WO2020053467A1 - Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico, estratificación y/o seguimiento de pacientes con artritis reumatoide - Google Patents

Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico, estratificación y/o seguimiento de pacientes con artritis reumatoide Download PDF

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WO2020053467A1
WO2020053467A1 PCT/ES2019/070608 ES2019070608W WO2020053467A1 WO 2020053467 A1 WO2020053467 A1 WO 2020053467A1 ES 2019070608 W ES2019070608 W ES 2019070608W WO 2020053467 A1 WO2020053467 A1 WO 2020053467A1
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rbm3
srsf10
snrnp70
rbm17
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PCT/ES2019/070608
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Inventor
Raul LUQUE HUERTAS
Carlos Perez Sanchez
Justo P. CASTAÑO FUENTES
Alejandro IBAÑEZ COSTA
Sergio PEDRAZA ARÉVALO
Mercedes DEL RIO MORENO
Nuria BARBARROJA PUERTO
Yolanda JIMENEZ GOMEZ
Rosario LOPEZ PEDRERA
Eduardo COLLANTES ESTÉVEZ
Rafaela ORTEGA CASTRO
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Servicio Andaluz De Salud
Universidad de Córdoba
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers

Definitions

  • the present invention is within the field of precision medicine, and refers to a method of obtaining useful data for the diagnosis, stratification and / or monitoring of patients with rheumatoid arthritis.
  • RA Rheumatoid arthritis
  • RA Rheumatoid arthritis
  • RA is considered a complex genetic disease, in which various genes, environmental, ethnic, geographic, and nutritional factors interact to cause pathological events.
  • the onset of the disease appears to be triggered by environmental factors, based on a genetic predisposition combined with repeated activation of the innate and adaptive immune system, leading to loss of immune tolerance, aberrant presentation of self-antigens, and activation of B and T lymphocytes, monocytes and dendritic cells, which promote an inflammatory response that culminates in a process of synovial hyperplasia, bone destruction and multisystemic involvement.
  • RF rheumatoid factor
  • anti-CCP cllululinated cyclic peptide antibodies
  • splicing During gene transcription, the process of removing sense sequences (introns) and splicing of coding sequences (exons) is called splicing. To carry out this process, there is a very complex molecular machinery in the cell nucleus: the spleiceosome. Splicing can originate different genetic messages (mRNAs) from a single genomic sequence (DNA) in a process called alternative splicing (AS), which affects the quantitative control of gene expression and the functional diversification of proteins. Its presence and influence on the clinical evolution and therapeutic response has been demonstrated in tumor and inflammatory pathologies, although it has not been characterized in the field of RA.
  • mRNAs genetic messages
  • AS alternative splicing
  • prognostic biomarkers that can predict the course of the disease and provide information on the possible response to treatment is an important challenge, since they can help the clinician to predict the evolution of arthritis undifferentiated to RA, or to predict the severity of RA. , which presents great variability. It could also help to identify subgroups of patients with a higher risk of complications, faster evolution or worse response to treatment, which would allow earlier interventions, more intensive treatment or identify groups of patients who may respond better to one therapy than another. All this would represent an essential step in the management of patients with RA, especially in patients of recent onset, allowing the creation of a personalized medicine model aimed at better management of the patient together with an improvement in costs and risk analysis- benefit of drugs, achieving the highest response rate with minimum toxicity. DESCRIPTION OF THE FIGURES
  • Figure 2 Logistic models for diagnosis of RA patients.
  • Figure 3 Logistic models for the identification of RA patients with high disease activity.
  • A Specificity, sensitivity and cut point values of the ROC curves;
  • B ROC curves, indicating area under the curve ⁇ AUC) and statistical significance (p value);
  • C Values of b for each value of x, and value of the constant b 0 in the 3 leukocyte subtypes studied;
  • D Formula of the proposed logistics model.
  • Figure 4 Logistic models for the identification of RA patients with atheroma plaques.
  • A Specificity, sensitivity and cut point values of the ROC curves;
  • B ROC curves, indicating area under the curve (AUC) and statistical significance (p value);
  • C Values of b for each value of x, and value of the constant b 0 in the 3 leukocyte subtypes studied;
  • D Formula of the proposed logistics model.
  • Figure 5 Logistic models for the identification of RA patients with radiological involvement.
  • the present invention is a complement to the diagnosis, stratification and / or monitoring of patients with RA.
  • the creation of the biomarker evaluation models proposed here allows: 1) to discriminate between healthy individuals and RA patients with high sensitivity and specificity, 2) to clinically stratify patients based on disease activity, radiological damage, and associated comorbidities such as cardiovascular disease; and 3) facilitate the clinical follow-up of these patients, contributing to the development of personalized medicine.
  • the present invention proposes the standardized evaluation of a panel of biomarkers, in this case related to the splicing machinery, in leukocytes from RA patients. This information would allow, for example, the development of a chip or array for the stratification of patients in various risk groups and the definition of their specific needs for clinical monitoring and therapeutic management.
  • the deregulation of the splicing process of messenger RNA molecules, or splicing is emerging as a hallmark in various pathologies.
  • the analysis of the splicing machinery, or spiceosome, and the associated splicing factors in autoimmune and rheumatic diseases are performed.
  • the objective of the present invention has been to identify, in different leukocyte subtypes (monocytes, lymphocytes, and neutrophils) of RA patients, the alterations present in the spleiceosome and the factors responsible for splicing, as well as their influence on the activity of the disease and its inflammatory and atherothrombotic profiles.
  • the authors of the present invention have evaluated, using a microfluidic qPCR-array, a set of 45 constituent elements of the splicing system, selected based on their role - previously demonstrated - in the pathophysiology of numerous tumor and inflammatory diseases. Analyzes were carried out on total RNA purified from monocytes, lymphocytes and neutrophils from 74 RA patients and 29 healthy donors, obtained using a positive immunomagnetic selection system. An extensive analysis of clinical and serological markers of the disease was carried out in parallel (Table 1).
  • Lymphocytes TCERG1, ESRP2, NOVA 1, PRPF8, PTBP1, RBM17, RBM3, KHDRS1, SF3BM, SRSF4, SRSF6, SRSF10, TIA1, SNRNP70, UA2F2, RNU4ATAC, SNRNP200.
  • Neutrophils - CELF1, FBP11, NOVA1, PRPF8, PTBP1, RAVER1, RBM17, RBM22, RBM3, KHDRS1, SF3BTV1, SF3BTV2, SRSF2, SRSF3, SRSF4, SRFSF9, SRSF10, TIA, TRS1, TRA2, TRS1 UA2F2, RNU4ATAC, SNRNP200, RNU6-1.
  • the observed alteration of different components of the splicing system in circulating cells of the immune system of these patients could be associated with the generation of different pathological protein isoforms that could contribute to the development and progression of RA.
  • the evaluation of these components involves the identification of novel biomarkers for the typification of the disease with a potential for industrial exploitation, so that, by analyzing these factors in whole blood, it would be possible to identify RA patients with the aforementioned clinical classification criteria. without the need for additional ultrasound or radiological tests.
  • the regulation of the expression or function of these factors represents a new specific therapeutic target for the administration of new treatments and / or existing drugs, used in spliceopathies, which exert their action on the spliceosome and therefore represent a potential treatment. alternative or complementary in this pathology.
  • a first aspect of the invention relates to the use of the expression levels of TCERG1, ESRP1, RBM17, RBM3, RBM45, KHDRS1, SRSF3, SRSF4, SRSF5, SRSF6, SRFSF9, SRSF10, TIA 1, TRA2A, SNRNP70, RNU12, U2AF1, UA2F2, RNU4ATAC, SNRNP200, RNU6-1, or any of their monocyte combinations, from TCERG1, ESRP2, NOVA 1, PRPF8, PTBP1, RBM17, RBM3, KHDRS1, SF3BM, SRSF4, SRSF4, SRSF4, SRSF4, SRSF4, SRSF4, SRSF4, SRSF4, SRSF4, SRSF4, SRSF4, SRSF4, SRSF4, SRSF4, SRSF4, SRSF4, SRSF4, SRSF4, SRSF4, SRSF4, SRSF4, SRSF4, SRSF4, SRSF4, SRSF4, SR
  • genes and / or proteins can be simultaneous or any of the genes and / or proteins or any of their combinations can be chosen.
  • the determination of the expression levels of combinations of various biomarkers can allow greater sensitivity and specificity in the diagnosis, prognosis, classification and monitoring of patients suffering from an autoimmune disease, preferably rheumatoid arthritis. Description of the biomarkers of the invention
  • a second aspect of the invention refers to a method of detection, diagnosis, prognosis and stratification of patients suffering from an autoimmune disease, hereinafter the first method of the invention, which comprises: a) Quantifying the expression levels of
  • SF3Btv1, SRSF4, SRSF6, SRSF10 TIA 1, SNRNP70, UA2F2, RNU4ATAC, SNRNP200, or any of their combinations in lymphocytes, and of
  • step (b) assign the patients who have different and statistically significant expression levels obtained in step (b) to the reference value or to the levels of the reference sample, to the group of individuals at risk of suffering from an autoimmune disease, or to the group of individuals suffering from rheumatoid arthritis.
  • the level of expression is considered increased where the difference between the test sample and the reference sample is at least 1.1 times, 1.5 times, 5 times, 10 times, 20 times, 30 times, 40 times, 50 times, 60 times, 70 times, 80 times, 90 times, 100 times or even more.
  • a decrease in expression with the reference value is considered where the difference between the test sample and the reference sample of at least 0.9 times, 0.75 times, 0.2 times, 0.1 times, 0 0.05 times, 0.025 times, 0.02 times, 0.01 times, 0.005 times or even less.
  • the method according to the preceding claim comprises assigning the patients who have statistically significant lower expression levels obtained in step (b) to the reference value or to the levels of the reference sample, to the group of individuals at risk of rheumatoid arthritis.
  • the authors of the present invention have also identified a signature of 8 integral elements of the splicing machinery with the same alteration pattern in the three leukocyte subtypes analyzed (RBM17, RBM3, KHDRS1, SRSF10, SNRNP70, UA2F2, RNU4ATAC and / or SNRNP200) (Figure 1).
  • the expression levels of RBM17, RBM3, KHDRS1, SRSF10, SNRNP70, UA2F2, RNU4ATAC and / or SNRNP200, or any of their combinations are quantified, and preferably the expression levels of all these are quantified. biomarkers simultaneously.
  • A1 1 / [1 + e A - [- 25.015204 + [(- 0.000135 * RBM 17) + (0.000031 * RBM3) + (-
  • A2 1 / [1 + e A - [0, 12461 + [(0.000003 * RBM17) + (- 0.000001 * RBM3) + (-
  • A3 1 / [1 + e A - [1, 442807 + [(0.000000 * RBM17) + (- 0.000002 * RBM3) + (-
  • a fourth aspect of the invention relates to a method for the classification, diagnosis and monitoring of RA patients, hereinafter the second method of the invention, comprising steps (a) and (e) according to the first method of the invention , and further comprises: d1) classifying the individual from step (a) in the group of individuals with rheumatoid arthritis when the value of the index A1 of step (a1) is preferably less than 0.0000015, preferably less than 0.000015, and even more preferably less than 0.5; when the value of the index A2 of step (a1) is preferably less than 0.8438, preferably less than 0.9035, and even more preferably less than 0.9271; when the value of the index A3 of step (a1) is preferably less than 0.6872, preferably less than 0.6954 and even more preferably less than 0.7005.
  • step (d2) classify the individual from step (a) into the group of individuals with RA with high disease activity when the value of the index B1 from step (a2) is preferably less than 0.11717, preferably less than 0.187, and even more preferably less than 0.3754; when the value of the index B3 of step (a2) is preferably less than 0.2045, preferably less than 0.2178, and even more preferably less than 0.227.
  • step (d3) classify the individual from step (a) into the group of individuals with RA and atheroma plaques when the value of the index C1 from step (a2) is preferably less than 0.4869, preferably less than 0.4981, and even more preferably less than 0.503; when the value of the index C2 of step (a2) is preferably less than 0.6625, preferably less than 0.7087, and even more preferably less than 0.7433; when the value of index C3 from step (a2) is preferably less than 0.2623, preferably less than 0.279 and even more preferably less than 0.4028.
  • step (d4) classify the individual from step (a) into the group of individuals with RA and radiological involvement when the value of the index D1 from step (a2) is preferably less than 0.5384, preferably less than 0.6139, and even more preferably less than 0.664; when the value of the index D2 of step (a2) is preferably less than 0.5; when the value of the index D3 of step (a2) is preferably less than 0.4021, preferably less than 0.467 and even more preferably less than 0.5061.
  • a fifth aspect of the invention relates to a method of monitoring the evolution of rheumatoid arthritis, hereinafter second method of the invention, comprising steps (a) and (c) of the first method of the invention, and it further comprises: d) repeating at least twice the sequence of steps (a) - (c) in samples obtained from the same individual according to step (a), not simultaneously.
  • steps (a), (b), (c) and / or (d) of the methods described above can be fully or partially automated and / or computerized, for example, by means of robotic equipment of liquid dispensing in step (a), robotic sensor equipment for quantity detection in step (b), or computerized comparison in step (c).
  • step (c) of the method of the invention can be performed manually or computer-assisted.
  • Suitable reference amounts can be determined by the method of the present invention from one or more reference samples that can / can be analyzed, for example, simultaneously or consecutively together with the test biological sample.
  • the reference sample / s may / may be negative control / s, that is, the amounts detected by the method of the invention in samples that come from clinically well documented individuals and that do not suffer from the disease or deficiency.
  • the biological sample isolated from an individual in step (a) is a sample comprising monocytes, lymphocytes and / or neutrophils.
