos por los expertos
en la técnica, incluyendo, por ejemplo, la cristalización
fraccionada o la cromatografía.
Es igualmente conocida la forma de seleccionar
en primer lugar la quiralidad finalmente deseada en la síntesis de
sertralina. Por ejemplo, la Patente de EE.UU. No. 5.750.794
anteriormente mencionada, describe un procedimiento para la
preparación de tetralona quiral mediante la reacción de tetralona
racémica con un agente reductor de cetona asimétrico, para
proporcionar los cis- o trans-alcoholes
correspondientes, dependiendo de la quiralidad del reactivo
asimétrico usado y, a continuación, separación de los alcoholes y
oxidación de los (1S,4S) y/o (1R,4S) alcoholes a
(4S)-tetralona.
Es igualmente conocida en la técnica que los
compuestos quirales pueden sintetizarse usando microorganismos,
tales como, hongos, p. ej., levadura. Por ejemplo, es bien conocido
el uso de levaduras para reducir cetonas a alcoholes quirales. Sin
embargo, como es reconocido por los expertos en la técnica adecuada,
los rendimientos químicos y ópticos, p. ej., enantiómeros
particulares y cantidades de los mismos, de dichas reducciones
microbianas, varían, generalmente, de manera substancial,
dependiendo, por ejemplo, del microorganismo particular elegido,
así como de los substituyentes del material de partida.
La Patente de EE.U. No. 5.049.497, describe un
procedimiento para la resolución de un derivado racémico de
biciclo[4.2.0]octano mediante la puesta en contacto
del derivado con levadura de panadería bajo condiciones suficientes
para proporcionar una mezcla de una cetona y un alcohol de alta
pureza enatiomérica. Tal como se describe en ella, únicamente se
reduce un enantiómero de la cetona racémica sujeto para proporcionar
un alcohol.
La Patente de EE.UU. No. 5.580.764, describe un
procedimiento de reducción asimétrico que usa un microorganismo
intacto, o una preparación de célula rota del mismo, para convertir
una cetona cíclica al alcohol quiral correspondiente.
La Patente de EE.UU. No. 5.618.707, describe un
procedimiento para la reducción estereoselectiva de substratos
cetona mediante la adición de los substratos a un caldo de cultivo
de Zygosaccharomyces bailii ATCC (American Type Culture
Collection) No. 38924 o de Schizosaccharomyces octosporus
ATCC No. 2479, incubación de la mezcla resultante, y aislamiento
del compuesto hidroxi a través de medios convencionales tales como,
por ejemplo, extracción con disolventes orgánicos, adsorción en
resinas, o cromatografía para posterior uso como un compuesto
intermedio en la preparación de un agente de reducción del
colesterol en suero. El compuesto hidroxi aislado descrito en ella,
se analizó mediante cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC)
quiral, HPLC de fase inversa, o ambas. En concordancia con lo que
daría por supuesto un experto en la técnica adecuada, tal como se
describe en ella, muchos del gran número de microorganismos que
fueron investigados para determinar su capacidad para reducir el
grupo cetona del substrato seleccionado fueron incapaces de reducir
el grupo cetona con la especificidad o productividad deseada.
De manera inesperada, se ha encontrado ahora que
una gama de microorganismos, que incluyen hongos, p. ej.,
levaduras, y actinomicetos, reducen substancialmente de manera
estereoselectiva una tetralona racémica. Más específicamente, la
reducción microbiana estereoselectiva sujeto reduce selectivamente
la (4R) tetralona de la mezcla racémica mientras que deja
substancialmente sin reaccionar la (4S) tetralona. Más aún, el (4R)
tetralol no deseado producido mediante el procedimiento sujeto,
puede ser oxidado y, a continuación, racemizado a tetralona
racémica y el procedimiento sujeto repetido con el fin de
proporcionar incluso más (4S) tetralona. La (4S) tetralona
producida mediante el procedimiento sujeto puede usarse en la
síntesis de sertralina.
Todos los documentos aquí citados, incluyendo
los anteriores, son incorporados como referencia aquí en su
totalidad.
La presente invención se refiere a la reducción
microbiológica de grupos carbonilo que comprende la puesta en
contacto de un compuesto cetona, la tetralona racémica de fórmula
(I), con un microorganismo, o un sistema de reducción de enzima
capaz de llevar a cabo la reducción sujeto que comprende una enzima
derivada a partir de dicho microorganismo y un
co-factor para dicha enzima, y la incubación de la
mezcla resultante bajo condiciones adecuadas de manera que puede
formarse un compuesto que tiene un grupo hidroxilo, específicamente,
el (4R) tetralol de fórmula (II) y acumularse en el medio, y un
compuesto que tiene la estereoquímica deseada, la (4S) tetralona de
fórmula (V) más adelante, que permanece substancialmente sin
reaccionar. La (4S) tetralona de fórmula (V) más adelante, es
decir, la tetralona quiral, puede, a continuación, aislarse mediante
cualquier procedimiento adecuado, p. ej., cromatografía o
cristalización. Además, el (4R) tetralol de fórmula (II) puede
separarse a partir de los compuestos de las fórmulas (III)-(V),
oxidarse y racemizarse a tetralona racémica y la reducción
microbiana estereoselectiva sujeto repetirse para dar como resultado
más aún de la cetona quiral deseada.
De acuerdo con ello, la presente invención
proporciona procedimientos para llevar a cabo la reducción
microbiana estereoespecífica siguiente:
que comprende: la puesta en
contacto de un compuesto de fórmula (I) con un microorganismo, o un
sistema de reducción de enzima capaz de llevar a cabo la reducción
sujeto que comprende una enzima derivada a partir de dicho
microorganismo y un co-factor para dicha enzima, y
la incubación de la mezcla resultante bajo condiciones suficientes
para proporcionar más del compuesto de fórmula (II) que del
compuesto de fórmula (III), dando lugar, de esta forma, a más
compuesto de fórmula (V) sin reaccionar que del compuesto de fórmula
(IV) sin
reaccionar.
La reacción estereoespecífica sujeto puede
igualmente representarse mediante:
que comprende: la puesta en
contacto de un compuesto de fórmula (I) con un microorganismo, o un
sistema de reducción de enzima capaz de llevar a cabo la reducción
sujeto que comprende una enzima derivada a partir de dicho
microorganismo y un co-factor para dicha enzima, y
la incubación de la mezcla resultante bajo condiciones suficientes
para proporcionar el (4R) tetralol de fórmula (II) y dejar
substancialmente sin reaccionar la (4S) tetralona de fórmula
(V).
La reducción estereoselectiva comprende
opcionalmente además la separación de la (4S) tetralona de fórmula
(V) del (4R) tetralol de fórmula (II). El (4R) tetralol puede, a
continuación, oxidarse para producir la (4R) tetralona, la cual, a
continuación, se hace reaccionar, p. ej., con un base, para
producir tetralona racémica de fórmula (I) y la reducción
microbiana estereoselectiva sujeto puede repetirse para dar como
resultado más aún de la (4S) tetralona deseada de fórmula (V), es
decir, el (4S) enantiómero de la tetralona racémica de fórmula
(I).
La presente invención proporciona procedimientos
que comprenden la reducción microbiana estereoselectiva de un
compuesto de fórmula (I) a un compuesto de fórmula (II), mediante:
la puesta en contacto de un compuesto de fórmula (I) con un
microorganismo, o un sistema de reducción de enzima capaz de llevar
a cabo la reducción sujeto que comprende una enzima derivada a
partir de dicho microorganismo y un co-factor para
dicha enzima, y la incubación de la mezcla resultante bajo
condiciones suficientes para proporcionar un compuesto de fórmula
(II), con lo cual, permanece sin reaccionar substancialmente más del
compuesto de fórmula (V) que del compuesto de fórmula (IV) y se
produce substancialmente más del compuesto de fórmula (II) que del
compuesto de fórmula (III).
En una realización preferida, la puesta en
contacto del compuesto de fórmula (I) es con un sistema de reducción
de enzima. En otra realización preferida, la puesta en contacto del
compuesto de fórmula (I) es con un sistema de reducción de enzima
en el que la enzima está inmovilizada. En una realización
particularmente preferida, la puesta en contacto del compuesto de
fórmula (I) es con un sistema de reducción de enzima derivado a
partir de Hansenula polymorpha ATCC No. 26012.
