CN108795893B - 一种氨基酸脱氢酶突变体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种氨基酸脱氢酶突变体及其制备方法和应用，所述氨基酸脱氢酶突变体具有(I)、(II)所示的氨基酸序列中任意一个：(I)与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列；(II)与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的41至301位氨基酸经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；所述取代为取代1‑15个氨基酸；其中，所述突变体具有氨基酸脱氢酶的活性。本发明中通过设计41至301位氨基酸的多个不同位点的突变，发现这些突变体提高了氨基酸脱氢酶的催化活性，还可以降低氨基酸脱氢酶的使用量。

Description

一种氨基酸脱氢酶突变体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种氨基酸脱氢酶突变体及其制备方法和应用。
背景技术
氨基酸是至少有一个羧基和一个氨基的两性化合物，按照氨基酸的存在方式，可以分为天然氨基酸和非天然氨基酸两类，天然氨基酸是自然界中存在的氨基酸，非天然氨基酸是由人工合成的氨基酸，一般是在天然氨基酸的侧链上引入一些基团以优化其性能。氨基酸及其衍生物因为其特殊的结构的性质在农业，工业，化工，食品，医药等方面有着广泛的应用。光学活性的非天然氨基酸是一些生物活性肽的手性合成单元，也是许多药物和精细化学品的重要中间体。
由酮酸经过不对称还原氨化制备氨基酸是非天然氨基酸生产的重要方法，CN104016872A公开了一种手性α-非天然氨基酸的合成方法，在钯催化剂、氧化剂作用下进行反应生成α-非天然氨基酸；CN101759601A公开了利用过渡金属配合物制备手性α-非天然氨基酸的方法，该发明采用金属络合剂代替强酸性体系进行解络合，可以用于合成侧链含有对酸敏感基团的手性α-非天然氨基酸；与上述化学法相比，酶催化方法具有反应条件温和，反映过程不需要有机溶剂，不需要添加金属催化，立体选择性较高等优点。
苯丙氨酸脱氢酶催化天然氨基酸苯丙氨酸的氧化脱氨或还原氨化。然而对于苯环上取代的非天然氨基酸催化效率很低，酶的使用量很大。一般而言，可以通过定向进化的手段对野生型酶进行改造，提高酶的各种性质，从而可以应用在生产中。
发明内容
针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种氨基酸脱氢酶突变体及其制备方法和应用，所述氨基酸脱氢酶突变体，提高了其转化效率，稳定性，有利于其在制药领域中的应用。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种氨基酸脱氢酶突变体，其具有(I)、(II)所示的氨基酸序列中任意一个：
(I)与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(II)与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的41至301位氨基酸经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；
所述取代为取代1-15个氨基酸；
其中，所述突变体具有氨基酸脱氢酶的活性。
本发明中，发明人通过设计41至301位氨基酸的多个不同位点的突变，从而对氨基酸脱氢酶的性质进行考察，发现这些位点的突变会提高氨基酸脱氢酶的活性，还可以降低酶的使用量，发明人进一步发现，通过在41至301位氨基酸的多个不同位点的突变，可以提高氨基酸脱氢酶的酶活至少1倍以上。
本发明中，所述SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列如下：
MRDVFEMMDRYGHEQVIFCRHPQTGLKAIIALHNTTAGPALGGCRMIPYASTDEALEDVLRLSKGMTYKCSLADVDFGGGKMVIIGDPKKDKSPELFRVIGRFVGGLNGRFYTGTDMGTNPEDFVHAARESKSFAGLPKSYGGKGDTSIPTALGVFHGMRATARFLWGTDQLKGRVVAIQGVGKVGERLLQLLVEVGAYCKIADIDSVRCEQLKEKYGDKVQLVDVNRIHKESCDIFSPCAKGGVVNDDTIDEFRCLAIVGSANNQLVEDRHGALLQKRSICYAPDYLVNAGGLIQVADELEGFHEERVLAKTEAIYDMVLDIFHRAKNENITTCEAADRIVMERLKKLTDIRRILLEDPRNSARR.