  • expression product also called “gene product” refers to the biochemical material, either RNA (for example microRNA) or protein, resulting from the expression of a gene. Sometimes a measure of the amount of gene product is used to infer how active a gene is.
  • Quantification of the expression product of the biomarkers, or detection of the expression of their corresponding genes can be carried out by any of the methods known in the state of the art.
  • quantification is performed by polymerase chain reaction (PCR) or a technique that includes PCR, and more preferably by real-time PCT (Q-RT-PCR).
  • PCR polymerase chain reaction
  • Q-RT-PCR real-time PCT
  • the measurement of the expression levels of a gene is based on a signal that is obtained directly from the transcripts of said genes (mRNA, microRNA, etc.), and that is directly correlated with the number of molecules of RNA produced by genes.
  • a signal - which we can also refer to as an intensity signal - can be obtained, for example, by measuring an intensity value of a chemical or physical property of said products.
  • indirect measurement refers to the measurement obtained from a secondary component or a biological measurement system (for example the measurement of cellular responses, ligands, "labels" or products of enzymatic reaction).
  • the preferably used technique is Q-RT-PCR.
  • Q-RT-PCR Q-RT-PCR.
  • This technique is carried out in an apparatus called a thermocycler that maintains the necessary temperature in each of the stages that make up a cycle.
  • Real-time detection is based on the use of fluorescent labels (probes) that bind to all double-stranded DNA sequences formed in the cycles of the PCR reaction. Once the marker binds to the double-stranded nucleic acid, it emits a fluorescent signal that is processed in real time (Walter et al., 2002, Science, 296, 557-559). The cycle at which the emission of the intensity of the fluorescent marker exceeds a certain threshold is called Ct.
  • the expression levels of a microRNA are calculated as 2 ct
  • Biomarker of the invention can be evaluated by any of a wide variety of methods well known to the person skilled in the art to detect the expression of a transcribed molecule or its corresponding protein. If the biomarkers are nucleic acid molecules, expression can be detected and / or quantified using nucleic acid hybridization, nucleic acid reverse transcription methods, nucleic acid amplification methods, and the like.
  • the expression of a marker gene is evaluated by preparing mRNA / cDNA (i.e., a transcribed polynucleotide) from a sample, and by hybridizing the mRNA / cDNA with a reference polynucleotide that is complementary to a polynucleotide comprising the marker gene, and / or fragments thereof.
  • mRNA / cDNA i.e., a transcribed polynucleotide
  • the cDNA can optionally be amplified using any of several polymerase chain reaction methods prior to hybridization with the reference polynucleotide.
  • a “diagnostic method” refers to a procedure where a patient (or a sample obtained from him) is examined or analyzed to obtain differential knowledge of a disease through the signs and symptoms that they characterize it.
  • diagnosis in the present application refers to the ability to discriminate between patients suffering from autoimmune disease, preferably rheumatoid arthritis, and patients who do not suffer from autoimmune disease, preferably rheumatoid arthritis. This discrimination as understood by an expert in the field does not claim to be correct in 100% of the samples analyzed. However, it requires that a statistically significant amount of the analyzed samples be classified correctly.
  • the amount that is statistically significant can be established by a person skilled in the art through the use of different statistical tools, for example, but without limitation, through the determination of confidence intervals, determination of the p-value, Student test or discriminant functions of Flsher.
  • the confidence intervals are at least 90%, at least 95%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%.
  • the p value is less than 0.1, 0.05, 0.01, 0.005, or 0.0001.
  • the present invention allows to correctly detect the disease differentially in at least 60%, in at least 70%, in at least 80%, or in at least 90% of the subjects of a certain group or population analyzed.
  • a “prognostic method” refers to a procedure where, from clinical analyzes, the disease or condition, such as autoimmune disease, preferably rheumatoid arthritis, is identified that the person suffers from, and from from experiences with other patients afflicted with the same disease or illness, such as an autoimmune disease, preferably rheumatoid arthritis, it is predicted how the individual's health status will be in the future; that is, the evolution of the disease or illness over time.
  • the term “prognosis” in the present invention also refers to the ability to detect asymptomatic patients or subjects who have a high probability of suffering from a disease or condition, such as autoimmune disease, preferably arthritis.
  • rheumatoid even when at the time of diagnosis they do not present these pathologies or their evident manifestations.
  • an assessment while preferred to be, may not normally be correct for 100% of the subjects to be forecast.
  • the term requires that a statistically significant part of the subjects can be identified as suffering from or predisposing to the disease. Whether a part is statistically significant can be readily determined by the person skilled in the art using various well-known statistical evaluation tools, for example, Confidence Interval determination, p-value determination, Student's t-test, Mann-Whitney test. , etc.
  • the preferred confidence intervals are at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95%.
  • the p values are preferably but not limited to 0.2, 0.1, 0.05.
  • autoimmune disease preferably rheumatoid arthritis. Therefore, in a preferred embodiment of this aspect of the invention, monitoring is performed post-treatment.
  • non-simultaneous refers to the acquisition of two or more samples of tissue, blood (which also includes plasma and serum) or urine where there is a time interval between the acquisition of the samples that allows monitoring of autoimmune disease, preferably rheumatoid arthritis and / or useful prognosis by comparing the amounts of mRNA and / or protein in the different samples.
  • the Time Interval is between 1 month and 20 years, such as between 1 month and 10 years, 1 month and 5 years or 1 month and 1 year.
  • the time interval between sample acquisition is approximately 1 month.
  • the time interval between sample acquisition is approximately 2 months.
  • the time interval between sample acquisition is approximately 3 months.
  • the time interval between sample acquisition is approximately 6 months.
  • the time interval between sample acquisition is approximately 1 year.
  • the time interval between sample acquisition is approximately 1.5 years.
  • the time interval between sample acquisition is approximately 2 years.
  • the time interval between sample acquisition is approximately 3 years.
  • the time interval between sample acquisition is approximately 5 years.
  • the degree of identity between two sequences can be determined by conventional methods, for example, by means of standard sequence alignment algorithms that are known in the state of the art, such as BLAST (Altschul SF et al. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 1990 Oct 5; 215 (3): 403-10).
  • BLAST Altschul SF et al. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 1990 Oct 5; 215 (3): 403-10).
  • a “biological sample”, as defined herein, is a small part of a subject, representative of the whole, and may consist of a biopsy or a sample of body fluid.
  • Biopsies are small pieces of tissue and can be fresh, frozen, or fixed, such as formalin-fixed and paraffin embedded FFPE.
  • Body fluid samples can be blood, plasma, serum, urine, sputum, cerebrospinal fluid, milk, or ductal fluid samples and can also be fresh, frozen, or fixed.
  • the samples can be removed surgically, by extraction, that is, by hypodermic or other needles, by microdissection or laser capture.
  • the sample should contain any biological material suitable to detect the desired biomarker or biomarkers, therefore, said sample should advantageously comprise material from the cells of the subject.
  • the sample is a body fluid sample such as a plasma, serum and / or blood sample.
  • a "plasma, serum and / or blood sample” refers to a sample obtained by a non-invasive method.
  • a non-limiting example known to a person skilled in the art would be by drawing a blood sample from an individual using a needle. If one wanted to obtain a plasma or serum sample, the plasma / serum would be separated from the other components of the blood by centrifugation.
  • the amount of biomarkers of the invention can be analyzed, for example, but not limited, in samples of plasma, serum and / or fresh blood or plasma, serum and / or blood that has been frozen and then thawed.
  • a "urine sample” refers to a sample obtained by a non-invasive method.
  • a non-limiting example known to a person skilled in the art would be by collecting the urine of an individual in a sealable container.
  • the amount of biomarkers of The invention can be tested, for example, but not limited, to samples of fresh urine or urine that has been frozen and then thawed.
  • the sample is a sample of
  • the terms "individual”, “patient” or “subject” are used interchangeably in the present description, and are not intended to be limiting in any respect, and may be the “individual”, “Patient” or “subject” of any age, sex and physical condition.
  • a "tissue sample”, “tissue sample” or “isolated tissue / tissue sample” includes, but is not limited to, cells and / or tissues from a subject, obtained by any method known to one skilled in the art.
  • the tissue sample may be, for example, but not limited to, a biopsy or a fine needle aspiration.
  • the cells are tumor cells.
  • the tissue sample is a bladder and / or colon tissue sample.
  • the measurement of the quantity or concentration can be carried out directly or indirectly, as previously indicated in the present description.
  • Direct measurement refers to the measurement of the quantity or concentration of the expression products, based on a signal that is obtained directly from the expression products, and that is correlated with the number of molecules of said expression products.
  • Said signal -which we can also refer to as an intensity signal- can be obtained, for example, by measuring an intensity value of a chemical or physical property of said expression products.
  • Indirect measurement includes measurement obtained from a secondary component or biological measurement system (eg, measurement of cellular responses, ligands, "tags" or enzymatic reaction products).
  • a “reference sample” refers to a similar sample obtained from a control subject or individual (patient) that does not have the disease or condition, such as an autoimmune disease, preferably rheumatoid arthritis, that is intended to be diagnosed or predicted.
  • the "reference quantity” or “reference level” refers to the absolute quantity (or levels) obtained from the reference sample.
  • a “reference sample” may also refer to a similar sample obtained from the same subject or individual in an earlier point in time.
  • a “reference value” refers to the set of values that are used to interpret the results of diagnostic, prognostic and / or follow-up tests on a subject or individual (patient). For example, reference values for a given test are based on the results of that same test in 95% of the healthy population. The reference values of a test can be different in different groups of people (for example, between women and men, or between children and adults). It can also be called “reference interval”, “reference limit”, and "normal limit.
  • a fourth aspect of the present invention relates to a kit or device, hereinafter kit or device of the invention, comprising the elements and / or reagents necessary to quantify the levels of the gene expression product I) TCERG1, ESRP1, RBM17, RBM3, RBM45, KHDRS1, SRSF3, SRSF4, SRSF5, SRSF6, SRFSF9, SRSF10, TIA 1, TRA2A, SNRNP70, RNU12, U2AF1, UA2F2, RNU4AT, RNU4AT, RNU4AT, RNUNAT200 their monocyte combinations,
  • the kit or device of the invention comprises the elements necessary to quantify the expression levels of RBM17, RBM3, KHDRS1, SRSF10, SNRNP70, UA2F2, RNU4ATAC and / or SNRNP200, or any of their combinations, and preferably said levels of expression simultaneously.
  • kit or device of the invention comprises primers, probes and / or antibodies capable of quantifying the expression product of RBM17, RBM3, KHDRS1, SRSF10, SNRNP70, UA2F2, RNU4ATAC and / or SNRNP200, and where:
  • the primers or primers are polynucleotide sequences of between 10 and 30 base pairs, more preferably between 15 and 25 base pairs, even more preferably between 18 and 22 base pairs, and still much more preferably around 20 base pairs, having an identity of at least 80%, more preferably of at least 90%, even more preferably of at least 95%, still much more preferably of at least 98%, and particularly 100 %, with a fragment of the complementary sequences to SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO : 42 and / or SEQ ID NO: 43.
  • the probes are polynucleotide sequences of between 30 and 1100 base pairs, more preferably between 100 and 1000 base pairs, and even more preferably between 150 and 500 base pairs, which have an identity of at least 80% , more preferably at least 90%, even more preferably at least 95%, still much more preferably at least 98%, and particularly 100%, with a fragment of the sequences complementary to SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 and / or SEQ ID NO: 43.
  • the primers or probes are modified, for example, but not limited, by radioactive or immunological labeling.
  • the oligonucleotides present modifications in some of their nucleotides, such as, but not limited to, nucleotides that have any of their atoms with a radioactive isotope, normally 32P or tritium, labeled nucleotides! immunologically, such as with a digoxigenin molecule, and / or immobilized on a membrane.
  • a radioactive isotope normally 32P or tritium
  • the antibody is human, humanized, or synthetic.
  • the antibody is monoclonal and / or is labeled with a fluorochrome.
  • flurochrome is selected from the list comprising Fluorescein (FITC), Tetramethylrodamine and derivatives, Phycoerythrin (PE), PerCP, Cy5, Texas, allophycocyanin, or any combination thereof.
  • the kit or device of the invention further comprises all those elements necessary to carry out a PCR procedure.
  • the kit may also include, without limitation, buffers, protein extraction solutions, agents to prevent contamination, inhibitors of protein degradation, etc.
  • the kit can include all the supports and containers necessary for its start-up and optimization.
  • the kit further comprises instructions for carrying out the methods of the invention.
  • a fifth aspect of the invention relates to a microarray, hereinafter the microarray of the invention, comprising oligonucleotides or single-channel microarrays designed from a known sequence or mRNA of the RBM17, RBM3, KHDRS1, SRSF10 genes. , SNRNP70, UA2F2, RNU4ATAC and / or SNRNP200, or any of their combinations, and preferably all of them simultaneously.
  • sequences of the RBM17, RBM3, KHDRS1, SRSF10, SNRNP70, UA2F2, RNU4ATAC and / or SNRNP200 genes are the nucleotide sequences SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 and / or SEQ ID NO: 43, respectively, or amino acid sequences that show a degree of identity with said amino acid sequences of, at least 85% , typically at least 90%, preferably at least 95%, more preferably at least 98%, even more preferably at least 99%
  • oligonucleotide sequences can be constructed on the surface of a chip by sequentially elongating a single nucleotide growing strand using photolithography.
  • the oligonucleotides are anchored at the 3 'end by means of a selective nucleotide activation method, protected by a photolabile reagent, by selective incidence of light through a photomask.
  • the photomask can be physical or virtual.
  • the oligonucleotide probes can be between 10 and 100 nucleotides, more preferably, between 20 and 70 nucleotides, and even more preferably, between 24 and 20 nucleotides.
