JP2006500911A - 幹細胞及び前駆細胞の分化のモジュレーション、アッセイ、並びにそれらの使用 - Google Patents

幹細胞及び前駆細胞の分化のモジュレーション、アッセイ、並びにそれらの使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、哺乳動物幹細胞又は前駆細胞の分化をモジュレートする方法に関する。本発明の方法は、特定の細胞及び組織系統への、哺乳動物、特にヒトの幹細胞の分化及び成熟を調節及び制御するために用いることができる。本発明の方法は、特定の細胞及び組織系統への幹細胞又は前駆細胞集団の分化、特に分娩後の胎盤に由来する胚様幹細胞（embryonic-like stem cell）の分化をモジュレートするため、又は初期前駆細胞の顆粒球系統への分化のための、特定の小さな有機分子の使用に関する。最後に、本発明は、移植及び他の医療処置におけるそのような分化した幹細胞又は前駆細胞の使用に関する。

Description

１．導入
本発明は、哺乳動物幹細胞及び／又は前駆細胞の分化をモジュレートする方法に関する。本発明の方法は、哺乳動物、特にヒトの幹細胞及び前駆細胞の分化及び成熟を、特定の細胞及び組織系統に調節及び制御するのに用いることができる。本発明の方法は、幹細胞集団の分化、特に分娩後の胎盤に由来する胚様幹細胞の分化を、特定の細胞及び組織系統にモジュレートするため、あるいは初期造血前駆細胞を、特定の分化経路、特に顆粒球分化経路にモジュレートするための、特定の有機小分子の使用に関する。本発明はまた、このような有機分子を使用して、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５＋、及びＣＤ１３３＋前駆細胞などの、特定の前駆細胞系統の分化をモジュレートすることに関する。本発明はまた、前駆細胞の発達の時間的な態様、並びにそのような時間的な態様に基づくｉｎ ｖｉｔｒｏモデルに関する。本発明はさらに、予防及び治療方法におけるこのようなモジュレートされた細胞の使用に関するものであり、これには、かかる細胞及び／又は小さな有機化合物の医薬組成物における使用が含まれる。最後に、本発明は、移植及び他の医療処置におけるかかる分化細胞の使用に関する。
２．発明の背景
本願は、２００２年４月１２日出願の米国特許仮出願第６０／３７２，３４８号、２００２年１２月３１日出願の同第６０／４３７，３４８号、２００２年１２月３１日出願の同第６０／４３７，３５０号の優先権を主張するものであり、これら特許それぞれの全体を本明細書に援用する。
ヒトの幹細胞及び前駆細胞の同定、単離、及び生成には、かなりの関心が寄せられている。幹細胞は、様々な成熟細胞系統を生み出すことのできる全能性若しくは多能性前駆細胞であり、前駆細胞は、特定の細胞系統の細胞を生み出すことができる細胞である。このような能力は、臓器及び組織の発達に必要な、細胞の分化及び特殊化の基盤として働く。
最近、幹細胞及び前駆細胞の移植で成功が収められて、疾患を原因とする骨髄切除や、毒性の化学物質及び／若しくは放射線への暴露の後に、骨髄を再構築及び／又は補充するための新しい臨床手段がもたらされた。さらに、幹細胞を用いると、すべてではないにしても多くの組織を再増殖させ、生理学的及び解剖学的な機能性を回復させることができることを証明する証拠が存在する。幹細胞の、組織工学、遺伝子治療送達及び細胞治療学への応用も急速に進歩している。
数多くの種々の型の哺乳動物及び前駆幹細胞が特性決定されている。たとえば、胚幹細胞、胚生殖細胞、成体幹細胞若しくは単分化能幹細胞、又は前駆細胞が知られている。ある種の幹細胞は、単離及び特性決定がなされていないだけでなく、限られた程度まで分化を可能にする条件下での培養も行われていない。しかし、造血前駆細胞など、幹細胞や前駆細胞の分化を調節又は制御するのが困難であるという根本的な問題が残っている。目下、このような細胞の分化をモジュレートする現存する方法は、未完成であり、統制できないので、細胞は、望ましくない時期に望ましくない細胞型へと分化する。その上、細胞産物の収率は概して低い。
さらに、治療又は研究の目的に十分な数のヒト幹細胞を得ることが問題となる。成体組織中に正常に存在する幹細胞又は前駆細胞集団の単離は、一部には、血液又は組織中に見られる幹細胞又は前駆細胞の質が限られており、骨髄吸引液を得るのにかなりの不快が伴うために、技術的に困難であり、コスト高である。一般に、代替供給源から、治療及び研究目的に十分な量の幹細胞及び前駆細胞を回収することは、たとえば、ドナー被験体又は患者からの細胞又は組織の採取、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞の培養及び／又は増殖、解剖などを含み、一般に労力を有する。特に幹細胞については、流産児を含む胚組織又は胎児組織からこうした細胞を調達することが、宗教的・倫理的な懸念を浮上させている。ヒトの胚及び胎児は、独立した生命であるという広く抱かれている信条が、医学的研究を含むすべての目的でのそのような供給源の使用に対する政府の規制を後押ししてきた。したがって、幹細胞の臨床での使用をさらに進歩させるために、胚組織又は胎児組織から調達した細胞を使わずに済む代替の供給源が求められている。しかし、幹細胞又は前駆細胞、特にヒトの幹細胞又は前駆細胞の、見込みのある代替供給源はほとんどなく、したがって、供給は限られている。
Ｈｕら（「Methods of isolation, cryopreservation, and therapeutic use of human aminiotic epithelial cells」と題された、２０００年１２月７日公開のＷＯ００／７３４２１号）は、分娩時に胎盤から得たヒト羊水上皮細胞を単離し、培養し、将来の使用に備えて凍結保存したこと、又は分化を誘導したことを開示している。Ｈｕらによれば、分娩後速やかに胎盤を採取し、羊水の膜を、たとえば切開によって漿膜から分離する。標準の細胞単離技術に従って、羊水の膜から羊水上皮細胞を単離する。開示された細胞は、様々な培地で培養し、培養中に増殖させ、凍結保存し、又は分化を誘導することができる。Ｈｕらは、羊水上皮細胞は、多分化能をもち（おそらくは多能性である）、角膜表面の上皮や膣上皮などの上皮組織へと分化し得ることを開示している。しかし、この方法の欠点は、かなり手間がかかり、幹細胞の収率が非常に低いことである。
現在利用可能な、細胞集団をｅｘ ｖｉｖｏで増殖させる方法も、かなり労力を要する。たとえば、Ｅｍｅｒｓｏｎら（Emersonらの「Methods and compositions for the ex vivo replication of stem cells, for the optimization of hematopoietic progenitor cell cultures, and for increasing the metabolism; GM-CSF secretion and/or IL-6 secretion of human stromal cells」と題された、２００１年１２月４日出願の米国特許第６，３２６，１９８号）は、ヒト幹細胞画分をｅｘ ｖｉｖｏで培養するための方法及び培地条件、並びに／又はヒト造血前駆細胞の最適化を開示している。開示された方法によれば、骨髄由来のヒト幹細胞又は前駆細胞を液体培地で培養し、培地を取り替えるが、好ましくは、約２４時間〜約４８時間毎に培養物１ｍｌあたり培地１ｍｌの速度で、連続的又は定期的に灌流を行う。代謝産物を除去し、生理的に許容される条件下で培養物を維持している間に添加した栄養素を消耗させる。
Ｋｒａｕｓら（Krausら、「Selective expansion of target cell populations」と題された、２００２年１月１５日出願の米国特許第６，３３８，９４２号）は、臍帯血又は末梢血からの出発細胞サンプルを増殖培地に導入し、標的細胞集団の細胞を分裂させ、増殖培地中の細胞を、予め決定された細胞集団（ＣＤ３４細胞など）に対して特異的な親和性のある結合分子（ＣＤ３４に対するモノクローナル抗体など）を含む選択成分と接触させて、増殖培地中の他の細胞から、予め決定された標的集団の細胞を選択することによって、予め決定された標的細胞集団を選択的に増殖させることができることを開示している。
Ｒｏｄｇｅｒｓら（「Method for promoting hematopoietic and mesenchymal cell proliferation and differentiation」と題された、２００２年１月１日出願の米国特許第６，３３５，１９５号）は、造血幹細胞及び間葉幹細胞をｅｘ ｖｉｖｏで培養する方法、並びに、単独又は他の増殖因子及びサイトカインと組み合わせたアンジオテオシノーゲン、アンジオテンシンＩ（ＡＩ）、ＡＩ類似体、ＡＩ断片及びその類似体、アンジオテンシンＩＩ（ＡＩＩ）、ＡＩＩ類似体、ＡＩＩ断片若しくはその類似体、又はＡＩＩＡＴ２２型受容体アゴニストの存在下で増殖させることによって、系統特異的な細胞の増殖及び分化を誘導する方法を開示している。幹細胞は、骨髄、末梢血、又は臍帯血由来である。しかし、この方法の欠点は、上で述べたように、幹細胞の増殖及び分化を誘導するためのｅｘ ｖｉｖｏでの方法に時間がかかること、また幹細胞の収率も低くなることである。
幹細胞及び前駆細胞は、悪性腫瘍、先天的な代謝障害、異常血色素症、及び免疫不全を含む様々な疾患の治療に使用できる可能性を秘めている。臍帯血又は胎盤由来の幹細胞を用いる用途及び研究の一大領域は、そうした細胞を使用して、骨髄移植及び関連する他の移植用に少量の細胞を生成することである。しかし、これまで、ヒトＣＤ３４＋若しくはＣＤ１３３＋前駆細胞などの幹細胞又は前駆細胞をかなりの数で産生する方法は記載されていない。特に、大量の前駆細胞によって、前駆細胞を使用する治療方法が容易になるはずである。本明細書に開示する本発明の方法は、この要求に対処するものである。
ビタミンＡやレチノイン酸（ＲＡ）などのレチノイド類は、幹細胞の分化に影響を及ぼすことが知られている。たとえば、レチノイン酸は、異常化した（慢性骨髄性白血病）造血幹細胞の増殖を抑制し（Nadkarniら、1984年、Tumori第70巻:503〜505ページ）、前骨髄球性白血病細胞の分化を誘導し、潜在的自己再生能力を失わせる（Melchnerら、1985年、Blood第66巻(6):1469〜1472ページ）ことがわかっている。レチノイン酸は、胚幹細胞からのニューロンの分化を誘導し、中胚葉の自発的な分化を抑制することもわかっている（Slagerら、Dev. Genet.1993年、第14巻(3):212〜24ページ、Rayら、1997年、J. Biol. Chem.第272巻(30):18702〜18708ページ）。レチノイン酸はさらに、形質転換した生殖細胞前駆体（Damjanovら、1993年、Labor.Investig.第68巻(2):220〜232ページ）、胎盤細胞前駆体（Yanら、2001年、Devel.Biol.第235巻:422〜432ページ）、及び内皮細胞前駆体（Hatzopoulosら、1998年、Development第125巻:1457〜1468ページ)の分化を誘導することもわかっている。しかし、分化に対するレチノイン酸の作用は、幹細胞の分化を制御する調節可能な手段として使用できる程には、まだ完全に理解されていない。
造血幹細胞の分化に対する、アミノプテリンやアメトプテリン（メトトレキサート)などの葉酸類似体の作用が研究されている。葉酸類似体は、急性リンパ芽球性貧血及び他の血液増殖障害、並びに癌では化学療法剤として使用され、幹細胞のいくらかの集団を死滅させることによって、幹細胞の分化に影響を及ぼすことがわかっており（DeLoiaら、1998年、Human Reproduction第13巻(4):1063〜1069ページ)、したがって、大量の幹細胞の分化を調節するために患者に投与する有効な手段にはならないはずである。
幹細胞の造血系統では、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１１などの数種のサイトカイン、並びにエリスロポエチン、Ｋｉｔリガンド、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦなどのタンパク質が、幹細胞を特定の細胞型へと直接に分化させることがわかっているが（Dushnik-Levinsonら、1995年、Biol.Neonate第67巻:77〜83ページ）、しかし、このような過程は、十分に理解されておらず、幹細胞の分化を制御する調節可能な手段を実現するにはまだあまりに粗末で不正確なままである。
これまで、幹細胞又は前駆細胞を分化させるのに、以下で論じる免疫調節化合物などの化合物を使用することは報告されていない。特に、この種の化合物を使用して、ＣＤ３４＋前駆細胞などの前駆細胞の分化を、樹状細胞系統から外してモジュレートすること、すなわち移植免疫寛容性の助長に有用となり得ることは実証されていない。同様に、そのような細胞を含有する医薬組成物を製造するために、本明細書に記載の化合物を使用して前駆細胞集団を増殖させることも報告されていない。そのような増殖させた前駆細胞の培養物は、移植片対宿主疾患を治療し、免疫寛容性を発現させるのに有用なはずである。
幹細胞及び前駆細胞の分化を制御すると、治療上有用な細胞集団が産生されるので、樹状細胞及び／又は顆粒球の産生を制御するために、ヒトＣＤ３４＋若しくはＣＤ１３３＋前駆細胞などの骨髄系樹状細胞系統又は初期前駆細胞の細胞分化を制御及び調節できることが求められている。
３．発明の概要
本発明は、哺乳動物、特にヒトの幹細胞又は前駆細胞の分化をモジュレートする方法を提供する。特に、本発明の方法を用いると、ヒト幹細胞の分化及び成熟を、特定の細胞及び組織系統に調節及び制御することができる。本発明は、免疫調節有機小分子、より好ましくはアミノ置換イソインドリン類、特に化合物Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）又はＲｅｖｉｍｉｄ（商標）を使用して、そのような調節及び制御を行うことを含む。本発明はさらに、そのような化合物を、特定の時期に前駆細胞に投与して、特定の様式にその分化をモジュレートすることを企図する。
本発明の方法は、幹細胞又は前駆細胞の、間葉、造血、脂肪生成、肝臓形成、神経形成、神経膠形成、軟骨形成、血管形成、筋形成、軟骨形成、又は骨形成系統が含まれるがこれに限定されるものではない、特定の細胞系統への分化の調節を含む。特定の実施形態では、本発明の方法は、幹細胞の造血系統細胞への分化の調節を含む。
本発明は、単分化能細胞の特定の細胞型、たとえば間葉細胞、造血細胞、脂肪細胞、肝細胞、神経芽細胞、膠芽細胞、軟骨細胞、内皮細胞（ＥＣ）前駆体、筋細胞、軟骨細胞、又は骨芽細胞へのモジュレーションも含む。特定の実施形態では、本発明は、単分化能造血前駆細胞を、赤血球、血小板、又は好中球、単球、マクロファージ、好酸球、好塩基球、肥満細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、形質細胞などの白血球にモジュレートすることを含む。
別の実施形態では、本発明の方法は、幹細胞の、造血系統、特にＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋、及びＣＤ４５＋造血系統の細胞への分化をモジュレートすること、並びにそのような細胞を含有する予防若しくは治療上有益な医薬組成物の製造方法に関する。別の具体的な実施形態では、本発明の方法は、初期前駆細胞の、樹状細胞系統若しくは顆粒球系統、内皮系統、又は心筋細胞系統の細胞への分化をモジュレートすることに関する。
別の実施形態では、本発明は、前駆細胞の、造血系統、特に樹状細胞若しくは顆粒球系統、内皮系統、神経系統、又は心筋細胞系統への分化を調節する方法を提供する。具体的な実施形態では、前記前駆細胞は、ＣＤ３４＋若しくはＣＤ１３３＋細胞である。この調節は、培養中の前駆細胞を本発明の化合物と接触させて実施する。一実施形態では、前記化合物は、ＴＮＦ−α活性の阻害剤である。より具体的な実施形態では、前記化合物は、本明細書に記載するような免疫調節化合物、又はサリドマイド、より好ましくはアミノ置換イソインドリンである。さらにより好ましい具体的な実施形態において、前記化合物は、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）又はＲｅｖｉｍｉｄ（商標）である。
別の具体的な実施形態では、本発明の方法は、前駆細胞の樹状細胞への分化の抑制を含む。もう１つの具体的な実施形態では、本発明は、培養の最初の６日間、前駆細胞の分化をモジュレートして、その前駆細胞の増殖した培養物を作製する方法を提供する。別の実施形態では、本発明の方法は、初期前駆細胞の、顆粒球への発達の促進を含むが、これは、感染と闘うのに有用となり得る。顆粒球系統になる単分化能前駆細胞（ＣＤ１５＋細胞）を増加させると、癌の化学療法に最も一般的な用量制限的な毒性の表れである好中球減少及びそれに続く感染性の合併症を減じるのに使用できる可能性がある。別の実施形態では、本発明の方法を使用して、樹状細胞の分化を抑制することができるが、これは、移植片対宿主疾患の影響を軽減するのに有用である。
本発明の化合物によってモジュレートされる本発明の前駆細胞は、移植（すなわち、造血系の再構成）に有用であり、正常な老化、心疾患、脳卒中、パーキンソン病、アルツハイマー病などの障害又は疾患の治療のために、代替細胞及び代替組織（膵臓、心臓、肝臓、腎臓、肝臓、脳、肺、膀胱、腸、筋肉の細胞など）の再生可能な供給源として再生医療で使用することができる。この細胞は、本発明の化合物の作用を媒介する細胞内の生化学経路の決定にも有用となる。このような細胞は、新薬及び毒素のスクリーニングを行って、たとえば、潜在的な抗癌薬の判定を行い、また出生の欠陥の原因を理解するなどにも有用であろう。
本発明の方法を使用すると、赤血球又は赤血球形成コロニー（ＢＦＵ−Ｅ及びＣＦＵ−Ｅ）の生成を特異的に抑制しながら、白血球及び血小板形成コロニー（ＣＦＵ−ＧＭ）の生成を増大させ、総コロニー形成単位生成を増強することができる。本発明の方法を使用すると、幹細胞、及びＣＤ３４＋前駆細胞などの前駆細胞の分化を調節することができるだけでなく、コロニー形成速度を刺激することもできるので、骨髄移植片生着の速度が向上して、造血幹細胞移植にかなりの利益がもたらされる。
本発明の方法によれば、臍帯血、胎盤、及び他の供給源から単離された幹細胞が含まれるがこれに限定されるものではない、どんな哺乳動物幹細胞を使用することもできる。幹細胞は、任意の哺乳動物種、たとえばマウス、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、サルなど、より好ましくはヒトから単離されたものでよい。幹細胞には、多能性細胞、すなわち完全な分化多様性を有し、自己再生可能であり、かつ組織内で休止若しくは静止状態に止まることのできる細胞が含まれるであろう。幹細胞には、多分化能細胞又は単分化能前駆細胞も含まれうる。好ましい一実施形態では、本発明は、満期胎盤内に存在し、又は満期胎盤によって後から産生される、生きた静止状態の多能性幹細胞である幹細胞を利用するが、すなわち、このような細胞は、出生及び胎盤の排出がうまく行われ、胎盤の瀉血及び灌流を行った後に回収することができ、その結果１０億個もの有核細胞が産生及び回収され、５千万〜１億個の多分化能幹細胞及び多能性幹細胞がもたらされる。この細胞は、本明細書では、ヒト胎盤幹細胞又は胚様幹細胞と呼ぶ。
本発明の具体的な一実施形態では、胚様幹細胞、ＣＤ３４＋若しくはＣＤ１３３＋細胞などの前駆細胞、多能性細胞、及び多分化能細胞が含まれるがこれに限定されるものではない細胞、たとえば骨髄又は灌流を行った分娩後胎盤に内在する細胞を本発明の化合物に暴露し、分化を誘導する。内因性細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させることができる。別の実施形態では、内因性細胞は、胎盤及び培地から回収し、所望の細胞型又は系統への分化を誘導するのに適する条件下で、そうするのに十分な時間にわたりｉｎ ｖｉｔｒｏで培養することができる。
本発明の別の実施形態では、幹細胞又は前駆細胞を、臍帯血、末梢血、成体血などの他の供給源から得、本発明の化合物に暴露し、分化を誘導する。好ましい実施形態では、分化は、所望の系統又は細胞型への分化を誘導するのに適する条件下で、そうするのに十分な時間にわたりｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる。本発明の化合物は、添加による分化／培養培地、ｉｎ ｓｉｔｕ産生、又は幹細胞若しくは前駆細胞と本発明の化合物との接触を可能にする他の任意の方法で使用する。
本発明の化合物を投与する時期は、ＣＤ３４＋前駆細胞の分化に対して甚大な影響を有することが発見されている。したがって、本発明の一実施形態では、培養初日の前駆細胞と本発明の化合物とを接触させることを含む方法によって、ＣＤ３４＋前駆細胞の樹状細胞への分化を遅延又は抑制する。別の実施形態では、ＣＤ３４＋前駆細胞と本発明の化合物とを培養初日に接触させることを含む方法によって、ＣＤ１ａ＋細胞のＣＤ３４＋前駆細胞からの発達を低減又は阻止する。別の実施形態では、ＣＤ３４＋前駆細胞を本発明の化合物の不在下で６日間培養した後に、前記前駆細胞と本発明の化合物とを接触させることによって、ＣＤ３４＋前駆細胞に由来するＣＤ１ａ＋細胞集団の存続を増進する。
本発明は、ヒトＣＤ３４＋細胞若しくはＣＤ１３３＋細胞などの初期前駆細胞の分化をモジュレートする方法であって、前駆細胞と１種又は複数の本発明の化合物とを、増殖期及び分化期中の様々な時期に接触させることを含む方法を包含する。従って、一実施形態では、本発明は、前駆細胞の分化をモジュレートする方法であって、前記細胞と１種又は複数の本発明の化合物とを培養初日のみ接触させることを含む方法を含む。別の実施形態では、培養初日と第１２日の間のいずれかの日に、前記細胞と単回用量の前記化合物とを接触させる。別の実施形態では、前記細胞と前記化合物とを、第０〜１２日の間の異なる日に少なくとも２回接触させる。さらに別の実施形態では、前記細胞と１種又は複数の化合物とを、増殖期及び／又は分化期中の１日２回、１日１回、又は１日おきに１回接触させる。別の実施形態では、前記接触をｉｎ ｖｉｔｒｏで実施する。さらに別の実施形態では、前記接触を被験体においてｉｎ ｖｉｖｏで実施する。より具体的な実施形態では、前記被験体は、ヒト、非ヒト哺乳動物、鳥、又は爬虫類である。
要するに、灌流を行った分娩後胎盤中で培養することのできる、内因性又は外因性の幹細胞又は前駆細胞を本発明の化合物に暴露することは、細胞を胎盤中で培養している間に行ってもよいし、あるいは好ましくは、細胞を胎盤から回収し、取り出した後にｉｎ ｖｉｔｒｏで行ってもよい。
本発明は、ＴＮＦ−α阻害活性を有する化合物の、幹細胞及び／又は前駆細胞の発達のモジュレーターとしての使用を含む。具体的な実施形態では、この化合物は、限定するものではないが、サリドマイド類似体、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）（Ｃｅｌｇｅｎｅ社、米国ニュージャージー州Ｗａｒｒｅｎ）又はＲｅｖｉｍｉｄ（商標）（Ｃｅｌｇｅｎｅ社、米国ニュージャージー州Ｗａｒｒｅｎ）を含むＩＭｉＤｓ（商標）として知られているクラスなどの、免疫調節化合物である。
本発明はまた、疾患を治療又は予防するための、前処理した幹細胞又は前駆細胞の移植も含む。一実施形態では、本発明の化合物を、移植の必要のある患者にも、移植前、移植中、及び／又は移植後に投与する。
本発明はさらに、本発明の方法により生成される前駆細胞又は特定の細胞型の使用を含む。換言すれば、本発明は、造血前駆細胞を分化させて作製した白血球、顆粒球、又は樹状細胞の使用を含み、この場合には必ず、前駆細胞の前記分化が、本発明の化合物を使用してモジュレート又は調節されている。
他の実施形態では、本発明は、必要のある患者に本発明の幹細胞及び小分子化合物の両方を投与することによる、幹細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの制御又は調節を含む。
一実施形態では、本発明は、培養の最初の６日間において前記前駆細胞の増殖及び分化を促進する条件下で、本発明の化合物、特にＴＮＦ‐α活性を阻害する化合物と接触させておいたＣＤ３４＋又はＣＤ１３３＋前駆細胞と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。具体的な実施形態では、医薬組成物は、培養してから６日後に回収し凍結保存しておいた細胞を含む。別の具体的な実施形態では、医薬組成物の細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３４−細胞又はＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３４＋細胞である。別の具体的な実施形態では、細胞と接触させる化合物は、本発明の免疫調節化合物、又はサリドマイド若しくはサリドマイド類似体である。別の具体的な実施形態では、細胞と接触させる化合物は、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）又はＲｅｖｉｍｉｄ（商標）である。
別の実施形態では、本発明はまた、医薬組成物の製造方法であって、ＣＤ３４＋又はＣＤ１３３＋前駆細胞とＴＮＦ−α活性を阻害する化合物とを接触させるステップであって、前記前駆細胞を、前記前駆細胞の増殖及び分化を可能にする培養条件下にて培地中で６日間培養するものである上記ステップ、培養して６日後に前記細胞を回収するステップ、前記細胞と薬学的に許容される担体を混合するステップを含む方法も提供する。この方法の具体的な実施形態では、前記接触ステップを培養初日に実施する。この方法の別の具体的な実施形態では、前記接触ステップの前記６日間の培養中に少なくとも２回実施する。別の具体的な実施形態では、前記化合物は、本発明の小さな免疫調節化合物である。別の具体的な実施形態では、前記化合物は、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）又はＲｅｖｉｍｉｄ（商標）である。この方法のさらに別の具体的な実施形態では、前記前駆細胞は、前記培養の前に他の血液細胞から単離されたものである。この方法の別の具体的な実施形態では、前記培養培地がＧＭ−ＣＳＦ及びＴＮＦ−αをさらに含有する。この方法のより具体的な実施形態では、前記Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）又はＲｅｖｉｍｉｄ（商標）は、０．１μＭ〜１０．０μＭの濃度で存在する。この方法の別のより具体的な実施形態では、前記Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）又はＲｅｖｉｍｉｄ（商標）は、１．０μＭの濃度で存在する。この方法の別の具体的な実施形態では、前記細胞を、前記回収ステップの後に凍結保存する。
本発明はさらに、哺乳動物被験体において前駆細胞集団を増殖させる方法であって、前記レシピエント哺乳動物被験体に、治療上有効な量のＣＤ３４＋又はＣＤ１３３＋前駆細胞と、１種又は複数のＡｃｔｉｍｉｄ（商標）又はＲｅｖｉｍｉｄ（商標）を投与するステップを含む方法を提供する。この方法の具体的な実施形態では、前記前駆細胞を、レシピエント哺乳動物被験体中で分化させる。この方法の別の具体的な実施形態では、前記前駆細胞を、赤血球を実質的に含まない細胞調製物の形態で前記被験体に投与する。この方法の別の具体的な実施形態では、前記前駆細胞を、骨髄細胞、胎盤細胞、臍帯血細胞、又はＰＢＭＣを含む細胞調製物の形態でレシピエント哺乳動物被験体に投与する。この方法の別の具体的な実施形態では、前記前駆細胞を、担体と共にレシピエント哺乳動物被験体に投与する。この方法の別の具体的な実施形態では、前記前駆細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋前駆細胞である。この方法の別の具体的な実施形態では、前駆細胞は、組み込まれている目的の遺伝物質を発現するものである。
本発明は、上記方法によって産生される、医薬組成物として有用な細胞も提供する。
さらに他の実施形態では、本発明は、幹細胞又は前駆細胞、たとえばＣＤ３４＋前駆細胞を、凍結保存及び解凍後に順化させて（conditioning）、凍結保存及び凍結保存剤への暴露が幹細胞に及ぼす有害な影響を無効にする方法を含む。ある実施形態では、本発明は、幹細胞を、凍結保存及び解凍後に順化させて、凍結保存剤（たとえばＤＭＳＯ）への暴露が幹細胞の増殖及び遊走能力に及ぼす有害な影響を無効にする方法を提供する。
３．１．定義
本明細書では、用語「バイオリアクター」とは、細胞を増殖させ、生体材料を産生又は発現させ、細胞、組織、オルガノイド、ウイルス、タンパク質、ポリヌクレオチド、及び微生物を増殖させ、又は培養するためのｅｘ ｖｉｖｏ系を指す。
本明細書では、「ＤＣ細胞」とは、樹状細胞を指す。
本明細書では、「初期前駆細胞」とは、ＣＤ３４＋前駆細胞、ＣＤ１３３＋前駆細胞、又はこれらいずれかの哺乳動物、鳥類、若しくは爬虫類の等価物を意味する。
