TWI224141B - Stereoselective microbial reduction of a racemic tetralone - Google Patents

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1224141 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 A7 B7 五、發明說明（1 ) 本發明係關於一種4 一（3，4 —二氯苯基）—3， 4 一二氫一 1 ( 2 Η ) -萘酮（以下亦稱爲 '、對掌性萘滿 酮〃或'' (4 S )萘滿酮〃）（4 S )鏡像異構物之新穎 製備方法’更特定的係關於以立體有擇性微生物還原法將 消旋一 4 一（3，4 一二氯苯基）一 3，4 —二氫—1 ( 2 Η ) -萘酮（以下亦稱爲、、消旋萘滿酮〃）還原成對掌 性萘滿酮。 發明背景 本發明製備之對掌性萘滿酮可藉由進一步反應而製備 成順一（IS) ( 4 S ) — Ν —甲基一4 一（3 ，4 —二 氯苯基）—1 ，2，3，4 —四氫一 1 —萘胺，通稱爲絲 川林（sertraline )。絲川林可作爲，例如：抗鎭靜劑以及 厭食藥劑、及用以治療化學毒癮、與焦慮相關的病症、早 洩、癌症以及後心肌梗塞。 技藝上已知製備絲川林的方法，例如描述於 U.S. Patent Nos. 4，5 3 6，5 1 8 ; 4，777，288;4，839，1〇4; 4，855，500;4，940，731; 4，962，128;5，〇82，970; 5，130，338;5，196，607; 5’248，699;5，442，116; 5，463，126;5，466，880; 5 ’597，826;以及 5，750，794;以及 本紙張泛度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） --^----^--------------—訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -4 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 1224141 A7 B7 五、發明說明（2 ) W. Μ · W e 1 c h，J r · e t a 1 ·，見 J 〇 U r n a 1 〇 f M e d i c i n a 1 C h e m i s t r y Vol. 27，No· 1 1，p. 1 508( 1 984)。 許多上述的專利係關於合成消旋的N -甲基- 4 -（ 3 ’ 4——氯苯基）—1 ，2，3，4 —四氫—1—萘胺 順-及反-異構物之混合物。本說明可分離順-及反-異 構物’及其（S )與（R )鏡像異構物，其係用熟知此技 藝之專業人士熟知的方法，包括：例如，分結晶或色層分 析法。 已知在合成絲川林的早期階段時須選用能達成所欲得 之對掌性。例如，上述的U.S. Patent No. 5，7 5 0，7 9 4中揭示一種對掌性萘滿酮之製備方法 ，其係由消旋萘滿酮與不對稱之酮還原劑反應以產生對應 的順-或反-醇類（視不對稱試劑之對掌性而定），再將 醇類分離並氧化（1 S，4 S )及/或（1 R，4 S )醇 類成（4 S )萘滿酮。 技藝上同時也已知道對掌性化合物可由微生物合成， 例如：真菌，例如：酵母菌。例如：使用酵母菌還原酮成 爲對掌性醇類爲眾所偕知。但是，正如熟於此技藝之士所 知，此種微生物還原法之化學和光學產率（例如：特定的 鏡像異構物及其數量）一般而Η在實質上需視情況而定， 例如：特定選用的微生物，以及起始材料之取代基。 U.S. Patent No. 5 ，〇 4 9 ，4 9 7 揭示一種分離雙 環〔4 · 2 · 0〕辛烷之消旋衍生物的方法，其係在足以 生成酮及高鏡像異構物純度醇之混合物的條件下使衍生物 本纸張&度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ---1----^-------— — — — — — — ^--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -5 - 1224141 A7 ___ B7 五、發明說明（3 ) 與Baker’s酵母菌接觸。如其文中所言，僅有一種標題消旋 酮之鏡像異構物可還原成醇。 U.S. Patent No. 5，5 8 0，7 6 4 揭示一種不對稱 之還原法，其係使用一種完整的微生物或其破裂的細胞製 備，以便將環酮轉換成對應的對掌性醇。 U.S. Patent No. 5，6 1 8，7 ◦ 7 揭示一種將酮受 質以立體有擇性還原的方法，其係將受質加入百利接合酵 母ATCC (美國類型之培養菌典藏）No · 38924 或八孢裂殖酵母ATCC No · 2479培養液中，培 養所生成的混合物，並以常見的方法（例如：用有機溶劑 萃取、吸附在樹脂上、或色層分析法）分離羥基化合物， 再作爲中間物以製備妥血淸膽固醇降低藥劑。上述之單離 的羥基化合物係採用對掌性高效能液體色層分析法（ HPLC)、逆相HPLC、或兩者分析。與熟於此技藝 方面之士所知一致的，上述用以硏究還原經選用之酮族受 質的任何大量微生物在將酮族還原時並未能達到令人滿意 的專一性或產率。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -·1111111 ^ · I I I----- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 、 更原滿 { 酮方 菌。還萘之滿題 母酮地 }得萘標 酵滿擇 S 欲旋由 : 萘選 4 不消 。 如旋可{之爲酮 例消法下成成滿 ， 原原留形化萘 菌還還時法旋 } 真地物同方消 S ••性生，題經 4 括擇微酮標再ί 包有性滿由後多 ， 體擇萘，其更 物立有}外，生 生可體 R 此化產 微上立 4 。氧以 群質之{應經法 一 實題之反可方 有，標中曾醇題 現類，物未滿標 發菌說合上萘覆 頃射的混質 } 重 放確旋實 R 並 及明消酮 4 ， 本紙張义度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -6 - 1224141 A7 _______B7____ 五、發明說明（4 ) 法形成之（4 S )萘滿酮可用以合成絲川林。 本文中提及的所有文件，包括前述，全文在此幷入參 考文獻。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 發明摘要 本發明係關於一種以微生物還原羰族之方法，其中包 含將酮化合物（式（I )之消旋萘滿酮）與微生物或一種 能完成該標題還原法之酵素還原系統（包括源出於該微生 物之酵素及該酵素之輔助因子）接觸，並在適當條件培養 所形成之混合物，以便形成具有羥基之化合物，特定言之 ’可形成式（Π)之（4R)萘滿醇並於培養液中累積， 而具有所欲得立體化學之化合物，即式（V )之（4 S ) 萘滿酮則實質上維持未反應。然後可將下列之式（V )( 4 S )萘滿酮’即對掌性萘滿酮以任何適當的方法分離， 例如：色層分析法或結晶。此外，式（Π ) ( 4 R )萘滿 醇可自式（m ) -（ V )化合物分離出，並予以氧化並經 消旋化而成爲消旋萘滿酮，再重覆標題之立體有擇性微生 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 酮 性 掌 對 之 得重 欲種 所一 多供 更提 生明 產發 以本 法， 原此 還據： 的法 物原 專 體 立 列 下 行 進 還 物 生 微 的 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1224141 Α7 Β7 五、發明說明（5