En otra realización preferida, el microorganismo
es una preparación de célula rota del mismo. En otra realización
aún preferida, el microorganismo es una preparación enzimática en
polvo en acetona del mismo.
En una realización especialmente preferida de la
presente invención, se usa un microorganismo intacto. En una
realización preferida en donde el microorganismo es un
microorganismo intacto, el compuesto de fórmula (I) se pone en
contacto con un medio de fermentación, caldo de cultivo, o
disolvente, que comprende el microorganismo. En otra realización
preferida en donde el microorganismo es un microorganismo intacto,
el compuesto de fórmula (I) se pone en contacto con microorganismo
intacto lavado. En otra realización aún preferida en donde el
microorganismo está intacto, el compuesto de fórmula (I) se pone en
contacto con microorganismo intacto inmovilizado.
En una realización especialmente preferida de la
presente invención, el microorganismo es un microorganismo intacto
que se desarrolla en un medio de fermentación y la puesta en
contacto se produce mediante la adición del compuesto de la fórmula
(I) al mismo.
En otra realización especialmente preferida de
la presente invención, el microorganismo es un microorganismo
intacto que se desarrolla en un medio de desarrollo durante
aproximadamente cuarenta y ocho horas, y la puesta en contacto se
produce en dicho medio de desarrollo mediante la adición del
compuesto de la fórmula (I) al mismo, y la incubación es durante
aproximadamente cinco días.
En otra realización preferida de la presente
invención, el microorganismo es un hongo, p. ej., una levadura, o
un actinomiceto, o un mutante del mismo que es capaz de realizar la
reducción estereoselectiva.
En otra realización aún preferida de la presente
invención, el microorganismo es un hongo. En otra realización
todavía preferida de la presente invención en la que el
microorganismo es un hongo, el hongo es Absidia coerulea
ATCC No. 20137.
En una realización particularmente preferida de
la presente invención, el microorganismo es una levadura. En una
realización especialmente preferida de la presente invención en la
que el microorganismo es una levadura, la levadura es Hansenula
polymorpha ATCC No. 26012, también depositada como ATCC No.
74449.
Cuando la Hansenula polymorpha ATCC No.
26012, también depositada como ATCC No. 74449, se usa como el
microorganismo, la reducción microbiana estereoselectiva sujeto
reduce de manera apreciable únicamente un enantiómero del compuesto
de fórmula (I), proporcionando el alcohol correspondiente, es decir,
el compuesto de fórmula (II), mientras que deja al otro enantiómero
del compuesto de fórmula (I), es decir, el compuesto de fórmula (V),
substancialmente sin reaccionar.
Tal como se ha expuesto anteriormente, los
procedimientos de la presente invención incluyen además
opcionalmente la separación, p. ej., llevada a cabo usando
cristalización o cromatografía, del compuesto de fórmula (V) a
partir de los compuestos de fórmulas (II)-(IV), y el uso de dicho
compuesto separado de fórmula (V) en la síntesis de sertralina
usando cualquiera de los procedimientos conocidos para ello.
Igualmente, tal como se ha expuesto
anteriormente, se prefiere oxidar el (4R) tetralol aislado de
fórmula (II) a la (4R) tetralona de fórmula (IV). A continuación,
se prefiere además racemizar, preferiblemente mediante reacción de
la (4R) tetralona con una base, la (4R) tetralona de fórmula (IV) a
la tetralona racémica de fórmula (I). La oxidación y racemización
recicla el (4R) tetralol no deseado para otra ronda de reducción
microbiana estereoselectiva de acuerdo con los procedimientos de la
presente invención. El reciclado del (4R) tetralol no deseado
incrementa la cantidad de la (4S) tetralona deseada y disminuye la
cantidad de (4R) tetralol no deseada descartada. La oxidación y la
racemización del producto oxidado puede llevarse a cabo usando
cualquiera de los procedimientos conocidos para ello.
Los expertos en la técnica entenderán
completamente los términos aquí usados para describir la presente
invención; no obstante, los términos siguientes usados aquí, son
tal como se describen inmediatamente a continuación.
"Co-factor" significa
cualquier co-factor adecuado que comprende el
sistema de reducción de enzima tal como, por ejemplo, NADH, NADPH,
FADH, y/o PQQ, o cualquier co-factor adecuado que se
produzca con la enzima en el microorganismo.
"Sistema de reducción de enzima" significa
una enzima oxidoreductasa microbiana adecuada y la forma reducida
de un co-factor para la enzima oxidoreductasa, en
donde el co-factor puede derivar a partir del
microorganismo seleccionado o puede proceder de cualquier fuente
adecuada. La enzima que comprende el sistema de reducción de enzima
puede estar en forma libre o inmovilizada, p. ej., en una columna o
unida a una esférula.
"Reducción microbiana" significa la
reducción estereoslectiva de la presente invención tal como se lleva
a cabo mediante el sistema de reducción de enzima, la reductasa
microbiana que comprende el sistema de reducción de enzima, el
microorganismo intacto, o cualquier preparación del mismo, y
similares.
"Microorganismo" incluye cualquier
microorganismo intacto o preparación a partir del mismo, incluyendo,
por ejemplo, una preparación de célula rota del microorganismo; una
preparación deshidratada del microorganismo, p. ej., una preparación
enzimática en polvo en acetona; microorganismo lavado libre de, p.
ej., medio de fermentación, caldo de cultivo, y similares;
microorganismo inmovilizado, p. ej., en una columna, unido a
esférulas, y similares.
Los procedimientos proporcionados por la
presente invención comprenden la reducción microbiana
estereoselectiva de un compuesto de fórmula (I) a un compuesto de
fórmula (II):
mediante la puesta en contacto de
un compuesto de fórmula (I) con un microorganismo, o un sistema de
reducción de enzima capaz de llevar a cabo la reducción sujeto que
comprende una enzima derivada a partir de dicho microorganismo y un
co-factor para dicha enzima, y la incubación de la
mezcla resultante bajo condiciones suficientes para proporcionar un
compuesto de fórmula (II), mediante el cual permanece
substancialmente más del compuesto de fórmula (V) sin reducir que
del compuesto de fórmula (IV) y se produce substancialmente más del
compuesto de fórmula (II) que del compuesto de fórmula
(III).
Tal como darían por supuesto los expertos en la
técnica, el compuesto de fórmula (I), tetralona racémica, es una
mezcla de (4S) tetralona y (4R) tetralona tal como se muestra a
continuación:
Los compuestos, o más específicamente, los
tetraloles de fórmula (II) son:
\vskip1.000000\baselineskip
Los compuestos, o más específicamente, los
tetraloles de fórmula (III) son:
Los compuestos de fórmulas (II) y (III) se
encuentran descritos y reivindicados en la Patente de EE.UU. No.
5.750.794 anteriormente mencionada.
El compuesto deseado de fórmula (V) puede
aislarse tal como se describe más adelante a partir de los
compuestos no deseados de fórmula (II), y cualquiera de los
compuestos de fórmulas (III) o (IV) que pueden haber sido
producidos o han permanecido sin reaccionar, respectivamente,
dependiendo, p. ej., del microorganismo seleccionado y las
condiciones de incubación.
Los compuestos de fórmula (II) pueden
convertirse a un compuesto de fórmula (I), p. ej., mediante
oxidación y racemización, y pasar a la reducción microbiana
estereoselectiva sujeto, dando como resultado otra cantidad aún de
la (4S) tetralona de fórmula (V).
