CN112285079B - 一种以唾液酸为标志的食物营养吸收利用评价方法及应用 - Google Patents

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Abstract

一种以唾液酸为标志的食物营养吸收利用评价方法及应用，涉及食物营养成分的检测及评价。包括以下步骤：1)将雄性ICR小鼠分为低剂量组、中剂量组、高剂量组、极高剂量组4个剂量组分别连续灌胃；2)采集不同时间点的血液，分为分离血浆、沉淀血浆蛋白、提取红细胞膜；3)检测小鼠血液游离唾液酸、红细胞膜唾液酸及蛋白结合唾液酸含量；4)绘制剂量时间‑浓度曲线，构建唾液酸体内代谢的常微分方程模型。常微分方程在药动学中可用来描述简单、线性的体内代谢过程，通过建立各变量之间的关系揭示研究事物之间的动态过程和变化规律。简化生物复杂性，可以用于评价、预测含唾液酸食物的吸收利用。

Description

一种以唾液酸为标志的食物营养吸收利用评价方法及应用
技术领域
本发明涉及食物营养成分的检测及评价，尤其是涉及一种以唾液酸为标志的食物营养吸收利用评价方法及应用。
背景技术
唾液酸(Sialic Acids，SA)是一类多样化的以九个碳原子为骨架的单糖家族的总称。人体体液如唾液、胃液、眼泪、血清、尿液和母乳中都含有唾液酸。N－乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminicacids，Neu5Ac)为人体中主要存在的唾液酸，易溶于水，分子量为309.270g/mol[1](1.Schauer R.Sialic acids:fascinating sugars in higher animalsand man[J].Zoology(Jena),2004,107(1):49-64.)，唾液酸一词通常指代Neu5Ac。
唾液酸位于细胞表面复合糖类的糖链终端，修饰脊椎和高级无脊椎动物所有细胞表面和大部分分泌蛋白，通常位于所有细胞表面糖链的最外层末端[2,3](2.Traving C,Schauer R.Structure,function and metabolism of sialic acids[J].Cellular andMolecular Life Sciences,1998,54(12):1330-49.3.Varki A.Glycan-basedinteractions involving vertebrate sialic-acid-recognizing proteins[J].Nature,2007,446(7139):1023-29.)，这使其成为最重要的生命分子之一，在生理、病理、免疫和发育现象中扮演着许多不同的角色[4,5](4.Gabius H-J.The sugar code:Why glycans areso important[J].Bio Systems,2018,164:102-11.5.Paulson J C.Glycoproteins:whatare the sugar chains for？[J].Trends in Biochemical Sciences,1989,14(7):272-76.)。研究显示，唾液酸具有多种生理功能的表现：促进婴儿认知发育、抗老年痴呆、抗衰老、提高肠道对维生素及矿物质的吸收、抗菌排毒、抗病毒、抗肿瘤、辅助提高免疫力、抑制白细胞黏附等。