在本发明的另一些实施例中，氨基酸脱氢酶的多个不同位点的突变体的氨基酸序列与氨基酸脱氢酶的氨基酸序列具有至少85％同一性的序列，且具有氨基酸脱氢酶的活性。
在本发明的一些实施例中，氨基酸脱氢酶突变体的氨基酸序列与氨基酸脱氢酶的氨基酸序列具有至少90％同一性的序列，且具有氨基酸脱氢酶的活性。
在本发明的一些实施例中，氨基酸脱氢酶突变体的氨基酸序列与氨基酸脱氢酶的氨基酸序列具有至少95％同一性的序列，且具有氨基酸脱氢酶的活性。
本发明中，所述修饰包括酰胺化、磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化、糖基化或羰基化中的任意一种或至少两种的组合。
所述取代为1-15个，例如可以是取代1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个，优选为1-9个。
本发明中，所述氨基酸脱氢酶突变体能够催化酮酸还原为氨基酸，所述酮酸类化合物为
Figure BDA0001709804300000031
其中，R1选自C1～C8烷基、C5～C10环烷基、C5～C10芳基、C5～C10杂芳基、R1和R2与羰基上的碳共同形成C5～C10杂环基、C5～C10碳环基、C5～C10杂芳基，所述C5～C10杂环基和C5～C10杂芳基中的杂原子各自独立地选自氮、氧和硫中的至少一种，所述C5～C10芳基中的芳基、C5～C10杂芳基中的杂芳基、C5～C10碳环基中的碳环基或C5～C10杂环基中的杂环基各自独立地未被取代或被卤素、烷氧基或烷基中的至少一个基团所取代，R2选自单键、C1～C8烷基、C5～C10环烷基、C5～C10芳基、C5～C10杂芳基、R1和R2与羰基上的碳共同形成C5～C10杂环基、C5～C10碳环基或C5～C10杂芳基，所述C5～C10杂环基和C5～C10杂芳基中的杂原子各自独立地选自氮、氧和硫中的至少一种，所述C5～C10芳基中的芳基、C5～C10杂芳基中的杂芳基、C5～C10碳环基中的碳环基或C5～C10杂环基中的杂环基各自独立地未被取代或被卤素、烷氧基或烷基中的至少一个基团所取代，优选地，所述R2选自单键；优选地，所述酮酸类化合物如式I所示；
具体反应式如下：
Figure BDA0001709804300000041
根据本发明，所述突变体的取代为第41位、第66位、第77位、第112位、第114位、第135位、第294位、第297位或第301位中的任意一个或至少两个的氨基酸被取代。
根据本发明，所述突变体的突变位点为L41A、M66A、M66V、F77A、F77V、Y112A、Y112V、Y112F、G114A、G114T、A135N、A135V、A135L、A135F、A135T、L294A、L294V、L294T、V297A或L301A中的任意一个或至少两个的组合。
本发明中，通过进一步实验验证，发明人发现这20个位点的突变，能够进一步提高氨基酸脱氢酶的性质，其中，第41位、第66位、第77位、第112位、第114位、第135位、第294位、第297位或第301位的突变会明显提高氨基酸脱氢酶的催化活性，突变体的催化活性相比于野生型酶本身提高不小于1倍，e.e.值能够达到99％以上。
根据本发明，所述取代为第66位、第77位、第112位、第135位、第294位或第301位中的任意一个或至少两个的氨基酸被取代。
根据本发明，所述突变体的突变位点为M66A、M66V、F77V、Y112A、Y112V、Y112F、A135N、A135V、A135L、A135F、A135T、L294A、L294V、L294T或L301A中的任意一个或至少两个的组合。
本发明中，通过进一步实验验证，发明人发现这6个位点的突变，能够进一步提高氨基酸脱氢酶的性质，其中，第66位、第77位、第112位、第135位、第294位或第301位的突变会明显提高氨基酸脱氢酶的催化活性，突变体的催化活性相比于野生型酶本身提高不小于3倍，e.e.值能够达到99％以上。
根据本发明，所述取代为第66位、第112位、第135位或第294位中的任意一个或至少两个的氨基酸被取代。
根据本发明，所述突变体的突变位点为M66A、Y112V、A135L、A135F、A135T、L294A、L294V或L294T中的任意一个或至少两个的组合。
本发明中，通过进一步实验验证，发明人发现这4个位点的突变，能够进一步提高氨基酸脱氢酶的性质，其中，第66位、第112位、第135位或第294位的突变会明显提高氨基酸脱氢酶的催化活性，突变体的催化活性相比于野生型酶本身提高不小于5倍，e.e.值能够达到99％以上。
本发明中，发明人通过进一步的考察，发现通过多个位点的组合突变能够进一步提高氨基酸脱氢酶的活性，所述突变体的取代为第66位和第294位的两个氨基酸被取代，第77位和第294位的两个氨基酸被取代，第112位和第294位的两个氨基酸被取代，第114位和第294位的两个氨基酸被取代，第135位和第294位的两个氨基酸被取代，第294位和第297位的两个氨基酸被取代，第294位和第301位的两个氨基酸被取代，第66位、第135位和第294位的三个氨基酸被取代，第77位、第112位和第294位的三个氨基酸被取代，第77位、第135位和第294位的三个氨基酸被取代，第112为、第114位和第294位的三个氨基酸被取代、第112为、第135位和第294位的三个氨基酸被取代、第114位、第135位和第294位的三个氨基酸被取代，第112为、第294位和第294位的三个氨基酸被取代、第112位、第294位和第301位的三个氨基酸被取代或第66位、第77位、第135位和第294位的四个氨基酸被取代中的任意一种时，突变体的催化活性相比于野生型酶本身提高不小于10倍，e.e.值能够达到99％以上。
根据本发明，所述突变体的突变位点为M66A和L294A的组合，F77V和L294A的组合，Y112F和L294A的组合，Y112V和L294A的组合，G114A和L294A的组合，A135L和L294A的组合，A135V和L294A的组合，A135F和L294A的组合，L294A和V297A的组合，L294A和L301A的组合，M66A、A135F和L294A的组合，F77V、Y112F和L294A的组合，F77A、A135F和L294A的组合，Y112F、G114A和L294A的组合，G114A、A135F和L294A的组合，或M66A、F77A、A135F和L294A的组合中的任意一种。
本发明中，发明人通过进一步的考察，发现L294A+Y112F、L294A+Y112F+A135V、L294A+Y112F+V297A、L294A+Y112F+G114、L294A+M66A、L294A+Y112V、L294A+A135F、L294A+L301A、L294A+A135F+M66A、L294A+A135F+G114A和L294A+A135F+M66A+F77A这11个突变体的催化活性最高，相比于野生型酶本身提高不小于50倍，e.e.值能够达到99％以上。
第二方面，本发明提供编码如第一方面所述的氨基酸脱氢酶突变体的核苷酸序列。
第三方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体含有至少一个拷贝的如第二方面所述的核苷酸序列。
第四方面，本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有第三方面所述的表达载体。
第五方面，本发明提供一种制备如第一方面所述的突变体的方法，包括：
(1)制备重组宿主细胞，其中所述细胞包含DNA分子，所述DNA分子包含编码根据第一方面所述突变体的核酸序列；
(2)在适合表达所述突变体的培养基中孵育所述宿主细胞；