本明細書では、用語「胚幹細胞」とは、胚盤胞の内部細胞塊（たとえば、生後４〜５日のヒトの胚）に由来し、多能性である細胞を指す。
本明細書では、用語「胚様幹細胞（embryonic-like stem cell）」とは、胚盤胞の内部細胞塊由来ではない細胞を指す。本明細書では、「胚様幹細胞」を「胎盤幹細胞」と呼ぶこともある。胚様幹細胞は、多能性であることが好ましい。しかし、胎盤から得ることのできる幹細胞には、胚様幹細胞、多分化能細胞、単分化能前駆細胞が含まれる。本発明の方法においては、胎盤由来の胚様幹細胞は、残りの細胞を除去するのに十分な時間をかけてその瀉血及び灌流を行った後、分離した胎盤から回収することができる。胚様幹細胞は、いずれの哺乳動物に由来するものでもよいが、ヒトのものであることが好ましい。
本明細書では、用語「瀉血した」又は「瀉血」とは、胎盤に関して用いるとき、胎盤から実質的にすべての臍帯血を除去及び／又は排液することを指す。本発明においては、胎盤の瀉血は、たとえば、限定するものでないが、排液、重力による流出、マッサージ、圧搾、ポンピングなどによって実施することができる。好ましい実施形態では、胎盤の瀉血を助けるための、抗凝固剤などの薬剤を含有する又は含有しない流体を用い、胎盤の灌流、洗浄、又はフラッシングを行うことによって、さらに胎盤の瀉血を行ってもよい。
本明細書では、用語「灌流する」又は「灌流」とは、臓器又は組織に流体を注ぎ、又は流体を通過させる行為、好ましくは、臓器又は組織から残りの細胞、たとえば非付着細胞を除去するのに十分な力又は圧力をかけて臓器又は組織に液体を通す通過を指す。本明細書では、用語「灌流液」とは、臓器又は組織に通過させた後に回収した流体を指す。好ましい実施形態では、灌流液は、１種又は複数の抗凝固剤を含有する。
本明細書では、用語「内因性細胞」とは、「非外来」細胞、すなわち胎盤由来の「自己」若しくは自家細胞を指す。
本明細書では、用語「外因性細胞」とは、「外来」細胞、すなわち、異種細胞（すなわち、胎盤ドナー以外の供給源に由来する「非自己」細胞）又は胎盤以外の臓器若しくは組織に由来する自家細胞（すなわち、胎盤ドナーに由来する「自己」細胞）を指す。
本明細書では、「免疫調節化合物」とは、以下の第５．３節で開示する化合物を指す。
本明細書では、用語「オルガノイド」とは、表面的な外観又は実際の構築物中に集まった、哺乳動物の身体、好ましくはヒトの身体の臓器又は腺としての、１種又は複数の細胞型の集合を指す。
本明細書では、用語「多分化能細胞（multipotent cell）」とは、哺乳動物身体の細胞型約２６０種のうちの任意のサブセットにも生育できる能力を有する細胞を指す。多能性細胞と異なり、多分化能細胞は、すべての細胞型を生成する能力をもたない。
本明細書では、用語「多能性細胞（pluripotent cell）」とは、完全な分化多様性、すなわち哺乳動物身体の細胞型約２６０種のいずれにも生育できる能力を有する細胞を指す。多能性細胞は、自己再生することができ、組織内で休止若しくは静止状態に止まることができる。全能性細胞（たとえば、受精した二倍体卵細胞）と異なり、胚幹細胞は、通常は新しい胚盤胞を生成することができない。
本明細書では、用語「前駆細胞」とは、特定の型の細胞に分化することになっているか、又は特定の種類の組織を形成する細胞を指す。
本明細書では、用語「幹細胞」とは、無期限に再生して、組織及び臓器の特殊化した細胞を生成することのできる親細胞を指す。幹細胞は、発生に関して多能性又は多分化能である細胞である。幹細胞は、分裂して、２個の娘幹細胞、又は１個の娘細胞及び１個の前駆（「遷移」）細胞を産生することができ、次いで前駆細胞が増殖して、各組織の成熟した、完全に形作られた細胞になる。
本明細書では、用語「全能性細胞」とは、完全な胚（たとえば、胚盤胞）を生成することのできる細胞を指す。
４．図面の簡単な説明
図１は、１μｇ／ｍｌ及び１０μｇ／ｍｌの濃度におけるサリドマイド（ＴＨＤ）、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）及びＲｅｖｉｍｉｄ（商標）の存在下における臍帯血ＣＤ３４＋細胞の培養結果を示す棒グラフである。等量のＤＭＳＯを陰性対照として使用した。赤芽球バースト形成細胞（ＢＦＵ−Ｅ）、赤芽球コロニー形成細胞（ＣＦＵ−Ｅ）、顆粒球／マクロファージコロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＧＭ）、及び合計コロニー数（ＣＦＵ−Ｔｏｔａｌ）の造血性コロニーを培養の第１４日に光学顕微鏡下で計数した。Ｙ軸：コロニー数。詳細については第６．１節参照。
図２（Ａ−Ｆ）は、フローサイトグラムを示す。Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）及びＲｅｖｉｍｉｄ（商標）へのヒト臍帯血ＣＤ４５＋細胞の曝露によって、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞の赤血球生成及び増殖が阻害される。臍帯血ＣＤ４５＋細胞は、サイトカイン類ＩＬ３、ＩＬ６、Ｇ−ＣＳＦ、Ｅｐｏ及びＫＬと共に１４日間培養した。各サイトグラムに示すパーセンテージは、特定のマーカーの組み合わせを発現する細胞集団のパーセンテージを示す。Ａ：対照、免疫グロブリン（Ｉｇ）、Ｂ：対照、化合物無添加、Ｃ：ＤＭＳＯ（５μｇ／ｍｌ）、Ｄ：サリドマイド（Ｔｈａｌ）（５μｇ／ｍｌ）、Ｅ：Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）（５μｇ／ｍｌ）、Ｆ：Ｒｅｖｉｍｉｄ（商標）（５μｇ／ｍｌ）。Ｘ軸：Ｇｌｙ−Ａ（ＦＬ１−Ｈ）染色の相対強度。Ｙ軸：ＣＤ３４（Ｆ２−Ｈ）染色の相対強度。詳細については第６．１節参照。
図３（Ａ−Ｆ）は、フローサイトグラムを示す。Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）又はＲｅｖｉｍｉｄ（商標）へのヒト臍帯血ＣＤ４５＋細胞の曝露によって、サイトカイン類ＩＬ３、ＫＬ及びＧ−ＣＳＦと共に１４日間培養したヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞上でのＣＸＣＲ４の発現が阻害される。各サイトグラムに示すパーセンテージは、特定のマーカーの組み合わせを発現する細胞集団のパーセンテージを示す。Ａ：対照、免疫グロブリン（Ｉｇ）、Ｂ：対照、ＣＤ４５＋細胞、Ｃ：ＤＭＳＯ（０．３μｇ／ｍｌ）、Ｄ：Ｔｈａｌ（０．３μｇ／ｍｌ）、Ｅ：Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）（０．３μｇ／ｍｌ）、Ｆ：Ｒｅｖｉｍｉｄ（商標）（０．３μｇ／ｍｌ）。Ｘ軸：ＣＤ３４（ＦＬ１−Ｈ）染色の相対強度。Ｙ軸：ＣＸＣＲ４（ＦＬ２−Ｈ）染色の相対強度。詳細については第６．２節参照。
図４（Ａ−Ｆ）は、フローサイトグラムを示す。Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）又はＲｅｖｉｍｉｄ（商標）へのヒト臍帯血ＣＤ４５＋細胞の曝露によって、ＣＤ３４＋及び／又はＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞集団の増殖が促進される。臍帯血ＣＤ４５＋細胞は、サイトカイン類ＩＬ３、ＩＬ６、Ｇ−ＣＳＦ、Ｅｐｏ及びＫＬと共に１４日間培養した。各サイトグラムに示すパーセンテージは、特定のマーカーの組み合わせを発現する細胞集団のパーセンテージを示す。Ａ：対照、免疫グロブリン（Ｉｇ）、Ｂ：対照、化合物無添加、Ｃ：ＤＭＳＯ（０．３μｇ／ｍｌ）、Ｄ：Ｔｈａｌ（０．３μｇ／ｍｌ）、Ｅ：Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）（０．３μｇ／ｍｌ）、Ｆ：Ｒｅｖｉｍｉｄ（商標）（０．３μｇ／ｍｌ）。Ｘ軸：ＣＤ３８（ＦＬ１−Ｈ）染色の相対強度。Ｙ軸：ＣＤ３４（ＦＬ２−Ｈ）染色の相対強度。詳細については第６．２節参照。
図５（Ａ−Ｆ）は、フローサイトグラムを示す。Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）又はＲｅｖｉｍｉｄ（商標）へのヒト臍帯血ＣＤ４５＋細胞の曝露によって、ヒト臍帯血前駆細胞の有意な保存（preservation）がもたらされる。臍帯血ＣＤ４５＋細胞は、サイトカイン類ＩＬ３、ＩＬ６、Ｇ−ＣＳＦ、Ｅｐｏ及びＫＬと共に１４日間培養した。各サイトグラムに示すパーセンテージは、特定のマーカーの組み合わせを発現する細胞集団のパーセンテージを示す。Ａ：対照、免疫グロブリン（Ｉｇ）、Ｂ：対照、化合物無添加、Ｃ：ＤＭＳＯ（５μｇ／ｍｌ）、Ｄ：Ｔｈａｌ（５μｇ／ｍｌ）、Ｅ：Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）（５μｇ／ｍｌ）、Ｆ：Ｒｅｖｉｍｉｄ（商標）（５μｇ／ｍｌ）。Ｘ軸：ＣＤ３８（ＦＬ１−Ｈ）染色の相対強度。Ｙ軸：ＣＤ３４（ＦＬ２−Ｈ）染色の相対強度。詳細については第６．２節参照。
図６（Ａ−Ｆ）は、フローサイトグラムを示す。Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）及びＲｅｖｉｍｉｄ（商標）へのヒト臍帯血ＣＤ４５＋細胞の曝露によって、ＣＸＣＲ４の発現が阻害され、ＣＤ４５＋細胞の集団が増殖する。臍帯血ＣＤ４５＋細胞は、サイトカイン類ＩＬ３、ＩＬ６、Ｇ−ＣＳＦ、Ｅｐｏ及びＫＬと共に１４日間培養した。各サイトグラムに示すパーセンテージは、特定のマーカーの組み合わせを発現する細胞集団のパーセンテージを示す。Ａ：対照、免疫グロブリン（Ｉｇ）、Ｂ：対照、化合物無添加、Ｃ：ＤＭＳＯ（５μｇ／ｍｌ）、Ｄ：Ｔｈａｌ（５μｇ／ｍｌ）、Ｅ：Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）（５μｇ／ｍｌ）、Ｆ：Ｒｅｖｉｍｉｄ（商標）（５μｇ／ｍｌ）。Ｘ軸：ＣＤ４５（ＦＬ１−Ｈ）染色の相対強度。Ｙ軸：ＣＸＣＲ４（ＦＬ２−Ｈ）染色の相対強度。詳細については第６．２節参照。
図７（Ａ−Ｆ）は、フローサイトグラムを示す。Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）及びＲｅｖｉｍｉｄ（商標）へのヒト臍帯血ＣＤ４５＋細胞の曝露によって、ＣＤ３４＋前駆細胞数が増大し、顆粒球及び単球の産生が増大する。臍帯血ＣＤ４５＋細胞は、サイトカイン類ＩＬ３、ＩＬ６、Ｇ−ＣＳＦ、Ｅｐｏ及びＫＬと共に１４日間培養した。各サイトグラムに示すパーセンテージは、特定のマーカーの組み合わせを発現する細胞集団のパーセンテージを示す。Ａ：対照、免疫グロブリン（Ｉｇ）、Ｂ：対照、化合物無添加、Ｃ：ＤＭＳＯ（５μｇ／ｍｌ）、Ｄ：Ｔｈａｌ（５μｇ／ｍｌ）、Ｅ：Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）（５μｇ／ｍｌ）、Ｆ：Ｒｅｖｉｍｉｄ（商標）（５μｇ／ｍｌ）。Ｘ軸：ＣＤ１１ｂ（ＦＬ１−Ｈ）染色の相対強度。Ｙ軸：ＣＤ３４（ＦＬ２−Ｈ）染色の相対強度。詳細については第６．２節参照。
図８（Ａ−Ｆ）は、フローサイトグラムを示す。Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）及びＲｅｖｉｍｉｄ（商標）へのヒト臍帯血ＣＤ４５＋細胞の曝露によって、ＣＤ３４＋前駆細胞が増殖し、単球産生のＤＭＳＯ媒介型抑制を妨害する。臍帯血ＣＤ４５＋細胞は、サイトカイン類ＩＬ３、ＩＬ６、Ｇ−ＣＳＦ、Ｅｐｏ及びＫＬと共に１４日間培養した。各サイトグラムに示すパーセンテージは、特定のマーカーの組み合わせを発現する細胞集団のパーセンテージを示す。Ａ：対照、免疫グロブリン（Ｉｇ）、Ｂ：対照、化合物無添加、Ｃ：ＤＭＳＯ（５μｇ／ｍｌ）、Ｄ：Ｔｈａｌ（５μｇ／ｍｌ）、Ｅ：Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）（５μｇ／ｍｌ）、Ｆ：Ｒｅｖｉｍｉｄ（商標）（５μｇ／ｍｌ）。Ｘ軸：ＣＤ１４発現（ＦＬ１−Ｈ）染色の相対強度。Ｙ軸：ＣＤ３４（ＦＬ２−Ｈ）染色の相対強度。詳細については第６．３節参照。
図９（Ａ−Ｆ）は、フローサイトグラムを示す。Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）へのヒト臍帯血ＣＤ４５＋細胞の曝露によって、Ｂ細胞への分化に対するわずかな抑制的作用が示された。臍帯血ＣＤ４５＋細胞は、サイトカイン類ＩＬ３、ＩＬ６、Ｇ−ＣＳＦ、Ｅｐｏ及びＫＬと共に１４日間培養した。各サイトグラムに示すパーセンテージは、特定のマーカーの組み合わせを発現する細胞集団のパーセンテージを示す。Ａ：対照、免疫グロブリン（Ｉｇ）、Ｂ：対照、化合物無添加、Ｃ：ＤＭＳＯ（５μｇ／ｍｌ）、Ｄ：Ｔｈａｌ（５μｇ／ｍｌ）、Ｅ：Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）（５μｇ／ｍｌ）、Ｆ：Ｒｅｖｉｍｉｄ（商標）（５μｇ／ｍｌ）。Ｘ軸：ＣＤ３８（ＦＬ１−Ｈ）染色の相対強度。Ｙ軸：ＣＤ１９（ＦＬ２−Ｈ）染色の相対強度。詳細については第６．３節参照。
図１０（Ａ−Ｆ）は、フローサイトグラムを示す。Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）及びＲｅｖｉｍｉｄ（商標）へのヒト臍帯血ＣＤ４５＋細胞の曝露によって、ＤＭＳＯへの曝露によりもたらされるＣＸＣＲ５の抑制が回復する。臍帯血ＣＤ４５＋細胞は、サイトカイン類ＩＬ３、ＩＬ６、Ｇ−ＣＳＦ、Ｅｐｏ及びＫＬと共に１４日間培養した。各サイトグラムに示すパーセンテージは、特定のマーカーの組み合わせを発現する細胞集団のパーセンテージを示す。Ａ：対照、免疫グロブリン（Ｉｇ）、Ｂ：対照、化合物無添加、Ｃ：ＤＭＳＯ（５μｇ／ｍｌ）、Ｄ：Ｔｈａｌ（５μｇ／ｍｌ）、Ｅ：Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）（５μｇ／ｍｌ）、Ｆ：Ｒｅｖｉｍｉｄ（商標）（５μｇ／ｍｌ）。Ｘ軸：ＣＸＣＲ５（ＦＬ１−Ｈ）染色の相対強度。Ｙ軸：ＣＤ３４（ＦＬ２−Ｈ）染色の相対強度。詳細については第６．３節参照。
図１１（Ａ−Ｅ）は、フローサイトグラムを示す。Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）及びＲｅｖｉｍｉｄ（商標）へのヒト臍帯血単核細胞（ＭＮＣ）の曝露によって、ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋細胞集団が増大する。各サイトグラムに示すパーセンテージは、特定のマーカーの組み合わせを発現する細胞集団のパーセンテージを示す。Ａ：対照、免疫グロブリン（Ｉｇ）、Ｂ：対照、化合物無添加、Ｃ：ＤＭＳＯ（５μｇ／ｍｌ）、Ｄ：Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）（５μｇ／ｍｌ）、Ｅ：Ｒｅｖｉｍｉｄ（商標）（５μｇ／ｍｌ）。Ｘ軸：ＣＤ３８（ＦＬ１−Ｈ）染色の相対強度。Ｙ軸：ＣＤ３４（ＦＬ２−Ｈ）染色の相対強度。詳細については第６．３節参照。
図１２（Ａ−Ｅ）は、フローサイトグラムを示す。Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）及びＲｅｖｉｍｉｄ（商標）へのＭＮＣの曝露によって、ＣＸＣＲ４＋ＣＤ４５＋細胞集団がダウンレギュレートされるが、ＣＸＣＲ＋ＣＤ４５−細胞集団は増大する。各サイトグラムに示すパーセンテージは、特定のマーカーの組み合わせを発現する細胞集団のパーセンテージを示す。Ａ：対照、免疫グロブリン（Ｉｇ）、Ｂ：対照、化合物無添加、Ｃ：ＤＭＳＯ（５μｇ／ｍｌ）、Ｄ：Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）（５μｇ／ｍｌ）、Ｅ：Ｒｅｖｉｍｉｄ（商標）（５μｇ／ｍｌ）。Ｘ軸：ＣＤ４５（ＦＬ１−Ｈ）染色の相対強度。Ｙ軸：ＣＸＣＲ４（ＦＬ２−Ｈ）染色の相対強度。詳細については第６．３節参照。
図１３（Ａ−Ｅ）は、フローサイトグラムを示す。臍帯血の有核細胞画分における造血前駆細胞の分化の系統の方向付けに対する、サリドマイド、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）及びＲｅｖｉｍｉｄ（商標）の作用を示す。フローサイトグラムは、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）及びＲｅｖｉｍｉｄ（商標）が対照と比較して単球系統細胞の割合を増大させることを示しており、このことは、リンパ球及び骨髄細胞となる系統へシフトさせる分化のモジュレーションがあることを示している。Ａ：対照、免疫グロブリン（Ｉｇ）、Ｂ：ＤＭＳＯ（５μｇ／ｍｌ）、Ｃ：Ｔｈａｌ（５μｇ／ｍｌ）、Ｄ：Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）（５μｇ／ｍｌ）、Ｅ：Ｒｅｖｉｍｉｄ（商標）（５μｇ／ｍｌ）。詳細については第６．４節参照。
図１４は、ＣＤ３４＋細胞の分化とＤＣ細胞への成熟に対するＡｃｔｉｍｉｄ（商標）の作用の研究の概要を示す。ＣＤ３４＋細胞は、増殖期及び成熟期（第１日〜第１２日）、又は成熟期（第６日〜第１２日）のいずれかの期間にわたり、１．０μＭ Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）及びＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）の存在下又は不在下にて培養した。免疫組織化学的マーカーは、ＦＩＴＣ及びＰＥ結合モノクローナル抗体を用いて第６日又は第１２日に評価した。詳細については第６．６節参照。
図１５（Ａ−Ｄ）は、第１日からＡｃｔｉｍｉｄ（商標）に曝露したＣＤ３４＋細胞の第６日における表現型の特徴を示すフローサイトグラムである。Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）は、ＣＤ８６＋ＣＤ１ａ＋細胞の発達をほぼ完全に抑制した。細胞は、ＣＤ１ａ ＦＩＴＣ及びＣＤ１４ ＰＥ、又はＣＤ１ａ ＦＩＴＣ及びＣＤ８６ ＰＥで二重標識した。Ａ：ＤＭＳＯ処理ＣＤ３４＋細胞から生じたＣＤ８６＋ＣＤ１＋細胞（対照）、Ｂ：ＤＭＳＯ処理ＣＤ３４＋細胞から生じたいＣＤ１４＋ＣＤ１＋細胞（対照）、Ｃ：Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）処理ＣＤ３４＋細胞から生じたＣＤ８６＋ＣＤ１＋細胞、Ｄ：Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）処理ＣＤ３４＋細胞から生じたＣＤ１４＋ＣＤ１＋細胞。各サイトグラムに示すパーセンテージは、特定のマーカーの組み合わせを発現する細胞のパーセンテージを示す。詳細については第６．６節参照。
図１６（Ａ−Ｄ）は、増殖期（第１日〜第６日）におけるＡｃｔｉｍｉｄ（商標）曝露がＣＤ３４＋細胞に及ぼす作用（第６日）を示すフローサイトグラムである。Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）に曝露したＣＤ３４＋ＣＤ−細胞は、６日後にＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３３＋細胞に分化した。細胞は、ＣＤ３３ ＦＩＴＣ及びＣＤ８３ ＰＥ、又はＣ３８ ＰＥ及びＣＤ３４ ＰＥで二重標識した。Ａ：ＤＭＳＯで処理しＣＤ３４及びＣＤ３８で標識した細胞、Ｂ：ＤＭＳＯで処理しＣＤ８３及びＣＤ３３で標識した細胞、Ｃ：Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）で処理しＣＤ３４及びＣＤ３８で標識した細胞、Ｄ：処理した細胞。各サイトグラムに示すパーセンテージは、特定のマーカーの組み合わせを発現する細胞のパーセンテージを示す。詳細については第６．６節参照。
図１７は、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）が第０日〜第６日における培養物からのＣＤ３４＋細胞由来細胞集団におけるシフトを誘導することを示す。細胞は、種々の濃度のＡｃｔｉｍｉｄ（商標）の存在下にて第０日〜第６日で培養し、その後、ＣＤ３４及びＣＤ３８、又はＣＤ１ａ及びＣＤ１４で二重標識した。Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）によって、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞が顕著に増大し、ＣＤ１ａ＋ＣＤ１４−細胞が低減した。詳細については第６．６節参照。
図１８は、種々の時間にわたりＡｃｔｉｍｉｄ（商標）で処理したＣＤ３４＋細胞の第６日における表現型の変化を示す。細胞は平板培養で６日間培養した。細胞は、第０日〜第１日のみ、第０日〜第２日のみ、第０日〜第３日のみ、第０日〜第４日のみ、第０日〜第５日のみ、又は第０日〜第６日にＡｃｔｉｍｉｄ（商標）で処理した。６日未満のインキュベーションでは、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）を所定の日に洗浄し、細胞をＤＭＳＯに再懸濁した。第６日に、細胞をＣＤ３４及びＣＤ３８、又はＣＤ１ａ及びＣＤ１４で標識した。詳細については第６．６節参照。
図１９（Ａ−Ｂ）は、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）の単回又は複数回投与で処理したＣＤ３４＋前駆細胞の第６日における表現型の変化を示す。図１９Ａ：条件１：第０日におけるＡｃｔｉｍｉｄ（商標）の単回投与、条件２：第０日及び第４日におけるＡｃｔｉｍｉｄ（商標）の投与、条件３：第０日、第２日及び第４日におけるＡｃｔｉｍｉｄ（商標）の投与。Ｙ軸は、特定のマーカー又はマーカーの組み合わせを発現する細胞のパーセンテージを示す。図１９Ｂ：条件１：第０日におけるＡｃｔｉｍｉｄ（商標）の単回投与、条件２：第０日、第４日、第６日及び第８日におけるＡｃｔｉｍｉｄ（商標）の投与、条件３：第０日、第２日、第４日、第６日及び第８日におけるＡｃｔｉｍｉｄ（商標）の投与。細胞は、ＣＤ１１ｃ及びＣＤ１５顆粒球マーカーの発現について評価した。Ｙ軸は、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）又はＤＭＳＯ（対照）で処理したＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１５−細胞及びＣＤ１１ｃ−ＣＤ１５＋細胞の割合（パーセンテージ）を示す。詳細については第６．６節参照。
図２０（Ａ−Ｆ）は、第１日〜第１２日にＡｃｔｉｍｉｄ（商標）（１μＭ）に曝露したＣＤ３４＋細胞から生成された第１２日における樹状細胞のフローサイトグラムである。Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）によって、対照と比較して、第１２日における共刺激分子ＣＤ８６及びＣＤ８０が低減した。細胞は、ＣＤ１ａ ＦＩＴＣ及びＣＤ８６ ＰＥ抗体、ＣＤ１ａ ＦＩＴＣ及びＣＤ８０ ＰＥ抗体、又はＣＤ１ａ ＦＩＴＣ及びＣＤ１４ ＰＥ抗体で二重標識した。Ａ：細胞をＤＭＳＯで処理し、第１２日にＣＤ８６及びＣＤ１ａについて染色した。Ｂ：細胞をＤＭＳＯで処理し、第１２日にＣＤ８０及びＣＤ１ａについて染色した。Ｃ：細胞をＤＭＳＯで処理し、第１２日にＣＤ１４及びＣＤ１ａについて染色した。Ｄ：細胞をＡｃｔｉｍｉｄ（商標）で処理し、第１２日にＣＤ８６及びＣＤ１ａについて染色した。Ｅ：細胞をＡｃｔｉｍｉｄ（商標）で処理し、第１２日にＣＤ８０及びＣＤ１ａについて染色した。Ｆ：細胞をＡｃｔｉｍｉｄ（商標）で処理し、第１２日にＣＤ１４及びＣＤ１ａについて染色した。各サイトグラムに示すパーセンテージは、特定のマーカーの組み合わせを発現する細胞のパーセンテージを示す。詳細については第６．６節参照。
図２１（Ａ−Ｄ）は、第１日〜第１２日にＡｃｔｉｍｉｄ（商標）（１μＭ）に曝露したＣＤ３４＋細胞から生成された第１２日における樹状細胞のフローサイトグラムである。Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）への曝露によって、接着分子ＣＤ５４発現がモジュレートされ、それにより対照と比較してＣＤ５４ｂｒｉｇｈｔの発現が低下し、ＣＤ５４ｄｉｍの発現が増大した（図２１Ｄにおける小パネルＥ及びＦを参照）。Ａ：細胞をＤＭＳＯで処理し、ＨＬＡ−ＤＲ及びｗｉｔｈＩｇＧｌについて染色した。Ｂ：細胞をＤＭＳＯで処理し、ＣＤ５４及びＣＤ４０について染色した。Ｃ：細胞をＡｃｔｉｍｉｄ（商標）で処理し、ＨＬＡ−ＤＲ及びｗｉｔｈＩｇＧＩについて染色した。Ｄ：細胞をＡｃｔｉｍｉｄ（商標）で処理し、ＣＤ５４及びＣＤ４０について染色した。各サイトグラムに示すパーセンテージは、特定のマーカーの組み合わせを発現する細胞集団のパーセンテージを示す。詳細については第６．６節参照。
図２２（Ａ−Ｂ）は、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）がＣＤ３４＋前駆細胞からの顆粒球への分化を促進することを示す。ＤＭＳＯ（図２２Ａ）又はＡｃｔｉｍｉｄ（商標）（図２２Ｂ）の存在下で１２日間増殖させ、その後、顆粒球マーカーＣＤ１５に対する抗体で染色したＣＤ３４＋細胞のフローサイトグラムである。各サイトグラムに示すパーセンテージは、特定のマーカーの組み合わせを発現する細胞のパーセンテージを示す。詳細については第６．６節参照。
図２３（Ａ−Ｄ）は、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）がＣＤ１ａ＋又はＣＤ１４＋前駆細胞のアポトーシスを誘導しないことを示す。ＣＤ１ａ＋ＣＤ１４−単離細胞又はＣＤ１ａ−ＣＤ１４＋単離細胞（ＤＣ前駆細胞）のフローサイトグラムである。ＣＤ３４＋前駆細胞は、ＳＣＦ、Ｆｌｔ−３Ｌ、ＧＭ−ＣＳＦ及びＴＮＦ−αの存在下で６日間にわたり培養した。第６日に、磁気細胞そーｒ品具（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）によりＣＤ１ａ＋ＣＤ１４−細胞及びＣＤ１ａ−ＣＤ１４＋細胞を単離した。精製したＣＤ１ａ＋ＣＤ１４−細胞及びＣＤ１ａ−ＣＤ１４＋細胞集団は、ＧＭ−ＣＳＦ及びＴＮＦ−αの存在下で、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）（１μＭ）を添加して又は添加しないでさらに２日間培養した。アポトーシス細胞をアネキシンＶ−ＦＩＴＣ染色（アポトーシスマーカー）と、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ；生存プローブ）とを組み合わせて用いてモニターした。各サイトグラムに示すパーセンテージは、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ及び／又はヨウ化プロピジウムに対する陽性染色細胞のパーセンテージを示す。アネキシンＶ−ＦＩＴＣに陽性の細胞数はＡｃｔｉｍｉｄ（商標）処理細胞及び対照細胞で同等であった（特に各サイトグラムのＢ３とＢ４を比較）。Ａ：ＤＭＳＯで処理したＣＤ１ａ＋ＣＤ１４−細胞。Ｂ：Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）で処理したＣＤ１ａ＋ＣＤ１４−細胞。Ｃ：ＤＭＳＯで処理したＣＤ１ａ−ＣＤ１４＋細胞。Ｄ：Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）で処理したＣＤ１ａ−ＣＤ１４＋細胞。詳細については第６．６節参照。
図２４（Ａ−Ｄ）は、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）の存在下又は不在下で１２日間増殖させたＣＤ３４＋細胞のフローサイトグラムである。Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）によって、マンノース受容体媒介型のエンドサイトーシスが低減し、これはＤＭＳＯ対照と比較してＦＩＴＣ標識デキストランの取り込みの低減により示される。Ａ：ＤＭＳＯ及び４℃。Ｂ：Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）及び４℃。Ｃ：ＤＭＳＯ及び３７℃。Ｄ：Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）及び３７℃。各サイトグラムに示すパーセンテージは、エンドサイトーシスを示す細胞の画分を示す。詳細については第６．６節参照。
図２５（Ａ−Ｄ）は、１２日間培養し、第６日〜第１２日にＡｃｔｉｍｉｄ（商標）の存在下又は不在下で培養したＣＤ３４＋細胞のフローサイトグラムである。第１日〜第５日にＡｃｔｉｍｉｄ（商標）の不在下で培養した後、第６日〜第１２日にＡｃｔｉｍｉｄ（商標）の存在下で培養すると、ＤＭＳＯ対照と比較してマンノース受容体媒介型のエンドサイトーシスは同等となる。各サイトグラムに示すパーセンテージは、エンドサイトーシスを示す細胞の画分を示す。Ａ：ＤＭＳＯ及び４℃。Ｂ：Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）及び４℃。Ｃ：ＤＭＳＯ及び３７℃。Ｄ：Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）及び３７℃。詳細については第６．６節参照。
