PT1664277E - Método de preparação de adn plasmídico de grau farmacêutico - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "MÉTODO DE PREPARAÇÃO DE ADN PLASMÍDICO DE GRAU FARMACÊUTICO"

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção refere-se à preparação de ADN plasmídico altamente purificado e, em particular, à produção e isolamento de ADN plasmídico de grau farmacêutico para utilização em terapia de base plasmídica.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Os desenvolvimentos em biologia molecular claramente sugerem que a terapia de base plasmídica, em particular no campo de vacinas e terapia génica humana, pode ser uma forma eficaz de tratar doenças. Um obstáculo significativo a esta tecnologia, contudo, é encontrar formas eficientes de distribuir o gene de interesse para dentro da célula. Um método promissor de distribuir segura e eficazmente um gene normal para dentro de células humanas é por meio de ADN plasmídico. 0 ADN plasmídico é uma forma fechada, circular, de ADN bacteriano dentro do qual uma sequência de ADN de interesse pode ser inserida. Uma vez distribuído à célula humana, o ADNp começa a replicar-se e a produzir cópias da sequência de ADN inserida. Deste modo, os investigadores encaram o ADN plasmídico como um veículo promissor para a distribuição de genes normais para dentro de células humanas, de modo a tratar uma variedade de estados de doença. 1

Para implementar esta nova tecnologia e terapia humana são necessárias enormes quantidades de ADN plasmídico para o desenvolvimento de investigação. Uma vez que o ADN plasmidico utilizado em terapia génica e outras aplicações clinicas é habitualmente produzido por bactérias, tal como Escherichia coli (E. coli), são necessários métodos para eficazmente separar o ADN plasmidico do ADN genómico (ADNg) da célula bacteriana, assim como de endotoxina e proteínas na célula bacteriana. Deste modo, existe uma necessidade crescente para processos simples, robustos e escaláveis de purificação que possam ser utilizados para isolar grandes quantidades de ADN plasmídico a partir de células bacterianas.

Uma etapa importante em qualquer processo de purificação plasmidica envolve a lise celular bacterianas, de modo a libertar os conteúdos celulares a partir dos quais o ADNp pode ser, depois, isolado. De facto, em primeiro lugar, é necessário alcançar três etapas de ressuspensão celular, lise celular e neutralização e precipitação de contaminantes de hospedeiro. A ressuspensão celular utiliza, normalmente, a agitação manual ou um agitador magnético e um homogeneizador ou misturador de rotor para ressuspender células no tampão de ressuspensão. A lise celular pode ser efectuada através de agitação em torvelinho manual ou agitação magnética, de modo a misturar as células ressuspensas com solução de lise (consistindo em alcali (base) diluida e detergentes); depois, manter a mistura, à temperatura ambiente (20-25 graus Celsius) ou sobre gelo, durante um período de tempo, tal como 5 minutos, até lise completa. Como notado acima, a agitação em torvelinho manual e agitação magnética não são escaláveis. A terceira fase é a neutralização e precipitação de contaminantes de hospedeiro. O lisado da segunda fase é, normalmente, misturado com uma solução de neutralização fria, 2 por agitação em torvelinho suave ou agitação magnética, para acidificar o lisado antes da colocação em gelo, durante 10-30 minutos, para facilitar a desnaturação e precipitação de ADN cromossómico de elevado peso molecular, proteínas de hospedeiro e outras moléculas de hospedeiro. A agitação em torvelinho manual e a agitação magnética não são escaláveis.

Em geral, a parede celular é digerida através de tratamento com lisozima, durante um tempo curto ou por meio de tratamento alcalino ou de acetato de potássio (KOAc) . A RNase também é, em geral, adicionada para degradar ARN da suspensão bacteriana. Estas etapas químicas podem ser eficientes na lise celular numa escala pequena. Contudo, o aumento em viscosidade torna o processamento de grande escala muito difícil. Um método simples e rápido alternativo para a preparação de plasmídeos compreende o tratamento com lisozima das bactérias, depois a ebulição a cerca de 100 °C num tampão apropriado, durante 20 a 40 segundos, formando um coágulo insolúvel de ADN genómico, proteína e detritos, deixando o plasmídeo em solução, com ARN como o principal contaminante. Em seguida, uma solução mista de NaOH e dodecilssulfato de sódio (SDS) é adicionada, para efeitos de dissolução da membrana citoplasmática. 0 NaOH desnatura parcialmente os ADN e degrada parcialmente os ARN e o SDS actua para dissolver a membrana e desnaturar proteínas. Sucessivamente, o complexo SDS-proteína e detritos celulares são precipitados através da adição de acetato de potássio a 5 N (pH 4,8) . Neste momento, o pH é importante para neutralizar o NaOH utilizado na referida manipulação e para renaturar o plasmídeo. Contudo, esta técnica não é adequada para o aumento de escala até um volume elevado de fermentações bacterianas e destina-se a fermentações inferiores a cinco litros. A seguir, é aplicada centrifugação para remover os precipitados obtendo-se, 3 deste modo, os plasmídeos visados no sobrenadante. Também, estas séries de manipulações requerem misturar lentamente e firmemente, de forma a evitar que o ADN cromossómico bacteriano seja cortado em pequenos fragmentos e agregue, fazendo com que contaminem o plasmídeo, e são difíceis de implementar num processamento de grande escala.

Um método alternativo comum de lisar células, conhecido como lise alcalina, consiste em misturar uma suspensão de células bacterianas (solução 1) com uma solução de lise alcalina (solução 2). A solução 2 consiste num detergente, e. g., dodecilssulfato de sódio (SDS), para lisar as células bacterianas e libertar o material intracelular e um alcali, e. g. , hidróxido de sódio, para desnaturar as proteínas e ácidos nucleicos das células (particularmente ADNg e ARN). À medida que as células são lisadas e o ADN é desnaturado, a viscosidade da solução aumenta dramaticamente. Após desnaturação, uma solução acídica, e. g. , acetato de potássio (solução 3), é adicionada para neutralizar o hidróxido de sódio, induzindo a renaturação de ácidos nucleicos. Os longos fragmentos de ADNg reassociam-se aleatoriamente e formam redes que precipitam como flocos, aprisionando proteínas, lípidos e outros ácidos nucleicos. 0 sal de potássio do dodecilssulfato também precipita, transportando as proteínas com as quais está associado. As duas cadeias de ADNp (ADN plasmídico), entrelaçadas entre si, reassociam-se de modo normal, para reformarem o plasmídeo inicial, que permanece em solução. A técnica anterior descreve, em geral, esta técnica de lise em modo descontínuo, i. e., onde as diferentes soluções são misturadas através da adição sequencial das soluções aos reservatórios ou tanques. Devido ao lisado alcalino ser um 4 fluido viscoelástico que é muito difícil manipular, uma dificuldade com este método ocorre durante a mistura das diferentes soluções. Uma vez que a tensão de cisalhamento causa a fragmentação de ADNg que, depois, se torna extremamente difícil de separar de ADNp, são necessários métodos para evitar a aplicação de tensões de cisalhamento ao fluido. Adicionalmente, o ADNp de grandes dimensões (i. e., mais de cerca de 10 quilopares de bases) também é susceptível a dano de cisalhamento durante o processo de mistura. Depois de a solução contendo a suspensão celular ter sido misturada com a solução de lise, o lisado alcalino viscoelástico é misturado com a solução de neutralização. De novo, este processo de mistura é problemático, devido às propriedades viscoelásticas da solução.

Adicionalmente, outra dificuldade no aumento de escala do processo de lise em descontínuo envolve a eficiência de mistura dos diferentes fluidos tentando, simultaneamente, limitar as tensões de cisalhamento, de forma a evitar a fragmentação do ADNg. Como notado anteriormente, o comportamento cromatográfico de ADN genómico fragmentado é muito semelhante ao de ADNp, de modo que se torna virtualmente impossível descartar por processos de purificação padrão. Deste modo, são evidentes várias limitações da utilização de um processo em descontínuo para lisar células bacterianas, tais como aumento de escala, fraca qualidade do ADNp recuperado, devido à contaminação por ADNg fragmentado e a quantidade relativamente baixa de ADNp obtida.

Em contraste com o método em descontínuo, também foram propostos vários métodos para continuamente misturar diversas soluções de lise celular, utilizando uma série de misturadores estáticos. De acordo com estes métodos, uma solução de suspensão 5 celular e uma solução de lise celular são simultaneamente adicionadas a um misturador estático. A solução celular lisada que abandona o primeiro misturador estático e uma solução de precipitação são, depois, simultaneamente adicionadas a um segundo misturador estático. A solução que sai deste segundo misturador contém o lisado precipitado e plasmídeos (WO 97. Outros modos contínuos de lise celular incluem a utilização de um permutador de calor de escoamento, onde as células suspensas são aquecidas a 70-100 °C. Após a lise celular no permutador de calor, a corrente de saída é submetida a centrifugação de fluxo contínuo ou em modo descontínuo, durante a qual os detritos celulares e ADN genómico são precipitados, deixando o ADN plasmídico no sobrenadante. 0 isolamento e purificação em grande escala de ADN plasmídico a partir de fermentações microbianas de grande volume requerem, por conseguinte, o desenvolvimento de um processo de preparação plasmídico melhorado. Não obstante os numerosos métodos actualmente utilizados para lisar células bacterianas, nenhum deles aborda os problemas causados pelas propriedades viscoelásticas dos fluidos e as forças de cisalhamento envolvidas durante as etapas de mistura. A presente invenção refere-se, deste modo, a um novo método para a lise alcalina contínua da suspensão celular bacteriana a uma grande escala e proporciona uma vantagem muito importante na limitação de forças de cisalhamento.

Outra etapa importante na preparação de ADN plasmídico é o isolamento ou separação e purificação de plasmídeo. As técnicas clássicas para o isolamento e purificação de ADN plasmídico a partir de fermentações bacterianas são adequadas para 6 preparações plasmídicas de escala pequena ou laboratorial. Após a disrupção de células hospedeiras bacterianas contendo o plasmídeo, seguida de neutralização por acetato, causando a precipitação de ADN genómico e proteínas de célula hospedeira são, em geral, removidos por, por exemplo, centrifugação. A fase liquida contém o ADN plasmidico que é precipitado por álcool e, depois, submetido a centrifugação isopícnica, utilizando CsCl na presença de brometo de etidio, para separar as diversas formas de ADN plasmidico, i. e., superenrolado, circulo entalhado e linearizado. É requerida extracção adicional com butanol para remover o brometo de etidio residual, seguida de precipitação de ADN utilizando álcool. Seguem-se etapas de purificação adicionais para remover proteínas de célula hospedeira.

Estes métodos actuais, para isolamento de ADN plasmidico, têm várias limitações. Por exemplo, os métodos de purificação que envolvem a utilização de grandes quantidades de solventes orgânicos inflamáveis (e. g. , etanol e isopropanol) e substâncias químicas tóxicas, e. g. , brometo de etidio, fenol e clorofórmio são, em geral, indesejáveis para o isolamento e purificação em grande escala de ADN plasmidico. Para purificação de ADN plasmidico podem ser utilizados métodos alternativos à centrifugação de cloreto de césio, tais como cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia sobre hidroxiapatite e diversos métodos cromatográficos baseados em permuta de fase reversa ou aniónica. Estas alternativas podem ser adequadas para produzir pequenas quantidades de material de investigação, numa escala laboratorial mas, em geral, não são facilmente escaláveis e não são capazes de produzirem as quantidades de ADN plasmidico. 7

Através de uma série de manipulações, como descritas acima, é possível obter-se plasmídeo com pureza relativamente elevada (a seguir, o referido método de separação e purificação de ácido nucleico é referido como método de separação química). Contudo, com o método de separação química, o processo de separação e purificação é complicado e uma grande quantidade de solvente orgânico tem de ser utilizada, por este motivo coloca muitos problemas de tratamento de resíduos de solventes e outros.

Além do método de separação e purificação química, existe um método de separação de plasmídeos por electroforese. 0 método electroforético inclui electroforese em papel e electroforese em gel e, actualmente, é comum a electroforese em gel. 0 método electroforético tem uma vantagem de obtenção de plasmídeo com elevada pureza, contudo tem muitos problemas de tempo de separação longo, recolha difícil, carregamento de pouca amostra, etc. Consequentemente, é uma situação presente que a separação electroforética é utilizada apenas quando a pureza da fracção plasmídica, purificada pelo referido método de separação e purificação química, é desejada para melhoramento adicional.

Os métodos actualmente disponíveis para separação das duas formas de ADN plasmídico utilizam cromatografia de permuta iónica (Duarte et al. , Journal of Chromatography A, 606 (1998), 31-45) ou cromatografia de exclusão de tamanho (Prazeres, D.M., Biotechnology Techniques Vol. 1, N° 6, Junho de 1997, p. 417-420), ligadas com a utilização de aditivos, tais como polietilenoglicol (PEG), detergentes e outros componentes, tais como hexamina cobalto, espermidina e polivinilpirrolidona (PVP) . Contudo, os métodos actualmente conhecidos não são capazes de proporcionar uma separação eficiente e eficaz em termos de custos de ADN superenrolado e entalhado (ou relaxado).

Adicionalmente, muitos dos métodos conhecidos sofrem da desvantagem da utilização de PEG ou outros aditivos que podem não ser desejados na preparação de ADN plasmídico, visto que requerem métodos adicionais de separação, eliminação e controlo de qualidade, que podem ser difíceis, mais demorados e mais dispendiosos. As formas alternativas de métodos conhecidos para separação de formas superenroladas e relaxadas de ADN plasmídico utilizam resinas muito dispendiosas, proprietárias, que também utilizam solventes, tais como acetonitrilo, etanol e outros componentes, como trietilamina e fosfato de tetrabutilamónio, durante o processamento. Métodos adicionais de separação de ADN superenrolado e relaxado baseiam-se em cromatografia de exclusão de tamanho, que envolve a separação das duas formas de ADN plasmídico com base na pequena diferença em tamanho. Estas colunas tendem a ser relativamente longas, colocando problemas significativos de aumento de escala, tornando inexequível a implementação em produção de grande escala. Adicionalmente, os métodos de exclusão de tamanho necessitam de soluções concentradas de amostra que são inexequíveis de obter com soluções de ADN plasmídico, devido à natureza altamente viscosa do ADN. As preparações de ADN plasmídico, que são produzidas a partir de preparações bacterianas e frequentemente contêm uma mistura de ADN plasmídico relaxado e superenrolado, frequentemente requerem a remoção de endotoxina, como requerido pela FDA, visto que as endotoxinas produzidas por muitos hospedeiros bacterianos são conhecidas por causarem reacções inflamatórias, tais como febre ou sépsia, no hospedeiro recebendo o ADN plasmídico. Estas endotoxinas são, em geral, lipopolissacáridos, ou seus fragmentos, que são componentes da membrana externa de bactérias Gram-negativas e estão presentes na preparação de ADN das células hospedeiras e membranas ou macromoléculas de células hospedeiras. Por este motivo, a 9 remoção de endotoxinas é uma etapa crucial e necessária na purificação de ADN plasmídico para utilização terapêutica ou profiláctica. A remoção de endotoxina de soluções de ADN plasmídico utilizava, principalmente, a estrutura negativamente carregada das endotoxinas. Contudo, o ADN plasmídico também está carregado negativamente e, por este motivo, a separação é habitualmente alcançada com resinas de permuta aniónica que se ligam a estas moléculas e, sob determinadas condições eluem, de um modo preferido, ADN plasmídico ligando-se, simultaneamente, às endotoxinas. Essa separação resulta na remoção apenas parcial, visto que quantidades significativas de endotoxinas eluem com o ADN plasmídico e/ou é alcançada uma recuperação muito fraca de ADN plasmídico. 0 isolamento e purificação de grande escala de ADN plasmídico a partir de fermentações microbianas de grande volume requerem, deste modo, o desenvolvimento de um processo de preparação plasmídico melhorado. Também é requerido um processo para a separação e purificação de uma grande quantidade de ADN plasmidro de forma mais simples e num tempo mais curto. Também é desejável para a investigação e terapia de base plasmídica que os ácidos nucleicos possam ser separados e purificados, mantendo a mesma estrutura num modo reproduzível e de modo a evitar o efeito adverso de impurezas no corpo humano, requer-se que os ácidos nucleicos tenham sido separados e purificados até elevada pureza.

Com o referido método convencional, contudo, existe um problema que os ácidos nucleicos com pureza suficientemente elevada, em particular ADN plasmidro, não podem ser obtidos em grande quantidade. Por conseguinte, a presente invenção visa proporcionar um método de separação que utiliza, pelo menos, 10 duas etapas de cromatografia, que possibilitam separar uma grande quantidade de ADN plasmidicos num tempo mais curto e com um grau de pureza mais elevado.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A invenção é baseada na verificação de um método para a produção e isolamento de ADN plasmídico altamente purificado. 0 ADN plasmídico produzido e isolado pelo método da invenção contém níveis muito baixos de ADN cromossómico contaminante, ARN, proteína e endotoxinas. 0 ADN plasmídico produzido de acordo com a invenção é de pureza suficiente para terapia de base plasmídica.

Deste modo, a invenção abrange um dispositivo de lise celular alcalina contínua, compreendendo: — um primeiro misturador ou injector, capaz de injectar uma solução de lise na direcção oposta de uma suspensão celular; — um primeiro tubo de pequeno diâmetro, de modo a gerar um fluxo turbulento dentro da mistura; — um segundo tubo de um grande diâmetro, de modo a gerar um fluxo laminar dentro da mistura; — um segundo misturador ou injector para injectar a solução neutralizante numa extremidade e recolher, na outra extremidade, a mistura.

Ainda noutra forma de realização, o mecanismo pode ser utilizado num método para isolar ADN plasmídico de células, 11 compreendendo: (a) mistura das células com uma solução de lise alcali no meio para fluxo turbulento e (b) neutralização da solução de lise alcalina através da adição de uma solução acidica. A invenção abrange, adicionalmente, um método de produção e isolamento de ADN plasmídico altamente purificado que está essencialmente isento de contaminantes e, deste modo, é ADN de grau farmacêutico.

Outro objectivo da presente invenção refere-se a um método para a separação e purificação de ácidos nucleicos e ADN plasmídico. Em maior detalhe, refere-se a um método para a separação de ácidos nucleicos e ADN plasmídico de grau farmacêutico, que são úteis para investigação e terapia de base plasmídica. Uma preparação de ADN plasmídico, isolada de acordo com os métodos da invenção, pode ser submetida a etapas de purificação incluindo, pelo menos, cromatografia de hélice tripla e, adicionalmente, pode incluir cromatografia de permuta aniónica e cromatografia de interacção hidrófoba.

Estes métodos incluem, deste modo, a etapa de lise alcalina contínua aqui descrita, em combinação com cromatografia de permuta aniónica e cromatografia de hélice tripla subsequentes e, adicionalmente, cromatografia de interacção hidrófoba.

Estes métodos também incluem, deste modo, a etapa de lise alcalina contínua aqui descrita, em combinação com etapas subsequentes de cromatografia de permuta aniónica e cromatografia de hélice tripla e cromatografia de interacção hidrófoba em combinação. Uma filtração de lisado ou outra 12 remoção de floculado pode preceder a primeira etapa de cromatograf ia.

Outro objectivo da invenção é maximizar o rendimento de ADN plasmídico de uma combinação de célula hospedeira/ADN plasmídico.

Outro objectivo da invenção é proporcionar uma preparação de ADN plasmídico que seja substancialmente isenta de ARN de hospedeiro bacteriano.

Outro objectivo da invenção é proporcionar uma preparação de ADN plasmídico que seja substancialmente isenta de proteína de hospedeiro bacteriano.

Outro objectivo da invenção é proporcionar uma preparação de ADN plasmídico que seja substancialmente isenta de ADN cromossómico de hospedeiro bacteriano.

Outro objectivo da invenção é proporcionar uma preparação de ADN plasmídico que seja substancialmente isenta de endotoxinas de hospedeiro bacteriano.

Outro objectivo da presente invenção é proporcionar um método para a preparação de ADN plasmídico de grau farmacêutico que seja altamente puro, para utilização em investigação e terapia de base plasmídica e seja passível de aumento de escala para preparação em grande escala.

Finalmente, a presente invenção refere-se a um dispositivo de lise celular alcalina contínua, compreendendo um primeiro misturador ou injector, capaz de injectar um fluido alcalino na 13 direcção oposta da suspensão celular, um primeiro tubo de pequeno diâmetro, de modo a gerar um fluxo turbulento dentro da mistura, um segundo tubo de um grande diâmetro, de modo a gerar um fluxo laminar dentro da mistura, um segundo misturador ou injector para injectar a solução neutralizante numa extremidade e a recolha, na outra extremidade, da mistura.

Os objectivos e vantagens adicionais da invenção serão expostos, em parte, na descrição que se segue e, em parte, serão óbvios a partir da descrição ou podem ser aprendidos pela prática da invenção. Os objectivos e vantagens da invenção serão compreendidos e alcançados por meio dos elementos e combinações particularmente salientados nas reivindicações anexas.

Deve ser compreendido que a descrição geral anterior e a descrição detalhada seguinte são apenas exemplificativas e explicativas e não são restritivas da invenção, como reivindicada.

Os desenhos anexos, que são incorporados e constituem uma parte desta descrição, ilustram uma (várias) forma(s) de realização da invenção e, juntamente com a descrição, servem para explicar os princípios da invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 é um esquema do aparelho que pode ser utilizado para a lise celular de modo contínuo da invenção. A Figura 2 é um esquema do misturador Ml no aparelho de lise celular contínua. 14 A Figura 3 é uma tabela comparando rendimentos de purificação em termos dos contaminantes ADNg, ARN, proteínas, endotoxina, utilizando uma única etapa de cromatografia de permuta aniónica (AEC), ou um método de duas etapas, com uma etapa de cromatografia de permuta aniónica, em combinação com cromatografia de afinidade de hélice tripla (THAC) e um método de três etapas, compreendendo uma etapa de cromatografia de permuta aniónica, uma etapa de cromatografia de afinidade de hélice tripla e uma etapa de cromatografia de interacção hidrófoba (HIC) em combinação. ND significa não detectado: métodos analíticos de baixa sensibilidade. A Figura 4 é uma tabela comparando diversos métodos de separação e purificação de ADN plasmídico, tais como cromatografia de permuta aniónica (AEC), HAC, cromatografia de hidroxiapatite (HAC), cromatografia de interacção hidrófoba (HIC), cromatografia de fase reversa (RPC), cromatografia de exclusão de tamanho (SEC), cromatografia de afinidade de hélice tripla (THAC), isoladamente ou em combinação, e o método de acordo com a presente invenção. São aqui proporcionados resultados em termos de qualidade do ADN plasmídico purificado. ND, não detectado (métodos analíticos de baixa sensibilidade).