(3)从所述培养基中回收步骤(2)中由所述宿主细胞表达的所述突变体的多肽。
第六方面，本发明提供一种组合物，所述组合物包括如第一方面所述的突变体的多肽。
根据本发明，所述组合物为干粉、片剂或液体中的任意一种或至少两种的组合。
第七方面，本发明提供一种如第一方面所述的突变体在催化氧化脱氨和/或还原氨化反应中的应用，优选为催化还原脱氨反应中的应用。
第八方面，本发明提供一种如第一方面所述的突变体在制备手性药物前体中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明中通过设计41至301位氨基酸的多个不同位点的突变，发现这些突变体提高了氨基酸脱氢酶的活性，还可以降低氨基酸脱氢酶的使用量；
(2)本发明通过验证发现在原氨基酸脱氢酶的基础上通过这9个位点的单独突变，即第41位、第66位、第77位、第112位、第114位、第135位、第294位、第297位或第301位，能够提高氨基酸脱氢酶的活性，通过将这9个位点的突变进行组合，得到的突变体中L294A+Y112F突变体、L294A+Y112F+A135V突变体、L294A+Y112F+V297A突变体、L294A+Y112F+G114突变体、L294A+M66A突变体、L294A+Y112V突变体、L294A+A135F突变体、L294A+L301A突变体、L294A+A135F+M66A突变体、L294A+A135F+G114A突变体和L294A+A135F+M66A+F77A突变体这11个突变体的催化活性最高，相比于野生型酶本身提高不小于50倍，e.e.值能够达到99％以上。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本发明所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1 单点突变(L41A)的氨基酸脱氢酶突变体
氨基酸脱氢酶突变体基因的构建：
为了提高来源于Thermoactinomyces intermedius的氨基酸脱氢酶(其氨基酸序列为SEQ ID NO.1，其编码核苷酸序列为SEQ ID NO.2)的催化活性，降低酶的使用量，对41位氨基酸进行突变，具体步骤如下：
所述SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列如下：
ATGCGTGACGTATTCGAAATGATGGATCGCTACGGCCACGAGCAGGTGATTTTCTGTCGTCATCCGCAGACTGGCCTGAAAGCGATCATCGCTCTGCATAACACCACTGCCGGTCCGGCACTGGGCGGTTGTCGCATGATTCCATACGCAAGCACCGATGAAGCTCTGGAAGACGTTCTGCGTCTGAGCAAAGGTATGACCTATAAATGCTCTCTGGCGGATGTTGATTTCGGTGGCGGTAAAATGGTGATTATCGGCGATCCGAAAAAGGATAAAAGCCCAGAACTGTTCCGTGTTATCGGTCGCTTCGTTGGCGGCCTGAACGGTCGTTTCTATACCGGTACTGATATGGGCACCAATCCGGAAGATTTCGTGCACGCCGCTCGCGAAAGCAAATCTTTTGCTGGTCTGCCTAAATCTTACGGTGGTAAAGGTGACACTTCTATCCCGACCGCACTGGGTGTATTTCACGGCATGCGCGCGACCGCCCGCTTTCTGTGGGGCACCGATCAACTGAAAGGTCGTGTTGTTGCTATCCAGGGTGTTGGCAAAGTGGGTGAACGTCTGCTGCAGCTGCTGGTGGAAGTGGGTGCATACTGCAAAATTGCTGATATTGACTCTGTACGTTGTGAGCAGCTGAAAGAAAAGTACGGCGACAAAGTCCAGCTGGTAGACGTGAACCGTATCCACAAAGAGTCTTGTGACATCTTCTCCCCGTGCGCAAAAGGCGGCGTAGTCAACGACGACACTATTGACGAATTCCGCTGCCTGGCGATTGTTGGTTCCGCGAACAATCAGCTGGTTGAAGATCGTCATGGCGCGCTGCTGCAAAAACGCTCCATTTGCTATGCCCCGGATTATCTGGTTAACGCTGGCGGTCTGATCCAGGTCGCAGACGAACTGGAGGGTTTTCACGAGGAGCGTGTGCTGGCGAAAACGGAAGCCATCTACGACATGGTTCTGGACATCTTCCACCGCGCTAAGAACGAAAACATCACTACCTGCGAAGCAGCGGACCGTATCGTAATGGAACGTCTGAAGAAGCTGACGGACATCCGTCGTATCCTGCTGGAAGATCCGCGTAACTCCGCGCGTCGT；
(1)引入突变：根据SEQ ID NO.2所示的核苷酸设计引物，设计包含有不同位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：
上游引物(SEQ ID NO.3)：ccactgccggtccggcagcgggcggttg；
下游引物(SEQ ID NO.4)：caaccgcccgctgccggaccggcagtgg；
将引物和模板质粒混合后，加入高保真Taq聚合酶KOD-Plus，进行全质粒PCR扩增，PCR结束后电泳检测PCR产物，所述PCR扩增体系如下表1所示：
表1
Figure BDA0001709804300000101
Figure BDA0001709804300000111
所述PCR反应的扩增条件如下表2所示：
表2
Figure BDA0001709804300000112
(2)转化：加入Dpn I酶，消化模板，转入大肠杆菌感受态BL21(DE3)中，37℃过夜培养，挑取单克隆到试管；
(3)诱导表达：由试管接种到1.5L摇瓶，37℃培养至OD600至1时，降低培养温度至25℃，加入终浓度为0.1mM IPTG诱导表达16h。
实施例2 单点突变(M66A)的氨基酸脱氢酶突变体
对M66A进行定点突变，具体步骤如下：
引入突变：设计包含有M66A位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：
上游引物(SEQ ID NO.5)：cgttctgcgtctgagcaaaggtgtgacctataaatgc；
下游引物(SEQ ID NO.6)：gcatttataggtcacacctttgctcagacgcagaacg；
其他方法和步骤同实施例1。
实施例3 单点突变(M66V)的氨基酸脱氢酶突变体
引入突变：设计包含有M66V位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：
上游引物(SEQ ID NO.7)：tctgcgtctgagcaaaggtgcgacctataaatgctctctg；
下游引物(SEQ ID NO.8)：cagagagcatttataggtcgcacctttgctcagacgcaga；
其他方法和步骤同实施例1。
实施例4 单点突变(F77A)的氨基酸脱氢酶突变体
引入突变：设计包含有F77A位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：
上游引物(SEQ ID NO.9)：tgctctctggcggatgttgatgccggtggcggta；
下游引物(SEQ ID NO.10)：taccgccaccggcatcaacatccgccagagagca；
