PT94641A

PT94641A - Promotores da actividade de factores estimulantes de colonias

Info

Publication number: PT94641A
Application number: PT94641A
Authority: PT
Inventors: Stephen D Wolpe; Anthony Cerami; Barbara Sherry
Original assignee: Univ Rockefeller
Priority date: 1989-07-10
Filing date: 1990-07-09
Publication date: 1991-04-18
Also published as: AU6040290A; WO1991000919A1; ES2088925T3; CA2035861A1; EP0409040B1; ATE129158T1; EP0409040A1; DK0409040T3; IE72139B1; JPH04501860A; DE69023060T2; AU638473B2; GR3018675T3; DE69023060D1

Description

THE ROGKEFELLER UNIVERSITY "PROMOTORES DA AGTIVXDADE DE FACTORES ESTIMULANTES DE COLÓNIAS"

ANTECEDENTES DA PRESENTE INVENÇÃO A produção de células mieléides do sangue que se inicia a partir do sistema hematopoético e das células progenitoras, e regulado por um trabalho de interação de uma população de células acessórias. Broxmeyer, H.E. and Williams, D.E., "The Production of Myeloid Blood Cells and Their Regulation During Health and Disease", CRC GRIT. REV. ONCOL./HEMATOL. 8 (1985) 173. As células acessórias libertam biomoléculas ou citoquinas que, por sua vez, podem actuar directamente no sistema hematopoiético e nas células progenitoras ou indirectamente através da acção sobre outras células acessórias. Determinadas citoquinas encontram-se já implicadas na modulação da produção das células sanguíneas. Isto inclui, mas não se limita a, factores estimulantes das colónias hematopoiéticas (CSF) : granulócitos macrófagos (GM)-GSF, macrófagos (M)-CSF ou CSF-1, granulócitos (G)-CSF, multi-CSF (também designados por interleucina (IL)-3) e eritropoietina, assim como IL-1 até IL-6, os factores de necrose de tumor - alfa e beta e os interferões, alfa, beta e gama, o factor de transformação do crescimento - beta, prostagladinas de tipo E 1 e 2, -2-

lactoferrina, isoferritina ácida, activina e inibina. As citoquinas , podem actuar individualmente sobre um ou mais tipos de células e podem ter mais do que um efeito. Continuam por descrever novas citoquinas e atribuem-se-lhes novas funções, assim como âs citoquinas previamente descritas.

SUMÁRIO DA PRESENTE INVENÇÃO

De acordo com a presente invenção, verificou-se que determinados materiais possuíam um efeito promotor sobre a actividade do factor de estimulação das colónias (CSF). Os materiais em que se determinou existir esta actividade consistem em citoquinas que possuem as características de actividade de duas espécies de citoquinas inflamatórias que foram divulgadas nos pedidos de patente de invenção conjuntamente pendentes com os NQs. de série 238937 e 240078. Estes materiais constituem isolados, descobertos de novo, de substâncias mediadoras divulgadas na patente de invenção norte-americana NQ, 4 603 106 e são constituídos por proteínas que se purificam. As citoquinas da presente invenção apresentam ainda a capacidade de se ligarem à heparina, mesmo em concentrações salinas elevadas e de induzir uma inflamação localizada caracterizada por uma infiltração de células polimor-fonucleares, quando administrada por via subcutânea.

Duas citoquinas previamente identificadas, MIP-1 e MIP-2 apresentam, em especial, um efeito promotor sobre as colónias e actividade de formação de cachos das células progenitoras de macrófagos granulocitícos (CFU-GM), a partir da medula óssea de ratos e de seres humanos normais que também se estimularam com concentrações sub-óptimas de factores conhecidos de estimulação de colónias.

Num primeiro aspecto da presente invenção, definiu-se como um agente para a promoção da produção das células mielóides do sangue, aquele que compreende uma citoquina susceptível de aumentar as colónias mielopoiêticas e a formação de cachos, ligando-se à heparina mesmo em elevadas concentrações salinas e que induz inflamação localizada quando administrada por via subcutânea. Também se encontram contempladas as composições farmacêuticas que compreendam o agente da presente invenção, ou um associado de ligação, se se considerar adequado, e um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.

Num segundo aspecto, a presente invenção compreende um método para a promoção da produção de células mielóides no sangue que consiste na administração de uma quantidade eficaz de um agente para aumentar a formação de colónias de células mielóides no sangue e de cachos, compreende um agente e as composições aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, de acordo com a presente invenção. fk- 9 %

Podem preparar-se composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção contendo uma quantidade terapeuticamente eficaz do presente agente e de um diluente ou veículo farmaceuti-camente aceitáveis. 0 agente pode encontrar-se presente, e de preferência, em quantidades eficazes para libertar, pelo menos, 100 ng/ml e de preferência entre cerca de 100 ng/ml a cerca de 200 ng/ml.

Em algumas circunstâncias pode monitorizar-se de um modo benéfico a produção de células sanguíneas mielopoiéticas, por exemplo para se identificarem perturbações sanguíneas que se pensa afectarem a produção celular, a presente invenção contempla um método para a medição de actividade do agente da presente invenção. 0 método consiste na recolha de uma amostra de medula óssea de um paciente no qual se suspeita existir tal perturbação e na incubação da amostra com uma quantidade de agente da presente invenção que suporta um marcador detectável adequado. Depois, pode examinar-se a amostra para se detectar se essa actividade celular aberrante se deve a uma dificiencia na presença ou actividade do factor estimulante das colónias e, por conseguinte, tentar-se isolar e identificar a origem de tal distúrbio. A presente invenção pode, de acordo com o anterior-mente exposto, estender-se a um conjunto de ensaios adequados que incluam o agente da presente invenção. 5- va

Num outro aspecto a presente invenção refere-se a determinados métodos terapêuticos que se basearão na actividade do agente ou em outros agentes ou fármacos em que se determinou existir a mesma actividade. 0 método terapêutico baseado na promoção da produção de células sanguíneas mielóides nos mamíferos compreende a administração de um agente ou de material semelhante susceptível de intensificar a actividade do factor de estimulação das colónias mielóides, individualmente ou numa mistura com outros agentes numa quantidade eficaz para promover a produção celular sanguínea no hospedeiro.

De um modo mais específico, o método terapêutico a que aqui se faz geralmente referência pode incluir o método para o tratamento de um disfunção da produção das células sanguíneas mielóides pela administração de composições farmacêuticas que podem compreender quantidades eficazes do agente ou de outros fármacos igualmente eficazes.

Por consequência, constitui um dos objectivos principais da presente invenção proporcionar um agente que promova a produção das células sanguíneas mielóides intensificando a actividade do factor de estimulação das colónias mielopoiéticas.

Constitui um outro objectivo da presente invenção proporcionar um método para se medir a actividade do agente tal como anteriormente referido que também serve para avaliar possíveis -6- distúrbios na produção de células sanguíneas.

Constitui um outro objectivo da presente invenção proporcionar composições farmacêuticas para utilização em métodos terapêuticos que compreendam ou se baseiem no agente ou nos seus associados de ligação.