微生物 '_ -—► ||的還原酶 oi 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制取

(II) 0H

(IV) 0 (V)

(請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁)

Cl Cl (4R) 其中包含：使式（I )化合物與微生物、或一種能完成此 標題還原法之酵素還原系統（內含源自於該微生物之酵素 及該酵素之輔助因子）接觸，並於足以生成較多式（π ) 化合物（多於式（m)化合物）之條件下培養所形成的混 合物’使化合物中有較多未反應之式（V )化合物（多於 未反應之式（I V )化合物）。 標題的立體專一還原法可以下式代表：

CI

其係包含：使式（I )化合物與微生物、或一種能完成ΰ 標題還原法之酵素還原系統（內含源自於該微生物之酵5 及該酵素之輔助因子）接觸，並於足以生成式（η)( 4 R )萘滿醇之條件下培養所形成的混合物而留下較多5 本紙張Κ度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） # 訂---------線· -8- 1224141 A7 B7 五、發明說明（6 ) 反應的式（v ) ( 4 S )萘滿酮。 (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) 此立體有擇性還原法並可視需要地包含自式（π )( 4R)萘滿醇中將式（V) (4S)萘滿酮分離出。然後

再氧化（4 R )萘滿醇產生（4 R )萘滿酮，然後與（例 如）鹼反應以產生式（I )消旋萘滿酮，並重覆標題立體 有擇性微生物還原法以產生更多所欲得之式（V ) ( 4 S )萘滿酮，即式（I )之消旋萘滿酮（4 S )鏡像異構物 〇 本發明提供一種方法將式（I )化合物以立體有擇性 微生物還原成式（Π )化合物：使式（I )化合物與微生 物、或一種能完成此標題還原法之酵素還原系統（內含源 自於該微生物之酵素及該酵素之輔助因子）接觸，並於足 以產生式（Π )化合物之條件下培養所形成的混合物，使 實質上有較多未反應的式（V )化合物（多於式（JV )化 合物），且實質上產生較多的式（Π)化合物（多於式（ m)化合物）。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 在較佳的具體實施例中，式（I )化合物係在酵素還 原系統下接觸。在其他較佳的具體實施例中，式（I )化 合物係在其中酵素爲固定化的酵素還原系統下接觸。尤其 是在較佳的具體實施例中，式（I )化合物係在其酵素爲 源自多形漢遜酵母ATCC No·26012的酵素還 原系統下接觸。 在其他的較佳具體實施例中該微生物是其破裂細胞製 劑。不過在其他的較佳具體實施例中該微生物是其丙酮粉 本紙張瓦度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） -9 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 1224141 Λ7 B7 五、發明說明（7 ) 末酵素製劑。 本發明的尤佳具體實施例係使用完整的微生物。在使 用完整微生物的較佳具體實施例中，式（I )化合物係與 內含該微生物之發酵培養液、培養液、或溶劑接觸。在使 用完整微生物的較佳具體實施例中，式（I )化合物係與 乾淨而完整的微生物接觸。不過在使用完整微生物的其他 較佳具體實施例中，式（I )化合物係與固定化的完整微 生物接觸。 在使用完整微生物的本發明尤佳具體實施例中，微生 物係於發酵培養液中生長，並添加式（I )化合物於其中 使其發生接觸。 在使用完整微生物的本發明尤佳具體實施例中，微生 物係於發酵培養液中生長約4 8小時，並添加式（I )化 合物於生長培養液中使發生接觸，並培養約5天。 在本發明之其他較佳具體實施例，微生物可爲真菌， 例如：酵母菌、或放射菌類、或其能進行立體有擇性還原 反應之突變株。 不過在本發明其他較佳的具體實施例中，微生物係使 用真菌類。在使用真菌微生物的其他較佳具體實施例中， 真菌是藍色犁頭霉ATCC No · 20137。 在本發明尤佳的具體實施例中，微生物是用酵母菌。 在使用酵母菌微生物的本發明尤佳具體實施例中，酵母菌 爲多形漢遜酵母ATCC No · 26012，亦爲 A T C C No.74449。 本紙張K度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） --^-------------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -10- 1224141 A7 B7 五、發明說明（8 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 使用多形漢遜酵母ATCC No · 260 12 (亦 爲ATCC No · 74449)作爲微生物時，標題立 體有擇性微生物的還原可明顯地僅還原式（1)化合物之 鏡像異構物成爲對應醇’即式（Π )化合物，而同時式（ I )化合物的其他鏡像異構物，即式（V )化合物，實質 上未經反應。 如先前所討論，本發明方法可視需要地包括自式（π )-（IV )化合物中分離（例如：以結晶或色層分析法進 行）出式（V )化合物’並在其任何已知的絲川林合成方 法中使用此單離的式（V)化合物。 如先前所討論的，宜氧化單離之式（Π ) ( 4 R )萘 滿醇成爲式（IV ) ( 4 R )萘滿酮。再進一步的消旋，較 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 佳者是（4R)萘滿酮與鹼反應，由式（IV) (4R)萘 滿酮形成式（I )消旋萘滿酮。氧化反應及消旋作用將不 需要的（4 R )萘滿醇回收供下一次依據本發明方法立體 有擇性微生物還原反應使用。回收不需用之（4 R )萘滿 醇會增加所欲得（4 S )萘滿酮之數量並降低不需用之（ 4 R )萘滿醇丟棄量。氧化反應及消旋化氧化產物可用其 任何適當的已知方法進行。 本發明之詳細說明 熟悉此技藝的專業人士應可完全了解本文之專用名詞 以描述本發明；不過，下列各名詞之說明則如下。 、、輔助因子〃意指任何包含酵素還原系統的適當輔助 -11 - 本紙張&度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210x 297公釐） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1224141 A7 B7 五、發明說明（9 ) 因子，例如：NADH、NADPH、FADH、 FMNH、及/或P Q Q或任何在微生物中與酵素一同出 現的適當輔助因。 ''酵素還原系統〃意指適當的微生物氧離子基還原酶 酵素及該氧離子基還原酶酵素輔助因子之還原形式，其中 輔助因子可源自於選擇的微生物或任何適當來源。包括酵 素還原系統的酵素可爲自由或固定化形式，例如，附著在 管柱上或圓珠上。 ''微生物還原〃意指本發明由酵素還原系統完成之立 體有擇性還原法，此微生物還原酶包括酵素還原系統、完 整的微生物、或其任何製劑，等。 '"微生物體〃包括任何完整的微生物或其衍生之製劑 ，包括：例如微生物破裂細胞製劑；微生物脫水製劑，例 如：丙酮粉末酵素製劑；不含例如：發酵培養液、培養液 、等之經淸洗的微生物；固定化微生物，例如，附著在管 柱上或圓珠上、等。 本發明之方法包含以立體有擇性微生物的還原法還原 式（I )化合物成爲式（Π )化合物： (IV) 0 (V)