其他方法和步骤同实施例1。
实施例5 单点突变(F77V)的氨基酸脱氢酶突变体
引入突变：设计包含有F77V位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：
上游引物(SEQ ID NO.11)：ctctctggcggatgttgatgtcggtggcgg；
下游引物(SEQ ID NO.12)：ccgccaccgacatcaacatccgccagagag；
其他方法和步骤同实施例1。
实施例6 单点突变(Y112A)的氨基酸脱氢酶突变体
引入突变：设计包含有Y112A位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：
上游引物(SEQ ID NO.13)：ggcctgaacggtcgtttcgctaccggtactgatatggg；
下游引物(SEQ ID NO.14)：cccatatcagtaccggtagcgaaacgaccgttcaggcc；
其他方法和步骤同实施例1。
实施例7 单点突变(Y112V)的氨基酸脱氢酶突变体
引入突变：设计包含有Y112V位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：
上游引物(SEQ ID NO.15)：ggcctgaacggtcgtttcgttaccggtactgatatggg；
下游引物(SEQ ID NO.16)：cccatatcagtaccggtaacgaaacgaccgttcaggcc；
其他方法和步骤同实施例1。
实施例8 单点突变(Y112F)的氨基酸脱氢酶突变体
引入突变：设计包含有Y112F位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：
上游引物(SEQ ID NO.17)：ggcctgaacggtcgtttctttaccggtactgata；
下游引物(SEQ ID NO.18)：tatcagtaccggtaaagaaacgaccgttcaggcc；
其他方法和步骤同实施例1。
实施例9 单点突变(G114A)的氨基酸脱氢酶突变体
引入突变：设计包含有G114A位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：
上游引物(SEQ ID NO.19)：ggtcgtttctataccgctactgatatgggcacc；
下游引物(SEQ ID NO.20)：ggtgcccatatcagtagcggtatagaaacgacc；
其他方法和步骤同实施例1。
实施例10 单点突变(G114T)的氨基酸脱氢酶突变体
引入突变：设计包含有G114T位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：
上游引物(SEQ ID NO.21)：gaacggtcgtttctataccactactgatatgggcaccaat；
下游引物(SEQ ID NO.22)：attggtgcccatatcagtagtggtatagaaacgaccgttc；
其他方法和步骤同实施例1。
实施例11 单点突变(A135N)的氨基酸脱氢酶突变体
引入突变：设计包含有A135N位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：
上游引物(SEQ ID NO.23)：cgccgctcgcgaaagcaaatcttttaatggtctgcctaaa；
下游引物(SEQ ID NO.24)：tttaggcagaccattaaaagatttgctttcgcgagcggcg；
其他方法和步骤同实施例1。
实施例12 单点突变(A135V)的氨基酸脱氢酶突变体
引入突变：设计包含有A135V位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：
上游引物(SEQ ID NO.25)：gctcgcgaaagcaaatcttttgttggtctgcctaaatc；
下游引物(SEQ ID NO.26)：gatttaggcagaccaacaaaagatttgctttcgcgagc；
其他方法和步骤同实施例1。
实施例13 单点突变(A135L)的氨基酸脱氢酶突变体
引入突变：设计包含有A135L位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：
上游引物(SEQ ID NO.27)：acgccgctcgcgaaagcaaatcttttctaggtctgcctaaatc；
下游引物(SEQ ID NO.28)：gatttaggcagacctagaaaagatttgctttcgcgagcggcgt；
其他方法和步骤同实施例1。
实施例14 单点突变(A135F)的氨基酸脱氢酶突变体
引入突变：设计包含有A135F位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：
上游引物(SEQ ID NO.29)：cgccgctcgcgaaagcaaatctttttttggtctgcctaaa；
下游引物(SEQ ID NO.30)：tttaggcagaccaaaaaaagatttgctttcgcgagcggcg；
其他方法和步骤同实施例1。
实施例15 单点突变(A135T)的氨基酸脱氢酶突变体
引入突变：设计包含有A135T位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：
上游引物(SEQ ID NO.31)：cgctcgcgaaagcaaatcttttactggtctgccta；
下游引物(SEQ ID NO.32)：taggcagaccagtaaaagatttgctttcgcgagcg；
其他方法和步骤同实施例1。
实施例16 单点突变(L294A)的氨基酸脱氢酶突变体
引入突变：设计包含有L294A位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：
上游引物(SEQ ID NO.33)：gttaacgctggcggtgcgatccaggtcgcaga；
下游引物(SEQ ID NO.34)：tctgcgacctggatcgcaccgccagcgttaac；
其他方法和步骤同实施例1。
实施例17 单点突变(L294V)的氨基酸脱氢酶突变体
引入突变：设计包含有L294V位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：
上游引物(SEQ ID NO.35)：gttaacgctggcggtgtgatccaggtcg；
下游引物(SEQ ID NO.36)：cgacctggatcacaccgccagcgttaac；
其他方法和步骤同实施例1。
实施例18 单点突变(L294T)的氨基酸脱氢酶突变体
引入突变：设计包含有L294T位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：
上游引物(SEQ ID NO.37)：ggttaacgctggcggtacgatccaggtcgcagac；
下游引物(SEQ ID NO.38)：gtctgcgacctggatcgtaccgccagcgttaacc；
其他方法和步骤同实施例1。
实施例19 单点突变(V297A)的氨基酸脱氢酶突变体
引入突变：设计包含有V297A位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：
上游引物(SEQ ID NO.39)：cggtctgatccaggccgcagacgaactgg；