  • On-site synthesis on a solid support could be done using ink-jet technology, which requires longer probes.
  • Supports could be, but are not limited to, NC or nylon (charged) filters or membranes, silicon, or glass carriers for microscopes covered with aminosilanes, polylysine, aldehydes, or epoxy.
  • the probe is each of the samples on the chip.
  • the target is the sample to be analyzed: messenger RNA, total RNA, a PCR fragment, etc.
  • the microarray of the invention features modified oligonucleotides, as described above.
  • kit or device of the invention comprises primers and / or probes capable of quantifying the expression product of the biomarkers of the invention, and where
  • the primers or primers are polynucleotide sequences of between 10 and 30 base pairs, more preferably between 15 and 25 base pairs, even more preferably between 18 and 22 base pairs, and still much more preferably around 20 base pairs, having an identity of at least 80%, more preferably of at least 90%, even more preferably of at least 95%, still much more preferably of at least 98%, and particularly 100 %, with a fragment of the complementary sequences to SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO : 42 and / or SEQ ID NO: 43.
  • the probes are polynucleotide sequences of between 30 and 1100 base pairs, more preferably between 100 and 1000 base pairs, and even more preferably between 150 and 500 base pairs, which have an identity of at least 80% , more preferably at least 90%, even more preferably at least 95%, still much more preferably at least 98%, and particularly 100%, with a fragment of the sequences complementary to SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 and / or SEQ ID NO: 43.
  • a seventh aspect of the invention refers to the use of the kit or device of the invention, the microarray, or the microarray of the invention, to obtain useful data for the detection, diagnosis, prognosis, classification, and monitoring of patients suffering from a autoimmune disease, preferably rheumatoid arthritis.
  • An eighth aspect of the invention relates to a computer program comprising program instructions for causing a computer to carry out the method according to any of the methods of the invention.
  • the invention encompasses computer programs arranged on or within a carrier.
  • the carrier can be any entity or device capable of supporting the program.
  • the carrier may be made up of said cable or another device or medium.
  • the carrier could be an integrated circuit in which the program is included, the integrated circuit being adapted to execute, or to be used in the execution of, the corresponding processes.
  • the programs could be embedded in a storage medium, such as a ROM, a CD ROM or a semiconductor ROM, a USB memory, or a magnetic recording medium, for example, a floppy disk or a disk. Lasted.
  • the programs could be supported on a transmittable carrier signal.
  • it could be an electrical or optical signal that could be transported through an electrical or optical cable, by radio or by any other means.
  • the invention also extends to computer programs adapted so that any processing means can carry out the methods of the invention.
  • Such programs may take the form of source code, object code, an intermediate source of code, and object code, for example, as in partially compiled form, or in any other form suitable for use in implementing the processes according to the invention.
  • Computer programs also encompass cloud applications based on this procedure.
  • a ninth aspect of the invention relates to a computer readable storage medium comprising program instructions capable of causing a computer to carry out the steps of any of the methods of the invention.
  • a tenth aspect of the invention relates to a transmittable signal comprising program instructions capable of causing a computer to carry out the steps of any of the methods of the invention.
  • polynucleotide and “nucleic acid” are used interchangeably herein, referring to polymeric forms of nucleotides of any length, both ribonucleotides (RNA or RNA) and deoxyribonucleotides (DNA or DNA).
  • a nucleic acid or polynucleotide sequence may comprise the five bases that appear biologically (adenine, guanine, thymine, cytosine, and uracil) and / or bases other than the five that appear biologically. These bases can serve different purposes, for example, to stabilize or destabilize hybridization; to stimulate or inhibit degradation of the probe; or as junction points for detectable debris or shielding debris.
  • a polynucleotide of the invention may contain one or more derivatized, non-standard, modified base moieties, including, but not limited to, N6-methyl-adenine, N6-tert-butyl-benzyl-adenine, imidazole, substituted imidazoles , 5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5- chlorouracil, 5-iodouracil, hypoxanthine, xanthine, 4-acetylcytosine, 5- (carboxyhydroxymethyl) uracil, 5-carboxymethylaminomethyl-2-thiouridine, 5- carboxymethylaminomethyluracil, beta-D- galactosylqueosine, inosine, N6- isopentenyladenine, 1- metllguanlna, 1-methylinosine, 2,2-dimethylguanine, 2-methyladenine, 2-methylguanine, 3-methylcytosine, 5-methylcytosine, N6-methyladen
  • nucleic acid or polynucleotide sequence may comprise one or more modified sugar residues including, but not limited to, arabinose, 2-fluoroarabinose, xylulose, and a hexose.
  • amino acid sequence refers to a polymeric form of amino acids of any length, which may be coding or non-coding, chemically or biochemically modified.
  • Table I shows the clinical / serological characteristics of the patients with Rheumatoid Arthritis included in the development of the invention.
  • Peripheral blood has been collected in tubes with trisodium citrate. The samples were centrifuged to separate the plasma fraction from the cell fraction. Platelets present in plasma were removed with a second centrifugation. Finally, the plasma and serum were stored at -80 ° C for further analysis. Lymphocyte purification.
  • Leukocytes were separated using autoMACS Pro Separator (Miltenyi Biotec) using positive immuno-magnetic selection after labeling with anti-CD14 (monocytes), anti-CD3 / ant ⁇ -CD19 (lymphocytes) and CD15 (neutrophils). Purity was analyzed. by flow cytometry.
  • DNase RQI DNAse, Promega; Wisconsin, United States
  • Nanodrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer system Thermo Fisher Scientific Inc., Wilmington, DE, USA
  • Revert Aid First Strand cDNA Synthesis kit MRI Fermentas, Flanover, MD, USA
  • the primers were designed by the team using the Primer 3 software with the following optimal conditions: the optimal parameters used to design primers between exons were as follows: (a) that the difference in binding temperature between the two primers did not was greater than 0.2oC (optimal 60 ° C); (b) exclusion of primers that they were highly complementary and could generate primer dimers and, (c) that amplify a product of between 100 and 180 base pairs.
  • Fluidigm microfluidic technology (Fluidigm, Barcelona, Spain) was used. This technique allows an analysis of expression using qPCR arrays, minimizing the manipulation of the samples, thus eliminating errors. All steps performed were carried out following the manufacturer's instructions and advice.
  • the copy DNA was preamplified and subsequently loaded onto the Dynamic Array M48.48 plate using the “Prime (113x)” software of the IFC controller MX (Fluidigm).

Landscapes

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Abstract

Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico, estratificación y/o seguimiento de pacientes con artritis reumatoide. Kit o dispositivo y usos.

Description

Método de obtención de datos útiles para el
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estratificación y/o seguimiento de pacientes con artritis reumatoide.
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente Invención se encuentra dentro del campo de la medicina de precisión, y se refiere a un método de obtención de datos útiles para el diagnóstico, estratificación y/o seguimiento de pacientes con artritis reumatoide.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad autoinmune, inflamatoria y sistémica de etiología desconocida, que se caracteriza por la inflamación crónica de múltiples articulaciones y vainas tendinosas de la membrana sinovial, provocando un deterioro progresivo. Aunque la sinovial es el foco principal de la lesión, en la AR se producen además cambios sistémicos responsables de manifestaciones extra-articulares tales como vasculitis, glomerulonefrltis, pericarditis, pleuritis y escleritis. Asimismo, los pacientes que padecen AR pueden sufrir comorbilidades (enfermedad cardiovascular, infecciones, neoplasias, osteoporosls y enfermedad gastrointestinal) con mayor frecuencia que la población general, lo que conduce a un acortamiento de la esperanza de vida de entre 5 y 10 años. En España se estima que afecta al 0.5% de la población mayor de 20 años, siendo más frecuente en mujeres y con un pico de incidencia entre los 40 y los 60 años.
La AR se considera una enfermedad genética compleja, en la que diversos genes y factores ambientales, étnicos, geográficos y nutriclonales ¡nteracclonan para causar los eventos patológicos. El inicio de la enfermedad parece ser desencadenado por factores ambientales, en base a una predisposición genética combinada con la activación repetida del sistema inmune Innato y adaptativo, que conducen a la pérdida de la tolerancia inmunológica, la presentación aberrante de auto-antígenos y la activación de linfocitos B y T, monocitos y células dendríticas, los cuales promueven una respuesta Inflamatoria que culmina en un proceso de hiperplasia sinovial, destrucción ósea y afectación multisistémica.
La mayoría de los pacientes presentan en el suero auto-anticuerpos como el factor reumatoide (FR) y los anticuerpos antl-péptidos cíclicos cltrulinados (anti-CCP), lo que le confiere carácter autoinmune. Aunque el FR también puede encontrarse en otras enfermedades autoinmunes y condiciones inmunológicas, así como en diversos estados inflamatorios, la presencia de anticuerpos anti-CCP es altamente específica, evidencia de que la autoinmunidad frente a proteínas citrulinadas es un factor clave en la patogénesis de la AR. Sin embargo, aproximadamente un 20% de los pacientes no presentan auto-anticuerpos, lo que sugiere una heterogeneidad etiológica de la enfermedad.
Los progresos desarrollados en las técnicas de Biología Molecular han identificado nuevas rutas, independientes de la expresión alterada de citoquinas inflamatorias, que también contribuyen a la patogenia de la AR y para las que las estrategias terapéuticas anti inflamatorias o inmunosupresoras disponibles no son efectivas. El análisis genómico (estudios de microarrays) ha permitido identificar firmas especificas de genes en diferentes enfermedades autoinmunes y obtener información sobre los mecanismos subyacentes al desarrollo de comorbilidades asociadas. Así, se han identificado los perfiles génicos de células mononucleadas de sangre periférica y linfocitos T y B de pacientes AR y analizado su relevancia como predictores de la evolución clínica y respuesta terapéutica. A pesar de estos descubrimientos, la información generada por los estudios de expresión génica es incompleta y presenta ciertas limitaciones, ligadas a la falta de linealidad entre la abundancia de expresión del genoma y su traducción en niveles reales de expresión proteica. Durante la transcripción génica, el proceso de eliminación de secuencias sin sentido (intrones) y de empalme de las secuencias codificantes (exones) recibe el nombre de splicing. Para llevar a cabo este proceso, existe en el núcleo celular una maquinaria molecular muy compleja: el espliceosoma. El splicing puede originar distintos mensajes genéticos (ARNm) a partir de una única secuencia genómica (ADN) en un proceso denominado splicing alternativo (AS, del inglés alternative splicing), el cual afecta al control cuantitativo de la expresión génica y la diversificación funcional de las proteínas. Su presencia e influencia en la evolución clínica y la respuesta terapéutica se ha demostrado en patologías tumorales e inflamatorias, aunque no se ha caracterizado en el ámbito de la AR.
La búsqueda de biomarcadores pronósticos que puedan predecir el curso de la enfermedad y proporcionen información sobre la posible respuesta a tratamiento es un reto importante, dado que pueden ayudar al clínico a predecir la evolución de artritis indiferenciadas a AR, o a pronosticar la severidad de la AR, la cual presenta gran variabilidad. Podría asimismo ayudar a identificar subgrupos de pacientes con mayor riesgo de complicaciones, evolución más rápida o peor respuesta al tratamiento, lo cual permitiría realizar intervenciones más precoces, tratamiento más intensivo o identificar grupos de pacientes que pueden responder mejor a una terapia que otra. Todo ello representaría un paso esencial en el manejo de los pacientes con AR, sobre todo en pacientes de reciente inicio, permitiendo crear un modelo de medicina personalizada orientada a un mejor manejo del enfermo junto a una mejora en los costes y el análisis del riesgo-beneficio de los fármacos, consiguiendo la más alta tasa de respuesta con la mínima toxicidad. DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Niveles de expresión de 8 elementos del splicing con alteración específica común y diferencialmente expresados en los 3 subtipos de leucocitos estudiados: monocitos, linfocitos y neutrófilos, de pacientes AR (AR, n=74; en naranja) en relación con donantes sanos (DS, n=29; en blanco). La expresión se analizó mediante un array de qPCR. Los datos representan la mediana ± rango intercuartílico de los niveles de expresión ajustado por un factor de normalización. Las diferencias se han evaluado mediante la prueba U de Mann-Whitney (* p<0,05, ** p<0.01 y *** p<0.001)
Figura 2. Modelos logístlcos para diagnóstico de pacientes AR. A. Valores de especificidad, sensibilidad y punto de corte de las curvas ROC; B. Curvas ROC, indicando área bajo la curva ( AUC ) y significación estadística (p valué); C. Valores de b para cada valor de x„ y valor de la constante b0 en los 3 subtipos de leucocitos estudiados; D. Fórmula del modelo logístico propuesto.
Figura 3. Modelos logísticos para la identificación de pacientes AR con alta actividad de la enfermedad. A. Valores de especificidad, sensibilidad y punto de corte de las curvas ROC; B. Curvas ROC, indicando área bajo la curva {AUC) y significación estadística (p valué); C. Valores de b para cada valor de x¡, y valor de la constante b0 en los 3 subtipos de leucocitos estudiados; D. Fórmula del modelo logístico propuesto.
Figura 4. Modelos logísticos para la identificación de pacientes AR con placas de ateroma. A. Valores de especificidad, sensibilidad y punto de corte de las curvas ROC; B. Curvas ROC, Indicando área bajo la curva (AUC) y significación estadística (p valué); C. Valores de b para cada valor de x¡, y valor de la constante b0 en los 3 subtipos de leucocitos estudiados; D. Fórmula del modelo logístico propuesto.