Constitui ainda um outro objectivo da presente invenção proporcionar um método para a promoção da produção das células sanguíneas mieloides mediante a administração do agente ou de uma composição farmacêutica tal como anteriormente referido.

Constitui ainda um outro objectivo da presente invenção proporcionar um método para o tratamento de mamíferos para a correcção de distúrbios da produção de células mieloides mediante a administração da composição farmacêutica tal como anteriormente referido. 0 especialista na matéria verificará que existem outras vantagens e objectivos a partir de uma leitura da descrição que se segue aos desenhos ilustrativos seguintes. -7-

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A FIGURA 1 mostra a influência dos anticorpos anti-MIP-1 e anti-MIP-2 na intensificação da actividade das células mielóides de MIP-1 e MIP-2.

As preparações de MIP foram pré-incubadas com meio de controlo ou com anti-MIP durante Ih 30m, à temperatura ambiente, antes de se adicionarem em recipientes de cultura com 5 x 10^ BDF-^ células da medula óssea/ml na presença de nmuCSF-1 ou de rmuGM--CSF. Notou-se um acréscimo significativo na formação de colónias e de cachos (p^0,001) com MIP-1, MIP-2, anti-MIP-1 mais MIP-2, e anti-MIP-2 mais MIP-1. Os outros valores não foram significativamente diferentes dos de controlo (p>0,05). A FIGURA 2 mostra a influência de MIP-1 e MIP-2 na formação de colónias e de cachos de CFU-GM purificado de rato, estimulado por nmuCSF-1 ou de rmuGM-CSF. Purificaram-se CFU-GM de rato tal como descrito em (Williams, D. E., et al., EXP. HEMATOL., 15 (1987) 243).

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA PRESENTE INVENÇÃO

Num primeiro aspecto a presente invenção refere-se à identificação de uma classe de citoquinas que se crê estarem implicadas na promoção da produção de células sanguíneas -8-

mielôides. De um modo específico, estes promotores da actividade miéLopoiética compreendem um grupo de citoquinas cujas propriedades comuns consistem no facto de intensificarem a actividade do factor de estimulação das colónias mielopoiêticas, de se ligarem a heparina mesmo para elevadas concentrações salinas e de induzirem inflamações localizadas caracterizadas por infiltrações de células polimorfonucleares, quando administrados por via subcutânea. Identificaram as citoquinas que constituem um dos objectivos da presente invenção como MIP-1 e MIP-2 e encontra-se uma exposição mais completa das suas origens e caracterís^ ticas de actividade e estruturais nos pedidos de patente de invenção conjuntamente cedidos com os N2s de série 238937 e 240078. Englobam-se aqui como referência as descobertas de ambos os pedidos de patente de invenção. MIP-1 e MIP-2 compreendem proteínas de sequências inferidas. Sabe-se, especificamente, que MIP-1 compreende dois componentes peptídicos purificados que possuem as sequências de aminoácidos que se indicam a seguir tal como se determinou em ratos. MIP-1

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Analogamente, verificou-se que MIP-2 tem a sequência parcial de aminoácidos N^-terminal a seguir indicada, tal como se determinou em ratos.

ALA VAL VAL ALA SER GLU LEU ARG CYS GLN CYS LEU LYS THR LEU PRO ARG VAL ASP PHE LYS ASN ILE GLN SER LEU SER VAL THR PRO PRO GLY

Naturalmente que outras linhas de células ou outras fontes para o desenvolvimento quer de materiais a partir dos quais se isolam em seguida as citoquinas, quer das próprias citoquinas inflamatórias, se encontram aqui contempladas e a presente invenção não se encontra por consequência limitada. Deste modo, encontram-se aqui contemplados meios alternativos tais como técnicas recombinantes, de acordo com a presente invenção, e que se indicam em ambos os pedidos de patente de invenção anterior-mente referidos. -10-

Demonstrou-se, previamente, que as proteínas MIP-1 e MIP-2 que se ligam a heparina despoletam uma resposta inflamatória localizada quando injectadas por via sub-cutânea nas plantas das patas ("footpads") de ratos C3H/Hej. MIP-1 actua como um pirogénio endógene independente de prostaglandina quando se administra aos ratos e é capaz de induzir quimiocinese in vitro de neutrófilos humanos e de despoletar neutrófilos aderentes libertando peróxido de hidrogénio. MIP-2 é capaz de actuar como um agente quimiostático, mas não como um agente quimiocinético para os neutrófilos e pode induzir a desgranulaçao dos neutrófilos de lisósima, mas não dos neutrófilos de beta-glucuronidase. A presente invenção baseia-se na descoberta de que os agentes que possuem as características das actividades gerais das citoquinas inflamatórias MIP-1 e MIP-2 tomam parte na actividade das células progenitoras, macrófagos granulocíticos. Embora MIP-1 e MIP-2 pareçam nao possuir actividade CSF hematopoiética intensificam num grau mais do que aditivo a formação de colónias e de cachos de CFU-GM da medula óssea de ratos estimulados com nmuCSF-1 e com rmuGM-CSF e com CFU-GM da medula óssea de doadores humanos normais estimulados com rhuGM-CSF. Os estudos em que se utilizaram CFU-GM de medula óssea de rato purificada que se apresentam posteriormente sugerem que os efeitos intensificadores mielopoiéticos de MIP-1 e de MIP-2 se devem a um efeito directo de CFU-GM. Continua por determinar o modo e o mecanismo exactos de acção de MIP-1 e de MIP-2 sobre CFU-GM, mas a acção parece ser -11- mediada ou, pelo menos, iniciada durante a fase S do ciclo celular. 0 facto de MIP-1 e de MIP-2 poderem actuar directamente sobre CFU-GM não deve, contudo, eliminar a possibilidade de M1P-1 e de MIP-2 poderem ser capazes de modular indirectamente a mielopoiese através de uma acção sobre as células acessórias.

Tal como anteriormente referido a presente invenção inclui os agentes acima mencionados, composições que contem os referidos agentes e métodos terapêuticos que utilizam os referidos agentes e composições. Por consequência, podem preparar-se os agentes da presente invenção ou os seus associados de ligação ou outros ligandos em composições farmacêuticas, com um veículo adequado e com uma grande eficácia para administração segundo diversos meios a um paciente que possua disfunções ou perturbações de produção de células sanguíneas mielóides. Pode utilizar-se uma diversidade de técnicas de administração entre elas o tratamento da medula óssea ex vivo, ou técnicas parenterais tais como a injecção intravenosa, cateterizações e similares. Podem utilizar-se, em particular, concentrações do agente de, pelo menos, cerca de 100 ng/ml e, de preferência, compreendidas entre cerca de 100 ng/ml e cerca de 200 ng/ml. As quantidades exactas do agente administrado variarão e poderão basear-se nas recomendações e prescrições de um médico ou de um veterinário qualificado.

