CN110055321A - 检测非酒精性脂肪肝的miRNA标志物、试剂盒、应用、检测方法 - Google Patents

检测非酒精性脂肪肝的miRNA标志物、试剂盒、应用、检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种检测检测非酒精性脂肪肝的miRNA标志物、试剂盒、应用、检测方法，为miR‑122‑5p、miR‑21‑5p、miR‑192‑5p、miR‑223‑3p、miR‑29a‑3p、miR‑331‑3p、miR‑30c‑5p、miR‑182‑5p、miR‑224‑5p和miR‑221‑5p中的任意一种或多种；所述标志物和试剂盒，可用于非酒精性脂肪肝辅助诊断，且易于检测，定量精确，敏感性和特异性佳。

Description

检测非酒精性脂肪肝的miRNA标志物、试剂盒、应用、检测方法
技术领域
本发明涉及技术领域，具体涉及一种检测检测非酒精性脂肪肝的miRNA标志物、试剂盒、应用、检测方法。
背景技术
非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholicfattyliverdisease,NAFLD)是一种无过量饮酒史，与胰岛素抵抗(insulinresistance，IR)和遗传易感性(geneticsusceptibility)密切相关的代谢应激性肝脏损伤，疾病谱包括非酒精性肝脂肪变(non-alcoholichepaticsteatosis)、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholicsteatohepatitis,NASH)、肝硬化和肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)。NAFLD不仅可以导致肝病残疾和死亡，还与代谢综合征(metabolicsyndrome,MetS)、2型糖尿病(type2diabetes mellitus,T2DM)、动脉硬化性心血管疾病以及结直肠肿瘤等的高发密切相关。随着肥胖及其相关代谢综合征全球化的流行趋势，非酒精性脂肪性肝病现已成为欧美等发达国家和我国富裕地区慢性肝病的重要病因，普通成人NAFLD患病率10％～30％，其中10％～20％为NASH，后者10年内肝硬化发生率高达25％。因此，非酒精性脂肪性肝病是当代医学领域的新挑战。
而体检项目中对于脂肪肝的检测方式还存在着很大的局限性，并不满足精准医疗的趋势。影像学检查和穿刺活检不能在早期做出诊断，耽误治疗；穿刺活检具有侵入性、采样的代表性差、变异程度高、可能会导致严重的并发症、患者的身心难以接受等。此外，近年新兴的瞬时弹性成像技术虽然可以测量肝硬度值，但还是只适用于肝纤维化中晚期的诊断。
发明内容
有鉴于此，本申请提供了一种检测检测非酒精性脂肪肝的miRNA标志物、试剂盒、应用、检测方法，所述标志物和试剂盒，可用于脑非酒精性脂肪肝辅助诊断，且易于检测，定量精确，敏感性和特异性佳。
为解决以上技术问题，本发明提供的技术方案是一种检测非酒精性脂肪肝的miRNA标志物，为miR-122-5p、miR-21-5p、miR-192-5p、miR-223-3p、miR-29a-3p、miR-331-3p、miR-30c-5p、miR-182-5p、miR-224-5p和miR-221-5p中的任意一种或多种。
优选的，所述标志物为miR-122-5p、miR-21-5p、miR-192-5p、miR-223-3p、miR-29a-3p、miR-331-3p、miR-30c-5p、miR-182-5p、miR-224-5p和miR-221-5p的组合。
本发明还提供了上述miRNA标志物的反转录引物、检测引物，
所述反转录引物为：
miR-122-5p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:1所示；
miR-21-5p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:2所示；
miR-192-5p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:3所示；
miR-223-3p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:4所示；
miR-29a-3p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:5所示；
miR-331-3p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:6所示；
miR-30c-5p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:7所示；
miR-182-5p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:8所示；
miR-224-5p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:9所示；
miR-221-5p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:10所示；
所述检测引物为：
miR-122-5p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:11所示；
miR-122-5p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:12所示；
miR-21-5p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:13所示；
miR-21-5p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:14所示；
miR-192-5p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:15所示；
miR-192-5p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:16所示；
miR-223-3p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:17所示；
miR-223-3p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:18所示；
miR-29a-3p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:19所示；
miR-29a-3p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:20所示；
miR-331-3p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:21所示；
miR-331-3p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:22所示；
miR-30c-5p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:23所示；
miR-30c-5p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:24所示；
miR-182-5p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:25所示；
miR-182-5p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:26所示；
