JP3159216B2 - 白血球由来の成長因子 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 発明の分野 本発明はPDGF様活性を有するがPDGFとは構造上異なる
白血球由来の成長因子に関する。この新規の成長因子
は、創傷［wounds］の治療に有効である。また、この成
長因子に対する抗体はフィブロティック症状［fibrotic
disorders］の処置に有効である。

先行技術 怪我直後の数分間は、血小板がその創傷部位に付着し
血餅形成を促進する。すると食細胞的な細胞（白血球お
よびマクロファージ）がその創傷を清拭し、そして結合
組織細胞（繊維芽細胞および滑らかな筋肉様の細胞）が
細胞外マトリックス［extracellular matrix］を増殖さ
せ沈着させる。そして最後に内皮細胞が創傷部位を血管
再生する［revascularize］。

走化性は、化学物質源に対し傾斜方向に運動する細胞
の一定方向への移動［migration］である。化学誘引物
質［chemoattractant］は、走化性を特異的に刺激する
化学物質である。それは創傷部位に食細胞、繊維芽細胞
および内皮細胞の整然とした補充をすることに深く関与
する細胞の型に特異性の化学誘引物質の逐次的産生であ
る。C5A、血小板因子４、エラスチンペプチドおよびあ
る種の合成Ｎ−ホルミルメチオニルペプチドが食細胞
（好中球および単球）を引き付ける。フィブロネクチン
および血小板由来成長因子はマトリックス産生細胞を呼
び集める。フィブロネクチンはまた内皮細胞の移動を刺
激する。

化学誘引物質として作用する特定因子に応答する細胞
能は、いくつかの生化学的原因に依存している。第一
に、誘引物質分子がある箇所で産生され、その箇所から
それら誘引物質分子が周囲の組織に分散することがで
き、それで問題の細胞に到達することができなければな
らない。第二に、標的細胞は化学誘引物質の僅かな量を
検出する特異的手段（即ち特異的高親和性受容体）を持
っていなければならない。そして最後に化学誘引物質に
よるその受容体の占拠は、細胞内で生化学変化を開始さ
せるのに違いなく、それが細胞の運動のため細胞骨格機
構を動かすのである。

創傷部位における結合組織増殖は、種々のポリペプチ
ド成長因子によって促進される。コンピテンス因子［co
mpetence factors］（PDGF、繊維芽細胞成長因子、単球
由来成長因子）は細胞周期のG₀期にある静止している細
胞を活性化し、静止細胞をして成長促進因子［progress
ion factors］に応答できるようにする。成長促進因子
（インシュリン、ソマトメジンＡとＣ、胞状マクロファ
ージ由来成長因子）は、細胞がＳ期に入るよう刺激す
る。

PDGFは結合細胞の化学誘引物質と、そうした細胞のマ
イトジェンとの両者であって、「マイトアトラクタン
ト」と呼ばれる。しかし繊維芽細胞に対し分裂促進的作
用を持つが、繊維芽細胞に対し化学誘引物質的でないそ
の他の成長因子（例えば上皮成長因子、形質転換成長因
子αとβ、ソマトメジンＡとＣ、およびインシュリン）
もある。上皮成長因子（EGF）は腸上皮細胞のマイトア
トラクタントである。

細胞外マトリックスは、コラーゲン、糖タンパク質お
よびプロテオグリカンからなる。細胞はコラーゲンに直
接結合しないが、アタッチメント因子と呼ばれる糖タン
パク質を介して相互に作用する。これらの因子として、
フィブロネクチン、ラミニン［laminin］、コンドロネ
クチン［chondronectin］がある。

線維症［fibrosis」は、実質組織［parenchymal tiss
ue］における結合組織、多くはコラーゲン、の過剰な沈
着で、結合組織を治癒するため過度に長引かされた信号
の結果と考えられているため、「創傷治癒の暗部」［th
e dark side of wound repair］とされている。以下を
参照。Ross,et al.,The Biology of Platelet−Derived
Growth Factor,Cell,46:155−169（1986）;Ross,Plate
let−Derived Growth Factor,Ann.Rev.Med.,38:71−79
（1987）;Grotendorst,et al.,Production of Growth F
actors（PDGF ＆ TGFβ）at the Site of Tissue Repai
r,in GROWTH FACTORS AND OTHER ASPECTS OF WOUND HEA
LING:BIOLOGICAL ANDCLINICAL IMPLICATIONS,pp.47−54
（1988）;Grotendorst,et al.,Molecular Mediators of
Tissue Repair,in Soft and Hard Tissue Repair;Biol
ogical and Clinical Aspects,pp.20−40（1984）;Grot
endorst and Martin,Cell Movements in Wound−Healin
g and Fibrosis,Rheumatol.,10:385−403（1986）;Grot
endorst,et al.,Chemoattractants in Fibrotic Disord
ers,In Fibrosis,Ciba Foundation Symposium（198
5）． ヒト血小板由来成長因子は、分子量約30,000ダルトン
の二量体糖タンパク質である。PDGFのナノモル濃度［na
nomolar concentrations］は、3T3細胞中で複製を刺激
する。そのジスルフィド結合の還元はPDGFの分裂促進的
作用を破壊する。PDGFのＡ−鎖およびＢ−鎖は互いに関
係しているが、PDGFがヘテロダイマーか、またはホモダ
イマーの混合物かは知られていない。Ａ鎖もまた、18k
D,15kD,14kD,および11kDの形で存在する不均質の［hete
rogeneous］ものであるが、Ｂ鎖の唯一の形式は16kDで
ある。Johnsson,et al.,Biochem.Biophys.Res.Comm.,10
4:66（1982）を参照せよ。PDGFは同質［homogeneity］
にまで純化した。Heldin,et al.,Biochem.J.,193:907
（1981）参照。PDGFのＡ鎖遺伝子のcDNA配列はBetsholt
z,et al.,Nature,320:695（1986）に記載されている。P
DGF−１とPDGF−２両者のアミノ酸配列はDoolittle,et
al.,Science,221:275（1983）に発見されるであろう。P
DGF類似体の発現に関してはZymogenetics,EP Appln 17
7,957（1886）参照。抗PDGF抗体は、Ａ鎖またはＢ鎖由
来の合成ペプチド（例えばvs.A92−119またはB79−10
7）に対する抗体と同様、購入可能である。PDGFの生物
学的活動についてはRoss,Ann.Rev.Med.,38:71（1987）a
nd Ross,et al.,Cell,46:155（1986）にまとめられてい
る。

血小板由来成長因子分子を創傷治癒の促進に使用する
のに不都合ないくつかの面がある。第一に、PDGFは、よ
り小さなグリコシル化されていない単量体ペプチドに比
較し産生が困難で高価なものとなる二量体グリコシル化
タンパク質である点である。また、３つのイソフォーム
［isoform］が存在する点である（AA,AB,BB）。これら
のイソフォームは結合組織細胞上に異なる生物学的活性
を発現するが、現在、どのような型のどれほどの量のも
のが組織治癒部位に存在するかは知られていない。しか
し発明者らの研究所における研究で、ヒトの創傷液中に
は本物のPDGFペプチドは痕跡程度しか存在しないことが
判明した。

特別関心がある作用は、PDGFの化学誘引物質作用であ
る。Grotendorst,Cell,36:279−85（1984）は、マイト
ジェンとしてPDGFに応答する細胞（ウシ大動脈平滑筋細
胞、ヒト皮膚繊維芽細胞、NIH/3T3細胞およびNRK細胞）
も走化性応答を示したが、PDGFがマイトジェン的でない
細胞（ウシ大動脈内皮細胞、MDCK細胞、TERA細胞および
PAM212細胞）にあっては化学誘引されなかった。Groten
dorstらPNAS（USA）、78:3669（1981）は、粥状硬化症
的な形成につながる平滑筋細胞の血管の中膜から内膜へ
の移動がPDGF起因性であることを示唆している。

低親和性血小板因子−４（LAPF4）とも呼ばれる結合
組織活性ペプチドIII（CTAP−III）は、分子量約9,300
ダルトンの分子をもつアシドエタノールに安定な、僅か
に塩基性の（等電点8.5）タンパク質で、鎖内のジスル
フィド結合によって影響される構造を持つ85の残基の単
一ポリペプチド鎖である。Castor,et al.,Arthritis an
d Rheumatism,20:859（1971）;Castor,et al.,PNAS（US
A）,80:765（1983）;Castor,et al.,Biochemistry,24:1
762（1985）;Castol,J.Rheumatol.,Suppl.11:55（198
3）．そのアミノ酸配列は既に知られており、抗CTAP II
I抗体も入手できる。Casterら（1983）参照。その（マ
イクログラムレベルで見られる）生物活性は、DNA合
成、ヒアルロン酸合成、硫酸塩のプロテオグリカンへの
組込み、プロスタグランジンE₂合成、プラスミノーゲン
活性体の分泌、グルコースの取込み、およびラクタート
［lactate］の形成である。Casterら（1985）参照。Mul
lenbach,et al.,J.Biol.Chem.,261:719（1986）はCTAP
IIIをコードする遺伝子を合成し、このタンパク質を酵
母中に発現させた。HPLC精製組換えタンパク質は半最高
マイトジェン的活性を10^-7Mレベルで発現すると言われ
ていた。

CTAP III（LAPF−４）のマイトジェン的活性はHolt,e
t al.,Biochemistry,25:1988（1986）で疑問視されてい
る。Holtはテストされた最初のLA−PF4原剤は3T3細胞に
分裂促進的であると考えたが、氏のより一層精製された
LA−PF4は不活性であった。氏は「テストされた物質の
順序が重要な問題である」と言っている。

βトロンボグロブリン（β−TG）はCTAP−IIIの分裂
促進的に不活性な一部切断のフォームである。それはCT
AP−IIIのＮ末端テトラペプチドを欠くもので、残りの8
1残基は明らかにマイトジェンとして独立に活性でな
い。しかしβ−TGは走化性である。Holt,et al.,Exp.He
matol.,16:302（1988）参照． 一方、血小板ベースのタンパク質（PBP）は９残基の
Ｎ末端エクステンションをもつCTAP−IIIである。PBPは
最初、１−10ng/mlの濃度の3T3細胞マイトジェンである
と報告されていた。Paul,et al.,Thrombosis Research,
18:883（1980）．その後このグループは説を撤回し、精
製PBPはマイトジェン活性がないと宣言した。Holt,et a
l.（1986）参照．我々は組換えDNA技術でPBPを発現させ
ようとする試みについては未見である。

