JPH04501860A - コロニー刺激因子活性のプロモーター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 コロニー刺激因子活性のプロモータ一 本発明に関する研究は部分的にナシロナル・インスチチュート・イソ・ヘルスお よびロックフ゛エラー財団からの補助金で行なわれた。 （関連分野） 造血幹細胞および前駆細胞から始まる骨髄血液細胞産生は補助細胞群ネットワー クにより調節される。プロクスメイヤー（Ｂｒｏｘ−＊ｅｙｅｒ）、　Ｈ，Ｅ、 およびウィリアムス（ｌｌｉｌｌｉａｍｓ）、　ｏ、　Ｅ、ど骨髄血液細胞およ び健康と病気におけるそれらの調節”ＣＲＣＣＲＩＴ。 Ｒｅｖ、　０ＮＣＯＬ、／ＨＥＭＡＴＯＬ、８　：　１７３　（１９８５）　、 補助細胞は生体分子またはサイトカインを放出し、次にそれらが直接的に造血幹 細胞および前駆細胞に、または間接的に他の補助細胞への作用を介して作用し得 る。特定のサイトカインが血液細胞産生の調節に関与していると考えられている 。それらには造血細胞コロニー刺激因子（Ｃ３Ｆ）：顆粒球−マクロファージ（ ＧＭ）−Ｃ３Ｆ。 マクロファージ（Ｍ）−Ｃ３ＦまたはＣ３Ｆ−１顆粒球（Ｇ）−Ｃ３Ｆ、マルチ Ｃ３Ｆ（インターロイキン（ＩＬ）−３とも呼ばれる）およびエリスロポイエチ ン、ＩＬ−１がらＩＬ−６、腫瘍壊死因子−アルファおよびベータ、インターフ ェロン−アルファ、ベータおよびガンマ、トランスホーミング増殖因子−ベータ 、Ｅ型プロスタグランジン１および２、ラクトフェリン、酸性イソフェリチン、 アクチビンおよびインヒビンなどが含まれる。各サイトカインは１つ以上の細胞 型に作用し得、かつ１つ以上の効果を持ち得る。新しいサイトカインが報告され つづけており、先に報告されているサイトカインに対してと同様新しい機能がそ れらに帰属されている。 （概　要） 本発明に従かい特定の物質のコロニー刺激因子（Ｃ３Ｆ）活性に関する促進効果 が測定される。この活性を有することが測定された物質には審査中の出願第２３ ８，９３７号および第２４０．０７８号で公開されている２種の炎症性サイトカ インの活性を有するサイトカインが含まれる。これらの物質は米国特許第４，６ ０３．１０６号に公開された仲介物質の新しく発見された単離物であり、精製さ れたたんばく質である。本発明のサイトカインは高塩濃度においてさえもヘパリ ンと結合し、かつ皮下注射した場合に多形核細胞侵入を特徴とする局所的炎症を 誘導する付加的能力を示す。 特に２つの特異的な先に同定されたサイトカイン、ＶＩＰ−１およびＭＩＰ−２ は準至適濃度の既知コロニー刺激因子で刺激した正常なマウスおよびヒトの骨髄 由来の顆粒球−マクロファージ前駆細胞（ＣＦＵ−ＧＭ）のコロニーおよびクラ スター形成活性に関する促進効果を示す。 本発明の第１の特徴は造血性コロニーおよびクラスター形成の促進、高塩濃度下 でのヘパリン結合および皮下注射したときの局所的炎症の誘導が可能なサイトカ インを含む骨髄血液細胞産生促進試薬を示していることである。また本発明は本 発明の試薬、または適当なものがあれば適当な結合パートナ−および医薬的に許 容可能なキャリヤーを含む医薬組成物に関する。 第２の特徴は本発明の試薬または医薬組成物を含む骨髄血液細胞コロニーおよび クラスター形成促進試薬を適当量投与することを含む骨髄血液細胞産生促進方法 にある。 医薬組成物は本発明に従って調製され、適当量の本発明の試薬および医薬的に許 容可能な希釈剤またはキャリヤーを含む、この試薬は少なくとも１００ｎｇ／ｓ ｊ！、好ましくは約１００ｎｇ／ｅ＋ｊから約２００ｎｇ／ｍＩ！供給するのに 適した量存在することが望ましい、細胞産生に影響する血液病を同定するなど造 血細胞の産生をうまくモニターできる場合は、本発明は本発明の試薬の活性の測 定法にも関する。この方法にはそのような病気にかかった患者の骨髄サンプルの 採取およびそのサンプルと適当な検出可能な標識を有する一定量の本発明の試薬 とのインキュベーションを含む。 その後このサンプルについてその異常な細胞活性がコロニー刺激因子の存在また は活性の欠失によるものかどうかを測定し、またそれによりそれらの病気の原因 を単離および同定し得る。したがって本発明は本発明の試薬を含む適当なテスト キットに拡張することができる。 さらにある態様において本発明は本発明の試薬の活性あるいは同活性を有するこ とが測定された他の試薬または薬剤に基づく特定の治療法に関する。哺乳類にお ける骨髄血液細胞産生の促進に基づく治療法には骨髄コロニー刺激因子活性を促 進し得る試薬またはそのＲ４Ｑ物質を宿主における血液細胞生産の促進に効果的 な量、個々にまたはそれらの混合物として投与することが含まれる。 より特別な場合、一般にここで述べている治療法には適当量の本発明の試薬また は他の等価な薬剤を含む医薬組成物の投与による骨髄血液細胞生産機能障害の治 療法が含まれる。 したがって本発明の基本的目的は造血細胞コロニー刺激因子活性を促進すること により骨髄血液細胞生産を促進する試薬を提供することである。 さらに本発明の目的は先に述べたような試薬で、さらに血液細胞生産における病 気を評価するのに使用できるものの活性の測定法を提供することである。 さらに本発明の目的は本発明の試薬またはその結合パートナ−を含む、もしくは それらに基づく治療法で使用するための医薬組成物を提供することである。 またさらに本発明の目的は本発明の試薬または先に述べた医薬組成物を投与する ことによる骨髄血液細胞生産の促進法を提供することである。 