miR-224-5p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:27所示；
miR-224-5p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:28所示；
miR-221-5p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:29所示；
miR-221-5p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:30所示。
优选的，
miR-122-5p的正向引物Tm值为60.8；
miR-122-5p的反向引物Tm值为60；
miR-21-5p的正向引物Tm值为61.2；
miR-21-5p的反向引物Tm值为61.2；
miR-192-5p的正向引物Tm值为60.3；
miR-192-5p的反向引物Tm值为61.7；
miR-223-3p的正向引物Tm值为60.5；
miR-223-3p的反向引物Tm值为61.7；
miR-29a-3p的正向引物Tm值为60.2；
miR-29a-3p的反向引物Tm值为60；
miR-331-3p的正向引物Tm值为60.3；
miR-331-3p的反向引物Tm值为60；
miR-30c-5p的正向引物Tm值为58.2；
miR-30c-5p的反向引物Tm值为60；
miR-182-5p的正向引物Tm值为59.4；
miR-182-5p的反向引物Tm值为60；
miR-224-5p的正向引物Tm值为61.8；
miR-224-5p的反向引物Tm值为60；
miR-221-5p的正向引物Tm值为61.7；
miR-221-5p的反向引物Tm值为60。
本发明还提供了上述miRNA标志物在制备检测非酒精性脂肪肝试剂中的应用。
优选的，所述试剂通过检测被试者生物样品中所述miRNA标志物的含量来判断被试者非酒精性脂肪肝程度。
优选的，所述试剂通过检测被试者生物样品中所述miRNA标志物的含量来判断被试者非酒精性脂肪肝程度。
优选的，所述试剂通过检测被试者生物样品中所述miRNA标志物的含量采用公式(I)来判断被试者非酒精性脂肪肝程度；
所述公式(I)为：
P＝es/(1+es)；
S＝0.438-0.001×m1-0.001×m2-0.008×m3+0.001×m4+0.007×m5-0.019×m6+0.004×m7-0.113×m8-0.17×m9+0.024×m10；
当P<0.223时，表示被试者健康；
当0.223<P<0.412时，表示被试者轻度脂肪肝；
当0.412<P<0.668时，表示被试者中度脂肪肝；
当P>0.668时，表示被试者重度脂肪肝；
其中，
es为e的S次方，e为自然常数e＝2.71828182845904；
m1为被试者生物样品中miR-221-5p的含量；
m2为被试者生物样品中miR-21-5p的含量；
m3为被试者生物样品中miR-192-5p的含量；
m4为被试者生物样品中miR-223-3p的含量；
m5为被试者生物样品中miR-29a-3p的含量；
m6为被试者生物样品中miR-331-3p的含量；
m7为被试者生物样品中miR-30c-5p的含量；
m8为被试者生物样品中miR-182-5p的含量；
m9为被试者生物样品中miR-224-5p的含量；
m10为被试者生物样品中miR-221-5p的含量。
优选的，所述生物样品为血浆。
本发明还提供了上述miRNA标志物的反转录引物、检测引物在制备检测非酒精性脂肪肝试剂中的应用。
本发明还提供了一种非酒精性脂肪肝的诊断试剂盒，所述试剂盒用于检测血浆中microRNA标志物的含量；所述标志物为miR-122-5p、miR-21-5p、miR-192-5p、miR-223-3p、miR-29a-3p、miR-331-3p、miR-30c-5p、miR-182-5p、miR-224-5p和miR-221-5p中的任意一种或多种。
优选的，所述试剂盒包括：所述的microRNA标志物的反转录引物、检测引物；
所述反转录引物为：
miR-122-5p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:1所示；
miR-21-5p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:2所示；
miR-192-5p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:3所示；
miR-223-3p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:4所示；
miR-29a-3p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:5所示；
miR-331-3p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:6所示；
miR-30c-5p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:7所示；
miR-182-5p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:8所示；
miR-224-5p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:9所示；
miR-221-5p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:10所示；
所述检测引物为：
miR-122-5p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:11所示；
miR-122-5p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:12所示；
miR-21-5p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:13所示；
miR-21-5p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:14所示；
miR-192-5p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:15所示；
miR-192-5p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:16所示；
miR-223-3p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:17所示；
miR-223-3p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:18所示；
miR-29a-3p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:19所示；
miR-29a-3p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:20所示；
miR-331-3p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:21所示；
miR-331-3p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:22所示；
miR-30c-5p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:23所示；
miR-30c-5p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:24所示；
miR-182-5p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:25所示；