人体自身利用葡萄糖为原料经过复杂的生化过程可以合成唾液酸，也可以通过食物摄取获得外源性的唾液酸。通常情况下，内外来源的唾液酸可以满足人体健康的需求，但在特殊生理时期，如发育的胎儿、婴幼儿、哺乳期、疾病恢复期、衰老等，由于机体组织更新加快，对唾液酸的需求大量增加。这些时期人体自身合成的唾液酸往往难以满足全部需求，外源性的补充就显得十分重要。
唾液酸在自然界中分布非常广泛，在动物性食物中普遍存在，但大多食物唾液酸含量不高，母乳(尤其是初乳)相对含量较高，是其他食物的5～10倍，唯独燕窝一枝独秀，唾液酸含量可达初乳的100倍以上。母乳、燕窝都是极其特殊的食物，在特殊的生理时期、大量摄入唾液酸的情况下，有可能在人体显现独特的效应。目前，已有唾液酸应用于婴儿食品添加。
鉴于唾液酸功能的多样性，食物来源的独特性，对食物唾液酸功效的评价缺乏有效手段。
发明内容
本发明的目的在于提供可快速评价、比较不同食物中唾液酸对人体的生理功能功效的一种以唾液酸为标志的食物营养吸收利用评价方法及应用。
所述以唾液酸为标志的食物营养吸收利用评价方法，包括以下步骤：
1)将雄性ICR小鼠分为低剂量组、中剂量组、高剂量组、极高剂量组4个剂量组分别连续灌胃；
2)采集不同时间点的血液，分为分离血浆、沉淀血浆蛋白、提取红细胞膜；
3)检测小鼠血液游离唾液酸、红细胞膜唾液酸及蛋白结合唾液酸含量；
4)绘制剂量时间-浓度曲线，构建唾液酸体内代谢的常微分方程模型。
在步骤1)中，所述4个剂量组的剂量分别可为：0.045g/kg、0.090g/kg、0.180g/kg、0.360g/kg；以唾液酸标准品配置浓度分别为4.5g/L、9.0g/L、18.0g/L、36.0g/L的唾液酸溶液，4℃存放备用；所述连续灌胃可每组每日不同剂量进行灌胃，灌胃体积可为10mL/(kg·BW)。
在步骤2)中，所述采集不同时间点的血液的具体方法可为：分别在第0天、5天、15天、20天、30天每组取小鼠末次灌胃干预唾液酸后禁食12h(不禁水)，进行摘眼球取血1mL，肝素抗凝，3000r/min，4min，吸取上清血浆，除去灰白色的白细胞层，下层红细胞备用提取红细胞膜；
所述沉淀血浆蛋白的具体方法可为：定量吸取100μL血浆，采用盐析法沉淀血浆蛋白，缓慢加入400μL饱和硫酸铵溶液，混匀后4℃存放8h，待蛋白完全析出，15000r/min离心10min，吸出上清，于蛋白沉淀物中加0.2mol/L稀硫酸1mL，于80℃水浴锅中水解120min，水解完全后吸取800μL蛋白水解液加入60μL衍生液50℃避光衍生150min，避光冷却后待检测。
在步骤3)中，所述检测小鼠血液游离唾液酸的具体方法可为：
(1)制作标准曲线溶液，浓度为分别1.0000g/L，0.5000g/L，0.2500g/L，0.1250g/L，0.0625g/L，0.0313g/L，0.0156g/L，取200μL唾液酸标准溶液，加入15μLDMB衍生液，50℃避光衍生150min，避光冷却后，将衍生后的标准溶液通过滤膜(0.22μm)过滤后置于微量比色皿中；荧光分光光度计参数设置：激发波长373nm，发射波长448nm，使用微量比色皿进行测量荧光值，标准曲线横坐标为标准品浓度X(g/L)，纵坐标为标准品荧光值Y，且每次测量样品前建立一条标准曲线，计算标准曲线方程；
(2)将衍生后的血浆通过滤膜(0.22μm)过滤后置于微量比色皿中，荧光分光光度计参数设置：激发波长373nm，发射波长448nm，使用微量比色皿进行测量荧光值，代入标准曲线方程计算其唾液酸浓度，测得血浆中唾液酸的浓度，单位为g/L。
(3)将衍生后的蛋白沉淀水解溶液通过滤膜(0.22μm)过滤后，荧光分光光度计参数设置：激发波长373nm，发射波长448nm，使用微量比色皿进行测量荧光值，代入标准曲线方程计算其唾液酸浓度，测得血浆中蛋白结合唾液酸的含量，单位为g/L：