下游引物(SEQ ID NO.40)：ccagttcgtctgcggcctggatcagaccg；
其他方法和步骤同实施例1。
实施例20 单点突变(L301A)的氨基酸脱氢酶突变体
引入突变：设计包含有L301A位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：
上游引物(SEQ ID NO.41)：atccaggtcgcagacgaagcggagggttttcacg；
下游引物(SEQ ID NO.42)：cgtgaaaaccctccgcttcgtctgcgacctggat；
其他方法和步骤同实施例1。
酶催化活性检测
(1)底物1的反应验证：10mL的反应瓶中加入底物1 50mg，1mL反应体系，氯化铵55mg、葡萄糖75mg、葡萄糖脱氢酶10mg、NAD+1mg、氨基酸脱氢酶10mg、0.1M Tris-HClbuffer；30℃反应18h，100μL体系加入900μL(0.1N HCl：MeOH＝1：1)，12000rpm离心3min，取上清进行检测，具体反应式如下：
Figure BDA0001709804300000171
检测ee值方法：取100μL反应体系，加100μL ACN，100μL H2O，100μL1M NaHCO3，12000rpm离心3min，取出上清，加入200μL 5mg/mL Na-(2,4-二硝基-5-氟苯基)-L-丙胺酰胺，50℃1h，加500μL ACN离心后取上清进行液相分析，结果如表3所示；
(2)底物2的反应验证：10mL的反应瓶中加入底物2 50mg，1mL反应体系，氯化铵55mg、葡萄糖75mg、葡萄糖脱氢酶10mg、NAD+1mg、氨基酸脱氢酶10mg、0.1M Tris-HClbuffer；30℃反应18h，100μL体系加入900μL(0.1N HCl：MeOH＝1：1)，12000rpm离心3min，取上清进行检测，具体反应式如下：
Figure BDA0001709804300000172
检测ee值方法：取100μL反应体系，加100μL ACN，100μL H2O，100μL1M NaHCO3，12000rpm离心3min，取出上清，加入200μL 5mg/mL Na-(2,4-二硝基-5-氟苯基)-L-丙胺酰胺，50℃1h，加500μL ACN离心后取上清进行液相分析，结果如表3所示；
表3
Figure BDA0001709804300000181
Figure BDA0001709804300000191
注：突变体相比于母本(野生型)提高的倍数，+提高1-3倍，++提高3-5倍，+++提高5-10倍，++++提高10-50倍，+++++提高大于50倍；
从表3可以看出，单点突变体的转化效果较母本有所提高，相比于野生型酶可以提高1倍以上，单点突变体中实施例2(M66A)、实施例3(M66V)、实施例5(F77V)、实施例6(Y112A)、实施例7(Y112V)、实施例8(Y112F)、实施例11(A135N)、实施例12(A135V)、实施例13(A135L)、实施例14(A135F)、实施例15(A135T)、实施例16(L294A)、实施例17(L294V)、实施例18(L294T)和实施例20(L301A)的突变体的催化活性显著提高，相比于野生型酶可以提高3倍以上；单点突变体中实施例2(M66A)、实施例7(Y112V)、实施例13(A135L)、实施例14(A135F)、实施例15(A135T)、实施例16(L294A)、实施例17(L294V)和实施例18(L294T)的突变体的催化活性显著提高，相比于野生型酶可以提高5倍以上；单点突变体中实施例2(M66A)、实施例14(A135F)、实施例15(A135T)、实施例16(L294A)和实施例18(L294T)的突变体的催化活性显著提高，相比于野生型酶可以提高10倍以上；一般而言，突变点的组合可以获得更优的突变体。
实施例21 多点突变的氨基酸脱氢酶突变体
通过DNA shuffling的方法将突变位点进行随机重组，建立突变文库，然后进行筛选，制备得到多点突变的氨基酸脱氢酶突变体，具体步骤如下：
(1)PCR获得带有L41A、M66A、M66V、F77A、F77V、Y112A、Y112V、Y112F、G114A、G114T、A135N、A135V、A135L、A135F、A135T、L294A、L294V、L294T、V297A和L301A突变位点的同源基因，将PCR产物进行纯化后，按照等摩尔量将这些基因进行混合，然后用核酸酶I消化成随机片段，由这些随机片段组成文库，互为引物和模板进行PCR扩增，当一个基因拷贝片段作为另一基因拷贝的引物时，发生模板互换和基因重组，所述N-PCR的反应体系如下表4所示：
表4
Figure BDA0001709804300000201
所述N-PCR反应的扩增条件如下表5所示：
表5
Figure BDA0001709804300000202
Figure BDA0001709804300000211
(2)转化和筛选：将制备得到的产物，转入大肠杆菌中，培养；
(3)酶液制备：96孔板离心去掉上清培养基，每孔加入200μL酶解溶液(溶菌酶2mg/mL，多黏菌素0.5mg/mL，pH＝7.0)，37℃保温破碎3h；
(4)高通量筛选：250μL测活体系：底物1或底物2终浓度2mM，NADPH终浓度0.3mM，破碎酶液加入量100μL，pH＝9.0，温度30℃，筛选得到的突变体进行摇瓶培养，再进行放大反应；
(5)诱导表达：25℃，0.1mM IPTG诱导过夜。
催化活性验证
(1)底物1的反应验证：10mL的反应瓶中加入底物1 50mg，1mL反应体系，氯化铵55mg、葡萄糖75mg、葡萄糖脱氢酶10mg、NAD+1mg、氨基酸脱氢酶10mg、0.1M Tris-HClbuffer；30℃反应18h，100μL体系加入900μL(0.1N HCl：MeOH＝1：1)，12000rpm离心3min，取上清进行检测，具体反应式如下：
Figure BDA0001709804300000221
检测ee值方法：取100μL反应体系，加100μL ACN，100μL H2O，100μL1M NaHCO3，12000rpm离心3min，取出上清，加入200μL 5mg/mL Na-(2,4-二硝基-5-氟苯基)-L-丙胺酰胺，50℃1h，加500μL ACN离心后取上清进行液相分析，结果如表6所示；
(2)底物2的反应验证：10mL的反应瓶中加入底物2 50mg，1mL反应体系，氯化铵55mg、葡萄糖75mg、葡萄糖脱氢酶10mg、NAD+1mg、氨基酸脱氢酶10mg、0.1M Tris-HClbuffer；30℃反应18h，100μL体系加入900μL(0.1N HCl：MeOH＝1：1)，12000rpm离心3min，取上清进行检测，具体反应式如下：
Figure BDA0001709804300000222
检测ee值方法：取100μL反应体系，加100μL ACN，100μL H2O，100μL1M NaHCO3，12000rpm离心3min，取出上清，加入200μL 5mg/mL Na-(2,4-二硝基-5-氟苯基)-L-丙胺酰胺，50℃1h，加500μL ACN离心后取上清进行液相分析，结果如表7所示；
表6
Figure BDA0001709804300000223
Figure BDA0001709804300000231
注：突变体相比于母本(野生型酶)提高的倍数，+提高1-3倍，++提高3-5倍，+++提高5-10倍，++++提高10-50倍，+++++提高大于50倍；