Figura 5. Modelos logísticos para la identificación de pacientes AR con afectación radiológica. A. Valores de especificidad, sensibilidad y punto de corte de las curvas ROC; B. Curvas ROC, Indicando área bajo la curva (AUC) y significación estadística (p valué); C. Valores de b para cada valor de x¡, y valor de la constante b0 en los 3 subtipos de leucocitos estudiados; D. Fórmula del modelo logístico propuesto. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención supone un complemento al diagnóstico, estratificación y/o seguimiento de pacientes con AR. La creación de los modelos de evaluación de los biomarcadores aquí propuestos permite: 1) discriminar entre individuos sanos y pacientes AR con elevada sensibilidad y especificidad, 2) estratificar clínicamente los pacientes en base a la actividad de la enfermedad, daño radiológico y comorbilidades asociadas como la enfermedad cardiovascular; y 3) facilitar el seguimiento clínico de estos pacientes, contribuyendo al desarrollo de una medicina personalizada.
La presente invención propone la evaluación estandarizada de un panel de biomarcadores, en este caso relacionados con la maquinaria de splicing, en leucocitos de pacientes con AR. Esta información permitiría, por ejemplo, el desarrollo de un chip o array para la estratificación de pacientes en diversos grupos de riesgo y la definición de sus necesidades específicas de seguimiento clínico y manejo terapéutico.
La desregulación del proceso de corte y empalme de moléculas de ARN mensajeros, o splicing, está emergiendo como un sello distintivo en diversas patologías. En la presente Invención se realiza el análisis de la maquinaria de splicing, o espliceosoma, y los factores de splicing asociados en enfermedades autoinmunes y reumatológicas.
El objetivo de la presente invención ha sido ha identificación en distintos subtipos de leucocitos (monocitos, linfocitos y neutrófilos) de pacientes AR, de las alteraciones presentes en el espliceosoma y los factores responsables del splicing, así como su influencia en la actividad de la enfermedad y sus perfiles inflamatorio y aterotrombótico.
Los autores de la presente invención han evaluado, utilizando un qPCR-array microfluídico, un conjunto de 45 elementos constituyentes del sistema de splicing, seleccionados en base a su papel -previamente demostrado- en la fisiopatología de numerosas enfermedades tumorales e inflamatorias. Los análisis se han llevado a cabo en ARN total purificado a partir de monocitos, linfocitos y neutrófilos procedentes de 74 pacientes con AR y 29 donantes sanos, obtenidos utilizando un sistema de selección inmunomagnética positiva. Se llevó a cabo, de forma paralela, un análisis extensivo de marcadores clínicos y serológicos de la enfermedad (Tabla 1).
Los resultados del estudio han demostrado la presencia de una alteración específica y significativa en varios componentes del espliceosoma en los distintos subtipos leucocitarios analizados en pacientes AR en relación a los donantes sanos. Específicamente, se encontraron significativamente alterados en pacientes AR los niveles de expresión de los siguientes componentes del espliceosoma:
Monocitos.- TCERG1, ESRP1, RBM17, RBM3, RBM45, KHDRS1, SRSF3, SRSF4, SRSF5, SRSF6, SRFSF9, SRSF10, TIA1, TRA2A, SNRNP70, RNU12, U2AF1, UA2F2, RNU4ATAC, SNRNP200, RNU6-1.
Linfocitos.- TCERG1, ESRP2, NOVA 1, PRPF8, PTBP1, RBM17, RBM3, KHDRS1, SF3BM, SRSF4, SRSF6, SRSF10, TIA1, SNRNP70, UA2F2, RNU4ATAC, SNRNP200.
Neutrófilos.- CELF1, FBP11, NOVA1, PRPF8, PTBP1, RAVER1, RBM17, RBM22, RBM3, KHDRS1, SF3BTV1, SF3BTV2, SRSF2, SRSF3, SRSF4, SRSF5, SRFSF9, SRSF10, TIA 1, TRA2A, TRA2B, SNRNP70, RNU11, UA2F2, RNU4ATAC, SNRNP200, RNU6-1.
Sorprendentemente, se ha observado una disminución generalizada en dichos componentes del espliceosoma y los factores de splicing estudiados, salvo un incremento puntual de algunos elementos de la maquinaria, específicamente relacionados con la regulación de la inducción de un splicing alternativo (U4atac). Se ha identificado asimismo una firma de 8 elementos integrantes de la maquinaria de splicing con idéntico patrón de alteración en los tres subtipos leucocitarios analizados (RBM17, RBM3, KHDRS1, SRSF10, SNRNP70, UA2F2, RNU4ATAC y/o SNRNP200) (Figura 1).
Dichas alteraciones se han encontrado asociadas con diversos aspectos fisiopatológicos de la enfermedad. Más específicamente, la firma de 8 elementos integrantes de la maquinaria de splicing con idéntico patrón de alteración en los tres subtipos leucocitarios analizados, nos ha permitido crear un modelo para discriminar entre individuos sanos y pacientes AR (Figura 2), identificar pacientes con alta actividad de la enfermedad (analizada utilizando el score DAS28) (Figura 3), presencia de placas de ateroma (como marcador de aterosclerosis) (Figura 4) y afectación radiológica (Figura 5). Mediante dichos modelos hemos observado, en análisis utilizando curvas ROC ( receiver operator characteristics), un área bajo la curva en todos los casos superior al 70%, con alta especificidad y sensibilidad.
La alteración observada de distintos componentes del sistema de splicing en células circulantes del sistema inmune de estos pacientes podría asociarse a la generación de diferentes isoformas proteicas de carácter patológico que podrían contribuir al desarrollo y la progresión de la AR. La evaluación de estos componentes supone la identificación de biomarcadores novedosos para la tipificación de la enfermedad con un potencial de explotación industrial, de modo que, mediante el análisis en sangre total de estos factores, sería posible identificar pacientes AR con los citados criterios de clasificación clínica sin necesidad de realizar pruebas ecográficas o radiológicas complementarias.
Además, la regulación de la expresión o función de estos factores representa una nueva diana terapéutica específica para la administración de nuevos tratamientos y/o fármacos ya existentes, usados en spliceopatías, que ejercen su acción sobre el spliceosoma y representan por lo tanto un potencial tratamiento alternativo o complementario en esta patología.
Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere al uso de los niveles de expresión de TCERG1, ESRP1, RBM17, RBM3, RBM45, KHDRS1, SRSF3, SRSF4, SRSF5, SRSF6, SRFSF9, SRSF10, TIA 1, TRA2A, SNRNP70, RNU12, U2AF1, UA2F2, RNU4ATAC, SNRNP200, RNU6-1, o cualquiera de sus combinaciones en monocitos, de TCERG1, ESRP2, NOVA 1, PRPF8, PTBP1, RBM17, RBM3, KHDRS1, SF3BM, SRSF4, SRSF6, SRSF10, TIA 1, SNRNP70, UA2F2, RNU4ATAC, SNRNP200, o cualquiera de su combinaciones en linfocitos, y de CELF1, FBP11, NOVA1, PRPF8, PTBP1, RAVER1, RBM17, RBM22, RBM3, KHDRS1, SF3BTV1, SF3BTV2, SRSF2, SRSF3, SRSF4, SRSF5, SRFSF9, SRSF10, TIA1, TRA2A, TRA2B, SNRNP70, RNU11, UA2F2, RNU4ATAC, SNRNP200, RNU6-1, o cualquiera de sus combinaciones, en neutrófilos, para la detección, diagnóstico, pronóstico, clasificación y seguimiento de pacientes que padecen una enfermedad autoinmune, preferiblemente donde la enfermedad autoinmune es artritis reumatoide.
El uso de dichos genes y/o proteínas puede ser simultáneo o puede elegirse cualquiera de los genes y/o proteínas o cualquiera de sus combinaciones. La determinación de los niveles de expresión de combinaciones de varios biomarcadores puede permitir mayor sensibilidad y especificidad en el diagnóstico, pronóstico, clasificación y seguimiento de pacientes que padecen una enfermedad autoinmune, preferiblemente artritis reumatoide. Descripción de los biomarcadores de la invención
A continuación, en la Tabla 2, se describen las características de los biomarcadores empleados en la invención. Se numera la secuencia del amplicón, no de los primers.
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Métodos de la invención
Un segundo aspecto de la invención se refiere a un método de detección, diagnóstico, pronóstico y estratificación de pacientes que padecen una enfermedad autoinmune, de ahora en adelante primer método de la invención, que comprende: a) Cuantificar los niveles de expresión de
I) TCERG1, ESRP1, RBM17, RBM3, RBM45, KHDRS1, SRSF3, SRSF4, SRSF5, SRSF6, SRFSF9, SRSF10, TIA 1, TRA2A, SNRNP70, RNU12, U2AF1, UA2F2, RNU4ATAC, SNRNP200, RNU6-1, o cualquiera de sus combinaciones en monocitos, II) TCERG1, ESRP2, NOVA1, PRPF8, PTBP1, RBM17, RBM3, KHDRS1,
SF3Btv1, SRSF4, SRSF6, SRSF10, TIA 1, SNRNP70, UA2F2, RNU4ATAC, SNRNP200 , o cualquiera de su combinaciones en linfocitos, y de
III) CELF1, FBP11, NOVA 1, PRPF8, PTBP1, RAVER1, RBM17, RBM22, RBM3, KHDRS1, SF3BTV1, SF3BTV2, SRSF2, SRSF3, SRSF4, SRSF5, SRFSF9, SRSF10, TIA1, TRA2A, TRA2B, SNRNP70, RNU11, UA2F2, RNU4ATAC, SNRNP200, RNU6-1, o cualquiera de sus combinaciones, en neutrófilos b) Comparar los niveles obtenidos en el paso (a) con un valor de referencia, o con los niveles de expresión de dichos marcadores obtenidos en una muestra de referencia. c) asignar los pacientes que presentan unos niveles de expresión obtenidos en el paso (b) diferentes y estadísticamente significativos al valor de referencia o a los niveles de la muestra de referencia, al grupo de individuos con riesgo de padecer una enfermedad autoinmune, o al grupo de individuos que padecen artritis reumatoide.
Valores diferentes y estadísticamente significativos implica que los niveles de expresión se consideran aumentados o disminuidos.
Según este método de la invención, el nivel de expresión se considera aumentado en donde la diferencia entre la muestra de ensayo y la muestra de referencia es al menos 1 ,1 veces, 1 ,5 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces o incluso más. Un descenso en la expresión con el valor de referencia se considera en donde la diferencia entre la muestra de ensayo y la muestra de referencia de al menos 0,9 veces, 0,75 veces, 0,2 veces, 0, 1 veces, 0,05 veces, 0,025 veces, 0,02 veces, 0,01 veces, 0,005 veces o incluso menos.
Por tanto, en una realización preferida, método según la reivindicación anterior, comprende asignar los pacientes que presentan unos niveles de expresión obtenidos en el paso (b) menores y estadísticamente significativos al valor de referencia o a los niveles de la muestra de referencia, al grupo de individuos con riesgo de padecer artritis reumatoide.
Los autores de la presente invención han identificado asimismo una firma de 8 elementos integrantes de la maquinaria de splicing con idéntico patrón de alteración en los tres subtipos leucocitarios analizados ( RBM17 , RBM3, KHDRS1, SRSF10, SNRNP70, UA2F2, RNU4ATAC y/o SNRNP200) (Figura 1).
Por tanto, en otra realización preferida, se cuantifican los niveles de expresión de RBM17, RBM3, KHDRS1, SRSF10, SNRNP70, UA2F2, RNU4ATAC y/o SNRNP200 , o cualquiera de sus combinaciones, y preferiblemente se cuantifican los niveles de expresión de todos estos biomarcadores simultáneamente.