Também se podem produzir anticorpos e fármacos para o agente e podem ser utilizados, quando apropriado, com a finalidade

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de modular a produção de células sanguíneas mielóides de um mamífero hospedeiro. Pode utilizar-se, em particular, o agente para produzir anticorpos para si próprio numa diversidade de mamíferos, de acordo com técnicas tais como a técnica hibridoma, utilizando, por exemplo, linfócitos de baço de rato fundidos e células de mieloma. Depois, podem formular-se os anticorpos resultantes numa composição farmacêutica adequada e administrar-se ao hospedeiro pretendido. As quantidades exactas, os intervalos de administração e as técnicas de administração no que se refere a tais composições farmacêuticas podem variar de acordo com os factos conhecidos na especialidade médica e de acordo com as instruções específicas de um médico ou de um veterinário qualificado. A presente invenção também se refere a uma diversidade de aplicações de diagnóstico, que inclui métodos para a detecção ou investigação de perturbações ou disfunções na produção das células sanguíneas mielóides no que se refere â capacidade do agente da presente invenção ou dos seus associados de ligação para promover ou inibir a actividade do factor estimu lante da colónia mielopoiética. Tal como anteriormente mencionados, pode marcar-se de modo adequado o agente ou o seu associado de ligação e colocar-se em contacto com uma amostra de medula óssea de um tal animal no qual se suspeita existir uma perturbação. Depois, pode examinar-se a amostra para se determinar a localização do estado do material marcado assim como a actividade geral da amostra, isto, é, se a produção de células sanguíneas aumentou ou diminuiu. 13- * a

Tal como anteriormente indicado, os exemplos que se seguem demonstram os pormenores da investigação e a identificação da actividade promotora de GSF das citoquinas inflamatórias anteriormente referidas. Naturalmente que os materiais específicos e as técnicas indicadas se fornecem apenas a título de exemplo e podem variar, pelo que os exemplos que se seguem se apresentam a título ilustrativo mas não restritivo do âmbito da presente invenção.

EXEMPLO I

Actividades Intensificadoras Mielopoiéticas in Vitro de MIP-1 e de MIP-2

Nesta série de experiências pretendeu-se determinar se as citoquinas MIP-1 e MIP-2 se encontravam envolvidas, de qualquer modo, na formação das colónias e dos cachos. Por consequência, examinaram-se MIP-1 e MIP-2 sozinhos e em combinação, a diversas concentrações, para se determinar a sua influência na formação dos cachos e das colónias através de GFU-GM da medula óssea de rato estimulada com concentrações sub-óptimas de nmuCSF-1 ou de rmuGM-CSF.

Materiais e Métodos Células e Procedimentos de Separação Celular

Obtiveram-se células da medula óssea do fémur a partir de -14- ratos fêmea (C57B1/6 x DBA/2) (BDF^) de 4 a 6 semanas de idade adquiridos à Cumberland View Farms (Clinton, TN), Utilizaram-se as células quer não separadas quer após purificação tal como descrito na bibliografia, com menores modificações (Williams, D. E., et al., EXP. HEMATOL., 15 (1987) 2#3?X. Resumidamente obtiveram-se CFU-GM purificadas tal como se segue : injectaram-se os ratos por via intraperitoneal com 200 mg/kg de ciclofosfamida, removeram-se as células da medula óssea 3 dias mais tarde e removeram-se as células de baixa densidade ( ^,1,077 g/cm ) apos separação por corte de densidade em Ficoll-Hypaque (Pharmacia Fine Chimicals, Piscataway, NJ). Depois submeteram-se as células de baixa densidade a uma separação posterior por purificação centrífuga, a 4°G em vez de 10°C utilizando uma câmara Sanderon. Nos presentes estudos as fracções que continham o pico CFU-GM foram elutriadas a uma velocidade de sedimentação menor (16 a 20 ml/min.) do que a previamente referida (24 a 28 ml/min.) mas o rendimento e a pureza de CFU-GM eram semelhantes.

Obtiveram-se as células de medula óssea por aspiração a partir de cristã ilíaca posterior de voluntários saudáveis que deram o seu consentimento de acordo com o estabelecimento nas normas do Human Investigation Comittee of the Indiana University School of Medicine. Purificaram-se as células de baixa densidade em Ficoll-Hypaque e cultivaram-se. -15

Biomoléculas e Anticorpos

Purificaram-se tal como anteriormente descrito MIP-1 e MIP-2 naturais de murino a partir dos sobrenatantes das células Raw 264.7. (Wolpe, S. D., et al., J. EXP. MED., 167 (1988) 570; Davatelis, G. , et al., J. EXP. MED., 167 (1988) 1939; Sherry, B. et al., J. EXP, MED., 168 (1988) 2251; Wolpe, S. D., et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, 86 (1989) 61)2). Reconhece-se MIP-1 como um dupleto de **8000 Daltons e MIP-2 como uma banda única de *>6000 Daltons em electroforese sobre gel poliacrilamida-SDS. As preparações recombinantes de mu e hu GM-CSF e muIL-4 (activi-

O dades específicas de -10 unidades/mg cada uma (Broxmeyer, H. E., et al., J. IMMUNQL. 141 (1988) 3852).ede huIL-6 (actividade c: específica de 5 x 10 unidades/mg) foram oferecidas pelos Dr. David Urdal e Dr. Steven Gillis, Immunex Corp., Seattle, WA. muCSF-1 natural (actividade específica de 2 x 10^ unidades/mg) (Id.) foi oferecida por Dr. Richard K. Sadduck, University of Pittsburgh School of Medicine, Pittsburgh, PA. 0 huG-CSF recombi nante (957a puro, actividade específica >5 x 10 unidades/mg) (Id.) foi oferecida pelos Dr. Peter Ralfh e Dr. Robert Drummond, Cetus Corporation, Emeryville, CA. huIL-1 alfa recombinante (actividade específica de 10 unidades/mg utilizando o ensaio celular D10) (Williams, D. E., et al., BLOOD 72 (1988) 1608) oferecida pelo Dr. Peter L. Lomedico, Hoffman-La Roche, Nutley, NJ. Prepararam-se as fracçÕes de imunoglobulina purificada contra MIP-1 e MIP-2 a partir de soros de coelhos injectados, -16- respectivamente com preparações de MIP-1 e de MIP-2 purificadas sobre gel SDS-PAGE. Adquiriu-se o lipopolissacarídeo de E. coli (LPS) na Sigma Chemical Co., St. Louis, MO.