(4)将衍生后的红细胞膜水解溶液通过滤膜(0.22μm)过滤后，荧光分光光度计参数设置：激发波长373nm，发射波长448nm，使用微量比色皿进行测量荧光值，代入标准曲线方程计算其红细胞膜膜液浓度，并以膜蛋白浓度进行标定，测得红细胞膜唾液酸含量，单位为μg/mg pro。
(5)不同时间点游离唾液酸浓度、红细胞膜唾液酸含量、蛋白结合唾液酸含量数据以
Figure BDA0002730773000000032
Figure BDA0002730773000000033
表示，使用SPSS20.0进行重复测量方差分析；若重复测量发现交互作用显著，说明一个自变量的效应受到另一个自变量的影响，此时无法单纯地分析某个自变量的效应，一般不再关心主效应是否相等，而是分别检验每个时点不同处理的总体均数是否相等和分别检验每种处理的不同时间点的总体均数是否相等，不同组别的动力学参数结果以
Figure BDA0002730773000000031
表示，多组采用One-way ANOVA方法，两组采用t检验进行统计分析。
在步骤4)中，所述构建唾液酸体内代谢的常微分方程模型是构建B-MPU具有4个仓室的常微分方程模型，四个仓室分别为血浆(B)、红细胞膜(M)、血浆蛋白(P)、尿液(U)；将唾液酸吸收分布过程简化为唾液酸进入体内后，首先分布于血浆中，游离唾液酸浓度上升，随后唾液酸结合于红细胞膜及血浆蛋白中，最后于尿液中排泄出体外。
本发明建立了一种不限于某种特定功能效应限制、以唾液酸为标志的食物营养吸收利用评价方法，用以评价不同食物唾液酸营养功效差别。本发明选择更上游的唾液酸考察指标，即血液中唾液酸的含量，包括游离唾液酸(Free serum sialic acid，FSSA)、红细胞膜唾液酸(Erythrocyte surface sialic acid，ESSA)、蛋白结合唾液酸(Protein-boundsialicacid，PBSA)，作为唾液酸的吸收、代谢、分布情况的判定指标，对食物唾液酸的吸收利用进行评价。为更好的预测不同食物唾液酸在体内的代谢分布，本发明还建立了唾液酸体内代谢的常微分方程模型。由于机体内源性唾液酸的干扰，一级消除、零级消除速率过程不能全面准确描述唾液酸在其体内的吸收分布消除过程，而常微分方程(ordinarydifferential equations，ODEs)在药动学中可用来描述简单、线性的体内代谢过程，通过建立各变量之间的关系揭示研究事物之间的动态过程和变化规律。仓室分析法把药物在体内复杂的吸收代谢过程用简洁的相互关联的仓室模型具体地表示出来，简化生物复杂性，是研究药动学模型有效的方法。实验结果表明，本发明的方法可以用于评价、预测含唾液酸食物的吸收利用。
附图说明
图1为小鼠连续灌胃后血浆游离唾液酸浓度变化；
图2为小鼠连续灌胃后血浆蛋白结合唾液酸含量变化；
图3为小鼠连续灌胃后红细胞膜唾液酸含量变化；
图4为连续灌胃小鼠血液唾液酸含量变化拟合曲线；
图5为小鼠血液唾液酸代谢模型框架图。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
本发明所述以唾液酸为标志的食物营养吸收利用评价方法实施例，包括以下步骤：
配置受试物：