从表6可以看出，多点突变体相比于单点突变的转化效果大部分进一步的提高，可见多点突变会进一步提高氨基酸脱氢酶的性质，其中，多点突变体中L294A+Y112F突变体、L294A+Y112F+A135V突变体、L294A+Y112F+V297A突变体和L294A+Y112F+G114突变体对底物1的催化效率高，催化活性相比于野生型酶本身提高不小于50倍，e.e.值能够达到99％以上。
表7
突变位点 活性 e.e.(％)
N/A - 99
L294A+M66A +++++ 99
L294A+F77V ++++ 99
L294A+Y112V +++++ 99
L294A+G114A ++++ 99
L294A+A135F +++++ 99
L294A+V297A ++++ 99
L294A+L301A +++++ 99
L294A+A135F+M66A +++++ 99
L294A+A135F+F77A ++++ 99
L294A+A135F+G114A +++++ 99
L294A+A135F+M66A+F77A +++++ 99
注：突变体相比于母本(野生型)提高的倍数，+提高1-3倍，++提高3-5倍，+++提高5-10倍，++++提高10-50倍，+++++提高大于50倍；
从表7可以看出，多点突变体相比于单点突变的转化效果大部分进一步的提高，可见多点突变会进一步提高氨基酸脱氢酶的性质，其中，多点突变体中L294A+M66A突变体、L294A+Y112V突变体、L294A+A135F突变体、L294A+L301A突变体、L294A+A135F+M66A突变体、L294A+A135F+G114A突变体和L294A+A135F+M66A+F77A突变体对底物2的催化效率高，催化活性相比于野生型酶本身提高不小于50倍，e.e.值能够达到99％以上。
综上所述，本发明通过验证发现在原氨基酸脱氢酶的基础上通过这9个位点的单独突变，即第41位、第66位、第77位、第112位、第114位、第135位、第294位、第297位或第301位，能够提高氨基酸脱氢酶的活性，通过将这9个位点的突变进行组合，得到的突变体L294A+Y112F突变体、L294A+Y112F+A135V突变体、L294A+Y112F+V297A突变体、L294A+Y112F+G114突变体、L294A+M66A突变体、L294A+Y112V突变体、L294A+A135F突变体、L294A+L301A突变体、L294A+A135F+M66A突变体、L294A+A135F+G114A突变体和L294A+A135F+M66A+F77A突变体这11个突变体的催化活性最高，相比于野生酶本身提高不小于50倍，e.e.值能够达到99％以上。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 凯莱英医药集团（天津）股份有限公司
<120> 一种氨基酸脱氢酶突变体及其制备方法和应用
<130> 2018
<160> 42
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 366
<212> PRT
<213> 人工合成序列
<400> 1
Met Arg Asp Val Phe Glu Met Met Asp Arg Tyr Gly His Glu Gln Val
1 5 10 15
Ile Phe Cys Arg His Pro Gln Thr Gly Leu Lys Ala Ile Ile Ala Leu
20 25 30
His Asn Thr Thr Ala Gly Pro Ala Leu Gly Gly Cys Arg Met Ile Pro
35 40 45
Tyr Ala Ser Thr Asp Glu Ala Leu Glu Asp Val Leu Arg Leu Ser Lys
50 55 60
Gly Met Thr Tyr Lys Cys Ser Leu Ala Asp Val Asp Phe Gly Gly Gly
65 70 75 80
Lys Met Val Ile Ile Gly Asp Pro Lys Lys Asp Lys Ser Pro Glu Leu
85 90 95
Phe Arg Val Ile Gly Arg Phe Val Gly Gly Leu Asn Gly Arg Phe Tyr
100 105 110
Thr Gly Thr Asp Met Gly Thr Asn Pro Glu Asp Phe Val His Ala Ala
115 120 125
Arg Glu Ser Lys Ser Phe Ala Gly Leu Pro Lys Ser Tyr Gly Gly Lys
130 135 140
Gly Asp Thr Ser Ile Pro Thr Ala Leu Gly Val Phe His Gly Met Arg
145 150 155 160
Ala Thr Ala Arg Phe Leu Trp Gly Thr Asp Gln Leu Lys Gly Arg Val
165 170 175
Val Ala Ile Gln Gly Val Gly Lys Val Gly Glu Arg Leu Leu Gln Leu
180 185 190
Leu Val Glu Val Gly Ala Tyr Cys Lys Ile Ala Asp Ile Asp Ser Val
195 200 205
Arg Cys Glu Gln Leu Lys Glu Lys Tyr Gly Asp Lys Val Gln Leu Val
210 215 220
Asp Val Asn Arg Ile His Lys Glu Ser Cys Asp Ile Phe Ser Pro Cys
225 230 235 240
Ala Lys Gly Gly Val Val Asn Asp Asp Thr Ile Asp Glu Phe Arg Cys
245 250 255
Leu Ala Ile Val Gly Ser Ala Asn Asn Gln Leu Val Glu Asp Arg His
260 265 270
Gly Ala Leu Leu Gln Lys Arg Ser Ile Cys Tyr Ala Pro Asp Tyr Leu
275 280 285
Val Asn Ala Gly Gly Leu Ile Gln Val Ala Asp Glu Leu Glu Gly Phe
290 295 300
His Glu Glu Arg Val Leu Ala Lys Thr Glu Ala Ile Tyr Asp Met Val
305 310 315 320
Leu Asp Ile Phe His Arg Ala Lys Asn Glu Asn Ile Thr Thr Cys Glu
325 330 335
Ala Ala Asp Arg Ile Val Met Glu Arg Leu Lys Lys Leu Thr Asp Ile
340 345 350
Arg Arg Ile Leu Leu Glu Asp Pro Arg Asn Ser Ala Arg Arg
355 360 365
<210> 2
<211> 1098
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 2
atgcgtgacg tattcgaaat gatggatcgc tacggccacg agcaggtgat tttctgtcgt 60
catccgcaga ctggcctgaa agcgatcatc gctctgcata acaccactgc cggtccggca 120