さらに本発明の目的は先に述べた医薬組成物の投与による骨髄血液生産病を治す ための哺乳類の治療法を提供することである。 他の目的および利点は以下の図式を参照しながら進められている説明から当業者 には明白であろう。 （図の簡単な説明） 第１図はＭＩＰ−１およびＭＩＦ−２の骨髄活性化に関する抗ＭＩＰ−１および 抗ＭＩＰ−２抗体の影響を示している。ＭＩＰの調製物をコントロール培地また は抗ＭＩＰと室温で１時間半インキュベーションし、その後ｎｍｕＣＳ　Ｆ　− １またはｒｍｕ　Ｇ　Ｍ　−Ｃ３Ｐの存在下５ＸｌＯ’ＢＤＦ＋骨髄細胞／−を 含む培養皿に添加した。ＭＩＰ−Ｌ　ＭＩＰ−２、抗ＭＩＰ−１＋ＭＩＰ−２お よび抗ＭＩＰ−２＋ＭＩＰ−１についてコロニーおよびクラスター形成に有意な 増加が認められた（ｐ＜０．００１）。他の値はコントロールと有意な差はなか った（ｐ＞０．０５）第２図はｎｍｕｃｓＦ−１またはｒｍｕＧＭ−ＣＳＦで刺 激した精製マウスＣＦＵ−ＧＭのコロニーおよびクラスター形成に関するＭＩＰ −１およびＭＩＰ−２の影響を示している。マウスＣＦＵ−ＧＭは先に報告され ている方法に従がって精製した（ウィリアムス（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）、　Ｄ、　 Ｅ、等、　ＢＸＰ、　ＨＢＭＡＴＯＬ、１５　：　２４３（１９８７）　）。 （詳細な説明） 第１の特徴として本発明は骨髄血液細胞生産の促進に関係すると考えられている 特定のクラスのサイトカインの同定に関する。 特に造血活性のプロモーターには造血細胞コロニー刺激因子活性を促進し、高イ オン強度においてもヘパリンに結合し、かつ皮下注射されたとき多核細胞侵入を 特徴とする局所的炎症を誘導するという共通した性質を有する特定のグループの サイトカインが含まれる０問題のサイトカインはＭＩＰ−１およびＭＩＰ−２と 同定され、またそれらの起源、構造および活性の詳説は共通に譲渡された特許出 願第２３８．９’３７号および２４０．０７８号に述べられている０両出願の公 開物は参考として引用している。 ＭＩＰ−］およびＭＩＰ−２は配列が推定されているたんばく賞を含む。特にＶ ＩＰ−１はマウスで決定された以下に示すアミノ酸配列を示す２つの精製された ペプチド酸物を含むことが知ら八ＬＡ　ＰＲＯＴＹＲＧＬＹ　ＡＬＡ　ＡＳＰ　 ＴＨＲＰＲＯＴＨＲＡＬＡ　ＣＹＳ　ＣＹＳ　ＰＨＥ　５ＥＲＴＹＲＳＥＲＡＲ Ｇ　ＬＹＳ　ＩＬＥ　Ｐｌ？ＯＡＲＧ　ＧＬＮ　ＰＨＥ　ＩＬＥ　ＶＡＬ　ＡＳ Ｐ　ＴＹＲＰＩＩＥＧＬＵ　ＴＨＲＳＥＲＳＥＲＬＥＤ　ＣＹＳ　ＳＥＲＧｌ、 Ｎ　ＰＲＯＧＬＹ　ＶＡＬ　ＩＬＢ　ＰＩＩＥ　ＬＥｔｌＴＨＲＬＹＳ　ＡＲＧ 　ＡＳＮ　ＡＩＩＧ　ＧＬＮ　ＩＬＥ　ＣＹＳ　ＡＬＡ　ＡＳＰ　ＳＥＲＬＹＳ 　ＧＬＩＩ　Ｔ）ＩＲＴＲＰ　ＶＡＬ　ＧＬＮ　ＧＬＵ　ＴＹＲＩＬＨＴＨＲＡ ＳＰ　ＬＥＵ　ＧＬＵ　ＬＥＤ　ＡＳＮ　ＡＬＡＭＩＰ−１β ＡＬＡ　ＰＲＯＭＥＴ　ＧＬＹ　ＳＥＲＡＳＰ　ＰＲＯＰＲＯＴＨＲＳＥＲＣＹ Ｓ　ＣＹＳ　ＰＨＥ　５ＥＲＴＹＲＴＨＲＳＥＲＡＲＧ　ＧＬＮ　ＬＥＤ　Ｈｉ ｓ　ＡＲＧ　ＳＥＲＰＩＩＥ　ＶＡＬ　ＭＥＴ　ＡＳＰ　ＴＹＩＩＴＹＲＧＬＵ 　ＴＨＲＳＥＲＳＥＲＬＥＤ　ＣＹＳ　ＳＵＲＬＹＳ　ＰＲＯ＾ＬＡ　ＶＡＬ　 ＶＡＬ　ＰＨ［！ＬＥＵ　Ｔ）ＩＲＬＹＳ　ＡＲＧ　ＧＬＹ　ＡＲＧ　ＧＬＮ　 ＩＬＥ　ＣＹＳ　ＡＬＡ　ＡＳＮ　ＰＲＯＳＥＲＧＬＵＰＲＯ↑ＩＩＰ　ＶＡＬ 　Ｔｌ（ＩＩ　ＧＬ［Ｉ　ＴＹｉ？　ＭＥＴ　ＳＥＩ？　ＡＳＰ　ＬＥＩＩ　Ｇ ＬＵ　ＬＥＵ　ＡＳＮ同様にＭＩ　Ｐ−２はこれもマウスで決定された以下に示 すＮＦＩ。 末端部分アミノ酸配列を有することが分っている。 ＡＬＡ　ＶＡＮ、ＶＡＬ　ＡＬＡ　ＳＥＲＧＬＩＩ　ＬＥＵ　ＡＲＧ　Ｃ’ｌＳ 　Ｇｌ、Ｎ　Ｇ’ＷＳ　ＩＪυ　ＬＹＳ　ＴＲＩ？ＬＥＤ　ＰＲＯＡＲＧ　ＶＡ Ｌ　ＡＳＰ　ＰＩＥ　ＬＹＳ　ＡＳＮ　ＩＬＥ　ＧＬＮ　ＳＥＲＬＥＤ　ＳＥＲ ＶＡＬＴＨＲＰＲＯＰＲＯＧＬＹ サイトカインを単離できる物質または炎症性サイトカイン自身を発現する別の細 胞系列または他の生物についても本発明は関しており、これらに限定されるわけ ではない。したがって組換え技術などの別の手段も本発明に関するものであり、 先に参照した両方の親出願においても述べられている。 先にヘパリン結合たんば←質ＭＩＰ−１およびＭｒＰ−２はＣ３Ｈ／Ｈｅｊマウ スの足に皮下注射したとき局所的炎症応答を示すことが報告されている。ＭＩＰ −１はマウスに投与されたときト好中球のインビトロケモキネシスを誘導し、か つ粘着性好中球に過酸化水素を放出させ得る。ＭＩＰ−２は好中球に対しケモキ ネシス剤としてではなくケモタキシス剤として作用し、かつべ−タークルコロニ ダーゼではなくリゾチー・ムによる好中球の顆粒分解を誘導し得る。 本発明は炎症性サイトカインＭＩＰ−１およびＭＩＰ−２の一般的活性特性を有 する試薬が顆粒球−マクロファージ前駆細胞の活性に作用するという発見に基づ いている。ＭＩＰ−１およびＭ　Ｉ　＋）　−２は独立する造血細胞Ｃ３Ｆ活性 を欠くと考えられるが、それらは相加的以上にｎｌ＋ｕｃｓＦ−１およびｒｍｕ ＧＭ−Ｃ３Ｆで刺激されたマウス由来の骨髄ＣＦＵ−ＧＭおよびｒｈｕ　Ｇ　Ｍ 　−Ｃ５Ｐで刺激した正常ヒト由来の骨髄ＣＦＵ−ＧＭのコロニーおよびりラス ター形成を促進する。後に示される精製マウス骨髄ＣＦＵ−ＧＭを用いた実験は ＭＩＰ−１およびＭＩＰ−２の造血促進効果はＧＦＵ−ＧＭそれ自身に対する直 接的効果によるものであることを示している。