唾液酸干预剂量设置：古典书籍中燕窝的推荐量为每日3～5g，以5g计，燕窝唾液酸含量约为7％～12％，以10％计，则50kg成人每日推荐量为0.01g/kg，以此为初始剂量。根据人鼠体表面积折算，则小鼠唾液酸初始剂量为0.090g/kg，以此剂量设置四个剂量组分别为：低、中、高、极高剂量组，分别为0.045g/kg、0.090g/kg、0.180g/kg、0.360g/kg；以唾液酸标准品配置浓度分别为4.5g/L、9.0g/L、18.0g/L、36.0g/L的唾液酸溶液，4℃存放备用。
分组及干预
采用随机数字表法，将60只体重相近小鼠分为低剂量组、中剂量组、高剂量组、极高剂量组4组，每组15只，灌胃后第0d、5d、15d、20d、30d末次灌胃干预唾液酸后禁食12h(不禁水)，采集血液，每一个时间点3只，每组每日不同剂量进行灌胃，灌胃体积为10mL/(kg·BW)。见表1。
表1：连续灌胃干预实验动物分组
Figure BDA0002730773000000051
血液的采集和样品的处理：
分别在第0天、5天、15天、20天、30天每组取3只小鼠末次灌胃干预唾液酸后禁食12h(不禁水)，进行摘眼球取血1mL，肝素抗凝，3000r/min，4min，吸取上清血浆，除去灰白色的白细胞层，下层红细胞备用提取红细胞膜。
取200μL血浆，加入15μLDMB衍生液，50℃避光衍生150min，避光冷却后待测。
红细胞膜制备方法参考文献[6](6.Cox R H,Hubbard J W,Lawler J E,etal.Cardiovascular and sympathoadrenal responses to stress in swim-trainedrats[J].Journal of applied physiology(Bethesda,Md.:1985),1985,58(4):1207-14.)：加入下层红细胞3倍体积的生理盐水(预冷)将红细胞悬浮，制成红细胞膜悬液，洗涤重悬2次后，2000r/min离心5min；加入10mmol/L Tris-HCL缓冲液(预冷，pH＝7.4)搅拌2min，4℃溶胀1h，12000r/min离心5min，重复三次；得到乳白色红细胞膜，加入0.5mL双蒸水稀释后在超声粉碎机制成均匀红细胞膜膜液，4℃备用。取10μL红细胞膜液用蛋白定量检测试剂盒(BCR法)测定膜蛋白含量，以膜蛋白标定红细胞膜唾液酸含量。300μL膜液加入500μL、0.05mol/L稀硫酸，于80℃水解120min，取出后冷却加入60μL DMB衍生液50℃避光衍生150min，避光冷却后进行测定。
定量吸取100μL血浆，采用盐析法沉淀血浆蛋白：缓慢加入400μL饱和硫酸铵溶液。混匀后4℃存放8h，待蛋白完全析出，15000r/min离心10min，吸出上清，于蛋白沉淀物中加0.2mol/L稀硫酸1mL，于80℃水浴锅中水解120min，水解完全后吸取800μL蛋白水解液加入60μL衍生液50℃避光衍生150min，避光冷却后待检测。
样品唾液酸的检测：
标准曲线溶液的浓度为分别1.0000g/L，0.5000g/L，0.2500g/L，0.1250g/L，0.0625g/L，0.0313g/L，0.0156g/L，取200μL唾液酸标准溶液，加入15μLDMB衍生液，50℃避光衍生150min，避光冷却后，将衍生后的标准溶液通过滤膜(0.22μm)过滤后置于微量比色皿中。荧光分光光度计参数设置：激发波长373nm，发射波长448nm，使用微量比色皿进行测量荧光值，标准曲线横坐标为标准品浓度X(g/L)，纵坐标为标准品荧光值Y，且每次测量样品前建立一条标准曲线，计算标准曲线方程。
将衍生后的血浆通过滤膜(0.22μm)过滤后置于微量比色皿中，荧光分光光度计参数设置：激发波长373nm，发射波长448nm，使用微量比色皿进行测量荧光值，代入标准曲线方程计算其唾液酸浓度，测得血浆中唾液酸的浓度，单位为g/L。