miR-182-5p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:26所示；
miR-224-5p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:27所示；
miR-224-5p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:28所示；
miR-221-5p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:29所示；
miR-221-5p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:30所示。
优选的，所述试剂盒还包括PCR技术常用的试剂。
优选的，所述试剂盒还包括Bio-rad公司的ddPCRTMProbeSupermix，ddPCRTMEvaGreen Supermix，ABI公司的TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit，质控品和超纯水。
优选的，所述试剂盒为基于数字PCR平台的试剂盒。
本发明还提供了一种血浆中权利要求1所述miRNA标志物的含量的检测方法，包括：
(1)采集血浆，总游离RNA的提取；
(2)使用得到的总游离RNA配置反转录反应体系，进行反转录反应得到反转录样品；
(3)使用得到的反转录样品配置数字PCR检测反应体系，制备数字PCR反应微滴，进行数字PCR反应。
本申请与现有技术相比，其详细说明如下：
(1)本发明提供的标志物miRNA，易于检测，且定量精确，提高了非酒精性脂肪肝诊断的敏感性和特异性。该miRNA生物标志物的成功开发有助于非酒精性脂肪肝的辅助诊断，为其他生物标志物的研制提供借鉴。所述标志物为miR-122-5p、miR-21-5p、miR-192-5p、miR-223-3p、miR-29a-3p、miR-331-3p、miR-30c-5p、miR-182-5p、miR-224-5p和miR-221-5p中的任意一种或多种；进一步的，所述标志物为miR-122-5p、miR-21-5p、miR-192-5p、miR-223-3p、miR-29a-3p、miR-331-3p、miR-30c-5p、miR-182-5p、miR-224-5p和miR-221-5p的组合，十种miRNA具有较好的组织特异性，检测的靶点适量，精简和可操作性强。
(2)本发明提供的技术方案是针对血浆中miRNA标志物含量进行检测，微创，能被大众所广泛接受。
(3)本发明通过检测血浆中标志物miRNA的含量，与健康对照人群平均水平相比较来判断脂肪变的严重程度，肝纤维化的程度。采用本发明提供的本发明提供的标志物和试剂盒，通过检测被试者生物样品中miRNA标志物的含量采用公式即可来判断被试者非酒精性脂肪肝程度，可用于非酒精性脂肪肝辅助诊断，有助于反映脂肪病变的严重程度，肝纤维化的程度，为临床医生快速准确掌握患者病情、及时采取更具个性化的防治方案提供支持。
(4)本发明提供的试剂盒为基于数字PCR平台的试剂盒具有更精准和更灵敏的特性。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1
一种非酒精性脂肪肝的诊断试剂盒，所述试剂盒用于检测血浆中microRNA标志物的含量；所述试剂盒包括：所述的microRNA标志物的反转录引物、检测引物；
所述标志物为miR-122-5p；
所述反转录引物为：miR-122-5p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:1所示；所述检测引物为：miR-122-5p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:11所示，Tm值为60.8；miR-122-5p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:12所示，Tm值为60。
实施例2
一种非酒精性脂肪肝的诊断试剂盒，所述试剂盒用于检测血浆中microRNA标志物的含量；所述试剂盒包括：所述的microRNA标志物的反转录引物、检测引物；
所述标志物为miR-21-5p；
所述反转录引物为：miR-21-5p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:2所示；所述检测引物为：miR-21-5p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:13所示，Tm值为61.2；miR-21-5p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:14所示，Tm值为61.2。
实施例3
一种非酒精性脂肪肝的诊断试剂盒，所述试剂盒用于检测血浆中microRNA标志物的含量；所述试剂盒包括：所述的microRNA标志物的反转录引物、检测引物；
所述标志物为miR-192-5p；
所述反转录引物为：miR-192-5p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:3所示；所述检测引物为：miR-192-5p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:15所示，Tm值为60.3；miR-192-5p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:16所示，Tm值为61.7。
实施例4
一种非酒精性脂肪肝的诊断试剂盒，所述试剂盒用于检测血浆中microRNA标志物的含量；所述试剂盒包括：所述的microRNA标志物的反转录引物、检测引物；
所述标志物为miR-223-3p；
所述反转录引物为：miR-223-3p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:4所示；所述检测引物为：miR-223-3p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:17所示，Tm值为60.5；miR-223-3p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:18所示，Tm值为61.7。
实施例5
一种非酒精性脂肪肝的诊断试剂盒，所述试剂盒用于检测血浆中microRNA标志物的含量；所述试剂盒包括：所述的microRNA标志物的反转录引物、检测引物；
所述标志物为miR-29a-3p；
所述反转录引物为：miR-29a-3p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:5所示；所述检测引物为：miR-29a-3p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:19所示，Tm值为60.2；miR-29a-3p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:20所示，Tm值为60。
实施例6
一种非酒精性脂肪肝的诊断试剂盒，所述试剂盒用于检测血浆中microRNA标志物的含量；所述试剂盒包括：所述的microRNA标志物的反转录引物、检测引物；
所述标志物为miR-331-3p；
所述反转录引物为：miR-331-3p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:6所示；所述检测引物为：miR-331-3p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:21所示，Tm值为60.3；miR-331-3p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:22所示，Tm值为60。