本紙張义度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） —^----^------------------------^ ^_wi (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (II) (III)

(4R) (4S) (I) 〇

-12- 1224141 A7 _____B7_ 五、發明說明（10 ) 使式（I )化合物與微生物、或一種能完成此標題還原法 之酵素還原系統（內含源自於該微生物之酵素及該酵素之 輔助因子）接觸，並於足以產生式（Π )化合物之條件下 培養所形成的混合物，以便實質上有較多式（V )化合物 (多於式（IV )化合物）未經還原，且實質上有較多式（ Π )化合物（多於式（m )化合物）產生。 熟悉此技藝的專業人士應可了解，式（I )化合物消 旋萘滿酮是一種（4 S )萘滿酮及（4 R )萘滿酮之混合 物，如下列： 0

(請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) C0

CI CI (4R)萘滿酮. 化合物’或更特定言之’式（π )萘滿醇爲 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制农 0HC0

CI CI (反）（1S，4R)

OH 03)

ci Cl (順）（1R，4R) 化合物，或更特定言之，式（m)萘滿醇爲 本纸張义度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -13- 1224141 A7 B7 五、發明說明（11)

QH

0H

(請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

Srci ci (順）（1S,4S) 式（Π )及（m )化合物係揭示於上述的u.s. Patent No· 5，750 ’ 794中並於其中申請專利範圍。 所欲得之式（V )化合物可依下述方法分離自不欲得 之式（Π )化合物’而任何未形成或仍未反應的式（m ) 或（IV )化合物分別視，例如：選擇的微生物種類及其培 養條件而定。 式（Π )化合物可轉換成式（I )化合物（例如經由 氧化及消旋反應）並經過標題之立體有擇性微生物還原反 應而產生另一個數量之式（V) (4S)萘滿酮。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本發明之方法易於進行。因此，在式（I )消旋萘滿 酮存在下微生物可經發酵（完整的微生物）或反應（破裂 細胞製劑、脫水製劑、或任何其他適當的微生物製劑）以 改變消旋萘滿酮，更明確言之，將非所欲得之消旋酮的（ 4 R )鏡像異構物還原成其對應醇式（π )，同時留下所 欲得之（4 S )鏡像異構物式（V )實質上未經反應，再 經一個步驟形成富含光學性的（4 S )鏡像異構物。（ 4 S )鏡像異構物可再以精於本技藝之士熟知之方法，例 如描述於（例如）上述U.S. Patent Nos. 本紙張&度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -14- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 1224141 Λ7 B7 五、發明說明（12) 4，536，518;4，777，288; 4，839，104;4，855，5〇〇; 4，940，731:4,962,128; 5，082，970;5，130,338; 5，196，607;5，248，699; 5，442，116;5，463，126; 5，466’880;5，597，826;及 5 ’ 7 5 〇 ’ 7 9 4 ，及上述 W.M. Welch，jr. et al.，之文 獻而產生最終之絲川林。 有關絲川林的形成活性、活性測試方法、投藥方法之 劑量、劑量形式均已在例如：上述的U.S. patent Nos. 4，536，518;4，777，288;及 4 ’ 8 3 9 ’ 1 0 4 ;上述的 paper by W.M· Welch，Jr· et al文獻中提及。 任何適當的微生物均可使用於本發明之方法中。如先 前所言，用於標題方法之微生物可爲其完整的任何適當的 製劑，例如，其一種破裂細胞製劑、其脫水製劑，並可爲 自由的或固定化。但是，若本發明使用的是不完整的微生 物，例如一種破裂細胞製劑，例如：細胞萃取液、丙酮粉 末酵素製劑、或其形成之酵素，則熟悉此技藝的專業人士 當可了解此酵素的適當輔助因子亦包括在內。 熟悉此技藝的專業人士將可由上述說明及其相關知識 了解到如何製備適當的破裂細胞製劑；例如：描述於例如 :R.N. Patel et al.之文獻、' Oxidation of Secondary 本紙張反度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---------線_ -15- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 1224141 A7 B7_ 五、發明說明（13 )

Alcohols to Methyl Ketones by Yeasts "，發表於 Applied and Environmental Microbiology, 38(2): 2 1 9-223( 1 979)。 熟悉此技藝的專業人士將可由上述說明及其相關知識 了解到如何製備適當的丙酮粉末酵素製劑，例如：描述於 例如：K. Nakamura et al·、' Asymmetric Reduction of Ketones by the Acetone Powder of Geotrichum candidum 〃 ，發表於 Tetrahedron Letters, 37( 1 0): 1 629- 1 632( 1 996)。 此外，任何適當的微生物酵素（例如：氧離子基還原 酶）亦可用於本標題方法中，而此酵素可以任何適當方法 自熟悉此技藝的專業人士熟知之微生物中分離出，至於完 整的微生物，則均可以自由的或固定化形式在標題方法中 使用。熟悉此技藝的專業人士將可由上述說明及其相關知 識了解到如何分離並純化此適當微生物的酵素，例如：一 般而言，例如描述於：M. Wada et al.，'' Purification and Characterization of NAIDPH-Dependent Carbonyl Reductase， Involved in Stereoselective Reduction of Ethyl 4-Chloro-3 -oxobutanoate, from Candida magnoliae 〃 ，發表於 Biosci.