将衍生后的蛋白沉淀水解溶液通过滤膜(0.22μm)过滤后，荧光分光光度计参数设置：激发波长373nm，发射波长448nm，使用微量比色皿进行测量荧光值，代入标准曲线方程计算其唾液酸浓度，测得血浆中蛋白结合唾液酸的含量，单位为g/L。
将衍生后的红细胞膜水解溶液通过滤膜(0.22μm)过滤后，荧光分光光度计参数设置：激发波长373nm，发射波长448nm，使用微量比色皿进行测量荧光值，代入标准曲线方程计算其红细胞膜膜液浓度，并以膜蛋白浓度进行标定，测得红细胞膜唾液酸含量，单位为μg/mg pro。
统计分析：
不同时间点游离唾液酸浓度、红细胞膜唾液酸含量、蛋白结合唾液酸含量数据以
Figure BDA0002730773000000062
表示，使用SPSS20.0进行重复测量方差分析(Repeat measure ANOVA，RM-ANOVA)。若重复测量发现交互作用显著，说明一个自变量的效应受到另一个自变量的影响，此时无法单纯地分析某个自变量的效应，一般不再关心主效应是否相等，而是分别检验每个时点不同处理的总体均数是否相等和分别检验每种处理的不同时间点的总体均数是否相等，即简单效应检验(Simple effecttest)[7,8](7.董英,赵耐青.重复测量资料方差分析中主效应意义的探讨[J].复旦学报(医学版),2005,(06):56-60.8.曲丽莉,佘燕朝.护理研究中重复测量设计及其资料处理的考量[J].护理研究,2018,32(11):1758-61.)。不同组别的动力学参数结果以
Figure BDA0002730773000000061
表示，多组采用One-way ANOVA方法，两组采用t检验进行统计分析。
常微分方程模型构建：
模型的构建
由于小鼠体内内源性唾液酸的干扰，一级消除、零级消除速率过程不能全面准确描述唾液酸在其体内的吸收分布消除过程，而常微分方程(ordinary differentialequations，ODEs)在药动学中可用来描述简单、线性的体内代谢过程[9](9.褚娟,万建平,高秀娟等.基于随机微分方程的药物动力学建模新方法[J].华中科技大学学报(医学版),2012,41(06):716-19)，通过建立各变量之间的关系揭示研究事物之间的动态过程和变化规律。仓室分析法把药物在体内复杂的吸收代谢过程用简洁的相互关联的仓室模型具体地表示出来，简化生物复杂性，是研究药动学模型有效的方法[10](10.Brochot C,Tóth J,Bois F Y.Lumping in pharmacokinetics[J].J Pharmacokinet Pharmacodyn,2005,32(5-6):719-36.)。设想唾液酸的吸收分布过程是以仓室模型为基础，在一个或几个仓室中进行的，分析实验数据并得到表示唾液酸分布特性的参数。
本发明构建B-MPU具有4个仓室的常微分方程模型，四个仓室分别为血浆(B)、红细胞膜(M)、血浆蛋白(P)、尿液(U)。将唾液酸吸收分布过程简化为唾液酸进入体内后，首先分布于血浆中，游离唾液酸浓度上升，随后唾液酸结合于红细胞膜及血浆蛋白中，最后于尿液中排泄出体外。B、M、P、U表示4个仓室分别为血浆、红细胞膜、血浆蛋白及尿液，模型基于以下假设：
(1)假设唾液酸的吸收、分布过程是在四个仓室中进行的；
(2)本模型不考虑组织中唾液酸的分布；
(3)设K为唾液酸实际干预剂量；
(4)血浆中唾液酸经过一段时间后分布进入组织中，设n为血浆中唾液酸进入体内的分布系数；