Ensaios de Colónias CFU-GM : Colocaram-se células não separadas da medula óssea de rato (0,5, 0,75 e 1,0 x 10^ células/ml) e células da medula óssea humana de baixa densidade (1,0 x 10 células/ml) em caixas para cultura de tecidos normalizadas de 35 mm em 1 ml de meio de cultura de agar a 0,73¾ (Difco Laboratories, Inc., Detroit, MI), contendo meio 5A de McCoy enriquecido com mais aminoácidos essenciais e não essenciais, glutamina, serina, asparagina, piruvato de sódio (GIBCO Laboratories, Grand Island, NY) e com soro de feto de bovino a 10¾ inactivado (a 56°C durante 30 minutos) (Hyclone Inc., Logan, UT) com ou sem factores de crescimento purificados (Broxmeyer, Η. E., et al., J. IMMUNOL. 141 (1988) 3852). Plaquearam-se CFU-GM purificados de murino a 200 células/ml em agarose a 0,4¾ (Williams, D. E., et al., EXP. HEMATOL., 15 (1987) 243). As condições de cultura isentas de soro estavam de acordo com o descrito em (Lu, L., et al., CÂNCER RES. 46 (1986) 4357). Incubaram-se as caixas de cultura a 37°C numa atmosfera humidificada que se submeteu a um jacto de CC^ a 5¾ a uma tensão de inferior (5¾) e efeetuou-se o registo decorridos 7 dias para as colónias ( >50 células/agregado) e para os cachos (5 a 50 células/agregado) para as células de seres humanos e de ratos e ainda 14 dias depois para as células -17-

de seres humanos. Ao 79 dia e ao 149 dia as colónias pareciam derivar de progenitores de CFU-GM humanos diferentes (Jacobsen, N. , et al., CELL TISSUE KINET., 12 (1979) 213); Ferrero, D., et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 80 (1983) 4114)e as colónias mais os cachos constituem um modo de cálculo mais apurado do número actual de células progenitoras estimuladas do que apenas as colónias (Jacobsen, N., et al,, CELL TISSUE KINET., 12 (1979) 213). Estabeleceu-se a morfologia das colónias e dos cachos em todas as placas coradas com «X-naftil-acetato-estearase e com azul rápido de luxol e depois contra-coradas com hematoxilina (Lu, L., et al., J. IMMUNOL. 139 (1987) 1823). Sacrificou-se CFU-GM na síntese do ADN (fase S do ciclo celular) por exposição a um impulso de timidina titulada a uma actividade específica elevada, utilizando 50 Ci/ml (actividade específica de 20 Ci/ /mmoles, New England Nuclear, Boston, MA) tal como anteriormente descrito (Broxmeyer, Η. E., et al., J. CLIN. 1NVEST., 79 (1987) 721; Broxmeyer, Η. E., et al., EXP. HEMATOL., 16 (1988) 594). BFU-E; Colocaram-se células da medula óssea de rato (2 x 10^ células/ml) em caixas para cultura de tecidos normalizadas de 35 mm contendo 1 ml de uma mistura de meio de Dulbecco modificado por Iscove, metilcelulose a 1,3%, soro de feto de bovino a 30%, 2-mercaptoetanol a 5 x 10"^M, hemina a 0,1 mM (Eastman Kodak Co., Rochester, NY) e 2 unidades de eritropoietina (r) em cultura de grelha tecidual (Amgen Corp,, Thousand Oaks, CA) (Broxmeyer, H. E., et al., J. CLIN. INVEST. 79 (1987) 721). Incubaram-se as 18- j culturas, tal como anteriormente descrito, para CFU-GM e efectua-ram-se os registos 7 dias após a incubação.

Estatística

Expressam-se os resultados como a média + 1 SEM de 3 placas por ponto para o ensaio CFU-GM e de 4 placas por ponto para o ensaio de BFU-E. Determinaram-se os níveis significativos para se efectuarem as comparações entre as amostras utilizando uma distribuição t de student.

RESULTADOS

Nos Quadros 1 e 2 que seguem indicam-se os resultados dos ensaios anteriormente descritos. -19- -19- s ιοι - ca C0 0 TU 0 ice ca Λ θ' rH /-Ν Ο ca d rH ca ca ca ca ca ca ca ca •r-l g β ο cn Ό -d- r—1 CN cn cn CN <n MU cn -3- <r cn MU O -d 0 w ca (U + ι 4-1 4-1 -H -H -H 4-i + 1 4-i -H 4-i 4-1 4-i + l 4-1 cn cn 0) ca cu TU ca i—l τ—Ι <N MU r—1 o Ο r—I o r- σ rH <r ca i ca ca MU ο o 00 r- MU MU 00 σο r- M3 U0 uo VQ σο 0 τυ .—1 rH β o Ή ΰ <υ « d '0 o 03 r—1 d w g ο o ca 0 Ο υ d o τ—1 <U '— u 0 ca tí tu d pH 0) tU 0Q β ca ca α ca Τ' ca ca ca ca ca ca ca ca cu rH 1 ca CN uo r-l 00 CN cn CN CN MU MU CN cn co CM uo TU ca d S •r-l ca ca S Ο d + 1 -Η 4-1 -H 4-1 -H 4-i -H 4-1 4-1 4-' 4-i 4-i 4-i 4-1 HiO Ή Ό O U d tH σ c^ co -cr O0 co CN M0 r- r- uo MU 1—1 ca ca ca β 0 -cí- ι-» r» MU LO <r -3" r- Γ- m -3- -3- ~3- <T 00 •H H cu Η α d c=. •'TJ co d CN CU CJ rH 1 β 1 d Ph a tu ca h ca o cu ο S TU s ου d ο cu 2 o ca ca ca ca ca ca ca TU o tu /-S ο OU r- CN Ό r-l MU -3- MU LTl r-» cn CN r-l H σ\ 1 \—1 rH O cu D I ca 6 cu + 1 + ι 4-i -H -H -H 4-1 -H 4-i 4-i 4-t 4-i -H 4-1 4-i 1—1 1¾ 1¾ ca o nuca iH C0 ca -3- o r- .—1 <3- i—1 <30 cn 00 σ\ o rH co CN d 1 o d cu ca Μ3 ο o uo LO MU vO o o co ιn MU MU LO O0 -μ PH d r—i TU Ή rH rH rH .—1 d H 0 6 'CU ca d O S a.0 O τυ Ό O 0 •Η 1—1 cu ca r—1 d Ο o co ϋ ·γ-ι pq ο o γΗ •r-l IO o <r (U o> d o s ca cu -η i—1 .—1 u 1 co ca ca ca ca ca o u ca X! Εη ca CN <r CN CN r-l r-l tH CN uo CN r—1 cn CN r—1 CN d ca C/3 •Η B CU -d LO υ d -Η + 1 4-1 -H 4-i 4-1 -H 4-1 4-1 4-1 -H + 1 4-i + 4-1 o ο α Ψ\ Ό o dO Γ'. 3 I—1 1^· ο MO CN MU r-- r·» o o co MU co r-~ un CN 0 rd Β 0 r-l <r m CN r-l r-l rd m cn r-l |H r-l tH t— CO o ϋ 0 Μ £3 ο iça o Ο o> ca d <a ph cn c3 ca cn ca Ϊ-Ι TU cu > 0 D s y-s ^-v pH O •rlica Eh ·· rH iH rH 0 o TU o> O ca rH B rH B B rH ca ca /-“s B /-s s. s bfl S d (U B d O tH rH rH \—1 bO rH rH rH tH bO bfl tí i—1 O TU u d tH B B 0 0 bO d B B 0 B àQ d d B bfl PH 0 u 0 \ d c MO d ca mh .—1 d bO bO bO bfl U0 bO bO bfl bfl M0 M0 CN bfl M0 •rl d d d d tí d MO CN tí d d d m CN CN - d o O o ca o d ·» *N Λ Λ MU o d o o o o Μ0 CN MU o o o M0 CM MU MU o .—1 O ((U (U ca o o o LO CN rH o o M0 CN rH »_S o »—s d d <ca CN CN rH \—1 \l r—1 MU cu w N-/ s*/ 'w' w —' —» N_/ '—^ CN CN UH 0 0 tu 1 1 d ca í ca i—! r-l rH rH rH .—1 CN CM CN CN CM CN .—1 PH i—1 PH PH H o o I 1 1 1 1 1 1 M l H •H •rl PH CM PH PH Ph PH PH ÍH PH PH P-t PH PH a (¾ a TU <U H H H H H 1—I M H H H H H H H <3 a a a S a a a a a a a a a a 4- a 4- ca α