ＤＦＵ−ＧＭに関するＭＩＰ−１ およびＭＩＰ−２の作用の正確な様式およびメカニズムが測定されなければなら ないが、その作用は細胞サイクルの８期に行なわれているか、または少なくとも 開始していると考えられる。ＭＩＰ−１およびＭＩＰ−２が直接ＣＦＵ−ＧＭに 作用し得るという事実はＭＩＰ−１およびＭＩＰ−２が補助細胞への作用を介し て造血作用を間接的に調節し得るという可能性は排除できない。 先に議論したように、本発明には先に述べた試薬、そのような試薬を含む組成物 、およびこれらの試薬および組成物を用いる治療法が含まれる。したがって、本 発明の試薬、またはそれらの結合パートナ−またはその他のリガンドは適当なキ ャリヤーとともに骨髄血液細胞生産病または障害を有する患者にそれらの治療を 目的として種々の手段で投与するのに効果的な量を用いて医薬組成物を調製する のに用いられる。種々の投与法が使用されるがそれらには体外骨髄処理または静 脈注射やカテーテル法などの非経口的方法がある。特にその試薬濃度は少なくと も約１００　ｎｇ／ｙ／が用いられ、好ましくは約１１００ｎ／−から約２００ ｎｇ／−が用いられる。その試薬の正確な投与量は担当医の判断に基づかなけれ ばならない。 またこの試薬に対する抗体や薬剤を作り、哺乳類による骨髄血液細胞の生産を調 節するのに適当な場合これらを用いる。特にこの試薬を使用したとえば融合マウ ス膵臓リンパ球およびミエローマ細胞を用いるハイブリドーマ技術など従来技術 により種々の哺乳類においてそれに対する抗体を作製する。この抗体を適当な医 薬組成物として調合し目的宿主に投与し得る。このような医薬組成物に関する正 確な投与量、投与間隔および投与方法は医学技術として知られているものに従が い、また担当医の診断に従がい決定される。 また本発明は造血細胞コロニー刺激因子活性を促進または阻害する本発明の試薬 またはその結合パートナ−の能力に関する骨髄血液細胞生産における病気または 障害を検出または研究するための方法を含む種々の診断に関する。先に述べたよ うに本試薬またはその結合パートナ−は適当に標識し、障害を有する哺乳類に由 来する骨髄サンプルと接触させ得る。その後このサンプルを試験し、標識化物質 の位置および状態、および該サンプルの一般的活性、すなわち血液細胞生産の増 減を測定する。 先に述べたように以下の例はここで取り上げた炎症性サイトカインＣ５Ｆ促進活 性の研究および同定に関する詳細を示している。 当然以後取り上げる特定の物質および技術は唯の例であり変化し得るものである 。従って以下の例は本発明を説明するものでありこれを制限するものではない。 （例Ｉ） インビトロにおけるＭＩＰ−１およびＶＩＰ−２の造血促進活性 一連の実験でサイトカインＭＩＰ−１およびＭＩＰ−２が何らかの形でコロニー およびクラスター形成に関するかどうかを決定した。したがって準至適濃度のｎ ｍｕｃｓＦ　１またはｒｓｕＧＭ−Ｃ３Ｆで刺激したマウス骨髄ＣＦＵ−ＧＭに よるコロニーおよびクラスター形成に関するＶＩＰ−１およびＶＩＰ−２の影響 に関し、それらを単独または合せて、かつ種々の濃度で用いて検定した。 （材料と方法） （細胞および細胞分離操作） カンバーランドヴユーファームス（Ｃｕｍｂｅｒｌａｎｄ　Ｖｉｅｗ　Ｆａｒｍ ｓ）社（クリントン、ＴＮ）から購入した退会４〜６オの（Ｃ５７Ｂ１／６ｘＤ ＢＡ／２）Ｆ＋　（ＢＤＦ、）雌マウスから大腿部骨髄細胞を入手した。この細 胞は未分離のまま、または先に報告されている方法を少し修正した方法で精製後 （ウィリアムス（Ｗｉｌｌｉａｗｓ）。 Ｄ、ε５等、ＥＸＰ、　ＨＢＭＡＴＯＬ、　ユニ　２４３　（１９８７））使用 した。 簡単に云えば精製ＣＦＵ−ＧＭは以下のように入手した。２００ｍｇ／ｋｇのシ クロホスホアミドをマウスにｉ、ｐ、注射し、３日後骨髄細胞を採取した後、フ ィコール−ハイバーク（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）　（ファルマシアファ インケミカルス、ピスカタウェイ、ＮＪ）による密度分画で低密度細胞（＜　１ ．０７７ｓｎ／ｄ）を得た。 この低密度細胞についてサンゾロンチャンバーを用い、１０℃ではなくむしろ３ ４℃での遠心分離による分離を行った０本実験においてＣＦＵ−ＧＭ含含有ピー クララクシ５ン先に報告されている沈降速度（２４−２８ｍｌ／ｓ＋ｉｎ）より も遅い沈降速度（１６〜２０ｍＺ／ｗｉｎ）で分離したがＣＦＵ−ＧＭの収量お よび純度は同しであった。 骨髄細胞はインディアナ医科大学のヒト研究委員会により設定されたガイドライ ンに従かう承認を受けた健康な提供者の背部腸骨上部からアスピレーションで入 手した。低密度骨髄細胞をフィコール−ハイバークで精製し培養した。 （生体分子および抗体） ロー（Ｒａｗ）　２６４．７細胞上清由来の天然のマウスＭＩＰ−１およびＭＩ Ｐ−２を先に報告されている方法により精製した（ウォルプ（Ｗｏｌｐｅ）、　 Ｓ、　Ｄ、、等Ｊ、ＥＸＰ、ＭＥＤ、、１６７　：　５７０（１９８８）：ダバ テリス（Ｄａｖａｔｅｌｉｓ）、　Ｇ、等Ｊ、　ＥＸＰ、　ＭＥＤ、。 １６７：１９３９　（１９８Ｂ）；シェリー（Ｓｈｅｒｒｙ）、　ａ、Ｉ等Ｊ。 ＥＸＰ、ＭＥＤ、、土工８．２２５１　（１９８Ｂ）；つｊＪＬｚプ（Ｗｏｌｐ ｅ）、　ｓ、　Ｄ、、等、ＰＲＯＣ，ＮＡＴＬ、ＡＣＡＤ、ＳＣＩ。 