实施例7
一种非酒精性脂肪肝的诊断试剂盒，所述试剂盒用于检测血浆中microRNA标志物的含量；所述试剂盒包括：所述的microRNA标志物的反转录引物、检测引物；
所述标志物为miR-30c-5p；
所述反转录引物为：miR-30c-5p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:7所示；所述检测引物为：miR-30c-5p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:23所示，Tm值为58.2；miR-30c-5p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:24所示，Tm值为60。
实施例8
一种非酒精性脂肪肝的诊断试剂盒，所述试剂盒用于检测血浆中microRNA标志物的含量；所述试剂盒包括：所述的microRNA标志物的反转录引物、检测引物；
所述标志物为miR-182-5p；
所述反转录引物为：miR-182-5p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:8所示；所述检测引物为：miR-182-5p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:25所示，Tm值为59.4；miR-182-5p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:26所示，Tm值为60。
实施例9
一种非酒精性脂肪肝的诊断试剂盒，所述试剂盒用于检测血浆中microRNA标志物的含量；所述试剂盒包括：所述的microRNA标志物的反转录引物、检测引物；
所述标志物为miR-224-5p；
所述反转录引物为：miR-224-5p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:9所示；所述检测引物为：miR-224-5p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:27所示，Tm值为61.8；miR-224-5p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:28所示，Tm值为60。
实施例10
一种非酒精性脂肪肝的诊断试剂盒，所述试剂盒用于检测血浆中microRNA标志物的含量；所述试剂盒包括：所述的microRNA标志物的反转录引物、检测引物；
所述标志物为miR-221-5p；
所述反转录引物为：miR-221-5p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:10所示；所述检测引物为：miR-221-5p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:29所示，Tm值为61.7；miR-221-5p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:30所示，Tm值为60。
实施例11
一种非酒精性脂肪肝的诊断试剂盒，所述试剂盒用于检测血浆中microRNA标志物的含量；所述试剂盒包括：所述的microRNA标志物的反转录引物、检测引物；
所述标志物为miR-122-5p、miR-21-5p、miR-192-5p、miR-223-3p、miR-29a-3p、miR-331-3p、miR-30c-5p、miR-182-5p、miR-224-5p和miR-221-5p的组合；
所述反转录引物为：
miR-122-5p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:1所示；
miR-21-5p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:2所示；
miR-192-5p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:3所示；
miR-223-3p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:4所示；
miR-29a-3p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:5所示；
miR-331-3p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:6所示；
miR-30c-5p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:7所示；
miR-182-5p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:8所示；
miR-224-5p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:9所示；
miR-221-5p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:10所示；
所述检测引物为：
miR-122-5p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:11所示，Tm值为60.8；
miR-122-5p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:12所示，Tm值为60；
miR-21-5p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:13所示，Tm值为61.2；
miR-21-5p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:14所示，Tm值为61.2；
miR-192-5p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:15所示，Tm值为60.3；
miR-192-5p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:16所示，Tm值为61.7；
miR-223-3p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:17所示，Tm值为60.5；
miR-223-3p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:18所示，Tm值为61.7；
miR-29a-3p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:19所示，Tm值为60.2；
miR-29a-3p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:20所示，Tm值为60；
miR-331-3p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:21所示，Tm值为60.3；
miR-331-3p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:22所示，Tm值为60；
miR-30c-5p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:23所示，Tm值为58.2；
miR-30c-5p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:24所示，Tm值为60；
miR-182-5p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:25所示，Tm值为59.4；