As Figuras 5A e 5B são gráficos mostrando taxas de depurinação e entalhamento (formação de forma plasmídica circular aberta) do ADN plasmídico, armazenado a +25 °C e +5 °C, durante até 90 dias. 15

Definições

Acídico significa relativo ou contendo um ácido; tendo um pH inferior a 7.

Alcalino significa relativo ou contendo um alcali ou base; tendo um pH superior a 7.

Continuo significa não interrompido, não tendo interrupção. ADN genómico significa um ADN que é derivado ou existindo num cromossoma.

Fluxo laminar significa o tipo de fluxo numa corrente de água de solução, na qual cada partícula se move numa direcção paralela a cada partícula.

Lisado significa o material produzido pelo processo de lise celular. 0 termo lise refere-se à acção de ruptura da parede celular e/ou membrana celular de uma célula que está numa solução tamponada (i. e., suspensão celular), através de tratamento químico, utilizando uma solução contendo um agente de lise. Os agentes de lise incluem, por exemplo, alcali, detergentes, solventes orgânicos e enzimas. Numa forma de realização preferida, a lise celular é realizada para libertar plasmídeos intactos de células hospedeiras.

Neutraliza para tornar (uma solução) neutra ou para causar (um ácido ou base/alcali) a sofrer neutralização. Por este termo, significa-se que algo que neutraliza uma solução conduz o pH da solução a um pH entre 5 e 7 e, de um modo preferido, em 16 torno de 7 ou, de um modo mais preferido, mais próximo de 7 do que anteriormente.

Fluido Newtoniano é um fluido no qual a tensão de cisalhamento é proporcional ao gradiente de velocidade e perpendicular ao plano de cisalhamento. A constante de proporcionalidade é conhecida como a viscosidade. Os exemplos de fluidos Newtonianos incluem líquidos e gases. 0 fluido não-Newtoniano é um fluido no qual a tensão de cisalhamento não é proporcional unicamente ao gradiente de velocidade e perpendicular ao plano de cisalhamento. Os fluidos não-Newtonianos podem não ter uma viscosidade bem definida. Os fluidos não-Newtonianos incluem sólidos plásticos, fluidos de lei de potência, fluidos viscoelásticos (tendo propriedades viscosas e elásticas) e fluidos de viscosidade dependente de tempo. ADN plasmídico significa uma pequena inclusão celular, consistindo num anel de ADN que não é um cromossoma, que pode ter a capacidade de ter um fragmento de ADN não endógeno inserido dentro do mesmo. Os processos para a construção de plasmídeos incluem os descritos em Maniatis et al. , Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) .

Para efeitos da presente invenção, o termo fluxo refere-se à passagem de um líquido, a um particular caudal (e. g. , litros por minuto), através do misturador, habitualmente pela acção de uma bomba. Deve ser notado que se pensa que o caudal através do misturador afecta a eficiência de lise, precipitação e mistura. 17 ADN "entalhado" ou "relaxado" significa ADN que não é superenrolado. ADN "superenrolado" é um termo bem compreendido na técnica.

Uma "impureza contaminante" é qualquer substância a partir da qual se deseja separar, ou isolar, ADN. As impurezas contaminantes incluem, mas não estão limitadas a proteínas de célula hospedeira, endotoxina, ADN e/ou ARN de célula hospedeira. Compreende-se que o que é considerado uma impureza contaminante pode depender do contexto no qual os métodos da invenção são praticados. Uma "impureza contaminante" pode ou não ser derivada de célula hospedeira, i. e., pode ou não ser uma impureza de célula hospedeira. "Isolamento" ou "purificação" de um primeiro componente (tal como ADN) significa enriquecimento do primeiro componente de outros componentes com os quais o primeiro componente se encontra inicialmente. São aqui proporcionadas extensões de purificação desejada e/ou obtenível.

Os termos essencialmente isento e altamente purificado são definidos como cerca de 95% e, de um modo preferido, mais de 98,99% puro ou isento de contaminantes, ou possuindo menos de 5% e de, um modo preferido, menos de 1-2% de contaminantes. 0 ADN de grau farmacêutico é aqui definido como uma preparação de ADN que não contém mais de cerca de 5% e, de um modo preferido, não mais de cerca de 1-2% de componentes celulares, tal como membranas celulares. ADN plasmídico de grau farmacêutico, é aqui definido como uma preparação de ADN que contém parte por milhão ou ppm 18 (< 0,0001%, i. e., < 0,0001 mg por 100 mg de ADN plasmídico) dos contaminantes ADN genómico, ARN e proteína.

Mais precisamente, ADN plasmídico de grau farmacêutico, significa aqui uma preparação de ADN que contém menos de cerca de 0,01%, ou menos de 0,001% e, de um modo preferido, menos de 0. 0001% ou, de um modo preferido, menos de 0,00008% (< 0,00008%,

1. e., < 0, 00008 mg por 100 mg de ADN plasmídico) de ADN cromossómico ou ADN genómico. ADN plasmídi co de grau farmacêutico, significa aqui uma preparação de ADN que contém menos de cerca de 0,01%, ou menos de 0,0 01% e, de um modo preferido, menos de 0,0001% ou, de um modo preferido, menos de 0,00002% (< 0,00002%, i . e. , < 0, 00002 mg por 100 mg de ADN plasmídico) de contaminantes de ARN. ADN plasmídico de grau farmacêutico, significa aqui uma preparação de ADN que contém menos de cerca de 0,001% e, de um modo muito preferido, menos de 0,00005% (< 0,00005%, i. e., < 0,00005 mg por 100 mg de ADN plasmídico) de contaminantes proteicos. ADN de grau farmacêutico, significa aqui uma preparação de ADN que contém menos de 0,1 EU/mg de endotoxinas. ADN de grau farmacêutico, significa aqui uma preparação de ADN que é, de um modo preferido, predominantemente circular em forma e, de um modo mais preciso, que contém mais de 80%, 85%, 90%, 95% ou mais de 99% de ADN plasmídico de forma circular fechada. 19

Tubo em T refere-se a uma configuração de tubagem em forma de T, em que uma forma em T é formada por um única peça de tubagem criada nessa configuração, ou mais de uma peça de tubagem combinada para criar essa configuração. 0 tubo em T tem três braços e uma área central onde os braços se unem. Um tubo em T pode ser utilizado para misturar ingredientes, visto que dois fluidos podem fluir cada para dentro de um dos braços do T, unidos na área central e para fora do terceiro braço. A mistura ocorre à medida que os fluidos se combinam. Um verificador

Fluxo turbulento significa movimento aleatório irregular de partículas de fluido em direcções transversais à direcção do fluxo principal, no qual a velocidade num determinado ponto varia erraticamente em magnitude e direcção.

Viscoelástico refere-se a fluidos tendo propriedades viscosas e elásticas.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A invenção é baseada na verificação de um método escalável para a produção de um elevado rendimento de ADN plasmídico de grau farmacêutico. Em particular, a invenção é baseada na verificação de um método para a produção e isolamento de ADN plasmidico altamente purificado, utilizando uma lise alcalina contínua de células hospedeiras.

Como uma primeira etapa, as células hospedeiras são inoculadas, i. e., transformadas com um ADN plasmídico em células na fase de crescimento exponencial e riscadas sobre placas contendo meio LB, contendo um antibiótico, tal como 20 tetraciclina. Colónias únicas da placa são, depois, inoculadas cada dentro de 20 mL de meio LB, suplementado com o antibiótico tetraciclina apropriado, em frascos Erlenmeyer de plástico estéreis separados e cultivadas, durante 12-16 horas, a 37 graus, numa incubadora agitada. Uma destas culturas foi, depois, utilizada para inocular 200 mL de meio LB estéril suplementado num frasco Erlenmeyer de 2 L. Esta foi cultivada, a 37 °C e 200 rpm, numa incubadora agitada e utilizada para inocular dois frascos Erlenmeyer de 5 L e cultivada, a 30 °C e 200 rpm, numa incubadora agitada e utilizada para inocular o reservatório fermentador, quando em fase semiexponencial, após 5 horas e a uma OD600 nm de 2 unidades.

As culturas de células hospedeiras e a inoculação são bem conhecidas na técnica. Em geral, as células hospedeiras são cultivadas até atingirem elevada biomassa e as células estarem em crescimento exponencial, de modo a ter-se uma grande quantidade de ADN plasmídico. Podem ser empregues dois métodos distintos, i. e., fermentação descontinua e semicontinua. A fermentação em descontinuo permite que a taxa de crescimento seja controlada através de manipulação da temperatura de crescimento e da fonte de carbono utilizada. Como aqui utilizado, a expressão "fermentação em descontinuo" é um processo de cultura celular, pelo qual todos os nutrientes requeridos para crescimento celular e para produção de plasmideo contido nas células cultivadas estão no reservatório em grande excesso (por exemplo, excesso de 10 vezes em relação a concentrações de nutrientes da técnica anterior) no momento da inoculação obviando, desse modo, a necessidade de realizar adições ao reservatório estéril depois das adições 21 pós-esterilização e a necessidade para modelos de alimentaçao e estratégias complexos.

Outro tipo de fermentação útil de acordo com a invenção é a fermentação semicontínua, na qual a taxa de crescimento celular é controlada pela adição de nutrientes à cultura durante o crescimento celular. Como aqui utilizado, "fermentação semicontínua", refere-se a um processo de cultura celular, no qual a taxa de crescimento é controlada por adições cuidadosamente monitorizadas de metabolitos à cultura durante a fermentação. A fermentação semicontínua, de acordo com a invenção, permite que a cultura celular atinja uma biomassa mais elevada do que a fermentação em descontínuo.

Exemplos do processo de fermentação e taxas exemplificativas de adição de alimentação são descritos abaixo para uma preparação de 50 L. Contudo, outros volumes, por exemplo 10 L, 50 L ou superiores a 500 L, também podem ser processados utilizando as taxas de alimentação exemplificativas descritas abaixo, dependendo da escala do equipamento.

As fermentações de meio em descontínuo e meio semicontínuo altamente enriquecidas são apropriadas para a produção de cultura de elevada densidade celular, para maximizar o rendimento específico de plasmídeo e permitir a recolha a elevada biomassa, enquanto ainda em crescimento exponencial. A Fermentação Semicontínua utiliza glucose ou glicerol como uma fonte de carbono. A fermentação é realizada em modo descontínuo até o substrato (glucose) de carbono inicial ser gasto. Este ponto é notado por uma súbita subida em DO e confirmado por análise de glucose de uma amostra retirada 22 imediatamente após este evento. A bomba de alimentação de meio anteriormente pré-injectada é, depois, ligada. 0 débito da bomba é determinado por um modelo derivado de Curless et al. , (Bíoeng. 38:1082-1090, 1991), cuja totalidade é aqui incorporada por referência. O modelo é concebido para facilitar o controlo da fase de alimentação de um processo semicontinuo. No processo em descontinuo inicial, uma concentração não inibitória de substrato é consumida por células crescendo à sua taxa de crescimento especifica máxima, max, proporcionando um rápido aumento nos niveis de biomassa após inoculação. A cultura não pode crescer a esta taxa indefinidamente, devido à acumulação de metabolitos tóxicos (Fieschio et al., "Fermentation Technology Using Recombinant Microorganisms", In Biotechnology, eds. H. J. Rhem e G. Reed. Weinheim: VCH Verlagsgesellschaft mbH 7b: 117-140, 1989). Para permitir o crescimento logarítmico continuado, o modelo calcula a taxa de alimentação de base temporal do substrato de carbono limitante do crescimento, sem a necessidade para controlo de retroacção, para proporcionar uma fase de crescimento em semicontinuo, a uma regulação pelo operador. Esta é escolhida a um nível que não cause a acumulação de catabolitos inibitórios e seja suficiente para proporcionar elevada biomassa.

Em geral, a fermentação em descontínuo utiliza níveis elevados (e. g. , 4 vezes mais elevados do que concentrações da técnica anterior) de precursores que estão presentes no meio em descontínuo enriquecido. Em particular, as quantidades de extracto de levedura no meio em descontínuo enriquecido formam 5 g/L (como em meio LB) a 20 g/litro proporcionando, deste modo, enormes quantidades de factores de crescimento e precursores de ácido nucleico. O meio também é suplementado com sulfato de amónio (5 g/L), que actua como uma fonte de azoto orgânico. As 23 adições de precursores (azoto orgânico, na forma de sulfato de amónio) durante o processo de alimentação na fermentação semicontinua são concebidas para prevenirem efeitos deletérios na qualidade de plasmideo.

Um aspecto importante do método de acordo com a presente invenção é a lise celular. Deste modo, a presente invenção abrange um processo para a produção e isolamento de ADN plasmidico altamente purificado que inclui a etapa de lise celular, na qual existe (a) um meio para fluxo turbulento, para rapidamente misturar uma suspensão celular (solução 1 na Figura 1) com uma solução que lisa as células (solução 2 na Figura 1); e (b) um meio para fluxo laminar, para permitir a incubação de uma mistura formada em (a) sem agitação substancial, em que a mistura formada em (a) flui do meio para fluxo turbulento para dentro do meio para fluxo laminar.

De acordo com uma forma de realização da invenção, o mecanismo pode adicionalmente compreender um meio para adição de uma segunda solução que neutraliza a solução de lise (solução 3 na Figura 1), em que a mistura incubada em (b) flui do meio para fluxo laminar para dentro do meio para adição de uma segunda solução.

Ainda noutra forma de realização, o mecanismo pode ser utilizado num método para isolar ADN plasmidico de células, compreendendo: (a) mistura das células com uma solução de lise alcali no meio para fluxo turbulento e (b) neutralização da solução de lise alcalina através da adição de uma solução acidica. 24 Não obstante os numerosos métodos actualmente utilizados para lisar células bacterianas, nenhum deles aborda os problemas causados pelas propriedades viscoelásticas dos fluidos e as forças de cisalhamento envolvidas durante as etapas de mistura. Um objectivo da presente invenção é um método de utilização de tubos em T para a mistura da suspensão celular (solução 1) e da solução alcalina (solução 2), uniformemente e muito rapidamente, antes de surgir o fluido viscoelástico. Deste modo, a lise continua de acordo com a presente invenção proporciona uma vantagem muito importante na limitação de forças de cisalhamento. Os tubos em T têm, em geral, tubagem de pequeno diâmetro, habitualmente com um diâmetro inferior a 1 cm, de um modo preferido, em torno de 2 e 8 mm e, de um modo mais preferido, em torno de 6 mm, de mod a aumentar o tempo de contacto de fluidos misturados, mas esse método não faz utilização da mistura induzida por passagem através do tubo. A presente Tabela 1 abaixo mostra a variação dos parâmetros Bla, Blb, B2 do meio para fluxo turbulento, fluxo laminar e fluxo turbulento, respectivamente e os seus caudais correspondentes Sl, S2 e S3, como exibidos na Figura 1.

Tabela 1

Bla (60 L/h) Blb (60 L/h) B2 (90 L/h) Caudais diâmetro comprimento diâmetro comprimento diâmetro comprimento Sl, S2 e S3 Gama 5 a 7 mm 2-6 m 12,5 a 19 mm 13 a 23 m 5 a 8 mm 2 a 4 m 60/60/90 L/h + 20%

Outro objecto da presente invenção é um misturador ou injector com tubos em vez de um T, que permite a dispersão das 25 células para dentro da solução de lise. Consequentemente, a tensão mecânica nos fluidos que passam através dos tubos é grandemente reduzida, em comparação com quando os fluidos são agitados, e. g. , por pás em tanques. A eficiência inicial da mistura resulta em eficiência ainda maior nos segundos que se seguem, visto que este fluido não tem ainda propriedades viscoelásticas e a mistura realizada pelo tubo de pequeno diâmetro é muito eficiente. Em contraste, quando um tubo em T é utilizado para misturar, a mistura inicial é apenas moderada, enquanto o fluido se torna rapidamente viscoelástico, resultando em problemas consideráveis enquanto fluem no tubo. Esta mistura parcial resulta em lise de apenas uma porção das células e, por conseguinte, apenas podem libertar uma porção dos plasmídeos antes da neutralização.

De acordo com a presente invenção, identificaram-se duas fases durante a lise, denominadas Fase I e Fase II. Estas duas fases correspondem a I) lise das células e II) desnaturação de ácidos nucleicos, causando um alteração muito importante no comportamento reológico que resulta num fluido viscoelástico. 0 ajuste dos diâmetros dos tubos torna possível o cumprimento das necessidades destas duas fases. Dentro de um tubo de pequeno diâmetro (Bla), a mistura é aumentada. Esta é a configuração utilizada para a Fase I. Dentro de um tubo de grande diâmetro (Blb), a mistura (e, deste modo, a tensão de cisalhamento) é reduzida. Esta é a configuração empregue para a Fase II.

Consequentemente, utiliza-se um misturador, denominado Ml, que é representado na Figura 2. Qualquer dispositivo em forma de T também pode ser utilizado para proporcionar a dispersão da suspensão celular de acordo com a presente invenção. Com este misturador, a solução 1 é injectada em contracorrente dentro da 26 solução de lise alcalina, através de um ou mais orifícios de pequeno diâmetro, de modo a obter-se uma dispersão eficiente. Os diâmetros destes orifícios são em torno de 0,5 mm a 2 mm e, de um modo preferido, cerca de 1 mm na configuração representada. A mistura abandona o misturador Ml para passar através de um tubo de pequeno diâmetro (Figura 1), durante um curto período de tempo (de cerca de 2,5 s) . A combinação do diâmetro e tempo de fluxo pode ser facilmente calculada para manter um fluxo turbulento. Os exemplos de variações destes parâmetros são proporcionados na Tabela 1. Todas as referências a diâmetro de tubo proporcionam o diâmetro interno do tubo, não o diâmetro externo, que inclui a espessura das próprias paredes do tubo. Este breve tempo de permanência no tubo permite a homogeneização muito rápida das soluções 1 e 2. Assumindo que a solução 1 e solução 2 são ainda fluidos Newtonianos durante a Fase I, o modo de fluxo é turbulento durante a fase de homogeneização. À saída deste tubo, as soluções 1 e 2 estão homogeneizadas e tem início a lise celular na suspensão. A mistura homogeneizada passa, depois, através de um segundo tubo (Blb) de diâmetro muito maior (Figura 1), no qual ocorre a lise das células e a formação do fluido viscoelástico. Durante esta fase, a mistura pode ser minimizada e a solução pode ser deixada a "repousar", para limitar a turbulência tanto quanto possível, de modo a minimizar qualquer tensão de cisalhamento que, de outro modo, fragmentaria o ADNg. Numa forma de realização da presente invenção, um tempo de contacto de cerca de 1 a 3 min, em torno de 2 min e, de um modo preferido, de 1 min 20 s é suficiente para completar a lise celular e para desnaturar os ácidos nucleicos. Durante a fase de desnaturação, o modo de fluxo do fluido é laminar, promovendo a difusão lenta 27 de SDS e hidróxido de sódio em direcção aos componentes celulares. 0 lisado obtido deste modo e a solução de neutralização 3 são, depois, misturados com um misturador Y, denominado M2. Numa forma de realização da presente invenção, o diâmetro interno do misturador Y é em torno de 4 a 15 mm, ou em torno de 6 a 10 mm e pode ser em torno de 6 mm ou em torno de 10 mm. 0 tubo de pequeno diâmetro (e. g. , tubo de cerca de 6 mm) é posicionado no orificio de descarga do misturador Y, para permitir a mistura rápida (< 1 s) e eficaz do lisado com a solução 3. A solução neutralizada é, depois, recolhida num tanque de recolha. Durante a neutralização, baixando rapidamente o pH induz a formação de floculado (i. e., formação de grumos ou massas). Por outro lado, o plasmídeo parcialmente desnaturado renatura-se muito rapidamente e permanece em solução. Os flocos sedimentam gradualmente no tanque de recolha, transportando a maior parte dos contaminantes. O desenho esquemático na Figura 1 mostra uma forma de realização do sistema de lise continua (CL) . A lise continua pode ser utilizada por si só, ou com processos adicionais. O método da presente invenção pode ser utilizado para lisar qualquer tipo de célula (i. e., procariótica ou eucariótica), para qualquer finalidade relacionada com a lise, tal como a libertação de ADN plasmidico desejado de células alvo a serem subsequentemente purificadas. Numa forma de realização preferida, o método da presente invenção é utilizado para lisar células hospedeiras contendo plasmideos para a libertação de plasmideos. 28 0 processo da etapa de lise alcalina contínua, de acordo com a presente invenção, pode ser realizado em células recolhidas de uma fermentação que tenha sido cultivada até uma biomassa de células que não atingiram ainda a fase estacionária e estão, deste modo, em crescimento exponencial (2-10 g de peso seco/litro). A etapa de lise alcalina continua também pode ser realizada em células recolhidas de uma fermentação que tenha sido cultivada até elevada biomassa de células e já não estão em crescimento exponencial, mas atingiram a fase estacionária, com uma concentração celular de, aproximadamente, 10-200 g de peso seco por litro e, de um modo preferido, 12-60 g de peso seco por litro. A invenção abrange, adicionalmente, um método de produção e isolamento de ADN plasmidico altamente purificado que está essencialmente isento de contaminantes e, deste modo, é ADN de grau farmacêutico. O ADN plasmidico produzido e isolado pelo método da invenção contém níveis muito baixos, i. e., parte por milhões (ppm) dos contaminantes ADN cromossómico, ARN, proteína e endotoxinas e contém, principalmente, ADN plasmidico de forma circular fechada. O ADN plasmidico produzido de acordo com a invenção é de pureza suficiente para utilização em investigação e terapia de base plasmídica. O método da invenção compreende etapas de purificação, incluindo cromatografia de afinidade de hélice tripla, com uma etapa adicional de cromatografia de permuta iónica e, adicionalmente, pode incluir cromatografia de interacção hidrófoba ou cromatograf ia de permeação em gel. A etapa de cromatografia de permuta iónica pode ser em cromatografia de permuta iónica de leito fluidizado e cromatografia de permuta aniónica de alta resolução axial e/ou radial. 29 0 método inclui, deste modo, a etapa de lise alcalina aqui descrita, em combinação com etapas subsequentes de cromatografia de permuta iónica, cromatografia de afinidade de hélice tripla e cromatografia de interacção hidrófoba, ocorrendo nessa ordem. Uma filtração de lisado ou outra remoção de floculado pode preceder a primeira etapa de cromatografia. Os métodos da invenção aqui descritos para a purificação de ADN plasmídico são escaláveis e, deste modo, passíveis de aumento de escala para preparação de grande escala.