El procedimiento de la presente invención se
lleva a cabo fácilmente. De acuerdo con ello, el microorganismo es
o bien fermentado (microorganismo intacto) o bien incubado
(preparación de célula rota, preparación deshidratada, o cualquier
otra preparación adecuada del microorganismo) en la presencia de la
tetralona racémica, representada por la fórmula (I), para modificar
la tetralona racémica, y más particularmente, para reducir el (4R)
enantiómero no deseado de la cetona racémica a su alcohol
correspondiente, representado por la fórmula (II), mientras que se
deja el (4S) enantiómero deseado, representado por la fórmula (V),
substancialmente sin reaccionar, dando como resultado, de esta
forma, en una etapa, el (4S) enantiómero enriquecido ópticamente. A
continuación, el (4S) enantiómero puede hacerse reaccionar
adicionalmente mediante procedimientos bien conocidos por los
expertos en la técnica adecuada, tales como los descritos, por
ejemplo, en las Patentes de EE.UU. Nos. 4.536.518; 4.777.288;
4.839.104; 4.885.500; 4.940.731; 4.962.128; 5.082.970; 5.130.338;
5.196.607; 5.248.699; 5.442.116; 5.463.126; 5.466.880; 5.597.826; y
5.750.794 anteriormente mencionadas; y, en el artículo anteriormente
mencionado de W.M. Welch, Jr., y otros, para proporcionar
finalmente sertralina.
La actividad, procedimientos para ensayo de
actividades, dosificaciones, formas de dosificación, procedimientos
de administración y bases de información concernientes a la
sertralina han sido establecidos, por ejemplo, en las Patentes de
EE.UU. Nos. 4.536.518; 4.777.288; y 4.839.104 anteriormente
mencionadas; y, en el artículo anteriormente mencionado de W.M.
Welch, Jr. y otros.
Cualquier microorganismo adecuado puede usarse
en el procedimiento de la presente invención. Tal como se ha
descrito anteriormente, el microorganismo usado en el procedimiento
sujeto puede estar intacto, cualquier preparación adecuada del
mismo, p. ej., una preparación de célula rota del mismo, una
preparación deshidratada del mismo, y estar libre o inmovilizado.
Sin embargo, cuando se usa un microorganismo no intacto en la
presente invención tal como, por ejemplo, una preparación de célula
rota, p. ej., extracto de célula, preparación enzimática en polvo
en acetona, o la enzima derivada a partir del mismo, los expertos en
la técnica darían por supuesto que se encuentra igualmente incluido
un co-factor adecuado para la enzima.
Los expertos en la técnica entenderán a partir
de la descripción proporcionada aquí y de su conocimiento
relacionado, cómo preparar una preparación de célula rota adecuada
tal como la descrita, por ejemplo, por R.N. Patel y otros, en el
artículo "Oxidación de alcoholes secundarios a metil cetonas
mediante levaduras", publicado en Applied and Environmental
Microbiology, vol. 38, (no. 2), págs. 219-223,
(1979).
Los expertos en la técnica entenderán a partir
de la descripción proporcionada aquí y de su conocimiento
relacionado, cómo preparar una preparación enzimática en polvo en
acetona adecuada tal como la descrita, por ejemplo, por K. Nakamura
y otros, en el artículo "Reducción asimétrica de cetonas mediante
el polvo en acetona de Geotrichum candidum", publicado en
Tetrahedron Letters, vol. 37, (no.10), págs.
1626-1632, (1996).
Además, puede usarse igualmente en los
procedimientos sujeto una enzima (p. ej., una oxidoreductasa) de
cualquier microorganismo adecuado, y esta enzima puede ser aislada
a partir del microorganismo mediante cualquier procedimiento
adecuado conocido para los expertos en la técnica y, para el
microorganismo intacto, puede usarse en el procedimiento sujeto en
forma libre o inmovilizada. Los expertos en la técnica entenderán a
partir de la descripción proporcionada aquí y de su conocimiento
relacionado, cómo aislar y purificar la enzima del microorganismo
adecuado tal como está descrito de manera general, por ejemplo, en
los artículos de M. Wada y otros, "Purificación y caracterización
de carbonil reductasa dependiente de NADPH, implicada en la
reducción estereoselectiva de
4-cloro-3-oxobutanoato
de etilo, procedente de Candida magnoliae", publicado en
Biosci. Biotechnol. Biochem., vol. 62, (no. 2), págs.
280-285, (1988), P. Trost y otros, "Purificación y
propiedades de oxidoreductasa
NAP(P)H:(quinona-aceptor) de células
de remolacha azucarera", publicado en Eur. J. Biochem.,
vol. 234, págs. 452-458, (1995), K.M. Madyastha y
T.L. Gururaja, "Purificación y algunas de las propiedades de una
nueva deshidrogenasa de alcohol secundario procedente de
Alcaligenes eutrophus", publicado en Biochemical and
Biophysical Research Communications, vol. 211, (no. 2), págs.
540-546, (1995), O. Bortolini y otros, "Resolución
cinética de vic-dioles mediante diacetil reductasa
de Bacillus stearothermophilus", publicado en
Tetrahedron: Asymmetry, vol. 9, págs.
647-651, (1998), R.N. Patel y otros, "Reducción
microbiana estereoespecífica de
4,5-dihidro-4-(4-metoxifenil)-6-(trifluorometil-1H-1)-benzazepin-2-ona",
publicado en Enzyme Microb. Technol., vol. 3, págs.
906-912, (1991) y R.N. Patel y otros, "Oxidación
microbiana/enzimática estereoselectiva de
(exo,exo)-7-oxabiciclo[2.2.1]heptano-2,3-dimetanol
al lactol y lactona quiral correspondiente", publicado en
Enzyme Microb. Technol., vol. 14, págs.
778-784, (1992), y por las Patentes de EE.UU. Nos.
5.523.223 y la anteriormente mencionada 5.580.764.
Los microorganismos adecuados incluyen
Hansenula polymorpha ATCC No. 26012, Hansenula
polymorpha ATCC No. 74449, Absidia coerulea ATCC No.
20137, Geotrichum candidum ATCC No. 34614, Geotrichum
candidum ATCC No. 62401, Mortierella isabellina ATCC No.
42613, Mortierella isabellina ATCC No. 38063, Mortierella
vinacea ATCC No. 09515, Penicillium notatum ATCC No.
36740, Blastoschizomyces capitatus ATCC No. 28575,
Monosporium olivaceum v. major ATCC No. 36300,
Aureobasidium pullulans ATCC No. 16623, Debaryomyces
polymorphus ATCC No. 20280, Saccharomyces cerevisiae
ATCC No. 15248, Candida schatavii ATCC No. 24409, Pichia
fabianii ATCC No. 16755 y Streptomyces rimosus
ss.rimosus ATCC No. 10970; y mutantes de los mismos que son
conocidos o de otra forma obtenibles por los expertos en la técnica
adecuada y capaces, a pesar de su mutación, de llevar a cabo la
reducción microbiana estereoselectiva aquí descrita.
Los microorganismos intactos preferidos serán
aquellos que reducen substancialmente la (4R) tetralona al mismo
tiempo que dejan a la (4S) tetralona substancialmente sin reaccionar
cuando los productos reaccionados incluyen la reducción o cualquier
otra actividad intrínseca que pudiera degradar o impactar de
cualquier otra forma negativamente a la (4S) tetralona deseada en
cualquier fase del procedimiento sujeto. Tal como darían por
supuesto los expertos en la técnica a partir de la exposición aquí
dada, dicha reacción no deseada de la (4S) tetralona puede
prevenirse de manera substancial, por ejemplo, mediante el uso de la
enzima derivada a partir del microorganismo seleccionado frente al
microorganismo intacto.
Los microorganismos adecuados para uso en la
reducción microbiana estereoespecífica sujeto, pueden prepararse
mediante cualquier procedimiento adecuado conocido por los expertos
en la técnica adecuada. Un ejemplo de un procedimiento adecuado
para la preparación de un microorganismo a partir de una cepa
vendida comercialmente es el proporcionado a continuación. El
procedimiento proporcionado a continuación puede usarse para
cualquier microorganismo adecuado para uso en el procedimiento de
la presente invención, y los expertos en la técnica darían por
supuesto a partir de la descripción proporcionada aquí, cómo
modificar cualquier parte del procedimiento, p. ej., procedimiento
de preparación del microorganismo, intacto o preparación, p. ej.,
célula rota o deshidratada, del mismo, libre o inmovilizado;
procedimiento de preparación de una enzima adecuada derivada a
partir de dichos microorganismos; procedimiento de puesta en
contacto de la tetralona racémica con el microorganismo o la enzima
que comprende el sistema de reducción de enzima derivado a partir
del mismo; componentes y condiciones del medio de desarrollo, p.
ej-. temperatura, pH y similares; o condiciones de incubación; para
lograr el resultado deseado en cualquier procedimiento
particular.