Shimokado,et al.,Cell,43:277（1985）は胞状［alve
olar］マクロファージで条件を整えられた培地を分断し
てマイトジェン活性のある断片を得ている。抗PDGF抗体
は分子量12〜13,000ダルトンの単量体タンパク質を免疫
沈降［immunoprecipate］させた。そのタンパク質はそ
れ以上特徴つけられたり精製されてはいない。

Martinet,et al.,Nature,319:158（1986）は、活性化
されたヒト血液単球（マクロファージ）がPDGF様活性を
持つ物質、特に間葉細胞に走化性活性を有し、繊維芽細
胞に成長コンピテンス活性を有する物質を放出すること
を報告している。この物質はその天然の繊維芽細胞受容
体および抗PDGF抗体からPDGFを取り除いた。PDGFと同
様、Martinetの仲介者が現れ生物学的活性のジスルフィ
ド結合を求めた。

Pencev and Grotendorst,Oncogene Research,3:333
（1988発行；しかし実際には1989年２月に公表）Matsuo
ka and Grotendorst,PNAS（USA）,86:4416（June 198
9）は、走化性成長因子に関し本発明者らの仕事に関係
しているが、彼らの仕事は部分的に精製された生タンパ
ク質の研究に限定されている。

Collagen,EP Appln 243,179は成長、走化性または分
化［differentiation］因子からなる創傷治癒組成物に
つき記載している。

Urry,U.S.4,693,718,は、トロポエラスチン［tropoel
astin］におけるペプチド反復に対応する合成ペプチド
による繊維芽細胞走化性の刺激につき述べている。

ここに引用の参考文献はいずれも本願発明に対する先
行技術または先行する関連技術であるとすることは許さ
れない。ここに挙げた日付は文献上に記載の日付であっ
て特許出願の目的における公表日でない。またここに引
用の文献は関係する限り本願中に取り込むものとする。

発明の概要 PDGFはヒト創傷液中にある主要なミトアトラクタント
［mitoattractant］ではない。ヒト創傷液は多クローン
抗ヒトPDGF抗体に反応したが、反応ペプチドはPDGFにも
そのサブユニットにも十分に応答しなかった。PDGFは約
30kDaの分子量であるが、本発明に係る２種は各々、16
〜17kDaと34〜36kDaであって、PDGFと共移動［comigrat
e］しなかった。免疫的に純化された［immunopurifie
d］ペプチドはPDGFのＡ鎖またはＢ鎖特異的抗血清によ
って識別されなかった。

16kDaのペプチドは、ヒト単球により分泌される16kDa
の単量体化学誘引物質に応答すると信じられており、ま
たPDGFのＡ鎖またはＢ鎖から識別されている。

抗PDGF多クローン抗体をプローブとして使用して、問
題とするcDNAを、活性化した末梢血液単球から採ったcD
NAライブラリ中に同定した。このcDNAは、34アミノ酸Ｎ
末端エクステンションを有するPBPとして記載されるタ
ンパク質をコードした。この新しいペプチドは、単球ば
かりでなく好中球によっても分泌されるので、“白血球
由来成長因子”（LDGF）とここでは呼ぶことにする。

このcDNAは、選択された宿主中で機能的なプロモータ
ーに操作可能に結合することでき、それでLDGFがその宿
主中に発現されるようにすることができる。

生のLDGFは血小板由来の成長因子（PDGF）と区別でき
ない仕方で挙動する。すなわちLDGFは、繊維芽細胞と
か、平滑筋細胞およびアストログリア細胞のような結合
組織細胞にとっては強力な走化性、かつマイトジェン因
子であるが、内皮細胞とか、上皮細胞あるいは白血球に
はそうでない。実験データはこれが同一の細胞表面受容
体分子とPDGFおよびLDGF双方との相互作用に起因してい
ることを示唆している。これらの受容体は、形質転換成
長因子αまたはβ、上皮成長因子、インシュリン様成長
因子、繊維芽細胞成長因子、インターロイキン、腫瘍壊
死因子、インターフェロン、その他、赤血球因子４、結
合組織活性ペプチドIII、あるいは黒色腫成長刺激活性
（gro gene生成物）のようなテスト済みの上記以外の成
長遺伝子ファミリー［gro−gene family」の既知の成長
因子とは結合しない。

LDPGおよびその類似体（「アナログ」とも言う。以下
同じ）は、創傷治癒を促進するのに使用できるであろ
う。通常の治癒しつつある創傷に比しこの因子の増加レ
ベルが見られる、特に、褥瘡とか、静脈血行静止、糖尿
性潰瘍［diabetic ulcer］などの慢性皮膚潰瘍を含む多
くの治癒悪化状態の処置に有効であろう。また、抗腫瘍
薬またはステロイドによる化学療法など、患者が治癒し
そこなった処置を経験している手術による創傷でうまく
創傷治癒されていないときの処置に有効である。皮膚創
傷のほかにもこの物質は、骨移植、骨折仮関節［bone f
racture non−unions］，人為的な関節置換、腱補修な
どの結合組織形成の促進が望ましい場合の怪我が外科的
処理の手当に有効である。眼科分野ではこの物質は、極
めて僅かな出血しか起こらず創傷はなかなか治癒しない
前部手術後の手術創傷の促進に非常に有効である。この
物質はPDGFと変わらない仕方で作用し、上記の状態下で
のPDGFの効力を証明しているので、発明者らはこの物質
がPDGFが作用するのと同じ標的細胞に適切な刺激を与え
ることを確信している。

それはPDGFより小さく、たった一つのサブユニットし
か含まず、グリコシレーショイン［glycosylation］部
位を一つも持たずPDGFのような糖タンパク質でないの
で、LDGFは製造するのがずっと簡単でコスト安である。

ここに論じてある研究は、LDGFが治癒過程の初期段階
でヒト創傷に存在する主要な成長因子であることを示し
ている。したがってこの因子の追加こそ、創傷治癒の自
然の進行過程に一層近い模倣なのである。この因子の使
用は、創傷部位にずっと少ない量しか存在しないPDGFに
比較し、好ましくない副作用を引き起こすことがより少
ない。

図面の簡単な説明 図１はcDNAと、LDGFと翻訳されたアミノ酸配列を示
す。血小板ベースのタンパク質、LAPF−4/CTAP−IIIお
よびβ−TGは、LDGFに対して異なるＮ末端と一つの共通
したＣ末端とを持つ。これら関連するタンパク質のＮ末
端がマークされている。

図２はLDGFの親水性および疎水性領域のマップであ
り、（ａ）Kyle and Doolittle、窓７、および（ｂ）Ho
op and Woods、窓６の方式で親水性領域は表面に張られ
る傾向があるから、それにより抗原的である。

図３は（ａ）αヘリックス、（ｂ）βシート、および
（ｃ）逆回転が、Chou and Fasmanのアルゴリズムを使
ってLDGF配列を横切るポテンシャルを調査したものであ
る。

図４は10の残基の各窓につきLDGFのネットチャージを
示すものである。

図５はＴリンパ球抗原決定基である両親媒性αヘリッ
クス（窓11、度数100）を示す。

図６は培地におけるPDGF様走化性活性、および不活性
化、LPS活性化ヒト末端血液単球の細胞抽出物を示す。

好ましい実施例の詳細な説明 本発明は、創傷の処置に有効な白血球由来成長因子
（LDGF）に関する。結合組織細胞の創傷部位には走化性
運動があり、その後に同細胞の増殖が引き起こされると
信じられている。

一面から見れば本発明は、活性化された末梢血液単球
またはヒト創傷液により条件付けられた培地から自然発
生する走化性因子およびマイトジェン因子の精製に関す
る。この因子は、抗PDGF抗体により認識されるが、PDGF
のＡ鎖またはＢ鎖特異性抗体によっては認識されない16
kDの単量体タンパク質として特徴付けられており、PDGF
の細胞受容体に相互反応し、ブロモシアンおよびギ酸に
対する感受性につきPDGFのＡ鎖およびＢ鎖とは区別され
ている。好ましい実施例では、この因子は固定化したヘ
パリンにアフィニティクロマトグラフィで部分的に精製
される。

第二の面から見れば、本発明は新規な走化性因子をコ
ードする遺伝子が抗PDGF抗体との発現ライブラリーをイ
ムノスクリーンすることによって同定されるという発見
に関係する。この遺伝子またはその断片は、関連する遺
伝子を同定し分離するためのオリゴヌクレオチドプロー
ブとして使用することができる。

第三の面として本発明は、新規な因子LDGFをコードす
る遺伝子のクローニングおよび発現に関係し、そのアミ
ノ酸配列をここに明らかにしているが、単球条件付け培
地およびヒト創傷液から精製した走化性因子であると考
えられる。組換え技術によるLDGFの生成が好ましい。

第四の面として本発明は、突然変異誘発されたLDGF遺
伝子の発現、または組換えLDGFタンパク質の酵素処理か
ら得られる新規な走化性因子及び／又はマイトジェン因
子の発生にも関係する。

第五の面として、本発明はLDGF様タンパク質に対する
抗体の調製、ならびにあるLDGF特性を模倣する抗抗体の
調製にも係わる。

LDGFは、例えば単球細胞培養の表面物とか、ヒト創傷
液といった天然物から精製して得ることができる。しか
し合成すればより容易に得ることが可能である。

好ましくはLDGFは、そのLDGFをコードする遺伝子をプ
ロモーターに操作可能に結び付け、形質転換した宿主細
胞中にそのプロモーターの制御下でその遺伝子を発現さ
せることによって調製される。遺伝子は本実施例におけ
るようにcDNAであってもよいし、ゲノムLDGF配列（LDGF
関連のcDNAを、ちょうどゲノムライブラリーに対する免
疫プローブのように、雑種形成プロモーターまたは抗PD
GF抗体として使って同定する）であってもよい、または
合成DNA（LDGFのcDNAが配列されているので）でもよ
い。

この細胞は原核細胞（例、細菌）でも真核細胞（例、
酵母哺乳動物）でもよい。好ましい宿主細胞はE.coliで
ある。プロモーターは宿主細胞中で機能的［functiona
l］でなければならない。好ましいプロモーターはＴ−
７ファージである。LDGFは好ましくは形質転換細胞から
分泌されるが、もしそうでないなら、この細胞はLDGFを
回収するため後で溶解されなければならない。

LDGFは次にその特異的活性を増進するように精製され
る。好ましくは抗PDGF（またはLDGF）イムノアフィニテ
ィカラムを使い、及び／又はヘパリン・セファロースへ
のアフィニティクロマトグラフィによってLDGFは精製さ
れる。

LDGFに対する多クローン抗体および単クローン抗体を
生じさせるのに精製LDGFが使われる。これら抗体は、追
加的なLDGFの免疫精製において、あるいは創傷液中のLD
GF分析の際、あるいはまた、フィブロティック［fibrot
ic］状態の処置に使用される。