ＵＳＡ、８６：６１２　（１９８９））、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気 泳動によりＭＩＰ−１は〜８０００ダルトンの二本バンドとして、またＭＩＰ− ２は〜６０００ダルトンの１本バンドとして確認された０ｍｕおよびｈｕＧＭ− Ｃ３Ｆおよび−ｕｌＬ−４（各々比活性〜１０＠ユニット／ｍｇ）　（ブロクス メーヤー（Ｂｒｏｘｓ＋ｅｙｅｒ）、　Ｈ，ｔ＋、１等、、Ｊ、ＩＭＭＵＮＯＬ 、１４１　：３８５２（１９８８））およびｈｕｌＬ　６（比活性５　ｘ　ｌ　 Ｑ’　ユニット／ｍｇ）の組換え調製物はデビット・アーダル博士（叶、　Ｄａ ｖｉｄｔｌｒｄａｌ）およびスチーブン・ギリス博士（Ｄｒ、　５ｔｅｖｅｎ　 Ｇ１１ｌｉｓ）　（イムネソクス社、シアトル、ＷＡ）から提供していただいた 。天然のｍｕＣ５Ｆ−１（比活性２．３ＸｌＯ’ユニット／＃ｇ）はリチヤード −に、サダック博士（Ｒｉｃｈａｒｄ　Ｋ、　５ａｄｄｎｃｋ）　（ビッッバー ク医科大学、ピッツバーグ、ＰＡ）から提供していただいた。組換えｈｕＧ−Ｃ ＳＦ　（純度９５％、比活性５Ｘ１０’ユニット／＋ｇ以上）はピーターラルフ 博士（Ｏｒ、　Ｐｅｔｅｒ　Ｒａｌρｈ）およびロバートドラモンド博士（叶、 　Ｒｏｂｅｒｔ　Ｄｒｕｍｓｏｎｄ）　（シータス社、エメリービル、ＣＡ）か ら提供していただいた。組換えｈｕｌＬ−１アルフア（比活性１０８ユニツト／ ｍｇ　（Ｄ　１０細胞検定による））（ウィリアムス（Ｗｉｌｌｉａｗｓ）、　 Ｄ、　Ｅ、、等ＢＬＯＯＤ７２；１６０８（１９８８））はビータ−し、ロメジ コ博士（叶、　Ｐｅｔｅｒ　Ｌ。 Ｌｏｍｅｄｉｃｏ）　（ホフマンーラロッシュ、ナフトリー、ＮＪ）から提供し ていただいた。ＶＩＰ−１およびＶＩＰ−２に対する精製免疫グロブリンフラク ションは各々ＭＩＰ−１およびＭＩＰ−２の５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル精製物を注射 したウサギの血清から調製した。大腸菌のリボ多糖はシグマ化学（セントルイス 、ＭＯ）から購入した。 （コロニー検定） ＣＦＵ−ＧＭ：未分画マウス骨髄細胞（０，５，０，７５および１．０Ｘ１０’ 細胞／ｍＡ）および低密度ヒト骨髄細胞（１，ＯＸ　１０’細胞／曽１）を精製 増殖因子有無の条件下、必須および非必須アミノ酸、グルタミン、セリン、アス パラギン、ピルビン酸ナトリウム（ギブコラボラトリーズ社、グランドアイラン ド、ＮＹ）および熱失活（５６℃、３０分）１０％ウシ胎児血清（ハイクローン 社、ローガン、ＵＴ）を補ったマツコイ５Ａ培地を含む０．３％寒天（ディフコ ラボラトリーズ社、デトロイト、Ｍｌ）培養培地ｂｗｌを含む標準的３５ｓ＋Ｉ ＆ｌｌｌ織培養皿にブレーティングした。精製したマウスＣＦＵ−ＧＭは０．４ ％アガロースに２００細胞／ｍＪの１度でブレーティングした（ウィリアムス（ Ｗｉｌｌ＋ａｍｓ）、　Ｄ、　ｔ！、＋等、　ＥＸＰ、　ＨＥＭＡＴＯＬ、↓５ １４３　（１，９８７））、無血清培養条件は先に報告されているものを使用し た（ル（Ｌｕ）＋　ｔ−ｉ等。 ＣＡＮＣＥＲＲＥＳ、４６：４３５７　（１９８６））、培養皿を低酸素分圧（ ５％）５％ＣＯ□加湿雰囲気下３７℃でインキュベートし、７日後にヒトおよび マウス細胞、および１４日後ヒト細胞のコロニー（７５０細胞／凝集体）および クラスター（５〜５０細胞／凝集体）を計数した。７日目および１４４日目コロ ニーは異なるヒトＣＦＵ−ＧＭ前駆細胞に由来すると考えられる（ヤコプセン（ Ｊａｃｏｂｓｅｎ）、　Ｎ、＋　等、ＣＲＬＬ　Ｔｌ５ＳＵＥ　ＫＩＮＥＴ。 １２：２１３　（１９７９）；フエレロ（Ｆｅｒｒｅｒｏ）＋　Ｄ、、等、、　 ＰｉｌＯＣ。 ＮＡＴＬ、ＡＣＡＤ、ＳＣ１，ＵＳＡ、８０　：４１１４　（１９８３））また （コロニー十クラスター）値はコロニー数のみの場合よりも刺激を受けた実際の 前駆細胞数をより正確に評価している（ヤコプセン（Ｊａｃｏｂｓｅｎ）、　Ｎ 、、等、　ＣＥＬＬ　Ｔｌ５ＳＵＢ　ＫＩＮＢＴ、上２：２１３（１９７９）） 。コロニーおよびクラスグーの形態はα−ナフイルアセテートエステラーゼおよ びルクトールファーストブルーで染色し、ついでｌ＼マドキシリンで逆染色した プレートで検定したＧＭは先に報告されているように（ブロクスメーヤー（Ｂｒ ｏｘｍｅｙｅｒ）。 Ｈ，Ｅ、、等、　Ｊ、ＣＬＩＮ、ＩＮＶＥＳＴ、７９　、　７２１　（１９８７ ）；ブロクスメーヤー（Ｂｒｏｘｍｅｙｅｒ）、　Ｈ，Ｅ、、等、　ＢＸＰ、Ｈ ＢＭＡＴＯＬ。 １６；５９４　（ｆ’＋８８））ｂＯμｃｉ／ｎ／の高比活性トリチル化チミジ ンによるパルス処理で殺した。 ＢＦＵ−Ｅ：マウス骨髄細胞（２ＸＩＯ’細胞／ｌ１１）をイスコブ修正ダルベ コ培地１ｍ／、１．３％メチルセルロース、３０％ウシ胎児血清、５Ｘ１０−’ Ｍ２−メルカプトエタノール、０．１＋ｏＭヘミン（イーストマンコダック社、 ロチニスター、ＮＹ）および２ユニット組織培養エリスロボイエチン（アムゲン 社、サウインドオークス、ＣＡ）を含む標準３５−ＩＩ（１１組織培養皿にブレ ーティングした（プロクスメイヤー（Ｂｒｏｘｍｅｙｅｒ）、　Ｈ，Ｂ、等、Ｊ 、ＣＬＩＮ。 ＩＮＶＥＳＴ、７９ニア２１　（１９８７））。培養はＣＦＵ−ＧＭの場合と同 様に行ない、インキュベーションして７日後に測定した。 （統計） 結果はＣＦＵ−ＧＭの場合３枚のプレート、またＢＦＵ−Ｅ検定の場合４枚のプ レートの平均値±ＩＳＥＭで表わした。サンプル間の比較に関する有意性はスチ ューデンツテストで決定した。 （結果） 上述の実験の結果を以下の第１表および第２表に示す。 （第２表脚注） １　結果はＣ３Ｆ添加、または非添加条件、および１ｏｏ〜３００ｎｇ／鋼ｌの ＭＩＰ−１またはＭＩＰ−２の添加または非添加条件下、５．Ｏｘｌ　Ｏ’　、 ７．５ｘｌ　Ｏ’　または１．