miR-182-5p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:26所示，Tm值为60；
miR-224-5p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:27所示，Tm值为61.8；
miR-224-5p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:28所示，Tm值为60；
miR-221-5p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:29所示，Tm值为61.7；
miR-221-5p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:30所示，Tm值为60。
实施例12
测试例1
(1)采集血浆，总游离RNA的提取；
取各受试者的血浆样本约200ul，4℃2000g离心10min，使用QIAGEN公司的miRNeasySerum/PlasmaKit进行总游离RNA(包括总miRNA)的提取，在加入QIAzolLysisReagent震荡并静置5min后，加入质控品10ul。提取完后测定浓度，调整浓度提取的总游离RNA为20～50ng/ul。
(2)使用得到的总游离RNA和反转录引物配置反转录反应体系，进行反转录反应得到miRNA反转录样品；miRNA反转录反应体系见表1(miR-122-5p、miR-21-5p、miR-192-5p、miR-223-3p、miR-29a-3p、miR-331-3p、miR-30c-5p、miR-182-5p、miR-224-5p和miR-221-5p各检测单独配置一管)
表1中本发明反转录引物为：
miR-122-5p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:1所示；
miR-21-5p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:2所示；
miR-192-5p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:3所示；
miR-223-3p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:4所示；
miR-29a-3p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:5所示；
miR-331-3p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:6所示；
miR-30c-5p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:7所示；
miR-182-5p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:8所示；
miR-224-5p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:9所示；
miR-221-5p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:10所示；
表1中质控品为Spike-inControl，为市售产品，包含在QIAGEN公司的miRNeasySerum/PlasmaKit试剂盒中，其实际为合成的线虫来源的cel-miRNA-39；
采用质控品反转录引物进行反转录反应得到质控品反转录样品；质控品反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:31所示；
反转录反应按表2条件进行反应，4℃表示反应完成；
表1miRNA、质控品反转录反应体系
成分 体积
100mM dNTPs(withdTTP) 0.15ul
MultiScribe<sup>TM</sup> Reverse Transcriptase,50U/μL 1ul
10XRT Buffer 1.5ul
RNase Inhibitor 0.188ul
本发明反转录引物或者质控品反转录引物 3ul
总游离RNA样品 3ul
超纯水 6.162ul
共计 15ul
表2miRNA和质控品反转录反应条件
(3)使用得到的miRNA反转录样品和检测引物配置miRNA数字PCR检测反应体系，制备数字PCR反应微滴，进行数字PCR反应；
miRNA数字PCR检测反应体系见表3(miR-122-5p、miR-21-5p、miR-192-5p、miR-223-3p、miR-29a-3p、miR-331-3p、miR-30c-5p、miR-182-5p、miR-224-5p和miR-221-5p各检测单独配置一管)；
表3中本发明检测引物为：
miR-122-5p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:11所示，Tm值为60.8；
miR-122-5p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:12所示，Tm值为60；
miR-21-5p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:13所示，Tm值为61.2；
miR-21-5p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:14所示，Tm值为61.2；
miR-192-5p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:15所示，Tm值为60.3；
miR-192-5p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:16所示，Tm值为61.7；
miR-223-3p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:17所示，Tm值为60.5；
miR-223-3p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:18所示，Tm值为61.7；
miR-29a-3p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:19所示，Tm值为60.2；
miR-29a-3p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:20所示，Tm值为60；
miR-331-3p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:21所示，Tm值为60.3；
miR-331-3p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:22所示，Tm值为60；
miR-30c-5p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:23所示，Tm值为58.2；
miR-30c-5p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:24所示，Tm值为60；
miR-182-5p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:25所示，Tm值为59.4；
miR-182-5p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:26所示，Tm值为60；
miR-224-5p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:27所示，Tm值为61.8；