ctgggcggtt gtcgcatgat tccatacgca agcaccgatg aagctctgga agacgttctg 180
cgtctgagca aaggtatgac ctataaatgc tctctggcgg atgttgattt cggtggcggt 240
aaaatggtga ttatcggcga tccgaaaaag gataaaagcc cagaactgtt ccgtgttatc 300
ggtcgcttcg ttggcggcct gaacggtcgt ttctataccg gtactgatat gggcaccaat 360
ccggaagatt tcgtgcacgc cgctcgcgaa agcaaatctt ttgctggtct gcctaaatct 420
tacggtggta aaggtgacac ttctatcccg accgcactgg gtgtatttca cggcatgcgc 480
gcgaccgccc gctttctgtg gggcaccgat caactgaaag gtcgtgttgt tgctatccag 540
ggtgttggca aagtgggtga acgtctgctg cagctgctgg tggaagtggg tgcatactgc 600
aaaattgctg atattgactc tgtacgttgt gagcagctga aagaaaagta cggcgacaaa 660
gtccagctgg tagacgtgaa ccgtatccac aaagagtctt gtgacatctt ctccccgtgc 720
gcaaaaggcg gcgtagtcaa cgacgacact attgacgaat tccgctgcct ggcgattgtt 780
ggttccgcga acaatcagct ggttgaagat cgtcatggcg cgctgctgca aaaacgctcc 840
atttgctatg ccccggatta tctggttaac gctggcggtc tgatccaggt cgcagacgaa 900
ctggagggtt ttcacgagga gcgtgtgctg gcgaaaacgg aagccatcta cgacatggtt 960
ctggacatct tccaccgcgc taagaacgaa aacatcacta cctgcgaagc agcggaccgt 1020
atcgtaatgg aacgtctgaa gaagctgacg gacatccgtc gtatcctgct ggaagatccg 1080
cgtaactccg cgcgtcgt 1098
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 3
ccactgccgg tccggcagcg ggcggttg 28
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 4
caaccgcccg ctgccggacc ggcagtgg 28
<210> 5
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 5
cgttctgcgt ctgagcaaag gtgtgaccta taaatgc 37
<210> 6
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 6
gcatttatag gtcacacctt tgctcagacg cagaacg 37
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 7
tctgcgtctg agcaaaggtg cgacctataa atgctctctg 40
<210> 8
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 8
cagagagcat ttataggtcg cacctttgct cagacgcaga 40
<210> 9
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 9
tgctctctgg cggatgttga tgccggtggc ggta 34
<210> 10
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 10
taccgccacc ggcatcaaca tccgccagag agca 34
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 11
ctctctggcg gatgttgatg tcggtggcgg 30
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 12
ccgccaccga catcaacatc cgccagagag 30
<210> 13
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 13
ggcctgaacg gtcgtttcgc taccggtact gatatggg 38
<210> 14
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 14
cccatatcag taccggtagc gaaacgaccg ttcaggcc 38
<210> 15
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 15
ggcctgaacg gtcgtttcgt taccggtact gatatggg 38
<210> 16
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 16
cccatatcag taccggtaac gaaacgaccg ttcaggcc 38
<210> 17
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 17
ggcctgaacg gtcgtttctt taccggtact gata 34
<210> 18
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 18
tatcagtacc ggtaaagaaa cgaccgttca ggcc 34
<210> 19
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 19
ggtcgtttct ataccgctac tgatatgggc acc 33
<210> 20
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 20
ggtgcccata tcagtagcgg tatagaaacg acc 33
<210> 21
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 21
gaacggtcgt ttctatacca ctactgatat gggcaccaat 40
<210> 22
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 22
attggtgccc atatcagtag tggtatagaa acgaccgttc 40
<210> 23
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 23