創傷液中のLDGFのレベルを観察すれば、その創傷部位
における治癒作用に関し有益な示唆が得られるであろ
う。その分析は好ましくはイムノアッセイであるが、コ
ンピティティブフォーマットまたはサンドイッチフォー
マットで行われる。１コンピティティブフォーマットで
はサンプルLDGFは、不溶化抗体のため標識付けたLDGFで
競合させるが、好ましくは抗LDGF抗体であって抗PDGF抗
体であってもよい。１サンドイッチフォーマットでは、
サンプルLDGFは不溶化抗体および標識付けた抗体の両者
に結合されている。反応物導入のオーダーは様々であ
る。

LDGFに対する抗体はLDGF/PDGF受容体を阻止するのに
使うことができ、それによってその受容体の過度の刺激
から生ずるフィブロティック状態を処置することができ
る。

組換えDNA技術による生成が好ましいが、LDGF分子
（または類似体）は、アミノ酸またはオリゴヌクレオチ
ドのインビトロ連鎖［concatenation］によっても調製
することができる。

LDGFの類似体も、化学誘引活性およびマイトジェン活
性を有していると信じられる。LDGFのＮ末端エクステン
ション（PBPに比し）は、これらの活性を実質的に促進
するもので、PDGF−Ｂ鎖タンパク質中のシステインと並
ぶLDGFの３つのシステインは特別の意味を持つものと考
えられる。類似体はLDGF遺伝子の部位特異的な突然変異
生成（Zoller Smith,1984;DNA vol.3,479−488）および
その突然変異遺伝子の発現によって調製される。好まし
くは、類似体はPBPとは異なりLDGFの特殊な「Ｎ末端エ
クステンション」［Ｎ−terminal extension］を少なく
とも持っている実質的に相同なものがよい。

追加的なシステイン残基を含むPDGFのＢ鎖と相同な配
列に有意義に追加するのは、LDGF分子のこの領域であ
る。またこの分子のこの領域の水治療法スロットは、PD
GFのＢ鎖分子に非常に類似するもので、抗体と受容体の
交差反応性を説明する類似の３次構造についてのさらな
る証明となる。発明者らはその生物学的および免疫学的
テストで精製CTAP−III,PBPおよびβ−TGを試験し、そ
れらが不活性であることを発見したので、追加的なＮ末
端ペプチド領域はPDGF様の生物学的活性にとり必須のも
のであると考えている。「LDGF様タンパク質」という言
葉は、Ｎ末端エクステンションを実質的に持つが、PDG
F、PBP、CTAP−IIIおよびβ−トロンボグロブリンを排
除する類似体という意味である。好ましくは、「LDGF様
タンパク質」はPDGF、PBP、CTAP−IIIまたはβ−トロン
ボグロブリンよりも、ここに定義した生LDGFの方に相同
であるのがよい。相同性はNeedleman Winsch,J.Mol.Bio
l.48:443−453（1970）のアルゴリズムにより、窓100、
ギャップペナルティ10、サイズペナルティ２、最大ギャ
ップ50で決定される。

これらのアナログは、シングルもしくはマルチプルの
挿入、削除または置換によってLDGFとは異なる。確実さ
を以てアプリオリに与えられる突然変異について述べる
ことは不可能だが、次のような一般化が言えると考え
る。すなわち、もし次の判断基準の１つまたは２つ以上
が満足されるならば、突然変異は活性に影響を与える傾
向が強まると。

（１）突然変異は、LDGFをPBPから区別する34−AAのＮ
末端エクステンションに影響を及ぼすこと。

（２）突然変異は、LDGFとPDGFのＢ鎖間に保存されてい
るアミノ酸の１つに影響を及ぼすこと。

（３）突然変異は、LDGFの親水領域（図２）中に存在す
るアミノ酸に影響し、したがって溶媒に露出される傾向
がある。

（４）図３に表されたように、突然変異はLDGFのαヘリ
ックスまたはβシート領域に影響する。特にもしその突
然変異が実質的に二次構造を変化させる傾向があるとき
はそうである。

（５）突然変異は、図５に示された両親媒性αヘリック
スの両親媒性を実質的に増減させる。

（６）突然変異はLDGFの疎水領域中にある残基のサイズ
を実質的に変化するもので、したがってその分子の核の
一部をなすと考えられる。

（７）突然変異は有意的に異なる構造の１つでアミノ酸
を交換する。

SchultzとSchirmerは,Principles of Protein Struct
ure 14−16,170（1979）で、相同有機体の対応するタン
パク質間にはアミノ酸の変化が頻繁であることを分析し
ている。この分析は交換群が存在することを露見するも
ので、かかる群中のアミノ酸は優先的に相互交換する。
SchultzとSchirmerはこのような交換群につき次の４種
を区別している。

Ｉ Phe,Tyr,Trp（芳香族アミノ酸） II Lys,Arg,His（正電荷アミノ酸） III Val,Leu,Ile,Met,Cys（大脂肪族アミノ酸） IV Ser,Thr,Asp,Asn,Gly,Ala,Glu,Gln,Pro（小アミノ
酸） SchultzとSchirmerはまた、各アミノ酸の突然変異傾
向についても述べている。Id.,171−172.最も頻繁に交
換されるアミノ酸は、セリン、メチオニン、およびアス
パラギンであって、最も少なく突然変異されるアミノ酸
はトリプトファン、システイン、およびチロシンであ
る。トリプトファンは最も大きい側鎖を持つ。システイ
ンはジスルフィド架橋に参加する。チロシンは非常に強
力な水素結合を形成する。

従来の交換についてのより厳格な定義はGENEPRO（Riv
erside Scientific）のアライメントプログラムにより
採択された。次の群を認める。（Ala,Gly），（Asp,Gl
u），（Phe,Tyr），（Ile,Leu,Val），（Lys,Arg），
（Asn,Gln）および（Ser,Thr）である。

もしLDGFの生物学的活性を実質的に変化させたいなら
ば（例えばLDGFの細胞表面受容体につき増大されたアフ
ィニティを持つLDGFを得るためとか、LDGFの走化性活性
およびマイトジェン活性のバランスを変更するため）、
上記基準に従った活性に影響する傾向にある突然変異が
導入されることになる。これら突然変異の多くは勿論、
活性を促進するよりも出せないものである。１策として
LDGF遺伝子をランダムに突然変異誘発し（その長手方向
に沿って行ったり、あるいは活性を左右する傾向にある
残基に集中的に行ったりして）、それから機能的突然変
異体をスクリーニングすることができる。あるいは、候
補となる突然変異体をランダムでない部位特異的突然変
異生成により個々に調製してからスクリーニングしても
よい。

突然変異生成の取組み方については下記参照。Botste
in and Shortle,Science,229:1193（1985）Abarzua and
Marians,PNAS（USA）,81:2030−34（1984）;Fasano,et
al.,PNAS（USA）,81:4008−12（1984）;Myers,et al.,
Science,229:242（1985）;Matteuci and Heyneker,Nucl
eic Acids Res.,11:3113（1983）;and Wells,et al.,Ge
ne,34:315−23（1985） LDGF中に「従来通りの」突然変異体だけを作ること、
即ち活性に影響しないような変化を作ることが次の目標
である。上記の基準はここでも同様に有効である。繰り
返すが変化の効果につき不確実な限り、集中的なランダ
ムの突然変異生成が採用されることになる。

免疫学的挙動は必ずしも生物学的挙動と連携する関係
にはないが、抗PDGF（またはLDGF）抗体のスクリーニン
グも有効であろう。類似体もまたPDGF（またはLDGF）受
容体への結合をコンピティティブに抑制する能力を求め
てPDGF（またはLDGF）でスクリーニングされてもよい。

タンパク質分解のデグラデーション［degradation］
に対する安定性を向上させたLDGFの類似体を調整するこ
とが有利であろう。こうした類似体は慢性的創傷の処置
に特に有効と考えられる。というのは、プロテアーゼは
創傷部位に存在する天然の成長因子を減らすので、多数
の専門家は損傷部位におけるプロテアーゼの過剰生成が
慢性的創傷の場合における阻害されている治癒の根本原
因であると感じているからである。これらの類似体は、
分子の不活性な形態であるCTAP−III,PBPおよびβ−TG
のデグラデーションを可能にするプロテアーゼの切断部
位［cleavage site］にある一部のアミノ酸を置き換え
ることによって作り出すことができる。例えば、位置35
と36にある２個のセリン残基はトレオニンと置き換える
ことができ、また位置44のアスパラギン残基はグルタミ
ンと置き換えることができる。（両方の従来通りの置換
はGENEPROの基準によったもの）その他の適当な置換も
上記の部位および同様な部位における集中的ランダム突
然変異生成によって決定することができる。

ここに詳細を記載していないが分子生物学および免疫
学の技術として通常のものについては以下を参照。Samb
rock,Fritsch and Maniatis,Molecular Cloning:A Labo
ratory Manual,Vols,1−３（Cold Spring Harbor:2d e
d.1989）,and Harlow and Lane,Antibodies:A Laborato
ry Manual（Cold Spring Harbor:1988） 例1:一定条件下の培地から単離された単球由来成長因子
の特性 物質および方法 成長因子 ヒトPDGFは血小板から単離され、前述の方法で均質に
精製された（Grotendorst,1984）。PDGFのＡ鎖ホモダイ
マー［homodimer］とＢ鎖ホモダイマーを、Biochem,In
c.またはAM GEN,Inc.で購入した。SDS PAGEゲル電気泳
動および逆相高性能液体クロマトグラフィで決定された
純粋な物質が以下の生物学的アッセイ全てで使われ、抗
ヒトPDGF抗体を産生している。

抗体 PDGFのＡ鎖（前駆体分子のアミノ酸92−119）およびP
DGFのＢ鎖（アミノ酸79−107）のアミノ酸末端配列を含
む合成ペプチドまたは精製PDGFがヤギに特異的抗体を産
生するため使用された。ヤギは不完全なフロイントアジ
ュバンド中の20μｇの精製PDGFまたは50μｇの合成ペプ
チドを多数皮内注射して免疫された。不完全フロイント
アジュバンド中の純粋PDGF20μｇ（50μｇの合成ペプチ
ド）で第４回目のチャレンジをした後、最後の免疫後７
日間免疫血清が集められ、免疫沈降［immunoprecipitat
ion］およびウエスタンブロットによってその特異性に
つきテストされた。そのテストされた免疫血清は、TGF
−Ｂ（ウエスタンブロット分析では精製TGF−５の50ng
まで）またはEGFのような他の単離された成長因子と交
差反応を少しも示さなかった。PDGFのＡ（92−119）ペ
プチドおよびPDGFのＢ（79−107）ペプチドに対して生
成された免疫血清は、免疫ドットブロットにより配列特
異的であることが証明され、PDGFのＡ鎖またはPDGFのＢ
鎖分子の残りのアミノ酸配列を有するペプチドと交差反
応しなかった。免疫血清のIgG断片がDEAE Affiゲルブル
ーセファロースに単離された（Biorad,Richmond,Califo
rnia、0.02 NaCl,0.02 Tris pH 8.0に平衡させられ
た）。