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No que se refere ao Quadro 1, tanto ΜΊΡ-1 como MIP-2 aumentaram significativamente a produção de colónias e a formação de colonias-mais-cachos estimulada por 10 unidades/ml de nmuCSF-I ou de rmuGM-CSF. Registaram-se os níveis máximos de intensificação entre 1D0 e 200 ng/ml de MIP-1 ou de MIP-2 e concentrações ate 1000 ng/ml de MIP-1 ou de HIP-2 não intensificaram ainda mais a formação de colónias ou de cachos (não se indicam os dados). A combinação de MIP-1 e de MIP-2 não indicou um efeito superior quer ao de MIP-1 quer ao de MIP-2.

Com referência ao Quadro 2, nem MIP-1 nem MIP-2, para concentrações compreendidas entre 100 a 300 ng/ml estimularam a formação de colónias ou de cachos de CFU-GM da medula óssea de ratos na ausência de uma fonte de CSF adicionada (não se formando colónias e somente alguns cachos). Tanto MIP-1 como MIP-2 intensificaram a formação de colónias e de cachos de CFU-GM de medula óssea de rato estimuladas a um nível máximo por nmuCSF-1 ou rmuCSF-1 (100 unidades/ml de cada) mas a percentagem de intensificação verificada não era superior ã que se tinha observado quando se haviam estimulado as colónias e os cachos com concentrações sub-óptimas de CSF (10 unidades/ml). Os efeitos intensificadores de MIP-1 ou de MIP-2 mostraram-se idênticos quando se examinaram as colónias e as colónias-mais--cachos excepto quando se utilizaram 10 unidades/ml de nmuCSF-1 para se estimularem as células; neste caso a intensificação das colónias por MIP-1 ou MIP-2 foi superior â intensificação das -22 colõnias-maís-cachos. Verificaram-se os efeitos intensificadores de MIP quando se colocaram as células na ausência ou na presença -6 de indometacina 10 M. A actividade intensificadora de M1P-1 ou de MIP-2 também se tornou evidente na ausência de soro em sistemas de cultura e a intensificação foi evidente tanto para as colonias como para os cachos que continham apenas macrófagos ou que continham macrófagos e neutrófilos, quando se cultivaram as células na presença ou na ausência de soro. Apresenta-se os resultados nos Quadros 3 e 4 que se seguem. -23- co § 1 οι

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X

EXEMPLO IX

Especificidade das Actividades Intensificadoras Míelopoi-éticas de MIP-1 e MIP-2

Para se verificar se os efeitos intensificadores observados para MIP-1 e MIP-2 eram independentes, efectuou-se uma incubação prévia de preparações de MIP-1 e de MIP-2 com fracções de imuno-globulina purificada de anti-nmu MIP-1 de coelho ou com anti--soros anti-nmu MIP-2 de coelho antes de se adicionar MIP-1 ou MIP-2 às culturas que continham 10 unidades/ml quer de nmuCSF-1 quer de rmuGM-CSF. Na Figura 1 indicam-se os resultados represen tativos de 1 de 2 ensaios similares.

No que se refere â Figura 1, os próprios anti-corpos não possuem qualquer efeito sobre a formação das colónias ou dos cachos estimulada por CSF. Anti-MIP-1 neutralizou a actividade intensificadora mielopoiêtica de MIP-1 mas não a de MIP-2 e anti-MIP-2 neutralizou a actividade intensificadora mielopoié-tica de MIP-2 mas nao a de MIP-1; estes dados sugerem que os efeitos intensificadores de MIP-1 e de MIP-2 são independentes e específicos das próprias moléculas MIP.

Enquanto MIP-1 e MIP-2 intensificaram a formação de colónias e de cachos de CFU-GM estimulada por nmuCSF-1 e rmuGM--CSF tal como se notou anteriormente (Quadros 1-4) MIP-1 e MIP-2 não possuíram qualquer efeito na estimulação das colónias ou dos -26 cachos estimulados por rhuG-CSF (Quadro 2). As colónias e os cachos estimulados por rhuG-CSF mostraram ser compostas por > 957o de apenas granulócitos neutrófilos.

Também se ensaiaram MIP-1 e MIP-2 para se verificar a sua possível capacidade para intensificar a proliferação das células progenitoras eritrõides através da estimulação de BFU-E da medula óssea de rato, in vitro com concentrações sub-óptimas (0,25 a 0,5 unidades/ml; não se apresentam os dados) ou com concentrações óptimas (2 unidades/ml) de Epo. Não se verificou a formação de colónias BFU-E na presença de Epo. Nem MIP-1 nem MIP-2 a concentrações compreendidas entre 1 e 1000 ng/ml influen ciaram a formação de colónias BFU-E estimuladas por Epo. Apresen tam-se pormenorizadamente no Quadro 5 que se segue.os resultados anteriores. 27 QUADRO 5Influência de MIP-1 e MIP-2 na formação de colónias por células progenitoras (BFU-E) fu Ω PQ OU cd U a)Ό cd a) cn cnΌ cd

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✓

Os efeitos intensificadores mielopoiéticos de MIP-1 e de MIP-2 sobre as células da medula óssea de ratos não foram imitados por rhuIL-1, rmuIL-4, rhuIL-6, ou E. coli LPS (não se indicam os dados). Ensaiaram-se rhuIL-1 e rhuIL-6 os quais se titularam quanto à sua actividade sobre as células dos ratos, em concentrações de 1,5 e 10 ng/ml e não se verificou uma influência significativa sobre a formação de colónias ou de

cachos estimulada com 10 unidades/ml de nmuCSF-1 ou de rmuGM-CSF ou com 100 unidades/ml de rhuG-CSF. Para além disso, nem 10 ng/ml de rhuIL-1 nem rhuIL-6 influenciaram de modo significativo a formação de colónias ou de cachos na presença de 100 mg/ml de