Em algumas formas de realização da invenção, a lise continua pode ser combinada com etapas de purificação adicionais, para resultar num produto de elevada pureza contendo ADNp. Pode, por exemplo, ser combinada com, pelo menos, uma de remoção de floculado (tal como filtração de lisado, sedimentação ou centrifugação) , cromatografia de permuta iónica (tais como permuta catiónica ou aniónica), cromatografia de afinidade tríplice e cromatografia de interacção hidrófoba. Numa forma de realização, a lise contínua é seguida de cromatografia de permuta aniónica, cromatografia de afinidade tríplice e cromatografia de interacção hidrófoba, nessa ordem. Noutra forma de realização, a lise continua é seguida de filtração de lisado, cromatografia de permuta aniónica, cromatografia de afinidade tríplice e cromatografia de interacção hidrófoba, nessa ordem. Estas etapas permitem um processo de produção de plasmídeo verdadeiramente escalável, que pode produzir grandes quantidades de ADNp com pureza sem precedentes. ADN & ARN, assim como proteínas de hospedeiro, são na gama sub-ppm. 0 método da presente invenção também pode utilizar etapas adicionais de SEC, cromatografia de fase reversa, cromatografia 30 de hidroxiapatite, etc., em combinação com as etapas aqui descritas de acordo com o presente pedido.

Pode ser empregue uma remoção de floculado, para proporcionar pureza mais elevada ao produto de ADNp resultante. Esta etapa pode ser utilizada para remover a maior parte do material precipitado (floculado). Um mecanismo de realização da remoção de floculado é através de uma etapa de filtração de lisado, tal como através de um filtro de grelha de 1 a 5 mm e, de um modo preferido, de 3,5 mm, seguida de uma filtração de profundidade como uma etapa de aperfeiçoamento de filtração. Outros métodos de realização da remoção de floculado são através de centrifugação ou sedimentação.

Pode ser empregue cromatografia de permuta iónica, para proporcionar pureza mais elevada ao produto de ADNp resultante. Pode ser seleccionada a permuta aniónica, dependendo das propriedades dos contaminantes e do pH da solução.

Pode ser empregue a cromatografia de permuta aniónica para proporcionar pureza mais elevada ao produto de ADNp resultante. A cromatografia de permuta aniónica funciona através da ligação de moléculas carregadas (ou acidicas) negativamente a um suporte que está carregado positivamente. A utilização de cromatografia de permuta iónica, depois, permite que as moléculas sejam separadas com base na sua carga. As famílias de moléculas (acidicas, básicas e neutras) podem ser facilmente separadas por esta técnica. Podem ser utilizados esquemas de eluição por etapas, com muitos contaminantes eluindo nas primeiras fracções e o ADNp eluído nas últimas fracções. A permuta aniónica é muito eficiente para a remoção de proteína e endotoxina da preparação de ADNp. 31

Para a cromatografia de permuta iónica, o material de empacotamento e método de preparação desse material, assim como o processo para a preparação, polimerização e funcionalização da cromatografia de permuta aniónica e a eluição e separação de ADN plasmidico através deste, são bem conhecidos na técnica. 0 composto a ser utilizado para a síntese de materiais de base que são utilizados para o material de empacotamento, para a cromatografia de permuta aniónica, pode ser qualquer composto, se diversos grupos funcionais que exibem hidrofobicidade ou diversos grupos de permuta iónica puderem ser introduzidos por uma pós-reacção, depois de os materiais de base serem sintetizados. Os exemplos de monómeros monofuncionais incluem estireno, o-halometilestireno, m-halometilestireno, p-halometilestireno, o-haloalquilestireno, m-haloalquilestireno, p-haloalquilestireno, oí-metilestireno, a-metil-o-halometilestireno, α-metil-m-halometilestireno, a-metil-p-halometilestireno, α-metil-o-haloalquilestireno, a-metil-m-haloalquilestireno, oí-met il-p-ha loa lqu ilest ireno, o-hidroximetilestireno, m-hidroximetilestireno, p-hidroximetilestireno, o-hidroxialquilestireno, m-hidroxialquilestireno, p-hidroxilalquilestireno, a-metil-o-hidroximetilestireno, a-metil-m-hidroximetilestireno, a-metil-p-hidroximetilestireno, a-metil-o-hidroxialquilestireno, a-metil-m-hidroxialquilestireno, α-metil-p-hidroxialquilestireno, metacrilato glicidilico, acrilato glicidilico, acrilato hidroxietílico, hidroximetacrilato e acetato vinílico. São compostos muito preferidos os grupos haloalquilo substituídos no anel aromático, halogéneos, tais como Cl, Br, I e F e hidrocarbonetos saturados, de cadeia linear e/ou ramificada, com átomos de carbono de 2 a 15. Os exemplos de monómeros polifuncionais incluem divinilbenzeno, trivinilbenzeno, 32 divinilnaftaleno, diviniltolueno, triviniltolueno, trivinilnaftaleno, dimetacrilato de etilenoglicol, diacrilato de etilenoglicol, dimetacrilato de dietilenoglicol, diacrilato de dietilenoglicol, metilenobismetacrilamida e metilenobisacrilamida.

Diversos grupos de permuta iónica podem ser introduzidos pela pós-reacção. A preparação do material de base inclui uma primeira etapa, em que o monómero monofuncional e monómero polifuncional são pesados, a uma razão apropriada e o diluente ou solvente pesados com precisão, os quais são utilizados para efeitos de ajustamento dos poros nas partículas formadas e o iniciador de polimerização pesado com precisão de modo semelhante é adicionado, seguido de boa agitação. A mistura é, depois, submetida a uma polimerização de suspensão de tipo óleo-em-água, em que a mistura é adicionada a um estabilizante de suspensão dissolvido em solução aquosa, pesado com precisão antecipadamente e as gotículas de óleo com o tamanho visado são formadas através da mistura com agitador e a polimerização é conduzida através do aquecimento gradual da solução misturada. A razão de monómero monofuncional para monómero polifuncional é, em geral, em torno de 1 mol de monómero monofuncional e em torno de 0,01 a 0,2 mol de monómero polifuncional, de forma a obter-se partículas moles de material de base. Um iniciador de polimerização também não está particularmente restringido e sendo geralmente utilizados o tipo azobis e/ou tipo peróxido são utilizados.

Os estabilizantes de suspensão, tais como tensioactivos iónicos, tensioactivos não iónicos e polímeros com propriedade anfifílica ou suas misturas, também podem ser utilizados para prevenir a agregação entre as próprias gotículas de óleo. 33

Prefere-se que o material de empacotamento a ser utilizado para a cromatografia de permuta iónica, para a purificação de ADN plasmidicos, tenha um diâmetro de poro relativamente grande, particularmente dentro de uma gama de 1500 a 4000 angstroms. A modificação de superfície para introduzir grupos de permuta iónica em materiais de base é bem conhecida na técnica.

Podem ser utilizados dois tipos de eluentes para a cromatografia de permuta iónica. Um primeiro eluente contendo baixa concentração de sal e um segundo eluente contendo alta concentração de sal podem ser utilizados. 0 método de eluição consiste na troca, por etapas, do primeiro eluente para o segundo eluente e o método de gradiente de eluição continuamente alterando a composição do primeiro eluente para o segundo eluente. Podem ser utilizados tampões e sais que são utilizados, em geral, nestes eluentes para a cromatografia de permuta iónica. Para o primeiro eluente contendo baixa concentração de sal é particularmente preferida solução aquosa com concentração de tampão de 10 a 50 mM e valor de pH de 6 a 9. Para o segundo eluente contendo alta concentração de sal é particularmente preferida solução aquosa com sal de sódio de 0,1 a 2 M adicionado ao eluente C. Para os sais de sódio, podem ser utilizados cloreto de sódio e sulfato de sódio.

Além disso, pode ser utilizado um agente quelante para ião metálico bivalente, tal como, por exemplo, ácido etilenodiaminotetracético, para inibição da degradação de plasmídeos devido às enzimas de degradação de ADN no lisado de Escherichia coli. A concentração de agente quelante para ião metálico bivalente é, de um modo preferido, 0,1 a 100 mM. 34

Uma ampla variedade de matrizes de permuta aniónica comercialmente disponíveis são adequadas para utilização na presente invenção, incluindo mas não limitadas às disponíveis a partir de POROS Anion Exchange Resíns, Qiagen, Toso Haas, Sterogene, Spherodex, Nucleopac e Pharmacia. Por exemplo, a coluna (Poros II PI/M, 4,5 mm x 100) é inicialmente equilibrada com Bis/TRIS Propano a 20 mM, a pH 7,5 e NaCl a 0,7 Μ. A amostra é carregada e lavada com o mesmo tampão inicial. Um gradiente de eluição de NaCl de 0,5 M a 0,85 M, em cerca de 25 volumes de coluna é, depois, aplicado e as fracções são recolhidas. A cromatografia de permuta aniónica preferida inclui Fractogel TMAE HiCap.

De acordo com uma forma de realização preferida do processo de separação e purificação de ADN plasmídico, a presente invenção refere-se a um método de separação e purificação de ácidos nucleicos e/ou ADN plasmidico por cromatografia de permuta iónica e cromatografia de hélice tripla, em combinação, para se obterem eficientemente ácidos nucleicos com pureza elevada em grande quantidade. A cromatografia de afinidade de hélice tríplice é descrita, inter alia, nas patentes US 6319672, 6287762, assim como no pedido de patente internacional publicado sob WO02/77274 do Requerente. A cromatografia de afinidade de hélice tríplice é baseada na hibridação específica de oligonucleótidos e uma sequência alvo dentro do ADN de cadeia dupla. Estes oligonucleótidos podem conter as seguintes bases: 35 - timidina (T), que é capaz de formar tripletos com dupletos A.T de ADN de cadeia dupla (Rajagopal et al., Biochem 28 (1989) 7859); - adenina (A) , que é capaz de formar tripletos com dupletos A.T de ADN de cadeia dupla; - guanina (G) , que é capaz de formar tripletos com dupletos G.C de ADN de cadeia dupla; - citosina protonada (C+), que é capaz de formar tripletos com dupletos G.C de ADN de cadeia dupla (Rajagopal et al., loc. cit.); - uracilo (U) , que é capaz de formar tripletos com os pares de bases A.U ou A.T.

De um modo preferido, o oligonucleótido utilizado compreende uma sequência de homopirimidina rica em citosina e a sequência especifica presente no ADN é uma sequência de homopurina-homopirimidina. A presença de citosinas torna possível ter uma hélice tripla, que é estável a pH ácido, onde as citosinas estão protonadas e desestabilizada a pH alcalino, onde as citosinas estão neutralizadas. 0 oligonucleótido e a sequência específica presente no ADN são, de um modo preferido, complementares, para permitir a formação de uma hélice tripla. Os melhores rendimentos e a melhor selectividade podem ser obtidos através da utilização de um oligonucleótido e uma sequência específica que sejam totalmente complementares. Por exemplo, um oligonucleótido poli(CTT) e uma sequência específica poli(GAA). Os oligonucleótidos preferidos têm uma sequência 5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (GAGG(CTT)7 ( SEQ ID N° : 1), na qual as bases GAGG não formam uma hélice tripla, mas 36 possibilitam que o oligonucleótido fique espaçado do braço de ligação; a sequência (CTT)7. Estes oligonucleótidos são capazes de formar uma hélice tripla com uma sequência específica contendo unidades complementares (GAA). A sequência em questão pode, em particular, ser uma região contendo 7, 14 ou 17 unidades GAA, como descrito nos exemplos.

Outra sequência de interesse especifico é a sequência 5' -AAGGGAGGGAGGAGAGGAA-3' (SEQ ID N° : 2). Esta sequência forma uma hélice tripla com os oligonucleótidos 5' -AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3' (SEQ ID N° : 3) ou 5' - TTGGTGTGGTGGGTGGGTT-3' (SEQ ID N° : 4). Neste caso, o oligonucleótido liga-se numa orientação antiparalela à cadeia de polipurina. Estas hélices triplas são estáveis apenas na presença de Mg2+ (Vasquez et al. , Biochemistry, 1995, 34, 7243-7251; Beal e Dervan, Science, 1991, 251, 1360-1363).

Como referido acima, a sequência específica pode ser uma sequência naturalmente presente no ADN de cadeia dupla, ou uma sequência sintética introduzida artificialmente na última. É especialmente vantajoso utilizar um oligonucleótido capaz de formar uma hélice tripla com uma sequência naturalmente presente no ADN de cadeia dupla, por exemplo na origem de replicação de um plasmídeo ou num gene marcador. A este respeito, sabe-se, através de análises de sequências, que algumas regiões destes ADN, em particular na origem de replicação, poderiam possuir regiões de homopurina-homopirimidina. A síntese de oligonucleótidos capazes de formarem hélices triplas com estas regiões de homopurina-homopirimidina naturais possibilita, de um modo vantajoso, que o método da invenção seja aplicado a plasmídeos não modificados, em particular plasmídeos comerciais do tipo pUC, pBR322, pSV e semelhantes. Entre as sequências de 37 homopurina-homopirimidina naturalmente presentes num ADN de cadeia dupla, pode ser mencionada uma sequência compreendendo a totalidade ou parte da sequência 5'-CTTCCCGAAGGGAGAAAGG-3' (SEQ ID N°: 5) presente na origem de replicação do plasmideo ColEl de E. coli. Neste caso, o oligonucleótido formando a hélice tripla possui a sequência: 5'-GAAGGGCTTCCCTCTTTCC-3' (SEQ ID N°: 6) e liga-se alternadamente às duas cadeias da hélice dupla, como descrito por Beal e Dervan (J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 4976-4982) e Jayasena e Johnston (Nucleic Acids Res. 1992, 20, 5279-5288). Também pode ser mencionada a sequência 5'-GAAAAAGGAAGAG-3' (SEQ ID N° : 7) do gene da /3-lactamase do plasmideo pBR322 (Duval-Valentin et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1992, 89, 504-508).

As sequências alvo apropriadas, que podem formar estruturas tríplices com particulares oligonucleótidos, foram identificadas em origens de replicação de plasmídeos ColEl, assim como plasmídeos pCOR. Os plasmídeos pCOR são plasmídeos com origem de replicação condicional e são descritos, inter alia, nos documentos US 2004/142452 e US 2003/161844. Os plasmídeos derivados de ColEl contêm uma sequência de homopurina de 12-mer (5' -AGAAAAAAAGGA-3') (SEQ ID N°: 8), mapeada a montante do transcrito ARN-II, envolvida na replicação plasmídica (Lacatena et ai., 1981, Nature, 294, 623). Esta sequência forma uma estrutura tríplice estável com o oligonucleótido 5'-TCTTTTTTTCCT-3' (SEQ ID N°: 9) complementar de 12-mer. A estrutura de pCOR contém uma extensão de homopurina de 14 bases não repetitivas (5'-AAGAAAAAAAAGAA-3') (SEQ ID N° : 10), situada no segmento rico em A+T do replicão de origem γ de pCOR (Levchenko et ai., 1996, Nucleic Acids Res.r 24, 1936). Esta sequência forma uma estrutura tríplice estável com o oligonucleótido complementar de 14-mer 5'-TTCTTTTTTTTCTT-3 ' 38 (SEQ ID N°: 11). Os oligonucleótidos correspondentes 5 ' - TCTTTTTTTCCT-3' (SEQ ID N° : 8) e 5 '-TTCTTTTTTTTCTT-3' (SEQ ID N°: 11) visam, eficientemente e especificamente, as suas respectivas sequências complementares localizadas dentro da origem de replicação de ColEl ori ou pCOR (oriY). De facto, uma única tríade não canónica (T*GC ou C*AT) pode resultar na completa desestabilização da estrutura tríplice. A utilização de um oligonucleótido capaz de formar uma hélice tripla com uma sequência presente numa origem de replicação ou um gene marcador é especialmente vantajosa, visto que torna possível, com o mesmo oligonucleótido, purificar qualquer ADN contendo a referida origem de replicação ou referido gene marcador. Por este motivo, não é necessário modificar o plasmideo ou o ADN de cadeia dupla, de modo a incorporar uma sequência especifica artificial no mesmo.

Embora sejam preferidas sequências totalmente complementares, compreende-se, contudo, que podem ser tolerados alguns erros-de-emparelhamento entre a sequência do oligonucleótido e a sequência presente no ADN, desde que não conduzam a uma perda demasiado grande de afinidade. Pode ser mencionada a sequência 5'-AAAAAAGGGAATAAGGG-3' (SEQ ID N°: 12) presente no gene de β-lactamase de E. coli. Neste caso, a timina interrompendo a sequência de polipurina pode ser reconhecida por uma guanina da terceira cadeia formando, desse modo, um tripleto G*TA que é estável quando flanqueado por dois tripletos T*AT (Kiessling et al., Bíochemístry, 1992, 31, 2829-2834).

De acordo com uma particular forma de realização, os oligonucleótidos da invenção compreendem a sequência (CCT)n, a sequência (CT)n ou a sequência (CTT)nr na qual n é um número 39 inteiro entre 1 e 15, inclusive. É especialmente vantajoso utilizar sequências do tipo (CT)n ou (CTT)n. A Requerente mostrou, com efeito, que o rendimento de purificação era influenciado pela quantidade de C no oligonucleótido. Em particular, como mostrado no Exemplo 7, o rendimento de purificação aumenta quando o oligonucleótido contém menos citosinas. Compreende-se que os oligonucleótidos da invenção também podem combinar unidades (CCT), (CT) ou (CTT) . 0 oligonucleótido utilizado pode ser natural (composto por bases naturais não modificadas) ou quimicamente modificado. Em particular, o oligonucleótido pode, de um modo vantajoso, possuir determinadas modificações químicas possibilitando que a sua resistência ou a sua protecção contra nucleases, ou a sua afinidade para a sequência específica, seja aumentada. Também se compreende que oligonucleótido significa qualquer sucessão ligada de nucleósidos que tenham sofrido uma modificação do esqueleto, com o fim de o tornar mais resistente a nucleases. Entre as modificações possíveis, podem ser mencionados fosforotioatos oligonucleotídicos, que são capazes de formarem hélices triplas com ADN (Xodo et al. , Nucleic Acids Res., 1994, 22, 3322-3330), assim como oligonucleótidos possuindo esqueletos de formacetal ou metilfosfonato (Matteucci et al. , J. Am. Chem. Soc.f 1991, 113, 7767-7768). Também é possível utilizar oligonucleótidos sintetizados com anómeros α de nucleótidos, que também formam hélices triplas com ADN (Le Doan et al., Nucleic Acids Res.r 1987, 15_, 7749-7760). Outra modificação do esqueleto é a ligação de fosforamidato. Por exemplo, pode ser mencionada a ligação de fosforamidato de internucleótido N3 -P5 , descrita por Gryaznov e Chen, que proporciona oligonucleótidos formando hélices triplas especialmente estáveis com ADN (J. Am. Chem. Soc.r 1994, 116, 3143-3144). Entre outras modificações do 40 a utilização de esqueleto, também pode ser mencionada ribonucleótidos de 2'-O-metilribose, fosfodiéster, etc. (Sun e Hélène, Curr. Opinion Struct. Biol., 116, 3143-3144). Por último, o esqueleto baseado em fósforo pode ser substituído por um esqueleto de poliamida, como nos PNA (ácidos nucleicos peptidicos), que também pode formar hélices triplas (Nielsen et al. , Science, 1991, 254, 1497-1500; Kim et al., J. Am. Chem.

Soc.r 1993, 115, 6477-6481) ou por um esqueleto baseado em guanidina, como nos DNG (guanidina desoxirribonucleica, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1995, 9_2, 6097-6101) ou por análogos policatiónicos de ADN, que também formam hélices triplas. A timina da terceira cadeia também pode ser substituída por um 5-bromouracilo, que aumenta a afinidade do oligonucleótido para ADN (Povsic e Dervan, J. Am. Chem. Soc., 1989, 111, 3059-3061). A terceira cadeia também pode conter bases não naturais, entre as quais podem ser mencionadas a 7-desaza-2'-desoxixantosina (Milligan et al., Nucleic Acids Res., 1993, 2_1, 327-333), l-(2-desoxi-p-D-ribofuranosil)-3- metil-5-amino-líí-pirazolo [4, 3-d]pirimidin-7-ona (Koh e Dervan, J. Am. Chem. Soc., 1992, 114, 1470-1478), 8-oxoadenina, 2-aminopurina, 2'-O-metilpseudoisocitidina ou qualquer outra modificação conhecida de um especialista na técnica (para uma revisão, ver Sun e Hélène, Curr. Opinion Struct. Biol., 1993, 3_, 345-356) .