総合試薬 リポポリサッカライド（LPS,E.coli 0127:B8）をSigu
ma Chemical Co.,St.Louis,Missouriから購入し、FMet
−Leu−Phe（MLP）をPeninsula Laboratories,Sun Carl
os.Californiaから購入し、免疫複合物をCooper Biomed
ical,Malvern,Pennsylvaniaから購入した。

Hypaque−Ficollの密度勾配遠心法を用いて新鮮な全
血液からヒト末端血液単球を単離した。1mg/mlウシ血清
アルブミン（BSA）およびゲンタマイシン（50μg/ml）
を含む10⁶細胞/mlの濃度のRPMI 1640培地で、95％の空
気と５％の炭酸ガスの雰囲気中に37℃で18時間、１μg/
ml LPS、免疫複合物（0.5mg/ml）またはfmet−leu−phe
（10^-6M）の存在下または不存在下で付着細胞（＞85％
単球）を培養した。一定条件下の培地を除去し付着した
細胞をリン酸緩衝の生理食塩水中で掻き落とし10分間20
00×ｇで遠心分離した。培地および細胞粒の両者からRo
bertsらが記載（1980）のアシド−エタノール抽出法と
エーテル沈降法によってペプチドを抽出した。簡単に言
うと活性または不活性細胞から得た一定条件下の培地ま
たは細胞粒の1volを４℃で一晩2volのアシド／エタノー
ル（1vol/51vol）で抽出した。600×ｇで30分間遠心分
離後、表面物を４℃で一晩4volの無水エチルエーテルで
沈降させた。沈降物を1Nの酢酸で再抽出し、凍結乾燥
し、平滑筋細胞走化性分析またはウエスタンブロットで
テストした。場合によっては一定条件下の培地を走化性
活性につき直接テストするか、または凍結乾燥し、サン
プル緩衝液（Tris,SDS,グリセロール）中で再懸濁しウ
エスタンブロットでテストした。

LDGFの特性 活性化した単球の条件設定培地からのLDGFの部分的精
製は、pH7、サイズ排除クロマトグラフィ（1Nの酢酸ま
たは0.5Nの酢酸アンモニウム中で発生させたHPLC,TSK−
2000）、0.1〜1Nの酢酸アンモニウムの勾配、で溶出さ
せたヘパリンセファロース（Pharmacia,Piscataway,New
Jersey）にアフィニティクロマトグラフィで行った。
部分的に精製した物質はHeldinら記載（1986）のように
ブロモシアンおよびギ酸の消化を使ってさらに詳しく特
徴つけられた。分別部分［aliquot］を37℃、48時間、7
0％のギ酸単独中、またはブロモシアン含有の70％ギ酸
（g CNBr/g全タンパク質）中でインキュベートした。次
にサンプルを凍結乾燥し、5mM HCl中で再溶解し、走化
性につきテストしウエスタンブロットした。

上述したようにウシ大動脈平滑筋細胞につき走化性活
性をボイデンチェンバーによる走化性分析で測定した
（Grotendorstら、1981）。サンプルをデュプリケート
にしてテストし、各結果は３回の実験の平均標準偏差を
示すものとした。走化性活性は既に詳述したように（Gr
otendorst、1987）、応答細胞から抽出されたステイン
のミリアブソーバンスユニット［milliabsorbance uni
t］として発現される。6ng/ml濃度の純粋なヒトPDGFはA
₆₀₀nmで350mAUの値を出す走化性応答を引き出す。CNBr
およびギ酸で処理された材料を除き、各サンプルの電気
泳動を12％または15％のポリアクリルアミドゲルで行
い、CNBrおよびギ酸で処理された物質についてはLaemml
i（1970）に記載されている通りドデシル硫酸ナトリウ
ム（SDS）含有の18％ゲルで分析した。Kyhse−Andersen
（1984）が記載するように、電気ブロッティングによっ
てタンパク質をニトロセルロースに移動した。タンパク
質のフィルタへの非特異的結合を阻止するため、移動
後、ブロットを2.5mg/mlの無脂肪粉カーネーション牛乳
（TBS−milk）を含むTris緩衝の生理食塩水（TBS）（10
0mM NaCl,50mM Tris,pH7.4）中で、４時間インキュベー
トした。次にこのフィルタをTBS−milk中に希釈された1
5μg/mlの抗ヒトPDGF IgGの存在下で一晩インキュベー
トした。それからTBS−milk中で５回洗浄し（各５分
間）、TBS−milk中で90分間、アルカリフォスファター
ゼ抱合のアフィニティ精製されたウサギ抗ヤギIgG（1:1
000希釈度）でインキュベートした。TBS−milkで５回洗
浄後、アルカリフォスファターゼ基質キット（KPL,Gait
hersburg,Maryland）を使って抗原を検出した。この方
法によりウエスタンブロット中の0.3ngという小さなPDG
Fをも検出することができる。

不活性化単球はPDGF様の 生物学的、免疫学的活性を有する 活性化された末端血液単球からの一定条件培地は平滑
筋細胞走化性を濃度依存的に引き出したが、不活性化細
胞から集めた一定条件培地は少しも測定可能な走化性活
性を示さなかった。かえって活性化細胞および不活性化
細胞の両者から得られた細胞抽出物は、この物質が不活
性化細胞中に存在することを示唆するようなほぼ同量の
生物学的活性を示した。この物質の濃度は時間依存性で
あることが報告されており（Martinetら、1986）、18時
間後に最高濃度に達し、応答は活性に使われた全試剤に
つき同じであったとされる（すなわちLPS、免疫複合
物）。また、前に報告された通りに（Shimokadoら、198
5;Martinetら、1986）、一定条件培地を30μｇの抗ヒト
PDGFヤギIgGでプレインキュベーションすると生物学的
活性を完全に消したが、非免疫ヤギIgGはこの物質の生
物学的活性に何の影響も示さなかった。

末端血液単球により産生された物質をより詳しく特徴
つけるため、不活性化、活性化細胞両者からの細胞抽出
物および一定条件培地を、抗ヒトPDGF IgGを使ってウ
エスタンブロットトランスファ分析で検査した。不活性
化単球からの抽出物は、56、45、31、25および16kDの明
確な分子量を有する少なくとも５つの主たる免疫反応性
ペプチドを露出した。これとは対照的に、活性化単球は
活性化細胞からの分泌産生物の分子量と同じ16kDのたっ
た１つの主たる免疫反応性ペプチドしか持っていなかっ
た。不活性化細胞からの一定条件培地は免疫反応性物質
を少しも持っていなかった。プレイミューンIgGは、細
胞抽出物あるいは一定条件培地のいずれにおいてもどん
なペプチドにも反応しなかった。

LDGFのマイトジェン分析 NIH/3T3細胞（ATCC CRL1658）をDulbecco修正Eagle培
地（DMEM）/10％ウシ胎児血清（FBS）の中で24のウエル
プレート中に１×10⁴/cm²濃度でプレートし、集密［con
fluence］になるまで成長させ３〜４日後に分析に使っ
た。成長因子を直接に添加し、18時間後に³H−チミジン
（2uCi/ml）（Amersham,Arlington Heights,Illinois）
を添加した。細胞をさらに２時間インキュベートし、４
℃で３回、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で、また５％
トリクロロ酢酸（TCA）で５回、洗浄した。TCAに不溶性
の物質を0.1N NaOH/0.1％ SDSで溶解し、混合した3H−
チミジン量をBeckman液体シンチレーションカウンタで
測定した。

LDGFを活性化単球から通常の方法で精製した。PDGFを
Grotendorst,Cell 36:279−285,1984に記載の通りに単
離した。

PDGF 20ng/ml 71,000cpm PDGF 10ng/ml 51,000cpm LDGF 100ul（サンプルの） 59,000cpm約14ng/ml LDGF 50ul（サンプルの） 45,000cpm約 7ng/ml LDGF 25ul（サンプルの） 28,000cpm約 3ng/ml 負の対照 2,500cpm LDGFは、ジスルフィド架橋に欠けるに単量体である 複数の研究所におけるこれまでの研究は２量体形式の
PDGFだけが生物学的に活性であることを示唆してきた
（Antoniadesら、1979;Heldinら、1981;Grotendorst
ら、1981）。しかし上述のようにマクロファージから分
泌された主要な免疫反応性ペプチドの分子量は16kDで、
血小板放出のPDGFが31kDであることに比べると、単球分
泌物質のPDGFとの関係につき疑問が生ずる。活性化マク
ロファージから分泌された物質をウエスタンブロット分
析するとSDSゲルに16kDのダブレットを露出した。これ
ら物質をジチオトレイトールで還元してもペプチドの電
気泳動移動度は不変であったので、ジスルフィド架橋は
存在しないことを示唆する。これに対して対照的に、血
小板から単離されたオーセンンティックヒトPDGFの同一
ゲルの電気泳動は、非還元状態の31kD（これは前述の通
り（Johnssonら、1982;Antoniadesら、1979;Heldinら、
1982）還元後18kDにシフトする）でダブレットを発現し
た。単球から分泌される免疫反応性ペプチドの相対的豊
富さと分子量は、細胞の活性を刺激するため使われる試
剤には依存していなかった（LPS、免疫複合物、またはF
MLP;データは不知）。これらのデータは、LDGFの主要な
分泌形式が変性条件下ではSDSゲル電気泳動で16kDの単
量体タンパク質として挙動することを示している。

この物質の分子量を非変性条件下で検査した。HPLCに
ゲル濾過クロマトグラフィを使って、1Nの酢酸または0.
5Nの酢酸アンモニウムpH7中に発生させたTSK−2000カラ
ムにヒトPDGFの溶離位置［elution position］と単球PD
GF様因子（LDGF）のそれとを比較した。酸性条件下では
PDGFの溶離回数とLDGFはほぼ同じで、LDGFはこの条件下
では30kDの二量体として挙動することを示唆した。しか
し走化性活性は、0.5Nの酢酸アンモニウムを18kDのペプ
チドとして溶離した。生物学的に活性な部分［fractio
n］のウエスタンブロット分析は16kDの免疫反応性ペプ
チドがこのカラムからの生物学的活性と共溶離すること
を示した。