miR-224-5p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:28所示，Tm值为60；
miR-221-5p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:29所示，Tm值为61.7；
miR-221-5p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:30所示，Tm值为60。
表1中质控品引物为：
正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:32所示；
反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:33所示；
使用得到的质控品反转录样品和质控品检测引物配置质控品数字PCR检测反应体系，制备数字PCR反应微滴，进行数字PCR反应；
质控品数字PCR检测反应体系见表4；
表3miRNA数字PCR反应体系
成分 体积
ddPCR<sup>TM</sup>ProbeSupermix 10ul
Taqman引物+探针 0.5ul
miRNA反转录样品 3ul
超纯水 6.5ul
共计 20ul
表4质控品数字PCR反应体系
其中，
制备数字PCR反应微滴，使用得到的反转录样品(miRNA反转录样品、质控品反转录样品)进行数字PCR反应过程具体包括：将配置好的数字PCR检测反应体系(miRNA数字PCR检测反应体系、质控品数字PCR检测反应体系)加入到微滴发生卡DG8TMCartridges的样品槽中，同时在发生油槽中加入60ul微滴发生油DropletGenerationOilforProbes，最后用封膜DG8TMGaskets封好，置于微滴发生仪上，进行数字PCR反应微滴的制备；
将制备好的数字PCR反应微滴缓慢转移至96孔板中，然后用铝制封膜配合封膜机器热封好后，按表5条件进行数字PCR反应。
表5数字PCR反应条件
数字PCR反应完后的96孔板，转移至QX200TM数字PCR读取仪中，进行结果的读取。
(5)结果计算：
1)假设提取后总游离RNA样品溶解体积为AμL，Bio-radQX200数字PCR检测结果为Bcopies/μL，则质控品的浓度(Xcopies/μL)按以下公式进行计算：
公式：X拷贝数/μL＝(B×20/3×15/3×A)/10＝10/3×A×B
2)质控品检测结果应满足：3×104～4×104copies/ul，满足则样品检测miRNA(miR-122-5p、miR-21-5p、miR-192-5p、miR-223-3p、miR-29a-3p、miR-331-3p、miR-30c-5p、miR-182-5p、miR-224-5p和miR-221-5p)结果有效，否则实验无效，需重新提取进行检测。
3)若质控品结果合格，血浆样本中的靶miRNA的浓度(Ycopies/μL)按以下公式计算：
公式：Y拷贝数/μL＝(B×20/3×15/3×A)/200＝1/6×A×B
(6)实验结果：
每组反应最终检测的微滴数在10000-20000之间，均大于10000，表示结果有效可靠。检测结果见表6。
表6
(7)使用MedCalc软件进行分析，得到检测对照的ROC曲线，从而确定实施例11的试剂盒检测的准确度，分析结果件表7。
表7
试剂盒 敏感度(％) 特异性(％) AUC 95％置信区间
实施例11 92.4 90.8 0.932 0.85-0.96
由表7可知，本发明提供的标志物非酒精性脂肪肝具有较高的准确性、灵敏度和特异性，能够应用于制备miRNA标志物在非酒精性脂肪肝的诊断试剂，辅助评估在非酒精性脂肪肝状况。
测试例2
分别采集非酒精性脂肪肝患者组(NAS≥5分)和健康对照组的血浆采用测试例1的试验过程进行分组试验，比较miRNA在非酒精性脂肪肝患者组和健康对照组的血浆中表达水平：
健康对照组的纳入标准：血、尿、粪常规及肝功能均正常，腹部超声显示无脂肪肝表现，既往无肿瘤病史、肝脏病史及影响肝脏功能的家族史；无烟酒嗜好。控制健康对照组年龄和性别、种族方面与非酒精性脂肪肝患者组基本匹配。
健康对照组的排除标准：除外药物性肝病、肝脏肿瘤、酒精性肝病、脂肪肝、血吸虫病、病毒性肝炎、Wilson病、自身免疫性肝炎、胆道梗阻等肝胆疾病，除外高血压、冠心病和其它系统性疾病。
结果表明，与健康对照组相比，非酒精性脂肪肝患者组血浆中的miR-122-5p、miR-21-5p、miR-192-5p、miR-223-3p、miR-29a-3p、miR-331-3p、miR-30c-5p、miR-182-5p、miR-224-5p和miR-221-5p总体表达水平均存在较大差异。
同时，
非酒精性脂肪肝患者组血浆中的miR-122-5p的总体表达水平比健康对照组血浆中的miR-122-5p的总体表达水平升高了(P＜0.05)；
非酒精性脂肪肝患者组血浆中的miR-21-5p的总体表达水平比健康对照组血浆中的miR-122-5p的总体表达水平升高了(P＜0.05)；
非酒精性脂肪肝患者组血浆中的miR-192-5p的总体表达水平比健康对照组血浆中的miR-122-5p的总体表达水平升高了(P＜0.05)；
非酒精性脂肪肝患者组血浆中的miR-223-3p的总体表达水平比健康对照组血浆中的miR-122-5p的总体表达水平升高了(P＜0.05)；
非酒精性脂肪肝患者组血浆中的miR-29a-3p的总体表达水平比健康对照组血浆中的miR-122-5p的总体表达水平升高了(P＜0.05)；
非酒精性脂肪肝患者组血浆中的miR-331-3p的总体表达水平比健康对照组血浆中的miR-122-5p的总体表达水平升高了(P＜0.05)；
非酒精性脂肪肝患者组血浆中的miR-30c-5p的总体表达水平比健康对照组血浆中的miR-122-5p的总体表达水平升高了(P＜0.05)；
非酒精性脂肪肝患者组血浆中的miR-182-5p的总体表达水平比健康对照组血浆中的miR-122-5p的总体表达水平升高了(P＜0.05)；
非酒精性脂肪肝患者组血浆中的miR-224-5p的总体表达水平比健康对照组血浆中的miR-122-5p的总体表达水平升高了(P＜0.05)；
非酒精性脂肪肝患者组血浆中的miR-221-5p的总体表达水平比健康对照组血浆中的miR-122-5p的总体表达水平升高了(P＜0.05)。
测试例3
采集被试者生物样品采用测试例1的试验过程进行试验，被试者包括：不同脂肪肝程度非酒精性脂肪肝患者和健康被试者，生物样品为血浆，通过检测被试者生物样品中所述miRNA标志物的含量采用公式(I)来判断被试者非酒精性脂肪肝程度；
所述公式(I)为：
P＝es/(1+es)；
S＝0.438-0.001×m1-0.001×m2-0.008×m3+0.001×m4+0.007×m5-0.019×m6+0.004×m7-0.113×m8-0.17×m9+0.024×m10；
当P<0.223时，表示被试者健康；
当0.223<P<0.412时，表示被试者轻度脂肪肝；
当0.412<P<0.668时，表示被试者中度脂肪肝；
当P>0.668时，表示被试者重度脂肪肝；
其中，
es为e的S次方，e为自然常数e＝2.71828182845904；
m1为被试者生物样品中miR-221-5p的含量；
m2为被试者生物样品中miR-21-5p的含量；
m3为被试者生物样品中miR-192-5p的含量；
m4为被试者生物样品中miR-223-3p的含量；
m5为被试者生物样品中miR-29a-3p的含量；
m6为被试者生物样品中miR-331-3p的含量；
m7为被试者生物样品中miR-30c-5p的含量；
m8为被试者生物样品中miR-182-5p的含量；
m9为被试者生物样品中miR-224-5p的含量；
m10为被试者生物样品中miR-221-5p的含量。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 成都仕康美生物科技有限公司