Outro tipo de modificação do oligonucleótido tem a finalidade, mais especialmente, de melhorar a interaeção e/ou afinidade entre o oligonucleótido e a sequência específica. Em particular, uma modificação muito vantajosa de acordo com a invenção consiste na metilação das citosinas do oligonucleótido. O oligonucleótido deste modo metilado exibe a propriedade digna 41 de nota de formação de uma hélice tripla estável com a sequência especifica, em gamas de pH próximas da neutralidade (h 5) . Por este motivo, torna possível trabalhar a valores de pH mais elevados do que os oligonucleótidos da técnica anterior, ou seja, a valores de pH onde os riscos de degradação de ADN plasmídico são muito mais pequenos. 0 comprimento do oligonucleótido utilizado no método da invenção é entre 5 e 30. É utilizado, de um modo vantajoso, um oligonucleótido de comprimento superior a 10 bases. O comprimento pode ser adaptado por um especialista na técnica para cada caso individual, para corresponder à selectividade e estabilidade desejadas da interacção.

Os oligonucleótidos de acordo com a invenção podem ser sintetizados por qualquer técnica conhecida. Em particular, podem ser preparados por meio de sintetizadores de ácido nucleico. Pode, muito obviamente, ser utilizado qualquer outro método conhecido de um especialista na técnica.

Para permitir a sua ligação covalente ao suporte, o oligonucleótido é, em geral, funcionalizado. Deste modo, pode ser modificado por um grupo tiol, amina ou carboxilo terminal na posição 5' ou 3'. Em particular, a adição de um grupo tiol, amina ou carboxilo torna possível, por exemplo, ligar o oligonucleótido a um suporte contendo funções dissulfureto, maleimido, amina, carboxilo, éster, epóxido, brometo de cianogénio ou aldeído. Estas ligações formam-se por estabelecimento de ligações dissulfureto, tioéter, éster, amida ou amina entre o oligonucleótido e o suporte. Pode ser utilizado qualquer outro método conhecido de um especialista na técnica, tal como reagentes de ligação bifuncionais, por exemplo. 42

Além disso, para melhorar a hibridação com o oligonucleótido ligado, pode ser vantajoso que o oligonucleótido contenha um "braço" e uma sequência "espaçadora" de bases. A utilização de um braço torna possível, com efeito, ligar o oligonucleótido a uma distância escolhida do suporte, possibilitando as suas condições de interacção com o ADN a ser melhorado. 0 braço consiste, de um modo vantajoso, numa cadeia de carbono linear, compreendendo 1 a 18 e, de um modo preferido, 6 ou 12 grupos (CH2) e uma amina que permite a ligação à coluna. 0 braço está ligado a um fosfato do oligonucleótido ou de um "espaçador" composto por bases que não interferem com a hibridação. Deste modo, o "espaçador" pode compreender bases purínicas. Como um exemplo, o "espaçador" pode compreender uma sequência GAGG. 0 braço é composto, de um modo vantajoso, por uma cadeia de carbono linear compreendendo 6 ou 12 átomos de carbono. A cromatografia de afinidade tríplice é muito eficiente para remoção de ARN e ADN genómico. Estes podem ser suportes cromatográficos funcionalizados, em bruto ou pré-empacotados numa coluna, superfícies plásticas funcionalizadas ou esferas de látex funcionalizadas, magnéticos ou outros. São, de um modo preferido, utilizados suportes cromatográficos. Como um exemplo, os suportes cromatográficos capazes de serem utilizados são agarose, acrilamida ou dextrano, assim como os seus derivados (tais como Sephadex, Sepharose, Superose, etc.), polímeros, tal como poli(estireno/divinilbenzeno), ou sílica enxertada ou não enxertada, por exemplo. As colunas de cromatografia podem operar no modo de difusão ou perfusão.

Para se obterem melhores rendimentos de purificação, é especialmente vantajoso utilizar, no plasmídeo, uma sequência contendo várias posições de hibridação com o oligonucleótido. A 43 presença de várias posições de hibridação promove, com efeito, as interacções entre a referida sequência e o oligonucleótido, o que conduz a um melhoramento nos rendimentos de purificação. Deste modo, para um oligonucleótido contendo n repetições de motivos (CCT) , (CT) ou (CTT), é preferido utilizar uma sequência de ADN contendo, pelo menos, n motivos complementares e, de um modo preferido, n+ 1 motivos complementares. Uma sequência transportando n+ 1 motivos complementares proporciona, deste modo, duas posições de hibridação com o oligonucleótido. De um modo vantajoso, a sequência de ADN contém até 11 posições de hibridação, ou seja, n+10 motivos complementares. 0 método de acordo com a presente invenção pode ser utilizado para purificar qualquer tipo de ADN de cadeia dupla. Um exemplo do último é um ADN circular, tal como um plasmideo, em geral transportando um ou mais genes de importância terapêutica. Este plasmideo também pode transportar uma origem de replicação, um gene marcador e semelhantes. 0 método da invenção pode ser aplicado directamente a um lisado celular. Nesta forma de realização, o plasmideo, amplificado por transformação seguida de cultura celular, é purificado directamente após lise das células. 0 método da invenção também pode ser aplicado a um lisado límpido, ou seja, ao sobrenadante obtido após neutralização e centrifugação do lisado celular. Pode, muito obviamente, ser aplicado também a uma solução pré-purifiçada por métodos conhecidos. Este método também possibilita que ADN linear ou circular, transportando uma sequência de importância, seja purificado a partir de uma mistura compreendendo ADN de sequências diferentes. 0 método de acordo com a invenção também pode ser utilizado para a purificação de ADN de cadeia dupla. 44 0 lisado celular pode ser um lisado de células procarióticas ou eucarióticas .

Quanto a células procarióticas, as bactérias E. coli, B. subtilisj_ S. typhimurium ou Strepomyces podem ser mencionadas como exemplos. Quanto a células eucarióticas, podem ser mencionadas células animais, leveduras, fungos e semelhantes e, mais especialmente, as leveduras Kluyveromyces ou Saccharomyces ou células COS, CHO, C127, NIH3T3 e semelhantes. 0 método da presente invenção que inclui, pelo menos, uma etapa de cromatografia de afinidade triplice pode ser empregue para proporcionar pureza mais elevada ao produto de ADNp resultante. Na cromatografia de afinidade tríplice, um oligonucleótido está ligado a um suporte, tal como uma resina de cromatografia, ou outra matriz. A amostra sendo purificada é, depois, misturada com o oligonucleótido ligado, tal como através da aplicação da amostra a uma coluna de cromatografia, contendo o oligonucleótido ligado a uma resina de cromatografia. 0 plasmídeo desejado na amostra irá ligar-se ao oligonucleótido, formando um tríplice. As ligações entre o oligonucleótido e o plasmídeo podem ser ligações de Hoogsteen. Esta etapa pode ocorrer a um pH <5, a uma elevada concentração de sal, durante um tempo de contacto de 20 minutos, ou mais. Uma etapa de lavagem pode ser empregue. Finalmente, ocorre a desprotonação de citosina, num tampão neutro, eluindo o plasmídeo da resina ligada a oligonucleótido.

De acordo com a forma de realização mais preferida, o processo de separação e purificação de ácidos nucleicos e/ou ADN plasmídicos compreende as etapas de cromatografia de permuta 45 iónica, cromatografia de afinidade de hélice tripla e cromatografia de interacção hidrófoba, em combinação. A cromatografia de interacção hidrófoba utiliza unidades hidrófobas num substrato para atrair regiões hidrófobas em moléculas na amostra para purificação. Deve ser notado que estes suportes HIC funcionam por um efeito de "agregação"; não são formadas ou partilhadas ligações covalentes ou iónicas quando estas moléculas se associam. A cromatografia de interacção hidrófoba é benéfica, visto que remove muito eficientemente formas plasmídicas circulares abertas e outros contaminantes, tais como ADNg, ARN e endotoxina. A síntese de materiais de base para a cromatograf ia de interacção hidrófoba, assim como o processo para preparação, polimerização e funcionalização de cromatografia de interacção hidrófoba e eluição e separação de ADN plasmídico através desta são bem conhecidos na técnica e são, inter alia, descritos na patente US N° 6441160, que é aqui incorporada por referência. 0 composto a ser utilizado para a síntese de materiais de base que são utilizados para o material de empacotamento, para a cromatografia de interacção hidrófoba, pode ser qualquer composto, se diversos grupos funcionais que exibem hidrofobicidade ou diversos grupos de permuta iónica puderem ser introduzidos por uma pós-reacção, depois de os materiais de base serem sintetizados. Os exemplos de monómeros monofuncionais incluem estireno, o-halometilestireno, m-halometilestireno, p-halometilestireno, o-haloalquilestireno, m-haloalquilestireno, p-haloalquilestireno, α-metilestireno, a-metil-o-halometilestireno, a-metil-m-halometilestireno, a-metil-p-halometilestireno, a-metil-o-haloalquilestireno, a-metil-m- 46 haloalquilestireno, α-metil-p-haloalquilestireno, o-hidroximetilestireno, m-hidroximetilestireno, p-hidroximetilestireno, o-hidroxialquilestireno, m-hidroxialquilestireno, p-hidroxilalquilestireno, a-metil-o-hidroximetilestireno, a-metil-m-hidroximetilestireno, a-metil-p-hidroximetilestireno, a-metil-o-hidroxialquilestireno, a-metil-m-hidroxialquilestireno, α-metil-p-hidroxialquilestireno, metacrilato glicidilico, acrilato glicidilico, acrilato hidroxietilico, hidroximetacrilato e acetato vinilico. São compostos muito preferidos os grupos haloalquilo, substituídos no anel aromático, halogéneos, tais como Cl, Br, I e F e hidrocarbonetos saturados, de cadeia linear e/ou ramificada, com átomos de carbono de 2 a 15.

Os exemplos de monómeros polifuncionais incluem divinilbenzeno, trivinilbenzeno, diviniltolueno, triviniltolueno, divinilnaftaleno, trivinilnaftaleno, dimetacrilato de etilenoglicol, diacrilato de etilenoglicol, dimetacrilato de dietilenoglicol, diacrilato de dietilenoglicol, metilenobismetacrilamida e metilenobisacrilamida.

Diversos grupos funcionais hidrófobos ou diversos grupos de permuta iónica podem ser introduzidos pela pós-reacção. De modo a minimizar a influência sobre produtos visados que se desejam separar, devido à hidrofobicidade exibida pelo próprio material de base, ou à dilatação ou contracção do próprio material de base, devido à alteração na concentração de sal e à alteração no valor de pH, o material de base é, de um modo preferido, preparado utilizando monómeros relativamente hidrófilos, tais como metacrilato glicidilico, acrilato glicidilico, acrilato hidroxietilico, hidroximetacrilato e acetato vinilico. A preparação do material de base inclui uma primeira etapa, em que 47 o monómero monofuncional e monómero polifuncional são pesados, a uma razão apropriada e o diluente ou solvente pesados com precisão, que são utilizados para efeitos de ajustamento dos poros nas partículas formadas e o iniciador de polimerização pesado com precisão de modo semelhante é adicionado, seguido de boa agitação. A mistura é, depois, submetida a uma polimerização de suspensão de tipo óleo-em-água, em que a mistura é adicionada a um estabilizante de suspensão dissolvido em solução aquosa, pesado com precisão antecipadamente e as gotículas de óleo com o tamanho visado são formadas através da mistura com agitador e a polimerização é conduzida através do aquecimento gradual da solução misturada. A razão de monómero monofuncional para monómero polifuncional é, em geral, em torno de 1 mol de monómero monofuncional e em torno de 0,01 a 0,2 mol de monómero polifuncional, de forma a obter-se partículas moles de material de base. A razão de monómero polifuncional pode ser aumentada para em torno de 0,2 a 0,5 mol, de forma a obter-se partículas duras de materiais de base. Para se obterem partículas ainda mais duras, pode ser utilizado apenas monómero polifuncional.

Um iniciador de polimerização também não está particularmente restringido e sendo geralmente utilizados o tipo azobis e/ou tipo peróxido são utilizados.

Os estabilizantes de suspensão, tais como tensioactivos iónicos, tensioactivos não iónicos e polímeros com propriedade anfifílica, ou suas misturas, também podem ser utilizados para prevenir a agregação entre as próprias gotículas de óleo. 0 diâmetro de partículas formadas é, em geral, em torno de 2 a 500 μπι. O diâmetro preferido das partículas está 48 compreendido entre 2 a 30 pm e, de um modo mais preferido, em torno de 2 a 10 pm. Quando se visa a purificação em grande escala de ácidos nucleicos com elevada pureza, é em torno de 10 a 100 pm e, quando se separa o produto visado da solução stock em bruto, pode ser 100 a 500 pm, de um modo mais preferido em torno de 200 a 400 pm. Para ajustamento do diâmetro de partícula, a velocidade rotacional do agitador pode ser ajustada durante a polimerização. Quando são necessárias partículas com diâmetro pequeno, o número de revoluções pode ser aumentado e, quando são desejadas partículas grandes, o número de revoluções pode ser diminuído. Aqui, visto que o diluente a ser utilizado é utilizado para o ajustamento de poros em partículas formadas, a selecção de diluente é particularmente importante. Como um conceito fundamental, para o solvente a ser utilizado para polimerização, o ajustamento é realizado através da combinação diversa de um solvente, que é solvente fraco para monómero, com um solvente, que é bom solvente para monómero. O tamanho do diâmetro de poro pode ser seleccionado apropriadamente, dependendo do tamanho molecular de ácidos nucleicos concebidos para separar, mas é preferido que seja dentro de uma gama de 500 a 4000 angstroms, para o material de empacotamento, para cromatografia de interacção hidrófoba e dentro de uma gama de 1500 a 4000 angstroms, para o material de empacotamento, para cromatografia de permuta iónica.

Na cromatografia de interacção hidrófoba, para separação de ácidos nucleicos com hidrofobicidade diferente, de um modo preferido através da utilização de materiais de empacotamento com hidrofobicidade diferente, respectivamente, a modificação de superfície do material de base é importante. 49

Os grupos hidrófobos podem ser seleccionados entre cadeia longa ou ramificada, incluindo grupos de hidrocarbonetos saturados ou grupos de hidrocarbonetos insaturados, com átomos de carbono de 2 a 20. O anel aromático também pode estar contido no grupo de hidrocarboneto.

Os grupos hidrófobos também podem ser seleccionados entre compostos tendo a seguinte fórmula:

Materiais de base — A(CH2)

Em que n=0 até em torno de 20 e o grupo metileno pode ser de cadeia linear ou ramificada, m=0 até cerca de 3 e o grupo de hidrocarboneto pode ser de cadeia linear ou ramificada, e A é o grupo C=0 ou grupo éter, mas o grupo metileno pode estar ligado directamente a material de base sem A.

Os grupos hidrófobos podem, adicionalmente, incluir o grupo éter de alquilenoglicol, com átomos de carbono de 2 a 20, que consistem em unidades de repetição de 0 a 10, em que a extremidade oposta do grupo funcional colocado em reacção com material de base pode ser o grupo OH, deixado tal como está, ou pode ser capeado com o grupo alquilo, com átomos de carbono de 1 a 4.

Os grupos hidrófobos descritos acima podem ser utilizados, isoladamente ou em mistura, para modificar a superfície. 50 A cadeia de grupos alquilo, com átomos de carbono de 6 a 20 átomos de carbono, é preferida para baixa hidrofobicidade, como plasmídeos. Cadeia longa de grupos alquilo, tendo 2 a 15 átomos de carbono, para separação de compostos com elevada hidrofobicidade, tais como ARN proveniente de Escherichia coli e ARN nas células de humanos e animais. Grupos alquilo, de 4 a 18 átomos de carbono, para separação de compostos com hidrofobicidade relativamente baixa, tais como ADN provenientes de Escherichia coli e ADN nas células de humanos e animais.

Após separaçao destes compostos, os compostos podem ser apropriadamente seleccionados para modificarem a superfície, sem estarem confinados à referida exemplificação. Com efeito, o grau de hidrofobicidade de material de empacotamento varia, dependendo da concentração de sal no meio ou da concentração de sal no eluente para adsorção. Adicionalmente, o grau de hidrofobicidade do material de empacotamento difere, dependendo da quantidade do grupo introduzido dentro do material de base. É particularmente preferido que o diâmetro de poro do material de base para cromatografia de interacção hidrófoba seja 500 a 4000 angstroms, mas pode ser apropriadamente seleccionado da referida gama, dependendo do tamanho molecular dos ácidos nucleicos que se desejam separar. Em geral, visto que a retenção de ácidos nucleicos no material de empacotamento e a capacidade de adsorção (condução de amostra) diferem, dependendo do diâmetro de poro, é preferido utilizar um material de base com grande diâmetro de poro, para ácidos nucleicos com grande tamanho molecular e um material de base com pequeno diâmetro de poro, para ácidos nucleicos com pequeno tamanho molecular. 51

Por exemplo, o material de base estireno pode ser colocado em reacção com o grupo hidrófobo compreendendo a cadeia longa de grupos alquilo, utilizando o composto contendo halogéneo e/ou halogeneto de carbonilo e catalisador, tais como FeC]_3, SnC]_2 ou A1C13 e utilizando a reacção de Friedel-Craft, é possível adicionar directamente ao anel aromático no material de base como composto des-halogenado e/ou composto acilado. No caso de o material de base ser uma partícula contendo o grupo halogéneo, por exemplo, utilizando compostos com OH contidos no grupo funcional a ser adicionado, como butanol, e utilizando a reacção de Williamson com catalisador alcali, tais como NaOH ou KOH, é possível introduzir o grupo funcional através de ligação éter. No caso de o grupo funcional que se deseja adicionar ser o composto contendo grupo amino, como hexilamina, é possível adicionar utilizando catalisador alcali, tais como NaOH ou KOH, e utilizando a reacção de ácido des-halogénico. No caso do material de base conter o grupo OH, inversamente, se se introduzir antecipadamente o grupo epóxido, grupo halogéneo ou grupo halogeneto de carbonilo dentro do grupo funcional que se deseja adicionar, é possível introduzir o grupo funcional através de ligação éter ou éster. No caso do material de base conter o grupo epóxido, se se colocar em reacção com composto com grupo OH ou grupo amino contido no grupo funcional que se deseja adicionar, é possível introduzir o grupo funcional através de ligação éter ou amino. Além disso, no caso do grupo funcional que se deseja adicionar conter o grupo halogéneo, é possível adicionar o grupo funcional através de ligação éter, utilizando catalisador ácido. Visto que a proporção de grupo funcional a ser introduzido dentro de material de base é influenciada pela hidrofobicidade do produto submetido que se deseja separar, a mesma não pode ser restringida mas, em geral, o material de empacotamento com cerca de 0,05 a 4,0 mmol de 52 grupo funcional adicionado por 1 g de material de base seco é adequado.

Com respeito à modificação de superfície, um método de adição do grupo funcional, através de pós-reacção após formação de material de base ou partículas, é como descrito. A modificação de superfície é conduzida de acordo com o mesmo método, onde o material de base é formado após polimerização, utilizando monómeros com os referidos grupos funcionais adicionados antes da polimerização. 0 material de base também pode ser sílica gel porosa. Um método de preparação de sílica gel compreende a ligação de silano utilizando um composto, tal como alquiltrimetoxisilano, directamente sobre partículas produzidas de acordo com o método descrito em "Latest High-Speed Liquid Chromatography", página 289 ff. (escrito por Toshio Nambara e Nobuo Ikegawa, publicado por Tokyo Hirokawa Bookstore em 1988) . Antes ou após a ligação do silano utilizando um agente de ligação de silano contendo grupo epóxido, um grupo funcional pode ser adicionado de acordo com o método acima mencionado. A proporção de grupo funcional que é introduzido em torno de 0,05 a 4,0 mmol de grupo funcional adicionado por 1 g de material de base seco é adequada.

Na etapa de separação ou purificação de cromatografia de interacção hidrófoba são utilizados eluentes. Em geral, são utilizados dois tipos de eluentes. Um eluente contém elevada concentração de sal, enquanto um segundo eluente contém baixa concentração de sal. 0 método de eluição compreende a troca, por etapas, de um eluente tendo elevada concentração de sal por um eluente tendo uma baixa concentração de sal e o método de gradiente de eluição alterando, continuamente, a composição de 53 um eluente para outro pode ser utilizado. Para os tampões e sais utilizados, em geral, para a cromatografia de interacção hidrófoba podem ser utilizados. Para o eluente contendo elevada concentração de sal, é particularmente preferida a solução aquosa com concentração de sal de 1,0 a 4,5 M e valor de pH de 6 a 8. Para o eluente contendo baixa concentração de sal, a solução aquosa com concentração de sal de 0,01 a 0,5 M e valor de pH de 6 a 8 são sais particularmente preferidos. Em geral, podem ser utilizados como sais sulfato de amónio e sulfato de sódio. A etapa de purificação de ADN plasmidico de cromatografia de interacção hidrófoba pode ser conduzida através da combinação de um material de empacotamento, introduzido o grupo funcional com fraca hidrofobicidade, com um material de empacotamento, introduzido o grupo funcional com forte hidrofobicidade em sequência. Com efeito, a Escherichia coli cultivada em meio contém, em grande quantidade, diversos componentes diferentes em hidrofobicidade, tais como polissacáridos, ADN genómico de Escherichia coli, plasmídeos de ARN e proteínas. Também se sabe que existem diferenças na hidrofobicidade, mesmo entre os próprios ácidos nucleicos. As proteínas que se tornam impurezas têm hidrofobicidade mais elevada em comparação com plasmídeos.