追加的なメチオニン残基は、PDGF A鎖分子 またはＢ鎖分子に比し、LDGF中に存在することの証明 ヒトPDGFのＡ鎖分子とＢ鎖分子は、LDGFの関係をこれ
らペプチドに比較するためのタンパク質化学工学により
開発できる特徴的な一次構造を持っている（Heldinら、
1986）。例えばPDGF A鎖分子の成熟形はメチオニン残基
を何も含んでいない（Betsholtzら、1986;waterfiel
ら、1983）。加えて、処理したＡ鎖は、ギ酸消化による
切断［Cleavage］に感受性あるアスパラギン酸−プロリ
ン結合を持っている。Ｂ鎖分子の成熟形こうした結合の
どれも持っていない（Doolittleら、1983;Waterfiel
ら、1983）。このようにＢ鎖分子はギ酸との切断に耐性
を有しているが、CNBrが添加されると位置11で切断さ
れ、減少された分子量のペプチドをもたらす（Heldin
ら、1986）。逆にＡ鎖分子はギ酸消化に感受性があり、
CNBrはＡ鎖ペプチドのフラグメンテーション［fragment
ation］に何ら効果を持たない（Heldinら、1986）。LDG
Fは次にギ酸単独、またはCNBr存在下に処理され、その
処理した分子の生物学的特性および電気泳動特性の両者
につき分析した。PDGFのＡ鎖分子の切断をもたらす一定
条件下でのLDGFのギ酸処理は、平滑筋細胞走化性分析に
おいて決定されたような生物学的活性も、ウエスタンブ
ロットでの主要な免疫反応性ペプチドの電気泳動移動度
にも、何ら効果を示さなかった。しかし本物質のCNBr消
化は、生物学的活性の完全な喪失をもたらすと共に、ウ
エスタンブロットでの免疫反応性物質の破壊を完成させ
た。逆に、SSV/NRKから単離された部分的精製のPDGF
Ｂ鎖分子は、抗PDGF IgGを使ってウエスタンブロット
分析でCNBr消化の前後に容易に検出された。

LDGFは、PDGFのＡ鎖または Ｂ鎖のアミノ末端に免疫学的に明確である。

LDGFのPDGF A鎖またはＢ鎖との関係をより詳しく決定
するために、分泌PDGF A（アミノ酸92−119）またはＢ
（アミノ酸79−107）鎖のＮ末端配列を有する合成ペプ
チドに対して抗体を起こしてみた。LDGFを分析し、還元
PDGF ＡホモダイマーおよびＢホモダイマーと比べてみ
たとき、Ａ鎖のアミノ末端ペプチドに対する抗体は還元
PDGF Ａホモダイマーを認識したが、還元LDGFまたは還
元PDGF Ｂホモダイマーには反応しなかった。Ｂ鎖のア
ミノ末端ペプチドに対する抗体は還元PDGF Ｂホモダイ
マーと免疫反応したが、還元PDGF Ａホモダイマーまた
はLDGFとは交差反応しなかった（図５）。

ここに提出されたデータは、ただ一つの大きさクラス
である活性化したヒト末端単球が約16kDの分子量の生物
学的に活性なペプチドを大量に分泌することを示してい
る。これらのペプチドはまた、抗ヒトPDGF抗体により完
全に中和される平滑筋細胞走化性活性も示す。これらペ
プチドは全く細胞内で活性刺激により処理されるようで
あり、ちょうど活性化細胞の抽出物が分泌ペプチドの電
気泳動移動度と同じ移動度をもつペプチドだけを含み、
また新たに単離されたかまたは不活性化された細胞が大
きい分子量（54、45、31、25、16kD）の免疫反応性ペプ
チドを含むのと同じである。より高い分子量のPDGF関連
ペプチドは、サル肉腫ウイルス［simian sarcoma viru
s］で形質転換されたマーモセット系などの種々の細胞
系において記述されており、追加的なＮ末端およびＣ末
端アミノ酸を有する成熟細胞の前駆体フォームを表すも
との考えられている（Robbinら1983）。LDGFは非変性条
件下で二量体として存在するが、ジスルフィド架橋を持
たない。このことはLDGFとPDGFのHPLCゲル濾過クロマト
グラフィで酸性状態に共溶出［coelute］するが、SDSゲ
ルには異なる電気泳動移動度を示すという我々の観察か
ら支持されている。PDGFとは逆に、SDSゲル中のLDGFの
移動度は還元剤の添加によって影響を受けない。Giese
らの最近の研究は（1987）、ｖ−sis腫瘍遺伝子のPDGF
関連ドメイン中の８つの保存されたシステイン残基のい
ずれかに部位指向性突然変異生成による修飾がジスルフ
ィド架橋を欠いたｖ−sis遺伝子生成物（PDGFのＢ鎖）
の形式の合成をもたらすことを示している。しかし位置
154、163、164および210のシステイン残基の修飾はｖ−
sis遺伝子の形質転換活性を変化しなかったのであり、
このことはジスルフィド架橋を欠くｖ−sis遺伝子生成
物のある種の形式が生物学的活性を保持していることを
示している。PDGFのＡ鎖ペプチドまたはＢ鎖ペプチドと
は異なり、LDGFの免疫反応性はブロモシアンで処理する
ことにより完全に破壊されたのであって、これは追加的
なメチオニン残基が存在することを示唆している。また
PDGFのＡ鎖およびＢ鎖のアミノ末端配列を特異的に認識
する抗体はLDGFに反応しなかったのであり、これはその
ようなアミノ酸配列がLDGF中に存在しないこと、または
そのようなアミノ酸配列が有意に変化させられたかその
抗体の届かないところにあるか、を示すもので、さらに
LDGFとPDGFの構造的相違を支持するものである。

要するにこれらのデータは、LDGF構造というものが、
今日まで特徴であるとされてきたPDGFの形式のいずれか
らも区別できることを示している。この物質は、結合組
織細胞の化学誘因物質およびマイトジェンとしての挙
動、ならびに「¹²⁵I］PDGFの細胞表面受容体に結合する
ための［¹²⁵I］PDGFとのコンピティションを含むPDGF様
生物学的活性の全てを発現する。しかしその分子組織
は、PDGFの公知形式の分子組織とは、それがジスルフィ
ド交差結合した二量体ではないという点で、また、ギ酸
またはCNBrによる切断に、処理されたPDGFのＡ鎖または
Ｂ鎖ペプチドのいずれかにつき見られるものとは異なる
感受性を示す点で、異なっていると思われる（Heldin
ら、1986）。

精製された物質は、10^-9Mレンジの濃度である濃度10
〜40ng/mlで生物学的活性を持つようである。これは同
じような生物学的活性につき要求されるPDGFのモル濃度
に比較できる。

例2: ヒト創傷液中のPDGF関連ペプチドの免疫検出法 方法および物質 細胞： NIH/3T3細胞は、S.Aaronson（National inst
itutes of Health）から初期の継代で得ることができ
た。細胞は10％ウシ胎児血清とゲンタマイシン（50μg/
ml）を補充されたDMEM中で成長され、90％雰囲気/10％C
O₂中で37℃に維持された。培養細胞が集密的になった直
後に濃度抑制された培養細胞を使って全てのマイトジェ
ン分析および走化性分析が行われた。

ヒト創傷液： ヒト創傷液を、腫瘍（直径＜1.5cm）
除去の目的で全面乳腺切除を受けた６人の女性患者から
毎日集めた。液は通常の方法として手術中の排水用に挿
入された吸入管を介して集められた。これら患者の誰も
血液学的あるいは細胞性免疫学的な異常な変化を示さな
かった。手術後の通常の管理は、抗生物質およびビタミ
ン剤、および、アドレノクロムやトレネキサム酸のよう
な止血剤の点滴である。抗癌剤は創傷液回収中は少しも
投与されなかった。創傷液は遠心分離（5000×ｇ）によ
り組織破片から分離され,20℃で貯蔵された。

成長因子：遺伝学的に生成されたPDGF AAホモダイマ
ー、BBホモダイマー、ABヘテロダイマー、およびヒト上
皮成長因子は、Creative BioMolecules（Hopkinton,M
A）から供給された。濃度および純度はアミノ酸配列分
析によって決定された。ヒト形質転換成長因子β型（TG
F−β）はResearch ＆ Diagnostic Systems（Minneapol
is,MN）で購入した。酸性の繊維芽細胞成長因子細胞はS
igmaから購入した。いくつかの実験では既述の通り、
（Grotendorst,1984）血小板から純化されたPDGFが基準
および免疫原として使用された。マクロファージ由来の
成長因子が、既に報告したように（Pencev and Grotend
orst,1988）活性化ヒトマクロファージの培養浮遊物か
らHPLCによって純化された。

抗体： 抗ヒトPDGFおよびPDGFのＡ鎖およびＢ鎖成分
の抗合成ペプチドが使われた。ヤギ抗ヒトPDGF抗体を血
小板からの精製PDGFに対して起こした（Grotendorst,19
84）。このヤギ抗PDGF抗体はPDGFの生物学的活性を特異
的に中和することができる（Grotendorstら,1988）。

抗Ａ鎖または抗Ｂ鎖特異性抗体を、PDGF Ａ鎖（アミ
ノ酸92−119）およびPDGF B鎖（アミノ酸79−107）のア
ミノ末端配列を有する合成ペプチドを免疫原として使っ
て調整した。PDGF A（92−119）およびＢ（79−107）ペ
プチドに対する免疫血清は、イムノドットブロットによ
って決定された配列特異的なものであって、PDGF Ａ鎖
またはＢ鎖分子の残りのアミノ酸配列を有するペプチド
と交差反応しなかった。さらに、抗血清は鎖特異性で、
各々、PDGF Ａ鎖またはＢ鎖ペプチドとだけしか反応し
ない。

ヒト創傷液中のPDGF関連ペプチドの精製： タンパク
質の高濃度ゆえに、創傷液サンプルまたは酸抽出された
サンプルはウエスタンブロット（免疫学的）技術では分
析できない、したがってヒト創傷液中のPDGF関連ペプチ
ドは抗PDGFイムノアフィニティ技術により精製した。ヤ
ギ多クローン抗PDGF IgGは、メーカーのプロトコルに
示されるようにAffi−Gel−10（Bio−Rad）に接合し
た。PDGF関連ペプチドは、凍結ストックから新たに解凍
した創傷液1mlを、抗PDGF IgGと接合したAffi−Gel−1
0の200μｌで４℃、24時間、インキュベーションして単
離した。創傷液のインキュベーション後、そのマトリッ
クスを0.1Mヘペス、pH7.4、1mlで５回洗浄した。特異的
結合のペプチドを1Mの酢酸で24時間処理することにより
放出させた。そのマトリックスを遠心分離して表面物を
回収し、1.0Mの酢酸に対してダイアライズし、分析する
前に−20℃で貯蔵した。同量の創傷液とアフィニティマ
トリックスとを使ってPDGF関連ペプチドを各サンプルか
ら単離した。準備的な研究は、この量のアフィニティマ
トリックスが、創傷液サンプル中の全PDGF関連ペプチド
を回収することにつき＞10倍であることを示した。一部
の実験では、DeLarco and Todaro（1978）が記載するよ
うに、ヒト創傷液はアシドエタノール沈降によって処理
した。