El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde preferiblemente el método comprende:
a) cuantificar los niveles de expresión de RBM17, RBM3, KHDRS1 , SRSF10, SNRNP70, UA2F2, RNU4ATAC y SNRNP200, en una muestra biológica aislada de dicho individuo, donde la muestra preferiblemente comprende monocitos, linfocitos y/o neutrófilos, preferiblemente purificados,
a1) calcular los índices A1 , A2 y A3 (donde A1 se refiere a monocitos, A2 a linfocitos y A3 a neutrófilos) según las ecuaciones: A1=1/[1 +eA-[-25,015204+[(-0,000135*RBM 17)+(0,000031*RBM3)+(-
0, 000007*KHDRS1)+(0,0002*SRSF10)+(0, 000116*SNRNP70)+(0,000062*U2AF2)+(0, 001458* RNU4ATAC)+(-0,000675*SNRNP200)]]]
A2=1/[1 +eA-[0, 12461+[(0,000003*RBM17)+(-0,000001*RBM3)+(-
0, 000002* KHDRS1)+(0,000003*SRSF10)+(0,000000*SNRNP70)+(0, 000001 *U2AF2)+(0, 00003 1*RNU4ATAC)+(-0, 000001 *SNRNP200)]]]
A3=1/[1 +eA-[1 ,442807+[(0,000000*RBM17)+(-0,000002*RBM3)+(-
0,000001*KHDRS1)+(0,000000*SRSF10)+(0, 000001 *SNRNP70)+(0,000000*U2AF2)+(0, 00470 8*R N U4ATAC)+(-0, 000000*SN RN P200)]]] a2) calcular los índices B1 y B3 (donde B1 se refiere a monocitos, y B3 a neutrófilos)según las ecuaciones:
B1=1/[1 +eA-[2,778512+[(-0,000033*RBM17)+(-0,000053*RBM3)+(0,000047*KHDRS1)+(- 0,000006*SRSF10)+(0, 000018*SNRNP70)+(0,000058*U2AF2)+(-0,000004*RNU4ATAC)+(- 0,000225*SNRNP200)]]]
B3=1/[1 +eA-[-1 ,276655+[(-0,000007*RBM17)+(0,000001*RBM3)+(0,000003*KHDRS1)+(- 0,000004*SRSF10)+(-0,000003*SNRNP70)+(0, 000010*U2AF2)+(0, 000001 *RNU4ATAC)+(- 0,000001 *SNRNP200)]]] a3) calcular los índices C1 , C2 y C3 (donde C1 se refiere a monocitos, C2 a linfocitos y C3 a neutrófilos) según las ecuaciones:
C1 =1/[1+eA-[0,36387+[(0,000004*RBM17)+(0,000007*RBM3)+(- 0, 000017*KHDRS1)+(0,000024*SRSF10)+(0,000003*SNRNP70)+(- 0,000029*U2AF2)+(0,000000*RNU4ATAC)+(0,000003*SNRNP200)]]]
C2=1/[1+eA-[2,45244+[(-0,000002*RBM17)+(-0,000002*RBM3)+(0,000004*KHDRS1)+(-
0,000008*SRSF10)+(0,000000*SNRNP70)+(-0,000008*U2AF2)+(-
0,000001*RNU4ATAC)+(0,000003*SNRNP200)]]]
C3=1/[1 +eA-[-0,280066+[(-0, 000012*RBM17)+(0, 000045*RBM3)+(0, 000017*KHDRS1)+(- 0,000010*SRSF 10)+(-0,000023*SNRN P70)+(- 0,000060*U2AF2)+(0,000020*RNU4ATAC)+(0, 000015*SNRNP200)]]] a4) calcular los índices D1 , D2 y D3 (donde D1 se refiere a monocitos, D2 a linfocitos y D3 a neutrófilos) según las ecuaciones: D1 =1/[1+eA-[3,722733+[(0,000015*RBM17)+(-0,000003*RBM3)+(-0,000002*KHDRS1)+(-
0,000008*SRSF10)+(0,000004*SNRNP70)+(-
0,000045*U2AF2)+(0,000000*RNU4ATAC)+(0,000005*SNRNP200)]]]
D2=1/[1+eA-[18,183604+[(0,000037*RBM17)+(0,000029*RBM3)+(0,000006*KHDRS1)+(- 0,000117*SRSF10)+(0, 000011*SNRNP70)+(-0,000159*U2AF2)+(0,000025*RNU4ATAC)+(- 0,000028*SNRNP200)]]]
D3=1/[1+eA-[0,5632+[(0,000005*RBM17)+(-
0,000011*RBM3)+(0,000009*KHDRS1)+(0,000004*SRSF10)+(0,000002*SNRNP70)+(- 0,000001*U2AF2)+(0,000005*RNU4ATAC)+(-0,000021*SNRNP200)]]]
Asignando en cada ecuación los valores de los biomarcadores correspondientes obtenidos en el paso (a).
Un cuarto aspecto de la invención se refiere a un método para la clasificación, diagnóstico y seguimiento pacientes con AR, de ahora en adelante segundo método de la invención, que comprende los pasos (a) y (e) según el primer método de la invención, y además comprende: d1) clasificar al individuo del paso (a) en el grupo de individuos con artritis reumatoide cuando el valor del índice A1 del paso (a1) sea preferiblemente menor que 0,0000015, preferiblemente menor que 0,000015, y aún más preferiblemente menor que 0,5; cuando el valor del índice A2 del paso (a1) sea preferiblemente menor que 0,8438, preferiblemente menor que 0,9035, y aun más preferiblemente menor que 0,9271 ; cuando el valor del índice A3 del paso (a1) sea preferiblemente menor que 0,6872, preferiblemente menor que 0,6954 y aun más preferiblemente menor que 0,7005.
En otra realización preferida el segundo método de la invención, además comprende:
d2) clasificar al individuo del paso (a) en el grupo de individuos con AR con alta actividad de la enfermedad cuando el valor del índice B1 del paso (a2) sea preferiblemente menor que 0, 1717, preferiblemente menor que 0, 1887, y aún más preferiblemente menor que 0,3754; cuando el valor del índice B3 del paso (a2) sea preferiblemente menor que 0,2045, preferiblemente menor que 0,2178, y aun más preferiblemente menor que 0,227.
En otra realización preferida el segundo método de la invención además comprende:
d3) clasificar al individuo del paso (a) en el grupo de individuos con AR y placas de ateroma cuando el valor del índice C1 del paso (a2) sea preferiblemente menor que 0,4869, preferiblemente menor que 0,4981 , y aún más preferiblemente menor que 0,503; cuando el valor del índice C2 del paso (a2) sea preferiblemente menor que 0,6625, preferiblemente menor que 0,7087, y aún más preferiblemente menor que 0,7433; cuando el valor del índice C3 del paso (a2) sea preferiblemente menor que 0,2623, preferiblemente menor que 0,279 y aun más preferiblemente menor que 0,4028.
En otra realización preferida el segundo método de la invención además comprende:
d4) clasificar al individuo del paso (a) en el grupo de individuos con AR y afectación radiológica cuando el valor del índice D1 del paso (a2) sea preferiblemente menor que 0,5384, preferiblemente menor que 0,6139, y aún más preferiblemente menor que 0,664; cuando el valor del índice D2 del paso (a2) sea preferiblemente menor que 0,5; cuando el valor del índice D3 del paso (a2) sea preferiblemente menor que 0,4021 , preferiblemente menor que 0,467 y aún más preferiblemente menor que 0,5061.
Un quinto aspecto de la invención se refiere a un método de seguimiento de la evolución de la artritis reumatoide, de ahora en adelante segundo método de la invención, que comprende los pasos (a) y (c) del primer método de la invención, y además comprende: d) repetir al menos dos veces la secuencia de pasos (a) - (c) en muestras obtenidas del mismo individuo según el paso (a), de manera no simultánea.
En una realización preferida, los pasos (a), (b), (c) y/o (d) de los métodos descritos anteriormente pueden ser total o parcialmente automatizados y/o computerizados, por ejemplo, por medio de un equipo robótico de dispensación de líquidos en el paso (a), un equipo robótico sensor para la detección de la cantidad en el paso (b), o la comparación computerizada en el paso (c).
La comparación descrita en el paso (c) del método de la invención puede ser realizada manualmente o asistida por ordenador.
Las cantidades de referencia adecuadas pueden ser determinadas por el método de la presente invención a partir de una o varias muestras de referencia que puede/n ser analizada/s, por ejemplo, simultánea o consecutivamente junto con la muestra biológica problema. Así, por ejemplo pero sin limitarnos, la/s muestra/s de referencia puede/n ser control/es negativo/s, esto es, las cantidades detectadas por el método de la invención en muestras que provienen de individuos clínicamente bien documentados y que no padecen la enfermedad o deficiencia.
Puede presentar dicho aumento o disminución de la cantidad de producto de expresión de cualquiera de los genes respectivos, o de todos ellos simultáneamente, o en cualquier combinación. En una realización preferida de los métodos de la invención, la muestra biológica aislada de un individuo en el paso (a) es una muestra que comprende monocitos, linfocitos y/o neutrófilos.
El término “producto de expresión”, también denominado “producto génico” se refiere al material bioquímico, ya sea ARN (por ejemplo microARN) o proteína, resultante de la expresión de un gen. Algunas veces se usa una medida de la cantidad de producto génico para inferir qué tan activo es un gen.
La cuantificación del producto de expresión de los biomarcadores, o la detección de la expresión de sus correspondientes genes, puede realizarse por cualquiera de los métodos conocidos en el estado de la técnica. Preferiblemente, la cuantificación se realiza mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o una técnica que incluya la PCR, y más preferiblemente mediante PCT a tiempo real (Q-RT-PCR).
La medida de los niveles de expresión de un gen, preferiblemente de manera cuantitativa, está basada en una señal que se obtiene directamente de los transcritos de dichos genes (ARNm, microARN, etc.), y que está correlacionada directamente con el número de moléculas de ARN producidas por los genes. Dicha señal - a la que también podemos referirnos como señal de intensidad - puede obtenerse, por ejemplo, midiendo un valor de intensidad de una propiedad química o física de dichos productos. Por otro lado, se podría realizar mediante medida indirecta que se refiere a la medida obtenida de un componente secundario o un sistema de medida biológica (por ejemplo la medida de respuestas celulares, ligandos, “etiquetas” o productos de reacción enzimática).
La técnica preferiblemente utilizada es la Q-RT-PCR. Según esta técnica, utilizando oligonucleótidos, enzimas, cebadores y solución tampón, se amplifica de forma exponencial un fragmento de ADN original. Esta técnica es llevada a cabo en un aparato llamado termociclador que mantiene la temperatura necesaria en cada una de las etapas que conforman un ciclo. La detección en tiempo real se basa en la utilización de marcadores fluorescentes (sondas) que se unen a todas las secuencias de doble cadena de ADN formadas en los ciclos de la reacción de PCR. Una vez que el marcador se une al ácido nucleico de doble cadena, éste emite una señal fluorescente que se procesa en tiempo real (Walter et al., 2002, Science, 296, 557-559). El ciclo al cual la emisión de la intensidad del marcador fluorescente supera un umbral determinado es llamado Ct. Los niveles de expresión de un microARN son calculados como 2 ct
La expresión de un biomarcador de la invención se puede evaluar mediante cualquiera de una amplia variedad de métodos bien conocidos por el experto en la materia para detectar la expresión de una molécula transcrita o su proteína correspondiente. Si los biomarcadores son moléculas de ácido nucleico, la expresión se puede detectar y/o cuantificar usando métodos de hibridación de ácidos nucleicos, métodos de transcripción inversa de ácidos nucleicos, métodos de amplificación de ácidos nucleicos y similares.
Así, en una forma de realización preferida, la expresión de un gen marcador se evalúa preparando ARNm/ADNc (es decir, un polinucleótido transcrito) de una muestra, y mediante la hibridación del ARNm/ADNc con un polinucleótido de referencia que es complementario a un polinucleótido que comprende el gen marcador, y/o fragmentos del mismo. El ADNc se puede, opcionalmente, amplificar usando cualquiera de varios métodos de la reacción en cadena de la pollmerasa antes de la hibridación con el polinucleótido de referencia.
Un“método diagnóstico” (o“método de diagnóstico”) se refiere a un procedimiento donde se examina o analiza a un paciente (o a una muestra obtenida del mismo) para obtener un conocimiento diferencial de una enfermedad a través de los signos y síntomas que la caracterizan. En breve, el término “ diagnóstico” en la presente solicitud se refiere a la capacidad de discriminar entre pacientes que padecen la enfermedad autoinmune, preferiblemente artritis reumatoide, y pacientes que no padecen la enfermedad autoinmune, preferiblemente artritis reumatoide. Esta discriminación tal y como es entendida por un experto en la materia no pretende ser correcta en un 100% de las muestras analizadas. Sin embargo, requiere que una cantidad estadísticamente significativa de las muestras analizadas sean clasificadas correctamente. La cantidad que es estadísticamente significativa puede ser establecida por un experto en la materia mediante el uso de diferentes herramientas estadísticas, por ejemplo, pero sin limitarse, mediante la determinación de intervalos de confianza, determinación del valor p, test de Student o funciones discriminantes de Flsher. Preferiblemente, los intervalos de confianza son al menos del 90 %, al menos del 95 %, al menos del 97 %, al menos del 98 % o al menos del 99 %. Preferiblemente, el valor de p es menor de 0.1 , de 0.05, de 0.01 , de 0.005 o de 0.0001. Preferiblemente, la presente invención permite detectar correctamente la enfermedad de forma diferencial en al menos el 60 %, en al menos el 70 %, en al menos el 80 %, o en al menos el 90 % de los sujetos de un determinado grupo o población analizada.
Un“método pronóstico” (o“método de pronóstico”) se refiere a un procedimiento donde, a partir de análisis clínicos, se identifica la enfermedad o dolencia, como la enfermedad autoinmune, preferiblemente artritis reumatoide, que sufre la persona y, a partir de las experiencias con otros pacientes aquejados por la misma enfermedad o dolencia, como una enfermedad autoinmune, preferiblemente artritis reumatoide, se predice cómo será el estado de salud del Individuo en el futuro; es decir, la evolución de la enfermedad o dolencia en el tiempo. El término“pronóstico” en la presente invención también se refiere a la capacidad de detectar pacientes o sujetos asintomáticos que presentan una alta probabilidad de padecer una enfermedad o dolencia, como d de la enfermedad autoinmune, preferiblemente artritis reumatoide, aun cuando en el momento del diagnóstico no presenten dichas patologías o manifestaciones evidentes de las mismas. Como entenderán los expertos en la materia, tal valoración, aunque se prefiere que sea, normalmente puede no ser correcta para el 100% de los sujetos que se va a pronosticar. El término, sin embargo, requiere que una parte estadísticamente significativa de los sujetos se pueda identificar como que padecen la enfermedad o que tienen predisposición a la misma. Si una parte es estadísticamente significativa se puede determinar sin más por el experto en la materia usando varias herramientas de evaluación estadística bien conocidas, por ejemplo, determinación de Intervalos de confianza, determinación de valores p, prueba t de Student, prueba de Mann- Whitney, etc. Los intervalos de confianza preferidos son al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%. Los valores de p son, preferiblemente pero sin limitarse, 0,2, 0, 1 , 0,05.
El término“seguimiento de la evolución”, tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere, a la supervisión del desarrollo de la enfermedad, como por ejemplo, pero sin limitarse, la evaluación de la respuesta a un determinado tratamiento de la enfermedad autoinmune, preferiblemente artritis reumatoide. Por tanto, en una realización preferida de este aspecto de la invención, el seguimiento se realiza post-tratamiento.
El término“no simultáneo” tal y como se emplea en la presente descripción, se refiere a la adquisición de dos o más muestras de tejido, de sangre (que también incluye plasma y suero) o de orina donde existe un intervalo de tiempo entre la adquisición de las muestras que permite un seguimiento de la enfermedad autoinmune, preferiblemente artritis reumatoide y/o pronóstico útil mediante la comparación entre las cantidades de ARNm y/o proteínas en las diferentes muestras.