Muitas resinas de cromatografia de interacção hidrófoba estão disponíveis comercialmente, tais como propilo de Fractogel, Toyopearl, isopropilo de Source ou quaisquer outras resinas tendo grupos hidrofobos. São resinas muito preferidas os meios poliméricos em bruto de Toyopearl. O Toyopearl é um polímero metacrílico incorporando elevada estabilidade mecânica e química. Estão disponíveis resinas, como resinas da série "HW" não funcionalizadas e podem ser derivatizadas com químicas de 54 superfície para cromatografia de permuta iónica ou interacções hidrófobas. Podem ser utilizados quatro tipos de resinas de HIC de Toyopearl, que incluem diferentes níveis de hidrofobicidade e química de superfície. A hidrofobicidade de resinas de HIC de Toyopearl aumenta com a série: Éter, Fenilo, Butilo e Hexilo. As estruturas de resinas de HIC de Toyopearl preferidas, i. e., Toyopearl HW-65 tendo 1000 angstroms de diâmetro de poro são mostradas abaixo:

Toyopearl Éter-650

Toyopearl Fenilo-650

Toyopearl Butilo-650 Toyopearl Hexilo-650

As resinas de Toyopearl descritas acima podem ter diversos graus de tamanho de partícula. As Toyopearl 650C têm um tamanho de partícula em torno de 50 a 150 pm, de um modo preferido em torno de 100 pm, enquanto as Toyopearl 650M têm um tamanho de partícula em torno de 40 a 90 pm, de um modo preferido em torno de 6 5 pm e as Toyopearl 650S têm um tamanho de partícula em torno de 20 a 50 pm, de um modo preferido em torno de 35 pm. É bem sabido que o tamanho de partícula influencia a resolução, 55 i. e.f a resolução melhora do grau de tamanho de partícula C para M para S e, deste modo, aumenta com tamanhos de partícula mais pequenos. A resina de Toyopearl mais preferida utilizada na etapa de cromatografia HIC, dentro do processo de separação e purificação do ADN plasmídico de acordo com a presente invenção, é a Toyopearl butilo-650S, que é comercializada por Tosoh Bioscience.

De acordo com uma forma de realização preferida, é realizada uma etapa de diafiltração adicional. Os materiais de diafiltração padrão, comercialmente disponíveis, são adequados para utilização neste processo, de acordo com técnicas padrão conhecidas na técnica. Um método de diafiltração preferido é a diafiltração utilizando uma membrana de ultrafiltração, tendo uma exclusão de peso molecular na gama de 30000 a 500000, dependendo do tamanho de plasmídeo. Esta etapa de diafiltração permite a troca de tampão e a concentração é, depois, realizada. O eluato da etapa 12 é concentrado 3 a 4 vezes por filtração de fluxo tangencial (exclusão de membrana, 30 kDa) para uma concentração alvo de cerca de 2,5 a 3,0 mg/mL e o concentrado é trocado de tampão por diafiltração, a volume constante, com 10 volumes de solução salina e ajustado para a concentração plasmídica alvo com solução salina. A concentração de NV1FGF é calculada a partir da absorvência a 260 nm de amostras de concentrado. A solução de NV1FGF é filtrada através de um filtro de cápsula de 0,2 pm e dividida em várias alíquotas, que são armazenadas em recipientes numa câmara frigorífica, a 2-8 °C, até processamento adicional. Isto produz um concentrado purificado, com uma concentração de ADN plasmídico de plasmídeo superenrolado, é em torno de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% e, de um modo preferido, 99%. A recuperação global de plasmídeo com 56 este processo é, pelo menos, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% e 80%, com uma recuperação média de 60%.

De acordo com esta forma de realização, a etapa de diafiltração é realizada de acordo com as seguintes condições: são utilizados tampão para a etapa a) e para a etapa b): i) uma primeira diafiltração (etapa a) contra 12,5 a 13,0 volumes de Tris/HCl a 50 mM, NaCl a 150 mM, pH 7,4 (denominado tampão I) e ii) Realização de uma segunda diafiltração do retentado da etapa a) acima (etapa b) contra 3,0 a 3,5 volumes de excipiente salino (NaCl a 150 mM) . Esta etapa de diafiltração preferida, de acordo com a presente invenção remove, de modo eficiente e extensivo, sulfato de amónio e EDTA extensivamente. Também, subsequentes a estas etapas de diafiltração, são obtidas a apropriada concentração fisiológica de NaCl (em torno de 150 mM) e concentração final de Tris abaixo de 1 mM (entre 200 μΜ e 1 mM). A formulação de ADN plasmidico assim obtida, através da utilização desta etapa de diafiltração, compreende NaCl como excipiente salino e uma concentração apropriada de tampão Tris, de forma a manter ou controlar o valor de pH entre 7 e 7,5. As formulações de ADN plasmidico de acordo com o presente pedido são particularmente úteis, visto que o seu ADN plasmidico pode, surpreendentemente, ser armazenado numa forma estável não degradável nestas condições, durante um período de tempo prolongado, a 5 °C e até 25 °C, ou seja, à temperatura ambiente.

Como descrito, de acordo com o método inventivo para a separação de ADN plasmidico com elevada pureza pode ser obtido 57 em grande quantidade, por manipulaçao mais simples em relaçao a um método convencional. 0 processo de purificação de plasmídeos pode ser utilizado subsequentemente ao método de lise contínua, como descrito acima, ou quaisquer métodos de lise alternativos que são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, pode ser utilizada a lise térmica de escoamento de células microbianas contendo plasmideo. Este processo é descrito, inter alia, na Publicação Internacional WO 96/02658. O particular permutador de calor consistia num tubo de aço inoxidável O.D., de 10 pés x 0,25 polegadas, em forma de uma serpentina. A serpentina está completamente imersa dentro de um banho-maria de temperatura elevada constante. O volume de retenção da serpentina é cerca de 50 mL. Foram utilizados pares termoeléctricos e um termómetro para medir as temperaturas de admissão e saída e da temperatura do banho-maria, respectivamente. A corrente de produto é bombeada para dentro da serpentina de aquecimento utilizando uma bomba peristáltica Masterflex, com tubagem de silicone. O lisado celular abandona a serpentina e é, depois, centrifugado numa centrífuga Beckman J-21, em descontínuo, para clarificação. Após centrifugação, o ADN plasmídico pode ser purificado utilizando o método de purificação de acordo com a presente invenção. A lise celular alternativa pode fazer utilização de misturadores estáticos em série. Com efeito, como descrito no documento WO97/23601 (aqui incorporado por referência), um primeiro misturador estático para a lise das células através de um primeiro misturador estático e para a precipitação do lisado celular através de um segundo misturador estático pode ser utilizado como um método alternativo para a lise da célula, 58 antes do método de purificação de ADN plasmídico de acordo com a presente invenção. Grandes volumes de células podem ser suave e continuamente lisados, em linha, utilizando o misturador estático e que os outros misturadores estáticos são colocados em linha, para realizarem outras funções, tais como diluição e precipitação. Os misturadores estáticos adequados úteis no método da presente invenção incluem qualquer dispositivo de escoamento referido na técnica, como um misturador estático ou imóvel, de um comprimento suficiente para permitir os processos da presente invenção. Por exemplo, para efeitos da lise celular, o misturador estático necessitaria de ter um comprimento que proporcionasse tempo de contacto suficiente entre a solução de lise e as células, para 5 causar a lise das células submetidas durante a passagem através do misturador. Numa forma de realização preferida, os misturadores estáticos 5 adequados contêm uma estrutura helicoidal interna que faz com que dois líquidos entrem em contacto um com o outro, num fluxo rotacional oposto, fazendo com que os líquidos se misturem entre si num fluxo turbulento. 0 método de separação e purificação de ADN plasmídico, de acordo com a presente invenção, pode ser utilizado para separar e purificar quaisquer tipos de vectores, com quaisquer tamanhos. A gama de tamanhos de ADN plasmídico que pode ser separada pelo método de acordo com a presente invenção é de, aproximadamente, 5 kb a, aproximadamente, 50 kb, de um modo preferido, 15 kb a 50 kb, cujo ADN inclui uma estrutura de vector de, aproximadamente, 3 kb, um gene terapêutico e sequências regulatórias associadas. Deste modo, uma estrutura de vector útil na invenção irá ser capaz de transportar insertos de, aproximadamente, 10-50 kb, ou maiores. O inserto pode incluir ADN de qualquer organismo mas irá, de um modo preferido, ser de 59 origem mamífera e pode incluir, adicionalmente a um gene codificando uma proteína terapêutica, sequências regulatórias, tais como promotores, sequências de poliadenilação, estimuladores, regiões de controlo de lócus, etc. 0 gene

codificando uma proteína terapêutica pode ser de origem genómica e, por conseguinte, conter exões e intrões, como reflectido na sua organização genómica ou pode ser derivado de ADN complementar. Esses vectores podem incluir, por exemplo, estrutura de vector replicável com replicação de elevado número de cópia, tendo um poliadaptador para inserção de um gene terapêutico, um gene codificando um marcador seleccionável, e. g. , ARNt SupPhe, o gene de resistência a tetraciclina canamicina e ser fisicamente pequeno e estável. A estrutura de vector do plasmídeo permite, de um modo vantajoso, insertos de fragmentos de ADN de mamífero, outros eucarióticos, procarióticos ou virais e o plasmídeo resultante pode ser purificado e utilizado em terapia de base plasmídica in vivo ou ex vivo. Os vectores tendo um número de cópia relativamente elevado, í. e., na gama de 20-40 cópias/célula até 1000-2000 cópias/célula, podem ser separados e purificados pelo método de acordo com a presente invenção. Por exemplo, de acordo com o método da invenção é preferido um vector que inclui a origem de replicação de pUC. A origem de replicação de pUC permite uma replicação mais eficiente de ADN plasmídico e resulta num aumento de dez vezes no número de cópia/célula de plasmídeo em relação, e. g., a uma origem de pBR322. De um modo preferido, o ADN plasmídico com origem de replicação condicional ou pCOR, como descrito no documento US 2003/1618445, pode ser separado pelo processo de acordo com a presente invenção. O elevado número de cópia resultante aumenta grandemente a razão de ADN plasmídico para ADN cromossómico, ARN, proteínas celulares e cofactores, melhora o rendimento de plasmídeo e 60 facilita uma purificação a jusante mais fácil. Consequentemente, qualquer vector (ADN plasmidico) pode ser utilizado de acordo com a invenção. Os vectores representativos incluem mas não estão limitados ao plasmídeo NV1FGF. 0 NV1FGF é um plasmídeo codificando um Factor de Crescimento de Fibroblastos acidico ou Factor de Crescimento de Fibroblastos de tipo 1 (FGF-1), útil para o tratamento de doentes com doença oclusiva arterial periférica de estádio terminal (PAOD) ou com doença arterial periférica (PAD), cumpre requisitos de segurança. Camerota et al. (J Vasc. Surg., 2002, 35, 5:930-936) descrevem que 51 doentes com PAD de estádio terminal não reconstruivel, com dor em repouso ou necrose tecidular, foram injectados intramuscularmente com doses crescentes, únicas ou repetidas, de NV1FGF na coxa e barriga da perna isquémicas. Foram subsequentemente avaliados diversos parâmetros, tais como pressão de oxigénio transcutâneo, índices braquiais de tornozelo e dedo do pé, avaliação de dores e cicatrização de úlcera. Um aumento significativo de índices braquiais, redução de dor, resolução de tamanho de úlcera e uma perfusão melhorada após administração de NV1FGF foram observados.

As células hospedeiras úteis de acordo com a invenção podem ser qualquer estirpe bacteriana, i. e., estirpes Gram positivas e Gram negativas, tais como E. coli e Salmonella Typhimurium ou Bacíllus, que são capazes de manter um elevado número de cópia dos plasmideos descritos acima; por exemplo, 20-200 cópias. As estirpes hospedeiras de E. coli podem ser utilizadas de acordo com a invenção e incluem HB101, DH1 e DH5aF, XAC-1 e XAC-lpir 116, TEX2 e TEX2pir42 (documento WO04/033664) . As estirpes contendo o plasmídeo F, ou derivados de plasmídeo F (por exemplo JM109) são, em geral, não preferidas, devido ao plasmídeo F se poder co-purificar com o produto plasmidico terapêutico. 61

De acordo com outro aspecto, a presente invenção também se refere a uma composição compreendendo ADN plasmídico altamente purificado que está essencialmente isento de contaminantes, ou na gama de contaminantes sub-ppm e, deste modo, é ADN de grau farmacêutico. A composição de ADN plasmídico de grau farmacêutico de acordo com a presente invenção contém, deste modo, os contaminantes ADNg, ARN e proteína sub-ppm (< 0,0001%, í. e., < 0,0001 mg por 100 mg de ADN plasmídico). A composição de ADN plasmídico de grau farmacêutico contém, deste modo, menos de cerca de 0,01% ou menos de 0,001% e, de um modo preferido, menos de 0,0001% ou, de um modo preferido, menos de 0,00008% (< 0,0008%, i. e., < 0,0008 mg por 100 mg de ADN plasmídico) de ADN cromossómico ou ADN genómico. A composição de ADN plasmídico de grau farmacêutico contém, deste modo, menos de cerca de 0,01% ou menos de 0,001% e, de um modo preferido, menos de 0,0001% ou, de um modo preferido, menos de 0,00002% (< 0,0002%, i. e., < 0,0002 mg por 100 mg de ADN plasmídico) de contaminantes de ARN. A composição de ADN plasmídico de grau farmacêutico contém, deste modo, menos de cerca de 0,0001% e, de um modo muito preferido, menos de 0,00005% de contaminantes proteicos. A composição de ADN plasmídico de grau farmacêutico contém, deste modo, menos de 0,1 EU/mg de endotoxinas. A composição de ADN plasmídico de grau farmacêutico contém, deste modo, ADN plasmídico na forma predominantemente circular e, de um modo mais preciso, contém mais de 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de ADN plasmídico de forma circular fechada. 62 A presente invenção também se refere a uma formulação líquida de ADN plasmídico que é estável e permanece não degradada, à temperatura ambiente, durante um longo período de tempo e é, deste modo, útil para armazenamento de ADN plasmídico que é utilizada para investigação e terapia humana relacionada. A presente invenção refere-se, deste modo, a uma formulação de ADN plasmídico estável, compreendendo ADN plasmídico, uma solução tampão muito diluída e um excipiente salino, em que a solução tampão está presente numa concentração, de forma a manter o pH da referida formulação ou composição entre 7 e 7,5.

As soluções tampão que são capazes de manter o pH da composição entre 7 e 7,5 consistem num sistema ácido/base compreendendo Tris [tris(hidroximetil)-aminometano] ou lisina, e um ácido escolhido de um ácido forte (ácido clorídrico, por exemplo) ou um ácido fraco (ácido maleico, ácido málico ou ácido acético, por exemplo), ou num sistema ácido/base compreendendo Hepes [ácido 2-(4-(2-hidroxietilpiperazin)-1-il)etanossulfónico] e uma base forte (hidróxido de sódio, por exemplo). A solução tampão também pode compreender Tris/HCl, lisina/HCl, Tris/ácido maleico, Tris/ácido málico, Tris/ácido acético ou Hepes/hidróxido de sódio.

De um modo preferido, o pH é mantido entre 7 e 7,5 e, de um modo ainda mais particular, em torno de 7,2. 0 excipiente salino que pode ser utilizado na formulação da presente invenção é, de um modo preferido, NaCl, a uma concentração entre 100 e 200 mM e, de um modo preferido, uma concentração em torno de 150 mM. Outro excipiente salino pode compreender aniões e catiões, seleccionados do grupo consistindo 63 em acetato, fosfato, carbonato, SO2 4, Cl , Br , N03 , Mg2+, Li + ,

Na+, K+ e NH4+. A concentração molar da solução tampão é determinada de forma a exercer o efeito de tamponização dentro de um limite e num volume onde o valor de pH é estabilizado entre 7 e 7,5. A composição de armazenamento de ADN plasmidico estável de acordo com a presente invenção compreende, deste modo, ADN plasmidico, um excipiente salino e uma solução tampão, em que a solução tampão está presente numa concentração até 1 mM e, de um modo preferido, entre 250 μΜ e 1 mM ou, de um modo preferido, entre 400 μΜ e 1 mM, de forma a manter o pH da referida formulação ou composição entre 7 e 7,5. Entre os sistemas tampão de acordo com a invenção, a solução tampão de Tris, a uma concentração de 400 μΜ, proporciona resultados particularmente satisfatórios e é, deste modo, preferida na formulação plasmídica da presente invenção.

Como mostrado nos Exemplos abaixo, a formulação de ADN plasmidico de acordo com a presente invenção exibe uma excelente estabilidade, a 4 °C e à temperatura ambiente (TA), e. g., 20 ou 25 °C. Particularmente, a formulação de ADN plasmidico é útil durante um período de tempo prolongado de 1 mês, 2 meses, 3 meses a 6 meses e até 12 meses, a 4 °C e a 25 °C, e. g. , TA. A presente invenção refere-se, deste modo, a uma composição compreendendo ADN plasmidico, uma solução tampão e excipiente salino, em que a solução tampão está presente numa concentração suficiente para preservar o ADN plasmidico na forma estável, a 4 °C até 25 °C. 64 A presente invenção também se refere a uma composição compreendendo ADN plasmidico, uma solução tampão e excipiente salino, em que a solução tampão está presente numa concentração suficiente para preservar o ADN plasmidico na forma estável, a 4 °C até 25 °C, durante um período de tempo prolongado, de 1 mês, 2 meses, 3 meses a 6 meses e até 12 meses.

Com efeito, o ADN plasmidico que é armazenado a 5 °C ou à temperatura ambiente, durante um longo período de tempo exibe taxas muito baixas de depurinação e circularização aberta, inferiores a 20%, 15%, 10%, 5% ou ^ 1% por mês. A composição de acordo com a presente invenção pode compreender, ainda, um adjuvante, tal como, por exemplo, um polímero, seleccionado entre polietilenoglicol, um plurónico ou um açúcar polissorbato ou álcool.

De acordo com outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método de preservação de ADN plasmidico numa composição, compreendendo a) preparação de uma amostra purificada de ADN plasmidico e b) combinação da referida amostra purificada de ADN plasmidico com um excipiente salino e uma solução tampão que mantém o pH da composição resultante entre 7 e 7,5. A presente invenção também se refere a um método de preservação de ADN plasmidico numa composição, a uma temperatura de até cerca de 20 °C, compreendendo a) preparação de uma

amostra purificada de ADN plasmidico, b) combinação da amostra purificada de ADN plasmidico com um excipiente salino e uma solução tampão, em que a solução tampão está presente numa concentração inferior a 1 mM, ou entre 250 μΜ e 1 mM e, de um modo preferido, 400 μΜ; e c) armazenamento da composição de ADN 65 plasmídico a uma temperatura de cerca de 4 °C até cerca de 20 °C.

Exemplos Técnicas gerais de clonagem e biologia molecular

Os métodos tradicionais de biologia molecular, tais como digestão com enzimas de restrição, electroforese em gel, transformação em E. coli, precipitação de ácidos nucleicos e semelhantes, são descritos na literatura (Maniatis et al., T., E.F. Fritsch e J. Sambrook, 1989. Molecular cloning: a laboratory manual, segunda edição. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova Iorque; Ausubel F.M., R. Brent, R.E. Kinston, D.D. Moore, J.A. Smith, J.G. Seidman e K. Struhl. 1987. Current protocols ín molecular biology, 1987-1988. John Willey and Sons, Nova Iorque). As sequências nucleotidicas foram determinadas pelo método de terminação de cadeia, de acordo com o protocolo já publicado (Ausubel et al., 1987).

As enzimas de restrição foram fornecidas pela New England Biolabs, Beverly, MA (Biolabs).

Para efectuar as ligações, os fragmentos de ADN são incubados num tampão compreendendo Tris-HCl a 50 mM, pH 7, 4, MgCl2 a 10 mM, DTT a 10 mM, ATP a 2 mM, na presença de T4 ADN ligase de fago (Biolabs).

Os oligonucleótidos são sintetizados utilizando a química do fosforamidito, com os fosforamiditos protegidos na posição β 66 por um grupo cianoetilo (Sinha, N.D., J. Biernat, J. McManus e H. Kõster, 1984. Síntese oligonucleotídica de suporte polimérico, XVIII: Utilização de /3-cianoetil-N, N-dialquilamino-/N-morfolino fosforamidito de desoxinucleósidos para a síntese de fragmentos de ADN simplificando a desprotecção e isolamento do produto final. Nucl. Acids Res., 12, 4539-4557: Giles, J.W. 1985. Avanços na síntese de ADN automatizada. Am. Biotechnol., Nov./Dez.) com um sintetizador de ADN automático Biosearch 8600, utilizando as recomendações do fabricante.

Os ADN ligados ou ADN a serem testados para a sua eficácia de transformação são utilizados para transformar a seguinte estirpe, tornada competente: E. coli DH5a[F/endÃl hsdR17, supE44, thi-1, recAl, gyrA96, relAl, Δ (lacZYA- arqF)O169, deoR, <í>80dlac (LacZAM15) ] (para qualquer plasmídeo Col El); ou E. coli XAC-pir (para qualquer plasmídeo derivado de pCor).

As minipreparações de ADN plasmídico são preparadas de acordo com o protocolo de Klein et al. , 1980. O meio de cultura LB é utilizado para o crescimento de estirpes de E. coli (Maniatis et al. , 1982) . As estirpes são incubadas a 37 °C. As bactérias são plaqueadas em placas de meio LB suplementado com antibióticos adequados.

Exemplo 1 O ajustamento dos diâmetros aos caudais utilizados resulta do cálculo dos números de Reynolds em serpentinas do sistema de 67 lise contínua. Devido à seguinte análise assumir que o comportamento dos fluidos é Newtoniano, os números referidos abaixo são apenas totalmente válidos em Bla e, até certo ponto, em B2 . 0 valor do número de Reynolds permite a um especialista na técnica especificar o tipo de comportamento encontrado. Aqui, irá abordar-se apenas o fluxo fluido num tubo (engenharia hidráulica). 1) Fluido nao-Newtoniano

Os dois tipos de fluidos não-Newtonianos mais geralmente encontrados na indústria são Bingham e Ostwald de Waele.