MIP-1 ou de MIP-2 com 10 unidades/ml de nmuCSF ou de rmuGM-CSF (não se indicam os dados). Demonstrou-se previamente que rmuIL-4 apenas intensificada a formação de colónias e de cachos neutró- filos da medula óssea de ratos na presença de rhuG-CSF, não intensifica a formação de colónias ou de cachos de macrófagos de macrófagos-neutrófilos ou de neutrófilos estimulada com nmuCSF-1 ou rmuGM-CSF (Broxmeyer, Η. E., et al., J. IMMUNOL. 114 (1988) 3852. E. coli LPS que se ensaiou entre 0,01 e 100 g/ml (em acréscimo de dez vezes) na ausência ou na presença de indometa- cina 10 M não intensificou a formação das colónias ou dos cachos estimulada por 10 unidades/ml de nmuGM-CSF mas suprimiu, de um modo dependente da dose, os cachos e as colónias estimulados por

CSF, com uma inibição aparente de 93% com 100 g LPS/ml. A supressão induzida por LPS era ainda aparente e encontrava-se apenas minimamente neutralizada quando se colocaram as células -6 com indometacina 10 aM. i -29

EXEMPLO III

Influencia de MIP-1 e de MIP-2 sobre as Populações Purificadas de CFU-GM da Medula Ossea de Rato

Uma vez que CFU-GM produz ^ 0,5¾ da população de células da medula óssea não separadas (como parece evidente a partir da eficácia de clonagem das colónias e dos cachos <0,5% das células plaqueadas na presença de 100 unidades/ml de nmCSF-1 ou de rmGM-CSF no Quadro 2), não foi possível determinar a partir dos estudos referidos antes se MIP-1 e MIP-2 actuam directamente na intensificação da formação das colónias e dos cachos sobre CFU-GM ou se indirectamente através de acções sobre as células acessórias. Para se determinar se MIP-1 e MIP-2 actuam directamente sobre CFU-GM purificaram-se células da medula óssea de ratos (Williams, D. E., et al., EXP. HEMATOL. 15 (1987) 243 e avaliaram-se as preparações de MIP quanto à sua influência na formação de colónias e de cachos através de 200 células purifi-cadas/ml estimuladas com 50 unidades/ml de nmuCSF-1 ou de rmuGM-CSF. Na Figura 2 apresentam-se os resultados de um ensaio representativo de dois ensaios semelhantes. A eficácia de clonagem das colónias e dos cachos de diversas fracçÕes encontrava-se compreendida entre 15 e 44% quando se estimularam as células com nmuCSF-1 e no intervalo compreendido entre 17 e 39% quando se estimularam as células com rmuGM-CSF. Estas concentrações de CSF (50 unidades/ml) originam -30- Λ uma estimulação máxima ou muito próxima da estimulação máxima da formação das colónias e dos cachos por CFU-GM purificado quando se utilizou apenas um tipo de CSF, embora em combinações de CSFs possam originar uma eficácia de clonagem superior (Williams, D. E., et al., EXP. HEMATOL. 15 (1987) 1007). Tanto MIP-1 como MIP-2 (100 ng/ml) intensificam significativamente (p ^ 0,01) a formação de cachos e de colónias estimulada por CSF, por CFU-GM purificado em diversas fracções (Figura 2). Verificou-se uma eficiência de clonagem de até 82l e 657o para as células colocadas na presença de MIP mais nmuCSF-1 ou de MIP mais rmuGM-CSF, respectivamente. Estes resultados sugerem que MIP-1 e MIP-2 exercem efeitos directos sobre CFU-GM da medula óssea de rato, in vitro.

EXEMPLO IV

Actividade de Intensificação Mielopoiética de MIP-1 e de MIP-2 Relacionados com o Ciclo Celular

Para se avaliar se MIP-1 e MIP-2 possuíam efeitos preferen ciais sobre CFU-GM na fase S ou durante as partes do ciclo celular que não pertenciam a fases trataram-se por impulsos as células da medula óssea de rato com timidina não radioactiva (fria) ou com timidina triciada de elevada actividade específica antes de se ter efectuado uma lavagem e da colocação das mesmas na presença de 10 ou 100 unidades/ml de nmuCSF-1 ou de rmuGM-CSF e na ausência ou na presença de 100 ng/ml de MIP-1 ou de MIP-2. 0 Quadro 6 contém os dados de um de dois ensaios com resultados similares. -31-οΐ νθ § 3 l TU 3 !<S 3 3 > 3 · of*- 3 σΝΝ O rM 3 1 ! 3 3 rl PM 3 3 - I+H <n cm cn NOO cn <3- CM CO <r rH g S 3 3 rM rM 0 3 3 Μ 3 3 3 0) 3 + 1+1+1 + 1+1+1 + 1+1+1 + 1+1+1 3 O O > TU /-. cn rH H CO CM CM 003 O O CM 300 W 1 rH 3 3 cn ffi cn on cn CO Lp| CP cn cn cn co <r cn cn g i > Ό 0 cn Η M rM ^ 3 PM 3 Jti 3 H 3 4J o 3 3 g O cd cd TU > 3 Μ CD 3 3 3 4-1 4J •M i—1 Td 3 3 3 cd Ή t—l i—1 mj o 3 O /*Ν •rH 3 TU 3 ο cd c Pm + 1+ 1+ 1 + 1+1+1 + 1+1+1 + 1+1+1 U o cn «*> •U'—· Ό TU 4-1 3 t—1 cd cn rH 3 O lo o cn <r o CP P» <3" O MD as H'3 U o 3 O tU +> o o i—1 rH i—1 MD O O POffi S CM - cu CD Eh i—1 i—1 cO -d- 'd- r~H r—1 r-H 3 o CU 3 0 3 3 V "0 cd 3 CM 3 cn cd •M "rl 3 CM cu cd M 3 en 3 (4H -M 3 - cn rM i—1 i—1 cn cn cn CM CM rH CN CM rH Ml -H 0 Ό g r-v 3 O rM CD 3 MJ 3 0 cd i 3 + 1+1+1 + 1+1+1 + 1+1+1 + 1+1+1 tU 3(3 3 t—1 CD tu Η g cn MJ 3 Pm H pv +> 00 CPLO CM <r on cn MD LO vj ^ 3 3 T) CJ 33 'O- <r ui rH rH r—i CM CM CM O 3 0 cu cn 3l3 o S cu 3 Ot 3 tU •M O 3 3 +1+3 rQ +3 4-J 3 cn d) i cu cd •H CM CM CM <3 CP CM rH cn 3 o O CU (O + 1+1+1 + 1+1+1 + 1+1+1 + 1+1+1 O 3 TU 3 TU rM U 3 g 0 TU 00 CM O lo r~~!—i rM MD CM 00 CP <1· 3 0 3 O cu cd O H rM cn cn CM MD CO <T MD P' lo oo oo 0 3 0 13 cu i—1 i—1 r—1 rM 3 3 O cm cn 3 TU 3 3 i cn CM cn rH ΡΜΌ /-N g 3 3 <D hH y""s rH •M 3 3 3 g cd y—\ rH r—i g PM rH t-í S g Θ o B (U 3 s \ cn 0 g 3 3 tU /-s r-\ cn *—s cn /-> 3 0 0 3 .m cu cn t—l t—! 3 r—1 rM 3 rM rM TU i—1 r—1 O O i S 3 g & tU g g TU _g J3 3 J3_B 3 rH > CM η-j 3 3 TU 3 rM g •H M 3 cn cn 3) cn cn tU ra cn «rH cn cn rM 3 — 4-1 · g T) 3 3 •M 3 3 Ή 3 3 ti 3 3 3 Ml 3 3 LO g •tH tU -d ti TU *"3 ti tU tU 3 TU tU rH 3 O O CU 0 3 0 3 3 3 0 3 3 3 0 3 3 0 3 3 \ 3 “H •rH * tU O 3 rH TU TU rH TU TU rM TU TU o rH TU TU 0 3 3 m o Ο ·Μ ·Μ o Ο -Μ -M o O *M *M o 0 *rl Ή O rM •rl . 3 Λ cd cn o 3 ti 3 o 3 3 3 i—1 3 3 3 i—1 μ c α 3 ·Η J 3 •H cd 1—1 M 3 3 \—1 •u 3 3 —- μ 3 3 —' M> 3 3 3 +1 O 00 O tu V 3 3 3 3 (•M •rl CM W Ui cd O o o 0 o o Pm O o o Pm 0 o o 3 o<r 3 (CU cu 1—1 CD o o 1—1 CD o o cn CD O O cn CD O O 3 3 0 - 3 3 [ CM CM 1 CN CM α CM CM CD CM CM 1 CM rM O 3 rH cr Pm CU—' Pm 3 w w 1 3 —rs_r 1 3 w w g 3 B o <M cd cn 33 cn tU g TU g TU 3 3 |x! •M > 3 iM O r-t CM CD rM CN CD rH CM O rM CM 3 0 Ή H PM O I 1 0 1 l 0 1 1 0 1 1 3 3 cn 3 Ml 3 •M CM CM 3 •M PM CM 3 •M Pu CM 3 •M PM CU 4-J tU '3 3 cn g 3HH g 3 Η H g 3 Η H g 3 Μ H 3 3 3 3 O cd ti SSS ti g g g 3 g g g 3 gss 3 TU O -M rM Η ·Μ 3 <J MH 3 > 3 •rl T—l •rl I 3 (3 r—v •TN 4-1 g OO O C FQ CD P 3 0 3 ^ ·Η 3 3 +3 3 *5* (Γ -32-