<120> 检测非酒精性脂肪肝的miRNA标志物、试剂盒、应用、检测方法
<160> 33
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtcgtatcca gtgcagtgtc agaggtagtc gcactggata cgaccaaaca cc 52
<210> 2
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtcgtatcca gtgcaccctg gcaggtactc gcactggata cgactcaaca tc 52
<210> 3
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtcgtatcca gtgccacacg tcctcgaggc ttaagcactg gatacgacgg ctgtca 56
<210> 4
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtcgtatcca gtgccacacg tcctcgaggc ttaagcactg gatacgactg gggtat 56
<210> 5
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtcgtatcca gtgcagtgtc agaggtagtc gcactggata cgactaaccg at 52
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<212> DNA
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gtcgtatcca gtgcagtgtc agaggtagtc gcactggata cgacttctag ga 52
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gtcgtatcca gtgcagtgtc agaggtagtc gcactggata cgacgctgag ag 52
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<212> DNA
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gtcgtatcca gtgcagtgtc agaggtagtc gcactggata cgacagtgtg ag 52
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gtcgtatcca gtgcagtgtc agaggtagtc gcactggata cgacctaaac gg 52
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<212> DNA
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atccagtgca ccctggcag 19
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
gtcgtatcca gtgcgagccg ttgagaccgc aagtgcactg gatacgacca agctga 56
<210> 32
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gccgtcaccg ggtgtaaat 19
<210> 33
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
atccagtgcg agccgttg 18

Claims (10)

1.一种检测非酒精性脂肪肝的miRNA标志物，其特征在于，为miR-122-5p、miR-21-5p、miR-192-5p、miR-223-3p、miR-29a-3p、miR-331-3p、miR-30c-5p、miR-182-5p、miR-224-5p和miR-221-5p中的任意一种或多种。
2.根据权利要求1所述的miRNA标志物，其特征在于，所述标志物为miR-122-5p、miR-21-5p、miR-192-5p、miR-223-3p、miR-29a-3p、miR-331-3p、miR-30c-5p、miR-182-5p、miR-224-5p和miR-221-5p的组合。
3.根据权利要求1所述的miRNA标志物的反转录引物、检测引物，其特征在于，
所述反转录引物为：
miR-122-5p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:1所示；
miR-21-5p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:2所示；
miR-192-5p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:3所示；
miR-223-3p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:4所示；
miR-29a-3p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:5所示；
miR-331-3p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:6所示；
miR-30c-5p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:7所示；
miR-182-5p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:8所示；
miR-224-5p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:9所示；
miR-221-5p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:10所示；
所述检测引物为：
miR-122-5p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:11所示；
miR-122-5p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:12所示；
miR-21-5p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:13所示；
miR-21-5p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:14所示；
miR-192-5p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:15所示；
miR-192-5p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:16所示；
miR-223-3p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:17所示；
miR-223-3p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:18所示；
miR-29a-3p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:19所示；
miR-29a-3p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:20所示；
miR-331-3p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:21所示；