Ｏｘｌ　Ｏ’細胞／　ｍ　１でブレーティングし たＢＤＦ、マウス骨髄細胞に対し、カッコ内に示す実験数の平均値±ｉ　Ｓ、Ｅ 、Ｍ、で表わされている。 結果はブレーティングした細胞濃度に関係なく同じであり、また細胞を１０−６ Ｍインドメタシンの非存在下でブレーティングし、従ってプールした場合も結果 は同じであった。増加はコントロールＣＦＵ−ＧＭ数ｎＣ３Ｆなしの場合の０個 コロニーおよびＯ〜Ｂ士工個コロニー十クラスター；ＩＯユニット／　ｗ　１Ｃ ３Ｆ−１の場合の７±１〜３９±１個コロニーおよび３ｏ±１−１２０±ＩＯコ ロニー十クラスター；１００ユニット／ＩＩＺＣ３Ｆ−１の場合の６２±１〜１ ５１±５個コロニーおよび１０９±６〜３１３±１３個コロニー十クラスターｉ １０ユニット／剛ＪＧＭ−Ｃ３Ｆの場合の１９±１〜４９±２個コロニーおよび ２８±１〜１０３±５個コロニー十クラスター；１００ユニット／−ＩＧＭ−Ｃ ３Ｆの場合の３１±１〜６７±２個コロニーおよび４５±３〜１３７±４個コロ ニー十クラスター；１００ユニツト１ｗｂｌＧ−Ｃ３Ｆの場合の８±ｌ〜１５± ３個コロニーおよび１９±２〜３８±５個コロニー十クラスターに基づいている 。 ｉ　これらのグループの各実験の増加は統計的にｐ＜Ｑ、０１で有意であった。 Ｃこれらのグループの各実験の増加は統計的にｐ　＜　Ｑ、　０５で有意であっ た。 第１表で示されているようにＭＩＰ−１およびＭＩＰ−２ば両方ともＩＯユニッ ト／ｍ／のｒ＋ｍｕｃｓＦｌまたはｒｍｕＧＭ−ＣＳＦによって刺激されるコロ ニーおよびコロニー十クラスター形成を有意に増加した。最高の増加はｉｏｏ〜 ２００　ｎｇ／ｍＩ！ＭＩ　Ｐ−１またはＭＩＰ−２で示され、また１１０００ ｎ／ｍｊ！までのＭＴＰ−１またはＶＩＰ−２濃度はもはやコロニーまたはクラ スター形成を増加させなかった（データ示さず）。ＭＩＰ−１＋ＭＩＰ−２の組 合せでＭＩＰ−１またはＭＩＰ−２単独の場合よりも効果が大きくなるようなこ とはなかった。 第２表に示されているように、Ｃ３Ｆ源非存在下（コロニーは全く、かつクラス ターもほとんど形成されない場合）、１００〜３００　ｎ　ｇ／ｍｆｆ１のＭＩ Ｐ−１またはＭｒＰ−２はいずれもマウス骨髄ＣＦＵ−ＧＭのコロニーおよびク ラスター形成を刺激しなかった。ｎｍｕｃｓＦ−１またはｒｍｕＣ３Ｆ−１（各 々１００ユニツト／ｍｆ）で最高に刺激を受けたマウス骨髄ＣＦＵ−ＧＭのコロ ニーおよびクラスター形成を増加させたが、その増加率は準至適濃度の各ＣＳＦ 　（各ＩＯユニット／ｍりでコロニーおよびクラスターを刺激したときに見られ る程太き（はなかった。ＭＩＰ−１またはＭＩＰ−２の促進効果は細胞をｌＯユ ニット／ｍｌのｎｍｕＣ８Ｆ−１を用いて刺激したとき以外（この場合ＭＩＰ− １またはＭＩＰ−２によるコロニーの増加はコロニー十クラスターの増加よりも 大きかった）コロニーでもコロニー十クラスターでも同じであった。ＭＩＰの促 進効果は細胞の１０−’Ｍイインメタシンの存在下または非存在下におけるブレ ーティングの場合について示されている。 またＭＩＰ−１またはＭＩＰ−２の促進活性はこの培養システムに血清が無い場 合も明白であった。またその増加は細胞の培養における血清の存在にかかわらず マクロファージのみまたはマクロファージおよび好中球の両方を含むコロニーお よびクラスターの両方に示された。これらの結果を第３表および第４表に示した 。 第　３　表 血清の非存在下、Ｃ３Ｆ−１およびＧＭ−ＣＳＦにより刺激されたマウス骨髄細 胞によるコロニーおよびクラスター形成に関するＭＩＰ−１およびＭ［’−２の 影響’ｐ＜０．０１ −−−−−−−ＣＣぷ） （例　■） ＭＩＰ−１およびＭＩＰ−２の造血促進活性の特異性ＭＩＰ−１およびＭＩＰ− ２について示された促進効果が独立しているかどうかを調べるためｌＯユニット ／　ｍ　１のｎｍｕＣＳ　Ｆ−１またはｒｍｕＧＭ−Ｃ８Ｆを含む培養物にＭＩ Ｐ−１またはＭＩＰ−２を添加する前に、ＭＩＰ−１およびＭＩＰ−２の調製物 を各々ウサギ抗−ｎｍｕＭ　Ｉ　Ｐ　−１またはウサギ抗−ｎＯ！＋！Ｍ　Ｉ　 Ｐ　−２抗血清の精製免疫グロブリンフラクションとインキュベーションした。 ２つの同じ実験のうちの１つの代表的結果を第１図に示す。 第１図に示されているように抗体自身によるＣ８Ｆ依存コロニーまたはクラスタ ー形成に影響しなかった。抗ＭＩＰ−１はＩＪＩＰ−１の造血促進活性を中和し たがＭＩＰ−２の活性は中和せず、また抗ＭＩＰ−２はＭＩＰ−２の造血促進活 性を中和したがＶＩＰ−１の活性は中和しなかった。このことはＭＩＰ−１およ びＭＩＰ−２の促進効果は独立であり、ＭＩＰ分子自身に特異的であることを示 している。 先に述べたように（第１〜４表）ｎｍｕＣ８Ｆ−１およびｒｍｕＧＭ−Ｃ８Ｆで 刺激されたコロニーおよびクラスター形成を促進したがＭＩＰ−１およびＭＩＰ −２の両方ともｒｈｕＧ−Ｃ８Ｆで刺激されたコロニーおよびクラスターには影 響を与えなかった（第２表）。ｒｈｕＧ　−ＣＳ　Ｆで刺激されたコロニーおよ びクラスターの９５％以上が好中性顆粒球のみを含んでいた。 またＭＩＰ−１およびＭＩＰ−２についてインビトロで準至適（０，２５〜０． ５ユニット／ｒｎｌ：データ示さず）または至適（２ユニツト／ｍｌ’）濃度の Ｅｐｏで刺激したマウス骨髄ＢＦＵ−Ｅによる赤芽球前駆細胞増殖を促進する能 力をテストした。Ｅｐ。 の非存在下ではＢＦＵ−Ｅは形成されなかった。ｌｌ−１Ｏ００ｎ／ｍｌの濃度 範囲のＭＩＰ’−１およびＭＩＰ−２はいずれもＥｐｏ刺激ＢＦＵ−Ｅコロニー 形成に影響しなかった。上記の結果を第５表に詳細に示す。 