図２６は、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）が１２日間培養したＣＤ３４＋細胞の抗原提示能を低減することを示す。ＣＤ３４＋細胞をＡｃｔｉｍｉｄ（商標）の存在下又は不在下で１２日間培養した。Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）処理細胞は、第１２日において、ＤＭＳＯ対照と比較して刺激指数（stimulation index）の実質的な低減を示す。詳細については第６．６節参照。
図２７は、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）が、第６日〜第１２日にＡｃｔｉｍｉｄ（商標）中で培養したＣＤ３４＋細胞に及ぼすＡＰＣ低減活性をほとんど有しないことを示す。ＣＤ３４＋細胞は５日間培養し、Ａｃｔｉｍｉｄの存在下又は不在下で培養した。処理細胞の抗原提示能は、対照のＤＭＳＯ処理細胞と同等であった。詳細については第６．６節参照。
図２８は、ＧＭ−ＣＳＦ及びＴＮＦ−αの存在下で培養したＣＤ３４＋造血前駆細胞の分化経路を示す。
図２９は、ＧＭ−ＣＳＦ及びＴＮＦ−αの存在下で培養したＣＤ３４＋造血前駆細胞の分化経路に対するＡｃｔｉｍｉｄ（商標）の作用を示す図である。詳細については第６．６節参照。
図３０は、ネズミＳｃａ＋Ｌｉｎ造血前駆細胞の成熟条件を示すダイアグラムである。細胞を、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｌｔ−３Ｌ、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及びマクロファージ−コロニー刺激因子（ＭＣＳＦ）の存在下で、０．１％ＤＭＳＯ（対照）、１０μＭ Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）、又は１０μＭオールトランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ）の存在下で９日間増殖させて、細胞をＤＣ前駆細胞の表現型に導いた。その後、細胞をＧＭ−ＣＳＦ及びＴＮＦ−α、並びにＤＭＳＯ、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）又はＡＴＲＡの存在下で第９日〜第１２日において培養し、ネズミ細胞の未成熟樹状細胞への分化に導いた。詳細については第６．８節参照。
図３１（Ａ−Ｅ）は、正常培養条件における第９日に存在するネズミ細胞を示す（実施例１の材料及び方法、図３０の説明を参照）。細胞は、ＣＤ８０（図３１Ａ）、ＣＤ１１（図３１Ｂ）、ＣＤ３２／１６（図３１Ｃ）、ＭＨＣ ＩＩ（Ｉ−Ａｂ）（図３１Ｄ）、ＣＤ１４（図３１Ｅ）、又はＧｒ−１（図３１Ｆ）に対する抗体で標識した。第９日の細胞は、ＣＤ８８、ＣＤ１１及びＣＤ３２／１６マーカーに対する抗体による標識を示し、Ｉ−Ａｂマーカーに対する抗体による標識はほとんど示さず、ＣＤ１４又はＧｒ−１に対しては全く示さなかった。詳細については第６．８節参照。
図３２（Ａ−Ｉ）は、ＤＭＳＯ、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）又はＡＴＲＡで処理したネズミ細胞の第１２日におけるフローサイトグラムを示す。細胞は、ＣＤ８６及びＣＤ１１ｂに対する抗体で標識した。図３２Ａ〜３２Ｃ（上段）：ＤＭＳＯ（対照）、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）又はオールトランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ）で処理した場合の、ＣＤ８６を発現する細胞の割合（パーセンテージ）（Ｙ軸）を示すサイトグラム。図３２Ｄ〜３２Ｆ（中段）：主要組織適合性ＩＩ（ＭＨＣＩＩ）マーカーを発現する細胞の割合（パーセンテージ）（処理は上段に示している）。図３２Ｇ〜３２Ｉ（下段）：ＣＤ１１ｂを発現する細胞の割合（パーセンテージ）（処理は上段に示している）。詳細については第６．８節参照。
５．発明の詳細な説明
本発明は、一部には、幹細胞又は前駆細胞を本発明の化合物に暴露すると、幹細胞若しくは前駆細胞の、特定の前駆細胞集団への分化、あるいは前駆細胞の、樹状細胞、顆粒球、内皮細胞、神経細胞などの特定の細胞型への分化を制御する調節可能な手段になるという予想外の知見に基づく。特に、幹細胞又は前駆細胞を本発明の化合物に暴露すると、ＣＤ３４＋、ＣＤ３８＋、及びＣＤ１３３＋細胞を含む特定の造血細胞集団の分化及び増殖が調節可能になる。このような分化の調節は、細胞死のために収率がかなり損失したり、あるいは望ましくない細胞型又は細胞系統に分化したりすることなく実現されるが、換言すれば、本発明の化合物は、１種又は複数の細胞集団のアポトーシスを引き起こさない。さらに、造血前駆細胞を本発明の化合物に暴露すると、特定の細胞型の分化及び増殖が調節可能になる。
したがって、本発明は、ヒト幹細胞の分化、具体的にはＣＤ３４＋造血前駆細胞及びＣＤ１３３＋前駆細胞の分化をモジュレートする方法を提供する。特に、本発明は、ＴＮＦ−α活性を阻害する有機小分子を用いて、前駆細胞集団の分化を、特定の細胞及び組織系統にモジュレートする方法を提供する。さらに、本発明は、哺乳動物、鳥類、又は爬虫類に移植するための、ヒトＣＤ１３３＋又はＣＤ３４＋、特にＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞などの初期前駆細胞を増殖させる方法であって、造血前駆細胞をＴＮＦ−αの阻害剤又は拮抗剤に暴露するステップを含み、前記阻害剤又は拮抗剤が小分子である、上記方法を包含する。本発明は、脳、腎臓、腸管、及び筋肉の細胞を含むがこれに限定されるものではない、これら初期前駆細胞に由来する他の細胞型の製造方法も提供する。本発明の化合物は、ヒトＣＤ３４＋前駆細胞などの初期前駆細胞からの、樹状細胞への分化を抑制し、顆粒球への分化を促進する機能を有する。
本発明と共に使用することができる小分子化合物の例には、これに限定されるものではないが、ＴＮＦ−α活性を阻害する化合物が含まれうる。本発明の方法で使用しうる化合物を、第５．３節で詳細に述べる。一実施形態において、好ましい化合物は、サリドマイド類似体であるが、サリドマイドの加水分解産物、代謝物、誘導体及び前駆体も使用しうる。特に好ましい実施形態では、その化合物は、ＩＭｉＤｓ（商標）（Ｃｅｌｇｅｎｅ）、例えばＡｃｔｉｍｉｄ（商標）又はＲｅｖｉｍｉｄ（商標）である。
本発明の方法は、幹細胞又は前駆細胞の、間葉、造血、脂肪生成、肝臓形成、神経形成、神経膠形成、軟骨形成、血管形成、筋形成、軟骨形成、又は骨形成系統が含まれるがこれに限定されるものではない特定の細胞系統への分化の調節を包含し、これは、前記幹細胞又は前駆細胞を本発明の化合物と共に、好ましくはｉｎ ｖｉｔｒｏで、前記細胞が所望の細胞系統の細胞に分化するのに十分な時間にわたりインキュベートするステップを含む。具体的な実施形態では、幹細胞又は前駆細胞の、造血系統の細胞への分化をモジュレートする。特に、本発明の方法を使用すると、ＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋、及びＣＤ４５＋造血前駆細胞からの血球コロニーの生成を用量依存的にモジュレートすることができる。
本発明の方法は、ＣＤ３４＋前駆細胞の樹状細胞への分化の調節を含み、これは、前記前駆細胞を本発明の化合物と共に、好ましくはｉｎ ｖｉｔｒｏで、前記細胞が所望の細胞系統の細胞に分化するのに十分な時間にわたりインキュベートするステップを含む。具体的な実施形態では、そのような前駆細胞の、樹状細胞系統の細胞への分化は、前記細胞とＡｃｔｉｍｉｄ（商標）又はＲｅｖｉｍｉｄ（商標）、又はそれらの類似体若しくはプロドラッグとを接触させることによってモジュレートされる。別の具体的な実施形態では、ＣＤ３４＋前駆細胞の分化を、骨髄系統への分化を抑制し、顆粒球系統への分化を促進するようにモジュレートする。より具体的な実施形態では、ＣＤ３４＋前駆細胞の、顆粒球系統の細胞への分化を、ＣＤ３４＋前駆細胞と本発明の化合物とを、前記前駆細胞を培養する初日に接触させるステップを含む方法によってモジュレートする。
本発明の方法においては、臍帯血から単離した幹細胞（「ＣＢ」細胞）、胎盤から単離した幹細胞、及び他の供給源から単離した幹細胞が含まれるがこれに限定されるものではないいずれの哺乳動物幹細胞又は前駆細胞をも使用することができる。幹細胞には、多能性細胞、すなわち完全な分化多様性を有し、自己再生し、組織内で休止若しくは静止状態に止まることのできる細胞が含まれうる。幹細胞には、多分化能細胞又は単分化能前駆細胞も含まれうる。好ましい一実施形態では、本発明は、満期胎盤内に存在する、生きた静止状態の多能性幹細胞を使用するが、すなわち、このような細胞は、出生及び胎盤の排出がうまく行われ、瀉血及び灌流を行った後に回収することができ、その結果、多分化能幹細胞及び多能性幹細胞が回収される。
好ましい別の実施形態では、前駆細胞は、初期前駆細胞、特にＣＤ３４＋若しくはＣＤ１３３＋細胞である。ＣＤ３４＋若しくはＣＤ１３３＋前駆細胞は、ヒト骨髄、胎盤、又は臍帯血由来であることが好ましい。他の哺乳動物に由来する、これら細胞の等価物を使用してもよい。たとえば、マウスでは、Ｓｃａ＋前駆細胞を本発明の方法に使用することができる。鳥類又は爬虫類に由来する等価な初期前駆細胞を使用してもよい。
本発明の特定の実施形態では、胚様幹細胞、前駆細胞、多能性細胞、及び多分化能細胞が含まれるがこれに限定されるものではない、胎盤に内因性の細胞、又は灌流を行った分娩後胎盤によって産生された細胞を、分離し灌流が行われた胎盤中で培養する間に本発明の化合物に暴露し、分化を誘導する。灌流を行った分娩後胎盤中で増殖させた内因性細胞を回収してもよいし及び／又は灌流液、培地、若しくは胎盤細胞自体から生理活性分子を回収してもよい。
本発明の別の実施形態では、分娩後胎盤以外の供給源に由来する幹細胞又は前駆細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養する間に本発明の化合物に暴露し、分化を誘導する。したがって、本発明は、哺乳動物幹細胞を特定の前駆細胞に分化させるための方法であって、前記幹細胞を、所望の分化に適する条件下及び／若しくは培地中で、かつ本発明の化合物の存在下で分化させるステップを含む方法を包含する。
さらに、本発明は、特定の前駆細胞集団の、特定の細胞型への分化をモジュレート又は調節するための方法であって、前記前駆細胞を、前記分化に適する条件下、かつ１種又は複数の本発明の化合物の存在下で分化させるステップを含む方法を包含する。あるいは、幹細胞又は前駆細胞を本発明の化合物に暴露し、その後適切な条件を使用して分化させることができる。適切な条件の例には、ヒト血清を添加した栄養培地調製物、及び増殖因子を添加したＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）などの細胞培養基質が含まれる。
本発明の方法は、前駆細胞と本発明の化合物とを、培養中の増殖期又は分化期のいずれかの様々な時期に接触させることによって、異なる細胞集団を製造することができることを企図するものでもある。以下の第５．４節、詳細には第５．４．２節を参照されたい。
具体的な実施形態では、本発明は、造血前駆細胞の移植前の順化（conditioning）に関連して、アミド類及びイミド小分子、特にサリドマイドのアミノ結合体を用いて、造血をモジュレート又は調節する方法を提供する。
本発明は、造血前駆細胞のｅｘ ｖｉｖｏでの順化に関連して、本発明の小分子を用いて、造血をモジュレート及び調節する方法も提供する。本発明の方法は、幹細胞又は前駆細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの分化の調節であって、幹細胞又は前駆細胞を化合物と共にｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベートするステップと、その後分化した細胞を被験体に直接に移植するステップを含む、上記調節を包含する。
本発明はまた、必要とする患者に、本発明の幹細胞若しくは前駆細胞と化合物の両方を投与することによる、幹細胞又は前駆細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの制御又は調節を包含する。
本発明はさらに、疾患を治療又は予防するための、前処理幹細胞又は前駆細胞の移植を含む。一実施形態では、移植の必要のある患者に、移植前、移植中、及び／又は移植後に本発明の化合物を投与する。別の実施形態では、移植の必要のある患者に、未処理幹細胞又は前駆細胞、たとえば臍帯血細胞、成体血細胞、末梢血細胞、又は骨髄細胞を投与する。別の実施形態では、本発明の方法は、既に移植された幹細胞に対するモジュレート作用を誘発する目的で、順化させていない幹細胞又は前駆細胞のレシピエントである被験体に化合物を投与することを含む。
ある実施形態では、本発明は、骨髄移植であって、臍帯血（又は臍帯血から得た幹細胞）、末梢（すなわち生体）血（又は末梢血から得た幹細胞）を移植することを含み、前記臍帯血又は幹細胞が本発明の化合物で前処理したものである、上記骨髄移植を含む。さらに、本発明は、本発明の化合物の存在下で分化させた造血前駆細胞から生成された白血球の使用を含む。たとえば、造血前駆細胞を分化させて生成した白血球を、移植に使用したり、あるいは、移植に先立って臍帯血又は臍帯血幹細胞と混合することができる。
他の実施形態では、本発明は、骨髄移植であって、本発明の方法に従って得た、ＣＤ３４＋若しくはＣＤ１３３＋前駆細胞などの初期前駆細胞の移植を含み、前記前駆細胞が本発明の化合物で前処理したものである、上記骨髄移植を含む。本発明の一実施形態では、前記樹状細胞の前駆細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３３＋若しくはＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３３−前駆細胞である。さらに、本発明は、本発明の化合物の存在下で分化させたＣＤ３４＋前駆細胞から生成された細胞の使用を含む。たとえば、本発明の化合物を使用してＣＤ３４＋前駆細胞を分化させることによって生成されたＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３３＋前駆細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３３−前駆細胞、顆粒球などを移植に使用することができる。本発明の化合物を使用してＣＤ１３３＋細胞から分化させた細胞も、本発明に含まれる。
本発明はさらに、凍結保存及び解凍後に幹細胞を順化させて、凍結保存及び凍結保存剤への暴露が幹細胞に及ぼす有害な影響を無効にする方法を含む。ある実施形態では、本発明は、凍結保存及び解凍後に幹細胞を順化させて、凍結保存剤（たとえばＤＭＳＯ）への暴露が幹細胞の増殖及び遊走能力に及ぼす有害な影響を無効にする方法を提供する。
５．１．幹細胞及びＣＤ３４ ＋ 若しくはＣＤ１３３ ＋ 前駆細胞の分化のモジュレーション
５．１．１．幹細胞
本発明は、ヒト幹細胞の分化をモジュレートする方法を提供する。ある実施形態では、本発明の方法は、幹細胞又は前駆細胞の分化のｉｎ ｖｉｔｒｏでの調節を含み、これは、前記幹細胞を化合物と共にｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベートした後、分化した細胞を被験体に直接に移植することを含むものである。他の実施形態では、本発明の方法は、幹細胞又は前駆細胞の分化のｉｎ ｖｉｖｏでの調節を含み、これは、順化させていない幹細胞のレシピエントである被験体に化合物を送達した後、その被験体に化合物を直接に投与することを含むものである。
本発明の方法によって得られる胚様幹細胞は、間葉、造血、脂肪生成、肝臓形成、神経形成、神経膠形成、軟骨形成、血管形成、筋形成、軟骨形成、又は骨形成系統が含まれるがこれに限定されるものではない特定の細胞系統への分化を誘導することができる。
ある実施形態では、移植及びｅｘ ｖｉｖｏの治療プロトコルでの使用のために、本発明の方法に従って得た胚様幹細胞の分化を誘導する。ある実施形態では、本発明の方法によって得た胚様幹細胞を特定の細胞型に分化させ、さらに遺伝子の改変を行って、治療用の遺伝子産物を得る。具体的な実施形態では、本発明の方法によって得た胚様幹細胞を、有機小分子など、この細胞の分化を誘導する化合物と共にインキュベートした後、分化した細胞を被験体に直接移植する。好ましい実施形態では、幹細胞の分化を制御又は調節するのに使用する化合物は、ポリペプチド、ペプチド、タンパク質、ホルモン、サイトカイン、オリゴヌクレオチド、又は核酸ではない。
本発明において使用しうる幹細胞には、臍帯血（ＣＢ）細胞、胎盤細胞、胚幹（ＥＳ）細胞、胚様幹細胞、栄養芽幹細胞、前駆細胞、骨髄幹細胞、並びに多分化能、多能性、及び全能性細胞が含まれるがこれに限定されるものではない。
特に、本発明の方法は、幹細胞集団、さらには間葉幹細胞の、特定の組織系統への分化の調節を含む。たとえば、本発明の方法を用いると、特定の筋骨格の再生及び修復、血管新生；心筋や骨格筋など、特定の筋肉組織の再増殖、並びに脳、脊髄、肝臓、肺、腎臓、及び膵臓が含まれるがこれに限定されるものではない様々な臓器及び組織の血管再生の促進によって、多分化能幹細胞の、軟骨形成、血管形成、筋形成、及び骨形成系統の細胞への分化を調節することができる。本発明の方法を用いて、多分化能幹細胞の、脂肪生成、軟骨形成、骨形成、神経形成、又は肝臓形成系統の細胞への分化を調節することができる。
分化のモジュレートに使用する薬剤を、灌流を行った分娩後胎盤に導入して、胎盤中で培養されている細胞の分化を誘導することができる。あるいは、細胞を胎盤から回収又は取り出した後、この薬剤を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで分化をモジュレートすることができる。
本発明の方法は、前駆幹細胞の、造血系統の細胞への分化の調節を含み、これは、前駆幹細胞を、化合物と共に、その細胞が造血系統に分化するのに十分な時間にわたりｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベートすることを含むものである。特に、本発明の方法を使用すると、ＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋、及びＣＤ４５＋造血前駆細胞からの血球コロニーの生成を、用量依存的にモジュレートすることができる（用量についての説明は、第５．７節を参照のこと）。
本発明の方法を使用して、赤血球又は赤血球形成コロニー（ＢＦＵ−Ｅ及びＣＦＵ−Ｅ）の生成を特異的に抑制し、白血球及び血小板形成コロニー（ＣＦＵ−ＧＭ）の生成を増大させ、総コロニー形成単位生成を増強することが好ましい。本発明の方法を使用すると、幹細胞の分化を調節することができるだけでなく、コロニー形成速度を刺激することもできるので、骨髄移植片の生着速度並びに白血球及び／又は血小板生成の回復が向上して、造血幹細胞移植にかなりの利益がもたらされる。
他の実施形態では、本発明の方法を使用して、たとえば、ニューロン前駆細胞又は神経芽細胞の、感覚ニューロン（たとえば、網膜細胞、嗅細胞、機械感覚ニューロン、化学受容性ニューロンなど）、運動ニューロン、皮質ニューロン、又は介在ニューロンなど、特定のニューロン細胞型への分化を調節することができる。他の実施形態では、本発明の方法を使用して、コリン作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、グリア細胞（ミエリンを産生する乏突起膠細胞）、及び（脳室系に沿って並ぶ）上衣細胞を含むがこれに限定されるものではない細胞型の分化を調節することができる。さらに他の実施形態では、本発明の方法を使用して、心臓のプルキンエ細胞、肝臓の胆管上皮細胞、膵臓の膵島β細胞、腎皮質若しくは腎髄質細胞、及び眼の網膜光受容体を含むがこれに限定されるものではない、臓器を構成する細胞の分化を調製することができる。
本発明の方法に従って得た幹細胞の分化状態の評価については、細胞表面マーカーの存在によって特定することができる。本発明の胚様幹細胞は、たとえば、細胞表面マーカーのＯＣＴ−４＋及びＡＢＣ−ｐｔによって識別することができる。さらに、本発明は、上述のように、胚様幹細胞で、ＣＤ１０、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ９０、ＳＨ２、ＳＨ３、ＳＨ４、ＯＣＴ−４、及びＡＢＣ−ｐのマーカーを有するもの、又はＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＳＳＥＡ３、及びＳＳＥＡ４の細胞表面マーカーを欠損するものを含む。このような細胞表面マーカーは、当技術分野で周知の方法に従って、たとえばフローサイトメトリーの後に、洗浄し、抗細胞表面マーカー抗体で染色することによって常法どおりに決定する。たとえば、ＣＤ３４又はＣＤ３８の有無を判定するために、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、次いで、抗ＣＤ３４フィコエリトリン及び抗ＣＤ３８フルオレセインイソチオシアネート（ベクトンディッキンソン、米国カリフォルニア州マウンテンヴュー）で二重染色することができる。
５．１．２．ＣＤ３４ ＋ 及びＣＤ１３３ ＋ 初期前駆細胞
本発明は、ヒトＣＤ３４＋若しくはＣＤ１３３＋細胞の分化をモジュレートする方法を提供する。ある実施形態では、本発明の方法は、幹細胞を化合物と共にｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベートした後、分化した細胞を被験体に直接移植することを含む、幹細胞又は前駆細胞の分化のｉｎ ｖｉｔｒｏでの調節を含む。
本発明の方法によって得た前駆細胞は、ＣＤ３４＋前駆細胞では骨髄若しくは顆粒球系統、及びＣＤ１３３＋細胞では内皮若しくは神経細胞系統を含むがこれに限定されるものではない、特定の細胞系統に分化させることができる。ある実施形態では、移植及びｅｘ ｖｉｖｏ治療プロトコルでの使用のために前駆細胞の分化を誘導する。ある実施形態では、前駆細胞の特定の細胞型への分化を誘導し、また前駆細胞に遺伝子改変を行って、治療用の遺伝子産物を得る。特定の実施形態では、前駆細胞を、有機小分子など、この細胞の分化を誘導する化合物と共にｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベートした後、分化した細胞を被験体に直接移植する。好ましい実施形態では、幹細胞の分化を制御又は調節するのに使用する化合物は、ポリペプチド、ペプチド、タンパク質、ホルモン、サイトカイン、オリゴヌクレオチド、又は核酸ではない。別の好ましい実施形態では、前駆細胞をＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３３＋若しくはＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３３−前駆細胞に分化させる。
本発明の方法を使用して、赤血球又は赤血球形成コロニー（ＢＦＵ−Ｅ及びＣＦＵ−Ｅ）の生成を特異的に抑制し、白血球及び血小板形成コロニー（ＣＦＵ−ＧＭ）の生成を増大させ、総コロニー形成単位生成を増強することが好ましい。本発明の方法を使用すると、幹細胞の分化を調節することができるだけでなく、コロニー形成速度を刺激することもできるので、骨髄移植片の生着速度、並びに白血球及び／又は血小板生成の回復が向上して、造血幹細胞移植にかなりの利益がもたらされる。
他の実施形態では、本発明の方法を使用して、ＣＤ３４＋前駆細胞の、ＣＤ１ａ＋細胞、特にＣＤ８６＋ＣＤ１ａ＋細胞への分化を低減することができる。別の実施形態では、本発明の方法を使用して、ＣＤ３４＋前駆細胞の、ＣＤ１４＋ＣＤ１ａ−細胞への分化を低減又は抑制することができる。ＣＤ１４＋ＣＤ１ａ−細胞は、皮膚の樹状細胞又は単球／マクロファージの前駆細胞である。別の実施形態では、本発明の方法を使用して、増殖性のＣＤ３４＋前駆細胞上での共刺激分子ＣＤ８０及びＣＤ８６の発現を低減することができる。別の実施形態では、本発明の方法を使用して、増殖性ＣＤ３４＋前駆細胞の、ＣＤ５４ｂｒｉｇｈｔ細胞への分化を低減し、ＣＤ５４ｄｉｍ細胞への分化を促進することができる。別の実施形態では、本発明の方法を使用して、内皮細胞の前駆細胞であるＣＤ１３３＋細胞数を増加させることができる。さらに別の実施形態では、本発明の方法を使用して、増殖性ＣＤ３４＋細胞の、ＣＤ１１ｃ−ＣＤ１５＋細胞への分化を低減し、ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１５−細胞への分化を増大させることができ、すなわち骨髄樹状細胞系統から顆粒球系統へと分化をシフトさせることができる。
本発明の方法に従って得た幹細胞の分化状態の評価については、細胞表面マーカーの存在によって特定することができる。本発明の前駆細胞は、たとえば、ＣＤ３４＋又はＣＤ１３３＋細胞表面マーカーによって識別することができる。さらに、本発明は、上述のように、ＣＤ１５、ＣＤ３４、ＣＤ３３、ＣＤ１３３、若しくはＣＤ５４ｄｉｍのうちの１種又は複数のマーカーを有するか、又はその発現が対照よりも増大を示す増殖性前駆細胞を含む。本発明はさらに、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１ａ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ３８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ５４ｂｒｉｇｈｔ、若しくはＣＤ１４のうちの１種又は複数のマーカーを欠損するか、又はその発現が対照よりも低減を示す増殖性前駆細胞を含む。好ましい実施形態では、本発明の増殖性前駆細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３３＋又はＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３３−を示す。このような細胞表面マーカーは、当技術分野で周知の方法に従って、たとえば、洗浄し、抗細胞表面マーカー抗体で染色し、その後フローサイトメトリーを行うことによって常法どおりに決定する。たとえば、ＣＤ３４又はＣＤ３８の有無を判定するには、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、次いで、抗ＣＤ３４フィコエリトリン及び抗ＣＤ３８フルオレセインイソチオシアネート（ベクトンディッキンソン、米国カリフォルニア州マウンテンヴュー）で二重染色することができる。
ある実施形態では、分化した細胞の貪食能の特性決定ことによって、分化した細胞の特性決定を行うことができる。分化した、又は分化途中の細胞の貪食能は、たとえば、デキストランをＦＩＴＣで標識し、既知の方法によって取り込み量を測定して評価することができる。分化した、又は分化途中の細胞のＴ細胞刺激能は、抗原担持細胞を推定に基づきＴ細胞と混合し、Ｔ細胞の活性化レベルを測定するという混合白血球反応（ＭＬＲ）で評価することができる。
５．１．３．細胞の同定及び特性決定