(5)灌胃干预唾液酸经胃肠道吸收入血或静脉注射唾液酸直接入血后，部分血浆从尿液中排出，设a为血浆中唾液酸经尿液排泄体外的排泄系数；
(6)灌胃干预唾液酸经胃肠道吸收入血或静脉注射唾液酸直接入血后，一部分唾液酸与红细胞膜蛋白结合，设x为血浆中唾液酸与红细胞膜蛋白结合系数；
(7)随着体内的代谢，红细胞膜蛋白结合唾液酸残基脱落或被切除，设q为红细胞膜蛋白结合唾液酸脱落的代谢系数；
(8)灌胃干预唾液酸经胃肠道吸收入血或静脉注射唾液酸直接入血后，一部分唾液酸与血浆蛋白结合，设y为血浆中唾液酸结合至血浆蛋白的结合系数；
(9)随着体内的代谢，蛋白结合唾液酸含量下降，设r为血浆蛋白上唾液酸脱落的代谢系数。
模型的框架如图5，结合图5建立微分方程模型为：
Figure BDA0002730773000000071
数据归一化：
本实施例中红细胞膜唾液酸、游离唾液酸及蛋白结合唾液酸含量单位不一致，因此需进行数据的归一化。将有量纲的数据，经变换成标量，便于进行模型的拟合。本发明采用线性函数归一化法，即min-max归一化法，其变换公式为：
Figure BDA0002730773000000081
其中，max为原始数据的最大值，min为原始数据的最小值。
参数估计：
本发明所需要的参数共有7个，分别为唾液酸干预剂量K、血浆中唾液酸进入体内的分布系数n、血浆中唾液酸经尿液排泄体外的排泄系数a、血浆中唾液酸与红细胞膜蛋白结合系数x、血浆中唾液酸结合至血浆蛋白的结合系数y、红细胞膜上唾液酸脱落的代谢系数q、血浆蛋白上唾液酸脱落的代谢系数r。其中K通过实际注射剂量及模型的拟合获得，其他参数通过实验数据模型拟合获得。仓室B、M、P初始值为实际实验结果的测量值，U的初始值为0。
数学模拟：
模型模拟采用Berkeley Madonna软件，该软件为伯克利大学开发的动态建模分析软件，一个十分快速通用的微分方程求解器，常用于对常微分方程组进行数值求解。数据录入和管理采用Excel 2016软件，图形绘制采用GraphPad Prism 7软件。微分方程求解方法采用四阶龙格库塔法，容忍度为0.001。曲线拟合优度的判定指标为模拟数据和实际数据的最小均方根RMS。
尾静脉注射唾液酸组模型拟合以1min为单位，根据曲线随时间变化的拐点分为[0，1]min、(1，5]min、(5，60]min三个时间段分段进行拟合。灌胃唾液酸组模型拟合以15min为单位，根据曲线随时间变化的拐点分为[0，15]min、(15，60]min两时间段分段进行拟合。连续灌胃组不分段进行拟合。
本发明提供的是一种动物实验的方案，包括实验动物种类、数量、分组、干预方式、检测监测指标、监测时点、数据分析和结果判断方法等系列方案。
唾液酸的功能多样，食物来源独特，外源性唾液酸干预多久能发挥功效，单一用某一功效指标考察并不全面，而且不同功效显现的时间也不一致。血液是外源性唾液酸进入人体被吸收、分布和消除的必经之路，唾液酸在分布到达动态平衡后，血液中唾液酸的浓度也可以反映身体代谢状态和身体组织水平，故有可能通过监测血液唾液酸浓度初步了解其可能显现功效的剂量和时间。因此，本发明选择更上游的唾液酸考察指标，即血液中唾液酸的含量，包括游离唾液酸(Free serum sialic acid，FSSA)、红细胞膜唾液酸(Erythrocytesurface sialic acid，ESSA)、蛋白结合唾液酸(Protein-boundsialicacid，PBSA)，作为唾液酸的吸收、代谢、分布情况的判定指标，对食物唾液酸的吸收利用进行评价。