Biotechnol. Biochem，62(2): 280-285(1 998)、 P· Trost et al ·，'、Purification and Properties of NAP(P)H: ( quinone-acceptor ) oxidoreductase of sugarbeet cells ，發表於 Eur. J Biochem·，234: 452-458( 1 995)、K.M. Madyastha and T.L. Gururaja，、、Purification and Some of the Properties of a novel Secondary Alcohol Dehydrogenase from Alcaligene eutrophus ，發表方令 Biochemical and 本紙張义度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) # 訂---------線_ -16- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 1224141 B7 五、發明說明（14 )

Biophysics Research Communications, 2 1 1 (2): 540-546(1 995 )、Ο. Βortolini et al.,、、Kinetic Resolution of vic-diols by Bacfflus stearothermophilus diacetyl reductase 〃 ，發表 於 Tetrahedron: Asymmetry, 9: 647-651(1998)、 R.N. Patel et al.,、、Stereospecific microbial reduction of 4,5-dihydro-4-(4-methoxyphenyl)-6-(triflurormethyl-lH-l)-benzazepin-2-one "，發表於 Enzyme Microb. Technol，3:906-912(1991)以 及 R.N. Patel et al.,、、Stereoselective microbial/enzymatic oxidation of (exo，exo)-7-oxabicyclo [2.2.1] heptane-2,3-dimethanol to the corresponding chiral lactol and lactone ^ ，發表於 Enzyme Microb. Technol，14: 778-784(1992); U.S. Patent Nos. 5，5 2 3，2 2 3 及上述的 5，5 8 〇，7 6 4。 適當的微生物包括多形漢遜酵母ATCC No. 26 0 12 、多形漢遜酵母ATCC No . 74449 、藍色犁頭霉ATCC No · 20137、白地霉 ATCC No.34614、白地霉ATCC No· 62401、深黃被孢霉ATCC No.42613、 深黃被孢霉ATCC No · 38063、葡酒色被孢霉 ATCC No · 09515、特異青霉 ATCC Ν ο · 3 6 7 4 0、芽枝裂殖酵母（Blastoschizomyces capitatus ) A T C C No .28575、單孢霉（ Monosporium olivaceum v.major ) A T C C N o . 363 0 0 ，出芽短梗霉 ATCC No · 16623、 本紙張义度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ---„----^---------------訂---------線 (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) -17· 1224141 Α7 Β7 五、發明說明（15) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 多形巴利酵母ATCC No · 20280、釀酒酵母 A T C C Ν ο · 1 5 2 4 8、夏他必氏假絲酵母 ATCC No · 24409、它必尼畢赤酵母（Pichia fabianii ) A T C C 16755 及鏈黴菌（Streptomyces rimosus ss. Rimosus ) A T C C No. 10970;及 其爲精於本發技藝之士所熟知或可形成之突變株（即使其 爲突變株）以完成揭示於本文之立體有擇性微生物還原。 較佳的完整微生物將可實質上還原（4 R )萘滿酮、 又使（4 S )萘滿酮實質上未經反應者，在此之反應是包 括還原或任何可降解或其他對本標題方法任何階段中之所 欲得之（4 S )萘滿酮有負面影響的其他內在活性。熟悉 此技藝的專業人士可由此說明中得知，此種不欲得之（ 4 S )萘滿酮反應可實質上以（例如）源自選擇微生物而 非完整微生物的酵素預防。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 適用於標題立體專一的微生物還原之微生物可用任何 熟悉此技藝的專業人士所知之適當方法製備。以市售材料 製備微生物的適當方法之實例如下。下列之方法均可使用 在適用於本發明方法之任何微生物，熟悉此技藝的專業人 士可由下述文中提供之說明中得知如何修改步驟中的任何 部份’例如，製備完整或製劑微生物的方法，例如：破裂 之細胞或其脫水的細胞，自由或固定化；製備源自此微生 物的酵素之適當方法；將消旋萘滿酮與微生物或包括其源 出酵素還原系統的酵素接觸之方法；生長培養液之成分及 條件’例如：溫度、p Η、等；或培養條件；以任何特定 本紙張义度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -18- 1224141 A7 B7 五、發明說明（16) 的方法達成所欲得之結果。 熟悉此技藝的專業人士可由本說明中及其相關知識得 知如何製備適當的固定化完整微生物，例如：由A. Bauer et al.於文獻、、p〇lyVinyi aic〇h〇l-immobilized whole-cell preparation for biotransformation of nitriles"，發表於 Biotechnology Letters, 1 8(3): 343-348 (March 1 996)。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 任何使式（I )化合物與微生物或酵素還原系統接觸 的適當方法均可用於本發明中。式（I )化合物可與微生 物或酵素還原系統以任何適當的順序接觸。例如：式（I )化合物可添加於培養液之中，例如：培養液，包括：微 生物、自由或固定化、或其某種組合；或培養液可含有式 (I )化合物’然後在此培養液中添加微生物；或可將式 (I )化合物及微生物一起添加於此培養液中；或可將式 (I )化合物加入其破裂細胞製劑中；或式（I )化合物 加入微生物之脫水製劑中；或可將式（I )化合物或微生 物或酵素還原系統加入含有其他物質之適當溶劑中；等。 熟悉此技藝的專業人士可由本說明中如何修改所欲得之標 題方法中的任何部份。 本發明尤佳者是此微生物、或其酵素還原系統係源自 多形漢遜酵母ATCC No · 26012。多形漢遜酵 母 ATCC Ν〇·26012(取自 D.W. LeWne )之冷 凍乾燥樣品，係根據Budapest Treaty ( 7月2 6日， 1 9 9 8)存放在 ATCC (位於 10801 University Boulevard，Manassas，Virginia，20110-2209，U.S.A.)。此 本紙張K度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -19- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 1224141 A7 B7 五、發明說明（18) 本發明可使用任何適當的微生物生長期、微生物與式 (I )化合物之接觸方式、式（I )化合物與微生物之培 養方式。微生物可在（例如）約2 4小時內達成適當生長 ’其後可將適當數量的消旋萘滿酮溶液（於適當的溶劑內 ，較佳者爲乙醇）加入培養液內。然後繼續發酵例如約兩 至約六天，較佳者，例如：約五天，其後發酵培養液可用 任何適當的萃取方法萃取及適當的溶劑，例如：乙酸乙酯 、甲基異丁基酮、甲基乙基酮、二氯甲烷等，較佳者乙酸 乙酉曰’以便移除發酵培養液中之有機成分。萃取發酵培養 液及分離有機相及水相後，內含有機殘餘物之化合物可以 任何適當的方法測定，例如：色層分析法，較佳者，對掌 性 Η P L C。 任何適當的生長培養液均可用於本發明方法中，而適 當的生長培養液將含碳或可同化的碳源、可同化的氮及內 含基本礦物之無機鹽類。一般而言，許多碳水合物，例如 :葡萄糖、麥芽糖、甘露糖、蔗糖、澱粉、甘油、小米膠 、糖蜜、大豆等，可作爲可同化的碳源。可同化的氮源包 括：例如材料，例如：酵母菌及酪蛋白水解液、初級酵母 菌、酵母菌萃取液、棉線種子粉、大豆、小麥胚芽、肉萃 取液、蛋白罩、玉米浸液、及錢鹽類。適用於本發明培養 液的無機鹽營養物包括，例如：一般內含鈉、鐵、鎂、鉀 、鈷、磷酸鹽等的鹽類。更明確的說，適用於本發明之生 長介質包括，例如： (a )葡萄糖（約2 〇克）、酵母菌萃取液（約5克 本紙張K度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -- — — — III— ^ - - - - - ----· -21 - 1224141 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 ---__B7__五、發明說明（19 ) )、大豆粉（約5克）、N a C 1 (約5克）、 K 2 Η P〇4 (約5克）、及蒸餾Η 2〇（約1公升（L ) )、Ρ Η 以 Η 2 S 〇 4 ( a q .)調至約 ρ η 7.0； (b )糊精（約1 〇 g )、牛肉萃取液（約3 g )、 亞達胺（ardamine ) p Η (約5克）、E型N Z胺（約5 克）、MgS〇4.7H2 ◦(約〇.5 克）、KH2P〇4 (約〇 · 3 7 g ) 、C a C〇3 (約Q · 5克）、及蒸餾 H 2 〇 (約1公升（L ) ) 、ρ η以H C 1 ( a q .)調至約 PH 7 . 1，再於第二步用葡萄糖（約l〇g)、 HY-CaSe SF® (約2 g )、牛肉萃取液（約1 g )、玉米浸 液（約3 g )、及蒸餾Η 2〇（約1 l ) ，ρ Η調至約ρ Η 7 · 0 ; (C )葡萄糖（約1 〇 g )、玉米浸液（約6 g )、 KH2p〇4 (約 3g) 、CaC〇3 (約 3 · 5 克）、大 迓油（粗’約2 · 2毫升（毫升））、酵母菌萃取液（約 2 · 5克）、及蒸餾H2〇（約1公升（l) ) ，pH以 C 1 ( a Q · ) g周至約 p η 7 · Q 至約 ρ Ιί 7 · 3 · (d)麥牙糖槳（約2〇g)、大豆粉（約5克）、 酷蛋白（約1 g )、乾燥酵母菌（約1 g ) 、N 約5克）、及蒸餾Η 2〇（約1 L ); (e )乳糖（約 7 5 克）、Pharmamedia^ 國萃取液，約4 0 g ) 、C a C〇3 (約1 〇 g )、 N a 2 S〇4 (約4 g )、及蒸餾Η 2〇（約1公开