Preferiblemente, el Intervalo de tiempo es de entre 1 mes y 20 años, como por ejemplo de entre 1 mes y 10 años, 1 mes y 5 años o 1 mes y 1 año. Por ejemplo, el intervalo de tiempo entre la adquisición de muestras es de aproximadamente 1 mes. Por ejemplo, el intervalo de tiempo entre la adquisición de muestras es de aproximadamente 2 meses. Por ejemplo, el intervalo de tiempo entre la adquisición de muestras es de aproximadamente 3 meses. Por ejemplo, el Intervalo de tiempo entre la adquisición de muestras es de aproximadamente 6 meses. Por ejemplo, el intervalo de tiempo entre la adquisición de muestras es de aproximadamente 1 año. Por ejemplo, el intervalo de tiempo entre la adquisición de muestras es de aproximadamente 1 año y medio. Por ejemplo, el intervalo de tiempo entre la adquisición de muestras es de aproximadamente 2 años. Por ejemplo, el intervalo de tiempo entre la adquisición de muestras es de aproximadamente 3 años. Por ejemplo, el intervalo de tiempo entre la adquisición de muestras es de aproximadamente 5 años. El grado de identidad existente entre dos secuencias se puede determinar por métodos convencionales, por ejemplo, por medio de algoritmos estándar de alineamiento de secuencias que son conocidos en el estado de la técnica, como por ejemplo BLAST (Altschul S.F. et al. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 1990 Oct 5; 215(3): 403- 10).
Una "muestra biológica", como se define aquí, es una pequeña parte de un sujeto, representativa del conjunto y puede estar constituido por una biopsia o una muestra de fluido corporal. Las biopsias son pequeñas piezas de tejido y pueden ser frescas, congeladas o fijas, como fijada con formalina y embebidas en parafina ( formalin - fixed and paraffín embedded FFPE). Muestras de fluidos corporales puede ser sangre, plasma, suero, orina, esputo, líquido cefalorraquídeo, leche o muestras de fluido ductal y pueden asimismo ser frescos, congelados o fijadas. Las muestras se pueden extirpar quirúrgicamente, mediante extracción es decir, por agujas hipodérmicas o de otro tipo, por microdisección o captura láser. La muestra debe contener cualquier material biológico adecuado para detectar el biomarcador o biomarcadores deseado/s, por lo tanto, dicha muestra debe, comprender ventajosamente material de las células del sujeto.
Por lo tanto, en una realización preferida, la muestra es una muestra de fluido corporal tal como una muestra de plasma, suero y/o sangre.
Una“muestra de plasma, suero y/o sangre” se refiere a una muestra obtenida mediante un método no invasivo. Un ejemplo no limitante y conocido por un experto en la materia sería mediante la extracción de una muestra de sangre de un individuo usando una aguja. Si se quisiese obtener una muestra de plasma o suero, se procedería a la separación del plasma/suero de los otros componentes de la sangre mediante la centrifugación. La cantidad de biomarcadores de la invención puede ser analizada, por ejemplo, pero sin limitarse, en muestras de plasma, suero y/o sangre fresco o plasma, suero y/o sangre que ha sido congelado y después descongelado.
Una“muestra de orina " se refiere a una muestra obtenida mediante un método no invasivo. Un ejemplo no limitante y conocido por un experto en la materia sería mediante la colección de la orina de un individuo en un contenedor sellable. La cantidad de biomarcadores de la invención puede ser analizada, por ejemplo, pero sin limitarse, en muestras de orina fresca u orina que ha sido congelada y después descongelada.
En una realización particular, la muestra es una muestra de Los términos“individuo”,“paciente” o“sujeto” se usan de manera intercambiable en la presente descripción, y no pretenden ser limitativos en ningún aspecto, pudiendo ser el“individuo”, “paciente” o“sujeto” de cualquier edad, sexo y condición física. Una“muestra tisular",“muestra de tejido" o“muestra tisular/de tejido aislada” incluye, pero sin limitarse, células y/o tejidos de un sujeto, obtenidos mediante cualquier método conocido por un experto en la materia. La muestra de tejido puede ser, por ejemplo, pero sin limitarse, una biopsia o un aspirado por aguja fina. Preferiblemente, las células son células tumorales. Tal y como se ha descrito anteriormente, la muestra tisular es muestra tisular de vejiga y/o colon.
Tal y como se ha descrito anteriormente, la medida de la cantidad o la concentración, preferiblemente de manera semi-cuantitativa o cuantitativa, puede ser llevada a cabo de manera directa o indirecta, tal y como se ha señalado anteriormente en la presente descripción. La medida directa se refiere a la medida de la cantidad o la concentración de los productos de expresión, basada en una señal que se obtiene directamente de los productos de expresión, y que está correlacionada con el número de moléculas de dichos productos de expresión. Dicha señal -a la que también podemos referirnos como señal de intensidad- puede obtenerse, por ejemplo, midiendo un valor de intensidad de una propiedad química o física de dichos productos de expresión. La medida indirecta incluye la medida obtenida de un componente secundario o un sistema de medida biológica (por ejemplo la medida de respuestas celulares, ligandos,“etiquetas” o productos de reacción enzimática).
Una“ muestra de referencia’’ se refiere a una muestra similar obtenida de un sujeto o individuo (paciente) control que no presente la enfermedad o dolencia, tal y como una enfermedad autoinmune, preferiblemente artritis reumatoide, que se pretende diagnosticar o pronosticar. La “cantidad de referencia” o“nivel de referencia " se refiere a la cantidad (o a los niveles) absoluta obtenida de la muestra de referencia. Una“muestra de referencia” puede también referirse a una muestra similar obtenida del mismo sujeto o individuo en un punto anterior en el tiempo.
Un “valor de referencia” se refiere al conjunto de valores que se emplean interpretar los resultados de las pruebas diagnósticas, pronosticas y/o de seguimiento en un sujeto o individuo (paciente). Por ejemplo, los valore de referencia para una prueba determinada se basan en los resultados de esa misma prueba en el 95% de la población sana. Los valores de referencia de una prueba pueden ser diferentes en distintos grupos de personas (por ejemplo, entre mujeres y hombres, o entre niños y adultos). También se puede denominar“intervalo de referencia”, “límite de referencia”, y“ límite normar.
Kits v dispositivos de la invención
Un cuarto aspecto de la presente invención se refiere a un kit o dispositivo, de ahora en adelante kit o dispositivo de la invención, que comprende los elementos y/o reactivos necesarios para cuantificar los niveles del producto de expresión de los genes I) TCERG1, ESRP1, RBM17, RBM3, RBM45, KHDRS1, SRSF3, SRSF4, SRSF5, SRSF6, SRFSF9, SRSF10, TIA 1, TRA2A, SNRNP70, RNU12, U2AF1, UA2F2, RNU4ATAC, SNRNP200, RNU6-1, o cualquiera de sus combinaciones en monocitos,
II) TCERG1, ESRP2, NOVA1, PRPF8, PTBP1, RBM17, RBM3, KHDRS1, SF3BM, SRSF4, SRSF6, SRSF10, Ti A l, SNRNP70, UA2F2, RNU4ATAC, SNRNP200, o cualquiera de su combinaciones en linfocitos, y de
III) CELF1, FBP11, NOVA 1, PRPF8, PTBP1, RAVER1, RBM17, RBM22, RBM3, KHDRS1, SF3BTV1, SF3BTV2, SRSF2, SRSF3, SRSF4, SRSF5, SRFSF9, SRSF10, TIA1, TRA2A, TRA2B, SNRNP70, RNU11, UA2F2, RNU4ATAC, SNRNP200, RNU6-1, o cualquiera de sus combinaciones, en neutrófilos.
Preferiblemente el kit o dispositivo de la invención comprende los elementos necesarios para cuantificar los niveles de expresión de RBM17, RBM3, KHDRS1, SRSF10, SNRNP70, UA2F2, RNU4ATAC y/o SNRNP200, o cualquiera de sus combinaciones, y preferiblemente se cuantifican dichos niveles de expresión simultáneamente.
En otra realización preferida el kit o dispositivo de la invención comprende cebadores, sondas y/o anticuerpos capaces de cuantificar el producto de expresión de RBM17, RBM3, KHDRS1, SRSF10, SNRNP70, UA2F2, RNU4ATAC y/o SNRNP200, y donde:
- los cebadores o primers son secuencias de polinucleótidos de entre 10 y 30 pares de bases, más preferiblemente de entre 15 y 25 pares de bases, aún más preferiblemente de entre 18 y 22 pares de bases, y aún mucho más preferiblemente de alrededor de 20 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 y/o SEQ ID NO: 43.
- las sondas son secuencias de polinucleótidos de entre 30 y 1100 pares de bases, más preferiblemente de entre 100 y 1000 pares de bases, y aún más preferiblemente de entre 150 y 500 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más 25 preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 y/o SEQ ID NO: 43.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, los cebadores o sondas están modificados, por ejemplo, pero sin limitarnos, mediante un mareaje radiactivo o inmunológico. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, los oligonucleótidos presentan modificaciones en alguno de sus nucleótidos, como por ejemplo, pero sin limitarnos a, nucleótidos que tengan alguno de sus átomos con un isótopo radiactivo, normalmente 32P o tritio, nucleótidos marcados ¡nmunológicamente, como por ejemplo con una molécula de digoxigenina, y/o inmovilizadas en una membrana. Varias posibilidades son conocidas en el estado de la técnica.
En otra realización preferida de este aspecto de la Invención, el anticuerpo es humano, humanizado o sintético. En otra realización preferida, el anticuerpo es monoclonal y/o se encuentra marcado con un fluorocromo. Preferiblemente, el flurocromo se selecciona de la lista que comprende Fluoresceína (FITC), Tetrametilrodamina y derivados, Ficoeritrina (PE), PerCP, Cy5, Texas, aloficocianina, o cualquiera de sus combinaciones.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el kit o dispositivo de la invención además comprende todos aquellos elementos necesarios para llevar a cabo un procedimiento PCR.
El kit además puede incluir, sin ningún tipo de limitación, tampones, soluciones de extracción de proteínas, agentes para prevenir la contaminación, inhibidores de la degradación de las proteínas, etc.
Por otro lado, el kit puede incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimización. Preferiblemente, el kit comprende además las instrucciones para llevar a cabo los métodos de la invención.
Un quinto aspecto de la invención se refiere a un microarray, de ahora en adelante microarray de la Invención, que comprende oligonucleótidos o micro-arreglos de canal único diseñados a partir de una secuencia conocida o ARNm de los genes RBM17, RBM3, KHDRS1, SRSF10, SNRNP70, UA2F2, RNU4ATAC y/o SNRNP200, o cualquiera de sus combinaciones, y preferiblemente de todos ellos simultáneamente. Más preferiblemente las secuencias de los genes RBM17, RBM3, KHDRS1, SRSF10, SNRNP70, UA2F2, RNU4ATAC y/o SNRNP200 son las secuencias nucleotídicas SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 y/o SEQ ID NO: 43, respectivamente, o secuencias aminoacídicas que presenten un grado de identidad con dichas secuencias aminoacídicas de, al menos del 85%, típicamente de, al menos del 90%, preferiblemente de, al menos del 95%, más preferiblemente de, al menos del 98%, aún más preferiblemente de, al menos del 99%
Así, por ejemplo, las secuencias de oligonucleótidos pueden ser construidas en la superficie un chip mediante el elongamiento secuencial de una cadena en crecimiento con un solo nucleótido utilizando fotolitografía. Así, los oligonucleótidos son anclados por el extremo 3' mediante un método de activación selectiva de nucleótidos, protegidos por un reactivo fotolábil, mediante la incidencia selectiva de luz a través de una fotomáscara. La fotomáscara puede ser física o virtual.
Así, las sondas de oligonucleótidos pueden ser de entre 10 y 100 nucleótidos, más preferiblemente, de entre 20 y 70 nucleótidos, y aún más preferiblemente, de entre 24 y 20 nucleótidos.
La síntesis ¡n situ sobre un soporte sólido (por ejemplo, vidrio), podría hacerse mediante tecnología chorro de tinta (ink-jet), lo que requiere sondas más largas. Los soportes podrían ser, pero sin limitarse a, filtros o membranas de NC o nylon (cargadas), silicio, o Portas de vidrio para microscopios cubiertos con aminosilanos, polilisina, aldehidos o epoxy. La sonda es cada una de las muestras del chip. El target es la muestra a analizar: ARN mensajero, ARN total, un fragmento de PCR, etc.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, el microarray de la invención presenta oligonucleótidos modificados, como se han descrito anteriormente.
Más preferiblemente el kit o dispositivo de la invención comprende cebadores y/o sondas capaces de cuantificar el producto de expresión de los biomarcadores de la invención, y donde
- los cebadores o primers son secuencias de polinucleótidos de entre 10 y 30 pares de bases, más preferiblemente de entre 15 y 25 pares de bases, aún más preferiblemente de entre 18 y 22 pares de bases, y aún mucho más preferiblemente de alrededor de 20 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 y/o SEQ ID NO: 43.
- las sondas son secuencias de polinucleótidos de entre 30 y 1100 pares de bases, más preferiblemente de entre 100 y 1000 pares de bases, y aún más preferiblemente de entre 150 y 500 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más 25 preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 y/o SEQ ID NO: 43.
- los anticuerpos son capaces de unirse específicamente a una región formada por cualquiera de las secuencias aminoacídicas SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 y/o SEQ ID NO: 43. Un séptimo aspecto de la invención se refiere al uso del kit o dispositivo de la invención, la micromatriz, o el microarray de la invención, para la obtención de datos útiles para la detección, diagnóstico, pronóstico, clasificación y seguimiento de pacientes que padecen una enfermedad autoinmune, preferiblemente artritis reumatoide.