Los expertos en la técnica entenderán a partir
de la descripción proporcionada aquí y de su conocimiento
relacionado, cómo preparar un microorganismo intacto inmovilizado
adecuado tal como se describe, por ejemplo, por A. Bauer y otros,
en el artículo "Preparaciones de célula entera inmovilizada en
alcohol polivinílico para biotransformación de nitrilos",
publicado en Biotechnology Letters, vol. 18, (no.3), págs.
343-348, (Marzo 1996).
Cualquier procedimiento adecuado de puesta en
contacto del compuesto de fórmula (I) con el microorganismo o
sistema de reducción de enzima, puede usarse en la presente
invención. El compuesto de fórmula (I) puede ponerse en contacto
con el microorganismo o el sistema de reducción de enzima en
cualquier orden adecuado. Por ejemplo, el compuesto de fórmula (I)
puede agregarse a un medio, tal como un caldo de cultivo, que
comprende el microorganismo, libre o inmovilizado, o alguna
combinación de los mismos; o el medio puede comprender el compuesto
de fórmula (I) y el microorganismo puede, a continuación, agregarse
a dicho medio; o el compuesto de fórmula (I) y el microorganismo
pueden agregarse conjuntamente a dicho medio; o el compuesto de
fórmula (I) puede agregarse a una preparación de célula rota del
mismo; o el compuesto de fórmula (I) puede agregarse a una
preparación deshidratada del microorganismo; o el compuesto de
fórmula (I) o el microorganismo o el sistema de reducción de enzima
puede agregarse a un disolvente adecuado que comprende el otro; y
similares. Los expertos en la técnica entenderán a partir de la
descripción proporcionada aquí, cómo modificar cualquier parte del
procedimiento sujeto según se desee.
Es especialmente preferido en la presente
invención que el microorganismo, o el sistema de reducción de
enzima, sea el derivado a partir de Hansenula polymorpha
ATCC No. 26012. Una muestra liofilizada de Hansenula
polymorpha ATCC No. 26012 (originalmente donada por D.W.
Levine) se depositó en la ATCC sita en el 10801 University
Boulevard, Manassas, Virginia, 20110-2209, U.S.A.,
bajo los términos del Tratado de Budapest el 26 de Junio de 1998. A
este cultivo recién depositado se le asignó el nuevo número de
depósito de ATCC No. 74449. De acuerdo con ello, es igualmente
especialmente preferido en la presente invención el que el
microorganismo sea Hansenula polymorpha ATCC No. 74449. Todas
las restricciones sobre la disponibilidad al público del cultivo de
microorganismo así depositado serán irrevocablemente derogadas con
la concesión de una patente a partir de la memoria descriptiva de
la presente invención.
Los cultivos de Hansenula polymorpha ATCC
No. 26012 pueden obtenerse del ATCC, y un ejemplo de un
procedimiento adecuado para su preparación a partir de dicha cepa
adquirida comercialmente se proporciona inmediatamente más
adelante. Un cultivo así obtenido se agrega a un medio de desarrollo
adecuado, y se incuba con agitación hasta que se produce el
desarrollo, ambas etapas tal como recocerían los expertos en la
técnica. El cultivo, así preparado, puede usarse para inocular
superficies de planos inclinados de agar, con porciones de estas
superficies de planos inclinados de agar congeladas como cepas
patrón. Como alternativa, pueden prepararse cultivos de cepas
líquidos a los cuales se agrega glicerol desde aproximadamente 10%
hasta aproximadamente 20%, los cuales, a continuación, se congelan
hasta aproximadamente -80ºC, preferiblemente en criotubos
pequeños.
Como darían por supuesto los expertos en la
técnica para cualquier microorganismo seleccionado, y tal como se
dispone específicamente aquí más adelante en los ejemplos para
Absidia coerulea ATCC No. 20137, y la Hansenula
polymorpha ATCC No. 26012 o ATCC No. 74449 especialmente
preferida, un procedimiento adecuado para la preparación del
microorganismo es como sigue: el microorganismo se inocula a partir
de un cultivo de cepa congelado tal como se ha descrito
anteriormente (aproximadamente una cepa en glicerol al 17%) dentro
de un matraz o un tubo de vidrio con un cierre de metal que
contiene un medio de desarrollo (conteniendo una parte alícuota
procedente de una solución estéril la cual incluye Tween® 80,
glicerol y agua destilada), cuya composición se describe con más
detalle más adelante. La fermentación se lleva a cabo a temperaturas
que varían desde aproximadamente 22ºC hasta aproximadamente 32ºC, y
preferiblemente a aproximadamente 29ºC, con agitación adecuada,
preferiblemente desde aproximadamente 200 rpm hasta aproximadamente
220 rpm, y lo más preferiblemente, a aproximadamente 210 rpm.
Cuando así se desee, el pH del medio de desarrollo puede mantenerse
mediante el uso de tampones adecuados incorporados dentro del medio
de fermentación y/o periódicamente ajustado mediante la adición de
base o ácido, según se requiera.
En la presente invención, puede usarse cualquier
duración adecuada de desarrollo del microorganismo, de puesta en
contacto del microorganismo con el compuesto de fórmula (I), y de
incubación del compuesto de fórmula (I) con el microorganismo. El
desarrollo adecuado del microorganismo puede lograrse, p. ej.,
dentro de aproximadamente 24 horas, al cabo de cuyo tiempo puede
agregarse al cultivo una parte alícuota adecuada de una solución de
tetralona racémica en un disolvente adecuado, preferiblemente
etanol. A continuación, la fermentación puede continuar durante, p.
ej., desde aproximadamente dos hasta aproximadamente seis días, y
preferiblemente, p. ej., durante aproximadamente cinco días, al
cabo de cuyo tiempo el caldo defermentación puede extraerse usando
cualquier procedimiento de extracción adecuado, mediante el cual, un
disolvente adecuado, tal como, por ejemplo, acetato de etilo, metil
isobutilcetona, metil etilcetona, cloruro de metileno, y similares,
preferiblemente acetato de etilo, elimina los componentes orgánicos
procedentes del caldo de fermentación. Después de extracción del
caldo de fermentación y de separación de las fases acuosa y
orgánica, los compuestos que comprenden el residuo orgánico pueden
determinarse usando cualquier procedimiento adecuado, tal como, por
ejemplo, cromatografía, preferiblemente, HPLC quiral.