a C 取代酵母 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) # ^1 ϋ l_i I ϋ I^OJI ϋ ϋ ϋ ϋ 線· ‘ &度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） -22- 1224141 A7 _________ B7 五、發明說明（2〇) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (f ) I SP#2 (參見例如，Hand book of Microbial Media by R.M. Atlas, edited by L.C. Parks, CRC Press，Inc.， 1993 ，第 460 頁（、' Handbook/7 ) (g ) I S P # 3 (參見，第 4 6 0 頁（、、Handbook 〃）； (h ) I S P # 4 (參見，第 4 6 1 頁（、、Handbook 〃）； (i) ISP#5 (參見，第 461 — 462 頁（、、 Handbook〃 );等。 特佳的生長培養液爲2 X的上述（a )。參考特定的 緩衝溶液、介質、試劑、接觸或培養條件、及等，其目的 並非在設限’而是應予以參閱以便包括所有此類一般熟悉 此技藝的專業人士認定是對特定的文中討論內容有價値或 意義相關的材料。例如，一般均可以一種緩衝溶液系統或 培養液取代其他，以便可用其它不同方法達成所建議使用 的方法、材料或組合物之目的。此外，本發明亦包括將標 題方法擴大規模作爲商業運用。 經濟部智慧財產局員工消費合作杜印制衣 因此’一般熟悉此技藝的專業人士應可了解，改變生 長培養液、發酵條件、及/或消旋萘滿酮數量會控制化合 物之產率及其相對的產率。一般而言，本發明係使用之技 藝與工業效率有關。熟悉此技藝的專業人士會發現上述提 及之生長介質、發酵條件及微生物的相對量、或酵素還原 系統、及消旋萘滿酮僅爲適用於本發明之眾多介質、發酵 條件及起始材料數量中的一小部份，因而並不足以設限。 木紙張义度適用中國國家標準（CNS)A4規格⑵〇 χ 297公餐） -23- 1224141 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Μ Β7 五、發明說明（21 ) 任何適當的單離及/或純化任何標題方法之產物的方 法均可適用於本發明，包括：過濾、萃取、結晶、管柱色 層分析法、薄層色層分析法、製備型低壓液體色層分析法 或Η P L C、或任何此等方法的適當組合。 此外，熟悉此技藝的專業人士會發現可回收揭示在本 方法所產生的不需用之（4 R )萘滿酮對應醇，式（Π ) 化合物，例如：先前提及以任何適當的己知方法氧化及消 旋化成爲式（I )消旋萘滿酮，並再重覆本發明方法以產 生所欲得之式（V ) ( 4 S )萘滿酮。（4 R )萘滿醇經 氧化反應成（4 R )酮可採用熟悉此技藝的專業人士熟知 的方法。消旋反應可以任何適當的方式進行，不過一般是 在溫度介於約0 °C至約1 〇 〇 °C、較佳者約2 5 °C至約 6 5 °C間。（4 R )萘滿酮係與鹼在溫度約2 5 °C至約 8 5 °C、較佳者約5 0 °C至約6 5 t：間反應。適用於消旋 反應的驗包括：t -丁氧化鉀、氣氧化鈉、甲醇鈉、氫氧 化鉀。較佳的驗是t -丁氧化鉀。 下列實施例顯示數種微生物包括：真菌，例如：酵母 菌，及放射菌類能立體有擇性地還原消旋萘滿酮而產生所 欲得之式（V ) ( 4 S )萘滿酮，即對掌性萘滿酮，然後 再由不需用之化合物中分離出而根據技藝上已知的方法進 一步反應成絲川林。 本發明由下列實施例展示。上述及下列之本發明及各 種具體實施例並非用以限制本發明，而是作爲其示範。因 此，可見本發明並非僅限用此類實施例內的詳細內容。 本紙張K度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -1111111 ^ ·11111111 . 24- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 1224141 A7 B7 五、發明說明（23) 用等體積乙酸乙酯（純）萃取：加入乙酸乙酯，將培養菌 管振盪，然後在約2，0 0 0 r p m下離心（ IEC@ Centrifuge, 300 Second Avenue, Needham Heights, Massachusetts 02 1 94 )。移除乙酸乙酯層。第二次萃取水 層。合并有機萃取液，在氮氣；約5 0 °C水浴下乾燥。 B ·離心殘存的酮類：式（IV )及（V )化合物 將上述製備的萃取液再懸浮於約1毫升之乙醇，將約 2 0微升之各再懸浮的萃取液注射入Η P L C管柱： Chiralcel 〇K guard 管柱（4 · 6 X 5 0 mm，Diacel Chemical Industries, LTD., 730 Springdale Drive, P.0. Box 564，Exton，Pennsylvania 1 934 1 )耦合至 Chiralcel OK 管 柱（4.6x250mm，Daicel )進行分析。名注射之 再懸浮的萃取液內含之化合物在約Q . 8毫升/分鐘之固 定濃度動相（乙醇：乙酸乙酯，8 5 : 1 5 )中分離，化 合物包括萃取液用9 9 6 P D A偵測器（Watere，34 Maple Street，Milford, Massachusetts 0 1 757 )在 2 5 4 n m下進行偵測。 以下表I說明C 1及T 1之數據，對掌性Η P L C分 析顯示內含微生物，即多形漢遜酵母A T C C No. 2 6 0 1 2 ，可導致1 6 : 1之比例（未反應的式（V ) (4S)萘滿酮：未反應的式（w) (4R)萘滿酮）， 進一步的說明標題微生物的還原方法的立體專一性。以下 之結果係以各鏡像異構物添加之已知量爲計（約5 0 u g 本紙張&度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210x297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ---— 丨丨丨訂---------線. -26- 1224141 A7 B7 五、發明說明（24) /毫升之各式（IV)及（V)化合物）。如上述所言，起 始之式（I )消旋萘滿酮其濃度約1 Ο Ο μ g /毫升。