ある実施形態では、示差的に発現される遺伝子の特性決定（たとえば、目的の未分化前駆細胞の遺伝子プール対その前駆細胞由来の分化した細胞の遺伝子プールの特性決定）によって、分化した細胞を同定することができる。たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの核酸増幅法、転写に基づく増幅法（たとえば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ））を使用すると、たとえばポリヌクレオチドマイクロアレイを使用して、異なる細胞集団の遺伝子発現のプロファイリングを行うことができる。示差的な遺伝子発現をプロファイリングする方法は、当技術分野で周知である（たとえば、Wielandら、Proc.Natl.Acad:Sci.USA第87巻:2720〜2724ページ(1990年)；Lisitsynら、Science第259巻:946〜951ページ(1993年)；Lisitsynら、Meth.Enzymology第254巻:291〜304ページ(1995年)；米国特許第５，４３６，１４２号；米国特許第５，５０１，９６４号；Lisitsynら、Nature Genetics第6巻:57〜63ページ(1994年)；Hubank及びSchatz、1994年、Nucleic Acids Research第22巻:5640〜5648ページ；Zengら、1994年、Nucleic Acids Research第22巻:4381〜4385ページ；米国特許第５，５２５，４７１号；「RNA amplification method」と題された、Linsleyら、２００１年８月７日発行の米国特許第６，２７１，００２号；「Processes for genetic manipulations using promoters」と題された、Van Gelderら、１９９８年２月１０日発行の米国特許第５，７１６，７８５号；Stofletら、1988年、Science第239巻:491〜494ページ、1988年；Sarkar及びSommer、1989年、Science第244巻:331〜334ページ；Mullisら、米国特許第４，６８３，１９５号；Malekら、米国特許第５，１３０，２３８号；Kacian及びFultz、米国特許第５，３９９，４９１号；Burgら、米国特許第５，４３７，９９０号；R. N Van Gelderら(1990年)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA第87巻、1663ページ；D.J.Lockhartら、1996年、Nature Biotechnol.第14巻、1675ページ；Shannon、米国特許第６，１３２，９９７号；「Procedure for subtractive hybridization and difference analysis」と題された、Lindemannら、２００１年５月２２日公開の米国特許第６，２３５，５０３号を参照のこと）。
市販のキット、たとえば、遺伝子発現のプロファイリングにゲルに基づく手法を使用するｄｉｓｐｌａｙＰＲＯＦＩＬＥ（商標）シリーズのキット（Qbiogene、米国カリフォルニア州Carlsbad）を遺伝子プロファイリングに利用できる。このキットは、制限断片長示差的表示ＰＣＲ（ＲＦＤＤ−ＰＣＲ）を利用して、真核生物細胞の遺伝子発現パターンを比較するものである。ＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）及びＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用することもできるが、そうすると、サブトラクトされたライブラリー中で、示差的に発現されたクローンの同定が可能になる。ＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎキットを用い、示差的に発現された遺伝子のプールを作製した後、ＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇキットを使用する。サブトラクトされたライブラリーに、テスター集団及びドライバー集団から直接に合成したプローブ、サブトラクトしたｃＤＮＡから作製したプローブ、及び逆サブトラクト（逆に実施した２回目のサブトラクト）したｃＤＮＡから作製したプローブをハイブリダイズさせる。テスタープローブにハイブリダイズするが、ドライバープローブにはハイブリダイズしないクローンが示差的に発現されるが、しかし、サブトラクトしたものでないプローブは、わずかなメッセージを検出するには感度が十分ではない。サブトラクトしたプローブは、示差的に発現されたｃＤＮＡに非常に富むが、偽陽性の結果を与えることもある。製造者（Clontech）の指示に従って、サブトラクトしたプローブとサブトラクトしたものでないプローブの両方を使用すると、示差的に発現された遺伝子が同定される。
別の実施形態では、Ｍｅｓｅｎ Ｃｕｌｔ（商標）培地（Stem Cell Technologies,Inc.、カナダ国ブリティッシュコロンビア州バンクーバー）など、当技術分野で一般に知られているコロニー形成単位アッセイによって、分化した幹細胞又は前駆細胞の同定及び特性決定を行う。
幹細胞又は前駆細胞が、特定の細胞型に分化したかどうかの判定は、当技術分野で周知の方法によって、たとえば、フローサイトメトリー又は免疫細胞化学（たとえば、組織特異的又は細胞マーカー特異的な抗体を用いた染色）などの技術を使用して、形態及び細胞表面マーカーの変化を測定することによって、あるいは光学若しくは共焦点顕微鏡法を使用して細胞の形態を調べることによって、あるいはＰＣＲや遺伝子発現プロファイリングなど、当技術分野で周知の技術を使用して遺伝子発現の変化を測定することによって実施することができる。
５．２．幹細胞及び前駆細胞集団
本発明は、ヒト幹細胞の分化をモジュレートする方法を提供する。臍帯血から単離された幹細胞（ＣＢ細胞）、末梢血、成体血、骨髄、胎盤、間葉幹細胞、及び他の供給源から単離された幹細胞が含まれるがこれに限定されるものではない、任意の哺乳動物幹細胞を本発明の方法の範囲内で使用することができる。好ましくない実施形態では、幹細胞は、胚幹細胞、又は胎盤以外の供給源から単離された細胞である。
間葉幹細胞の供給源には、骨髄、胚卵黄嚢、胎盤、臍帯、胎児及び青年の皮膚、及び血液が含まれる。骨髄細胞は、たとえば、腸骨稜、大腿、脛骨、脊椎、肋骨、又は他の髄質の空間から得ることができる。
本発明の方法に従って使用することになる幹細胞には、多能性細胞、すなわち完全な分化多様性を有し、自己再生性であり、組織内で休止若しくは静止状態に止まることのできる細胞が含まれうる。幹細胞には、多分化能細胞、単分化能前駆細胞、及び線維芽細胞も含まれうる。好ましい一実施形態では、本発明は、瀉血及び灌流を行った満期胎盤から単離した、生きた静止状態の多能性幹細胞である幹細胞を利用する。
幹細胞集団は、商業的サービス、たとえば、LifeBank USA（米国ニュージャージー州Cedar Knolls）、ViaCord（米国マサチューセッツ州ボストン）、Cord Blood Registry（米国カリフォルニア州サンブルーノ）、及びCryocell（米国フロリダ州クリアウォーター）を通して入手した胎盤幹細胞からなっていてよい。
幹細胞集団は、「Method of Collecting Placental Stem Cells」と題された、２００２年９月５日公開の米国特許出願公開第２００２０１２３１４１号、及び「Post-Partum Mammalian Placenta, Its Use and Placental Stem Cells Therefrom」と題された、２００３年２月１３日公開の米国特許出願公開第２００３００３２１７９号で開示されている方法に従って回収した胎盤幹細胞からなっていてもよい（両特許の全体を参照により本明細書に援用する）。
一実施形態では、臍帯血由来の幹細胞を使用してよい。胎盤から最初に回収した血液を臍帯血と呼ぶが、これは、主にＣＤ３４＋及びＣＤ３８＋造血前駆細胞を含んでいる。分娩後灌流を行って最初の２４時間以内に、胎盤から高濃度のＣＤ３４＋ＣＤ３８−造血前駆細胞を単離することができる。灌流を行って約２４時間後には、前述の細胞と共に、高濃度のＣＤ３４−ＣＤ３８−細胞を胎盤から単離することができる。単離され、灌流を行った本発明の胎盤は、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−幹細胞及びＣＤ３４−ＣＤ３８＋幹細胞に富む大量の幹細胞の供給源となる。単離された胎盤に２４時間以上灌流を行ったものは、ＣＤ３４−及びＣＤ３８−幹細胞に富む大量の幹細胞の供給源となる。
本発明に従って使用する好ましい細胞は、瀉血及び灌流を行った胎盤に由来する胚様幹細胞、又は胎盤胚様幹細胞に由来する細胞である。本発明の胚様幹細胞は、フローサイトメトリー及び免疫細胞化学などの技術を使用して形態及び細胞表面マーカーの変化を測定し、またＰＣＲなどの技術を使用して遺伝子発現の変化を測定することによって特性決定することができる。本発明の一実施形態では、このような胚様幹細胞は、細胞表面マーカーＣＤ１０、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ９０、ＳＨ２、ＳＨ３、ＳＨ４、ＯＣＴ−４、及びＡＢＣ−ｐが存在すること、又は細胞表面マーカーＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＳＳＥＡ３、及びＳＳＥＡ４が存在しないことによって特性決定することができる。好ましい実施形態では、こうした胚様幹細胞は、細胞表面マーカーＯＣＴ−４及びＡＰＣ−ｐの存在によって特性決定することもできる。このような細胞表面マーカーは、当技術分野で周知の方法に従って、たとえば、フローサイトメトリーの後に、洗浄し、抗細胞表面マーカー抗体で染色することによって常法どおりに決定する。たとえば、ＣＤ３４又はＣＤ３８細胞の有無を判定するには、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、次いで抗ＣＤ３４フィコエリトリン及び抗ＣＤ３８フルオレセインイソチオシアネート（ベクトンディッキンソン、米国カリフォルニア州マウンテンヴュー）で二重染色することができる。
胎盤に由来する胚様幹細胞は、胚幹細胞の特徴を有するが、胚由来ではない。換言すれば、本発明は、灌流を行った分娩後胎盤から単離される未分化の幹細胞であるＯＣＴ−４＋及びＡＢＣ−ｐ＋細胞の使用を含む。この種の細胞は、ヒト胚幹細胞と同じく多様性（たとえば多能性）である。上述のように、灌流を行った胎盤から、異なる時期に、数種の異なる多能性若しくは多分化能幹細胞、たとえば、ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−、及びＣＤ３４−ＣＤ３８−造血細胞を単離することができる。本発明の方法においては、出産後のヒト胎盤を、胚様幹細胞の供給源として使用する。
たとえば、胎盤は、アポトーシスを防止し、又は最小に抑えるために、子宮から排出された後できるだけ速く瀉血を行う。続いて、瀉血後できるだけ速やかに胎盤に灌流を行って、血液、残りの細胞、タンパク質、諸因子、及び臓器中に存在する他の物質を除去する。また、胎盤から壊死組織片を除去する。灌流は、通常、適切な灌流液を用いて少なくとも２時間〜２４時間以上続ける。幾例かの追加の実施形態では、少なくとも４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、及び２２時間にわたり胎盤の灌流を行う。換言すれば、本発明は、少なくとも一部には、十分な時間にわたり瀉血及び灌流を行うことによって、分娩後胎盤の細胞を活性化することができるという知見に基づく。したがって、胎盤は、胚様幹細胞の高品位で豊富な供給源として容易に使用でき、この胚様幹細胞を、薬物の発見、疾患の治療及び予防、特に移植手術又は移植療法、並びに単分化能細胞、組織、及びオルガノイドの生成を含む研究に使用することができる。「Method of Collecting Placental Stem Cells」と題された、２００１年１２月５日出願の同時係属出願第１０／００４，９４２号、及び「Post-Partum Mammalian Placenta, Its Use and Placental Stem Cells Therefrom」と題された、２００２年２月１３日出願の出願第１０／０７６，１８０号を参照されたい。これら両出願の全体を参照により本明細書に援用する。
胚様幹細胞は、臍動脈及び臍静脈のどちらか又は両方を利用する灌流技術によって、排液処置した胎盤から抽出する。胎盤には、残った血液（たとえば、残った臍帯血）の瀉血及び回収によって排液処置を施すことが好ましい。次いで、排液処置した胎盤を、その中に実質組織及び血管外空間内に存在する残りの胚様幹細胞が補充されるｅｘ ｖｉｖｏの自然のバイオリアクター環境が確立されるように処理する。胚様幹細胞は、排液処置された空の微小循環へと遊走し、本発明の方法により、そこで、好ましくは灌流によって回収容器に洗い流すことにより、その幹細胞を回収する。
本発明の一部として特に企図するのは、ＣＤ３４＋及びＣＤ１３３＋前駆細胞が骨髄細胞、特に樹状細胞又は顆粒球になるのをモジュレートすることである。最近の報告では、そのような細胞が多能性であることが示されているので、本発明は、これらの前駆細胞の、脳、腎臓、腸管、肝臓、又は筋肉の細胞への発達をモジュレートすることも企図する。
臍帯血から単離された幹細胞（ＣＢ細胞）、末梢血、成体血、骨髄、灌流を行った胎盤（「Post-Partum Mammalian Placenta, Its Use and Placental Stem Cells Therefrom」と題された、その全体が参照により本明細書に援用される２００３年２月１３日公開の米国特許出願公開第２００３００３２１７９号を参照のこと）を含む胎盤、間葉幹細胞、及び他の供給源から単離された幹細胞が含まれるがこれに限定されるものではない、任意の哺乳動物、鳥類、又は爬虫類のＣＤ３４＋若しくはＣＤ１３３＋幹細胞又は前駆細胞を、本発明の範囲内で使用することができる。好ましい実施形態では、幹細胞は、造血幹細胞、又は骨髄から単離された細胞である。この種の細胞は、他の臓器又は組織から得ることもできるが、そのような供給源はそれほど好ましくない。
一実施形態では、臍帯血又は分娩後胎盤由来の前駆細胞を使用することができる。上述のように、臍帯血は、主にＣＤ３４＋及びＣＤ３８＋造血前駆細胞を含んでいる。分娩後灌流の最初の２４時間以内では、単離され、灌流を行った胎盤から、高濃度のＣＤ３４＋ＣＤ３８−造血前駆細胞を単離することができる。灌流を行って約２４時間後には、前述の細胞と共に、高濃度のＣＤ３４−ＣＤ３８−細胞を胎盤から単離することができる。別の実施形態では、商業的サービス、たとえば、LifeBank USA（米国ニュージャージー州Cedar Knolls）、ViaCord（米国マサチューセッツ州ボストン）、Cord Blood Registry（米国カリフォルニア州サンブルーノ）、及びCryocell（米国フロリダ州クリアウォーター）を通じて前駆細胞集団を入手してもよい。
５．３．本発明の化合物
本発明において使用する化合物は、本明細書において「免疫調節化合物（immunomodulatory compound）」といい、ラセミ体、立体異性体を多量に含む又は立体異性体として純粋である免疫調節化合物、並びにその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、立体異性体、多形体及びプロドラッグを含む。本発明において使用するのに好ましい化合物は、分子量が約１０００ｇ／ｍｏｌ未満の有機小分子であり、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、オリゴ糖又は他の高分子ではない。
特に指摘しない限り、本明細書において使用する用語「立体異性体として純粋な」とは、ある化合物の１の立体異性体を含み、その化合物の他の立体異性体は実質的に含まないことを意味する。例えば、キラル中心を１つ有する化合物の立体異性体として純粋な組成物は、その化合物の反対のエナンチオマーを実質的に含まないことになる。キラル中心を２つ有する化合物の立体異性体として純粋な組成物は、その化合物の他のジアステレオマーを実質的に含まない。特に指摘しない限り、本明細書において使用する用語「エナンチオマーとして純粋な」とは、キラル中心を１つ有する化合物の立体異性体として純粋な組成物を意味する。特に指摘しない限り、本明細書において使用する用語「立体異性体を多量に含む」とは、ある化合物の１つの立体異性体を約６０重量％以上、好ましくは約７０重量％以上、より好ましくは約８０重量％以上含む組成物を意味する。本明細書において使用する用語「エナンチオマーとして純粋な」とは、キラル中心を１つ有する化合物の立体異性体として純粋な組成物を意味する。同様に、用語「エナンチオマーを多量に含む」とは、キラル中心を１つ有する化合物の立体異性体を多量に含む組成物を意味する。
特に指摘しない限り、本明細書において使用する用語「免疫調節化合物」、又は本明細書において使用する「ＩＭｉＤｓ（商標）」（Ｃｅｌｇｅｎｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）は、ＴＮＦ−α、ＬＰＳ誘導型単球ＩＬ１β及びＩＬ１２を顕著に阻害する、特にＩＬ６産生を阻害する有機小分子を包含する。本発明の具体的な免疫調節化合物については後述する。これらの化合物は、市販のものとして、例えば、Ｃｅｌｇｅｎｅから入手してもよいし、又は、本明細書において例示した特許若しくは刊行物に記載の方法に従って調製することもできる。
ＴＮＦ−αは、急性炎症の過程でマクロファージ及び単球により産生される炎症性サイトカインである。ＴＮＦ−αは細胞内における多様なシグナル伝達事象の原因となる。ＴＮＦ−αは、癌において病理学的役割を果たすと考えられる。特定の理論に制限されるものではないが、本発明の免疫調節化合物により発揮される生物学的作用は、ＴＮＦ−αの合成の低減である。また本発明の免疫調節化合物はＴＮＦ−α ｍＲＮＡの分解を促進する。
さらに、特定の理論に制限されるものではないが、本発明において使用する免疫調節化合物はまた、Ｔ細胞の強力な共刺激因子である可能性があり、用量依存的に細胞増殖を顕著に増大する。本発明の免疫調節化合物は、ＣＤ４＋Ｔ細胞小集団よりもＣＤ８＋Ｔ細胞小集団に対してより大きな共刺激作用を有しうる。さらに、化合物は、抗炎症特性を有し、Ｔ細胞を効率的に共刺激することが好ましい。
本発明の免疫調節化合物の具体的な例としては、限定するものではないが、例えば米国特許第５，９２９，１１７号に開示されている置換スチレンのシアノ及びカルボキシ誘導体；例えば米国特許第５，８７４，４４８号に開示されている１−オキソ−２−（２，６−ジオキソ−３−フルオロピペリジン−３−イル）イソインドリン類、及び１，３−ジオキソ−２−（２，６−ジオキソ−３−フルオロピペリジン−３−イル）イソインドリン類；例えば米国特許第５，７９８，３６８号に記載されているテトラ置換２−（２，６−ジオキソピペリジン−３−イル）−１−オキソイソインドリン類；例えば限定されるものではないが、米国特許第５，６３５，５１７号に開示されている１−オキソ及び１，３−ジオキソ−２−（２，６−ジオキソピペリジン−３−イル）イソインドリン類（例えばサリドマイド及びＥＭ−１２の４−メチル誘導体）；並びに、同第５，６９８，５７９号及び同第５，８７７，２００号に開示されている非ポリペプチド環状アミドのクラスが含まれる。本明細書で特定した特許はそれぞれその全文が本明細書に参照により援用される。本発明の免疫調節化合物としては、サリドマイドは含まれない。
本発明の免疫調節化合物の他の具体例としては、限定されるものではないが、ベンゾ環においてアミノ又は置換アミノで置換された、１−オキソ−及び１，３ジオキソ−２−（２，６−ジオキソピペリジン−３−イル）イソインドリン類（本明細書に援用される米国特許第５，６３５，５１７号に記載）が挙げられる。これらの化合物は、下記式Ｉ：
Figure 2006500911
〔式中、
Ｘ及びＹの一方はＣ＝Ｏであり、Ｘ及びＹの他方はＣ＝Ｏ又はＣＨ２であり、
Ｒ２は水素又は低級アルキル（特にメチル）である。〕
を有する。具体的な免疫調節化合物としては、限定されるものではないが、以下のものが挙げられる：
１−オキソ−２−（２，６−ジオキソピペリジン−３−イル）−４−アミノイソインドリン；
１−オキソ−２−（２，６−ジオキソピペリジン−３−イル）−５−アミノイソインドリン；
１−オキソ−２−（２，６−ジオキソピペリジン−３−イル）−６−アミノイソインドリン；
１−オキソ−２−（２，６−ジオキソピペリジン−３−イル）−７−アミノイソインドリン；
１，３−ジオキソ−２−（２，６−ジオキソピペリジン−３−イル）−４−アミノイソインドリン；及び
１，３−ジオキソ−２−（２，６−ジオキソピペリジン−３−イル）−５−アミノイソインドリン。
本発明の免疫調節化合物の他の具体例は、置換２−（２，６−ジオキソピペリジン−３−イル）フタルイミド類及び置換２−（２，６−ジオキソピペリジン−３−イル）−１−オキソイソインドール類のクラスに属し、例えば、米国特許第６，２８１，２３０号、同第６，３１６，４７１号、同第６，３３５，３４９号、及び同第６，４７６，０５２、並びに国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／１３３７５号（国際公開ＷＯ９８／０３５０２号）（その全文を本明細書に援用する）に記載されている。このクラスの代表的な化合物は以下の式：
Figure 2006500911
Figure 2006500911
〔式中、Ｒ１は水素又はメチルである。〕
を有する。別の実施形態において、本発明は、上記化合物のエナンチオマーとして純粋な形態（例えば、光学的に純粋な（Ｒ）又は（Ｓ）エナンチオマー）の使用を包含する。
本発明の免疫調節化合物のまた別の具体例は、イソインドール−イミド類のクラスに属し、米国特許出願第１０／０３２，２８６号及び同０９／９７２，４８７号、並びに国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／５０４０１号（国際公開ＷＯ０２／０５９１０６号）（参照により本明細書に援用する）に開示されている。その代表的な化合物は、式ＩＩ：
Figure 2006500911
〔式中、
Ｘ及びＹの一方はＣ＝Ｏであり、Ｘ及びＹの他方はＣＨ２又はＣ＝Ｏであり、
Ｒ１は、Ｈ、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、（Ｃ３−Ｃ７）シクロアルキル、（Ｃ２−Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ８）アルキニル、ベンジル、アリール、（Ｃ０−Ｃ４）アルキル−（Ｃ１−Ｃ６）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ０−Ｃ４）アルキル−（Ｃ２−Ｃ５）ヘテロアリール、Ｃ（Ｏ）Ｒ３、Ｃ（Ｓ）Ｒ３、Ｃ（Ｏ）ＯＲ４、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル−Ｎ（Ｒ６）２、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル−ＯＲ５、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル−Ｃ（Ｏ）ＯＲ５、Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ３、Ｃ（Ｓ）ＮＨＲ３、Ｃ（Ｏ）ＮＲ３Ｒ３’、Ｃ（Ｓ）ＮＲ３Ｒ３’、又は（Ｃ１−Ｃ８）アルキル−Ｏ（ＣＯ）Ｒ５であり；
Ｒ２は、Ｈ、Ｆ、ベンジル、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、（Ｃ２−Ｃ８）アルケニル、又は（Ｃ２−Ｃ８）アルキニルであり；
Ｒ３及びＲ３’は独立して、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、（Ｃ３−Ｃ７）シクロアルキル、（Ｃ２−Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ８）アルキニル、ベンジル、アリール、（Ｃ０−Ｃ４）アルキル−（Ｃ１−Ｃ６）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ０−Ｃ４）アルキル−（Ｃ２−Ｃ５）ヘテロアリール、（Ｃ０−Ｃ８）アルキル−Ｎ（Ｒ６）２、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル−ＯＲ５、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル−Ｃ（Ｏ）ＯＲ５、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル−Ｏ（ＣＯ）Ｒ５、又はＣ（Ｏ）ＯＲ５であり；
Ｒ４は、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、（Ｃ２−Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ８）アルキニル、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル−ＯＲ５、ベンジル、アリール、（Ｃ０−Ｃ４）アルキル−（Ｃ１−Ｃ６）ヘテロシクロアルキル、又は（Ｃ０−Ｃ４）アルキル−（Ｃ２−Ｃ５）ヘテロアリールであり；
Ｒ５は、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、（Ｃ２−Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ８）アルキニル、ベンジル、アリール、又は（Ｃ２−Ｃ５）ヘテロアリール；
Ｒ６の各存在は独立して、Ｈ、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、（Ｃ２−Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ８）アルキニル、ベンジル、アリール、（Ｃ２−Ｃ５）ヘテロアリール、若しくは（Ｃ０−Ｃ８）アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｒ５であるか、又はＲ６基は連結してヘテロシクロアルキル基を形成することができ；
ｎは０又は１であり；
＊はキラル炭素中心を表す。〕
を有する化合物、並びに、その薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、多形体、エナンチオマー、ジアステレオマー、ラセミ体、及び立体異性体の混合物である。
式ＩＩの具体的な化合物は、ｎが０の場合には、
Ｒ１は、（Ｃ３−Ｃ７）シクロアルキル、（Ｃ２−Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ８）アルキニル、ベンジル、アリール、（Ｃ０−Ｃ４）アルキル−（Ｃ１−Ｃ６）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ０−Ｃ４）アルキル−（Ｃ２−Ｃ５）ヘテロアリール、Ｃ（Ｏ）Ｒ３、Ｃ（Ｏ）ＯＲ４、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル−Ｎ（Ｒ６）２、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル−ＯＲ５、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル−Ｃ（Ｏ）ＯＲ５、Ｃ（Ｓ）ＮＨＲ３、又は（Ｃ１−Ｃ８）アルキル−Ｏ（ＣＯ）Ｒ５であり；
Ｒ２は、Ｈ又は（Ｃ１−Ｃ８）アルキルであり；
Ｒ３は、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、（Ｃ３−Ｃ７）シクロアルキル、（Ｃ２−Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ８）アルキニル、ベンジル、アリール、（Ｃ０−Ｃ４）アルキル−（Ｃ１−Ｃ６）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ０−Ｃ４）アルキル−（Ｃ２−Ｃ５）ヘテロアリール、（Ｃ５−Ｃ８）アルキル−Ｎ（Ｒ６）２、（Ｃ０−Ｃ８）アルキル−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｒ５、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル−ＯＲ５、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル−Ｃ（Ｏ）ＯＲ５、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル−Ｏ（ＣＯ）Ｒ５、又はＣ（Ｏ）ＯＲ５であり；
他の可変因子は上記と同じ定義を有する。
式ＩＩの他の具体的な化合物において、Ｒ２はＨ又は（Ｃ１−Ｃ４）アルキルである。
式ＩＩの他の具体的な化合物において、Ｒ１は（Ｃ１−Ｃ８）アルキル又はベンジルである。
式ＩＩの他の具体的な化合物において、Ｒ１はＨ、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、ベンジル、ＣＨ２ＯＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、又は
Figure 2006500911
である。
式ＩＩの化合物の他の実施形態においては、Ｒ１は、下記式：
Figure 2006500911
〔式中、ＱはＯ又はＳであり、Ｒ７の各存在は独立して、Ｈ、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、ベンジル、ＣＨ２ＯＣＨ３、又はＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３である。〕
を有する。
式ＩＩの他の具体的な化合物において、Ｒ１はＣ（Ｏ）Ｒ３である。
式ＩＩの他の具体的な化合物において、Ｒ３は、（Ｃ０−Ｃ４）アルキル−（Ｃ２−Ｃ５）ヘテロアリール、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、アリール、又は（Ｃ０−Ｃ４）アルキル−ＯＲ５である。