Demonstrou-se que a estimulação das células com timidina fria não possuía qualquer efeito na subsequente formação de colónias ou de cachos pelas células (Broxmeyer, Η. E., et al., J. CLIN. INVEST. 79 (1987) 721; Broxmeyer, Η. E., et al., EXP. HEMATOL. 16 (1988) 594) e que tanto MIP-1 como MIP-2 intensificavam de modo significativo a formação de colónias e de cachos pelas células estimuladas em primeiro lugar com timidina fria. Como contraste,CFU-GM na síntese de ADN (fase S) na altura da exposição ao impulso com timidina triciada de elevada actividade específica foram aniquiladas e apenas CSF-GM que não se encontrava na fase S do ciclo celular no momento da exposição ao estimulo continuou a efectuar a sua proliferação como resposta a CSF para formar uma colónia ou um cacho. MIP-1 e MIP-2 não possuem actividade intensificadora mielopoiética sobre as células que foram primitivamente tratadas com impulsos de timidina titulada de elevada especificidade para remover CFU-GM da fase S. Estes resultados sugerem que as actividades intensificadoras mielo-poiéticas de MIP-1 e de MIP-2 se iniciam em grande parte ou totalmente durante a fase de síntese do ADN do ciclo celular de CFU-GM.

EXEMPLO V

Influencia de MIP-1 e de MIP-2 na Formação de Colónias e de Cachos por CFU-GM da Medula õssea Humana

Analisaram-se MIP-1 e MIP-2 (200 ng/ml) quanto aos seus -33- efeitos sobre a formação de colónias e de cachos por CFU-GM presente na fracção de baixa densidade de medula óssea humana normal. Colocaram-se as células numa concentração de 10^ células/ /ml na ausência ou na presença de 100 unidades/ml de rhuGM-CSF ou de rhuG-CSF e efectuaram-se os registos 7 e 14 dias após a incubação. As células da medula óssea humana de baixa densidade podem formar colónias e cachos na ausência de uma fonte exógena-mente adicionada de CSF, mas os números de colónias e de cachos formados estão relacionados com o número de células colocadas nas placas e constituem um resultado da libertação endógena de CSFs das células acessórias da medula. Indicam-se no Quadro 7 a seguir os resultados dos ensaios com células da medula óssea humana. Γ·'.

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O -35-

Nas duas esperiências indicadas, MIP-1 e MIP-2 na ausência de adição de CSF intensificaram de modo significativo a formação de colónias quando essas colónias se formaram na ausência de MIP, mas o mesmo não aconteceu quando essas colónias não se formaram na ausência de MIP, Tanto MIP-1 como MIP-2 intensificaram a formação de cachos na ausência de CSF adicionado exogenamente.

No 79 dia e no 149 dia MIP-1 e MIP-2 tinham intensificado significativamente a formação de cachos e de colónias por CFU-GM estimulada com rhuGM-CSF, mas de modo similar aos resultados observados para a formação de colónias e de cachos no rato estimulada por G-CSF (Quadro 2), nem MIP-1 nem MIP-2 intensificaram a formação de colónias ou de cachos das células da medula óssea humana estimuladas com rhuG-CSF. A comparação dos dados anteriores com os referidos na literatura indica que as outras citoquinas conhecidas não parecem de modo algum imitar as actividades intensificadoras mielopoiiticas de MIP-1 e de MIP-2, pelo que estas acções parecem actualmente ser únicas. Algumas moléculas sem actividades CSF independente podem modular 'a mielopoiese de um modo positivo, mas o tipo de actividade intensificadora notada com MIP-1 e MIP-2 não foi duplicado pelos presentes inventores com factores tais como IL-1 alfa, IL-6, ou.com LPS bacteriano. Verificou-se previamente que IL-4 actua de modo sinérgico com G-CSF para intensificar a formação de colónias de neutrófilos (Broxmeyer, Η. E,, et al., J. IMMUNOL. 141 (1988) 3852), mas MIP-1 e MIP-2 -36- f 1 / não intensificam a actividade de rhuG-CSF nas células da medula óssea de seres humanos ou de ratos, e IL-4 não intensifica as actividades de nmuCSF-1 e de rmuGM-CSF (Id.).