表 I 培養菌 4S萘滿酮（ug /毫升） 4R萘滿酮（ug/毫升） 4S:4R C1 42.63 43.04 1 T1 37.92 2.37 16 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 對掌性分析的結果顯示多形漢遜酵母A T C C No · 26012培養菌（T1)可實質上降低（4R) 萘滿酮而留下實質上未反應的（4 S)萘滿酮（約4 · 7 % ( 4 R )萘滿酮比上約7 6 %之（4 S )萘滿酮）。對 掌性Η P L C測定得知（4 S )萘滿酮約占8 8 % e e (a鏡像異構物的過量的百分比〃）。表1之數據亦顯示 (4S) : (4R)特定的比例爲16，實質上更多未反 應的（4S)萘滿酮留存，（4R)萘滿酮較少。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 據此，內含完整的微生物，即多型多形漢遜酵母 ATCC N〇 · ，造成立體專一的降低更多 起始之式（IV) ( 4R)蔡滿嗣，較少降低式（v)之（ 4S)奈滿酮（（4S) · ( 4 R ))，主要產物爲式（ Π ) ( 4 R )萘滿醇，以及少量之式（m ) ( 4 3 )萘滿 醇（數據未不）。產生之主要的（4R)萘滿醇爲（is

’ 4R)奈滿醇’其次之（4S)萘滿醇爲（is，4S )萘滿醇。 本紙張瓦度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 27- 1224141 A7 B7 五、發明說明（25) (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 實施例π 使用藍色犁頭霉ATCC N 0 · 2 0 1 3 7 降低外消旋萘滿酮 A ·藍色犁頭霉ATCC N〇 · 20137真菌之 發酵 、、對照組〃培養菌（C 2 )及、、測§式培養菌（T 2 )的製備如下：約2 · 5毫升滅菌之生長培養液（約2 0 g / 1之葡萄糖，約5克/ 1之營養大丑粉，約5克/ 1 之酵母菌萃取液，約5克/ 1之N a C 1及約5克/ 1之 K2HP〇4，用H2S〇4將PH調至約7·0)各添加至 兩管各有金屬蓋的16x125mm玻璃管（C2，T2 )。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 將約2 5微升之約1 7 %冷凍甘油保存之藍色犁頭霉 ATCC No .20137接種至T2。兩管之培養菌 在約2 9 〇C、約2 1 0 r p m下反應。約4 8小時後，將 約5 0微升（約5毫克/毫升之乙醇’最終濃度爲約 1 0 0 u g /毫升）之消旋萘滿酮（如描述於實施例I ， 約5毫克/毫升之約1 0 0%乙醇）添加至C 2及T2。 約5天後，各兩管之培養菌中添加入1毫升之 N a C 1 ( sard.)。各管培養菌之發酵培養液（約3 . 6 毫升）用約3毫升之乙酸乙酯（純）萃取：加入乙酸乙酯 ，振盪培養菌管，然後在下約2，0 0 0 r p m離心（ IEC Centrifuge )。移除乙酸乙酯層，第二次萃取水層。合 本紙張K度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） -28- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 1224141 Α7 Β7 五、發明說明（26) 并有機萃取液在氮氣、約5 0 °C水浴下乾燥。 B ·離心殘存的酮類：式（IV )及（V )化合物 將上述製備的各萃取液再懸浮於約1毫升之乙醇，將 約2 0微升之各再懸浮的萃取液注射入Η P L C管柱： Chiralcel 〇K guard 管柱（4 · 6 X 5 〇 mm ，Diacel Chemical Industries, LTD., 730 Springdale Drive, P.O. Box 564，Exton，Pennsylvania 19341 )鍋合至 Chiralcel OK 管 柱（4 · 6x250mm，Daicel )進行分析。名注射之 再懸浮的萃取液內含之化合物在約0 · 8毫升/分鐘之固 定濃度動相（乙醇：乙酸乙酯，8 5 : 1 5 )中分離，化 合物包括萃取液用9 9 6 P D A偵測器（Watere，34 Maple Street，Milford, Massachusetts 0 1 757 )在 2 5 4 n m下進行偵測。 以下HP L C之C 2及T2數據顯示內含微生物，即 藍色犁頭霉ATCC No · 2Q137，造成立體專一 的降低更多之起始式（IV ) ( 4 R )萘滿酮，較少之起始 式（V) (4S)萘滿酮。 更明確的說，對掌性分析的結果顯示藍色犁頭霉 ATCC No · 20137培養菌可降低（4R)萘滿 酮留下實質上未反應的（4S)萘滿酮（約1 3 · 6% ( 4R)萘滿酮比上約40 · 5%之（4S)萘滿酮。用對 掌性Η P L C測定（4 S )萘滿酮約爲5 0 % e e。 以下表Π說明C 2及T 2之數據，對掌性Η P L C分 本纸張又度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210x297公釐） -29- (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) # 訂---------線· 1224141 A7 B7 五、發明說明（27 ) 析顯示內含微生物，即藍色犁頭霉A T C C N 〇 . 2 0 1 3 7 ( T 2 ) ’導致未反應的（4S)萘滿酮爲（ 4 R )萘滿酮的兩倍，進~步的證實標題微生物還原方法 之立體專一性。以下之結果係以各鏡像異構物添加之已知 量爲計（如描述於實施例I約5 0 u g /毫升）。如上述 所言，起始之消旋萘滿酮其濃度約1 〇 〇 u g /毫升。 表 Π 1---- 培養菌 4S萘滿酮（ug/毫升） 4 R萘滿酮（u g /毫升） 4S:4R C2 39.53 39.47 1 T2 20.24 6.81 3