式ＩＩの他の具体的な化合物において、ヘテロアリールはピリジル、フリル又はチエニルである。
式ＩＩの他の具体的な化合物において、Ｒ１はＣ（Ｏ）ＯＲ４である。
式ＩＩの他の具体的な化合物において、Ｃ（Ｏ）ＮＨＣ（Ｏ）のＨは（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、アリール又はベンジルで置換されていてもよい。
本発明の免疫調節化合物のまた別の具体例は、イソインドール−イミド類のクラスに属し、米国特許出願第０９／７８１，１７９号、国際公開ＷＯ９８／５４１７０号、及び米国特許第６，３９５，７５４号（それぞれ参照により本明細書に援用する）に記載されている。代表的な化合物は、下記式ＩＩＩ：
Figure 2006500911
〔式中、
Ｘ及びＹの一方はＣ＝Ｏであり、他方はＣＨ２又はＣ＝Ｏであり；
Ｒは、Ｈ又はＣＨ２ＯＣＯＲ’であり；
（ｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、又はＲ４のそれぞれは他と独立して、ハロ、炭素原子１〜４のアルキル、又は炭素原子１〜４のアルコキシであるか、あるいは
（ｉｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、又はＲ４の１つはニトロ又は−ＮＨＲ５であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、又はＲ４の残りは水素であり；
Ｒ５は水素又は炭素原子１〜８のアルキルであり；
Ｒ６は、水素、炭素原子１〜８のアルキル、ベンゾ、クロロ、又はフルオロであり；
Ｒ’はＲ７−ＣＨＲ１０−Ｎ（Ｒ８Ｒ９）であり；
Ｒ７は、ｍ−フェニレン又はｐ−フェニレン又は−（ＣｎＨ２ｎ）−であり、ここでｎは０〜４の値である；
Ｒ８及びＲ９はそれぞれ他と独立して、水素若しくは炭素原子１〜８のアルキルであるか、又はＲ８及びＲ９は一緒にテトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレン、若しくは−ＣＨ２ＣＨ２［Ｘ］Ｘ１ＣＨ２ＣＨ２−を形成し、ここで［Ｘ］Ｘ１は−Ｏ−、−Ｓ−、又は−ＮＨ−であり；
Ｒ１０は、水素、炭素原子１〜８のアルキル、又はフェニルであり；
＊はキラル炭素中心を表す。〕
の化合物、並びにその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、多形体、エナンチオマー、ジアステレオマー、ラセミ体、及び立体異性体の混合物である。
本発明の最も好ましい免疫調節化合物は、４−（アミノ）−２−（２，６−ジオキソ（３−ピペリジル））−イソインドリン−１，３−ジオン及び３−（４−アミノ−１−オキソ−１，３−ジヒドロ−イソインドール−２−イル）−ピペリジン−２，６−ジオンである。化合物は、標準的な合成方法により得ることができる（例えば、米国特許第５，６３５，５１７号を参照。これは参照により本明細書に援用する）。上記化合物は、Ｃｅｌｇｅｎｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｒｒｅｎ，ＮＪより入手可能である。４−（アミノ）−２−（２，６−ジオキソ（３−ピペリジル））−イソインドリン−１，３−ジオン（ＡＣＴＩＭＩＤ（商標））は以下の化学構造を有する：
Figure 2006500911
３−（４−アミノ−１−オキソ−１，３−ジヒドロ−イソインドール−２−イル）−ピペリジン−２，６−ジオン（ＲＥＶＩＭＩＤ（商標））は以下の化学構造を有する：
Figure 2006500911
５．４．幹細胞の培養方法
本発明のある実施形態では、胚幹細胞、胚様幹細胞、前駆細胞、多能性細胞、全能性細胞、多分化能細胞、灌流を行った分娩後胎盤に内因性の細胞、臍帯血細胞、末梢血若しくは成体血由来の幹細胞若しくは前駆細胞、又は骨髄細胞を含むがこれに限定されるものではない幹細胞又は前駆細胞を、本発明の化合物に暴露し、分化を誘導する。これらの細胞は、当技術分野で周知の方法を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させてもよいし、あるいは、灌流を行った分娩後胎盤中で増殖させてもよい。
ある実施形態では、灌流を行った分娩後胎盤に内因性の細胞を胎盤及び培地から回収し、所望の細胞型又は細胞系統への分化を誘導するのに適する条件下で、そうするのに十分な時間にわたりｉｎ ｖｉｔｒｏで培養することができる。「Post-Partum Mammalian Placenta, Its Use and Placental Stem Cells Therefrom」と題された、２００３年２月１３日公開の米国特許出願公開第２００３００３２１７９号を参照のこと（この特許の全体を本明細書に援用する）。
本発明の別の実施形態では、幹細胞又は前駆細胞は、灌流を行った分娩後胎盤から得るのではなく、臍帯血、骨髄、末梢血、成体血などの他の供給源から単離し、本発明の化合物に暴露し、分化を誘導する。好ましい実施形態では、分化は、所望の系統又は細胞型への分化を誘導するのに適する条件下で、そうするのに十分な時間にわたりｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる。本発明の化合物は、添加による分化／培養培地、ｉｎ ｓｉｔｕ産生、又は幹細胞若しくは前駆細胞と本発明の化合物との接触を可能にする他の任意の方法で使用する。
別の実施形態では、培養された幹細胞、たとえばｉｎ ｖｉｔｒｏで、又は灌流を行った分娩後胎盤中で培養された幹細胞を、たとえば、エリスロポエチン、サイトカイン、リンホカイン、インターフェロン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン、ケモカイン、インターロイキン、リガンドを含む組換え型ヒト造血増殖因子、幹細胞因子、トロンボポエチン（Ｔｐｏ）、インターロイキン、及び顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、又は他の増殖因子の投与によって刺激して、培養中に増殖させる。
培養した細胞は、回収及び／又は単離した後、Ｍｅｓｅｎ Ｃｕｌｔ（商標）培地（stem cell Technologies, Inc.、カナダ国ブリティッシュコロンビア州バンクーバー）など、当技術分野で一般に公知のコロニー形成単位アッセイによって同定し、特性決定することができる。
幹細胞又は前駆細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養方法は、当技術分野で周知であり、たとえば、Thomsonら、1998年、Science第282巻:1145〜47ページ（胚幹細胞）；Hirashimaら、1999年、Blood第93巻(4):1253〜63ページ、及びHatzopoulosら、1998年、Development第125巻:1457〜1468ページ（内皮細胞前駆体）；Slagerら、1993年、Dev.Genet.第14巻(3):212〜24ページ（ニューロン又は筋肉前駆細胞）；Genbachevら、1995年、Reprod.Toxicol.第9巻(3):245〜55ページ（細胞栄養芽層、すなわち胎盤上皮細胞の前駆細胞）；Nadkarniら、1984年、Tumori第70巻:503〜505ページ、Melchnerら、1985年、Blood第66巻(6):1469〜1472ページ、２０００年５月１８日公開の国際ＰＣＴ公開ＷＯ００／２７９９９号、Himoriら、1984年、Intl.J.Cell Cloning第2巻:254〜262ページ、及びDouayら、1995年、Bone Marrow Transplantation第15巻:769〜775ページ（造血前駆細胞）；Shamblottら、1998年、Proc. Natl. Acad. Sci.USA第95巻:13726〜31ページ（始原生殖細胞）；Yanら、2001年、Devel.Biol.第235巻:422〜432ページ（栄養芽幹細胞）を参照されたい。このような方法は、前駆細胞の培養が、細胞を所定の時期に本発明の化合物と共に培養して、所望の分化した細胞集団を産生させるステップを含むという条件で、本発明の方法での使用に容易に適合させることができる。
５．４．１．ｉｎ ｖｉｔｒｏでの幹細胞培養
本発明の方法は、幹細胞又は前駆細胞の分化のｉｎ ｖｉｔｒｏでの調節を含み、これは、前記細胞を、本発明の有機小分子など、前記細胞の所望の特定の細胞系統の細胞への分化を誘導する化合物と共にｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベートした後、分化した細胞を被験体に直接移植することを含むものである。好ましい実施形態では、細胞の造血細胞系統への分化を誘導する。
ある実施形態では、培養した目的の幹細胞を、濃度０．１μｇ／ｍｌ、０．２μ／ｍｌ、０．３μｇ／ｍｌ、０．４μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、５μｇ若しくは１０μｇ／ｍｌの本発明の化合物にｉｎ ｖｉｔｒｏで暴露する。目的の細胞を、約０．００５μｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌの濃度のサリドマイド、約０．００５μｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌの濃度のＡｃｔｉｍｉｄ（商標）（Ｃｅｌｇｅｎｅ社、米国ニュージャージー州Ｗａｒｒｅｎ）、約０．００５μｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌの濃度のＲｅｖｉｍｉｄ（商標）（Ｃｅｌｇｅｎｅ社、米国ニュージャージー州Ｗａｒｒｅｎ）、約０．００５μｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌの濃度のＡｃｔｉｍｉｄ（商標）（Ｃｅｌｇｅｎｅ社、米国ニュージャージー州Ｗａｒｒｅｎ）、又は約０．００５μｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌの濃度のＲｅｖｉｍｉｄ（商標）（Ｃｅｌｇｅｎｅ社、米国ニュージャージー州Ｗａｒｒｅｎ）に暴露することが好ましい（第５．７節「医薬組成物」の項も参照のこと）。
ある実施形態では、灌流液に栄養素、ホルモン、ビタミン、増殖因子、又はこれらの任意の組合せを導入することによって、胚様幹細胞を胎盤バイオリアクター中で増殖させる。増殖灌流液若しくは培地に血清及び他の増殖因子を加えてもよい。増殖因子は、通常はタンパク質であり、増殖因子には、サイトカイン、リンホカイン、インターフェロン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン、ケモカイン、及びインターロイキンが含まれるがこれに限定されるものではない。使用しうる他の増殖因子には、リガンドを含む組換え型ヒト造血増殖因子、幹細胞因子、トロンボポエチン（Ｔｐｏ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、白血病阻害因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、胎盤由来増殖因子、及び上皮細胞増殖因子が含まれる。
灌流液に導入された増殖因子は、未分化の胚様幹細胞、単分化能前駆細胞、又は分化した細胞（たとえば、分化した造血細胞）の増殖を刺激することができる。増殖因子は、免疫グロブリン、ホルモン、酵素、又は先述の増殖因子が含まれるがこれに限定されるものではない成体材料及び生理活性分子の産生を刺激することができる。培養する胎盤には、定期的に「供給」を行って、使用済みの培地を除去し、放出される細胞を減らし、新鮮な培地を加える。培養する胎盤は、混入の可能性を減らすために無菌条件下で貯蔵し、断続的かつ定期的に圧力をかけ続けて、胎盤の細胞に栄養素が十分に供給される条件下にする必要がある。胎盤の灌流及び培養は、効率と処理能力の拡大を考えて、どちらも自動化及びコンピューター管理ができることを理解されたい。
５．４．２．前駆細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養
本発明の方法は、前駆細胞、特にＣＤ３４＋及びＣＤ１３３＋前駆細胞の発達の調節及びモジュレーションを含む。本発明の一実施形態では、前駆細胞の造血細胞系統への分化を誘導する。具体的な実施形態では、その系統は顆粒球系統である。別の実施形態では、ＣＤ１３３＋細胞を、内皮細胞、脳細胞、腎臓細胞、肝細胞、又は腸管細胞に分化するよう誘導する。
前駆細胞は、上述のように標準の方法によって培養することができる。さらに、前駆細胞の培養は、前駆細胞を、種々の細胞系統に分化させるように、培養中の種々の時点又は期間での細胞の接触を含んでもよい。
従って、ＣＤ３４＋若しくはＣＤ１３３＋前駆細胞を培養する一方法では、細胞を第０日に、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｌｔ−３Ｌ、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＴＮＦ−αを含有する培地に播き、６日間培養する。第６日に、細胞をＧＭ−ＣＳＦ及びＴＮＦ−αを含有する培地に再度播種し、さらに６日間培養を続ける。この方法によって、樹状細胞が産生される。この方法の別の形態では、細胞を、最初にＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を含有する培地に播き、次いで第６日に単球調整培地に切り替える（Ｓｔｅｉｎｍａｎら、国際公開ＷＯ９７／２９１８２号を参照のこと）。ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３３＋若しくはＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３３＋前駆細胞の集団を生成させるには、第０日に前駆細胞を本発明の化合物と接触させて配置し、第６日にＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３３＋若しくはＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３３−前駆細胞を回収する。
本発明者は、本発明の化合物、特にＡｃｔｉｍｉｄ（商標）又はＲｅｖｉｍｉｄ（商標）を加える時期は、ＣＤ３４＋細胞の特定の細胞系統への分化の経路、並びにＣＤ１３３＋細胞の分化に対してかなりの影響を有することを見出した。標準の条件下で培養されたＣＤ３４＋前駆細胞は、骨髄発達経路若しくは系統をたどり、すなわち最初に播種してから（すなわち最初の培養後）１２日以内に樹状細胞になる。しかし、本発明の化合物を、培養の最初の６日間の間のいくつかの時期のうちの１時期に加えると、この経路が実質的に変更される。たとえば、ＣＤ３４＋細胞、特に骨髄由来のＣＤ３４＋を、培養初日に本発明の化合物、特にＡｃｔｉｍｉｄ（商標）又はＲｅｖｉｍｉｄ（商標）に暴露した場合、培養第６日に、本発明の化合物に暴露していない（すなわち、ＤＭＳＯに暴露した）対照と比較して、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞数が増加し、ＣＤ１ａ＋ＣＤ１４−細胞数が減少することが証拠となるが、骨髄系統への分化が抑制される。さらに、本発明の化合物に暴露すると、ＣＤ８０やＣＤ８６など、樹状細胞系統の細胞によって発現される表面マーカーを発現する細胞の発達が抑制される。対照的に、培養初日、又は培養初日から３日後までの任意の時期に本発明の化合物と接触させると、ＣＤ３４＋前駆細胞の発達がそのようにモジュレートされる。ＣＤ３４＋細胞数の増加は、本発明の化合物を、第０日と第６日の間に複数回、たとえば第０日及び第２日、第０日及び第４日、第３日及び第６日、又は第２日、第４日、及び第６日に投与した場合に増強することになる。
本発明の特に有用な態様は、本発明の化合物をＣＤ３４＋前駆細胞の培養初日に加え、第１２日まで暴露し続けると、独特な組合せの細胞表面マーカー、すなわちＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３３＋若しくはＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３３−を発現する独特な前駆細胞が発達する。ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３３＋若しくはＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３３−細胞集団は、分化の中間段階を表す。この集団は、急速に発達する造血系統細胞、たとえば顆粒球細胞の集団を必要とする患者に容易に移植することのできる増殖可能な前駆細胞集団として有用である。別の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞を、増殖期（約６日間）の間に標準培地（すなわち、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）又はＲｅｖｉｍｉｄ（商標）などに暴露していないもの）に播き、培養し、次いで、同じ培地、又はＡｃｔｉｍｉｄ（商標）などを含有する同様の培地に切り替えて、第１２日まで培養を続ける。この実施形態では、分化途中の細胞は、通常、対照と比べてＣＤ８０、ＣＤ８６、及びＣＤ１４の発現の減少を示すが、ＣＤ１ａ＋細胞集団の持続性は増大することになる。このような分化途中の細胞は、樹状細胞になるのを妨げられない。別の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、増殖期（播種後第１〜６日）中にＡｃｔｉｍｉｄ（商標）、Ｒｅｖｉｍｉｄ（商標）又は本発明の別の化合物で少なくとも３日間連続で処理する。さらに別の実施形態では、ＣＤ３４＋又はＣＤ１３３＋前駆細胞を、播種後の最初の６日間中にＡｃｔｉｍｉｄ（商標）、Ｒｅｖｉｍｉｄ（商標）又は他の本発明の化合物で２回以上処理する。このように複数回処理すると、ＣＤ３４＋又はＣＤ１３３＋集団の両方の増殖が増大する。Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）又は本発明の別の化合物で複数回処理すると、ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１５−系統から逸れ、ＣＤ１１ｃ−ＣＤ１５＋系統に向かう、すなわち骨髄樹状細胞系統から逸れ、顆粒球系統に向かう、ＣＤ３４＋前駆細胞の分化のシフトが生じる（図６Ｂ）。
培養の第０日からの前駆細胞の処理、特に第０日〜第６日の間の複数回投与によっても、ＣＤ１３３＋前駆細胞数の増加、特にＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋前駆細胞集団の増大がもたらされる。ＣＤ１３３＋細胞は、ＣＤ３４＋サブセットと同様に増殖し、多系統分化能を保持することができるので、ＣＤ１３３は、ＣＤ３４の単離に代わる造血系マーカーである（Kobariら、J.Hematother.Stem Cell Res.第10巻(2):273〜81ページ(2001年)を参照のこと）。ＣＤ１３３＋は、ヒト胎児脳組織由来のＣＤ３４−細胞中に存在し、新生児マウスに注射したとき、強力な移植片生着、増殖、遊走、及び神経分化を示したことが報告されている（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.19:97(26):14720〜5ページ(2000年)を参照のこと）。ＣＤ１３３＋造血幹細胞は、前駆細胞活性が高まっており、クローン原性は拡大され、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスでの移植片生着が高かったことが示されている。
上記のことにもかかわらず、本発明の化合物を培養して３日後の増殖性ＣＤ３４＋前駆細胞（すなわち、最初の培養の後３〜６日の間の任意の時期のもの）と接触させておくとき、すでに細胞表面マーカーＣＤ１ａの発現を開始している増殖性前駆細胞では、このマーカーの発現の持続性がＤＭＳＯ処理した対照よりも実質的に増大している。この持続性の増大に細胞毒性が伴わないことは注目に値する。換言すれば、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）による処理は、他の細胞集団のアポトーシスを引き起こさない。最終的な効果は、現存する免疫能力の維持及び新たな免疫能力の発達である。
したがって、本発明の方法の一実施形態では、ＣＤ３４＋前駆細胞と本発明の化合物とを、培養第０日（すなわち、培養初日）に接触させて、ＣＤ３４＋細胞の樹状細胞への分化をモジュレート（すなわち、抑制）する。別の実施形態では、ＣＤ３４＋前駆細胞と本発明の化合物とを、培養第０日（すなわち、培養初日）に接触させて、ＣＤ３４＋細胞の顆粒球細胞への分化を増強する。別の実施形態では、ＣＤ３４＋前駆細胞と本発明の化合物とを、培養の最初の３日間中に接触させて、ＣＤ３４＋細胞のＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３３＋若しくはＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３３−前駆細胞集団への分化を増強する。別の実施形態では、前駆細胞と本発明の化合物とを、培養第０日〜第６日に複数回接触させて、ＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋集団を増強するか、又は増大させる。別の実施形態では、ＣＤ３４＋前駆細胞と本発明の化合物とを培養第６日に接触させて、ＣＤ１ａ＋細胞集団の持続性を増強するか、又は増大させるが、前記ＣＤ３４＋細胞は、ＣＤ１ａ表面マーカーを示す細胞に分化し、前記培養は、最高で６日間の前記化合物との接触を含まない。
上記実施形態では、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）、Ｒｅｖｉｍｉｄ（商標）又は同類の化合物を投与する対象を、ｉｎ ｖｉｔｒｏの前駆細胞だけでなく、ｉｎ ｖｉｖｏ、たとえばそうした細胞を移植又は移植片生着した患者などの前駆細胞に変更してもよいことは理解されよう。
本発明の方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの幹細胞又は前駆細胞の分化の調節を含み、これは、前記細胞を、本発明の有機小分子など、それを特定の所望の細胞系統への分化を誘導する化合物と共にｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベートした後、分化した細胞を被験体に直接移植することを含むものである。好ましい実施形態では、細胞を造血細胞系統へ分化を誘導する。別の実施形態では、ＣＤ１３３＋細胞を、内皮細胞、脳細胞、腎細胞、肝細胞、又は腸管細胞へ分化を誘導する。
本明細書に記載の方法は、哺乳動物、好ましくはヒト由来のＤ３４＋若しくはＣＤ１３３＋前駆細胞を用いる用途を企図してはいるが、鳥類又は爬虫類の前駆細胞を用いる用途も企図していることに留意されたい。しかし、本発明の化合物は、前駆細胞が由来する種に応じて効力が様々である可能性がある。したがって、特に投与する化合物の濃度に関して、培養方法の若干の変更も企図する。たとえば、マウス由来の前駆細胞は、本発明の化合物、たとえばＡｃｔｉｍｉｄ（商標）に対する感受性が低く、ヒト由来の前駆細胞を用いて１μＭで得られる効果を実現するのに、より高い濃度を必要とするはずである。当業者ならば、このような最適化が慣用の手順であることがわかるはずである。
５．５．幹細胞及び前駆細胞の遺伝子操作
本発明の別の実施形態では、たとえば、アデノウイルス若しくはレトロウイルスベクターなどのウイルスベクターを使用して、あるいはリポソーム又は化学物質を媒介とするＤＮＡ取り込みなどの機械的手段を使用して、本発明の化合物に暴露する前に又はその後に、本発明の方法に従って分化させる幹細胞又は前駆細胞の遺伝子改変を行う。具体的な実施形態では、ＣＤ３４＋前駆細胞に遺伝子改変を行い、次いでそれを本発明の化合物で処理するが、より具体的な実施形態では、前記化合物は、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）、Ｒｅｖｉｍｉｄ（商標）又はその類似体である。別の実施形態では、前記細胞を本発明の化合物で処理し、次いで遺伝子改変を行う。
当技術分野で周知の方法、たとえば、トランスフェクション、形質転換、形質導入、エレクトロポレーション、感染、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポソーム、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）、リソソーム融合、合成カチオン脂質、遺伝子銃若しくはＤＮＡベクター輸送体の使用によって、導入遺伝子が、娘細胞、たとえば胚様幹細胞が分裂して生成した娘胚様幹細胞若しくは前駆細胞に伝達されるように、導入遺伝子を含むベクターを目的の細胞に導入することができる。哺乳動物細胞に形質転換又はトランスフェクションを施すための様々な技術については、Keownら、1990年、Methods Enzymol.第185巻:527〜37ページ;Sambrookら、2001年、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual」、第3版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、米国ニューヨーク、を参照されたい。
好ましいことに、導入遺伝子は、細胞の核膜、又は他に存在する細胞若しくは遺伝子の構造物に対して破壊性でない限り、任意の技術を使用して導入しうる。ある実施形態では、導入遺伝子をマイクロインジェクションによって核の遺伝物質に挿入する。細胞及び細胞の構造物へのマイクロインジェクションは、当技術分野で一般に公知であり、実施されている。
胎盤中で培養した細胞など、培養した哺乳動物細胞に安定なトランスフェクションを行うために、ほんの少ない細胞画分のゲノムに外来ＤＮＡを組み込む。組込みの効率は、使用するベクター及びトランスフェクション法に応じて変わる。遺伝子組込み体を同定し選択するために、一般に、目的の遺伝子配列と共に、（たとえば、抗生物質耐性の）選択可能なマーカーをコードする遺伝子を宿主胚様幹細胞に導入する。好ましい選択可能なマーカーには、Ｇ４１８、ヒグロマイシン、メトトレキサートなどの薬物耐性を付与するものが含まれる。導入された核酸によって安定にトランスフェクトされた細胞は、薬物による選択によって同定することができる（たとえば、選択可能なマーカー遺伝子が組み込まれている細胞が生き残り、他の細胞が死滅する）。このような方法は、哺乳動物細胞（たとえば、胚様幹細胞）中での相同組換えを、被験体又は患者に組換え細胞を導入又は移植する前に行う方法に特に有用である。
形質転換された、胚様細胞などの宿主幹細胞、又はＣＤ３４＋若しくはＣＤ１３３＋前駆細胞などの前駆細胞を選択するために、いくつかの選択系を使用することができる。特に、ベクターは、特定の検出可能若しくは選択可能なマーカーを含んでいてよい。他の選択方法には、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wiglerら、1977年、Cell第11巻:223ページ）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Szybalska及びSzybalski、1962年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA第48巻:2026ページ）、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowyら、1980年、Cell第22巻:817ページ）など、遺伝子をそれぞれｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−、又はａｐｒｔ−細胞中で使用することができる別のマーカーの選択が含まれるがこれに限定されるものではない。また、代謝拮抗物質耐性も、次の遺伝子、すなわち、メトトレキサートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ（Wiglerら、1980年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA第77巻:3567ページ；O'Hareら、1981年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA第78巻:1527ページ）；ミコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ（Mulligan及びBerg、1981年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA第78巻:2072ページ）；アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ（Colberre-Garapinら、1981年、J.Mol.Biol.第150巻:1ページ）；及びヒグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Santerreら、1984年、Gene第30巻:147ページ）での選択に基づいて使用することができる。