miR-331-3p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:22所示；
miR-30c-5p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:23所示；
miR-30c-5p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:24所示；
miR-182-5p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:25所示；
miR-182-5p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:26所示；
miR-224-5p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:27所示；
miR-224-5p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:28所示；
miR-221-5p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:29所示；
miR-221-5p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:30所示。
4.权利要求1所述的miRNA标志物在制备检测非酒精性脂肪肝试剂中的应用。
5.据权利要求4所述应用，其特征在于，所述试剂通过检测被试者生物样品中所述miRNA标志物的含量来判断被试者非酒精性脂肪肝程度。
6.权利要求3所述的miRNA标志物的反转录引物、检测引物在制备检测非酒精性脂肪肝试剂中的应用。
7.一种非酒精性脂肪肝的诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于检测血浆中microRNA标志物的含量；所述标志物为miR-122-5p、miR-21-5p、miR-192-5p、miR-223-3p、miR-29a-3p、miR-331-3p、miR-30c-5p、miR-182-5p、miR-224-5p和miR-221-5p中的任意一种或多种。
8.根据权利要求7所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：所述的microRNA标志物的反转录引物、检测引物；
所述反转录引物为：
miR-122-5p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:1所示；
miR-21-5p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:2所示；
miR-192-5p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:3所示；
miR-223-3p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:4所示；
miR-29a-3p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:5所示；
miR-331-3p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:6所示；
miR-30c-5p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:7所示；
miR-182-5p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:8所示；
miR-224-5p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:9所示；
miR-221-5p的反转录引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:10所示；
所述检测引物为：
miR-122-5p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:11所示；
miR-122-5p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:12所示；
miR-21-5p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:13所示；
miR-21-5p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:14所示；
miR-192-5p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:15所示；
miR-192-5p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:16所示；
miR-223-3p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:17所示；
miR-223-3p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:18所示；
miR-29a-3p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:19所示；
miR-29a-3p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:20所示；
miR-331-3p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:21所示；
miR-331-3p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:22所示；
miR-30c-5p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:23所示；
miR-30c-5p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:24所示；
miR-182-5p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:25所示；
miR-182-5p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:26所示；
miR-224-5p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:27所示；
miR-224-5p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:28所示；
miR-221-5p的正向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:29所示；
miR-221-5p的反向引物序列(5'-3')为SEQ ID NO:30所示。
9.根据权利要求7所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为基于数字PCR平台的试剂盒。
10.一种血浆中权利要求1所述miRNA标志物的含量的检测方法，其特征在于，包括：
(1)采集血浆，总游离RNA的提取；
(2)使用得到的总游离RNA配置反转录反应体系，进行反转录反应得到反转录样品；
(3)使用得到的反转录样品配置数字PCR检测反应体系，制备数字PCR反应微滴，进行数字PCR反应。
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