實施例J m 使用 FUNGI, YEASTS AND AN ACTINOMYCETE 降低外消旋萘滿酮 熟悉相關技藝之專業人士將了解表ΠΙ中用於標題還原 法之微生物：白地霉ATCC No · 62401、深黃 被孢霉ATCC No · 38063、葡酒色被孢霉 ATCC No · 09515、特異青霉 ATCC N 〇· 3 6 7 4 0、芽枝裂殖酵母（Blastoschizomyces capitatus ) A T C C Νο·28575、橄欖色單孢霉 (Monosporium olivaceum v.major) A T C C No· 36300、出芽短梗霉 ATCC No · 16623、 它必尼畢赤酵母（Pichia fabianii ) A T C C No. 1 6 7 5 5 及鏈黴菌（Streptomyces rimosus s s. Rimosus 木紙張泛度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) --------訂---------線 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -30- 1224141 A7 ____B7__ 五、發明說明（28 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) )ATCC NO · 10970 ’其製備描述於實施例π ;白地霉ATCC No · 34614、深黃被孢霉（ Mortierella isabellma ) A T C C Ν〇·42613，多 型德巴利酵母ATCC No·20280及釀酒酵母 ATCC Ν〇· 1 5248 ’除了重覆萃取之外其製備 的如描述於實施例Π ;夏他必氏假絲酵母 ATCC No · 24409之製備描述於下。 依據本發明夏他必氏假絲酵母A T C C N 〇 . 2 4 4 0 9的製備方法如下：將約2 · 5毫升滅菌之生長 培養液（約2 0 g / 1之葡萄糖，約5克/ 1之營養大豆 粉，約5克/1之酵母菌萃取液，約5克/1之NaC 1 及約5克/ 1之K 2 Η P 0 4，用Η 2 S〇4將p Η調至約 7 · 0)添加至有金屬蓋之16xl25mm玻璃管’接 著加入約0 · 1毫升之濾膜過濾的溶液（含約2 5克之 Tweerf 80、約1 0 〇 g之甘油及約2 5 0毫升之蒸纟留水）

I 至培養液。接著培養液中接種約2 5 u 1之約1 7 %冷凍 甘油儲存之夏他必氏假絲酵母A T C C N 〇 . 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 2 4 4 0 9。培養液約2 9 °C下、約2 1 0 r p m搖動下 生長。約4 8小時後，培養液中加入約5 0 u 1之消旋萘 滿酮（式（I )化合物，包括式（IV )及（V )化合物’ 約5毫克/毫升之約1 0 0 %乙醇）標準溶液（約5毫克 /毫升之約1 0 0%乙醇，最終濃度約1 〇 0 u g/毫升 )° 四天後，培養菌之發酵培養液（約2 · 6毫升）用等 -31 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1224141 A7 B7_ 五、發明說明（29 ) 體積之乙酸乙酯（純）萃取，振動培養菌，然後在約 2，0 0 0 r p m ( IEC Centrifuge )下離心。重覆萃取。 萃取液在氮氣、約5 0 °C水浴下乾燥。然後萃取液再懸浮 於約1毫升之乙醇，將約5 u 1之再懸浮的萃取液注射入 Η P L C 管柱：Chiralcel 〇K guard 管柱（4 · 6 X 5 0 mm，Diacel Chemical Industries，LTD.)親合至 Chiralcel 〇K管柱（4 · 6x2 5〇mm， Daicel )進行分析。注 射之再懸浮的萃取液內含之化合物在約Ο · 9毫升/分鐘 之固定濃度動相（己烷：異丙醇，9 5 : 5 )中分離，化 合物包括萃取液用9 9 6 P D A偵測器（Watere，34 Maple Street, Milford, Massachusetts 0 1 757 )在 2 5 4 n m下進行偵測。 對掌性H P L C (如實施例I及Π )之數據示於表m ，立體專一的降低更多之（4R)萘滿酮，較少（4S) 萘滿酮（一般而言未反應的（4S)萘滿酮與未反應的（ 4 R )萘滿酮之比例至少約兩倍）之各微生物列於以下之 表m。 (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) --------訂---------線- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 本紙張瓦度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -32- 1224141

A B7 五、發明說明（30 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 表 m 培養菌ATCC N〇.，微生物類型 4S萘滿酮 4R萘滿酮 4S:4R (ug/毫升） (ug/毫升） 白地霉- 1,346 1 4,真菌 18.23 7.85 2.32 白地霉-2,6240 1，真菌 12.16 6.17 1.97 深黃被孢霉- 1,426 1 3,真菌 3.33 1.36 2.45 深黃被孢霉-2,3 8063,真菌 2.74 0.95 2.88 葡酒色被孢霉，095 1 5,真菌 6.01 1.45 4.14 特異青霉，36740,真菌 10.39 5.50 1.89 芽枝裂殖酵母 9.47 4.5 2.10 (Blastoschizomyces capitatus) 28575，真菌 主要的橄欖色單孢霉，36300,真 10.39 0.71 14.6 菌 出芽短梗霉，1 6623,真菌 11.76 3.65 3.22 多型德巴利酵母，20280,酵母菌 7.18 3.67 1.96 釀酒酵母，1 5248,酵母菌 24.33 14.42 1.69 夏他必氏假絲酵母，24409,酵母 7.18 1.03 6.97 菌 費邊氏畢亦酵母，1 6755,酵母菌 17.89 8.97 1.99 鏈黴菌（Streptomyces rimosus 3.21 1.68 1.91 ss. Rimosus)，放射菌 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ---------訂---------線 . 本纸張义度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） -33- 1224141 A7 ___ B7 _ 五、發明說明（31 ) 完整的主要橄欖色單孢霉ATCC No. 36300 (見表m之數據）實質上降低較多之（4R) 萘滿酮較少之（4 S )萘滿酮，爲使用標題方法較佳的微 生物，但是此培養菌亦降解（4 R )萘滿酮及（4 S )萘 滿酮。此非所欲之降解係歸因於，例如完整微生物的其他 酵素等。因此，熟悉此技藝的專業人士從本文之描述可較 佳的使用分離自主要橄欖色單孢霉ATCC No. 3 6 3 0 0之酵素而非完整的主要橄欖色單孢霉ATC C N 〇 · 3 6 3 0 0 。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) --------訂---------線· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張&度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -34-