第　５　表 ＢＤＦ、マウス骨髄赤芽球（ＢＦＵ−Ｅ）前駆細胞によるコロニー形成に関する ＭＩＰ−１およびＭＩＰ−２の影響 コントロール培地　０　２５±１　０　２５±２”　２ＸＩＯ’　ＢＤＦＩマウ ス骨髄細胞をＯ，１ｍＭヘミンの存在下、かつ２ユニツト／　ｍ　ｌエリスロポ イエチン（Ｅｐｏ）非存在下または存在下、か−）ｌ−１０００ｎｇ／ｍｎＭＩ Ｐ−１またはＭＩＰ−２存在下でブレーティングした。どの数字もコントロール 培地と統計的差異は無かった（ｐ＞０．０５）マウス骨髄細胞に関するＭＩＰ− １およびＭＩＰ−２の造血促進効果はｒｈｕｌＬ−１，ｒｍｕＩＬ−４，ｒｈｕ ＩＬ−６または大腸菌ＬＰＳによっては起こらなかった（データ示さず）。マウ ス細胞に関する活性を測定したｒｈｕｌＬ−１αおよびｒｈｕＩＬ−６を各々１ ．５および１０ｎｇ／ｍＡでテストしたがＩＯユニット／ｎｕのｎｍｕＣ３Ｆ− １またはｒｍｕＧＭ−ＣＳＦもしくは１００ユニツト／ｒｎｌのｒｈｕＧ−Ｃ８ Ｆで刺激したコロニーまたはクラスター形成に有意な影響を与えないことが分っ た。さらにｔａｎｇ／［［１１のｒｈｕｌＬ−１（ＺまたはｒｈｕＩＬ−６はい ずれも１１００ｎ／ｍＡ！ＭＩＰ−１またはＭＩＰ−２存在下、１０ユニット／ ｍ１のｎｍｕＣＳ　ＦまたはｒｍｕＧＭ−Ｃ３Ｆを用いて形成されたコロニーま たはクラスターに有意な影響を与えなかった（データ示さず）。 先にｒｍｕＩＬ−４のみがｒｈｕＧ−Ｃ８Ｆの存在下におけるマウス骨髄好中球 コロニーおよびクラスター形成を促進するがｎｍｕｃｓＰ−１またはｒｍｕＧＭ −Ｃ３Ｆで刺激した好中球、好中球−マクロファージ、またはマクロファージコ ロニーまたはクラスター形成は促進しないことが示された（ブロクスメーヤー（ Ｂｒｏｘｍｅｙｅｒ）。 Ｈ，Ｅ、等、　Ｊ、ＩＭＭＵＮＯＬ、　１４１：３８５２　（１９８８））。　 Ｉ　０−６Ｍインドメタシンの存在下または非存在下における０、０１−１００ μｇ／ｍ１（１０倍づつ増加）でテストした大腸菌ＬＰＳはｌＯユニー−ｙト／ ｒｎｌ　ｎｍｕＣＳ　Ｆ　−１またはｒｍｕＧＭ−Ｃ８Ｆにより刺激されたコロ ニーまたはクラスター形成を促進しなかったが、投与量に依存して、１００μｇ ＬＰＳ／ａ＋１における９３％阻害までのＣ８Ｆ刺激コロニーおよびクラスグー の抑制が見られた。このＬＰＳ誘導抑制は細胞を１０−’Ｍイインメタシン存在 下でブレーティングしたときでさえも明白であるがわずかに減少した。 （例　■） マウス骨髄ＣＦＵ−ＧＭの精製集団に関するＭＩＰ−１およびＭＩＰ−２の影響 ＣＦＵ−ＧＭは未分画骨髄細胞集団の０．５％以下であるので（第２表の１００ ユニツト／　ｍ　Ｉ！のｎｍＣＦＦ−１またはｒｍＧＭ−Ｃ３Ｆの存在下でブレ ーティングした細胞の０．５％以下のコロニーおよびクラスタークローニング効 率から明らかであるように）、上述の実験でＭ　Ｉ　Ｐ　−１およびＭＩＰ−２ がＣＦＵ−ＧＭに直接的に作用してコロニーおよびクラスター形成を促進するの か、もしくは補助細胞への作用を介する間接的なプロセスによるのかを決定する ことはできない、ＭＩＰ−１およびＶＩ　Ｐ−２がＣＦτＪ−ＧＭに直接作用す るかどうかを決定するため、マウス骨髄細胞を精製しくウィリアムス（縁１１Ｈ ａ曽ｓ）、　Ｄ、　Ｅ、等、　ＥＸＰ。 ＨＩ！Ｍ＾ＴＯＬ、１５；２４３　（１９８７））、かつＭＩＰの調製物の５０ ニー’−７ト／　ｍ　１のｎｍｕｃｓＦ−１またはｒｍｕＧＭ−ＣＳＦにより刺 激されたーｌ当り２００個の精製細胞によるコロニーおよびクラスター形成に関 する影響を評価した。２つの同じ実験の１つの代表的結果を第２図に示す。 種々のフラクションのコロニー十クラスタークローニング効率は細胞をｒｖｕＣ Ｓ　Ｆ−１で刺激した場合１５〜４４％、ｒ＋ｗｕＧＭ−Ｃ３Ｆで刺激した場合 １７〜３９％であった。これらの濃度のＣ３Ｆ（５０ユニット／ｍＡ）で唯１種 のＣ３Ｆを用いたとき精製したＣＦＵ−ＧＭによるコロニーおよびクラスター形 成に関し最高もしくは最高に近い刺激が行なわれたが、Ｃ３Ｆを組合せるとより 高いクローニング効率が得られる（ウィリアムス（Ｗｉｌｌｉ−ａ＊ｓ）、　Ｄ 、　Ｅ、等、ＥＸＰ、　ＨＥＭＡＴＯＬ、１５　：１００７　（＋９８７））。 ＭＩＰ−１およびＭＩ　Ｐ−２（１００ｎｇ／ｍｊりは各々種々のフラクション における精製ＣＦＬＩ−ＧＭによるＣ５Ｆ刺激コロニーおよびクラスター形成を 有意に促進した（ｐ＜０．０１）（第２図）、ＭＩＰおよびｎｍｕｃｓＦ　１ま たはｒｓｕＧＭ−Ｃ３Ｆの存在下でブレーティングした細胞については各々８２ ％および６５％までのクローニング効率が示された。これらの結果はＭＩＰ−１ およびＭＩＰ−２はインビトロでマウス骨＠ＣＦＩＪ−ＧＭに直接作用すること を示している。 （例　■） ＶＩＰ−１およびＶＩＰ−２の細胞周期関連造血促進活性ＶＩＰ−１およびＭＩ Ｐ２のＣＦＵ−ＧＭに関する効果が細胞周期の３期に選択的か非Ｓ期に選択的か を評価するためにマウス骨髄細胞を洗浄および１０または１００ユニツト／ｗｌ ｌのｒｖｕＣ５Ｆ−２またはｒｗｕＧＭ−Ｃ３Ｆの存在下でかつ１１００ｎ／ｌ ａ１のＭｒＰ−１またはＭ　Ｉ　Ｐ　−２の存在下または非存在下でのＩ　ブレ ーティング前非放射性（コールド）チミジンまたは高比活性トリチル化チミジン でパルス処理した。第６表は同様の結果を示す２回の実験のうちの１つのデータ を示している。 コールドチミジンによる細胞のパルス処理は細胞によるコロニーまたはクラスタ ー形成に影響しないことが示され（ブロクスメーヤー（Ｂｒｏｘ胃ｅｙｅｒ）＋ 　Ｈ，Ｅ、＋等、Ｊ、ＣＬ　ＩＮ、ＩＮＶＥＳＴ、７９；７２１　（１９８７） ：ブロクスメーヤー（Ｂｒｏｘｍｅｙｅｒ）＋　Ｈ，Ｅ、、等。 