为更好的预测不同食物唾液酸在体内的代谢分布，本发明还建立了唾液酸体内代谢的常微分方程模型。由于机体内源性唾液酸的干扰，一级消除、零级消除速率过程不能全面准确描述唾液酸在其体内的吸收分布消除过程，而常微分方程(ordinary differentialequations，ODEs)在药动学中可用来描述简单、线性的体内代谢过程[41]，通过建立各变量之间的关系揭示研究事物之间的动态过程和变化规律。仓室分析法把药物在体内复杂的吸收代谢过程用简洁的相互关联的仓室模型具体地表示出来，简化生物复杂性，是研究药动学模型有效的方法[11](11.Brochot C,Tóth J,Bois F Y.Lumping in pharmacokinetics[J].J Pharmacokinet Pharmacodyn,2005,32(5-6):719-36.)。
本发明的实验结果发现，连续30天唾液酸灌胃各剂量组小鼠游离唾液酸含量基本保持稳定；血浆蛋白结合唾液酸含量逐渐上升，于第20天达到峰值，不同剂量组变化趋势一致；各剂量组红细胞膜唾液酸含量上升，于第15天达到峰值，不同剂量组变化趋势一致。红细胞膜唾液酸含量达到峰值的时间早于蛋白结合唾液酸，红细胞膜唾液酸含量上升的速度快于蛋白结合唾液酸，与红细胞膜唾液酸相关的功效可能较快显现。因此，游离唾液酸可作为唾液酸监测的快速反应性指标，蛋白结合唾液酸是血液中唾液酸的主要分布项，红细胞膜唾液酸可以作为功能显现的标志指标，15～20天为监测的期限。
表2：连续灌胃血液唾液酸变化微分方程参数
Figure BDA0002730773000000091
Figure BDA0002730773000000092
通过模型与连续灌胃唾液酸后小鼠血液唾液酸变化数据拟合，结果显示，当K＝0.89，n＝0.00，a＝0.11，x＝1.52，y＝0.55，q＝0.60，r＝0.01时模拟结果与实际数据最为接近，得上述公式。图1为小鼠连续灌胃后血浆游离唾液酸浓度变化；图2为小鼠连续灌胃后血浆蛋白结合唾液酸含量变化；图3为小鼠连续灌胃后红细胞膜唾液酸含量变化；图4为连续灌胃小鼠血液唾液酸含量变化拟合曲线；由图4可看出，血浆游离唾液浓度、红细胞膜唾液酸及蛋白结合唾液酸含量拟合方程R2分别为0.61，0.90及0.96，且方程均有统计学意义(P<0.05)，模型拟合效果良好。因此，由拟合方程可推测连续灌胃后不同时间点各仓室中唾液酸含量。
本发明建立了一种不限于某种特定功能效应限制、以唾液酸为标志的食物营养吸收利用评价方法，用以评价不同食物唾液酸营养功效差别。实验结果表明，本发明的方法可以用于评价、预测含唾液酸食物的吸收利用。

Claims (5)

1.一种以唾液酸为标志的食物营养吸收利用评价方法，其特征在于包括以下步骤：
1)将雄性ICR小鼠分为低剂量组、中剂量组、高剂量组、极高剂量组4个剂量组分别连续灌胃；
2)采集不同时间点的血液，分为分离血浆、沉淀血浆蛋白、提取红细胞膜；
所述采集不同时间点的血液的具体方法为：分别在第0天、5天、15天、20天、30天每组取小鼠末次灌胃干预唾液酸后禁食12h，不禁水，进行摘眼球取血1mL，肝素抗凝，3000r/min，4min，吸取上清血浆，除去灰白色的白细胞层，下层红细胞备用提取红细胞膜；
3)检测小鼠血液游离唾液酸、红细胞膜唾液酸及蛋白结合唾液酸含量；
所述检测小鼠血液游离唾液酸的具体方法为：