Neste caso, o número de Reynolds (Re) é calculado como se segue:

ReN é o número de Reynolds generalizado

Reu = (1 /(2 n'3))x(n/3n +1)"x ((pxDnxw2'n)/m) (1) D: diâmetro interno da secção transversal (m) p: massa volumétrica do fluido (kg/m3) w: velocidade espacial do fluido (m/s) n: índice de comportamento de fluxo (adimensional) m: coeficiente de consistência de fluido (dyn . sn / cm2) E n e m são determinados empiricamente (estudo de comportamento reológico). 68 2) Fluido Newtoniano

Quanto à primeira secção, na Equação (1) tem-se:

Re = f (diâmetro interno, μ, p e u) , visto que nem são funções de μ. (2)

Re = (u x D x p) / μ p: Massa volumétrica do fluido (kg/m3) μ: Viscosidade do fluido (Pa.s, e 1 mPa.s = 1 cP) D: diâmetro interno da secção transversal (m) u: velocidade espacial média do fluido (m/s) A Equação (1), para n=l, reduz-se à Equação (2).

Com Q = caudal (m3/h) e S = área de superfície da secção transversal (m2) e se μ é dado em cP, então: (3)

Re = (4 x (Q/3600) x p) / ((μ/1000) x Π x D)

Numa conduta circular, o fluxo é laminar para um número de Reynolds abaixo de 2500 e é fluxo turbulento hidraulicamente consistente para um número de Reynolds entre 2000 e 500000. O limite é deliberadamente vago entre 2000 e 2500, onde ambos os tipos de comportamento são utilizados para determinar o que pode, depois, ocorrer e a escolha é realizada a posteriori. 69 3) Cálculos

Visto que nem sao, em geral, não conhecidos, as seguintes aproximações foram utilizadas para estimar as tendências:

Fluido Newtoniano (em todas as secções transversais) p = 1000 kg/m3 (para todos os fluidos) μ = 5 cP em Bla e 40 cP em Blb (dados próprios) 2,5 cP em B2 (dados próprios)

Os seguintes cálculos foram realizados utilizando a Equação (3) para duas configurações de tubagem padrão testadas, denominadas configuração 1 e configuração 2 (sem o tubo Blb):

Tabela 2

Serpentina Configuração 1 Configuração 2 Bla B2 Bla B2 Viscosidade* (cP) 5 2,5 5 2,5 Diâmetro (mm) 12,7 9,5 6 6 Caudal (L/h) 60 105 12 21 Número de Reynolds 334 1564 141 495 Processo laminar laminar laminar laminar

Nestas duas configurações, os fluxos são laminares em todas as fases e as soluções não estão adequadamente misturadas entre si.

Para outras configurações de tubagem (sem o tubo Blb), tem-se: 70

Tabela 3

Serpentina Velocidade elevada / Velocidade elevada Velocidade elevada diâmetro padrão / ID de 16 mm / ID de 5 mm Bla B2 Bla B2 Bla B2 Viscosidade* 5 2,5 5 2,5 5 2,5 (CP) Diâmetro (mm) 12 10 16 16 6 6 Caudal (L/h) 120 210 120 210 120 210 Número de 707 2971 531 1857 1415 4951 Reynolds Processo laminar turbulento laminar laminar laminar turbulento

Foram realizados cálculos semelhantes utilizando a Equação (3) para diversas configurações de tubagem, com os tubos Bla e Blb presentes:

Tabela 4

Serpentina Velocidade elevada Velocidade elevada / agitação max Bla Blb B2 Bla Bla Bla Viscosidade* 5 5 2,5 5 5 5 (CP) Diâmetro (mm) 6 16 6 3 2 3 Caudal (L/h) 120 120 210 120 120 160 Número de 1415 531 4951 2829 4244 3773 Reynolds Processo laminar laminar turbulento turbulento turbulento turbulento

Claramente, obtidos através caudais. os valores de Reynolds predefinidos podem ser do ajustamento dos diâmetros de tubo e dos 71

Um especialista na técnica pode prever muitas combinações de diâmetros e comprimentos para B2 ou para as duas secções de BI (Bla e Blb) . Por exemplo, a primeira secção de BI pode ser reduzida de 6 mm para 3 mm, de modo a reduzir o comprimento e aumentar a agitação. Além disso, nem podem ser determinados a partir do estudo do comportamento reológico dos fluidos e utilizados para determinar as características correctas dos tubos.

Além da eficiência de agitação, também se pode considerar a duração da agitação que, em algumas formas de realização da presente invenção, é obtida através do ajustamento do comprimento das serpentinas. 0 diâmetro dos tubos ou a velocidade do fluido não parece dominar na Equação (1) para um fluido não-Newtoniano (dados não mostrados). Por outras palavras, não parece ser mais eficaz a alterar o diâmetro do que é a alterar o caudal se a equação (1) for utilizada para cálculos dentro de Blb e em B2. Onde forem desejáveis caudais elevados, o diâmetro pode ser variado juntamente com o caudal.

Estes princípios podem ser utilizados como uma base para limitar a agitação, tanto quanto possível, em Blb e B2, de modo a evitar a fragmentação de ADNg.

Durante a lise, a agitação pode ser bastante vigorosa, desde que o ADNg não seja desnaturado. Reduzindo o diâmetro no início de BI torna possível aumentar a agitação (Re aumentado) , de modo a misturar suficientemente a solução 2 com as células. Por outro lado, quando as células estão lisadas, a agitação e forças friccionais contra a parede podem ser reduzidas, para 72 evitar a fragmentação de ácido nucleico. Aumentando o diâmetro, torna possivel reduzir a agitação (Re diminuído) e fricção (velocidade reduzida).

Ml: mistura dos fluidos.

Bla: sintonização fina da mistura no início da lise: fenómeno de convecção (macromistura).

Blb: deixar ocorrer a desnaturação mais o fenómeno de convecção (micromistura).

Assume-se que o número de Reynolds generalizado tem o mesmo significado para um fluido não-Newtoniano que tem o número de Reynolds clássico para um fluido Newtoniano. Em particular, assume-se que o limite para o regime laminar numa conduta de secção transversal circular é ReN < 2300. A neutralização é realizada dentro de B2. Caudais elevados tendem a aumentar a fragmentação de ADN genómico, ao causarem a agitação, que é demasiado vigorosa e às forças friccionais na parede (tensões mecânicas). Utilizando um tubo de grande diâmetro torna possível reduzir a agitação (Re) e forças friccionais (velocidade). Posicionou-se aqui um tubo de pequeno diâmetro (6 mm), para evitar não ter agitação suficiente. As observações próprias mostraram que era melhor ter apenas um tubo de pequeno diâmetro para B2, de modo a "violentamente e rapidamente" agitar o lisado neutralizado. 73

Exemplo 2

Pode decompor-se o sistema CL em 5 etapas. Numa particular forma de realização, a configuração foi como se segue: 1) Mistura: células (em solução 1) + solução 2 (Ml + 3 m de tubo de 6 mm).

Inicio da lise das células por SDS, sem risco de fragmentação de ADN, desde que não seja desnaturado. 2) Fim da lise e desnaturação de ADNg (13 m de tubo de 16 mm). 3) Mistura: Lisado + solução 3 (M2 + 3 m de tubo de 6 mm).

4) Recolha do lisado neutralizado, a 4 °C 5) Sedimentação de flocos e fragmentos grandes de ADNg, de um dia para o outro, a 4 °C.

As seguintes condições podem ser utilizadas para efectuar a lise continua: - Solução 1: EDTA a 10 mM, glucose (Glc) a 9 g/L e Tris HC1 a 25 mM, pH 7,2. - Solução 2: SDS a 1% e NaOH a 0,2 N. - Solução 3: Ácido acético a 2 M e acetato de potássio a 3 M. - Caudal de 60 L/h: Solução 1 e solução 2 - Caudal de 90 L/h: Solução 3. - Células ajustadas para 38,5 g/L com solução 1.

As células na solução 1 passam através de 3 bocais que as dispersam para dentro da solução 2, que chega da direcção oposta. 74 - 0 misturador Ml tem uma geometria tornando possível optimizar a mistura dos dois fluidos (ver a Figura 2, desenho esquemático do misturador) . — A primeira secção do tubo a seguir ao misturador Ml é Bla e a secção seguinte é Blb.

Bla: 3 m de comprimento, 6 mm de diâmetro, 2,5 s de tempo de permanência

Blb: 13 m de comprimento, 16 mm de diâmetro, 77 s de tempo de permanência 0 processo da presente invenção proporciona uma vantagem em termos de eficiência, sumariada como: dispersão, mistura violenta breve e mistura suave por difusão.

Utilizando o processo da presente invenção, o número de células lisadas é aumentado e, por conseguinte, a quantidade de ADNp recuperado é aumentada. A ideia de difusão é especialmente importante, devido à dificuldade de misturar estes fluidos, devido às suas propriedades, em particular a viscoelasticidade. 0 processo da presente invenção torna possível limitar a tensão de cisalhamento e, por conseguinte, limitar a fragmentação de ADNg, facilitando a sua remoção durante a purificação cromatográfica subsequente. 0 problema é, depois, misturar com solução 3, que pode ser arrefecida para 4 °C. Numa forma de realização, o processo da invenção utiliza: 75 - Misturador M2, que é um Y de diâmetro interno de cerca de 10 mm — A secção do tubo B2 colocado a seguir ao misturador M2. B2: 2 m de tubo de 6 mm; tempo de permanência: 1 s A Tabela 5 abaixo proporciona os resultados obtidos em testes comparativos, para mostrar as vantagens do presente processo de lise contínua, em comparação com a lise em descontínuo.

Tabela 5

Razão ADNg/ADNp Quantidade de plasmídeo em lisado extraído por g de célula (mg/g) Lise em descontinuo 16,9 1,4

Lise continua com o 1,6 1,9 sistema CL descrito no exemplo 1

Exemplo 3 A coluna utilizada é uma coluna HiTrap de 1 mL, activada com NHS (N-hidroxisuccinimida, Pharmacia), ligada a uma bomba peristáltica (débito < 1 mL/min). O oligonucleótido específico utilizado possui um grupo NH2 na extremidade 5', a sua sequência é como se segue: 5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (SEQ ID N°: 1).

Os tampões utilizados neste exemplo são os seguintes:

Tampão de ligação: NaHC03 a 0,2 M, NaCl a 0,5 M, pH 8,3. 76

Tampão A: etanolamina a 0,5 M, NaCl a 0,5 M, pH 8,3.

Tampão B: acetato a 0,1 M, NaCl a 0,5 M, pH 4. A coluna é lavada com 6 mL de HC1 a 1 mM e o oligonucleót ido diluído no tampão de ligação (50 nmol em 1 mL) é, depois, aplicado à coluna e deixada, durante 30 minutos, à temperatura ambiente. A coluna é lavada três vezes em sucessão com 6 mL de tampão A e, depois, 6 mL de tampão B. O oligonucleótido é, deste modo, ligado covalentemente à coluna através de uma ligação CONH. A coluna é armazenada, a 4 °C, em PBS, NaN3 a 0,1% e pode ser utilizada, pelo menos, quatro vezes.

Foram sintetizados os dois oligonucleótidos seguintes: oligonucleótido 4817: 5'-GATCCGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGA AGAAGAAGAAGAAGAAGAAGG-3' (SEQ ID N° : 13) e oligonucleótido 4818 5'-AATTCCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCG-3' (SEQ ID N°: 14) .

Estes oligonucleótidos, quando hibridados e clonados dentro de um plasmídeo, introduzem uma sequência de homopurina-homopirimidina (GAA)i7 (SEQ ID N° : 15) dentro do plasmídeo correspondente, como descrito acima. A sequência correspondendo a estes dois oligonucleótidos hibridados foi clonada no sítio de clonagem múltipla do plasmídeo pBKS+ (Stratagene Cloning System, La Jolla CA), que transporta um gene de resistência a ampicilina. Para o efeito, os oligonucleótidos foram hibridados do seguinte modo: um pg destes dois oligonucleótidos foi colocado em conjunto em 40 mL de um tampão final compreendendo Tris-HCl a 50 mM, pH 7, 4, MgCl2 a 10 mM. Esta mistura foi aquecida a 95 °C e foi, depois, colocada à temperatura ambiente, para que a temperatura descesse 77 lentamente. Dez ng da mistura de oligonucleótidos hibridados foram ligados com 200 ng de plasmídeo pBKS+ (Stratagene Cloning System, La Jolla CA) digerido com BamE.1 e EcoRI em 30 pL finais. Após ligação, uma aliquota foi transformada dentro de DH5a. As misturas de transformação foram plaqueadas sobre meio L, suplementado com ampicilina (50 mg/L) e X-gal (20 mg/L). Os clones recombinantes devem exibir uma ausência de coloração azul neste meio, contrariamente ao plasmídeo parental (pBKS+), que permite a complementação α do fragmento ω de /3-galactosidase de E. coli. Após a minipreparação de ADN plasmídico a partir de 6 clones, todos eles exibiram o desaparecimento do sítio PstI, localizado entre os sítios EcoRI e BamHl de pBKS+ e um aumento no peso molecular da banda PvuII de 448 pb contendo o sítio de múltipla clonagem. Um clone foi seleccionado e o plasmídeo correspondente foi designado pXL2563. A sequência clonada foi verificada por sequenciação utilizando o iniciador -20 (5'-TGACCGGCAGCAAAATG-3' (SEQ ID N°: 16)) (Viera J. e J. Messing. 1982. Os plasmídeos pUC, um sistema derivado de M13mp7 para mutagénese de inserção e sequenciação com iniciadores sintéticos universais. Gene, 19, 259-268) para o plasmídeo pBKS+ (Stratagene Cloning System, La Jolla CA). O plasmídeo pXL2563 foi purificado de acordo com o kit Wizard Megaprep (Promega Corp. Madison, WI) de acordo com as recomendações do fornecedor. Esta preparação de ADN plasmídico foi a seguir utilizada nos exemplos descritos abaixo. 0 plasmídeo pXL2563 foi purificado na coluna HiTrap ligada ao oligonucleótido, descrito em 1.1., a partir de uma solução contendo também o plasmídeo pBKS+.

Os tampões utilizados nesta purificação são os seguintes: 78

Tampão F: NaCl a 2 M, acetato a 0,2 M, pH 4,5 a 5.

Tampão E: Tris-HCl a 1 M, pH 9, EDTA a 0,5 mM. A coluna é lavada com 6 mL de tampão F e os plasmídeos (20 pg de pXL2563 e 20 pg de pBKS+ em 400 pL de tampão F) são aplicados à coluna e incubados, durante 2 horas, à temperatura ambiente. A coluna é lavada com 10 mL de tampão F e a eluição é, depois, efectuada com tampão E. Os plasmídeos são detectados após electroforese em gel de agarose a 1% e coloração de brometo de etidio. A proporção dos plasmídeo na solução é estimada através da medição da sua actividade de transformação em E. coli.

Partindo de uma mistura contendo 30% de pXL2563 e 70% de pBKS+, uma solução contendo 100% de pXL2563 é recuperada no orifício de descarga da coluna. A pureza, estimada pela razão de DO a 260 e 280 nm, sobe de 1,9 para 2,5, o que indica que as proteínas contaminantes são removidas por este método.

Exemplo 4 A ligação do oligonucleótido (5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (SEQ ID N°: 1)) à coluna é realizada como descrito no Exemplo 3. Para a ligação, o oligonucleótido é modificado na extremidade 5' com um grupo amina, ligado ao fosfato do espaçador por um braço contendo 6 átomos de carbono (Modified oligonucleotide Eurogentec SA, Bélgica). O plasmídeo pXL2563 foi purificado utilizando o kit Wizard Megaprep (Promega Corp., Madison, WI) de acordo com as recomendações do fornecedor. Os tampões utilizados neste exemplo são os seguintes: 79

Tampão F: NaCl a 0-2 M, acetato a 0,2 M, pH 4,5 a 5.

Tampão E: Tris-HCl a 1 M, pH 9, EDTA a 0,5 mM. A coluna é lavada com 6 mL de tampão F e 100 pg de plasmídeo pXL2563, diluído em 400 pL de tampão F são, depois, aplicados à coluna e incubados, durante 2 horas, à temperatura ambiente. A coluna é lavada com 10 mL de tampão F e a eluição é, depois, efectuada com tampão E. O plasmídeo é quantificado através da medição da densidade óptica a 260 nm.

Neste exemplo, a ligação é efectuada num tampão cuja molaridade, com respeito a NaCl, varia de 0 a 2 M (tampão F) . O rendimento de purificação diminui quando a molaridade de NaCl cai. 0 pH do tampão de ligação pode variar de 4,5 a 5, o rendimento de purificação sendo melhor a 4,5. Também é possível utilizar outro tampão de eluição de pH básico: a eluição foi, deste modo, efectuada com um tampão compreendendo borato a 50 mM, pH 9, EDTA a 0,5 mM. A ligação do oligonucleótido (5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (SEQ ID N°: 1) à coluna é efectuada como descrito no Exemplo 3. O plasmídeo pXL2563 foi purificado utilizando o kit Wizard Megaprep (Promega Corp., Madison, WI) de acordo com as recomendações do fornecedor. Os tampões utilizados neste exemplo são os seguintes:

Tampão F: NaCl a 0,1 M, acetato a 0,2 M, pH 5.

Tampão E: Tris-HCl a 1 M, pH 9, EDTA a 0,5 mM. A coluna é lavada com 6 mL de tampão F e 100 pg de plasmídeo pXL2563, diluído em 400 pL de tampão F são, depois, aplicados à coluna e incubados, durante uma hora, à temperatura ambiente. A coluna é lavada com 10 mL de tampão F e a eluição é, 80 depois, efectuada com tampão E. 0 teor de ADN genómico ou cromossómico de E. coli presente nas amostras plasmídicas, antes e após passagem através da coluna de oligonucleótido, é medido. Este ADN genómico é quantificado por PCR utilizando iniciadores no gene galK de E. coli. De acordo com o seguinte protocolo: A sequência destes iniciadores é descrita por Debouck et al. (Nucleic Acids Res. 1985, 13, 1841-1853): 5'-CCG AAT TCT GGG GAC CAA AGC AGT TTC-3' (SEQ ID N°: 17) e 5'-CCA AGC TTC ACT GTT CAC GAC GGG TGT -3' (SEQ ID N°: 18) . 0 meio de reacção compreende, em 25 pL de tampão de PCR (Promega França, Charbonnières) : MgCl2 a 1,5 mM; dXTP a 0,2 mM (Pharmacia, Orsay); iniciador a 0,5 pM; 20 U/mL de Taq polimerase (Promega). A reacção é realizada de acordo com a sequência:

- 5 min a 95 °C

- 30 ciclos de 10 s a 95 °C

30 s a 60 °C 1 min a 78 °C - 10 min a 78 °C. O fragmento de ADN amplificado, de 124 pares de bases em comprimento, é separado por electroforese em gel de agarose a 3%, na presença de SybrGreen I (Molecular Probes, Eugene, EUA) 81 e, depois, quantificado por referência a uma série de ADN genómico Ultrapur da estirpe B de E. coli (Sigma, ref. D4889).

Exemplo 5

Este exemplo descreve a purificação de ADN plasmídico a partir de um lisado nitido de cultura bacteriana, na denominada escala "miniprep": 1,5 mL de uma cultura, de um dia para o outro, de estirpes DH5oí contendo o plasmídeo pXL2563 são centrifugados e o sedimento é ressuspenso em 100 pL de glucose a 50 mM, Tris-HCl a 25 mM, pH 8, EDTA a 10 mM. São adicionados 200 pL de NaOH a 0,2 M, SDS a 1%, os tubos são invertidos para misturar, 150 pL de acetato de potássio a 3 M, pH 5, são, depois, adicionados e os tubos são invertidos para misturar. Após centrifugação, o sobrenadante é recuperado e carregado sobre a coluna de oligonucleótido, obtida como descrito no Exemplo 1. A ligação, lavagens e eluição são idênticas às descritas no Exemplo 3. Aproximadamente 1 pg de plasmídeo é recuperado de 1,5 mL de cultura. O plasmídeo obtido, analisado por electroforese em gel de agarose e coloração de brometo de etídio, toma a forma de uma única banda de ADN circular "superenrolado". Nenhum vestígio de ADN (cromossómico) ou de ARN, de elevado peso molecular, é detectável no plasmídeo purificado por este método.

Exemplo 6

Este exemplo descreve uma experiência de purificação de ADN plasmídico, efectuada sob as mesmas condições que o Exemplo 5, partindo de 20 mL de cultura bacteriana de estirpes DH5a 82 contendo o plasmídeo pXL2563. 0 sedimento celular é retirado em 1,5 mL de glucose a 50 mM, Tris-HCl a 25 mM, pH 8, EDTA a 10 mM. A lise é efectuada com 2 mL de NaOH a 0,2 M, SDS a 1% e a neutralização com 1,5 mL de acetato de potássio a 3 M, pH 5. O ADN é, depois, precipitado com 3 mL de 2-propanol e o sedimento é retirado em 0,5 mL de acetato de sódio a 0,2 M, pH 5, NaCl a 0,1 M e carregado sobre a coluna de oligonucleótido, obtida como descrito no Exemplo acima. A ligaçao, lavagem da coluna e eluição são efectuadas como descrito no Exemplo acima, à excepção do tampão de lavagem, cuja molaridade com respeito a

NaCl é 0,1 Μ. O plasmídeo obtido, analisado por electroforese em gel de agarose e coloração de brometo de etídio, toma a forma de uma única banda de ADN circular "superenrolado". Nenhum vestígio de ADN (cromossómico) ou de ARN, de elevado peso molecular, é detectável no plasmídeo purificado. A digestão do plasmídeo com uma enzima de restrição proporciona uma única banda com o peso molecular esperado de 3 quilobases. 0 plasmídeo utilizado contém uma cassete contendo o promotor de citomegalovírus, o gene codificando para luciferase e a sequência de homopurina-homopirimidina (GAA)i7 (SEQ ID N° : 15), proveniente do plasmídeo pXL2563. A estirpe DH1 (Maniatis et al., 1989) contendo este plasmídeo é cultivada num fermentador de 7 litros.