ウエスタンブロット分析： ヒト創傷エタノール物質
をウエスタンブロット分析で分析した。抗ペプチド抗体
がSDS含有の15％ポリアクリルアミドゲル中に使われて
いる場合を除いて、サンプルを非還元下に電気泳動さ
せ、次にサンプルを前述の通りニトロセルロースに電気
ブロット［electroblot］させた（Leibovich and Ross,
1976;Takeharaら、1987）。免疫反応性PDGFペプチドを
抗ヒトPDGF IgGとアルカリホスファートとが接合した
ウサギ抗ヤギIgGで検出した。

マイトジェン分析と走化性分析： 精製した創傷液サ
ンプルのマイトジェン活性を次のようにして決定した。
NIH 3T3細胞（Grotendorst,1984）を集密になるまで10
％ウシ胎児血清でDMEMの48個のウエルプレート（Costa
r）中で培養し、その培地を2.5％ウシ胎児血清で使用12
時間前にDMEMに変えた。DMEM中のサンプルを各ウエルに
加え、DNA合成につき16時間後にトリクロロ酢酸沈降物
質中へ［³H］チミジンを組み入れて測定した。

コラーゲンでコーティングしたポリカーボネートフィ
ルタ（Nuclepore;8−μｍ−孔径）を使って、前述した
ように（Grotendorst、1987）変形ボイデンチェンバー
中で走化性分析を行った。分析は４時間無血清のDMEM含
有ウシ血清アルブミン中で2.0mg/mlで行った。フィルタ
を通って移動した細胞から抽出したステインの600nmの
吸光度を測定することで走化性応答について測量した。

結果 ヒト創傷液中のPDGF関連ペプチド： ヒト創傷液中のPDGF関連ペプチドをウエスタンブロッ
ト分析すると、２つの異なる分子塊種［molecular mass
species］（16−17kDaと34−36kDa）を露出させた。こ
のウエスタンブロットは16−kDaおよび17−kDaのペプチ
ドが手術後の第１日目の液中で最も高濃度であるが、手
術後７日で減少することを示している。逆に、高分子量
塊ペプチド（34−36kDa）は僅量、創傷治癒の初期段階
にあるが、４日および５日後に増加し、７日までに減少
する。こうした知見は創傷液を検査された６人の患者各
々に本質的に同様であった。16−kDaから17−kDaの産生
物は、活性化マクロファージから標準精製されたマクロ
ファージ由来の成長因子（PencevとGrotendorst,1988）
と共に移動するので、マクロファージから来るもののよ
うである。34−から36−kDaの産生物はPDGFと共に移動
しないのであって、我々はこのペプチドがどこに由来す
るのか不明である。

多クローン抗ヒトPDGFの特異性は、組換えヒトAB PD
GFとの抗体の阻止［block］の研究から明らかにされ
る。Ａ Ｂヘテロダイマーの50ngを持つ第一抗体のプレ
インキュベーションは、創傷液中のPDGF関連ペプチドに
その抗体が結合することを完全に阻止する。この現象は
AAまたはBBホモダイマーを遮断薬［blocker］として使
っても同様に見られた。非免疫IgGはこの分析系ではど
のペプチドも検出しなかった。さらに、この多クローン
抗ヒトPDGFはPDGFに特異性でTGF−β（100ng）、ヒト上
皮成長因子（100ng）、または酸性繊維芽細胞成長因子
（100ng）に反応しない。創傷液は回収後最初の３日間
は赤色で、出血および凝固が損傷部位で起こっているこ
とを示した。驚くべきことに、創傷部位での血小板作用
があるにも拘わらず、検査した６組の創傷液サンプルの
どれひとつにもオーセンティックな30−kDa PDGFを検出
できなかった。

抗PDGFイムノアフィニティ精製の有効性： オーセンティック30−kDa PDGFの回収不能性を説明す
るいくつかのものは、（１）30−kDa PDGFが酵素消化に
より分解された、（２）イムノアフィニティ精製過程は
タンパク質に富む創傷液から抗原を拾い出すのに効果的
なものではない、（３）30−kDa PDGFはキャリヤタンパ
ク質に結合しているから抗体に近づくことができない、
というものである。これらの疑問によく注意してみる
と、既知量のPDGF（20ng/ml）が創傷液中に添加されて
いる。そのサンプルは24時間室温でインキュベーション
され、PDGF関連ペプチドが前述のイムノアフィニティ過
程を経て精製された。外来的に添加されたPDGFの回収は
＞90％で、創傷液中に存在する免疫反応性ペプチドの量
は、オーセンティックPDGFを追加するかしないかにより
違ってこない。こうした結果は、創傷液中に存在するPD
GFが、この単離過程で回収できるものなのか、また、創
傷液サンプル中のPDGF抗原量を２倍にすることは、ウエ
スタンブロット分析で判定されるPDGFまたはPDGF関連ペ
プチドの回収に影響を及ぼさないのであるから、使われ
たマトリックス量は十分なのかといった点を激しく問題
にする。

ヒト創傷液中のＡ鎖ペプチドおよびＢ鎖ペプチドの欠
乏： 創傷液中のPDGF関連ペプチドがPDGF Ａ鎖またはＢ鎖
からなるのかどうかを検査するため、第１日目の創傷液
から得た精製PDGF関連ペプチドの大部分を、PDGF Ａ鎖
またはＢ鎖に対する抗血清特異性を用いて分析した。こ
れら血清は、成熟Ａ鎖分子または成熟Ｂ鎖分子のいずれ
かのＮ末端配列に対応する30−mer合成ペプチドに対し
て産生したものである。これらの抗血清は鎖特異性で、
手をつけていないＡ鎖またはＢ鎖ペプチドいずれかの１
ないし2ngという微量でも検出できる。いずれの抗血清
も、PDGFの生物学的活性の20ngに等しい量を含有する第
一日目の創傷液サンプル中に、Ａ鎖またはＢ鎖ペプチド
を何も検出しなかった。こうした結果は、PDGFのＡ鎖ま
たはＢ鎖ペプチドは創傷液中に＜2ng/mlの濃度で存在し
なければならないこと、また、主要なPDGF関連の生物学
的活性は創傷液中のＡ鎖またはＢ鎖分子に原因を求める
ことはできないこと、を示唆している。

ヒト創傷液中のPDGF関連ペプチドの生物学的活性： PDGF関連ペプチドの量は、ウエスタンペプチドブロッ
トのデンシトメータースキャニングおよび生物学的分析
の両者を使って決定した。16−ないし17−kDaおよび34
−ないし36−kDa産生物の現出と不現出の速度論［kinet
ics］は各々非依存的であった。16−ないし17−kDaペプ
チドのレベルは手術後第１日目にピークに達し、７日目
までに殆ど検出不能な程度にまで指数的に減少した。こ
れと対照的に、34−ないし36−kDaの産生物は最初低レ
ベルで存在するだけであったが、その後増加し、手術後
５日および６日目にピークに達した。

全創傷液およびイムノアブソーブ［immunoabsorb］さ
れた小片の走化性活性とマイトジェン活性が検査され
た。イムノアフィニティ精製した小片のマイトジェン活
性は第１日目に最高で、手術後第４日目後は検出できな
いレベルへと減少した。これらのキネティックス［kine
tics］は、ウエスタンブロット分析で検査された16−な
いし17−kDaペプチドのそれと同一であった。全創傷液
のマイトジェン活性はイムノアフィニティ精製した小片
のそれとは異なるものであった。この活性は第５日目に
ピークに達し、その時の全マイトジェン活性はイムノア
フィニティ精製された物質のそれより大きかった。この
ように多様なマイトジェン活性が創傷液に存在し、その
うち一部だけが免疫学的にPDGFに関係しているにすぎな
い。

全創傷液とイムノアフィニティ精製された小片の走化
性活性も検査された。マイトジェン活性同様、イムノア
フィニティ精製された小片の走化性活性量は、ウエスタ
ンブロット分析で測定した16−ないし17−kDaペプチド
の日毎の変化に関連していた。この活性は第１日目にピ
ークに達し、その後減少した。

創傷液からの精製PDGF関連ペプチドの走化性活性は、
コンペティティブアッセイにおいて組換えPDGFで処理さ
れた（表１）。第１日目の創傷液からのPDGF関連ペプチ
ドは、上室中で組換えPDGF BBホモダイマーのないNIH
3T3細胞により強い走化性応答を引き出した。しか
し、PDGF BBホモダイマー25ng/mlが上室に加えられる
と、化学誘引物質の濃度勾配を減少させ、免疫精製因子
に応答して下室へと移動する細胞はなかった。こうした
データは、免疫精製された走化性因子がおそらくはPDGF
受容体に活動していることを示唆した。

創傷液のアシドエタノール抽出物中に存在の活性は、
手術後第４日目に活性はピークに達し、イムノアフィニ
ティ精製PDGF関連ペプチドのものとは異なるキネティッ
クスを見せた。このようにマイトジェン活性と同様、多
様な走化性活性があるようであり、あるものはPDGF様
で、他のものはそうでない。

PDGF様走化性活性とマイトジェン活性は、オーセンテ
ィック血小板PDGF（PencevとGrotendorst,1988）由来で
はなく、マクロファージ由来のPDGF関連ペプチドに類似
の因子により主として仲介されるようである。この因子
がマクロファージによって独占的に産生されるのかどう
かについては未だ明確でない。我々の研究所での最近の
研究は、好中球が同様の因子を産生することができるこ
とを発見している。もっともマクロファージ由来の成長
因子とこの因子との関係は現在の所未だ不明である。そ
れにも拘わらずマクロファージは、創傷治癒応答を制御
するのに中心的役割を演ずると長い間考えられてきたの
であり（Leibovitch Ross,1975;Diegelmannら、198
0）、創傷液中に見た所マクロファージ関連産生物らし
きものが高レベルに見つかることは予想できないことで
はない。創傷液中にオーセンティックPDGFペプチドが何
も存在しないことは驚くべきことであった。こうしたペ
プチドが分析感受性以下の量しかないのか、あるいは痕
跡程度の量はあるのかは明らかでない。もしオーセンテ
ィックPDGFペプチドが創傷液中に低レベルで存在するな
ら、全PDGF関連生物学的活性の＜10％であることを説明
するにちがいない。オーセンティックPDGFがある方法で
マスクされているか、または上記の単離過程で分解［de
grade］してしまうのかは、加えられるPDGFが創傷液サ
ンプルから＞90％の効率で回収されるのであるから、考
えにくい所である。おそらくPDGFのＡ鎖ペプチドとＢ鎖
ペプチドは、細胞外マトリックスまたはフィブリン凝固
物と支配的に関連しており、したがって溶解が簡単でな
いのであろう。あるいは、オーセンティックPDGFが組織
エレメントにより組織修復部位で急速に消費されるとも
考え得る。