Além disso, observações não publicadas indicam, que IL-5 actua como CSF-eosinófilico e que MIP-1 ou MIP-2 não estimularam ou intensificaram a formação de colónias ou de cachos de eosinó-filos quando estudados pelos presentes inventores. Não se demonstrou que IL-2 intensificasse directamente os numeros de CFU-GM (Broxmeyer, Η. E., et al., CRG CRIT. REV. ONCOL./HEMATOL. 8i (1988) 173). No tipo de ensaios nas esperiincias aqui apresentadas, os factores de necrose de tumor, os interferões, e a isoferritina ácida suprime a formação de colónias (Broxmeyer, H. E. et al., GRC CRIT. REV. ONCOL./HEMATOL. 8 (1988) 173; Williams, D. E. et al., CÂNCER RES. 48 (1988) 1548). A activina intensifica e a inibina suprime a formação de colónias BFU-E por uma acção mediada através de linfócitos T e de monócitos, mas não possui qualquer efeito sobre a formação de colónias de CFU-GM (Broxmeyer, Η. E., et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 85 (1988) 9052). As prostaglandinas 1 e 2 de tipo E intensificam a formação de colónias de BFU-E mas suprimem a formação de colónias de CFU-GM (Lu, L., et al., J. IMMUNOL. 139 (1987) 1823). Os efeitos que têm vindo a ser referidos do factor-beta de transformação de crescimento também não são consistentes com os efeitos que aqui se verificaram para MIP-1 e MIP-2 (Sing, G. K., et al., BLOQD 72 (1988) 1504; Ottman, 0. G., et al., J, IMMUNOL. 14 (1988) 2661). -37-

Em resumo, a presente invenção constitui o desenvolvimento de ensaios in vitro com as proteínas inflamatórias de macrófagos de murino purificadas recentemente identificadas (MIPs). Ensaiaram-se MIP-1 e MIP-2 separadamente, conjuntamente e em combinação com GM-CSF de murino (mu) recombinantes (r) purificados, muCSF-1 naturais (n) ou com G-CSF humano (hu), quanto aos seus efeitos sobre CFU-GM da medula óssea do rato; em combinação com eritropoietina quanto aos efeitos sobre BFU-E da medula óssea de rato; e em combinação com rhuGM-CSF ou com rhuG-CSF quanto aos efeitos sobre CFU-GM da medula óssea humana. MIP-1 e MIP-2 nao estimularam de modo independente mas intensificaram até 3 vezes a formação de colónias de CFU-GM de rato estimuladas conjuntamente com rmuGM-CSF e com nmuCSF-1, mas não o fizeram com rhuG-CSF na ausência ou na presença de soro. MIP-1 e MIP-2 demonstraram uma actividade máxima em concentrações ^ 100 ng/ml e as suas acções parecem iniciar-se durante a parte sintética do ADN do ciclo celular. Nem MIP-1 nem MIP-2 em concentrações até 1 yjig/ml demonstraram qualquer efeito sobre BFU-E de rato, na ausência ou na presença de eritropoietina. Tanto MIP-1 como MIP-2 possuem efeitos de acção directa sobre CFU-GM purificado de rato. A Eficácia de clonagem de 200 células purificadas colocadas com 50 unidades de muCSF-1 foi de 821 com MIP e de 43% sem MIP; a eficácia de clonagem com 50 unidades de rmuGM-CSF foi de 652 com MIP e de 35% sem MIP. -38-

Os efeitos de MIP não foram de modo algum imitados por LPS bacteriano, rhuIL-1 , rhuIL-6 ou rmuIL-4, e foram neutralizados pelos seus próprios respectivos anticorpos específicos. MIP-1 e MIP-2 também intensificaram a formação de colónias estimulada de modo endógeno e a formação de colónias estimulada por rhuGM-CSF mas não intensificaram a formação de colónias estimuladas por rhuG-CSF por CFU-GM da medula óssea humana. Estes resultados demonstram um novo desempenho de MIP-1 e de MIP-2, in vitro, como intensificadores de actividades mielopoiéticas para CFU-GM. A presente invenção pode ser caracterizada de outros modos ou efectuada de acordo com outras vias sem que isso constitua um afastamento do espírito ou das características essenciais da presente invenção. Deverá considerar-se a presente invenção em todos os seus aspectos ilustrativos, que de modo algum restringem o âmbito da presente invenção que se encontra indicado nas reivin dicações em anexo, tendo em atenção que todas as alterações que lhe possam ser feitas e que sejam equivalentes se encontrem englobadas no âmbito da presente invenção.

Claims

-39- REIVINDIC AÇÕES 1,- Anticorpo para um antigénio presente num agente para promoção da produção de células sanguíneas mielopoiéticas, exibin do o antigénio para o qual o referido anticorpo é aumentado as seguintes actividades: é susceptível de intensificar a actividade do factor estimulante da colónia mielopoiética; liga-se ã hepari-na; e induz a inflamação localizada, caracterizado pelo facto de infiltrar células polimorfonucleares quando administrado por via subcutânea
2.- Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o antigénio se ligar à heparina para concentrações de sal elevadas. 40-
3.- Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, carac terizado pelo facto de o antigénio ser uma citocina selecciona-da entre o grupo constituído por citocina inflamatória MIP-1, citocina inflamatória MIP-2 e suas misturas.
4.- Anticorpo para um antigénio de origem humana pre sente em um agente para a promoção da produção de células sanguíneas mielopoiéticas, caracterizado pelo pelo facto de o refe rido antigénio para o qual o referido anticorpo é aumentado apresentar as seguintes actividades: é susceptível de intensifi car a actividade do factor estimulante da colónia mielopoiéti-ca; liga-se à heparina; induz a inflamação localizada; e infiltra células polimorfonucleares quando administrado por via subcutânea .
5.- Anticorpo para um antigénio obtido a partir de ratos presente em um agente para a promoção da produção de célu las sanguíneas mielopoiéticas, caracterizado pelo facto de o re ferido antigénio para o qual o referido anticorpo é aumentado apresentar as seguintes actividades: é susceptível de intensifi car a actividade do factor estimulante da colónia mielopoiéti-ca; liga-se à heparina; induz a inflamação localizada; e infiltra células polimorfonucleares quando administrado por via subcutânea .
6.- Anticorpo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo facto de ser um anticorpo po liclonal.
7.- Anticorpo policlonal obtido a partir de coelhos, cabras, ovelhas ou outros mamíferos ou a partir de frangos, para .-41 I um antigénio presente em um agente para a promoção da produção de células sanguíneas mielopoiéticas, caracterizado pelo facto de o referido antigénio para o qual o referido anticorpo é aumentado apresentar as seguintes actividades: é susceptível de intensificar a actividade do factor estimulante da colónia mielopoiética; liga-se à heparina; induz a inflamação localiza da; e infiltra células polimorfonucleares quando administrado por via subcutânea.
8. - Anticorpo de acordo com uma qualquer das reivin dicações 1 a 5, caracterizado pelo facto de ser um anticorpo monoclonal.
9. - Anticorpo de acordo com a reivindicação 8, carac terizado pelo facto de ser obtido a partir de células de hibri-dona.
10. - Anticorpo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo facto de a célula de hibridoma ser um produto da fusão de um linfócito do baço de rato e uma célula de mieloma.
11. - Anticorpo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo facto de ser marcado com uma marca detectável escolhida de entre produtos químicos que provocam fluorescência, enzimas e elementos radioactivos. Lisboa, 16 de Janeiro de 1991 CHcíaí -:!a [sf0pr.*8dade