En el procedimiento de la presente invención
puede usarse cualquier medio de desarrollo adecuado, y el medio de
desarrollo adecuado contendrá una fuente o fuentes de carbono
asimilable, nitrógeno asimilable y sales inorgánicas conteniendo
minerales esenciales. En general, como fuentes de carbono
asimilables pueden usarse muchos carbohidratos tales como, por
ejemplo, glucosa, maltosa, mannosa, sacarosa, almidón, glicerina,
jalea de mijo, melazas, soja, y similares. Las fuentes de nitrógeno
asimilable incluyen, por ejemplo, materiales tales como levadura e
hidrolizados de caseína, levadura primaria, extractos de levadura,
harina de semilla de algodón, sólidos de soja, gérmen de trigo,
extractos de carne, peptona, licor de maceración de cereales, y
sales de amonio. Los nutrientes de sales inorgánicas adecuados para
uso en el medio de cultivo de la presente invención, incluyen, por
ejemplo, las sales ordinarias que contienen sodio, hierro, magnesio,
potasio, cobalto, fosfato, y similares. Más particularmente, los
medios de desarrollo adecuados para uso en la presente invención
incluye, por ejemplo:
(a) dextrosa (aproximadamente 20 gramos (g)),
extracto de levadura (aproximadamente 5 g), harina de soja
(aproximadamente 5 g), NaCl (aproximadamente 5 g), K_{2}HPO_{4}
(aproximadamente 5 g), y H_{2}O destilada (aproximadamente 1
litro (L)), pH ajustado a pH aproximadamente 7,0 con H_{2}SO_{4}
(ac.);
(b) dextrina (aproximadamente 10 g), extracto de
carne de vaca (aproximadamente 3 g), ardamina pH (aproximadamente 5
g), NZ amina tipo E (aproximadamente 5 g), MgSO_{4}·7H_{2}O
(aproximadamente 0,5 g), KH_{2}PO_{4} (aproximadamente 0,37
g), CaCO_{3} (aproximadamente 0,5 g), y H_{2}O destilada
(aproximadamente 1 L), pH ajustado a pH aproximadamente 7,1 con HCl
(ac.), seguido de una segunda fase de glucosa (aproximadamente 10
g), Hy-Case SP® (aproximadamente 2 g), extracto de
carne de vaca (aproximadamente 1 g), licor de maceración de
cereales (aproximadamente 3 g), y H_{2}O destilada
(aproximadamente 1 L), pH ajustado a pH aproximadamente 7,0;
(c) glucosa (aproximadamente 10 g), licor de
maceración de cereales (aproximadamente 6 g), KH_{2}PO_{4}
(aproximadamente 3 g), CaCO_{3} (aproximadamente 3,5 g), aceite de
soja (bruto, aproximadamente 2,2 mililitros (ml)), extracto de
levadura (aproximadamente 2,5 g), y H_{2}O destilada
(aproximadamente 1 L), pH ajustado desde pH aproximadamente 7,0
hasta pH aproximadamente 7,3 con HCl (ac.);
(d) jarabe de malta (aproximadamente 20 g),
harina de soja (aproximadamente 5 g), caseína (aproximadamente 1
g), levadura seca (aproximadamente 1 g), NaCl (aproximadamente 5 g)
y H_{2}O destilada (aproximadamente 1 L);
(e) lactosa (aproximadamente 75 g), Pharmamedia®
(substituto del extracto de levadura, aproximadamente 40 g),
CaCO_{3} (aproximadamente 10 g), Na_{2}SO_{4} (aproximadamente
4 g), y H_{2}O destilada (aproximadamente 1 L);
(f) ISP #2 (véase, p. ej., página 460 del
Handbook of Microbial Media, por R.M. Atlas, editado por
L.C. Parks, CRC Press, Inc., 1993, ("Handbook"));
(g) ISP #3 (véase, p. ej., página 460 del
Handbook);
(h) ISP #4 (véase, p. ej., página 461 del
Handbook);
(i) ISP #5 (véanse, p. ej., páginas
461-462 del Handbook); y similares.
Un medio de desarrollo particularmente preferido
es 2X de (a) proporcionado anteriormente.
La referencia a tampones, medios, reactivos,
condiciones de puesta en contacto o cultivo, y similares,
particulares, no está destinada a ser limitativa, sino que debería
leerse como como que incluye todos dichos materiales relacionados
que los expertos normales en la técnica reconocerían como ser de
interés o valiosos en el contexto particular en el cual se ha
presentado aquí la exposición. Por ejemplo, frecuentemente es
posible substituir un sistema de tampón o medio de cultivo por
otro, de manera tal que se usa una vía diferente pero conocida para
alcanzar los mismos objetivos que aquellos a los cuales está
dirigido el uso de un procedimiento, material o composición
sugerido. Más aún, debería darse por entendido que la presente
invención incluye el aumento de escala del procedimiento sujeto
para fines comerciales.
Por ello, tal como darían por supuesto los
expertos normales en la técnica, la variación del medio de
desarrollo, las condiciones de fermentación, y/o la cantidad de
tetralona racémica, pueden alterarse con el fin de controlar el
rendimiento de los compuestos resultantes y sus proporciones
relativas de producción. En general, las técnicas usadas en una
presente invención se escogerán con respecto a la eficacia
industrial. El medio de desarrollo, condiciones de fermentación y
cantidades relativas de microorganismo, o sistema de reducción de
enzima, y tetralona racémica descritos aquí, son meramente
ilustrativos de la amplia variedad de medios, condiciones de
fermentación y cantidades de materiales de partida que pueden usarse
de manera adecuada en la presente invención, tal como reconocerían
los expertos en la técnica, no estando en ningún caso destinados a
ser limitativos.
En la presente invención, pueden usarse
cualquiera de los procedimientos adecuados para el aislamiento y/o
la purificación de cualquiera de los productos del procedimiento
sujeto, incluyendo la filtración, extracción, cristalización,
cromatografía de columna, cromatografía de capa fina, cromatografía
líquida de baja presión preparativa o HPLC, o cualquier combinación
adecuada de dichos procedimientos.
Además, un experto en la técnica reconocería que
el alcohol correspondiente no deseado de la (4R) tetralona, el
compuesto de fórmula (II), producido mediante el procedimiento aquí
descrito, puede ser reciclado, p. ej., oxidado y racemizado tal
como se ha expuesto aquí anteriormente, mediante cualquier
procedimiento conocido adecuado a una tetralona racémica de fórmula
(I), y los procedimientos de la presente invención repetidos dar
como resultado, una vez más, la (4S) tetralona deseada de fórmula
(V). La oxidación del (4R) tetralol a la (4R) cetona puede
realizarse mediante procedimientos conocidos por los expertos en la
técnica. La reacción de racemización puede realizarse de cualquier
manera adecuada, pero, generalmente, se realiza a una temperatura
de desde aproximadamente 0ºC hasta aproximadamente 100ºC,
preferiblemente desde aproximadamente 25ºC hasta aproximadamente
65ºC. La (4R) tetralona se hace reaccionar con una base a una
temperatura de desde aproximadamente 25ºC hasta aproximadamente
85ºC, preferiblemente desde aproximadamente 50ºc hasta
aproximadamente 65ºC. Las bases adecuadas para esta reacción de
racemización incluyen t-butóxido potásico, hidróxido
sódico, metóxido sódico e hidróxido potásico. Una base preferida es
t-butóxido potásico.
Los ejemplos detallados proporcionados más
adelante, muestran que una gama de microorganismos, incluyendo
hongos, p. ej., levaduras, y actinomicetos, reducen
estereoselectivamente la tetralona racémica, proporcionando la (4S)
tetralona deseada de fórmula (V), es decir, tetralona quiral, la
cual, a continuación, puede separarse de los compuestos no deseados
y hacerse reaccionar posteriormente de acuerdo con procedimientos
bien conocidos en la técnica para proporcionar sertralina.
La presente invención se ilustra mediante los
ejemplos siguientes. La descripción anterior y siguiente de la
presente invención y las diversas realizaciones no están destinadas
a ser limitativas de la invención, sino más bien ilustrativas de la
misma. Por ello, debe entenderse que la invención no está limitada a
los detalles específicos de estos ejemplos.
Se prepararon un cultivo de "control" (C1)
y un cultivo de "ensayo" (T1) tal como sigue: aproximadamente
2,5 ml de medio de desarrollo estéril (aproximadamente 40 g/l de
dextrosa, aproximadamente 10 g/l de harina nutrisoja,
aproximadamente 10 g/l de extracto de levadura, aproximadamente 10
g/l de NaCl y aproximadamente 10 g/l de K_{2}HPO_{4} con el pH
ajustado a aproximadamente 7,0 con H_{2}SO_{4}), se agregaron a
cada uno de dos tubos de vidrio de 16 x 125 mm conteniendo cada uno
un cierre de metal (C1, T1), seguido de la adición de
aproximadamente 0,2 ml de una solución A (aproximadamente 25 g de
Tween® 80, aproximadamente 100 g de glicerol y aproximadamente 250
ml de agua destilada, filtrada-esterilizada) a cada
uno de los dos cultivos.
Aproximadamente 25 \mul de aproximadamente una
cepa en glicerol congelada al 17% de Hansenula polymorpha
ATCC No. 26012, se inocularon dentro de T1. Los dos tubos de cultivo
se incubaron a aproximadamente 29ºC, con agitación a
aproximadamente 210 rpm. Después de aproximadamente 24 horas, se
agregaron a C1 y T1 aproximadamente 50 \mul de una solución de
cepa (aproximadamente 5 mg/ml en aproximadamente etanol al 100%,
concentración final de aproximadamente 100 \mug/ml) de una
tetralona racémica (compuesto de fórmula (I) que comprende los
compuestos de las fórmulas (IV) y (V), a aproximadamente 5 mg/ml en
etanol).