Un octavo aspecto de la invención se refiere a un programa de ordenador que comprende instrucciones de programa para hacer que un ordenador lleve a la práctica el procedimiento de acuerdo con cualquiera de los métodos de la invención.
En particular, la invención abarca programas de ordenador dispuestos sobre o dentro de una portadora. La portadora puede ser cualquier entidad o dispositivo capaz de soportar el programa. Cuando el programa va incorporado en una señal que puede ser transportada directamente por un cable u otro dispositivo o medio, la portadora puede estar constituida por dicho cable u otro dispositivo o medio. Como variante, la portadora podría ser un circuito integrado en el que va incluido el programa, estando el circuito integrado adaptado para ejecutar, o para ser utilizado en la ejecución de, los procesos correspondientes.
Por ejemplo, los programas podrían estar incorporados en un medio de almacenamiento, como una memoria ROM, una memoria CD ROM o una memoria ROM de semiconductor, una memoria USB, o un soporte de grabación magnética, por ejemplo, un disco flexible o un disco duro. Alternativamente, los programas podrían estar soportados en una señal portadora transmisible. Por ejemplo, podría tratarse de una señal eléctrica u óptica que podría transportarse a través de cable eléctrico u óptico, por radio o por cualesquiera otros medios.
La invención se extiende también a programas de ordenador adaptados para que cualquier medio de procesamiento pueda llevar a la práctica los métodos de la invención. Tales programas pueden tener la forma de código fuente, código objeto, una fuente intermedia de código y código objeto, por ejemplo, como en forma parcialmente compilada, o en cualquier otra forma adecuada para uso en la puesta en práctica de los procesos según la invención. Los programas de ordenador también abarcan aplicaciones en la nube basadas en dicho procedimiento.
Un noveno aspecto de la invención se refiere a un medio de almacenamiento legible por un ordenador que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención.
Un décimo aspecto de la invención se refiere a una señal transmisible que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención. Los términos “polinucleótido” y “ácido nucleico” se usan aquí de manera intercambiable, refiriéndose a formas polimérlcas de nucleótldos de cualquier longitud, tanto ribonucleótidos (ARN o RNA) como desoxirribonucleótidos (ADN o DNA).
Una secuencia de ácido nucleico o polinucleótido puede comprender las cinco bases que aparecen biológicamente (adenina, guanina, timina, citosina y uracilo) y/o bases distintas de las cinco que aparecen biológicamente. Estas bases pueden servir para distintos propósitos, por ejemplo, para estabilizar o desestabilizar la hibridación; para estimular o inhibir la degradación de la sonda; o como puntos de unión para restos detectables o restos de apantallamiento. Por ejemplo, un polinucleótido de la invención puede contener uno o más restos de base modificados, no estándar, derivatizados, incluyendo, pero sin limitarse a, N6-metil-adenina, N6- terc-butil-bencil-adenina, imidazol, imidazoles sustituidos, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5- clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitoslna, 5- (carboxihidroximetil) uracilo, 5-carboxlmetilaminometil-2-tiouridina, 5- carboximetilaminometiluracilo, d¡hidrourac¡lo,beta-D- galactosilqueosina, inosina, N6- isopenteniladenina, 1- metllguanlna, 1-metilinosina, 2,2- dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6- metiladenlna, 7-metilguanina, 5 metilaminometiluracllo, 5-metox¡aminometil-2-t¡ouracilo, beta-D- manosllqueosina, 5'- metoxicarboximetll uracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltlo-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5- oxiacético, wybutoxosina, pesudouracilo, queoslna, 2-tiocitoslna, 5-metil-2-tiouracilo, 2- tiouracllo, 2-tiouracllo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo (es decir, timina), éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil) uracilo, (acp3)w, 2,6-dlaminopurlna, y 5- propinil pirimidina. Otros ejemplos de restos de bases modificados, no estándar, o derivatizados pueden encontrarse en las Patentes de EEUU Nos. 6.001.611 ; 5.955.589; 5.844.106; 5.789.562; 5.750.343; 5.728.525; y 5.679.785. Además, una secuencia de ácido nucleico o polinucleótido puede comprender uno o más restos de azúcares modificados incluyendo, pero sin limitarse a, arabinosa, 2-fluoroarabinosa, xilulosa, y una hexosa.
Los términos“secuencia aminoacídica”,“péptido”,“oligopéptido”,“polipéptido” y“proteína” se usan aquí de manera intercambiable, y se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que pueden ser codificantes o no codificantes, química o bioquímicamente modificados.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. EJEMPLOS DE LA INVENCIÓN
La Tabla I muestra las características clínicas / serológicas de los pacientes con Artritis Reumatoide incluidos en el desarrollo de la invención
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Tabla I. Características clínicas / serológicas de los pacientes con Artritis Reumatoide incluidos en el desarrollo de la invención
Obtención y procesamiento de muestras sanguíneas.
Se ha recogido sangre periférica en tubos con citrato trisódico. Las muestras fueron centrifugadas para separar la fracción plasmática de la fracción celular. Las plaquetas presentes en el plasma fueron eliminadas con una segunda centrifugación. Finalmente, el plasma y el suero se almacenaron a -80°C para su posterior análisis. Purificación de linfocitos.
Los leucocitos se separaron utilizando el autoMACS Pro Separator (Miltenyi Biotec) utilizando selección inmuno-magnética positiva tras mareaje con anti-CD14 (monocitos), anti-CD3/ant¡- CD19 (linfocitos) y CD15 (neutrófilos), La pureza se analizó mediante citometría de flujo.
Aislamiento de ácidos nucleicos. Los subtipos de leucocitos fueron procesados para la extracción de ARN total utilizando el kit comercial AllPrep DNA/RNA/Protein Mini Kit (QIAGEN, Germantown, MD, EEUU). El ARN total fue tratado con ADNasa (RQI DNAse, Promega; Wisconsin, Estados Unidos); cuantificado mediante el sistema Nanodrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific Inc., Wilmington, DE, EEUU); y retrotranscrito a ADN copia con 1 pg de partida de ARN total en un volumen final de 20 pL con el uso del kit Revert Aid First Strand cDNA Synthesis (MRI Fermentas, Flanover, MD, EEUU), siguiendo las instrucciones del fabricante.
Diseño de cebadores.
Los cebadores fueron diseñados por el equipo de trabajo utilizando el software Primer 3 con las siguientes condiciones óptimas: los parámetros óptimos utilizados para el diseño de cebadores entre exones fueron los siguientes: (a) que la diferencia en la temperatura de unión entre ambos cebadores no fuera mayor de 0,2oC (60°C óptima); (b) exclusión de cebadores que tuvieran alta complementariedad y que pudieran generar dímeros de cebadores y, (c) que amplifican un producto de entre 100 y 180 pares de bases.
Array de qPCR.
Se utilizó la tecnología microfluídica Fluidigm (Fluidigm, Barcelona, España). Esta técnica permite realizar un análisis de expresión mediante arrays de qPCR, reduciendo al mínimo la manipulación de las muestras, eliminando así los errores. Todos los pasos realizados se llevaron a cabo siguiendo las instrucciones y consejos del fabricante. El ADN copia fue preamplificado y posteriormente cargado en la placa Dynamic Array M48.48 usando el software “Prime (113x)” del IFC controller MX (Fluidigm). Posteriormente, se añadió, a cada uno de los pocilios, 2,7 pL de las muestras pre-amplificadas y tratadas con Exonucleasa I y 3,3 pL de una mezcla de 2,5 pL EvaGreen Supermix with Low ROX (Bio-Rad, PN 172- 5211) y 0,25 pL DNA Binding Dye Sample Loading Reagent 20X (Fluidigm, PN 100- 3738), previamente mezcladas y homogeneizadas. Posteriormente se volvió a introducir la placa en el IFC Controller, usando esta vez el software“Load Mix (1 13x)”. Después de esto, se corrió el array de qPCR en el sistema de Biomark HD (Fluidigm).
De forma paralela se llevó a cabo una evaluación clínica y serológica exhaustiva.
Finalmente se realizaron diversos estudios estadísticos de correlación asociación, análisis multivariantes, curvas ROC, etc. para valorar la relevancia de los resultados obtenidos en estudios funcionales en relación con el perfil clínico de los pacientes. Los resultados se muestran en las figuras de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES
1.- El uso de los niveles de expresión de TCERG1, ESRP1, RBM17, RBM3, RBM45, KHDRS1, SRSF3, SRSF4, SRSF5, SRSF6, SRFSF9, SRSF10, TIA1, TRA2A, SNRNP70, RNU12, U2AF1, UA2F2, RNU4ATAC, SNRNP200, RNU6-1, o cualquiera de sus combinaciones en monocitos, de TCERG1, ESRP2, NOVA 1, PRPF8, PTBP1, RBM17, RBM3, KHDRS1, SF3BM, SRSF4, SRSF6, SRSF10, TIA 1, SNRNP70, UA2F2, RNU4ATAC, SNRNP200, o cualquiera de su combinaciones en linfocitos, y de CELF1, FBP11, NOVA1, PRPF8, PTBP1, RAVER1, RBM17, RBM22, RBM3, KHDRS1, SF3BTV1, SF3BTV2, SRSF2, SRSF3, SRSF4, SRSF5, SRFSF9, SRSF10, Ti A l, TRA2A, TRA2B, SNRNP70, RNU11, UA2F2, RNU4ATAC, SNRNP200, RNU6-1, o cualquiera de sus combinaciones, en neutrófilos, para la detección, diagnóstico, pronóstico, clasificación y seguimiento de pacientes que padecen artritis reumatoide.
2.- Un método de detección, diagnóstico, pronóstico y estratificación de pacientes que padecen una enfermedad autoinmune, que comprende: a) Cuantificar los niveles de expresión de
I) TCERG1, ESRP1, RBM17, RBM3, RBM45, KHDRS1, SRSF3, SRSF4, SRSF5, SRSF6, SRFSF9, SRSF10, TIA 1, TRA2A, SNRNP70, RNU12, U2AF1, UA2F2, RNU4ATAC, SNRNP200, RNU6-1, o cualquiera de sus combinaciones en monocitos,
II) TCERG1, ESRP2, NOVA1, PRPF8, PTBP1, RBM17, RBM3, KHDRS1, SF3BM, SRSF4, SRSF6, SRSF10, Ti A l, SNRNP70, UA2F2, RNU4ATAC, SNRNP200, o cualquiera de su combinaciones en linfocitos, y de
III) CELF1, FBP11, NOVA 1, PRPF8, PTBP1, RAVER1, RBM17, RBM22, RBM3, KHDRS1, SF3BTV1, SF3BTV2, SRSF2, SRSF3, SRSF4, SRSF5, SRFSF9, SRSF10, TIA1, TRA2A, TRA2B, SNRNP70, RNU11, UA2F2, RNU4ATAC, SNRNP200, RNU6-1, o cualquiera de sus combinaciones, en neutrófilos b) Comparar los niveles obtenidos en el paso (a) con un valor de referencia, o con los niveles de expresión de dichos marcadores obtenidos en una muestra de referencia.