導入遺伝子は、好ましくはランダム組込みによって目的の細胞のゲノムに組み込むことができる。他の実施形態では、導入遺伝子は、部位特異的方法、たとえノックイン」又は「ノックアウト」）によって組み込むことができる（Ｃｈａｐｐｅｌの米国特許第５，２７２，０７１号及び１９９１年５月１６日公開のＰＣＴ公開ＷＯ９１／０６６６７号；１９９５年１１月７日発行のＣａｐｅｃｃｈｉらの米国特許第５，４６４，７６４号；１９９７年５月６日発行のＣａｐｅｃｃｈｉらの米国特許第５，６２７，０５９号；１９９６年１月３０日発行のＣａｐｅｃｃｈｉらの米国特許第５，４８７，９９２号）。
相同組換えによって標的化された遺伝子改変を有する細胞を作製する方法は、当技術分野で公知である。構築物は、所望の遺伝子改変のなされた少なくとも一部の目的の遺伝子を含み、標的座に対する相同領域、すなわち、宿主ゲノム中の、標的化遺伝子の内因性コピーを含む。ランダム組込み用のＤＮＡ構築物は、相同組換えに使用されるものとは対照的に、組換えを媒介するために相同領域を含む必要がない。標的化構築物又はランダム構築物中にマーカーを含めると、導入遺伝子の挿入についてポジティブ及びネガティブ選択を行うことができる。
相同組換え細胞、たとえば、相同組換え胚様幹細胞、内因性胎盤細胞、又は胎盤中で培養した外因性細胞を作出するために、目的の遺伝子の５’及び３’末端に、標的細胞のゲノムに内在する遺伝子配列に隣接させて、ベクターによって保持される目的の遺伝子と標的細胞のゲノム中の内因性遺伝子との間で相同組換えが起こるのを可能にする相同組換えベクターを調製する。追加のフランキング核酸配列は、標的細胞のゲノム中の内因性遺伝子との相同組換えがうまく行われるのに十分な長さの配列である。通常、（５’及び３’末端の両方の）フランキングＤＮＡは数キロベースがベクターに含められる。相同組換えベクターを構築する方法、並びに組換え幹細胞から相同組換え動物を構築する方法は、当技術分野で一般に公知である（たとえば、Thomas及びCapecchi、1987年、Cell第51巻:503ページ;Bradley、1991年、Curr.Opin.Bio/Technol.第2巻:823〜29ページ；及びＰＣＴ公開ＷＯ９０／１１３５４号、ＷＯ９１／０１１４０号、及びＷＯ９３／０４１６９号を参照のこと）。
具体的な実施形態では、Bonadioらの方法(「Methods and compositions for multiple gene transfer into bone cells」と題された、１９９９年８月２４日発行の米国特許第５，９４２，４９６号；及び「Methods and compositions for stimulating bone cells」と題された、１９９５年８月２４日公開のＰＣＴ ＷＯ９５／２２６１１号）を使用して、幹細胞、前駆細胞、又は胎盤中で培養した外因性細胞、たとえば骨前駆細胞などの目的の細胞に核酸を導入する。
５．６．分化用に順化させた幹細胞及び前駆細胞の使用
５．６．１．一般の用途
本発明の幹細胞、並びにＣＤ３４＋及びＣＤ１３３＋前駆細胞は、移植及びｅｘ ｖｉｖｏ治療プロトコルでの使用のために分化を誘導することができる。一実施形態では、幹細胞集団を特定の細胞型に分化させ、遺伝子改変を行って、治療用遺伝子産物を提供する。別の実施形態では、前駆細胞集団を初期前駆細胞に増殖させ、遺伝子改変を行って、治療用遺伝子産物を提供する。別の実施形態では、前駆細胞集団を顆粒球などの特定の細胞型に分化させ、遺伝子改変を行って、治療用遺伝子産物を提供する。
本発明の化合物は、疾患及び／又は臨床的な骨髄切除のために生じる好中球減少及び白血球減少の逆転など、移植の主目的が、骨髄白血球細胞産生を回復させることである臨床状況でも有用性がある。化合物は、疾患、既知の様々な治療による副作用、又は骨髄切除のために起こる初期前駆細胞又は顆粒球の産生の回復においても有用である。本発明の化合物は、骨髄の抑制を伴わない赤血球産生の抑制が好ましい場合にも有用である。
ある実施形態では、本発明の化合物で処理しておいた幹細胞を、臍帯血又は末梢血由来の幹細胞などの未処理細胞と共に、その必要のある患者に投与する。他の実施形態では、本発明の化合物で処理しておいたＣＤ３４＋若しくはＣＤ１３３＋細胞を、臍帯血又は末梢血由来の幹細胞などの未処置細胞と共に、その必要のある患者に投与する。一実施形態では、培養初日から本発明の化合物で処理したＣＤ３４＋前駆細胞を、未処理細胞と共にその必要のある患者に投与する。より具体的な実施形態では、移植される前駆細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３３＋若しくはＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３３−前駆細胞である。
本発明の方法によって分化をモジュレートした幹細胞、たとえば胚様幹細胞若しくは造血幹細胞、又は前駆細胞は、注射可能なように製剤化することができる（その全体が参照により本明細書に援用されるＰＣＴ ＷＯ９６／３９１０１号を参照のこと）。別の実施形態では、本発明の方法に従って分化をモジュレートした細胞及び組織は、その全体が参照により本明細書に援用される米国特許第５，７０９，８５４号、同第５，５１６，５３２号、又は同第５，６５４，３８１号に記載されているように、重合性若しくは架橋ヒドロゲルを使用して製剤化することができる。
胚様幹細胞は、前駆細胞が通常使用されうる治療又は研究プロトコルで、特定のクラスの前駆細胞（たとえば、軟骨細胞、肝細胞、造血細胞、膵臓実質細胞、神経芽細胞、筋前駆細胞など）の代わりに使用することができる。
５．６．２．組織の交換又は増強
本発明の方法に従って分化をモジュレートした本発明の幹細胞、特に胚様幹細胞及び前駆細胞は、幹細胞や前駆細胞集団など、所望の細胞集団の移植又は注入に関する広範な種類の治療プロトコルに使用することができる。この幹細胞又は前駆細胞を使用して、既存の組織を交換若しくは増強し、新規若しくは代替の組織を導入し、又は成体組織若しくは構造を接合することができる。
本発明の好ましい実施形態では、本発明の方法に従って分化をモジュレートした胎盤由来胚様幹細胞などの幹細胞、又は造血前駆細胞などの前駆細胞は、適合又は非適合のＨＬＡ型を含む自己及び同種異系の造血移植片として使用しうる。胚様幹細胞の同種異系造血移植片としての使用によって、好ましくは共に参照により本明細書に援用される１９９８年９月１日発行の米国特許第５，８００，５３９号及び１９９８年９月１５日発行の米国特許第５，８０６，５２９号に記載のものなど、宿主に処置を施して、ドナー細胞に対する免疫拒絶を低減しうる。
たとえば、本発明の方法に従って分化をモジュレートした胚様幹細胞を、治療用移植プロトコルで使用して、例えば、肝臓、膵臓、腎臓、肺、神経系、筋肉系、骨、骨髄、胸腺、脾臓、粘膜組織、性腺、又は毛髪の幹細胞又は前駆細胞を増強又は交換することができる。同様に、本発明の方法に従って分化をモジュレートした造血前駆細胞は、骨髄若しくは内皮前駆細胞の代わりに使用することができる。
本発明の方法に従って分化をモジュレートした幹細胞、たとえば胚様幹細胞は、軟骨、腱、又は靭帯の増強、修復又は交換に使用することができる。たとえば、ある実施形態では、人工器官（たとえば、股関節部人工器官）を、本発明の胚様幹細胞から増殖させた代替軟骨組織構築物でコーティングする。他の実施形態では、胚様幹細胞から増殖させた軟骨組織構築物を用いて関節（たとえば、膝）を再構築する。軟骨組織構築物は、異なる種類の関節の主要な再建手術で用いることもできる（プロトコルについては、たとえば、Resnick,D.及びNiwayama, G.ら、1988年、「Diagnosis of Bone and Joint Disorders」、第2版、W.B.Saunders Co.を参照のこと）。
本発明の方法に従って処理した幹細胞及び前駆細胞を使用して、疾患のために生じた組織及び臓器の損傷を修復することができる。そのような実施形態では、患者に胚様幹細胞を投与して、疾患のために損傷を受けた組織又は臓器を再生又は回復させる、たとえば、化学療法又は放射線療法の後に免疫系を増強し、心筋梗塞の後に心臓組織を修復することができる。幹細胞及び／又は前駆細胞を、本発明の方法に従い、本発明の免疫調節化合物で処理し、あるいは本発明の免疫調節化合物と共に投与して、その必要のある個体に移植すると、肝臓、膵臓、又は心臓組織を修復及び／又は交換することができる。
本発明の方法に従って処理した幹細胞及び前駆細胞はまた、骨髄移植で骨髄細胞を増強又は交換するために使用することができる。ヒトの自己及び同種異系骨髄移植は、現在白血病やリンパ腫などの疾患、及び生命を脅かす他の障害の治療法として利用されている。しかし、このような手法の欠点は、細胞が確実に移植に足りるようにするために、大量のドナー骨髄を取り出さなければならないことである。
本発明の方法に従って回収した胚様幹細胞は、大規模な骨髄供与の必要を低減し得る幹細胞及び前駆細胞をもたらすことができる。また、本発明の方法によれば、小規模な骨髄供与を実現し、次いで、胎盤中で培養し、増殖させて幹細胞及び前駆細胞の数を増やした後に、レシピエントに注入又は移植することもできるはずである。
ある実施形態では、本発明の方法を使用して得た多数の胚様幹細胞及び／又は前駆細胞が、大規模な骨髄供与の必要を低減するはずである。骨髄移植での移植片生着には、患者の体重１キログラムあたりおよそ１×１０８〜２×１０８個の骨髄単核細胞（すなわち、７０ｋｇのドナーでは約７０ｍｌの骨髄）を注入しなければならない。７０ｍｌを得るために、供与の過程では、過剰な供与とかなりの血液損失が必要となる。特定の実施形態では、小規模骨髄供与（たとえば、７〜１０ｍｌ）からの細胞は、たとえば胎盤バイオリアクター中で増殖して増やした後、レシピエントに注入できるはずである。本発明の方法に従って分化をモジュレートした幹細胞、及び前駆細胞、特にＣＤ３４＋若しくはＣＤ１３３＋前駆細胞は、大規模骨髄供与の必要を低減し、又は排除し得る幹細胞及び／又は前駆細胞をもたらすことができる。
具体的な実施形態では、胎盤から単離した胚様幹細胞を、自己若しくは異種性酵素による代償療法に使用して、テイ−サックス病、ニーマン−ピック病、ファブリー病、ゴーシェ病、ハンター病、ハーラー症候群などのリソソーム蓄積症、並びに他のガングリオシド蓄積症、ムコ多糖症、及び糖原病が含まれるがこれに限定されるものではない、特定の疾患又は症状を治療することができる。
他の実施形態では、細胞を遺伝子治療において自己若しくは異種導入遺伝子のキャリアーとして使用して、先天的な代謝障害、例えば副腎白質ジストロトフィー、嚢胞性線維症、糖原蓄積病、甲状腺機能低下症、鎌状赤血球貧血、ピアソン症候群、ポンペ病、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、及びテイ−サックス病、ポルフィリン症、メープルシロップ尿症、ホモシスチン尿症、ムコ多糖蓄積症、慢性肉芽腫症、及びチロシン血症を矯正し、あるいは癌、腫瘍、又は他の病理学的状態を治療することができる。
他の実施形態では、角膜上皮欠損の治療、軟骨の修復、顔面削皮術、粘膜、鼓膜、腸の内層（intestinal linings）、神経構造（たとえば、網膜、基底膜の聴覚ニューロン、嗅覚上皮の嗅覚ニューロン）、皮膚外傷についての火傷及び創傷の修復、頭皮（毛髪）移植を含むがこれに限定されるものではない自己若しくは異種組織の再生若しくは代償療法若しくはプロトコルにおいて、又は他の損傷若しくは患部臓器若しくは組織の再構築のために、細胞を使用することができる。
さらに、血流中を循環する幹細胞及び前駆細胞は、通常は少数である。別の実施形態では、血漿交換、すなわち、血液を採取し、１種又は複数の成分を選択的に除去し、血液の残りをドナーに再注入する手順によって、そうした外因性幹細胞又は外因性前駆細胞を回収する。血漿交換によって回収された外因性細胞を、本発明の方法によって増殖させ、それにより骨髄供与の必要が完全になくなる。
別の実施形態では、本発明の方法による造血前駆細胞の増殖を、化学療法の補足治療として使用する。癌細胞を標的にして破壊するのに使用される大部分の化学療法剤は、すべての増殖性細胞、すなわち細胞分裂の途中の細胞を死滅させることによって作用する。骨髄は、体内で最も活発に増殖する組織の１つであるので、造血幹細胞は、化学療法剤によってしばしば損傷を受け、又は破壊され、その結果、血球産生が縮小し、又は停止する。化学療法は、一定間隔で終了し、患者の造血系が、化学療法の再開前に血球量を補充しなければならない。以前に静止状態にあった幹細胞が増殖し、白血球数が化学療法を再開してよい（同時にまた骨髄幹細胞が破壊される）許容レベルに増加するのには、１ヶ月以上かかるであろう。
白血球は、化学療法の治療の合間に再生するが、しかし、癌が増殖する時間もあり、さらに自然選択のために化学療法薬に対する耐性が高くなるかもしれない。したがって、化学療法の期間が長くなり、治療間隔が短くなるほど、癌を首尾よく死滅させられる見込みが高くなる。化学療法処置間の時間短縮のために、本発明の方法に従って分化させた胚様幹細胞又は前駆細胞を患者に導入できると考えられる。このような処置は、患者が少ない血球数を示すはずの時間を短縮し、したがって化学療法処置をより早期に再開することが可能となりうる。
別の実施形態では、ヒト胎盤幹細胞を使用して、慢性肉芽腫症などの遺伝病を治療又は予防することができる。
５．６．３．炎症の改善
本発明の方法に従って分化をモジュレートした幹細胞及び前駆細胞は、一般の抗炎症剤として使用することができる。本発明者らは、たとえば臍帯血由来の幹細胞及び前駆細胞が、患者に移植したとき、炎症性の応答を低減し、又は実質的に消失させることを見出した。したがって、一実施形態では、本発明の方法は、炎症性の応答を伴う患者、又は炎症性の応答を発症すると考えられる患者に、１種又は複数の本発明の化合物によって分化をモジュレートした幹細胞又は前駆細胞を投与することを含む。具体的な実施形態では、幹細胞は胚様幹細胞であり、前駆細胞は造血幹細胞、特にＣＤ３４＋若しくはＣＤ１３３＋前駆細胞である。
本発明者らは、個体を本発明の化合物、すなわちＩＭｉＤｓで処置すると、炎症性の応答をモジュレートし、改善させ又は軽減する細胞の発達及び分化が刺激されることも見出した。したがって、本発明の別の実施形態は、炎症性の応答を伴う個体、又は炎症性の応答を発症すると考えられる個体の治療方法であって、前記個体に、１種又は複数の有効量の本発明の化合物を投与することを含む方法を含む。別の実施形態では、この方法は、幹細胞又は前駆細胞と本発明の化合物とを、前記個体に投与する前に接触させ、次いで治療上有効な量の前記細胞を前記個体に投与することを含む。さらに別の実施形態では、そのように処理した細胞を、１種又は複数の本発明の化合物と同時に、前記個体に治療上有効な量で投与することができる。
他の実施形態では、本発明の化合物及び／又は細胞と組み合わせて他の化合物を投与して、炎症を軽減することができる。たとえば、そのような追加の化合物は、プレドニソンなどのステロイド類を含んもよいし、又はｃｏｘ−１／ｃｏｘ−２阻害剤、アセチルサリチル酸（アスピリン）、イブプロフェン、アセトアミノフェン、ｃｏｘ−１特異的阻害剤、若しくはこれら化合物のいずれかの誘導体など、非ステロイド系抗炎症剤のいずれかを含んでもよい。このような追加の抗炎症剤は、静脈内、局所、皮内又は吸入などの任意の標準の経路によって送達することができ、また本発明の化合物及び／若しくは細胞と同時に送達してもよいし、又は別の時間に送達してもよい。
上記方法を使用して、炎症に関連し、炎症によって生じ、又は炎症の結果として生じるいずれの疾患又は状態を治療してもよい。たとえば、不慮の損傷などの外傷によって生じる炎症の治療にこの方法を使用することができる。この方法は、外科手順、特に、天然組織の移植片、合成の血管移植片、心臓弁、血管形成術など、血管関連の外科手順によって引き起こされる炎症、又はそれに随伴する損傷の治療にも使用してよい。この方法を使用して、狭窄又は再狭窄を予防することもできる。上記方法は、心臓病、アテローム性動脈硬化症、アレルギー若しくは過敏症、免疫障害、自己免疫疾患（関節炎など）、感染による炎症などの疾患又は症状を含むがこれに限定されるものではない、任意の疾患又は症状の結果として生じる炎症の治療にも使用することができる。すでに存在する炎症性症状の治療に加えて、炎症の発生が低減されるように、本発明の細胞及び／又は化合物を、予防目的で個体に投与してもよい。これは、術後の炎症性応答の軽減によって、個体が好結果を収め、入院時間及び作業不能期間を短縮させる可能性を高める術前療法の形として特に有用である。
上記治療の抗炎症作用の有効性は、視診、ＭＲＩ若しくはＣＡＴ走査、全身若しくは局所の温度測定など、任意の既知の方法によってモニターすることができる。Ｃ反応性タンパク質として知られているタンパク質は、炎症のマーカーであるので、個体中、特に以前に炎症を起こしたことのある区域中のＣ反応性タンパク質量が減少するかどうかを分析して、上記治療方法の有効性をモニターすることができる。
５．６．４．樹状細胞及び顆粒球細胞集団の産生
本発明の化合物を投与すると、特に、幹細胞及び／又は前駆細胞の分化を、樹状細胞発達系路でなく顆粒球発達経路に沿ってモジュレートすることができる。同様に、本発明の細胞をｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏでモジュレートして、増殖した樹状細胞若しくは顆粒球集団を提供することができる。
樹状細胞は、免疫療法のための試薬として使用することができる。たとえば、樹状細胞をＴリンパ球及びタンパク質抗原とｉｎ ｖｉｔｒｏで共培養し、それによりＴ細胞をｅｘ ｖｉｖｏで抗原特異的に活性化することができる。次いで、活性化したＴ細胞を自家投与して、ｉｎ ｖｉｖｏで抗原特異的免疫応答を起こす（ＷＯ９７／２４４３８号）。別の例では、Ｔリンパ球と、組換え構築物由来の抗原タンパク質を直接に発現する樹状細胞とを接触させて、Ｔ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで活性化することができる。活性化したＴ細胞は、自家注入に使用することができる（ＷＯ９７／２９１８３号）。
特定のペプチド又はタンパク質断片によって活性化されたＴ細胞は、そのペプチド又は断片の供給源であったタンパク質、細胞若しくは生物体に対する免疫感作剤になる。たとえば、樹状細胞に、腫瘍特異的なペプチドを負荷することができる。ＤＣによってＴ細胞をｅｘ ｖｉｖｏで活性化して前立腺癌を治療するという特定の適用例が、米国特許第５，７８８，９６３号に記載され、特許請求の範囲に記載されている。Ｍａｙｏｒｄｏｍｏらは、合成腫瘍ペプチドを提示させた骨髄由来樹状細胞が、防御及び治療となる抗腫瘍免疫を惹起することを実証している（Nature Medicine第1巻:1297〜1302ページ(1995年)；J.Exp.Med、第183巻:1357〜1365ページ(1996年)）。米国特許第５，６９８，６７９号は、樹状細胞を含む標的の抗原提示細胞（ＡＰＣ）に抗原ペプチドをｉｎ ｖｉｖｏで送達する免疫グロブリン融合タンパク質を記載している。この同じ手法を、ウイルス、細菌、又は寄生生物由来のペプチド又は抗原で使用すると、ウイルス、細菌、又は寄生生物のワクチンを創出することができる。
樹状細胞は、様々な免疫障害の治療における治療介入のための標的でもある。たとえば、樹状細胞は、ＡＩＤＳの病原性及び病態生理において重要な役割を果たす（たとえば、ＨＩＶウイルスの貯蔵器として働く）ことが示唆されている。Zoeteweijら、J.Biomed.Sci.第5巻(4):253〜259ページ(1998年)；Grouardら、Curr.Opin.Immunol.第9巻(4):563〜567ページ(1997年)；Weissmanら、Clin.Microbiol.Rev.第10巻(2):358〜367ページ(1997年)を参照されたい。ＤＣのＨＩＶ感染を無効にする薬剤の薬剤候補をｉｎ ｖｉｔｒｏでスクリーニングする方法が、米国特許第５，６２７，０２５号に記載されている。別の例では、樹状細胞を操作して、レシピエント中でドナー組織又は臓器に対するＴ細胞の無応答性を誘導することができる（米国特許第６，３７５，９５０号を参照のこと）。
顆粒球は、感染、たとえば細菌による新生児敗血症、癌患者における好中球減少に随伴する感染、及び骨髄移植を受けている患者の潜在的な感染を治療又は予防する際に顆粒球輸血に使用することができる。顆粒球は、アレルギーの予防又は治療にも使用することができる。たとえば、ＩｇＥを媒介とする炎症に関与する顆粒球（すなわち、その一部がアレルゲンに特異的である、ＩｇＥ抗体で覆われた顆粒球）を失活させ、アレルゲンに対してすでに確立している免疫応答の症状を軽減するために使用することができる（米国特許第６，３８３，４８９号を参照のこと）。
したがって、本発明の一実施形態では、個体に治療上有効な量の本発明の化合物を投与することを含み、前記量が、前記個体に内因性のＣＤ３４＋細胞から複数の顆粒球を産生させるのに十分なものである方法によって、前記個体中の顆粒球集団を本発明の前駆細胞から増殖させる。別の実施形態では、個体にＣＤ３４＋若しくはＣＤ１３３＋前駆細胞集団を投与することを含み、ここで前記細胞が、本発明の化合物と少なくとも３日間接触させたものであって、前記個体にその細胞集団を投与する方法によって、前記個体内で顆粒球集団を増殖させる。別の実施形態では、個体にＣＤ３４＋若しくはＣＤ１３３＋前駆細胞集団と本発明の化合物を投与すること含み、前記本発明の化合物の用量が、複数の前記細胞集団を顆粒球へと分化させるのに十分なものである方法によって、前記個体中で顆粒球集団を増殖させる。上記実施形態の具体的な実施形態では、前記ＣＤ３４＋前駆細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３３＋細胞である。
５．６．５．他の疾患及び症状の治療
本発明の分化した幹細胞及び前駆細胞、又は本発明の化合物は、単独又は組み合わせて、他の様々な疾患又は症状の治療又は予防にも使用することができる。ある実施形態では、たとえば、その疾患又は障害には、血管若しくは心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、再生不良性貧血、脊髄形成異常、心筋梗塞、発作障害、多発性硬化症、卒中、低血圧、心停止、虚血、炎症、加齢による認知機能の喪失、放射線による損傷、脳性麻痺、神経変性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、リー病、ＡＩＤＳ痴呆、記憶喪失、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、虚血性腎疾患、脳若しくは脊髄の外傷、心肺バイパス、緑内障、網膜の虚血、網膜の外傷；リソソーム蓄積症、例えばテイ−サックス病、ニーマン−ピック病、ファブリー病、ゴーシェ病、ハンター病、ハーラー症候群など、並びに他のガングリオシド蓄積症、ムコ多糖症、及び糖原病リソソーム蓄積症；先天的な代謝障害、副腎白質ジストロトフィー、嚢胞性線維症、糖原蓄積病、甲状腺機能低下症、鎌状赤血球貧血、ピアソン症候群、ポンペ病、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、ポルフィリン症、メープルシロップ尿症、ホモシスチン尿症、ムコ多糖蓄積症、慢性肉芽腫症、及びチロシン血症、テイ−サックス病、癌、腫瘍、又は他の病理学的若しくは腫瘍性の状態が含まれるがこれに限定されるものではない。
他の実施形態では、本発明の細胞（たとえば、本発明の化合物に暴露してあるもの）は、外傷、特に炎症を伴う外傷によるあらゆる種類の傷害の治療に使用することができる。そのような外傷に関連した状態の例には、脳、脊髄、若しくはＣＮＳの周囲組織の傷害を含む中枢神経系（ＣＮＳ）の傷害、末梢神経系（ＰＮＳ）の傷害、又は他の任意の身体部分の傷害が含まれる。このような外傷は、事故によって引き起こされたものであっても、手術や血管形成術などの医学的手順の正常又は異常な結果であってもよい。外傷は、血管の破裂又は閉塞、たとえば卒中又は静脈炎に関連していてもよい。具体的な実施形態では、角膜上皮欠損の治療、軟骨の修復、顔面削皮術、粘膜、鼓膜、腸の内層、神経構造（たとえば、網膜、基底膜の聴覚ニューロン、嗅覚上皮の嗅覚ニューロン）、外傷による皮膚損傷についての火傷及び創傷の修復を含むがこれに限定されるものではない、自己又は異種組織の再生若しくは代償療法若しくはプロトコルにおいて、又は損傷若しくは疾患のある他の臓器若しくは組織の再構築のために、上記細胞を使用することができる。
具体的な実施形態では、疾患又は障害は、再生不良性貧血、脊髄形成異常、白血病、骨髄障害、又は造血の疾患若しくは障害である。別の具体的な実施形態では、被験体はヒトである。
５．７．医薬組成物
本発明は、単回及び／又は複数回用量の１種又は複数の本発明の化合物を含み、前記の単回用量又は複数回用量は、順化させた又は順化させていないヒトＣＤ３４＋若しくはＣＤ１３３＋前駆細胞又は幹細胞の移植前又はその後に、個体に単回投与又は複数回投与すると有効であり、そうした幹細胞及び／又は前駆細胞の、特定の細胞型、たとえば造血系統の細胞、特に骨髄系統の細胞への分化を抑制し、モジュレートし、かつ／又は調節するのに十分な効果を発揮する医薬組成物を含む。これに関連して、他の場合と同様に本発明でも、「個体」とは、化合物又は細胞を投与する任意の個体、たとえば哺乳動物、鳥類、又は爬虫類を意味する。
したがって、具体的な実施形態では、本発明の化合物の、前記の単回用量又は複数回用量を個体に投与すると、内因性のＣＤ３４＋前駆細胞の樹状細胞への分化がモジュレートされる。より具体的な実施形態では、その単回用量又は複数回用量は、前記単回用量又は複数回用量を投与した前記個体中の顆粒球細胞数を増加させる。別のより具体的な実施形態では、その単回用量又は複数回用量は、前記の単回用量又は複数回用量を投与した哺乳動物中のＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３３＋若しくはＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３３−前駆細胞数を増加させる。
他の実施形態では、目的のＣＤ３４＋若しくはＣＤ１３３＋前駆細胞又は幹細胞を、その必要のあるヒト被験体又は患者に移植する。移植した後、本発明の化合物をヒト被験体又は患者に投与して、移植された目的の細胞の分化をｉｎ ｖｉｖｏでモジュレートする。具体的な実施形態では、そのような細胞をｉｎ ｖｉｖｏで顆粒球に分化させる。さらに他の実施形態では、ヒト被験体又は患者の中にある目的の前駆細胞又は幹細胞の分化を、本発明の化合物を投与してｉｎ ｓｉｔｕでモジュレートする。
さらに別の実施形態では、本発明は、単離された臍帯血幹細胞又は前駆細胞集団を、本発明の方法に従ってＴＮＦ−α活性を阻害する化合物に暴露して分化させた造血前駆細胞で増強したものを含む医薬組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、本発明の化合物と接触させた幹細胞又は前駆細胞を添加した臍帯血を含む医薬組成物を提供するが、具体的な実施形態では、前記幹細胞又は前駆細胞は、前記化合物によって分化させたものである。
さらに別の実施形態では、本発明は、１種又は複数の本発明の免疫調節化合物と、本発明の幹細胞及び／若しくは前駆細胞の両方を含む医薬組成物を提供する。このような組成物は、幹細胞及び／又は前駆細胞の分化が、異なる発達／分化経路に沿ってモジュレートされるように、投与の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、若しくは１２日前に調製することができる。
さらに別の実施形態では、本発明の医薬組成物は、幹細胞又は前駆細胞のみを含んでいてもよく、ここで前記細胞は、本明細書で開示する方法に従って分化させたものである。したがって、本発明は、複数の幹細胞及び／又は前駆細胞を含み、ここで前記の複数の幹細胞及び／又は前駆細胞が、前記細胞の分化をモジュレートするのに十分な濃度の本発明の１種又は複数の免疫調節化合物と、そうするのに十分な期間にわたり接触させたものである、医薬組成物を提供する。
したがって、本発明の医薬組成物は、個体に投与される本発明の化合物；本発明の化合物と組み合わせて別々に個体に投与される本発明の細胞；及び前記個体に投与される、本発明の化合物と接触させた本発明の細胞を含む。