修復応答の後期期間中に集められた創傷液における走
化性活性とマイトジェン活性の有意的比率は、PDGF関連
ペプチドのイムノアブソープション［immunoabsorptio
n］による枯渇後に維持された。互いに類似関係にある
未処理創傷液またはアシドエタノール抽出物におけるマ
イトジェン活性と走化性活性は、イムノアフィニティ精
製物質の活性とは異なる外観上の時間経過を見せる。こ
れらの活性は16−ないし17−kDaのPDGF関連ペプチドの
レベルが減少する後期の日々にピークレベルに達するも
ので、それらの因子がおそらく、PDGF関連ペプチドを産
生するものとは異なる細胞型によって産生されているこ
とを示している。このようにPDGFとは顕著に異なるマイ
トジェン因子と走化性因子が創傷液中にも存在し、修復
過程の後期制御に本質的役割を演じていると思われる。

以上の結果は、ヒトの通常の創傷治癒部位にPDGF関連
ペプチドが存在することを示している。類似するペプチ
ドが、腹水液および慢性アルコール性肝硬変の患者から
得た肝臓生検組織の両者に見つかった。この障害［diso
rder］は肝臓の慢性的炎症とこの部位における単核細胞
の大きな蓄積物に特徴つけられるので、マクロファージ
由来の成長因子もフィブロティック症状初期の原因成分
であろうと考えられる。このように、マクロファージの
ような細胞型は、通常の修復期間中および外傷後の組織
再生期間中におけるPDGF関連成長因子の産生に重要に関
わっており、また類似の因子がアテローム性動脈硬化、
関節炎、肺繊維症および肝硬変のようなフィブロティッ
ク障害中の結合組織形成を刺激しているように考えられ
る。

例3: LDGF関連cDNAの単離と特性 活性化した（LPS処理［1/ug/ml］24時間）ヒト末梢血
液単球から得た全RNAをChugauinらの方法（Biochemistr
y;18:5294−5299;1979）で調製した。ポリＡ＋を有する
mRNAをオリゴディティ［oligo dt］セルロースクロマト
グラフィで単離した。存在する全てのmRNAのcDNAコピー
をPharmaciaから購入のcDNAライブラリ構築キットを使
って構築した。次にそのcDNAをブラントエンドし、その
エンドにEcoR1アダプターを付加させた。cDNAを低溶解
アガロース電気泳動で単離し、長さが800塩基対より長
いcDNAを低溶解アガロース電気泳動で集め、ラムダgt 1
1発現ベクターにパッケージした。この遺伝子ベクター
は、それがβガラクトシダーゼプロモーターに制御さ
れ、適当な刺激が細菌培養培地に加えられたときは、こ
のプロモーターがβガラクトシダーゼのＮ末端を含む融
合タンパク質の合成を活性化し、cDNAでコードされたそ
のタンパク質配列のＣ末端がそのファージゲノム中にパ
ッケージされるように、cDNA挿入物を適切な部位にパッ
ケージする。ファージゲノムにつきただ一つのcDNA配列
だけがパッケージされる。

次に発現ライブラリを我々がヤギで調製した抗PDGF抗
体でスクリーンし、一定条件培地でLDGFを同定するため
使用した。全部で800,000の組換えファージをスクリー
ンしたが、ただ一つのファージがその抗体に反応する融
合タンパク質を産生した。このファージをプラーク精製
し、挿入物をEcoR1制限エンドヌクレアーゼを使って切
断した。我々の制限断片からして、挿入物が約300塩基
でEcoR1リンカーの一つから内EcoR1部位を有することが
明らかである。

次に、EcoR1による部分消化を使い、その手をつけて
いない挿入物の多数の組換え体をスクリーンして、M13
中に手をてつけていない挿入物をサブクローンした。デ
オキシ法を使って、いくつかのプラークを１本鎖DNA配
列をさせるため採取した。DNA配列分析は、384塩基（図
１）の単一の読み取り枠を有する675塩基対の挿入物お
よび予想された内部EcoR1部位を露呈した。この配列が
あるGenbankライブラリのサーチは、これが特殊な配列
であることを示し、成長遺伝子によりコードされるタン
パク質に40％の相同性を示した（図２）。このことはcD
NAがCTAP−III遺伝子ファミリーに関係していることを
示している。上記読み取り枠をPC−GENEプログラムで翻
訳し、データベース中の配列と比較した。そのタンパク
質配列は３つの既知のタンパク質、すなわち血小板ベー
スのタンパク質（PBP）、CTAP−IIIまたはLA−PF4およ
びβトロンボグロブリン（βTG）と同一の領域を示し
た。しかし予想されたLDGF配列は、付加的な34アミノ酸
をPBP関連配列のＮ末端に有していた。CTAP−IIIとβTG
は、PBPのタンパク質分解産生物であると考えられてい
る。実際、βトロンボグロブリンは古くなった血小板の
マーカーとして使われている。我々のテストによれば、
PBP、LA−PF4、βTGのいずれも生物学的活性または免疫
学的活性を少しも見せなかった。このようにLDGFタンパ
ク質のＮ末端にある付加的なアミノ酸は、その生物学的
活性にとって必須なもののようである。マイクロコンピ
ュータプログラム（GENEPRO,Riverside Scientific）を
使ったとき、もし分子構造に中性な一定のアミノ酸の代
替物を含ましめるなら、LDGFとPDGFのＢ鎖分子の領域と
の間には25％の相同性があることが示されている（図
３）。重要なことは、LDGF配列中の５つのシステイン残
基のうち３つはPDGFのＢ鎖タンパク質中のシステインと
並んでいることである。さらに、LDGFとPDGF−Ｂ鎖の親
水性領域ならびに疎水性領域を反映する水治療法スロッ
トの比較は、手をつけていないLDGF分子が、PDGFにつき
見られる縦断面図［profile］と非常に類似したものを
もっていることを示している。こうした類似性は抗体と
受容体との結合交差反応性についての説明的根拠となり
得るもので、構造上の同一領域を共有する分子ループが
あることを示唆している。

LDGFは共に活性化されたマクロファージと好中球によ
って産生される。さらに、ひとの治癒過程にある外科的
創傷部位から集めた液を分析したとき、LDGFが創傷液中
の主要なPDGF様因子であること、およびオーセンティッ
クPDGFは存在しないことが発見された（例２）。LDGF
は、皮膚創傷および整形外科的創傷（骨融合［bone fus
ion］）などの通常の創傷が治癒過程にあるときどんな
型のものでも存在する。

重要なことは、糖尿病患者、ステロイド処置されたリ
ューマチ患者、および末梢循環系疾患の患者に生ずる非
治癒皮膚潰瘍から集めた創傷液が分析されたが、今日ま
で検査されたすべての場合に、通常の治癒過程にある患
者につきテストしたものと同じ量を使ったサンプル中に
はPDGF様生物学的活性もLDGF免疫反応性も検出されなか
ったことである。こうした結果は、治癒阻害の患者の損
傷部位にLDGFが欠乏していることを暗示している。この
物質は、慢性アルコール性肝硬変の患者の肝臓組織に存
在するものであるが、正常な肝臓組織または肝細胞癌の
ようなフィブロティック複合物を生成しない病変肝臓組
織には存在しない。