Después de aproximadamente cinco días, se agregó
un ml de NaCl (saturado) a cada uno de los dos tubos de cultivo. El
caldo de fermentación de cada cultivo del tubo (aproximadamente 3,6
ml) se extrajo con un volumen igual de acetato de etilo (puro): se
agregó el acetato de etilo, el cultivo del tubo se batió y, a
continuación, se centrifugó a aproximadamente 2.000 rpm (Centrífuga
IEC®, 300 Second Avenue, Needham Heights, Massachusetts 02194). La
capa de acetato de etilo se eliminó y la capa acuosa se extrajo una
segunda vez. Los extractos orgánicos combinados se secaron, bajo
nitrógeno, en un baño de agua a aproximadamente 50ºC.
Cada uno de los extractos, preparados tal como
se ha descrito anteriormente, se resuspendieron en aproximadamente
un ml de etanol, y aproximadamente 20 \mul de cada extracto
resuspendido se analizó mediante inyección sobre una columna HPLC:
columna de guarda Chiralcel OK (4,6 x 50 mm, Diacel Chemical
Industries, LTD., 730 Springdale Drive, P.O. Box 564, Exton,
Pennsylvania 19341) acoplada a una columna Chiralcel OK (4,6 x 250
mm, Daicel). Los compuestos contenidos dentro de cada extracto
resuspendido inyectado se separaron isocráticamente a
aproximadamente 0,8 ml por minuto en una fase móvil (etanol:acetato
de etilo, 85:15), y los compuestos que comprendían los extractos se
detectaron usando un detector 996 PDA (Waters®, 34 Maple Street,
Milford, Massachusetts 01757) fijado a 254 nm.
Tal como se ilustra mediante los datos para C1 y
T1 de la Tabla I más adelante, el análisis mediante HPLC quiral
muestra que la inclusión del microorganismo, es decir, Hansenula
polymorpha ATCC No. 26012, da como resultado una relación de
16:1 ((4S) tetralona de fórmula V) sin reaccionar: frente a (4R)
tetralona de fórmula (IV) sin reaccionar), lo cual ilustra
adicionalmente la estereoespecificidad del procedimiento de
reducción microbiano sujeto. Los resultados informados más adelante
están basados en la cantidad conocida de cada enantiómero agregado
(aproximadamente 50 \mug/ml de cada uno de los compuestos de las
fórmulas (IV) y (V)). Tal como se ha mencionado anteriormente, la
tetralona racémica de partida de fórmula (I) tenía una concentración
de aproximadamente 100 \mug/ml.
| Cultivo | 4S Tetralona (\mug/ml) | 4R Tetralona (\mug/ml) | 4S:4R |
| C1 | 42,63 | 43,04 | 1 |
| T1 | 37,92 | 2,37 | 16 |
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados procedentes del análisis quiral
muestran que el cultivo de la Hansenula polymorpha ATCC No.
26012 (T1) reduce substancialmente la (4R) tetralona, mientras que
deja substancialmente sin reaccionar la (4S) tetralona
(aproximadamente permanece el 4,7% de (4R) tetralona frente a
aproximadamente el 76% de la (4S) tetralona). La (4S) tetralona se
determinó que estaba presente en aproximadamente 88% ee ("por
ciento de cantidad de exceso enantiómerico") mediante dicha HPLC
quiral. Tal como igualmente se muestra mediante los datos de la
Tabla I, específicamente mediante la relación de (4S):(4R), es
decir, 16, substancialmente permanece más (4S) tetralona sin
reaccionar que (4R) tetralona.
De acuerdo con ello, la inclusión del
microorganismo intacto, es decir, Hansenula polymorpha ATCC
No. 26012, dio como resultado la reducción estereoespecífica de
substancialmente más de la (4R) tetralona de partida de fórmula
(IV) que la (4S) tetralona de partida de fórmula (V) ((4S):4R)), y
proporcionó en su mayor parte el (4R) tetralol de fórmula (II)
frente al (4S) tetralol de fórmula (III) (datos no mostrados). La
mayoría del (4R) tetralol proporcionado fue el (1S,4R) tetralol, y
la mayoría de la cantidad menor de (4S) tetralol proporcionado fue
el (1S,4S) tetralol.
Se prepararon un cultivo de "control" (C2)
y un cultivo de "ensayo" (T2) tal como sigue: aproximadamente
2,5 ml de medio de desarrollo estéril (aproximadamente 20 g/l de
dextrosa, aproximadamente 5 g/l de harina nutrisoja,
aproximadamente 5 g/l de extracto de levadura, aproximadamente 5 g/l
de NaCl y aproximadamente 5 g/l de K_{2}HPO_{4} con el pH
ajustado a aproximadamente 7,0 con H_{2}SO_{4}), se agregaron a
cada uno de dos tubos de vidrio de 16x125 mm conteniendo cada uno
un cierre de metal (C2, T2).
Aproximadamente 25 \mul de aproximadamente una
cepa en glicerol congelada al 17% de Absidia coerulea ATCC
No. 20137, se inocularon dentro de T2. Los dos tubos de cultivo se
incubaron a aproximadamente 29ºC, con agitación a aproximadamente
210 rpm. Después de aproximadamente 48 horas, se agregaron a C2 y T2
aproximadamente 50 \mul (aproximadamente 5 mg/ml en etanol,
concentración final de aproximadamente 100 \mug/ml) de una
tetralona racémica (tal como se ha descrito aquí en el Ejemplo I, a
aproximadamente 5 mg/ml en aproximadamente etanol al 100%).
Después de aproximadamente cinco días, se agregó
un ml de NaCl (saturado) a cada uno de los dos tubos de cultivo. El
caldo de fermentación de cada cultivo del tubo (aproximadamente 3,6
ml) se extrajo con aproximadamente 3 ml de acetato de etilo (puro):
se agregó el acetato de etilo, el cultivo del tubo se batió y, a
continuación, se centrifugó a aproximadamente 2.000 rpm (Centrífuga
IEC®). La capa de acetato de etilo se eliminó y la capa acuosa se
extrajo una segunda vez. Los extractos orgánicos combinados se
secaron, bajo nitrógeno, en un baño de agua a aproximadamente
50ºC.
Cada uno de los extractos, preparados tal como
se ha descrito anteriormente, se resuspendieron en aproximadamente
un ml de etanol, y aproximadamente 20 \mul de cada extracto
resuspendido se analizó mediante inyección sobre una columna HPLC:
columna de guarda Chiralcel OK (4,6x50 mm) acoplada a una columna
Chiralcel OK (4,6x250 mm). Los compuestos contenidos dentro de cada
extracto resuspendido inyectado se separaron isocráticamente a
aproximadamente 0,8 ml por minuto en una fase móvil (etanol:acetato
de etilo, 85:15), y los compuestos que comprendían los extractos se
detectaron usando un detector 996 PDA (Waters®) fijado a 254 nm.
Tal como se ilustra mediante los datos de HPLC
para C2 y T2 mostrados más adelante, la inclusión del
microorganismo, es decir, Absidia coerulea ATCC No. 20137,
dió como resultado la reducción estereoespecífica de más de la (4R)
tetralona de partida de fórmula (IV) que de la (4S) tetralona de
partida de fórmula (V).
Más específicamente, los resultados procedentes
del análisis quiral muestran que el cultivo de Absidia
coerulea ATCC No. 20137 reduce la (4R) tetralona, mientras que
deja substancialmente sin reaccionar la (4S) tetralona
(aproximadamente 13,6% de (4R) tetralona permanece sin reaccionar
frente a aproximadamente 40,5% de la (4S) tetralona). Se determinó
que la (4S) tetralona estaba presente en aproximadamente 50% ee
mediante dicha HPLC quiral.