ＥＸＰ、　ＨＥＭＡＴＯＬ、１６；５９４　（］、９８８）　）、また　ＭＩＰ −１およびＭＩＰ−２はいずれも始めにコールドチミジンでパルス処理した細胞 によるコロニーおよびクラスター形成を有意に促進した。対照的に高比活性トリ チル化チミジンによるパルス処理の時にＤＮＡ合成（３期）中のＣＦＵ−ＧＭは 死滅し、その時に細胞周期の３期ではないＣＦＵ−ＧＭのみがＣ３Ｆに応答して 増殖しつづけコロニーまたはクラスターを形成した。ＭＩＰ−１およびＭＩＰ− ２は最初に高比活性トリチル化チミジンでパルス処理しＳ期ＣＦＵ−ＧＭを除去 した細胞には造血促進活性を示さなかった。これらの結果はＭＩＰ−１およびＭ ＩＰ−２の造血促進活性が主にもしくは全てＣＦＵ−ＧＭＩＩＩ胞周期のＤＮＡ 合成合成間始することを示している。 （例　■） ヒト骨髄ＣＦＵ−ＧＭによるコロニーおよびクラスター形成に関するＭＩＰ−１ およびＶＩＰ−２の影響正常ヒト骨髄の低密度フラクションに存在するＣＦＵ− ＧＭによるコロニーおよびクラスタル形成に関するＭＩＰ−１およびＭＩＰ−２ の効果を評価した。１００ユニット乙ｉのｒｈｕＧＭ−Ｃ３ＦまたはｒｈｕＧ　 Ｃ３Ｆの存在下または非存左下ｉｏ’細胞７．１の細胞をブレーティングし、イ ンキユベーションから７日後および１４日後側定した。外部から添加するＣ３Ｆ の非存在下でも低密度ヒト骨髄細胞はコロニーおよびクラスターを形成し得るが 、形成されるコロニーおよびクラスター数はプレーティングする細胞数に依存し 、かつそれは骨髄補助細胞に由来するＣ３Ｆの内的放出に起因する。ヒト骨髄を 用いた実験結果を第７図に示す。 示した２つの実験においてコロニーがＭＩＰの非存在下で形成した限り好酸球コ ロニーまたはクラスター形成を刺激または促進したときＣ３Ｆの非存在下でのＭ ＩＰ−１およびＭＩＰ−２はコロニー形成を有意に促進したが、コロニーがＶＩ Ｐの非存在下で形成しなかったときその促進はなかった。外部からのＣ５Ｆの添 加がないときＭＩＰ−１およびＭＩＰ−２は各々クラスター形成を促進した。７ 日問および１４日間でＭＩＰ−１およびＭＩ　Ｐ−２はｒｈｕＧＭ　−ＣＳ　Ｆ で刺激したＣＦＵ−ＧＭによるコロニーおよびクラスター形成を有意に促進した が、Ｇ−Ｃ３Ｆによって刺激したマウスのコロニーおよびクラスター形成につい て示された結果と同様であった（第２表）。ＭＩＰ−１またはＭＩＰ−２はいず れもｒｈｕＧ−Ｃ３Ｆで刺激したヒト骨髄細胞のコロニーまたはクラスター形成 を促進しなかった。 文献と上記データとの比較は、他の既知サイトカインがＶＩＰ−１およびＭＡＰ 〜２の造血促進活性と類似しているとは考えられず、かつこれらの作用は現在独 特のものであると考えられることを示している。独立したＣ３Ｆ活性を有さない 多くの分子はポジティブに造血を調節し得るが、ＭＩＰ−１およびＭＩＰ−２に ついて示されたこのタイプの促進活性はＩＬ−１アルフア、ＩＬ−６またはバク テリアＬＰＳを用いては確認されなかった。先にＩＬ−４はＧ−Ｃ３Ｆと共同し て好中球コロニー形成を促進することが示されたが（プロクスメーヤ−（Ｂｒｏ ｘｗｅｙｅｒ）、　Ｈ，Ｆ、、等、Ｊ。 ＩＭＭＵＮＯＬ、１４１　：　３８５２　（１９８８））　、ＭｔＰ−１および ＭＩＰ２はマウスまたはヒト骨髄細胞に対するｒｈｕＧ　−Ｃ３Ｆの活性を促進 せず、またＩＬ−４はｎｍｕＣ３Ｆ−１およびｒ■ｕＧ　Ｍ　−ＣＳ　Ｆ　（Ｉ ｄ、）の活性を促進しなかった。 また未公表の観察によりＩＬ−５が好酸球Ｃ３Ｆとして作用することが示され、 またＶＩＰ−１およびＭＩＰ−２は我々が実験しなかった。ＩＬ−２はＣＦＵ− ０Ｍ数を直接増加することが示された（ブロクスメーヤー（Ｂｒｏｘｍｅｙｅｒ ）＋　Ｈ，Ｅ、等、ＣＲＣＣＩＩＩＴ。 ＲＥＶ、０ＮＣＯＬ、／ＨＥＭＡＴＯＬ、工：１７３　（１９８８））。 ここで示されている実験で用いた検定において腫瘍壊死因子、イ−ｌ、またはｒ ｈｕ　ｍａｎ（ｈｕ）　Ｇ　−ＣＳ　Ｆと組合せてテストし、マウス骨髄ＢＦＵ −Ｅに関する効果についてはエリスロボイエチンと組合せて、またヒト骨髄ＣＦ Ｕ−ＧＭに関する効果についてはｒｈｕＧＭ−Ｃ８ＦまたはｒｈｕＧ−Ｃ８Ｆと 組合せてテストした。 ＭＩＰ−１およびＭＩＰ−２はｒｍｕＧＭ−Ｃ３ＦおよびｎｍｕＣ３Ｆ−１で共 刺激したマウスＣＦＵ−ＧＭのコロニー形成を独立に最高３倍まで促進したが血 清の存在下または非存在下でｒｈｕＧ　−Ｃ８Ｆによって刺激した場合は促進し なかった。 ＭＩＰ−１およびＭＩＰ−２は≧ｌ　ＯＯｎｇ／ｍｊ？の濃度のときに活性が最 高であり、その作用は細胞周期のＤＮＡ合成期に開始すると考えられる。１Ｆｇ ／ｍｌまでのＭＩＰ−１またはＭＩＰ−２はいずれもエリスロポイエチンの非存 在下または存在下でマウスＢＦＵ−Ｅに全（効果を示さなかった。ＭＩＰ−１お よびＭＩＰ−２はいずれも精製マウスＣＦＵ−ＧＭに直接作用した。 ５０ユニツトのｍｕＣ８Ｆ−１とともにブレーティングした２００個の精製細胞 のクローニング効率はＭＩＰ存在下で８２％、非存在下で４３％であった。５０ ユニツトのｒｍｕＧＭ−Ｃ８Ｆを用いたクローニング効率はＭＩＰ存在下で６５ ％、非存在下で３５％であった。 ＭＩＰの効果はバクテリアＬＰＳ、　ｒｈｕ　Ｉ　Ｌ　−１ａ、ｒｈｕｌＬ−６ またはｒｍｕｌＬ−４の効果には見られず、またそれら自身の特異的抗体により 中和される。またＭＩＰ−１およびＭＩＰ−２は内因的刺激およびｒｈｕＧＭ− Ｃ３Ｆによる刺激によるヒト骨髄ＣＦＵ−ＧＭのコロニー形成は促進するがｒｈ ｕＧ−Ｃ３Ｆにより刺激されたものは促進しなかった。これらの結果はＣＦＵ− ＧＭに対する造血促進活性というインビトロのＭＩＰ−１およびＶＩＰ−２の新 しい役割を示している。 本発明はその基本的特徴または精神を逸脱することなしに他の形で具体化し、ま たは他の方法で実行することができる。したがって本公開物はあらゆる点で説明 を目的としており、本発明を制限するものではない０本発明の範囲は特許請求の 範囲で示されており、かつこれと等価な意味および範囲内にあるあらゆる変化も 本発明の範囲にあると考えられる。 手続補正書（方１式国 １１２．２０ 平成　年　月　日