参考文献 Antoniades,H.N.,Scher,C.D.,Stiles,C,D.（1979）．
ヒト血小板由来成長因子の精製。Proc.Natl.Acad.Sci.
（USA）,76 1809−1813. Baird.A.,Wornede.P.,Bohlen,P.（1985）．腹腔滲出
細胞中の免疫反応性繊維芽細胞成長因子は、マクロファ
ージ由来の成長因子との同一性を示唆する。Biochem.Bi
ophys.Res.Commun.,126,358−364. Barret,T.B.,Gajdusek,C.M.,Schwartz,S.M.,McDougal
l,J.K.＆ Benditt,E.P.（1984）Proc.Natl.Acad.Sci.
（USA），81,6772−6774. Betsholtz,C.,Johnsson,A.,Heldin,C.H.,Westermark,
B.,Lind,P.,Urdea,M.S.,Eddy,R.,Shows,T.B.,Philpott,
K.,Mellor,A.L.,Knott,T.J.,Scott,J.（1986）.cDNA配
列とヒト血小板由来成長因子Ａ鎖の染色体局在化、およ
びその腫瘍細胞系における発現。Nature,320,695−699. Bittermann,P.B.,Rennard,S.I.,Hunninghake,G.W.,Cr
ystal,R.G.（1982）．繊維芽細胞のためのヒト胞状マク
ロファージ成長因子：制御法および一部的特徴。J.Cli
n.Invest.,70,806−822. Collins,T.,Bonthron,D.T.,Orkin,S.H.（1987）．代
替的RNAのスプライシングは、コードされた血小板由来
成長因子Ａ鎖の機能に影響する。Nature,328,621−624. DeLarco,J.E.＆ Todaro,G.J.（1978）.Proc.Natl.Aca
d.Sci.（USA），75,4001−4005. DeLustro,F.,Sherer,S.K.,and LeRoy,E.C.,（198
0）．溶解性仲介物による繊維芽細胞のヒト単球刺激。
J.Reticuloendoethel.Soc.,28:519−532 Diegelmann,R.E.,Cohen,I.K.＆ Kaplan,A.M.（1980）
Plastic Reconstr.Surg.,68,107−113. Doolittle,R.F.,Hunkapiller,M.W.,Hood,L.E.,Devar
e,S.G.,Robbins,K.C.,Aaronson,S.A.,and Antoniades,
H.N.（1983）．サル肉腫ウイルス腫瘍遺伝子、ｖ−sis
は、血小板由来の成長因子をコードする遺伝子に由来し
ている。Science,221,275−277. Douglass,J.,Cirelli,O.,and Herbert,D.（1984）．
タンパク質遺伝子の発現：神経分泌ペプチドの分化生
成。Annu.Rev.Biochem.,53,665−671. Estes,J.E.,Pledger,W.J.,and Gillespie,G.Y.（198
4）．マクロファージ由来の成長因子とインターロイキ
ン１は別個の存在である。J.Leuk.Biol.,35,115−129. Giese,N.A.,Robbins,K.C.,and Aaronson,S.A.（198
7）ｖ−sis遺伝子産生物の構造と機能における個々のシ
ステイン残基の役割。Science 236,1315−1318. Glenn,K.,and Ross,R.（1981）．間葉細胞のヒト単球
由来成長因子：内毒素とコンカナバリンＡによる分泌の
活性化。Cell,25,603−615. Grotendorst,G.R.,Pencev,D.,Martin,G.R.＆ Sodek,J
r.（1984）硬軟組織の修復。Hunt,T.K.,Heppenstall,R.
B.,Pines E.＆ Rovee,D.（Praeger,New York）,pp.20−
44. Grotendorst,G.R.（1984）.NIH/3T3細胞のPDGFに対す
る走化性応答の成長因子、形質転換および腫瘍プロモー
ターによる変更。Cell,36,279−285. Grotendorst,G.R.（1987）．ボイデンチェンバー走化
性分析における細胞移動量の分光光度計による分析。Me
thods Enzymol.,147,144−152. Grotendorst,G.R.,Harvey,A.K.,Nagarajan,L.,Anders
on,W.B.＆ Gatewood,E.（1988）J.Cell Physiol.,134,4
37−444. Grotendorst,G.R.,Seppa,H.E.,Kleinman,H.K.,and Ma
rtin,G.R.（1981）平滑筋細胞のコラーゲンへの付着お
よび該細胞の血小板由来成長因子への移動。Proc.Natl.
Acd.Sci.（USA），78,3669−3672. Grotendorst,G.R.,Chang,T.,Seppa,H.E.,Kleinman,H.
K.,and Martin,G.R.（1982）．血小板由来成長因子は、
血管の平滑筋細胞の化学誘因物質である。J.Cell Physi
ol.,113,261−266. Grotendorst,G.R.,Seppa,H.E.,Kleinman,H.K.,＆ Mar
tin,G.R.（1981）Proc.Natl.Acad.Sci.（USA），78,366
9−3672. Heldin,C.H.,Westermark,B.,and Wasteson,A.（198
1）．血小板由来成長因子：大規模工程による単離法と
サブユニット成分の分析。Biochem.J.,193,907−913. Heldin,C.H.,Johnsson,A.,Wennegren,S.,Wernstedt,
C.,Betsholtz,C.,and Westermark B.（1986）．ヒト骨
肉腫細胞ラインはPDGF Ａ鎖のホモダイマーに構造的に
関係している成長因子を分泌する。Nature,319,511−51
4. Johnsson,A.,Heldin,Ch.H.,Westermark,B.,and Waste
son,A.（1982）．血小板由来成長因子：構造ポリペプチ
ド鎖の同定。Biochem.Biophys.Res.Commun.,104,66−7
4. Kyhse−Andersen,J.（1984）．多様なゲルの電気ブロ
ッティング：ポリアクリルアミドからニトロセルロース
へのタンパク質の急速なトランスファーのためのバッフ
ァタンクなしの単一機器。J.Biochem.Biophys.Methods,
10,203−209. Laemmli,U.K.（1970）．バクテリオファージT4のヘッ
ドの分析中における構造タンパク質の切断。Nature,22
7,680−685. Lawrence W.T.,Sporn,M.B.,Gorshboth,C.,Norton,J.
A.＆ Grotendorst,G.R.（1986）Ann.Surg,203,142−14
7. Leibovich,S.J.＆ Ross,R.（1975）Am.J.Pathol.,84,
71−100. Leibovich,S.J.,and Ross,R.（1976）．インヴィトロ
での繊維芽細胞の増殖を刺激するマクロファージ依存性
因子。Am.J.Pathol.,84,501−554. Martinet,Y.,Bitterman,P.B.,Mornex,J.−F,Grotendo
rst,G.R.＆ Crystal,R.G.（1986）．活性化されたヒト
単球はｃ−sisの主要な腫瘍遺伝子を発現し、PDGF様活
性を示す仲介物を放出する。Nature（London），319,15
8−160. Mornex,J.−F.,Martinet,Y.Yamauchi,K.,Bitterman,
P.B.,Grotendorst,G.R.,Chytil−Weir,A.,Martin,G.R.,
and Crystal.,R.G.（1986）．ヒト細胞マクロファージ
によるｃ−sis遺伝子の自然発現と、血小板由来成長因
子様分子の放出。J.Clin.Invest.,78,61−66. Pencev,D.＆ Grotendorst,G.R.（1988）Oncogene Re
s.,３,333−342. Pledger,W.J.,Stiles,C.D.,Antoniades,H.N.＆ Sche
r,C.D.（1977）Proc.Natl.Acad.Sci.（USA），74,4481
−4485. Roberts,A.B.,Lamb,L.C.,Newton,D.L.,Sporn,M.B.,De
Larco,J.E.,and Todaro,G.J.（1980）成長因子の形質転
換：ウイルス的、化学的に形質転換した細胞からポリペ
プチドをアシド／エタノーツ抽出物で単離すること。Pr
oc.Natl.Acad.Sci.（USA），77,3494−3498. Robbins,K.C.,Antoniades,H.N.,Devare,S.G.,Hunkapi
ller,M.W.,and Aaronson,S.A.（1983）．サル肉腫ウイ
ルス遺伝子産生物と、ヒト血小板由来成長因子との間の
構造的、免疫学的類似性。Nature,305,605−608. Ross,R.,＆ Benditt,E.P.（1961）J.Biophys.Bioche
m.Cytol.,11,665−677. Schmidt,J.A.,Mizel,S.B.,Cohen,D.,and Green I.（1
982）．繊維芽細胞増殖のポテンシャルレギュレータで
あるインターロイキン１。J.Immunol.,128,2177−2182. Seppa,H.E.,Grotendorst,G.R.,Seppa,S.,Schiffmann,
E.＆ Martin,G.R.（1982）J.Cell Biol.,92,584−588. Shimokado,K.,Paines,E.W.,Madtes,D.K.,Barrett,T.
B.,Benditt,E.P.,and Ross,R.（1985）．マクロファー
ジ由来成長因子の重要部分はPDGFの少なくとも２つのフ
ォームからなっている。Cell,43,277−286. Takehara,K.,Grotendorst,G.R.,Silver,R.＆ Leroy,
E.C.（1987）Arteriosclerosis,７,152−158 Tong,B.D.,Auer,D.E.,Jaye,M.Kaplow,J.M.,Picca,G.,
McConathy,E.,Drohan,W.,and Deuel,T.F.（1987）.cDNA
クローンはヒトグリア細胞とヒト内皮細胞の血小板由来
成長因子Ａ鎖間の相違を露呈する。Nature,328,619−62
1. Tsukamoto,Y.,Helsel,W.E.,and Wahl.S.M.（1982）フ
ィブロネクチンのマクロファージ生成、繊維芽細胞の化
学誘因物質。J.Immunol.,127,673−678 Vogel,A.E.,Raines,E.,Kariya,B.,Rivest,M.−J.＆ R
oss,R.（1978）Proc.Natl.Acad.Sci.（USA），75,2810
−2814. Waterfield,M.D.,Scrace,G.T.,Whittle,N.,Strooban
t,P.,Johnsson,A.,Wasteson,A.,Westermark,B.,Heldin,
C.H.,Huang,J.S.,and Deuel,T.F.（1983）．血小板由来
成長因子は、サル肉腫ウイルスの推定上の形質転換タン
パク質p28sisに構造的に関係している。Nature,304,35
−39. 走化性は上記の通りに分析された。正PDGFの中和、すな
わちPDGFを上室へ加えることによる創傷液因子濃度の下
室への傾斜は、下室への細胞移動を阻止した。濃度25ng
/mlまでの上皮成長因子（EGF）、酸性繊維芽細胞成長因
子（FGF）、TGF−βなどの他の成長因子は細胞のPDGFへ
の移動を阻止しなかった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 ＢＬＯＯＤ，Ｖｏｌ．73，Ｎｏ．６, （1989），ｐ．1498−1503 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/12 - 15/28 A61K 38/17 - 38/42 A61P 17/02 C07K 14/435 - 14/825 C12P 21/02 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｐ ＩＲ／ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ)

Claims (7)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】走化性活性および／またはマイトジェン活
   性を持ち、かつ、下記のアミノ酸配列で一または数個の
   アミノ酸が置換、欠失、挿入、または付加されたアミノ
   酸配列を含む、LDGFポリペプチドの非天然型アナログを
   含む創傷治療剤。
2. 【請求項２】走化性活性および／またはマイトジェン活
   性を持ち、かつ、下記のアミノ酸配列で一または数個の
   アミノ酸が置換、欠失、挿入、または付加されたアミノ
   酸配列を含むLDGFポリペプチドの非天然型アナログと、
   薬学許容的キャリヤとを有する創傷治療組成物。
3. 【請求項３】走化性活性および／またはマイトジェン活
   性を持つポリペプチドから成る、創傷治療剤の製造方法
   であって、 繊維芽細胞に対する走化性活性および／またはマイトジ
   ェン活性を持ち、かつ、下記のアミノ酸配列で一または
   数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、または付加された
   アミノ酸配列を含む、ポリペプチドをコードする組換え
   DNA分子で形質転換された細胞培養組織を、前記ポリペ
   プチドを発現させる条件で培養することを特徴とする製
   造方法。
4. 【請求項４】前記組換えDNA分子が、繊維芽細胞に対す
   る走化性活性および／またはマイトジェン活性を持ち、
   かつ、下記のアミノ酸配列で一または数個のアミノ酸が
   置換、欠失、挿入、または付加されたアミノ酸配列を含
   むポリペプチドと、その構造遺伝子に操作可能に結合し
   たプロモーターとをコードすることを特徴とする請求項
   ３に記載の製造方法。
5. 【請求項５】前記プロモーターと構造遺伝子の連結の仕
   方が天然型と異なる請求項４に記載の製造方法。
6. 【請求項６】下記のアミノ酸配列を有する天然型LDGFよ
   りタンパク質分解に感受性の少ないポリペプチドを与え
   るように、前記天然型のLDGFの位置35および36のセリン
   を突然変異させることにより、プロテアーゼ切断部位を
   変更した点で少なくとも天然型LDGFから区別されるポリ
   ペプチド。
7. 【請求項７】下記のアミノ酸配列を有する天然型LDGFよ
   りタンパク質分解に感受性の少ないポリペプチドを与え
   るように、前記天然型のLDGFの位置44のアスパラギンを
   突然変異させることにより、プロテアーゼ切断部位を変
   更した点で少なくとも天然型LDGFから区別されるポリペ
   プチド。