Claims (1)

122414fc

TO 月 a 修正 補充 公告本1 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 '附件四A ··第88118421號修正後無劃線之 中文申請專利範圍替換本民國93年8月12日呈 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1 · 一種以立體有擇性微生物將式（I )化合物還原 成式（π )及（m )化合物之方法， (丨） (Μ) (ΙΜ) (IV) (V) 〇 Y 微生物 OH οώ OH G0 o5 Λ 的還原i每 Π) Λ + rV Λ V^CI Cl Cl Cl V^CI ei V Cl (4R), (4S) (4R) (4S) (4R) (4S) 其係包括： 將式（I )化合物與微生物、或能完成該還原反應之 酵素還原系統接觸，該系統中含有源自該微生物之酵素及 該酵素之輔助因子；及 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 於周溫足以生成較多式（π )化合物（多於式（m ) 化合物）下，藉由振盪自低於24小時至7天以培養所形成 的混合物，使得有較多未反應之式（v )化合物（多於未 反應之式（IV )化合物），其中該微生物係選自：多形漢 遜酵母（Hansenula polymorpha) ATCC No. 260 12 、多形漢遜酵母AT CC No · 74449 、藍色 梨頭霉（Absidia coerulea) ATCC No. 201 37、白地霉（Geotrichum candidum) ATCC 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2】0X297公釐） 1224141 A8 B8 C8 D8 7T、申請專利範圍 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) No .34614' 白地霉 ATCC No. 62401 、深黃被孢霉（Mortierella isabellina) A T C C No. 42613、深黃被孢霉 ATCC No · 38063、 葡酒色被孢霉（Mortierella vinacea) ATCC No. 09515、特異青霉（Penicillium notatum ) ATCC No · 367 40、芽枝裂殖酵母（Blastoschizomyces capitatus ) ATCC No . 28575、主要橄欖色單孢 霉（Monosporium oliva ceum ν· major) ATCC N o . 36 300、出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans) ATCC No · 16623 、多型德巴利酵母（ Debaryomyces polymorphus ) ATCC N o . 2 0 2 8 0 、釀酒酵母（Candida schatavii ) ATCC No. 1 5 2 4 8、夏他必氏假絲酵母A T C C No. 24409、費邊式畢赤酵母（Pichia f abi anii ) ATCC No · 16755 以及鏈黴菌（Slrejtomvces nmosus ss. rimosus ) ATCC No.l〇97〇。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 2 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中將式（v ) 化合物與式（Π )、式（m )以及式（jy )化合物分離。 3 ·如申請專利範圍第2項之方法，其中係以色層分 析法進行分離。 4 ·如申請專利範圍第2項之方法，其中係以結晶進 行分離。 5 ·如申請專利範圍第2項之方法，其中該式（D ) 化合物係與式（m )以及式（IV )化合物分離。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 9 ---；一一~ 1224141 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 6 ·如申請專利範圍第5項之方法，其中該經分離的 式（Π )化合物係回收成式（I )化合物，其係藉由氧化 該經分離的式（Π )化合物並將該經氧化的化合物消旋化 而成爲該式（1 )化合物。 7 ·如申請專利範圍第6項之方法，其中該消旋作用 包括使該經氧化的化合物與鹼反應。 8 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中該式（I ) 化合物的製備如申請專利範圍第6項中之定義。 9 .如申請專利範圍第1項之方法，其中該接觸係與 該微生物進行。 1 0 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中該接觸係 與該酵素還原系統進行。 1 1 ·如申請專利範圍第9項之方法，其中該微生物 是完整的微生物。 1 2 .如申請專利範圍第9項之方法，其中該微生物 是其破碎細胞製劑。 1 3 ·如申請專利範圍第9項之方法，其中該微生物 是其脫水的製劑。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1 4 ·如申請專利範圍第1 1項之方法，其中該完整 的微生物包括該完整的微生物之經淸洗細胞。 1 5 ·如申請專利範圍第1 4項之方法，其中該經淸 洗細胞係被固定化。 1 6 ·如申請專利範圍第1 〇項之方法，其中該酵素 還原系統之該酵素係經固定化。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4见格（210 X 297公釐） 1224141 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 1 7 ·如串請專利範圍第！ 3項之方法，其中該脫水 製劑是丙酮粉末酵素製劑。 1 8 .如申請專利範圍第9項之方法’其中該微生物 係在培養菌培養液中。 1 9 ·如申請專利範圍第i 8項之方法，其中該接觸 係藉由添加該式（I )化合物至該培養菌培養液中。 2 0 ·如申請專利範圍第1 Q項之方法，其中該酵素 還原系統係於溶劑中。 2 1 ·如申請專利範圍第1 〇項之方法，其中該接觸 係藉由添加該式（I )化合物至該溶劑中。 2 2 ·如申g靑專利範圍第9項之方法，其中該微生物 是該多形漢遜酵母A T C C N 〇 · 2 6 0 1 2或該多形 漢遜酵母ATCC No.74449。 2 3 ·如申請專利範圍第1 〇項之方法，其中包括該 酵素還原系統之該酵素係源自於該多形漢遜酵母A T c c No· 26012或該多形漢遜酵母at CC No· 7 4 4 4 9。 2 4 ·如申請專利範圍第1 8項之方法，其中該微生 物係該多形漢遜酵母A T C C N 〇 · 2 6 0 1 2或該多 形漢遜酵母A T C C N〇· 7 4 4 4 9。 2 5 ·如申請專利範圍第1 9項之方法，其中該微生 物係該多形漢遞酵母ATC C N 〇 · 2 6 0 1 2或該多 形漢遜酵母ATCC No . 74449。 2 6 ·如申請專利範圍第9項之方法，其中該微生物 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) *1T 鲁· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1224141 A8 B8 C8 D8 穴、申請專利乾圍 係藍色犁頭霉ATCC No . 20137。 2 7 ·如申請專利範圍第1 0項之方法，其中包括該 酵素還原系統之該酵素係源自該藍色犁頭霉A T C C N 〇 · 2 0 1 3 7。 2 8 ·如申請專利範圍第1 0項之方法，其中包括該 酵素還原系統之該酵素係源自該主要橄欖色單孢霉 ATCC No.36300。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家摞準（CNS ) A4規格（21〇X29*7公釐）