(1)制作标准曲线溶液，浓度为分别1.0000g/L，0.5000g/L，0.2500g/L，0.1250g/L，0.0625g/L，0.0313g/L，0.0156g/L，取200μL唾液酸标准溶液，加入15μLDMB衍生液，50℃避光衍生150min，避光冷却后，将衍生后的标准溶液通过滤膜过滤后置于微量比色皿中；荧光分光光度计参数设置：激发波长373nm，发射波长448nm，使用微量比色皿进行测量荧光值，标准曲线横坐标为标准品浓度X(g/L)，纵坐标为标准品荧光值Y，且每次测量样品前建立一条标准曲线，计算标准曲线方程；
(2)将衍生后的血浆通过滤膜过滤后置于微量比色皿中，荧光分光光度计参数设置：激发波长373nm，发射波长448nm，使用微量比色皿进行测量荧光值，代入标准曲线方程计算其唾液酸浓度，测得血浆中唾液酸的浓度，单位为g/L；
(3)将衍生后的蛋白沉淀水解溶液通过滤膜过滤后，荧光分光光度计参数设置：激发波长373nm，发射波长448nm，使用微量比色皿进行测量荧光值，代入标准曲线方程计算其唾液酸浓度，测得血浆中蛋白结合唾液酸的含量，单位为g/L：
(4)将衍生后的红细胞膜水解溶液通过滤膜过滤后，荧光分光光度计参数设置：激发波长373nm，发射波长448nm，使用微量比色皿进行测量荧光值，代入标准曲线方程计算其红细胞膜膜液浓度，并以膜蛋白浓度进行标定，测得红细胞膜唾液酸含量，单位为μg/mg pro；
(5)不同时间点游离唾液酸浓度、红细胞膜唾液酸含量、蛋白结合唾液酸含量数据以x±s表示，使用SPSS20.0进行重复测量方差分析；若重复测量发现交互作用显著，说明一个自变量的效应受到另一个自变量的影响，此时无法单纯地分析某个自变量的效应，一般不再关心主效应是否相等，而是分别检验每个时点不同处理的总体均数是否相等和分别检验每种处理的不同时间点的总体均数是否相等，不同组别的动力学参数结果以x±s表示，多组采用One-way ANOVA方法，两组采用t检验进行统计分析；
4)绘制剂量时间-浓度曲线，构建唾液酸体内代谢的常微分方程模型。
2.如权利要求1所述一种以唾液酸为标志的食物营养吸收利用评价方法，其特征在于在步骤1)中，所述4个剂量组的剂量分别为：0.045g/kg、0.090g/kg、0.180g/kg、0.360g/kg；以唾液酸标准品配置浓度分别为4.5g/L、9.0g/L、18.0g/L、36.0g/L的唾液酸溶液，4℃存放备用；所述连续灌胃可每组每日不同剂量进行灌胃，灌胃体积可为10mL/(kg·BW)。
3.如权利要求1所述一种以唾液酸为标志的食物营养吸收利用评价方法，其特征在于在步骤2)中，所述沉淀血浆蛋白的具体方法为：定量吸取100μL血浆，采用盐析法沉淀血浆蛋白，缓慢加入400μL饱和硫酸铵溶液，混匀后4℃存放8h，待蛋白完全析出，15000r/min离心10min，吸出上清，于蛋白沉淀物中加0.2mol/L稀硫酸1mL，于80℃水浴锅中水解120min，水解完全后吸取800μL蛋白水解液加入60μL衍生液50℃避光衍生150min，避光冷却后待检测。
4.如权利要求1所述一种以唾液酸为标志的食物营养吸收利用评价方法，其特征在于在步骤4)中，所述构建唾液酸体内代谢的常微分方程模型是构建B-MPU具有4个仓室的常微分方程模型，四个仓室分别为血浆(B)、红细胞膜(M)、血浆蛋白(P)、尿液(U)；将唾液酸吸收分布过程简化为唾液酸进入体内后，首先分布于血浆中，游离唾液酸浓度上升，随后唾液酸结合于红细胞膜及血浆蛋白中，最后于尿液中排泄出体外。
5.如权利要求1所述一种以唾液酸为标志的食物营养吸收利用评价方法在用于评价、预测含唾液酸食物吸收利用中的应用。
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