Um lisado límpido é preparado a partir de 200 gramas de células: o sedimento celular é retirado em 2 litros de Tris a 25 mM, PH 6,8, glucose a 50 mM, EDTA a 10 mM, aos quais são adicionados 2 litros de NaOH a 0,2 M, SDS a 1%. 0 lisado é neutralizado através da adição de um litro de acetato de potássio a 3 M. Após diafiltração, 4 mL deste lisado são aplicados a uma coluna HiTrap-NHS de 5 mL, ligada ao oligonucleótido de sequência 5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3 ' (SEQ ID N°: 1), de acordo com o método descrito no Exemplo 3. A lavagem e eluição são efectuadas como descrito no Exemplo acima. 83

Exemplo 7

Este exemplo descreve a utilização de um oligonucleótido contendo citosinas metiladas. A sequência do oligonucleótido utilizado é como se segue: 5 '-GAGGMeCTTMeCTTMeCTTMeCTTMeCCTMeCTTMeCTT-3 ' ( SEQ ID N° : 19)

Este oligonucleótido possui um grupo NH2 na extremidade 5'. MeC=5-metilcitosina. Este oligonucleótido possibilita que o plasmideo pXL2563 seja purificado, sob as condições do Exemplo 1, com um tampão de ligação de pH 5 (o risco de degradação do plasmideo é, desse modo, diminuído).

Exemplo 8

Nos exemplos acima, o oligonucleótido utilizado é modificado na extremidade terminal 5', com um grupo amina ligado ao fosfato através de um braço contendo 6 átomos de carbono: NH2-(CH2)6· Neste exemplo, o grupo amina está ligado ao fosfato da extremidade terminal 5', através de um braço contendo 12 átomos de carbono: NH2-(CH2)i2· A ligação do oligonucleótido e passagem através da coluna são efectuadas como descrito no

Exemplo 3, com um tampão F: NaCl a 2 M, acetato a 0,2 M, pH 4,5. Este oligonucleótido torna possível ter melhores rendimentos de purificação: é obtido um rendimento de 53%, ao passo que, sob as mesmas condições, com o oligonucleótido contendo 6 átomos de carbono, este rendimento é da ordem de 45%. 84

Exemplo 9

Seguindo a estratégia de clonagem descrita no Exemplo 3, foram construídos outros dois plasmídeos transportando sequências de homopurina-homopirimidina: o plasmídeo pXL2725, que contém a sequência (GGA)i6, (SEQ ID N° : 20) e o plasmídeo pXL2726, que contém a sequência (GA)25 (SEQ ID N°: 21).

Os plasmídeos pXL2725 e pXL2726, análogos ao plasmídeo pXL2563, foram construídos de acordo com a estratégia de clonagem descrita no Exemplo 3, utilizando os seguintes pares oligonucleotídicos: 5986 : 5 ' -GATCC (GA) 25GGG-3 ' (SEQ ID N° : 22 5987: 5 '-AATTCCC (TC) 25G-3 ' (SEQ ID N° : 23 5981: 5 '-GATCC (GGA) i?GG-3 ' (SEQ ID N° : 24 5982 : 5 ' -AATT (CCT) 17CCG-3 ' (SEQ ID N° : 25 0 par oligonucleot ídico 5986 e 5987 foi utilizado para construir o plasmídeo pXL2726, através da clonagem dos oligonucleotidos nos sítios BamRI e EcoRI de pBKS+ (Stratagene Cloning System, La Jolla CA) , enquanto os oligonucleotidos 5981 e 5982 foram utilizados para a construção do plasmídeo pXL2725. Foram utilizadas as mesmas condições experimentais que para a construção do plasmídeo pXL2563 e apenas os pares oligonucleotídicos foram alterados. De modo semelhante, as sequências clonadas foram verificadas através de sequenciação nos plasmídeos. Isto possibilitou que fosse verificado que o plasmídeo pXL2725 possui uma modificação relativa à sequência esperada: em vez da sequência GGA repetida 17 vezes, existe GGAGA(GGA)is (SEQ ID N° : 26). 85

Exemplo 10

Os oligonucleótidos formando hélices triplas com estas sequências de homopurina foram ligados a colunas HiTrap, de acordo com a técnica descrita no Exemplo 1.1. 0 oligonucleótido de sequência 5'-AATGCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCT-3' (SEQ ID N°: 27) foi utilizado para a purificação do plasmideo pXL2725 e o oligonucleótido de sequência 5'-AGTGCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT-3' (SEQ ID N° : 28) foi utilizado para a purificação do plasmideo pXL2726.

As duas colunas desse modo obtidas possibilitaram que os correspondentes plasmideos fossem purificados de acordo com a técnica descrita no Exemplo 2, com os seguintes tampões:

Tampão F: NaCl a 2 M, acetato a 0,2 M, pH 4,5.

Tampão E: Tris-HCl a 1 M, pH 9, EDTA a 0,5 mM.

Os rendimentos obtidos são 23% e 31% para pXL2725 e pXL2726, respectivamente.

Exemplo 11

Este exemplo ilustra a influência do comprimento da sequência especifica presente no plasmideo nos rendimentos de purificação. 0 gene repórter utilizado nestas experiências para demonstrar a actividade das composições da invenção é o gene codificando para a luciferase (Luc). 86 0 plasmídeo pXL2621 contém uma cassete contendo o promotor de citomegalovírus (CMV), de 661 pb, extraído de pcDNA3 (Invitrogen Corp., San Diego, CA) por clivagem com as enzimas de restrição MluI e HindIII, clonado a montante do gene codificando para luciferase, nos sítios MluI e HindIII, dentro do vector Vector básico pGL (Promega Corp., Madison, WI). Este plasmídeo foi construído utilizando técnicas padrão de biologia molecular.

Os plasmídeos pXL2727-l e pXL2727-2 foram construídos da seguinte forma:

Dois microgramas de plasmídeo pXL2621 foram linearizados com BamRl; a enzima foi inactivada por tratamento, durante 10 min, a 65 °C; ao mesmo tempo, os oligonucleótidos 6006 e 6008 foram hibridados como descrito para a construção do plasmídeo pXL2563. 6006: 5 '-GATCT(GAA) i7CTGCAGATCT-3' (SEQ ID N°: 29) 6008: 5 '-GATCAGATCTGCAG(TTC) i7A-3' (SEQ ID N°: 30).

Esta mistura de hibridação foi clonada nas extremidades de BamRl do plasmídeo pXL2621 e, após transformação dentro de DH5a, os clones recombinantes foram identificados por análise de restrição enzimática de PstI, visto que os oligonucleótidos introduzem um sítio PstI. Foram seleccionados dois clones e a sequência nucleotidica do fragmento clonado foi verificada utilizando o iniciador (6282, 5'-ACAGTCATAAGTGCGGCGACG-3' (SEQ ID N° : 31)) como um iniciador de reacção de sequenciação (Viera J. e J. Messing, 1982. Os plasmídeos pUC, um sistema derivado de M13mp7 para mutagénese de inserção e sequenciação com iniciadores universais sintéticos. Gene 19:259-268). 87 0 primeiro clone (pXL2727-l) contém a sequência GAA repetida 10 vezes. O segundo (pXL2727-2) contém a sequência 5 ' -GAAGAAGAG (GAA) 7GGAAGAGAA-3 ’ ( SEQ ID N° : 32). É utilizada uma coluna, tal como a descrita no Exemplo 3 e que está ligada ao oligonucleótido 5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (SEQ ID N°: 1) . O plasmideo pXL2727-l transporta 14 repetições da sequência GAA. O oligonucleótido descrito acima, que contém apenas 7 repetições da correspondente sequência de hibridação CTT pode, por este motivo, hibridar-se com o plasmideo em 8 posições diferentes. O plasmideo pXL2727-2, em contraste, possui uma sequência de hibridação (GAA)7 (SEQ ID N° : 36) do mesmo comprimento que o do oligonucleótido ligado à coluna. Este oligonucleótido pode, por este motivo, hibridar-se apenas a uma posição em pXL2727-2. A experiência é idêntica à descrita no Exemplo 4, com os seguintes tampões:

Tampão F: NaCl a 2 M, acetato a 0,2 M, pH 4,5.

Tampão E: Tris-HCl a 1 M, pH 9, EDTA a 0,5 mM. O rendimento de purificação é 29% com o plasmideo pXL2727-l e 19% com pXL2727-2.

As células utilizadas são células NIH 3T3, inoculadas no dia antes da experiência dentro de placas de cultura de 24 poços, com base em 50000 células/poço. O plasmideo é diluído em NaCl a 150 mM e misturado com o lipofectante RPR115335. É utilizada uma razão de cargas positivas de lipofectante/cargas 88 negativas de ADN igual a 6. A mistura é submetida a um vórtice, deixada durante dez minutos à temperatura ambiente, diluída em meio sem soro de vitelo fetal e, depois, adicionada às células na proporção de 1 pg de ADN por poço de cultura. Após duas horas, a 37 °C, 10% de volume/volume de soro de vitelo fetal é adicionado e as células são incubadas, durante 48 horas, a 37 °C, na presença de 5% de CO2. As células são lavadas duas vezes com PBS e a actividade de luciferase é medida de acordo com o protocolo descrito (kit Promega, Promega Corp. Madison, WI) num luminómetro Lumat LB9501 (EG and G Berthold, Evry). O plasmídeo pXL2727-l, purificado como descrito no Exemplo 8.2, proporciona rendimentos de transfecção duas vezes maiores do que os obtidos com o mesmo plasmídeo purificado, utilizando o kit Wizard Megaprep (Promega Corp. Madison, WI).

Exemplo 12 O exemplo seguinte demonstra a purificação de plasmídeos derivados de pCOR, utilizando cromatografia de afinidade de hélice tripla. Demonstrou-se que esta tecnologia remove contaminantes de ácido nucleico (particularmente ADN genómico e ARN de hospedeiro) para níveis que não foram alcançados com métodos de cromatografia convencionais.

Um gel de afinidade tríplice foi sintetizado com Sephacryl S-1000 SF (Amersham-Pharmacia Biotech) como a matriz de cromatografia. A Sephacryl S-1000 foi activada, em primeiro lugar, com m-periodato de sódio (3 mM, temperatura ambiente, 1 h) em acetato de sódio a 0,2 M (pH 4,7). Depois, o oligonucleótido foi ligado através da sua fracção terminal 5'-NH2 a grupos aldeído da matriz activada por aminação redutora, na 89 presença de ácido ascórbico (5 mM) , como descrito anteriormente para a ligação de proteínas (Hornsey et al. , J. Immunol. Methods, 1986, 9_3, 83-88). 0 oligonucleótido de homopirimidina utilizado para estas experiências (da Eurogentec, purificado por HPLC) tinha uma sequência que era complementar a uma curta sequência de homopurina de 14-mer (5'-AAGAAAAAAAAGAA-3') (SEQ ID N° : 10), presente na origem de replicação (oriy) do plasmideo pCOR (Soubrier et al., Gene Therapy, 1999, 6, 1482-1488). Como discutido acima, a sequência do oligonucleótido de homopirimidina é 5'-TTCTTTTTTTTCTT-3 ' (SEQ ID N°: 11).

Os seguintes plasmídeos foram submetidos a cromatografia: pXL3296 (pCOR sem transgene, 2,0 kpb), pXL3179 (pCOR-FGF, 2,4 kpb), pXL3579 (pCOR-VEGFB, 2,5 kbp), pXL3678 (pCOR-AFP, 3,7 kbp), pXL3227 (pCOR-lacZ 5,4 kbp) e pXL3397 (pCOR-Bdeleted FVIII, 6,6 kbp). Todos estes plasmídeos foram purificados por duas etapas de cromatografia de permuta aniónica a partir de lisados límpidos, obtidos como descrito no exemplo 4. O plasmideo pBKS+ (pBluescript II KS + da Stratagene), um plasmideo derivado de ColEl, purificado por ultracentrifugação em CsCl, também foi estudado. Todos os plasmídeos utilizados estavam no seu estado topológico superenrolado (> 95%).

Em cada experiência de purificação de ADN plasmídico, 300 pg de ADN plasmídico em 6 mL de NaCl a 2 M, acetato de potássio a 0,2 M (pH 5,0) foram carregados, a um caudal de 30 cm/h, numa coluna de afinidade contendo o oligonucleótido mencionado acima 5'-TTCTTTTTTTTCTT-3' (SEQ ID N° : 11). Após lavagem da coluna com 5 volumes do mesmo tampão, o plasmideo ligado foi eluído com Tris/HCl a 1 M, EDTA a 0,5 mM (pH 9,0) e quantificado por UV (260 nm) e cromatografia de permuta iónica, com uma coluna Gen-Pak Millipore (Marquet et al., BioPharm, 90 1995, _8, 26-37) . As recuperações de plasmídeo na fracção recolhida foram 207 pg para pXL3296, 196 pg para pXL3179, 192 pg para pXL3579, 139 pg para pXL3678, 97 pg para pXL 3227 e 79 pg para pXL 3397. Não se conseguiu detectar a ligação de plasmideo (< 3 pg) quando o pBKS foi submetido a cromatografia nesta coluna. Isto indica que o oligonucleótido 5'-TTCTTTTTTTTCTT-3' (SEQ ID N° : 11) estabelece estruturas tríplices estáveis com a sequência de 14-mer complementar 5'-AAGAAAAAAAAGAA-3' (SEQ ID N° : 10), presente em pCOR (oriY) , mas não com a sequência estreitamente relacionada 5'-AGAAAAAAAGGA-3' (SEQ ID N° : 8), presente em pBKS. Isto indica que a introdução de uma única tríade não canónica (T*GC, neste caso) resulta numa completa desestabilização da estrutura tríplice.

Como um controlo, não foi observada ligação de plasmídeo (< 1 pg) , quando o pXL3179 foi submetido a cromatograf ia numa coluna de branco, sintetizada sob condições estritamente semelhantes, mas sem oligonucleótido.

Através da operação desta coluna de purificação de afinidade nas condições aqui referidas, o nível de contaminação por ADN genómico de hospedeiro foi reduzido de 2,6% para 0,07%, para uma preparação de pXL3296. De modo semelhante, o nível de contaminação por ADN de hospedeiro foi reduzido de 0,5% para 0,008%, para uma preparação de pXL3179, quando a amostra foi submetida a cromatografia através da mesma coluna de afinidade. 91

Exemplo 13 0 seguinte exemplo demonstra a purificação de plasmídeos derivados de ColEl, utilizando cromatografia de afinidade de hélice tripla. Demonstrou-se que esta tecnologia remove contaminantes de ácido nucleico (particularmente ADN genómico e ARN de hospedeiro) para niveis que não foram alcançados com métodos de cromatografia convencionais.

Um gel de afinidade tríplice foi sintetizado através da ligação de um oligonucleótido, tendo a sequência 5'-TCTTTTTTTCCT-3' (SEQ ID N°: 9), a uma Sephacryl S-1000 SF oxidada com periodato, como descrito no Exemplo acima.

Os plasmídeos pXL3296 (pCOR sem transgene) e pBKS, um plasmídeo derivado de ColEl, foram submetidos a cromatografia numa coluna de 1 mL, contendo o oligonucleótido 5'-TCTTTTTTTCCT-3' (SEQ ID N° : 9), nas condições descritas no Exemplo 9. As recuperações de plasmídeo na fracção recolhida foram 175 pg para pBKS e <1 pg para pXL3296. Isto indica que o oligonucleótido 5'-TCTTTTTTTCCT-3 ' (SEQ ID N°: 9) estabelece estruturas tríplices estáveis com a sequência de 12-mer complementar (5'-AGAAAAAAAGGA-3 ') (SEQ ID N°: 8), presente em pBKS, mas não com a sequência de 12-mer muito estreitamente relacionada (5'-AGAAAAAAAAGA-3') (SEQ ID N°: 34), presente em pCOR. Isto indica que a introdução de uma única tríade não canónica (C*AT, neste caso) pode resultar na completa desestabilização da estrutura tríplice. 92

Exemplo 14

Uma cultura de inoculação foi produzida num frasco Erlenmeyer, sem deflector, pelo seguinte método. 0 banco celular de trabalho é inoculado dentro de um frasco Erlenmeyer contendo meio M9modG5, a uma taxa de inoculação de 0,2%, v/v. A estirpe é cultivada, a 220 rpm, num agitador rotativo, a 37° ± 1 °C, durante cerca de 18 ± 2 horas, até esgotamento de glucose. Isto resulta numa cultura de inoculação de 200 mL. Espera-se que a densidade óptica da cultura tenha Aeoo em torno de 2-3. É, depois, criada uma pré-cultura num primeiro fermentador. A cultura de inoculação é transferida, de modo asséptico, para um pré-fermentador contendo meio M9modG5, para garantir uma taxa de inoculação de 0,2% (v/v) e cultivada sob arejamento e agitação. A pCg é mantida acima de 40% de saturação. A cultura é recolhida quando a glucose é consumida após 16 horas. Isto resulta em cerca de 30 litros de pré-cultura. Espera-se que a densidade óptica da cultura tenha A^oo em torno de 2-3.

Uma cultura principal é, depois, criada num segundo fermentador. 30 litros de pré-cultura são transferidos, de modo asséptico, para um fermentador cheio com 270 litros de meio FmodG2 esterilizado, para garantir uma taxa de inoculação de cerca de 10% (v/v) . A cultura é iniciada num modo em descontinuo, para acumular alguma biomassa. Assim que o açúcar inicial é consumido, após cerca de 4 horas, é iniciada a alimentação de glucose. 0 arejamento, agitação, pC>2 (40%), pH (6,9 ± 0,1), temperatura (37 ± 1 °C) e alimentação de glucose são controlados, de modo a manter uma taxa especifica de crescimento próxima de 0,09 1Γ1. A cultura é terminada após cerca de 35 horas de alimentação. Isto resulta em cerca de 400 litros 93 de cultura. Espera-se que a densidade óptica da cultura tenha A60o de cerca de 100. É realizada uma primeira etapa de separação, a qual é denominada recolha celular. A biomassa é recolhida com uma centrífuga de pilha de discos. O caldo é concentrado 3 a 4 vezes, para eliminar o meio de cultura extinto e

continuamente ressuspenso em 400 litros de tampão SI estéril. Isto resulta em cerca de 500 litros de biomassa pré-condicionada. DCW = 25 ± 5 g/L. E realizada uma segunda etapa de separação, a qual é denominada uma etapa de concentração. Após ressuspensão/homogeneização em tampão Sl, as células são de novo processadas com o separador, para produzir pasta concentrada. Isto resulta em cerca de 60-80 litros de pasta lavada e concentrada. DCW = 150 ± 30 g/L; ADNp = 300 ± 60 mg/L. É, depois, realizada uma etapa de congelação. A pasta é despachada, de modo asséptico, para dentro de sacos Flexboy™ de 20 L (cheios até 50% da sua capacidade) e subsequentemente congelada, a 20° ± 5 °C, antes de processamento a jusante adicional. Isto resulta numa biomassa congelada. ADNp = 300 ± 60 mg/L; forma superenrolada > 95%. E, depois, realizada uma etapa de descongelação celular. Os sacos congelados são aquecidos até 20 °C e a pasta celular é diluída para 40 g/L, pH 8,0, com cloridrato de Tris a 100 mM, EDTA a 10 mM, glucose a 20 mM e a suspensão é deixada a 20 ± 2 °C, durante 1 h, sob agitação, antes da lise celular. Isto resulta em pasta de biomassa descongelada. pH=8,0 ± 0,2. 94

Durante esta etapa podem ser utilizadas temperaturas em torno de 20 °C. É, depois, realizada uma etapa de lise alcalina. A etapa de lise celular é constituída por bombagem da suspensão celular diluída, por meio de um misturador em linha, com uma solução de NaOH a 0,2 N-SDS a 35 mM (solução S2), seguida de uma etapa de contacto contínuo numa tubagem em serpentina. A etapa de contacto contínuo é para garantir lise celular completa e desnaturação de ADN genómico e proteínas. A solução de células lisadas é misturada, em linha, com a solução 3 (S3) de acetato de potássio a 3 M-ácido acético a 2 N refrigerada, antes de recolha num reservatório agitado refrigerado. A adição de solução S3 resulta na precipitação de um ADN genómico, ARN, proteínas e KDS. A seguir, é realizada uma filtração de lisado. O lisado neutralizado é, depois, incubado a 5 ± 3 °C, durante 2 a 24 h, sem agitação e filtrado através de um filtro de grelha de 3,5 mm, para remover a maior parte do material precipitado (fase de floco) , seguida de uma filtração de profundidade como etapa de aperfeiçoamento de filtração. Isto resulta num lisado clarificado, com uma concentração de plasmídeo superenrolado de mais de 90%. É, depois, realizada cromatografia de permuta aniónica. A solução de lisado límpido é diluída com água purificada para um valor de condutividade alvo de 50 mS/cm, filtrada através de um filtro de camada dupla (3 μπι-0,8 μπι) e carregada sobre uma coluna de cromatografia de permuta aniónica. É utilizada uma coluna de 300 mm empacotada com 11,0 L de resina Fractogel® TMAE HiCap (M) (Merck; N° 1.10316.5000). 0 lisado límpido é carregado 95 sobre a coluna e a eluição é realizada utilizando uma etapa de gradiente de NaCl. A maior parte de contaminantes ligados à coluna é eluída com uma solução de NaCl, a cerca de 61 mS/cm e o ADN plasmídico é eluído com uma solução de NaCl, a cerca de 72 mS/cm. Isto resulta num eluato de cromatografia de permuta iónica tendo uma elevada concentração de ADN plasmídico.

Isto é seguido de cromatografia de afinidade triplice. 0 eluato da coluna de cromatografia de permuta aniónica é diluído com cerca de 0,5 volumes de uma solução de acetato de sódio a 500 mM (pH 4,2), contendo NaCl a 4,8 Me bombeado através de uma coluna de cromatografia de afinidade tríplice, equilibrada com acetato de sódio a 50 mM (pH 4,5), contendo NaCl a 2 Μ. A coluna tem 300 mm de diâmetro e contém 10,0 L de gel THAC Sephacryl™ S-1000 (Amersham Biosciences; Piscataway, NJ). A coluna é lavada com uma solução de acetato de sódio a 50 mM (pH 4,5), contendo NaCl a 1 M e NV1FGF é eluído com Tris a 100 mM (pH 9,0), contendo EDTA a 0,5 mM. Isto resulta num eluato de cromatografia de afinidade tríplice tendo uma elevada concentração de plasmídeo.