Tal como se ilustra mediante los datos para C2 y
T2 de la Tabla II más adelante, el análisis mediante HPLC quiral
muestra que la inclusión del microorganismo, es decir, Absidia
coerulea ATCC No. 20137 (T2), da como resultado una relación
de al menos más del doble de la (4S) tetralona dejada sin reducir
frente a la (4R) tetralona sin reducir, lo cual evidencia
adicionalmente la estereoespecificidad del procedimiento de
reducción microbiano sujeto. Los resultados informados más adelante
están basados en la cantidad conocida de cada enantiómero agregado
(aproximadamente 50 \mug/ml de cada uno tal como se ha descrito
aquí en el Ejemplo I). Tal como se ha mencionado anteriormente, la
tetralona racémica de partida tenía una concentración de
aproximadamente 100 \mug/ml.
| Cultivo | 4S Tetralona (\mug/ml) | 4R Tetralona (\mug/ml) | 4S:4R |
| C2 | 39,53 | 39,47 | 1 |
| T2 | 20,24 | 6,81 | 3 |
Tal como darían por supuesto los expertos en la
técnica adecuada, para los microorganismos listados en la Tabla III
que han sido usados en la reducción sujeto, Geotrichum
candidum ATCC No. 62401, Mortierella isabellina ATCC No.
38063, Mortierella vinacea ATCC No. 09515, Penicillium
notatum ATCC No. 36740, Blastoschizomyces capitatus ATCC
No. 28575, Monosporium olivaceum v. major ATCC No.
36300, Aureobasidium pullulans ATCC No. 16623, Pichia
fabianii ATCC No. 16755 y Streptomyces rimosus ss.
rimosus ATCC No. 10970, se prepararon tal como se ha descrito
en el Ejemplo II; Geotrichum candidum ATCC No. 34614,
Mortierella isabellina ATCC No. 42613, Debaryomyces
polymorphus ATCC No. 20280 y Saccharomyces cerevisiae
ATCC No. 15248 se prepararon tal como se ha descrito en el Ejemplo
II excepto que la extracción se repitió; y Candida schatavii
ATCC No. 24409 se preparó tal como se proporciona a
continuación.
Candida schatavii ATCC No. 24409 se
preparó y usó de acuerdo con la presente invención tal como sigue:
aproximadamente 2,5 ml de medio de desarrollo estéril
(aproximadamente 20 g/l de dextrosa, aproximadamente 5 g/l de harina
nutrisoja, aproximadamente 5 g/l de extracto de levadura,
aproximadamente 5 g/l de NaCl y aproximadamente 5 g/l de
K_{2}HPO_{4,} con el pH ajustado a aproximadamente 7,0 con
H_{2}SO_{4}), se agregaron a un tubo de vidrio de 16x125 mm
conteniendo un cierre de metal, seguido de la adición de
aproximadamente 0,1 ml de una solución
filtrada-esterilizada de aproximadamente 25 g de de
Tween® 80, aproximadamente 100 g de glicerol y aproximadamente 250
ml de agua destilada al cultivo. A continuación, aproximadamente 25
\mul de aproximadamente una cepa en glicerol congelada al 17% de
Candida schatavii ATCC No. 24409 se inocularon dentro del
cultivo. El cultivo se desarrolló a aproximadamente 29ºC, con
agitación a aproximadamente 210 rpm. Después de aproximadamente 48
horas, se agregaron al cultivo aproximadamente 50 \mul de una
solución de cepa (aproximadamente 5 mg/ml en aproximadamente etanol
al 100%, concentración final de aproximadamente 100 \mug/ml) de
una tetralona racémica (compuesto de fórmula (I) que comprende los
compuestos de las fórmulas (IV) y (V), a aproximadamente 5 mg/ml en
etanol).
Después de un tiempo adicional de cuatro días,
el caldo de fermentación del cultivo (aproximadamente 2,6 ml) se
extrajo con un volumen igual de acetato de etilo (puro), el cultivo
se batió y, a continuación, se centrifugó a aproximadamente 2.000
rpm (Centrífuga IEC®). La extracción se repitió. Los extractos se
secaron, bajo nitrógeno, en un baño de agua a aproximadamente 50ºC.
A continuación, el extracto se resuspendió en aproximadamente un ml
de etanol, y aproximadamente 5 \mul del extracto resuspendido se
analizó mediante inyección sobre una columna HPLC: columna de
guarda Chiralcel OK (4,6x50 mm, Diacel Chemical Industries, LTD.)
acoplada a una columna Chiralcel OK (4,6x250 mm, Daicel). Los
compuestos contenidos dentro del extracto resuspendido inyectado se
separaron isocráticamente a aproximadamente 0,9 ml por minuto en una
fase móvil (hexano:isopropanol, 95:5), y los compuestos que
comprendían el extracto se detectaron usando un detector 996 PDA
(Waters®) fijado a 210 nm.
Tal como se muestra mediante la HPLC quiral
(realizada como en el Ejemplo I y II), los datos informados en la
Tabla III, cada uno de los microorganismos enumerados en la Tabla
III más adelante, redujo estereoespecíficamente más de la (4R)
tetralona que de la (4S) tetralona, y dio como resultado de manera
general una relación de al menos aproximadamente más del doble de
la (4S) tetralona dejada sin reaccionar frente a la (4R) tetralona
sin reaccionar.
| Cultivo | 4S Tetralona | 4R Tetralona | 4S:4R |
| ATCC No., Tipo organismo | (\mug/ml) | (\mug/ml) | |
| Geotrichum candidum - 1 34614, Hongo | 18,23 | 7,85 | 2,32 |
| Geotrichum candidum -2 62401, Hongo | 12,16 | 6,17 | 1,97 |
| Mortierella isabellina - 1 42613, Hongo | 3,33 | 1,36 | 2,45 |
| Mortierella isabellina - 2 38063, Hongo | 2,74 | 0,95 | 2,88 |
| Mortierella vinacea 09515, Hongo | 6,01 | 1,45 | 4,14 |
| Penicillium notatum 36740, Hongo | 10,39 | 5,50 | 1.89 |
| Blastoschizomyces capitatus 28575, Hongo | 9,47 | 4,5 | 2,10 |
| Monosporium olivaceum v. major 36300, Hongo | 10,39 | 0,71 | 14,6 |
| Aureobasidium pullulans 16623, Hongo | 11,76 | 3,65 | 3,22 |
| Debaryomyces polymorphus 20280, Levadura | 7,18 | 3,67 | 1,96 |
| Saccharomyces cerevisiae 15248, Levadura | 24,33 | 14,42 | 1,69 |
| Candida schatavii 24409, Levadura | 7,18 | 1,03 | 6,97 |
| Pichia fabianii 16755, Levadura | 17,89 | 8,97 | 1,99 |
| Streptomyces rimosus ss. rimosus 16755, Actinomiceto | 3,21 | 1,68 | 1,91 |
Debería indicarse que mientras que el
Monosporium olivaceum v. major ATCC No. 36300, tal como se
ilustra mediante los datos de la Tabla III, redujo
substancialmente más de la (4R) tetralona frente a la (4S)
tetralona, y que como tal sería un microorganismo preferido para
uso en procedimiento sujeto, sin embargo, se informó igualmente
para este cultivo de la degradación no deseable de la (4R) tetralona
y la (4S) tetralona. La degradación no deseable puede ser debida,
por ejemplo, a otras enzimas y similares que comprenden el
microorganismo intacto. De acuerdo con ello, tal como entenderán
los expertos en la técnica a partir de la descripción aquí
proporcionada, se prefiere usar la enzima aislada procedente de
Monosporium olivaceum v. major ATCC No. 36300 frente al
Monosporium olivaceum v. major ATCC No. 36300 intacto.
Claims (35)
1. Un procedimiento para la reducción microbiana
estereoespecífica de un compuesto de fórmula (I) a compuestos de
fórmulas (II) y (III):
\vskip1.000000\baselineskip
que
comprende:
la puesta en contacto de un compuesto de fórmula
(I) con un microorganismo, o un sistema de reducción de enzima
capaz de llevar a cabo dicha reducción que comprende una enzima
derivada a partir de dicho microorganismo y un
co-factor para dicha enzima, y
la incubación de la mezcla resultante bajo
condiciones suficientes para proporcionar más del compuesto de
fórmula (II) que del compuesto de fórmula (III), dando lugar, de
esta forma, a más compuesto de fórmula (V) sin reaccionar que del
compuesto de fórmula (IV) sin reaccionar, en el que dicho
microorganismo está seleccionado entre el grupo formado por
Hansenula polymorpha ATCC No. 26012, Hansenula
polymorpha ATCC No. 74449, Absidia coerulea ATCC No.