Claims (28)

【特許請求の範囲】
1. １．造血細胞生産を促進する試薬中に存在する抗原に対する抗体で、該抗体を作 る抗原が以下の活性 （イ）造血細胞コロニー刺激因子活性の促進、（ロ）ヘパリソヘの結合、および （ハ）皮下投与した場合多核細胞侵入を特徴とする局所的炎症の誘導、 を有するもの。
2. ２．前記抗原が高い塩濃度においてヘパリンに結合する請求の範囲１記載の抗体 。
3. ３．前記抗原が炎症性サイトカインＭＩＰ−１、炎症性サイトカインＭＩＰ−２ およびそれらの混合物からなる群から選ばれるサイトカインである請求の範囲１ 記載の抗体。
4. ４．前記抗原がヒトの抗原である請求の範囲１乃至３のいずれか１項記載の抗体 。
5. ５．前記抗原がマウスの抗原である請求の範囲１乃至３のいずれか１項記載の抗 体。
6. ６．ポリクローナル抗体である請求の範囲１乃至５のいずれか１項記載の抗体。
7. ７．ウサギ、ヤギ、ヒツジまたはその他の哺乳類またはニワトリから得られる請 求の範囲６記載の抗体。
8. ８．モノクローナル抗体である請求の範囲１乃至５のいずれか１項記載の抗体。
9. ９．ハイプリドーマ細胞から得られる請求の範囲８記載の抗体。
10. １０．前記ハイブリドーマ細胞がマウス脾臓リンパ球およびミエローマ細胞の融 合産物である請求の環囲９記載の抗体。
11. １１．検出可能な標識を用いて標識化した請求の範囲１乃至１０のいずれか１項 記載の抗体。
12. １２．造血細胞生産を促進する試薬、該試薬に対する抗体またはその活性フラグ メントの活性を測定することを含む哺乳類の造血細胞の生産に関する病気のイン ビトロ検出方法で、該試薬は造血細胞刺激因子活性の促進、ヘパリンヘの結合、 および皮下投与した場合の多核細胞侵入を特徴とする局所的炎症の誘導が可能な サイトカインを含むもので、以下のステップ；Ａ．少なくとも１種の前記試薬の 調製、Ｂ．該試薬サンプルヘの検出可能な標識化、Ｃ．病気の疑いのある前記哺 乳類に由来する骨髓サンプルと標議化試薬サンプルの混合、および Ｄ．骸骨髓サンプルを調べて該標識物質を検出し、かつ造血細胞コロニーおよび クラスター形成を測飽して該試薬の活性を測定する、 を含む検出方法。
13. １３．前記サイトカインが高い塩濃度においてヘパリンと結合する請求の範囲１ ２記載の方法。
14. １４．前記サイトカインが炎症性サイトカインＭＩＰ−１、炎症性サイトカイン Ｍ１Ｐ−２およびそれらの混合物からなる群から選ばれる請求の範囲１２記載の 方法。
15. １５．前記試薬が組換え技術で生産される細胞に由来する請求の範囲１２乃至１ ４のいずれか１項記載の方法。
16. １６．前記抗体が請求の範囲１乃至１１のいずれか１項記載の抗体である請求の 範囲１２記載の方法。
17. １７．造血細胞コロニー刺激因子活性の促進、ヘパリンヘの結合および皮下投与 した場合の多核細胞侵入を特徴とする局所的炎症の誘導が可能なサイトカインを 含む造血細胞生産促進試薬、該試薬に対する抗体またはそのフラグメントのヒト の造血細胞生産疾患の治療を目的とした使用。
18. １８．前記サイトカインが高い塩濃度においてヘパリンに結合する請求の範囲１ ７記載の使用。
19. １９．前記サイトカインが炎症性サイトカインＭＩＰ−１、炎症性ＭＩＰ−２お よびそれらの混合物からなる群から選ばれる請求の範囲１７記載の使用。
20. ２０．前記医薬組成物が少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌ濃度で調製される請求の 範囲１７記載の使用。
21. ２１．前記医薬組成物が約１００ｎｇ／ｍｌから約２００ｎｇ／ｍｌの濃度で調 製される請求の範囲１７記載の使用。
22. ２２．前記試薬が組換え技術で生産される細胞に由来する請求の範囲１７乃至２ ２のいずれか１項記載の使用。
23. ２３．前記試薬、該試薬に対する抗体またはその活性フラグメントを含む請求の 範囲１２乃至１６のいずれか１項記載の方法に使用することを目的とするテスト キット。
24. ２４．ヒトの造血細胞生産疾患を治療し得る新しい薬剤のスクリーニングに使用 することを目的とするテストキットで、造血細胞コロニー刺激因子活性の促進、 ヘパリンヘの結合、および皮下投与した場合の多核細胞侵入を特徴とする局所的 炎症の誘導が可能なサイトカインを含む造血細胞生産促進を目的とする一定量の 試薬を含むキット。
25. ２５．前記サイトカインが高い塩濃度においてヘパリンに結合する請求の範囲２ ４記載のテストキット。
26. ２６．前記サイトカインが炎症性サイトカインＭＩＰ−１、炎症性サイトカイン ＭｌＰ−２およびそれらの混合物からなる群から選ばれる請求の範囲２４記載の テストキット。
27. ２７．前記試薬が組換え技術で生産される細胞に由来する請求の範囲２４乃至２ ６のいずれか１項記載のテストキット。
28. ２８．前記抗体が請求の範囲１乃至１１のいずれか１項記載の抗体である請求の 範囲２４記載のテストキット。