本発明は、治療上有効な量の本発明の化合物又は組成物を、哺乳動物、好ましくはヒト被験体に投与して、被験体に移植された又は被験体内に存在するＣＤ３４＋若しくはＣＤ１３３＋前駆細胞又は幹細胞の増殖及び／又は分化のモジュレーションを実現することによる、疾患又は障害の治療及び予防方法を提供する。一実施形態では、本発明は、ＣＤ３４＋及びＣＤ１３３＋前駆細胞又は幹細胞の分化を、哺乳動物内で顆粒球細胞数が増加するようにモジュレートする方法を提供する。別の実施形態では、本発明の化合物を哺乳動物、好ましくはヒトに投与して、ＣＤ３４＋及び／若しくはＣＤ１３３＋前駆細胞又は幹細胞から派生し得る任意の細胞系統をモジュレートすることができる。用語「哺乳動物」は、本明細書では、任意の哺乳動物を含む。哺乳動物は、そのような治療又は予防を必要としていることが好ましい。哺乳動物の例には、好ましくは、限定されるものではないが、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サルなどが含まれ、より好ましくはヒトである。
本発明の化合物の投与は、全身投与又は局所投与のいずれでもよい。ほとんどの場合、哺乳動物に投与すると、本発明の化合物が全身に放出されることになる（すなわち、血流にのる）。投与方法には、経口、頬側、舌下、直腸などの経腸経路；経皮や皮内などの局所投与；及び非経口投与が含まれる。適切な非経口経路には、皮下針若しくはカテーテルによる注射、たとえば、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内、動脈内、脳室内、くも膜下腔内、眼内、及び前眼房内（intracameral）注射、並びに腟内、直腸、若しくは経鼻投与などの非注射経路が含まれる。本発明の化合物及び組成物は、経口投与することが好ましい。特定の実施形態では、１種又は複数の本発明の化合物を、治療する必要のある区域に局所投与することが望ましい。これは、たとえば、術中の局所注入、たとえば術後の創傷包帯剤と合わせての局所への塗布、注射、カテーテル、坐剤、又は植込錠によって実施することができ、前記の植込錠は、シアラスティック膜などの膜や繊維を含む多孔質、非多孔質、又はゼラチン質の材料のものでありうる。
本発明の化合物は、典型的な送達系だけでなく、標準的でない送達系、たとえば、リポソーム中への封入、微小粒子、マイクロカプセル、カプセルなどによっても投与することができる。たとえば、本発明の化合物及び組成物を、小胞、特にリポソームに入れて送達することができる（Langer、1990年、Science第249巻:1527〜1533ページ；Treatら、「Liposomes」、出典:Therapy of Infectious Disease and Cancer、Lopez-Berestein及びFidler編、Liss、米国ニューヨーク、353〜365ページ(1989年)；Lopez-Berestein、同書、317〜327ページ；並びに同書全般を参照のこと）。別の例では、本発明の化合物及び組成物を、徐放系で送達することができる。一実施形態では、ポンプを使用することができる（Langer、前掲書；Sefton、1987年、CRC Crit.Ref Biomed.Eng.第14巻:201ページ；Buchwaldら、1980年、Surgery第88巻:507ページ、Saudekら、1989年、N.Engl.J Med.第3巻:574ページを参照のこと）。別の例では、高分子材料を使用することができる（Medical Applications of Controlled Release）、Langer及びWise編、CRC Press.、米国フロリダ州Boca Raton(1974年)；「Controlled Drag Bioavailability, Drug Product Design and Performance」、Smolen及びBall編、Wiley、ニューヨーク(1984年)；Ranger及びPeppas、1983年、J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.第23巻:61ページ；並びにLevyら、1985年、Science第228巻:190ページ；Duringら、1989年、Ann.Neurol.第25巻:351ページ；Howardら、1989年、J.Neurosurg.第71巻:105ページを参照のこと)。さらに別の例では、徐放系を治療する標的区域、たとえば肝臓の付近に配置することができ、したがって、全身用量のほんの一部しか必要とならない（たとえば、Goodsonの「Medical Applications of Controlled Release」、前掲書、第2巻、115〜138ページ(1984年)を参照のこと）。Langerによる総説(1990年、Science第249巻:1527〜1533ページ)で論じられている他の徐放系を使用することもできる。本発明の化合物は、組成物として投与するとき、哺乳動物への投与に適した剤形になるよう、薬学的に許容される適量のビヒクル又は担体を配合する。用語「薬学的に許容される」とは、哺乳動物、特にヒトでの使用が、連邦政府又は州政府の規制機関に認可され、あるいは米国薬局方、又は一般に認められている他の薬局方に記載されていることを意味する。用語「ビヒクル」とは、哺乳動物に投与するために本発明の化合物に配合する希釈剤、佐剤、賦形剤、又は担体を指す。このような薬学的に許容されるビヒクルは、水や油などの液体、例えばラッカセイ油、ダイズ油、鉱物油、ゴマ油などの、石油系、動物性、植物性、又は合成の油でありうる。薬剤用ビヒクルは、生理食塩水、アラビアゴム、ゼラチン、デンプンペースト、タルク、ケラチン、コロイド状シリカ、尿素などでよい。さらに、補助剤、安定剤、増粘剤、滑沢剤、及び着色剤を使用してよい。哺乳動物に投与するとき、本発明の化合物及び組成物、並びに薬学的に許容されるビヒクル、賦形剤、又は希釈剤は、無菌であることが好ましい。本発明の化合物を静脈内投与するとき、水、生理食塩水、デキストロース水溶液、グリセロール水溶液などの水性媒質が好ましいビヒクルである。
本発明の化合物及び組成物は、カプセル剤、錠剤、丸剤、ペレット、トローチ剤、粉剤、顆粒剤、シロップ剤、エリキシル剤、溶剤、懸濁剤、乳剤、坐剤、若しくはその持効放出性製剤の剤形、又は哺乳動物への投与に適する他の任意の剤形を取ることができる。好ましい実施形態では、本発明の化合物及び組成物を、常套の手順に従って、ヒトへの経口若しくは静脈内投与に適合させた投与用医薬組成物として製剤化する。一実施形態では、薬学的に許容されるビヒクルは、硬質ゼラチンカプセルである。適切な薬剤用ビヒクル及びその配合方法の例は、参照により本明細書に組み込まれる「Remington: The Science and Practice of Pharmacy」、Alfonso R. Gennaro編、Mack Publishing Co.米国ペンシルヴェニア州Easton、第19版、1995年、Chapters 86、87、88、91、及び92章に記載されている。
経口送達用に製剤化された本発明の化合物及び組成物は、カプセル剤、錠剤、丸剤の剤形、又は任意の圧縮剤形であることが好ましい。さらに、錠剤又は丸剤の形である場合、化合物及び組成物をコーティングして、消化管での崩壊及び吸収を遅らせ、それによってより長い期間にわたり持効性作用をもたらすことができる。浸透圧により活性が生じる推進化合物を覆う選択的に透過性のある膜も、経口投与用の本発明の化合物及び組成物に適する。その後者の基盤（platform）では、カプセルを覆う環境からの流体が推進化合物によって吸収され、化合物が膨張して、開口部を通して薬品又は薬品組成物を放出する。このような送達基盤は、即時放出製剤の鋭利なプロフィールとは対照的に、本質的にゼロ次の送達プロフィールをもたらし得る。モノステアリン酸グリセロールやステアリン酸グリセロールなどの時間遅延材料を使用してもよい。経口組成物は、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アラビアゴム、ケイ酸ナトリウム、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、シロップ、メチルセルロースなど、標準のビヒクル、賦形剤、及び希釈剤を含んでよく、その製剤は、タルク、ステアリン酸マグネシウム、鉱物油などの滑沢剤；湿潤剤、乳化剤、懸濁化剤；メチル及びプロピルヒドロキシ安息香酸塩などの保存剤をさらに含んでよい。そうしたビヒクルは、医薬級であることが好ましい。経口投与される本発明の化合物及び組成物は、薬剤として味のよい製剤にするために、任意選択で、フルクトース、アスパルテーム、サッカリンなどの１種又は複数の甘味剤；ペパーミント、冬緑油、チェリーなどの１種又は複数の着香剤；あるいは１種又は複数の着色剤を含んでいてもよい。
特定の障害又は症状を治療するための治療上有効な投与計画は、その性質及び重症度に応じて変わり、医療従事者の判断に従って、標準の臨床上の技量によって決定することができる。さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏのアッセイを使用して、最適投与量の確認に役立ててもよい。当然、治療上有効な用量を構成する本発明の化合物の量も、投与経路に応じて変わる。一般に、経口投与に適する投与量は、１日当たり、体重１キログラムあたり本発明の化合物約０．００１ミリグラム〜約２０ミリグラム、好ましくは約０．７ミリグラム〜約６ミリグラム、より好ましくは約１．５ミリグラム〜約４．５ミリグラムの範囲である。好ましい実施形態では、哺乳動物、好ましくはヒトに、本発明の化合物を１日当たり約０．０１ｍｇ〜約１０００ｍｇ、より好ましくは１日約０．１ｍｇ〜約３００ｍｇ、又は約１ｍｇ〜約２５０ｍｇを、単回用量又は分割用量で経口投与する。本明細書に記載の投与量は、総投与量を指し、すなわち、本発明の化合物を２種以上投与する場合、好ましい投与量は、投与する本発明の化合物の総量に対応する。経口用組成物は、本発明の化合物を１０重量％〜９５重量％含有していることが好ましい。好ましい単位経口投与剤形には、丸剤、錠剤、及びカプセル剤が含まれ、カプセル剤がより好ましい。通常、このような投与剤形単位は、本発明の化合物を約０．０１ｍｇ、０．１ｍｇ、１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２０ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２５０ｍｇ、又は５００ｍｇ含有し、好ましくは剤形単位あたり化合物を約５ｍｇ〜約２００ｍｇ含有する。
別の実施形態では、本発明の化合物及び組成物は、（たとえば、筋肉内、くも膜下腔内、静脈内、及び動脈内経路によって）非経口的に投与、好ましくは静脈内投与することができる。通常、静脈内投与用の本発明の化合物及び組成物は、水、生理食塩水、リンガー液、デキストロース溶液など、等張性の無菌水性ビヒクルの溶液である。必要に応じて、組成物は、安定剤も含んでよい。静脈内投与用の組成物は、場合により、注射部位の痛みを和らげるために、リグノカインなどの局所麻酔剤を含んでよい。静脈内投与では、本発明の化合物及び組成物を、アンプル又はサシェットなどの、有効薬剤の量を表示してある密閉容器に入れた、凍結乾燥した無菌の乾燥粉末又は水を含まない濃縮物として供給することができる。次いで、静脈内投与の前に、そのような粉末又は濃縮物を適切な水性媒質で希釈する。投与前に希釈するために、無菌の水、生理食塩水、又は他の適切な水性媒質のアンプルを、粉末又は濃縮物に添えて提供することができる。あるいは、組成物を、すぐに投与できる混合済みの形態にして供給することもできる。本発明の化合物又は組成物を静脈内注入によって投与しようとする場合では、たとえば、化合物又は組成物を、医薬級の無菌の水、生理食塩水、又は他の適切な媒質を含む注入瓶に分注することができる。
カカオ脂、変性植物油などの従来型の担体、及び他の脂肪基剤から製剤化した坐剤を使用して、直腸投与を行うことができる。坐剤は、周知の処方を使用して周知の方法によって製剤化することができ、たとえば、参照により本明細書に援用される「Remington: The Science and Practice of Pharmacy」、Alfonso R. Gennaro編、Mack Publishing Co.米国ペンシルヴェニア州Easton、第19版、1995年、1591〜1597ページを参照されたい。
局所投与剤形を製剤化し、投与するには、ローション剤、クリーム剤、軟膏などの周知の経皮及び皮内送達媒質、並びにパッチなどの経皮送達デバイスを使用することができる（参照により本明細書に援用されるGhosh,T.K.、Pfister,W.R.、Yum,S.I.「Transdermal and Topical Drug Delivery Systems」、Interpharm Press,Inc.、249〜297ページ）。たとえば、貯蔵型のパッチ設計は、接着剤で覆われた背面フィルムと、半透膜によって皮膚と隔てられる、本発明の化合物又は組成物を含む貯蔵区画とを含むことができる（たとえば、参照により本明細書に援用される米国特許第４，６１５，６９９号）。接着剤で覆われた背面層は、貯蔵区画の境界周囲に広がって、皮膚と共に中心位での密閉を実現し、貯蔵区画を皮膚に隣接させて保持する。
本発明は、１種又は複数の本発明の化合物を充填した１種又は複数の容器を含む薬剤パック又はキットも提供する。場合により、そのような容器に、医薬品又は生物製剤の製造、使用、又は販売を取り締まる政府機関によって規定された、その機関によってヒトへの投与向けに製造、使用又は販売することが認可されたことを表す通知を添えることができる。一実施形態では、キットは、１種以上の本発明の化合物を含む。別の実施形態では、キットは、本発明の化合物と、別の生物学的活性を有する薬剤とを含む。
本発明の化合物は、ヒトに使用する前に、所望の治療又は予防活性があるかどうか、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでアッセイすることが好ましい。たとえば、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを使用して、本発明の特定の一化合物を投与するのと、本発明の化合物を併用投与するのではどちらが好ましいかを判定することができる。本発明の化合物及び組成物が有効かつ安全であることを、動物モデル系を使用して実証してもよい。他の方法は、当業者に公知であり、本発明の範囲内にある。
５．８．本発明の方法を使用するアッセイ
上述の方法、すなわち、ＩＭｉＤｓ（Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）など）がＣＤ３４＋細胞などの初期前駆細胞の分化に及ぼす作用についての試験は、目的のどんな化合物にも適用できるが、分化に対するその作用がわかっていることが望ましい。試験は、いくつかの手段で実施することができる。
一実施形態では、単にＡｃｔｉｍｉｄ（商標）又は他の本発明の化合物に替えて、その化合物を使用することができる。そこで、前駆細胞の、単分化能細胞及び／又は完全に分化した細胞への増殖及び／又は分化を可能にする条件下で、ＣＤ３４＋前駆細胞及び／又はＣＤ１３３＋前駆細胞を、様々な濃度の目的の化合物と接触させることができる。本明細書で開示する培養方法、特に第５．４節で開示した培養方法を使用することができる。目的の化合物の作用は、それがある場合には、前駆細胞から分化する細胞集団の変化を評価して決定し、その変化は、表現型の変化によってモニターすることもできるが、細胞表面マーカーが存在するか否かを判定して評価することが好ましい。本発明の方法のように、目的の化合物を、最初の培養からの任意の時期に１回で投与して、最終的に分化した細胞を得ることができる。あるいは、目的の化合物を、増殖期、分化期、又はその両方の期間中に複数回で投与してもよい。増殖／分化途中にある前駆細胞の表現型の特徴の変化は、ＤＭＳＯ処理細胞などの対照細胞培養物と比較することが好ましい。これに限定されるものではないが、増殖速度のモジュレーション、分化速度のモジュレーション、前駆細胞の特定の単分化能前駆細胞への分化のモジュレーション、特定の細胞型への分化の阻止、及び特定の細胞型への分化の増強など、増殖又は分化に対する作用があれば、特に関心を引くものになる。
別の実施形態では、培養、増殖、及び分化は上記のように行われるが、目的の化合物をＡｃｔｉｍｉｄ（商標）と共に前駆細胞と接触させる。この方式では、複数の化合物の可能性ある相乗効果（相乗作用）を判定することができる。単独では増殖又は分化に対して全く又は僅かしか効果をもたないが、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）と併用すると有意な作用をもつ化合物があれば、特に関心を引くものになる。別の実施形態では、通常は前駆細胞の増殖及び分化を可能にする上記のような培養条件下で、任意の目的の化合物２種を前駆細胞と接触させることができる。そこで、前駆細胞を２種の目的の化合物と接触させる実験が、前駆細胞を前記化合物それぞれの一方のみと接触させる対照、前駆細胞をＡｃｔｉｍｉｄ（商標）と接触させる対照、並びに細胞を化合物と接触させないか、又はＤＭＳＯと接触させる対照を含むことが好ましい。投与量及び投与するタイミングの変形形態は、同じく上記及び第５．４節に記載のとおりである。
６．１．実施例１：ＣＤ３４ ＋ 前駆細胞の分化に対するサリドマイド、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）及びＲｅｖｉｍｉｄ（商標）の作用
本実施例では、ＣＤ３４＋（造血前駆細胞）細胞の分化とコロニー形成単位（ＣＦＵ）の生成にサリドマイド（Ｔｈａｌ）、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）及びＲｅｖｉｍｉｄ（商標）が及ぼす作用を研究した。重要なことには、この結果が、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）及びＲｅｖｉｍｉｄ（商標）が、赤血球形成コロニー（ＢＦＵ−Ｅ及びＣＦＵ−Ｅ）の生成を特異的に抑制する一方で、白血球及び血小板形成コロニー（ＣＦＵ−ＧＭ）の生成と総コロニー形成単位（ＣＦＵ−Ｔｏｔａｌ）の産生促進との両方を増強するために使用できることを示している。
したがって、本発明の方法は、幹細胞の分化の調節に使用でき、コロニー形成速度の促進にも使用でき、骨髄移植片生着速度と白血球及び／又は血小板産生の回復とを促進することによって造血幹細胞移植に顕著な利益をもたらす。
２０％ウシ胎仔血清及びサイトカイン類（ＩＬ−３、Ｇ−ＣＳＦ及びｋｉｔリガンド（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社））を添加したＩＭＤＭ培地で１ウェルあたり１０００細胞の密度となるように臍帯血ＣＤ３４＋造血前駆細胞を９６ウェル培養ディッシュ内で培養した。細胞を、サリドマイド（Ｔｈａｌ）、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）及びＲｅｖｉｍｉｄ（商標）、又はＤＭＳＯ（対照化合物）に暴露し、６日間培養した。２０％ウシ胎仔血清及びサイトカイン類（ＩＬ−３、Ｇ−ＣＳＦ及びｋｉｔリガンド（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社））を添加したＩＭＤＭ培地で１ウェルあたり１０００細胞の密度で臍帯血ＣＤ３４＋細胞を９６ウェル培養ディッシュに播種した。培養後、細胞を染色して蛍光励起セルソーター（ＦＡＣＳ）で分取した。染色した細胞４００μＬを回収し、１％でウシ胎仔血清を溶解したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈して１．０ｍｌとした。細胞を計数して幹細胞の分化のモジュレーションの作用を判定した。得られた細胞数を図１に示す。
これらの結果は、本発明の化合物が、造血前駆幹細胞の系統分化（lineage commitment）のモジュレーションに有効であることを示している。従って、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）及びＲｅｖｉｍｉｄ（商標）は、赤血球又は赤血球形成コロニー（ＢＦＵ−Ｅ及びＣＦＵ−Ｅ）の生成を特異的に抑制し、白血球及び血小板形成コロニー（ＣＦＵ−ＧＭ）の生成の増強、並びに総コロニー形成単位の生成促進を行うために使用することができる。したがって、本発明の方法は幹細胞の分化の調節に使用でき、特異的コロニー形成速度の促進にも使用でき、目的とする移植片が生着可能な系統に始原幹細胞の分化を方向づけることで骨髄移植片生着速度と白血球及び／又は血小板産生の回復とを促進することによって造血幹細胞移植に顕著な利益をもたらす。Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）及びＲｅｖｉｍｉｄ（商標）による赤血球形成の抑制及びＣＤ３４＋ＣＤ３８−前駆細胞集団の増殖はさらに図２に示す。
６．２．実施例２：ヒト臍帯血ＣＤ３４ ＋ 細胞の増殖及び分化に対するサリドマイド、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）及びＲｅｖｉｍｉｄ（商標）の作用
本実施例では、臍帯血（ＣＢ）単核細胞の増殖とそのＣＤ３４＋（造血前駆）細胞への分化に対するサリドマイド、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）及びＲｅｖｉｍｉｄ（商標）の作用を検討した。臍帯血単核細胞は造血前駆（ＣＤ３４＋）細胞の小集団を含む混合細胞集団である。このＣＤ３４＋細胞の小集団のサブセットには（総ＣＢ単核細胞のおよそ１％の）ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋細胞集団及びそれより小さな（総ＣＢ単核細胞の１％未満の）ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞集団が含まれる。重要なことには、結果は、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）がＣＤ３４＋細胞のアップレギュレーション（分化の促進）をもたらし、またＡｃｔｉｍｉｄ（商標）及びＲｅｖｉｍｉｄ（商標）が、陽性対照及び陰性対照と比較して、造血幹細胞又は前駆細胞の分化を見かけ上阻害又は速度低下しうることを示している（図３〜７）。
６．２．１．材料及び方法
ＣＢのＣＤ３４＋細胞はサイトカイン類（ＩＬ３、Ｇ−ＣＳＦ及びＫｉｔリガンド（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社））を添加した２０％ＦＣＳ ＩＭＤＭ（ウシ胎仔血清／Ｉｓｃｏｖｅ改変ダルベッコ培地）を用い２４ウェルプレート内で４×１０４細胞／ｍｌで培養を開始した。サリドマイド（Ｔｈａｌ）、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）又はＲｅｖｉｍｉｄ（商標）を３つの異なる濃度（５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ及び０．３μｇ／ｍｌ）で培養液に加えた。同容量のＤＭＳＯを対照として用いた。何も化合物を加えない陰性対照も用いた（図３〜７において、「なし」として示す）。細胞を加湿培養器内で５％ＣＯ２の気相下で３７℃にて７日間培養した。次に細胞をそれぞれのウェルから回収した。
ＣＥＬＬ−ＤＹＮ（登録商標）１７００（Ａｂｏｔｔ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で計数することで各ウェルの総細胞数を測定し、ＣＸＣＲ４、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ１１ｂ及びＧｌｙ−Ａの発現をＦＡＣＳ（蛍光励起セルソーティング）染色で分析した（図３〜７）。
２つの異なるドナー（ＣＢ２２７６及びＣＢ２４１７）からのＣＢ細胞を別々に培養し、アッセイし、分析した（表１）。
６．２．２．結果及び考察
サイトカインで刺激されたＣＤ３４＋細胞の増殖に及ぼすサリドマイド、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）又はＲｅｖｉｍｉｄ（商標）の作用を試験した。図４に示すように、陰性対照（「なし」）と比較した場合に、サリドマイド、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）及びＲｅｖｉｍｉｄ（商標）はＩＬ−３、Ｋｉｔリガンド（ＫＬ）及びＧ−ＣＳＦの存在下で培養したＣＤ３４＋細胞の増殖に有意な影響を及ぼさない。しかし、サリドマイド、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）及びＲｅｖｉｍｉｄ（商標）はＤＭＳＯ対照に比べてわずかに多くの細胞の回収を誘導すると考えられる。ＤＭＳＯがこれらの実験において概して細胞増殖に対し負の作用を有することを考慮すると、これらの結果は、同量のＤＭＳＯを担体として使用した場合に、サリドマイド、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）及びＲｅｖｉｍｉｄ（商標）化合物が、ＩＬ−３、ＫＬ及びＧ−ＣＳＦの存在下で培養したＣＤ３４＋細胞の増殖に対し刺激作用を有する可能性があることを示唆している。この点に関して、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）及びＲｅｖｉｍｉｄ（商標）はサリドマイドよりもその作用が大きい。
細胞の分化の発現に及ぼすサリドマイド、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）及びＲｅｖｉｍｉｄ（商標）の作用を表面タンパク質であるＣＸＣＲ４及びＣＤ３４のＦＡＣＳ分析により分析した（図３及び４）。Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）及びＲｅｖｉｍｉｄ（商標）はＣＸＣＲ４の発現に阻害作用を示したが、サリドマイドは示さなかった。Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）はＲｅｖｉｍｉｄ（商標）よりも強力な作用を有していた。
表面タンパク質ＣＤ３４＋に関しては、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）は、ＣＢ２２７６及びＣＢ２４１７培養物の両方においてＣＤ３４＋細胞のアップレギュレーション（増殖の増大）を引き起こした。しかしながら、サリドマイド及びＲｅｖｉｍｉｄ（商標）は、一方のドナーにおいては同様の効果を示したが、別のドナーでは示さなかった。興味深いことに、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）及びＲｅｖｉｍｉｄ（商標）で処理した細胞のいずれにおいても、大部分のＣＤ３４＋細胞及びＣＤ３４−細胞はＣＤ３８−で、対照細胞、ＤＭＳＯ処理細胞、及びサリドマイド処理細胞集団は主にＣＤ３８＋である。これは、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）及びＲｅｖｉｍｉｄ（商標）を使用して、白血球及び血小板形成コロニー（ＣＦＵ−ＧＭ）の生成と総コロニー形成単位の産生促進の両方を増強する一方で、赤血球又は赤血球形成コロニー（ＢＦＵ−Ｅ及びＣＦＵ−Ｅ）の生成を特異的に抑制することができることを示している。したがって、本発明の方法は幹細胞の分化の調節に使用でき、コロニー形成速度の促進にも使用でき、骨髄移植片生着速度と白血球及び／又は血小板産生の回復を改善することによって造血幹細胞移植に顕著な利益をもたらす。以下の表４を参照されたい。
サリドマイド、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）及びＲｅｖｉｍｉｄ（商標）が細胞の分化の発現に及ぼす作用は、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−対ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋の細胞表面タンパク質、又はＣＤ１１ｂ＋の細胞表面タンパク質のＦＡＣＳ分析により分析した。結果を表１に示す。
Figure 2006500911
Ｄ１１ｂ＋細胞集団のサイズには有意な変化はなかったが、Ｒｅｖｉｍｉｄ（商標）の場合には、より大きなＣＤ１１ｂ＋細胞集団が低濃度で観察された。
しかしながら、ＣＤ１１ｂ発現のレベルは、平均免疫蛍光（ＭＩＦ）により測定した場合にＡｃｔｉｍｉｄ（商標）及びＲｅｖｉｍｉｄ（商標）処理細胞の両方において低減しており、これはＣＤ１１ｂの発現が抑制されていることを示した。このことは、ＣＤ１１ｂ＋細胞は、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）及びＲｅｖｉｍｉｄ（商標）の存在下で培養した場合にはあまり分化していない状態となることを示唆している。
６．３．実施例３：ヒト臍帯血ＭＮＣ細胞に対するＡｃｔｉｍｉｄ（商標）及びＲｅｖｉｍｉｄ（商標）の作用