20137, Geotrichum candidum ATCC No. 34614, Geotrichum
candidum ATCC No. 62401, Mortierella isabellina ATCC No.
42613, Mortierella isabellina ATCC No. 38063, Mortierella
vinacea ATCC No. 09515, Penicillium notatum ATCC No.
36740, Blastoschizomyces capitatus ATCC No. 28575,
Monosporium olivaceum v. major ATCC No. 36300,
Aureobasidium pullulans ATCC No. 16623, Debaryomyces
polymorphus ATCC No. 20280, Saccharomyces cerevisiae
ATCC No. 15248, Candida schatavii ATCC No. 24409, Pichia
fabianii ATCC No. 16755 y Streptomyces rimosus ss.rimosus
ATCC No. 10970; y mutantes de los mismos capaces de llevar a cabo
dicha reducción.
2. El procedimiento tal como se define en la
Reivindicación 1, en el que el compuesto de fórmula (V) se separa
de los compuestos de fórmulas (II), (III) y (IV).
3. El procedimiento tal como se define en la
Reivindicación 2, en el que dicha separación se lleva a cabo
mediante cromatografía.
4. El procedimiento tal como se define en la
Reivindicación 2, en el que dicha separación se lleva a cabo
mediante cristalización.
5. El procedimiento tal como se define en la
Reivindicación 2, en el que dicho compuesto de fórmula (II) se
separa de dichos compuestos de fórmulas (III) y (IV).
6. El procedimiento tal como se define en la
Reivindicación 5, en el que dicho compuesto separado de fórmula
(II) se recicla a un compuesto de fórmula (I) mediante oxidación de
dicho compuesto separado de fórmula (II) y racemización de dicho
compuesto oxidado a dicho compuesto de fórmula (I).
7. El procedimiento tal como se define en la
Reivindicación 6, en el que dicha racemización comprende la reacción
de dicho compuesto oxidado con una base.
8. El procedimiento tal como se define en la
Reivindicación 1, en el que dicho compuesto de fórmula (I) se
prepara tal como se define en la Reivindicación 6.
9. El procedimiento tal como se define en la
Reivindicación 1, en el que dicha puesta en contacto es con dicho
microorganismo.
10. El procedimiento tal como se define en la
Reivindicación 1, en el que dicha puesta en contacto es con dicho
sistema de reducción de enzima.
11. El procedimiento tal como se define en la
Reivindicación 9, en el que dicho microorganismo es un
microorganismo intacto.
12. El procedimiento tal como se define en la
Reivindicación 9, en el que dicho microorganismo es una preparación
de célula rota del mismo.
13. El procedimiento tal como se define en la
Reivindicación 9, en el que dicho microorganismo es una preparación
deshidratada del mismo.
14. El procedimiento tal como se define en la
Reivindicación 11, en el que dicho microorganismo intacto comprende
células lavadas de dicho microorganismo intacto.
15. El procedimiento tal como se define en la
Reivindicación 14, en el que dichas células lavadas están
inmovilizadas.
16. El procedimiento tal como se define en la
Reivindicación 10, en el que dicha enzima de dicho sistema de
reducción de enzima está inmovilizada.
17. El procedimiento tal como se define en la
Reivindicación 13, en el que dicha preparación deshidratada es una
preparación enzimática en polvo en acetona.
18. El procedimiento tal como se define en la
Reivindicación 9, en el que dicho microorganismo está en un caldo
de cultivo.
19. El procedimiento tal como se define en la
Reivindicación 18, en el que dicha puesta en contacto es mediante
la adición de dicho compuesto de fórmula (I) a dicho caldo de
cultivo.
20. El procedimiento tal como se define en la
Reivindicación 10, en el que dicho sistema de reducción de enzima
está en un disolvente.
21. El procedimiento tal como se define en la
Reivindicación 20, en el que dicho disolvente es un disolvente de
manera apreciable orgánico.
22. El procedimiento tal como se define en la
Reivindicación 10, en el que dicha puesta en contacto es mediante
la adición de dicho compuesto de fórmula (I) a dicho disolvente.
23. El procedimiento tal como se define en la
Reivindicación 9, en el que dicho microorganismo es dicha
Hansenula polymorpha ATCC No. 26012 o dicha Hansenula
polymorpha ATCC No. 74449, o dichos mutantes de las mismas.
24. El procedimiento tal como se define en la
Reivindicación 10, en el que dicha enzima que comprende dicho
sistema de reducción de enzima deriva a partir de dicha Hansenula
polymorpha ATCC No. 26012 o de dicha Hansenula polymorpha
ATCC No. 74449, o de dichos mutantes de las mismas.
25. El procedimiento tal como se define en la
Reivindicación 18, en el que dicho microorganismo es dicha
Hansenula polymorpha ATCC No. 26012 o dicha Hansenula
polymorpha ATCC No. 74449, o dichos mutantes de las mismas.
26. El procedimiento tal como se define en la
Reivindicación 19, en el que dicho microorganismo es dicha
Hansenula polymorpha ATCC No. 26012 o dicha Hansenula
polymorpha ATCC No. 74449, o dichos mutantes de las mismas.
27. El procedimiento tal como se define en la
Reivindicación 9, en el que dicho microorganismo es Absidia
coerulea ATCC No. 20137 o dichos mutantes de la misma.
28. El procedimiento tal como se define en la
Reivindicación 10, en el que dicha enzima que comprende dicho
sistema de reducción de enzima deriva a partir de dicha Absidia
coerulea ATCC No. 20137 o de dichos mutantes de la misma.
29. El procedimiento tal como se define en la
Reivindicación 10, en el que dicha enzima que comprende dicho
sistema de reducción de enzima deriva a partir de dicha
Monosporium olivaceum v. major ATCC No. 36300 o de
dichos mutantes de la misma.
30. Un procedimiento para la reducción
microbiana estereoespecífica de un compuesto de fórmula (I) a
compuestos de fórmulas (II) y (III):
que
comprende:
la puesta en contacto de un compuesto de fórmula
(I) con un microorganismo y
la incubación de la mezcla resultante bajo
condiciones suficientes para proporcionar más del compuesto de
fórmula (II) que del compuesto de fórmula (III), dando lugar, de
esta forma, a más compuesto de fórmula (V) sin reaccionar que del
compuesto de fórmula (IV), en el que dicho microorganismo está
seleccionado entre el grupo formado por: Hansenula
polymorpha ATCC No. 26012, Hansenula polymorpha ATCC No.
74449 y mutantes de los mismos capaces de llevar a cabo dicha
reducción.
31. El procedimiento tal como se define en la
Reivindicación 30, en el que dicho microorganismo está en un caldo
de cultivo.
32. El procedimiento tal como se define en la
Reivindicación 31, en el que dicha puesta en contacto es mediante
la adición de dicho compuesto de fórmula (I) a dicho caldo de
cultivo.
33. Un procedimiento para la reducción
microbiana estereoespecífica de un compuesto de fórmula (I) a
compuestos de fórmulas (II) y (III):
que
comprende:
la puesta en contacto de un compuesto de fórmula
(I) con un sistema de reducción de enzima capaz de llevar a cabo
dicha reducción que comprende una enzima derivada a partir de un
microorganismo y un co-factor para dicha enzima
y
la incubación de la mezcla resultante bajo
condiciones suficientes para proporcionar más del compuesto de
fórmula (II) que del compuesto de fórmula (III), dando lugar, de
esta forma, a más compuesto de fórmula (V) sin reaccionar que del
compuesto de fórmula (IV), en el que dicho microorganismo está
seleccionado entre el grupo formado por: Hansenula
polymorpha ATCC No. 26012, Hansenula polymorpha ATCC No.
74449 y mutantes de los mismos capaces de llevar a cabo dicha
reducción.
34. El procedimiento tal como se define en la
Reivindicación 33, en el que dicho sistema de reducción de enzima
está en un disolvente.
35. El procedimiento tal como se define en la
Reivindicación 34, en el que dicha puesta en contacto es mediante
la adición de dicho compuesto de fórmula (I) a dicho disolvente.
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