cgccgctcgc gaaagcaaat cttttaatgg tctgcctaaa 40
<210> 24
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 24
tttaggcaga ccattaaaag atttgctttc gcgagcggcg 40
<210> 25
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 25
gctcgcgaaa gcaaatcttt tgttggtctg cctaaatc 38
<210> 26
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 26
gatttaggca gaccaacaaa agatttgctt tcgcgagc 38
<210> 27
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 27
acgccgctcg cgaaagcaaa tcttttctag gtctgcctaa atc 43
<210> 28
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 28
gatttaggca gacctagaaa agatttgctt tcgcgagcgg cgt 43
<210> 29
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 29
cgccgctcgc gaaagcaaat ctttttttgg tctgcctaaa 40
<210> 30
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 30
tttaggcaga ccaaaaaaag atttgctttc gcgagcggcg 40
<210> 31
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 31
cgctcgcgaa agcaaatctt ttactggtct gccta 35
<210> 32
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 32
taggcagacc agtaaaagat ttgctttcgc gagcg 35
<210> 33
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 33
gttaacgctg gcggtgcgat ccaggtcgca ga 32
<210> 34
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 34
tctgcgacct ggatcgcacc gccagcgtta ac 32
<210> 35
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 35
gttaacgctg gcggtgtgat ccaggtcg 28
<210> 36
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 36
cgacctggat cacaccgcca gcgttaac 28
<210> 37
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 37
ggttaacgct ggcggtacga tccaggtcgc agac 34
<210> 38
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 38
gtctgcgacc tggatcgtac cgccagcgtt aacc 34
<210> 39
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 39
cggtctgatc caggccgcag acgaactgg 29
<210> 40
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 40
ccagttcgtc tgcggcctgg atcagaccg 29
<210> 41
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 41
atccaggtcg cagacgaagc ggagggtttt cacg 34
<210> 42
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 42
cgtgaaaacc ctccgcttcg tctgcgacct ggat 34

Claims (10)

1.一种氨基酸脱氢酶突变体，其特征在于，其为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的41至301位氨基酸经取代一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；
其中，所述突变体具有氨基酸脱氢酶的活性；
所述突变体的突变位点为L294A；
或者，所述突变体的突变位点为M66A和L294A的组合，F77V和L294A的组合，Y112F和L294A的组合，Y112V和L294A的组合，G114A和L294A的组合，A135L和L294A的组合，A135V和L294A的组合，A135F和L294A的组合，L294A和V297A的组合，L294A和L301A的组合，M66A、A135F和L294A的组合，F77V、Y112F和L294A的组合，F77A、A135F和L294A的组合，Y112F、G114A和L294A的组合，G114A、A135F和L294A的组合，或M66A、F77A、A135F和L294A的组合中的任意一种。
2.编码如权利要求1所述的氨基酸脱氢酶突变体的核苷酸序列。
3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有至少一个拷贝的如权利要求2所述的核苷酸序列。
4.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求3所述的表达载体。
5.一种制备如权利要求1所述的突变体的方法，其特征在于，包括：
(1)制备重组宿主细胞，其中所述细胞包含DNA分子，所述DNA分子包含编码根据权利要求1所述突变体的核酸序列；
(2)在适合表达所述突变体的培养基中孵育所述宿主细胞；
(3)从所述培养基中回收步骤(2)中由所述宿主细胞表达的所述突变体的多肽。
6.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括如权利要求1所述的突变体的多肽。
7.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述组合物为干粉、片剂或液体中的任意一种或至少两种的组合。
8.一种如权利要求1所述的突变体在催化氧化脱氨和/或还原氨化反应中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用为所述突变体在催化还原脱氨反应中的应用。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用为所述突变体在制备手性药物前体中的应用。
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