Segue-se uma etapa de cromatografia de interacção hidrófoba. O eluato da coluna de cromatografia de afinidade é diluído com 3,6 volumes de uma solução de sulfato de amónio a 3,8 M em Tris (pH 8,0) . Após filtração através de um filtro de 0,45 μιη, o filtrado é carregado, a 60 cm/h, sobre uma coluna de interacção hidrófoba (300 mm de diâmetro) empacotada com 9,0 L de resina Toyopearl® Butilo-650S (TosoH corp., Grove City, OH). A coluna é lavada com uma solução de sulfato de amónio a cerca de 240 mS/cm e o NV1FGF é eluído com sulfato de amónio a 220 mS/cm. Isto resulta num eluato de HIC isento de formas relaxadas. 96

De acordo com uma forma de realização preferida, é realizada uma etapa de diafiltração adicional. Os materiais de diafiltração padrão, comercialmente disponíveis, são adequados para utilização neste processo, de acordo com técnicas padrão conhecidas na técnica. Um método de diafiltração preferido é a diafiltração utilizando uma membrana de ultrafiltração, tendo uma exclusão de peso molecular na gama de 30000 a 500000, dependendo do tamanho de plasmídeo. Esta etapa de diafiltração permite a troca de tampão e a concentração é, depois, realizada. O eluato da etapa 12 é concentrado, 3 a 4 vezes, por filtração de fluxo tangencial (exclusão de membrana, 30 kDa) para uma

concentração alvo de cerca de 2,5 a 3,0 mg/mL e o concentrado é trocado de tampão por diafiltração, a volume constante, com 10 volumes de solução salina e ajustado para a concentração plasmidica alvo com solução salina. A concentração de NV1FGF é calculada a partir da absorvência a 260 nm de amostras de concentrado. A solução de NV1FGF é filtrada através de um filtro de cápsula de 0,2 pm e armazenada em recipientes numa câmara frigorífica, a 2-8 °C, até processamento adicional. Isto produz um concentrado purificado, com uma concentração de ADN plasmídico de plasmídeo superenrolado em torno de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% e, de um modo preferido, 99%. A recuperação global de plasmídeo com este processo é, pelo menos, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% e 80%, com uma recuperação média de 60%.

Exemplo 15 0 método do Exemplo acima, compreendendo uma etapa de cromatografia de permuta iónica, uma etapa de cromatografia de afinidade de hélice tripla e uma etapa de cromatografia hidrófoba, resulta numa preparação de ADN plasmídico mais 97 purificada, são comparadas com métodos anteriormente conhecidos. Este novo método foi comparado com métodos anteriormente conhecidos e resultou em preparações de ADNp tendo quantidades muito inferiores de ADN genómico, ARN, proteína e endotoxina. Isto é reflectido nas Figuras 6. Estas experiências mostram que a AEC, THAC e HIC proporcionam um rendimento de purificação surpreendentemente superior, em comparação com algumas das combinações de 2 etapas para a remoção eficaz de todos os contaminantes. A combinação destas etapas proporciona uma clara sinergia em termos de eficácia de separação de ADN plasmídico de outros materiais e contaminantes biológicos, tais como proteína e endotoxina, ARN e ADN genómico, assim como plasmídeo circular aberto. Além disso, a combinação de etapas sinérgicas, i. e., AEC/THAC/HIC de acordo com a presente invenção possibilita, não apenas a obtenção de ADN plasmídico de grau farmacêutico altamente purificado, mas também composições de ADN plasmídico altamente puro e totalmente superenrolado de mais de 80%, 85%, 90%, 95% e mais de 99%.

Exemplo 16 O método do Exemplo acima, que compreende uma etapa de cromatografia de permuta iónica, uma etapa de cromatografia de afinidade de hélice tripla e uma etapa de cromatografia hidrófoba, para a preparação de uma preparação de ADN plasmídico altamente purificado, é comparado com métodos anteriormente conhecidos. Como mostrado na Figura 3, o método de acordo com a presente invenção resulta, surpreendentemente, em preparações de ADNp tendo quantidades muito inferiores de ADN genómico, ARN, proteína e endotoxina, na gama das sub-ppm. Também, como 98 mostrado na Figura 4, o processo da presente invenção mostra uma qualidade de produto obtida a até 10 g.

Exemplo 17 A etapa de diafiltração, como descrita no Exemplo 14, é realizada de acordo com as seguintes condições: o tampão para a etapa a e para a etapa b foi utilizado para determinar as melhores condições para: iii) uma primeira diafiltração (etapa a) contra 12,5 a 13,0 volumes de Tris/HCl a 50 mM, NaCl a 150 mM, pH 7,4 (denominado tampão I) e iv) Realizar uma segunda diafiltração do retentado da etapa a) acima (etapa b) contra 3,0 a 3,5 volumes de excipiente salino (NaCl a 150 mM).

Esta etapa de diafiltração alternativa, de acordo com a presente invenção, remove de modo eficiente e extensivo o sulfato de amónio e o EDTA extensivamente. Também, subsequentes a estas etapas de diafiltração, são obtidas concentração de NaCl alvo apropriadas, em torno de 150 mM e concentração de Tris final entre 400 μΜ e 1 mM. Os exemplos de composições de formulações de ADN plasmídico são proporcionados na Tabela 6 abaixo e 99

Tabela 6

Espécie Concentração final Ia diafiltração 2a diafiltração Ingrediente Farmacêutico Activo Sulfato de amónio 10 μΜ <1 μΜ < 1 μΜ EDTA 4 μΜ < 1 μΜ < 1 μΜ Tris 5 0 mM 1,48 μΜ 740 μΜ NaCl 154 mM 154 mM 154 mM

Exemplo 18

Um lote técnico de API (ingredientes farmacêuticos activos) de NV1FGF de ADN plasmídico, denominado LS06, é preparado de acordo com o Exemplo 13, com a etapa de processo de diafiltração descrita no Exemplo 17. 0 eluato é, em primeiro lugar, diafiltrado em torno de 2 mg de API/mL contra cerca de 13 volumes de tampão I e o retentado resultante foi diafiltrado contra cerca de 3 volumes de excipiente salino. 0 retentado final foi, depois, filtrado através de um filtro de 0,2 pm e ajustado para 1 mg/mL. 0 API final (pH 7,24) foi armazenado numa garrafa de vidro Duran, a +5 °C, até à preparação de DP.

Foi realizado um estudo de estabilidade em amostras de LS06, armazenadas em garrafas de vidro Duran (API), assim como em frascos de 8 mL utilizados para a preparação de Produto de Fármaco. Após 90 dias, a +5 °C, a extensão de depurinação e circularização aberta para todas as amostras era dificilmente detectável (^ 0,3%). Após 90 dias, a +25 °C, as taxas de depurinação e circularização aberta das amostras LS06 também 100 eram bastante baixas. As taxas de depurinação e circularizaçao aberta, calculadas a partir deste estudo, eram ^ 1% por mês.

Este estudo demonstrou que o perfil de estabilidade de NV1FGF de ADN plasmídico é muito estável na formulação da presente invenção, em que os valores de pH são mantidos em torno de 7 a 7,5. Embora a taxa de depurinação e taxas de entalhamento de plasmideo sejam, em geral, fortemente aceleradas a +25 °C, a Requerente mostrou que o ADN plasmidico permanece estável, numa forma não degradada, durante um longo período de tempo, mesmo à TA. A descrição deve ser compreendida à luz dos ensinamentos das referências citadas dentro da descrição. As formas de realização dentro da descrição proporcionam uma ilustração de formas de realização da invenção e não devem ser consideradas como limitando o âmbito da invenção. 0 especialista na técnica facilmente reconhece que muitas outras formas de realização estão abrangidas pela invenção. Todas as publicações e patentes citadas nesta divulgação são incorporadas por referência na sua totalidade. Na medida e que o material incorporado por referência contradiga ou seja inconsistente com esta descrição, a descrição irá substituir qualquer material desse tipo. A citação de quaisquer referências presentes não é uma admissão de que essas referências são técnica anterior à presente invenção.

Salvo indicado em contrário, todos os números expressando quantidades de ingredientes, condições de reacção e assim por diante, utilizados na descrição, incluindo reivindicações, devem ser compreendidos como sendo modificados em todos os casos pelo termo "cerca de". Consequentemente, salvo indicado de outro modo em contrário, os parâmetros numéricos são aproximações e podem 101 variar, dependendo das propriedades desejadas que pretendem ser obtidas pela presente invenção. No mínimo, e não como uma tentativa para limitar a aplicação da doutrina de equivalentes ao âmbito das reivindicações, cada parâmetro numérico deve ser interpretado à luz do número de dígitos significativos e abordagens de arredondamento habituais.

Salvo indicado em contrário, o termo "pelo menos", precedendo uma série de elementos, deve ser compreendido como referindo-se a cada elemento na série. Os especialistas na técnica irão reconhecer, ou ser capazes de verificar, utilizando não mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes às formas de realização específicas da invenção aqui descritas. Pretende-se que esses equivalentes estejam abrangidos pelas reivindicações seguintes.

REFERENCIAS

Patentes: WO 98/00815 (utilização de T [Tê], Pasteur Mérieux Sérums et Vaccins [Soros e Vacinas]). WO 96/02658, A.L. Lee et al. , Um Método para Purificação Plasmídica em Grande Escala (1996). WO 97/23601, N.C. Wan et al., Método para a Lise celular (1997). 102 WO 99/29832, D.S. McNeilly, Método para a purificação de ADN plasmídico e ADN plasmídico substancialmente isento de ADN genómico (1999).

Patente U.S. N° 6214568, D.S. McNeilly Método para a purificação de ADN plasmídico e ADN plasmídico substancialmente isento de ADN genómico (2001).

Publicações: H.C. Birnboim e J. Doly, Um processo rápido de extracção alcalina para o rastreio de ADN plasmídico recombinante Nucleic Acid Research 7(6):1513-1523 (1979). D. Stephenson, F. Norman e R.H. Cumming, Espessamento de cisalhamento de ADN em Usados de SDS Bioseparation 3:285-289 (1993) . M.S. Levy, L.A.S. Ciccolini, S.S.S. Yim, J.T. Tsai, N. Titchener-Hooker, P. Ayazi Shamlou e P. Dunnill, Os efeitos das propriedades de material e intensidade de fluxo de fluido na recuperação de ADN plasmídico durante a lise celular Chemical Engineering Science 54:3171-3178 (1999).

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

<110> Gencell SAS <120> Método de Preparação de ADN Plasmídico de Grau Farmacêutico 103

<13 0> GC03 Ο 01-PCT <150> Documento US 60/503464 <151> 2003-09-17 <150> Documento US 60/563008 <151> 2004-04-19 <160> 34 <170> Patentln versão 3.2 <210> 1 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Oligonucleótido sintético <400> 1 gaggcttctt cttcttcttc ttctt 25 <210> 2 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Oligonucleótido sintético 104 <4Ο0> 2 aagggaggga ggagaggaa 19 <210> 3 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Oligonucleótido sintético <400> 3 aaggagagga gggagggaa 19 <210> 4 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Oligonucleótido sintético <400> 4 ttggtgtggt gggtgggtt 19

<210> 5 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Oligonucleótido sintético 105 < 4 Ο Ο > 5 cttcccgaag ggagaaagg 19 <210> 6 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Oligonucleótido sintético <400> 6 gaagggcttc cctctttcc 19 <210> 7 <211> 13 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Oligonucleótido sintético <400> 7 gaaaaaggaa gag 13 <210> 8 <211> 12 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Oligonucleótido sintético 106 12 <400> 8 agaaaaaaag ga <210> 9 <211> 12 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Oligonucleótido sintético 12 <400> 9 tctttttttc ct <210> 10 <211> 14 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Oligonucleótido sintético 14 <400> 10 aagaaaaaaa agaa <210> 11 <211> 14 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Nucleótido sintético 107 <4 Ο 0> 11 ttcttttttt tctt 14 <210> 12 <211> 17 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Oligonucleótido sintético <400> 12 aaaaaaggga ataaggg 17 <210> 13 <211> 58 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Oligonucleótido sintético <400> 13 gatccgaaga agaagaagaa gaagaagaag aagaagaaga agaagaagaa gaagaagg 58 <210> 14 <211> 58 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Oligonucleótido sintético 108 <4 Ο 0> 14 aattccttct tcttcttctt cttcttcttc ttcttcttct tcttcttctt cttcttcg 58 <210> 15 <211> 51 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Oligonucleótido sintético <400> 15 gaagaagaag aagaagaaga agaagaagaa gaagaagaag aagaagaaga a 51 <210> 16 <211> 17 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Oligonucleótido sintético <400> 16 tgaccggcag caaaatg 17 <210> 17 <211> 27 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Oligonucleótido sintético 109 <4 Ο 0> 17 ccgaattctg gggaccaaag cagtttc 27 <210> 18 <211> 27 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Oligonucleótido sintético <400> 18 ccaagcttca ctgttcacga cgggtgt 27 <210> 19 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> 5-metileitosina <400> 19 gaggcttctt cttcttcttc ttctt 25 <210> 20 <211> 48 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Oligonucleótido sintético 110

<4Ο0> 20 ggaggaggag gaggaggagg aggaggagga ggaggaggag gaggagga 48 <210> 21 <211> 50 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Oligonucleótido sintético <400> 21 gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga 50 <210> 22 <211> 58 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Oligonucleótido sintético <400> 22 gatccgagag agagagagag agagagagag agagagagag agagagagag agagaggg 58 <210> 23 <211> 58 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Oligonucleótido sintético 111 <400> 23 aattccctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctcg 58 <210> 24 <211> 58 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Oligonucleótido sintético <400> 24 gatccggagg aggaggagga ggaggaggag gaggaggagg aggaggagga ggaggagg 58 <210> 25 <211> 58 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Oligonucleótido sintético <400> 25 aattcctcct cctcctcctc ctcctcctcc tcctcctcct cctcctcctc ctcctccg 58 <210> 26 <211> 50 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Oligonucleótido sintético 112 <4Ο0> 26 ggagaggagg aggaggagga ggaggaggag gaggaggagg aggaggagga 50 <210> 27 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Oligonucleótido sintético <400> 27 aatgcctcct cctcctcctc ctcct 25 <210> 28 <211> 26 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Oligonucleótido sintético <400> 28 agtgctctct ctctctctct ctctct 26 <210> 29 <211> 6 6 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Oligonucleótido sintético 113 <4Ο0> 29 gatctgaaga agaagaagaa gaagaagaag aagaagaaga agaagaagaa gaagaactgc 60 agatct 66 <210> 30 <211> 66 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido sintético <400> 30 gatcagatct gcagttcttc ttcttcttct tcttcttctt cttcttcttc ttcttcttct 60 tcttca 66 <210> 31 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Oligonucleótido sintético <400> 31 21 acagtcataa gtgcggcgac g <210> 32 <211> 39 <212> ADN <213> Artificial 114 <220> <223> Oligonucleótido sintético <400> 32 gaagaagagg aagaagaaga agaagaagaa ggaagagaa 39 <210> 33 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Oligonucleótido sintético <400> 33 gaagaagaag aagaagaaga a 21 <210> 34 <211> 12 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Oligonucleótido sintético <400> 34 agaaaaaaaa ga 12

Lisboa, 6 de Janeiro de 2012 115

Claims (28)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Dispositivo de lise celular alcalina continua compreendendo: - um primeiro misturador ou injector, capaz de injectar uma solução de lise na direcção oposta de uma suspensão celular; - um primeiro tubo de pequeno diâmetro, de forma a gerar um fluxo turbulento dentro da mistura; - um segundo tubo de um grande diâmetro, de forma a gerar um fluxo laminar dentro da mistura; - um segundo misturador ou injector para injectar a solução neutralizante numa extremidade e recolher, na outra extremidade, a mistura.
2. 2. Dispositivo da reivindicação 1, em que os diâmetros dos tubos e injectores são seleccionados para controlar os caudais das misturas dentro dos fluxos turbulento e laminar.
3. 3. Dispositivo de lise celular alcalina contínua da reivindicação 1 ou 2 que compreende, ainda, uma bomba para injectar ou bombear a suspensão celular para colocar em contacto, na direcção oposta, a solução de lise.
4. 4. Dispositivo de qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o primeiro misturador ou injector é um misturador ou injector em linha. 1
5. 5. Dispositivo de qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que o primeiro misturador é um tubo em T.
6. 6. Dispositivo de qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que a mistura da suspensão celular e solução de lise flui através do primeiro tubo, sob um fluxo turbulento, durante um tempo curto.
7. 7. Dispositivo de qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que o primeiro tubo tem um diâmetro inferior a 1 cm, de um modo preferido entre 2 e 8 mm e, de um modo mais preferido, em torno de 6 mm e um comprimento de 1 a 10 m e, de um modo preferido, de 2 a 6 m.
8. 8. Dispositivo de qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que a mistura é submetida ao fluxo turbulento durante 1 a 10 s e, de um modo preferido, 2 a 5 s e, de um modo mais preferido, 2,5 s.
9. 9. Dispositivo de qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que o segundo tubo é uma tubagem em serpentina, capaz de gerar um fluxo laminar, para permitir o contacto continuo da solução alcalina e suspensão celular e para garantir lise celular completa.
10. 10. Dispositivo de qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que o período de contacto contínuo é entre 30 s a 2 min, de um modo preferido entre 1 min a 1 min 30 s e, de um modo preferido, de 1 min 20 s.
11. 11. Dispositivo de qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que o segundo tubo tem um diâmetro inferior a 1 cm, de um 2 modo preferido entre 10 e 20 mm ou entre 12,5 e 19 mm e, de um modo mais preferido, igual a 16 mm e um comprimento de 5 a 30 m e, de um modo preferido, de 13 a 23 m.
12. 12. Dispositivo de qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em que o terceiro tubo tem um diâmetro inferior a 1 cm, de um modo preferido entre 2 a 10 mm, de um modo mais preferido entre 5 a 8 mm e um comprimento entre 1 a 10 m e, de um modo mais preferido, entre 2 a 4 m.
13. 13. Dispositivo de qualquer uma das reivindicações 1 a 12, em que o segundo misturador ou injector é em forma de Y e em linha com as células lisadas, para injectar uma solução resultando na precipitação de um ADN genómico, ARN e proteinas.
14. 14. Dispositivo de qualquer uma das reivindicações 1 a 13 que está ligado, de um modo operativo, a um tanque para fermentação.
15. 15. Método de lise celular, compreendendo fluir as células através de um dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14.
16. 16. Método da reivindicação 15, em que a solução de lise é uma solução contendo um agente de lise, seleccionado do grupo consistindo num alcali, um detergente, um solvente orgânico e uma enzima ou uma sua mistura.
17. 17. Método de qualquer uma das reivindicações 15 e 16 compreendendo, ainda, pelo menos, duas etapas de cromatografia, seleccionadas entre cromatografia de permuta 3 aniónica, cromatografia de afinidade tríplice e cromatografia de interacção hidrófoba.
18. 18. Método da reivindicação 17, em que a cromatografia de permuta aniónica, cromatografia de afinidade tríplice e cromatografia de interacção hidrófoba ocorrem nessa ordem.
19. 19. Método da reivindicação 17, em que a primeira cromatografia realizada é precedida de uma filtração de lisado.
20. 20. Método da reivindicação 17, em que a primeira cromatografia realizada é precedida de remoção de floculado.
21. 21. Método de qualquer uma das reivindicações 18 a 20, que é passível de aumento de escala para preparação em grande escala.
22. 22. Método de grande escala de preparação de ADN plasmídico altamente puro, em que células hospedeiras contendo plasmídeo são fluídas através de um meio para fluxo turbulento, para rapidamente misturar uma suspensão celular com uma solução que lisa células; (b) as células são, depois, fluídas através de um meio para fluxo laminar, para permitir a incubação de uma mistura formada em (a) , sem agitação substancial, em que a mistura de células formada em (a) é, depois, fluída do meio para fluxo turbulento para dentro do meio para fluxo laminar e (c) é colocada em contacto através de um meio para adicionar uma segunda solução que neutraliza a solução de lise, em que a mistura de células incubada em (b) flui do meio para fluxo laminar para dentro do meio para adicionar uma segunda solução e os plasmídeos, como libertados das células, são separados por 4 cromatografia de permuta aniónica, cromatografia de afinidade tríplice e cromatografia de interacção hidrófoba, ocorrem nessa ordem.
23. 23. Método de qualquer uma das reivindicações 15 a 22 compreendendo, ainda, uma etapa anterior de remoção de floculado, passando a solução através de um filtro de grelha e através de uma filtração de profundidade.
24. 24. Método de qualquer uma das reivindicações 15 a 23 compreendendo, ainda, uma etapa de diafiltração após a última etapa de cromatografia.
25. 25. Método da reivindicação 24, em que a etapa de diafiltração permite atingir valores alvo apropriados de sal, tampão e pH.
26. 26. Método da reivindicação 24 ou 25, em que a etapa de diafiltração compreende as seguintes etapas: recolha da solução da última etapa de cromatografia; realização de uma primeira etapa de diafiltração contra tampão Tris/NaCl; realização de uma segunda etapa de diafiltração contra solução salina, em condições adequadas para controlar a concentração de tampão final e para estabilizar o pH da formulação de ADN plasmídico final.
27. 27. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 26, em que as etapas de cromatograf ia são realizadas em suporte sólido, que é qualquer material orgânico, inorgânico ou compósito, poroso, superporoso ou não poroso, 5 28.
28. 28. adequado para separações cromatográficas, que é derivatizado com poli(alcenoglicóis) , alcanos, alcenos, alcinos, arenos ou outras moléculas que conferem um carácter hidrófobo ao suporte. 15 a 26, efectuada Método de acordo com qualquer das reivindicações em que a cromatografia de interacção hidrófoba é num leito fixo ou em leito expandido. Lisboa, 6 de Janeiro de 2012 6