c) asignar los pacientes que presentan unos niveles de expresión obtenidos en el paso (b) diferentes y estadísticamente significativos al valor de referencia o a los niveles de la muestra de referencia, al grupo de Individuos con riesgo de padecer una enfermedad autoinmune, o al grupo de individuos que padecen una enfermedad autoinmune, y donde preferiblemente la enfermedad autoinmune es la artritis reumatoide. El método según la reivindicación anterior, donde preferiblemente el método comprende: a) cuantificar los niveles de expresión de RBM17, RBM3, KHDRS1, SRSF10, SNRNP70, UA2F2, RNU4ATAC y SNRNP200, en una muestra biológica aislada de dicho individuo, donde la muestra preferiblemente comprende monocitos, linfocitos y/o neutrófilos, preferiblemente purificados,
a1) calcular los índices A1 , A2 y A3 (donde A1 se refiere a monocitos, A2 a linfocitos y A3 a neutrófilos) según las ecuaciones:
A1 = 1/[1 +eA-[-25, 015204+[(-0, 000135*RBM17)+(0, 000031 *RBM3)+(-
0, 000007*KHDRS1)+(0,0002*SRSF10)+(0, 0001 16*SNRNP70)+(0,000062*U2AF2)+(0, 0014
58*RNU4ATAC)+(-0,000675*SNRNP200)]]]
A2=1/[1 +eA-[0, 12461 +[(0,000003*RBM17)+(-0, 000001 *RBM3)+(-
0,000002*KHDRS1)+(0,000003*SRSF10)+(0,000000*SNRNP70)+(0, 000001 *U2AF2)+(0, 00 0031*RNU4ATAC)+(-0,000001*SNRNP200)]]]
A3=1/[1 +eA-[1 ,442807+[(0,000000*RBM17)+(-0,000002*RBM3)+(-
0,000001*KHDRS1)+(0,000000*SRSF10)+(0, 000001 *SNRNP70)+(0,000000*U2AF2)+(0, 00 4708*RNU4ATAC)+(-0,000000*SNRNP200)]]] a2) calcular los índices B1 y B3 (donde B1 se refiere a monocitos, y B3 a neutrófllos)según las ecuaciones:
B1 = 1/[1 +eA-[2,778512+[(-0,000033*RBM17)+(-0,000053*RBM3)+(0,000047*KHDRS1)+(- 0,000006*SRSF10)+(0, 000018*SNRNP70)+(0, 000058*U2AF2)+(-0,000004*RNU4ATAC)+(- 0,000225*SNRNP200)]]]
B3=1/[1 +eA-[-1 ,276655+[(-0,000007*RBM17)+(0,000001*RBM3)+(0,000003*KHDRS1)+(- 0,000004*SRSF10)+(-0,000003*SNRNP70)+(0, 000010*U2AF2)+(0, 000001 *RNU4ATAC)+(- 0, 000001 *SNRNP200)]]] a3) calcular los índices C1 , C2 y C3 (donde C1 se refiere a monocitos, C2 a linfocitos y C3 a neutrófilos) según las ecuaciones:
C1 =1/[1 +eA-[0,36387+[(0,000004*RBM 17)+(0,000007*RBM3)+(- 0, 000017*KHDRS1)+(0,000024*SRSF10)+(0,000003*SNRNP70)+(- 0,000029*U2AF2)+(0,000000*RNU4ATAC)+(0,000003*SNRNP200)]]]
C2=1/[1 +eA-[2,45244+[(-0,000002*RBM17)+(-0,000002*RBM3)+(0,000004*KHDRS1)+(-
0,000008*SRSF10)+(0,000000*SNRNP70)+(-0,000008*U2AF2)+(-
0,000001*RNU4ATAC)+(0,000003*SNRNP200)]]] C3=1/[1 +eA-[-0,280066+[(-0,000012*RBM17)+(0,000045*RBM3)+(0,000017*KHDRS1)+(- 0, 000010*SRSF10)+(-0,000023*SNRNP70)+(- 0,000060*U2AF2)+(0,000020*RNU4ATAC)+(0, 000015*SNRNP200)]]] a4) calcular los índices D1 , D2 y D3 (donde D1 se refiere a monocitos, D2 a linfocitos y D3 a neutrófilos) según las ecuaciones:
D1 =1/[1 +eA-[3,722733+[(0,000015*RBM17)+(-0,000003*RBM3)+(-0,000002*KHDRS1)+(-
0,000008*SRSF10)+(0,000004*SNRNP70)+(-
0,000045*U2AF2)+(0,000000*RNU4ATAC)+(0,000005*SNRNP200)]]]
D2=1/[1 +eA-[18,183604+[(0,000037*RBM17)+(0,000029*RBM3)+(0,000006*KHDRS1)+(- 0,000117*SRSF10)+(0, 000011*SNRNP70)+(-0,000159*U2AF2)+(0,000025*RNU4ATAC)+(- 0,000028*SNRNP200)]]]
D3=1/[1 +eA-[0,5632+[(0,000005*RBM17)+(-
0,000011*RBM3)+(0,000009*KHDRS1)+(0,000004*SRSF10)+(0,000002*SNRNP70)+(- 0,000001*U2AF2)+(0,000005*RNU4ATAC)+(-0, 000021 *SNRNP200)]]]
A1 = 1/(1+eA-[-25, 015204+[(-0, 000135*RBM 17)+(0, 000031 *RBM3)+(- 0,000007*KHDRS1)+(0,000200*SRSF10)+(0,000116*SNRNP70)+(0,000062*U2AF2)+(0,00 1458*RNU4ATAC)+(-0,000675*SNRNP200)]]
A2= 1 /(1 +eA-[0, 12461 +[(0,000003*RBM 17)+(-0,000001*RBM3)+(-
0,000002*KHDRS1)+(0,000003*SRSF10)+(0,000000*SNRNP70)+(0, 000001 *U2AF2)+(0, 00 0031*RNU4ATAC)+(-0,000001*SNRNP200)]]
A3=1/(1+eA-[1 ,442807+[(0,000000*RBM17)+(-0,000002*RBM3)+(-
0,000001*KHDRS1)+(0,000000*SRSF10)+(0, 000001 *SNRNP70)+(0,000000*U2AF2)+(0, 00 4708*RNU4ATAC)+(-0,000000*SNRNP200)]]
a2) calcular los índices B1 y B3 (donde B1 se refiere a monocitos, y B3 a neutrófilos) según las ecuaciones:
B1 = 1/(1+eA-[2,778512+[(-0,000033*RBM17)+(-0,000053*RBM3)+(0,000047*KHDRS1)+(- 0,000006*SRSF10)+(0, 000018*SNRNP70)+(0,000058*U2AF2)+(-0,000004*RNU4ATAC)+(- 0,000225*SNRNP200)]]
B3=1/(1+eA-[-1 ,276655+[(-0,000007*RBM17)+(0,000001*RBM3)+(0,000003*KHDRS1)+(- 0,000004*SRSF10)+(-0,000003*SNRNP70)+(0, 000010*U2AF2)+(0,000001*RNU4ATAC)+(- 0, 000001 *SNRNP200)]]
a3) calcular los índices C1 , C2 y C3 (donde C1 se refiere a monocitos, C2 a linfocitos y C3 a neutrófilos) según las ecuaciones: C1 =1/(1+eA-[0,36387+[(0,000004*RBM 17)+(0,000007*RBM3)+(- 0, 000017*KHDRS1)+(0, 000024*SRSF10)+(0,000003*SNRNP70)+(- 0,000029*U2AF2)+(0,000000*RNU4ATAC)+(0,000003*SNRNP200)]]
C2=1/(1+eA-[2,45244+[(-0,000002*RBM17)+(-0,000002*RBM3)+(0,000004*KHDRS1)+(-
0,000008*SRSF10)+(0,000000*SNRNP70)+(-0,000008*U2AF2)+(-
0,000001*RNU4ATAC)+(0,000003*SNRNP200)]]
C3=1/(1 +eA-[-0,280066+[(-0,000012*RBM17)+(0,000045*RBM3)+(0,000017*KHDRS1)+(- 0, 000010*SRSF10)+(-0,000023*SNRNP70)+(- 0,000060*U2AF2)+(0,000020*RNU4ATAC)+(0, 000015*SNRNP200)]]
a4) calcular los índices D1 , D2 y D3 (donde D1 se refiere a monocitos, D2 a linfocitos y D3 a neutrófilos) según las ecuaciones:
D1 =1/(1+eA-[3,722733+[(0,000015*RBM17)+(-0,000003*RBM3)+(-0,000002*KHDRS1)+(-
0,000008*SRSF10)+(0,000004*SNRNP70)+(-
0,000045*U2AF2)+(0,000000*RNU4ATAC)+(0,000005*SNRNP200)]]
D2=1/(1+eA-[18,183604+[(0,000037*RBM17)+(0,000029*RBM3)+(0,000006*KHDRS1)+(- 0,000117*SRSF10)+(0, 000011*SNRNP70)+(-0,000159*U2AF2)+(0,000025*RNU4ATAC)+(- 0,000028*SNRNP200)]]
D3=1/(1+eA-[0,5632+[(0,000005*RBM17)+(-
0,000011*RBM3)+(0,000009*KHDRS1)+(0,000004*SRSF10)+(0,000002*SNRNP70)+(- 0, 000001 *U2AF2)+(0,000005*RNU4ATAC)+(-0, 000021*SNRNP200)]]
Asignando en cada ecuación los valores de los biomarcadores correspondientes obtenidos en el paso (a).
4.- Un método para la clasificación, diagnóstico y seguimiento pacientes con AR, que comprende los pasos (a) y (c) según cualquiera de las reivindicaciones 2-3, y además comprende:
d1) clasificar al individuo del paso (a) en el grupo de individuos con artritis reumatoide cuando el valor del índice A1 del paso (a1) sea preferiblemente menor que 0,0000015, preferiblemente menor que 0,000015, y aún más preferiblemente menor que 0,5; cuando el valor del índice A2 del paso (a1) sea preferiblemente menor que 0,8438, preferiblemente menor que 0,9035, y aun más preferiblemente menor que 0,9271 ; cuando el valor del índice A3 del paso (a1) sea preferiblemente menor que 0,6872, preferiblemente menor que 0,6954 y aún más preferiblemente menor que 0,7005.
5.- El método para la clasificación, diagnóstico y seguimiento pacientes con AR según según cualquiera de las reivindicaciones 2-4, que además comprende: d2) clasificar al individuo del paso (a) en el grupo de individuos con AR con alta actividad de la enfermedad cuando el valor del índice B1 del paso (a2) sea preferiblemente menor que 0, 1717, preferiblemente menor que 0, 1887, y aún más preferiblemente menor que 0,3754; cuando el valor del índice B3 del paso (a2) sea preferiblemente menor que 0,2045, preferiblemente menor que 0,2178, y aún más preferiblemente menor que 0,227.
6.- El método para la clasificación, diagnóstico y seguimiento pacientes con AR según según cualquiera de las reivindicaciones 2-5, que además comprende: d3) clasificar al individuo del paso (a) en el grupo de individuos con AR y placas de ateroma cuando el valor del índice C1 del paso (a3) sea preferiblemente menor que 0,4869, preferiblemente menor que 0,4981 , y aún más preferiblemente menor que 0,503; cuando el valor del índice C2 del paso (a3) sea preferiblemente menor que 0,6625, preferiblemente menor que 0,7087, y aun más preferiblemente menor que 0,7433; cuando el valor del índice C3 del paso (a3) sea preferiblemente menor que 0,2623, preferiblemente menor que 0,279 y aún más preferiblemente menor que 0,4028.
7.- El método para la clasificación, diagnóstico y seguimiento pacientes con AR según según cualquiera de las reivindicaciones 2-6, que además comprende: d4) clasificar al individuo del paso (a) en el grupo de individuos con AR y afectación radiológica cuando el valor del índice D1 del paso (a2) sea preferiblemente menor que 0,5384, preferiblemente menor que 0,6139, y aún más preferiblemente menor que 0,664; cuando el valor del índice D2 del paso (a2) sea preferiblemente menor que 0,5; cuando el valor del índice D3 del paso (a2) sea preferiblemente menor que 0,4021 , preferiblemente menor que 0,467 y aún más preferiblemente menor que 0,5061.
8.- Un método de seguimiento de la evolución de una enfermedad autoinmune, preferiblemente artritis reumatoide, que comprende los pasos (a) y (c) del método según cualquiera de las reivindicaciones 2-7, y además comprende: d) repetir al menos dos veces la secuencia de pasos (a) - (c) en muestras obtenidas del mismo individuo según el paso (a), de manera no simultánea.
9.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 2-8, donde los pasos (a), (b) (c) y/o (d) pueden ser total o parcialmente automatizados y/o computerizados.
10.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 2-7, donde la muestra biológica es sangre periférica.
11.- Un kit o dispositivo que comprende los elementos y/o reactivos necesarios para cuantificar los niveles del producto de expresión de los genes
I) TCERG1, ESRP1, RBM17, RBM3, RBM45, KHDRS1, SRSF3, SRSF4, SRSF5, SRSF6, SRFSF9, SRSF10, TIA 1, TRA2A, SNRNP70, RNU12, U2AF1, UA2F2, RNU4ATAC, SNRNP200, RNU6-1, o cualquiera de sus combinaciones en monocitos,
II) TCERG1, ESRP2, NOVA1, PRPF8, PTBP1, RBM17, RBM3, KHDRS1, SF3BM, SRSF4, SRSF6, SRSF10, TIA 1, SNRNP70, UA2F2, RNU4ATAC, SNRNP200 , o cualquiera de su combinaciones en linfocitos, y de
III) CELF1, FBP11, NOVA 1, PRPF8, PTBP1, RAVER1, RBM17, RBM22, RBM3, KHDRS1, SF3BTV1, SF3BTV2, SRSF2, SRSF3, SRSF4, SRSF5, SRFSF9, SRSF10, TIA1, TRA2A, TRA2B, SNRNP70, RNU11, UA2F2, RNU4ATAC, SNRNP200, RNU6-1, o cualquiera de sus combinaciones, en neutrófilos.
12.- El kit o dispositivo según la reivindicaciones anterior, donde se cuantifican los niveles de expresión de RBM17, RBM3, KHDRS1, SRSF10, SNRNP70, UA2F2, RNU4ATAC y/o SNRNP200, o cualquiera de sus combinaciones, y preferiblemente se cuantifican dichos niveles de expresión simultáneamente.
13.- El kit o dispositivo según la reivindicación anterior que comprende cebadores, sondas y/o anticuerpos capaces de cuantificar el producto de expresión de RBM17, RBM3, KHDRS1, SRSF10, SNRNP70, UA2F2, RNU4ATAC y/o SNRNP200 , y donde:
- los cebadores o primers son secuencias de polinucleótidos de entre 10 y 30 pares de bases, más preferiblemente de entre 15 y 25 pares de bases, aún más preferiblemente de entre 18 y 22 pares de bases, y aún mucho más preferiblemente de alrededor de 20 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 y/o SEQ ID NO: 43.
- las sondas son secuencias de polinucleótidos de entre 30 y 1100 pares de bases, más preferiblemente de entre 100 y 1000 pares de bases, y aún más preferiblemente de entre 150 y 500 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más 25 preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 y/o SEQ ID NO: 43.
14.- El kit o dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 10-11 que comprende cebadores, sondas y/o anticuerpos capaces de cuantificar el producto de expresión de todos los biomarcadores de la Invención, y donde
- los cebadores o primers son secuencias de polinucleótidos de entre 10 y 30 pares de bases, más preferiblemente de entre 15 y 25 pares de bases, aún más preferiblemente de entre 18 y 22 pares de bases, y aún mucho más preferiblemente de alrededor de 20 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un
98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a las secuencias de la tabla 2.
- las sondas son secuencias de polinucleótidos de entre 30 y 1100 pares de bases, más preferiblemente de entre 100 y 1000 pares de bases, y aún más preferiblemente de entre 150 y 500 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más 25 preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a las secuencias de la tabla 2.
15.- El uso kit o dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 10-13 para la detección, diagnóstico, pronóstico, clasificación y seguimiento de pacientes que padecen artritis reumatoide.
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