前実施例ではＡｃｔｉｍｉｄ（商標）及びＲｅｖｉｍｉｄ（商標）が臍帯血ＣＤ３４＋細胞におけるＣＸＣＲ４の発現を有意にダウンレギュレートし、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞集団を増加させることが示された。本実施例ではＡｃｔｉｍｉｄ（商標）及びＲｅｖｉｍｉｄ（商標）が臍帯血単核細胞（ＭＮＣ）に対して同様の活性を有することを示す。
６．３．１．材料及び方法
標準法を用いて凍結保存し解凍した臍帯血ＭＮＣを標準Ｆｉｃｏｌｌ分離法で単離し、サイトカイン類（ＩＬ６、ＫＬ及びＧ−ＣＳＦ、各１０ｎｇ／ｍｌ）を加えた２０％ＦＣＳ−ＩＭＤＭに０．５×１０６細胞／ｍｌで２４ウェルプレート内で培養する（三連で行う）。実験群は、なし（サイトカインのみ）、ＤＭＳＯ（１．７μｌ）、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）（ＤＭＳＯ１．７μｌ中に５．０μｇ）、及びＲｅｖｉｍｉｄ（商標）（ＤＭＳＯ１．７μｌ中に５μｇ）とした。１週間培養後に培養細胞を回収し、ＦＡＣＳ染色で分析した。結果を表２及び図８〜１２にまとめる。データは、３つの独立したウエルからの平均±ＳＤとして表した。
Figure 2006500911
６．３．２．結果及び考察
表２及び図８〜１２に示すように、ＤＭＳＯ、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）又はＲｅｖｉｍｉｄ（商標）と共に培養したＭＮＣの総細胞数は対照群（「なし」、サイトカインのみ）において低下した。これは、ＤＭＳＯの作用から生じた可能性がある。ＭＩＤ１と共に培養した細胞培養物は他の全ての群よりもＣＤ３４＋細胞の割合が高かったのに対し、ＣＤ３４＋細胞の総数は全ての群において同様であった。ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞の数はＩＭＪＤ１及びＲｅｖｉｍｉｄ（商標）処理細胞において有意に高く、このことは、化合物による精製ＣＤ３４＋細胞の処理の結果と一致する。ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞が、ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋細胞よりも高い効率で移植後に移植片生着し増殖する、あまり分化していない造血前駆細胞であることは十分に許容しうる（Daoら、1998年、Blood第91巻(4), 1243〜55ページ；Huangら、1994年、Blood第83巻(6), 1515〜26ページ）。
ＤＭＳＯは、臍帯血ＭＮＣにおけるＣＸＣＲ４発現を刺激すると考えられる。Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）及びＲｅｖｉｍｉｄ（商標）は、両対照群と比較して、ＣＤ４５＋細胞におけるＣＸＣＲ４発現の発現を有意に阻害した。
Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）及びＲｅｖｉｍｉｄ（商標）処理細胞の培養物におけるＣＸＣＲ４＋細胞の大部分はＣＤ４５陰性であった。この細胞集団は、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）及びＲｅｖｉｍｉｄ（商標）処理細胞において有意に高かった。
上記の結果は、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）及びＲｅｖｉｍｉｄ（商標）が、幹細胞を順化させて、凍結保存、解凍及び／又は凍結保存剤の曝露が幹細胞に及ぼす悪影響を無効にするために有用であることを示している。この結果はさらに、ＤＭＳＯによるＣＤ３４＋細胞及びＣＤ１４＋細胞集団の抑制は、ＣＤ３４＋細胞及びＣＤ１４＋細胞の増殖能を増強するＡｃｔｉｍｉｄ（商標）又はＲｅｖｉｍｉｄ（商標）で処理することにより無効となり得ることを示す。
６．４．実施例５：単球産生に対するサリドマイド、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）及びＲｅｖｉｍｉｄ（商標）の作用
６．４．１．材料及び方法
加湿した５％ＣＯ２培養器内で、サイトカイン類（ＩＬ−３、ＩＬ６、Ｇ−ＣＳＦ、ＫＬ及びＥｐｏ）を添加した２０％ＦＣＳ ＩＭＤＭ培地において４×１０４細胞／ｍｌで精製ヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞（９０％を超えるＣＤ３４＋）を３７℃で１４日間培養した。実験群は、（ｉ）ＤＭＳＯと化学化合物無添加（「なし」）、（ｉｉ）ＤＭＳＯ単独、（ｉｉｉ）ＤＭＳＯに溶解したサリドマイド、（ｉｖ）ＤＭＳＯに溶解したＡｃｔｉｍｉｄ（商標）、並びに（ｖ）ＤＭＳＯに溶解したＲｅｖｉｍｉｄ（商標）、の群からなる。細胞のアリコートを回収し、ＣＤ３４−ＰＥ結合モノクローナル抗体及びＣＤ１４−ＦＩＴＣ結合モノクローナル抗体で染色した。
６．４．２．結果及び考察
結果は、「なし」の群において、全細胞の０．９５％のみがＣＤ３４＋であったことを示した。ＤＭＳＯ処理群では、細胞の０．１７％のみがＣＤ３４＋であり、このことは、ＤＭＳＯがＣＤ３４＋の増殖及び保存に対し負の作用を有することを示唆している。サリドマイド処理群においては、細胞の０．２４％がＣＤ３４＋であり、ＤＭＳＯ処理細胞と有意には異ならなかった。しかしながらＡｃｔｉｍｉｄ（商標）処理群及びＲｅｖｉｍｉｄ（商標）処理群においては、ＣＤ３４＋細胞が有意に高い割合で存在した（それぞれ１８．７％及び７．１％）（図１３に示す実験結果と図面の説明も参照されたい）。
ＣＤ１４は単球のマーカーである。「なし」の群においては、細胞の１１．５％がＣＤ１４＋であり、ＤＭＳＯ処理群では３．７％がＣＤ１４＋であった。このことは、単球の産生が低減したことを示している。上記のＣＤ３４発現の場合と同様に、サリドマイド処理群及びＤＭＳＯ処理群の結果は同様であった。Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）処理群及びＲｅｖｉｍｉｄ（商標）処理群は同様にＤＭＳＯに曝露しているため、ＤＭＳＯにより阻害される単球の産生がＡｃｔｉｍｉｄ（商標）又はＲｅｖｉｍｉｄ（商標）処理によって克服されることが推定されうる。
６．５．実施例５：臍帯血及び胎盤由来の移植された有核細胞に対するＡｃｔｉｍｉｄ（商標）前処理の作用
本実験はＡｃｔｉｍｉｄ（商標）による前処理が、移植された胎盤有核細胞（ＰＬＮＣ）、臍帯血有核細胞（ＵＣＢＮＣ）及び骨髄細胞（ＢＭＮＣ）の生存を増強することを実証する。
６．５．１．材料及び方法
胎盤有核細胞（ＰＬＮＣ）、臍帯血有核細胞（ＵＣＢＮＣ）及び骨髄細胞（ＢＭＮＣ）はヒトのドナーから得た。ＰＬＮＣ及びＵＣＢＮＣは、第５．４節に記載の方法を用いて胎盤及び臍帯から得た。
細胞を１０ｇ／ｍｌのＡｃｔｉｍｉｄ（商標）と共に２％ヒトＣＢ血清を添加したＤＭＥＭで２４時間インキュベートすることで前処理した。次に、細胞を洗浄し、自己血漿に再懸濁して、標準法にしたがって致死照射（９００ｃＧｙ）により骨髄破壊を生じたレシピエント成体ＳＪＬ／Ｌマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に静脈内投与した。このような放射線照射で照射後５０日以内に９０％以上が死亡する（Endeら、2001年、Life Sciences第69巻(13)、1531〜1539ページ;ChenとEnde、2000年、J. Med.第31巻、21〜30ページ;Endeら、2000年、Life Sci.第67巻(1)、53〜9ページ;EndeとChen、2000年、Am. J. Clin. Pathol.第114巻、89ページ）。
６．５．２．結果及び考察
移植したＰＬＮＣ、ＵＣＢＮＣ及びＢＭＮＣに対するＡｃｔｉｍｉｄ（商標）前処理の作用は、以下の表３に示す。表３に示されるように、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）の前処理によって、移植した胎盤有核細胞（ＰＬＮＣ）、臍帯血有核細胞（ＵＣＢＮＣ）及び骨髄細胞（ＢＭＮＣ）の生存が増大する。
Figure 2006500911
６．６．ＣＤ３４ ＋ 前駆細胞の分化のモジュレーション
６．６．１．材料及び方法
骨髄及び臍帯血ＣＤ３４＋前駆細胞をＣｌｏｎｅｔｉｃｓから入手し、ＳＣＦ、Ｆｌｔ−３Ｌ、ＧＭ−ＣＳＦ及びＴＮＦ−αの存在下でＢＩＴ９５０００（StemCell Technologies）を加えたＩｓｃｏｖｅのＭＤＭで６日間培養し、次にＧＭ−ＣＳＦ及びＴＮＦ−αの存在下でさらに６日間培養した。
細胞表面表現型の分析：第６日及び第１２日にＦＩＴＣ結合ｍＡｂ及びＰＥ結合ｍＡｂを用いて細胞を二重染色（４℃、３０分間）した。使用する抗体としてＢＤ ＰｈａｒｍｉｎｇｅｎからＣＤ３４（ＰＥ）、ＣＤ３８（ＦＩＴＣ）、ＣＤ３３（ＦＩＴＣ）、ＣＤ１ａ（ＦＩＴＣ）、ＣＤ８６（ＰＥ）、ＣＤ１４（ＰＥ）、ＣＤ８３（ＰＥ）、ＣＤ５４（ＰＥ）、ＣＤ１１ｂ（ＰＥ）、ＣＤ１１ｃ（ＰＥ）、ＨＬＡ−ＤＲ（ＰＥ）、ＣＤ１５（ＦＩＴＣ）を、ＭｉｌｔｅｎｙｉからＣＤ１３３（ＰＥ）を入手した。１００００事象（Ｃｏｕｌｔｅｒ）の獲得後にＦＡＣＳｃａｎフローサイトメータで蛍光分析を行った。結果は４回の独立した実験の代表例を示す。
アポトーシスの検出：ヨウ化プロピジウムと組み合わせてアネキシンＶ−ＦＩＴＣ染色（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎアポトーシス検出キットＩ）を使い製造業者の指示に従ってホスファチジルセリンの露出を測定した。
食作用：細胞のエンドサイトーシス活性をＦＩＴＣ−デキストランの取込みを測定することで分析した。細胞を完全培地で１ｍｇ／ｍｌのデキストラン−ＦＩＴＣ（シグマ）と共に３７℃で１時間インキュベートし、陰性対照では４℃で１時間インキュベートした。結果は２回の独立した実験の代表例を示す。
Ｔ細胞増殖アッセイ：１３日間培養後にＣＤ３４＋由来ＤＣ細胞を回収しマイトマイシンＣ（５０μｇ／ｍｌ、シグマ）で処理してから、健康なボランティアの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から精製した同種成人ＣＤ３＋Ｔ細胞用の刺激細胞として使用した。ＣＤ３＋Ｔ応答細胞を５×１０４細胞／ウェルの濃度で使用した。化学発光検出用の９６ウェル透明平底組織培養プレートにＴ細胞を入れ、刺激細胞を段階濃度で加えた。１０％の熱不活性化ＦＢＳ、グルタミン及びペニシリン−ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。６日間培養後、細胞の増殖をＢｒｄＵ化学発光アッセイ（ロシュ、ナトリー、ニュージャージー州）で製造業者の指示に従って測定した。三連の培養から得られる平均±ＳＤとして結果を表す。
６．６．２．結果及び考察
Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）はＣＤ３４＋前駆細胞からのＤＣの発達を有意に改変することが見いだされた。ＤＣの生成に及ぼすＡｃｔｉｍｉｄ（商標）の作用を検討するためにＣＤ３４＋前駆細胞をＡｃｔｉｍｉｄ（商標）（１μＭ）の存在下又は不在下で増殖成熟期（第１〜１２日）の１２日間、又は成熟期（第６〜１２日）の６日間培養した（図１４）。第１〜１２日におけるＡｃｔｉｍｉｄ（商標）の添加はＤＣの表現型の獲得を阻害し（図１５）、さらに重要なことにはＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞集団を増大し、ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋細胞へのＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞の正常な分化を改変した（図１６）。しかし、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）で処理されたＣＤ３４＋細胞はＣＤ３３骨髄系細胞マーカーを獲得し、これらの細胞は第６日にＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３３＋表現型を示した。Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）は第６日にＣＤ１ａ＋細胞の生成をほぼ完全に抑制し、特に二重陽性ＣＤ８６＋ＣＤ１ａ＋細胞の生成を抑制した。この二重陽性細胞集団は表皮ランゲルハンスＤＣの前駆細胞と考えられる。Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）は表皮ＤＣと単球／マクロファージとの両方を生じることができるＣＤ１４＋ＣＤ１ａ−細胞の生成も減少させた。初期前駆細胞集団（ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞）の増加及び骨髄系ＤＣ前駆細胞（ＣＤ１ａ＋ＣＤ１４−細胞及びＣＤ１ａ−ＣＤ１４＋細胞）の遮断は用量依存的であり、１μＭのＡｃｔｉｍｉｄ（商標）で最大に達した（図１７）。この作用は可逆的であり、ＣＤ３４の分化経路の妨害はＣＤ３４＋前駆細胞をＡｃｔｉｍｉｄ（商標）と共に少なくとも３日間培養する場合にのみ観察された（図１８）。
第０〜６日のＡｃｔｉｍｉｄ（商標）の複数回投与はＣＤ３４＋細胞集団の増加を増強した（図１９Ａ）。
Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）の存在下で培養したＣＤ３４＋前駆細胞も第１２日に共刺激分子（ＣＤ８６、ＣＤ８０）の発現の減少を示した（図２０）。ＣＤ５４接着分子はＣＤ５４ｂｒｉｇｈｔ細胞集団の発現の減少とＣＤ５４ｄｉｍ細胞集団の発現の増加と共に改変された（図２１）。Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）で処理したＣＤ３４＋前駆細胞ではＨＬＡ−ＤＲ分子の発現は減少した。
第０〜６日に無処理の培養を行った後、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）を第６日に添加する場合、そしてＣＤ１ａ＋細胞集団がすでに生成していた場合には、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）はＣＤ１ａ＋細胞集団の存続を増大した（表１）。Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）で処理した培養物は第１２日にＤＭＳＯ対照よりも多数のＣＤ１ａ＋前駆細胞を含んでいた。第６日におけるＣＤ３４＋分化細胞へのＡｃｔｉｍｉｄ（商標）の添加によってＣＤ１４＋前駆細胞の生成と共刺激分子（ＣＤ８６、ＣＤ８０）の発現とがかなり減少した。
Figure 2006500911
Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）は顆粒球の分化を促進する：ＤＣの生成の遮断に伴って異なった骨髄系分化経路に変わるかどうかを調べるために、ＣＤ１５顆粒球マーカーの発現をモニターした。Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）の存在下で培養したＣＤ３４＋前駆細胞では細胞表面のＣＤ１５分子の発現が増大した（図２２）。ＤＣの分化を駆動するサイトカイン混合液の存在下では、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）を添加すると、前駆細胞の増殖／成熟はさらに顆粒球様の表現型へと転換した。骨髄系細胞の分化のひずみは、ランゲルハンス細胞及び間質ＤＣの前駆細胞である骨髄系ＤＣ前駆細胞が発現するＣＤ１１ｃと、顆粒球前駆細胞が発現するＣＤ１５という二つのマーカーの発現をモニターすることによって検討した。ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１５−細胞集団の減少はＣＤ１１ｃ−ＣＤ１５＋顆粒球集団が付随して増加することと関係していた（図１９Ｂ）。興味深いことに、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）の複数回投与は顆粒球系統へのシフトを増大させた。
ＤＣ生成の遮断はＤＣ前駆細胞の特異的死滅により媒介されない：ＤＣ前駆細胞の減少が特異的死滅によって媒介されるかを調べるために、ＣＤ３４＋前駆細胞をＳＣＦ、Ｆｌｔ−３Ｌ、ＧＭ−ＣＳＦ及びＴＮＦ−αの存在下で６日間培養した。第６日にＣＤ１ａ＋ＣＤ１４−細胞及びＣＤ１ａ−ＣＤ１４＋細胞（ＤＣ前駆細胞）を磁気セルソーティング（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）で単離した。精製した細胞集団をＧＭ−ＣＳＦ及びＴＮＦ−αの存在下でＡｃｔｉｍｉｄ（商標）（１μＭ）を添加して又は添加しないでさらに２日間培養した。Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）処理によるアネキシンＶ＋−ＰＩ−（アポトーシス初期）細胞集団及びアネキシンＶ＋−ＰＩ＋（アポトーシス後期）細胞集団のレベルに有意な増加はなかった（図２３）。
ＣＤ３４＋前駆細胞から生成したＤＣの機能的活性は変化する：サイトカイン類を添加し、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）を添加して又は添加しないで培養したＣＤ３４＋前駆細胞から得られる細胞の食作用能を第１２日におけるデキストラン−ＦＩＴＣのマンノース受容体媒介型エンドサイトーシスによってアッセイした。Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）を第１〜１２日に添加した場合、ＤＭＳＯ対照に比べ食作用能が大きく減少した（図２４）。Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）を第６〜１２日に添加した場合には、食作用能はＤＭＳＯ対照細胞と同等となった（図２５）。
サイトカインの存在下でＡｃｔｉｍｉｄ（商標）を添加して又は添加しないで培養したＣＤ３４＋細胞の抗原提示能（ＡＰＣ）を第１２日における混合白血球反応（ＭＬＲ）でのＣＤ３＋同種Ｔ細胞の増殖誘導能を測定することで評価した。Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）を第１〜１２日に添加した場合、ＣＤ３４＋細胞はＤＭＳＯ対照と比べてＴ細胞の増殖刺激能の減少を示した（図２６）。対照的に、第６〜１２日にＡｃｔｉｍｉｄ（商標）を添加した場合にはＴ細胞の増殖刺激能はＤＭＳＯ対照細胞と同等となる（図２７）。正常な分化経路とその後のＣＤ３４＋細胞を図２８に示す。
上記の結果は、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）が樹状細胞へのＣＤ３４＋前駆細胞の分化を顕著に減弱したことを示している。その結果、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）で処理された細胞は低い食作用能とＡＰＣ能の低減を示した。より重要なことは、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）が初期造血前駆細胞であるＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞も増加させたことである。それらの初期造血前駆細胞はＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスモデルにおいてより良く移植片を生着させ再増殖することが示された（Tamakiら、2002年、J. Neurosci. Res.第69巻(6)、976〜86ページ）。さらにＡｃｔｉｍｉｄ（商標）は、サイトカイン圧が樹状細胞の分化に好適である場合にも、骨髄系細胞の分化を顆粒球系統にシフトすることによってＣＤ３４＋細胞の分化を別の方向へ向けた。加えて、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）はＣＤ３４＋細胞に毒性作用を有さず、細胞の増殖能を損なわないことが分かった。こういうＤＣの機能のモジュレーションと顆粒球への分化の促進は、様々な癌、免疫疾患及び感染症の治療のために、そして臓器移植及び再生医療において顕著な治療の有用性を有し得る。
上記結果をまとめたグラフとして図２９を参照されたい。
６．７．Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）はＣＤ１３３ ＋ 前駆細胞の分化をモジュレートする
Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）の複数回投与はＣＤ３４＋細胞集団の増大を増強することに加えて、ＣＤ３４ｂｒｉｇｈｔ造血前駆細胞と初期のＣＤ３４−小集団の一部が通常は発現するＣＤ１３３の発現も増大させる（図１９Ａ及び１９Ｂ）。Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）は、ＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋初期造血細胞を多量に存在させる（濃縮する）ことによって、幹細胞移植後の造血細胞の回復に臨床的意義を有するはずである。加えて、ＣＤ１３３＋幹細胞も内皮系統を生じ、創傷治癒の点で貢献することができる。Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）の複数回投与はランゲルハンスＤＣ前駆細胞の生成の遮断を悪化させない。
６．８．骨髄（ＢＭ）Ｓｃａ ＋ 造血前駆細胞からのマウス樹状細胞の生成
６．８．１．材料及び方法
近交系Ｃ５７ＢＬ／６マウスの骨髄をＣｌｏｎｅｔｉｃｓから入手した。造血Ｓｃａ＋Ｌｉｎ−前駆細胞をＳｐｉｎＳｅｐマウス前駆細胞濃縮用カクテル（StemCell Technologies）を用いて濃縮し、マウス増殖因子であるＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＧＭ−ＣＳＦ及びＭ−ＣＳＦの存在下で、ＢＴＩ９５０００（StemCell Technologies）を含むＩｓｃｏｖｅのＭＤＭで９日間培養し、Ｓｃａ＋細胞とＤＣ前駆細胞表現型の増殖を促進した。次に、ＧＭ−ＣＳＦ及びＴＮＦ−αの存在下でさらに３日間培養して細胞を未成熟ＤＣ表現型に推進した。図３０を参照されたい。濃縮したＳｃａ＋Ｌｉｎ−細胞を第０日からＤＭＳＯ（０．１％）、１０μＭのＡｃｔｉｍｉｄ（商標）又は１０μＭのオールトランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ）（ＩＣＮ−Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）の存在下で培養した。第０日及び第９日に細胞に化合物を加えた。
マウス細胞表面表現型の分析：第９日及び第１２日にＦＩＴＣ結合ｍＡｂ及びＰＥ結合ｍＡＢを用いてマウス細胞を二重染色のために処理した（室温で１４分間）。使用する抗体としてＢＤ ＰｈａｒｍｉｎｇｅｎからＳｃａ（ＰＥ）、ＣＤ１１ｂ（ＦＩＴＣ）、Ｇｒ−１（ＦＩＴＣ）、ＣＤ８６（ＰＥ）、ＣＤ１４（ＰＥ）、ＣＤ８０（ＰＥ）、Ｉ−Ａｂ（ＰＥ）、ＣＤ４０（ＰＥ）を、ＭｉｌｔｅｎｙｉからＣＤ３２．１／１６．１（ＦＩＴＣ）を入手した。１００００事象の獲得後にＦＡＣＳｃａｎフローサイトメータ（Ｃｏｕｌｔｅｒ）で蛍光分析を行った。
６．８．２．結果及び考察
Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）はＳｃａ＋前駆細胞からのマウスＤＣの発達を改変することが見いだされた。第９日に細胞は、樹状／骨髄系細胞マーカーであるＣＤ３２／１６（Ｆｃレセプター）、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ８０の細胞表面での高い発現と、Ｉ−Ａｂ及びＣＤ８６の低い発現と、ＣＤ１４及びＧｒ−１としての系統マーカーの発現の欠如とを有するＤＣ前駆細胞表現型を示した（図３１）。Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）は第９日までに細胞表面マーカーの発現に有意な作用を示さないが、ＡＴＲＡはＣＤ８０、Ｉ−Ａｂ及びＳｃａ＋の発現の顕著なダウンレギュレーションを示した（データは示さない）。しかし、第１２日までにＡｃｔｉｍｉｄ（商標）はＣＤ８６及び鮮明なＩ−Ａｂの発現のダウンレギュレーションと、ＣＤ１１ｂの発現のアップレギュレーションとを示した（図３２）。ＡＴＲＡはＡｃｔｉｍｉｄ（商標）と類似するがさらに顕著な作用を示した。加えて、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）はＣＤ４０及びＣＤ８０の発現に作用を示さないが、ＡＴＲＡはこれらの分子の顕著なダウンレギュレーションを示した（データは示さない）。
上記の結果は、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）がＣＤ８６及びＭＨＣＩＩの発現をダウンレギュレーションすることにより未成熟ＤＣへのＤＣ前駆細胞の分化を阻害することを示唆している。この化合物の作用はヒトの造血前駆細胞で観察される作用と同じくらい顕著ではなく、これは他のモデルにおけるｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでのマウスにおけるＡｃｔｉｍｉｄ（商標）の低活性と類似する。Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）の作用は、マウスにおける催奇形物質であるＡＴＲＡの作用に比べずっと弱い。
６．９．ＩＭｉＤｓ以外の化合物に対する分化アッセイの適用
上述した方法、すなわちＣＤ３４＋細胞のような初期前駆細胞の分化にＡｃｔｉｍｉｄ（商標）などのＩＭｉＤｓが及ぼす作用の試験は、分化に及ぼす作用を知ることが望まれる関心のあるどのような化合物にも適用できる。このアッセイを他の化合物に拡大する例として、対照（ＤＭＳＯ処理）細胞と比べたときのＤＣ系統へのＣＤ３４＋細胞の分化に及ぼす、レチノイン酸（ＡＴＲＡ）及びアスピリンの作用をＡｃｔｉｍｉｄ（商標）の作用と比較した。細胞の増殖及び分化に及ぼす作用が既知であること、一部の癌の治療に応用されていること、及び催奇形性作用が知られていることからレチノイン酸を検討した。逆に、免疫調節性をもたない一般に使用されている抗炎症剤であることからアスピリンの作用を検討した。ＳＣＦ、Ｆｌｔ−３Ｌ、ＧＭ−ＣＳＦ及びＴＮＦ−αの存在下で化合物を添加して又は添加しないで６日間培養したＣＤ３４＋前駆細胞の第６日における結果を以下の表２に示す（上向きの矢印は細胞集団の増殖を示し、下向きの矢印は低減を示す）。
Figure 2006500911
文献では他の薬剤が細胞の分化をモジュレートすることが示されている。例えば、最近の論文はコルチコステロイドによるＣＤ３４＋前駆細胞からのＤＣの生成のモジュレーションを報告している。細胞プロフィールはＣＤ１ａ＋細胞集団の増加とＣＤ１４＋細胞集団の減少を伴い、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）とは異なっている。
６．１０．実施例１０：特定の細胞型への分化の誘導
臍帯血細胞及び／又は胚様幹細胞は、増殖因子に曝露することによって特定の細胞型への分化が誘導される。誘導に用いる増殖因子は、限定するものではないが、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、Ｆｌｔ３Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＩＦＮ−α、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、レチノイン酸、塩基性線維芽細胞増殖因子、ＴＧＦ−β−１、ＴＧＦ−β−３、肝細胞増殖因子、上皮増殖因子、カルジオトロピン−１、アンギオテンシノゲン、アンギオテンシンＩ（ＡＩ）、アンギオテンシンＩＩ（ＡＩＩ）、ＡＩＩ ＡＴ２ ２型受容体アゴニスト、又はそれらの類似体若しくはフラグメントが挙げられる。
６．１０．１．ニューロンへの分化の誘導
本実施例は、臍帯血細胞及び／又は胚様幹細胞のニューロンへの分化の誘導を説明する。以下のプロトコールを使用して、ニューロンの分化を誘導する：
１．胎盤幹細胞を、ＤＭＥＭ／２０％ＦＢＳ及び１ｍＭβ−メルカプトエタノールからなる前誘導培地中で２４時間増殖させる
２．前誘導培地を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄する
３．ＤＭＥＭ及び１〜１０ｍＭβ−メルカプトエタノールからなるニューロン誘導培地を添加する。あるいは、ＤＭＥＭ／２％ＤＭＳＯ／２００μＭブチル化ヒドロキシアニソールからなる誘導培地を使用して、ニューロンへの分化効率を増強しうる
４．特定の実施形態においては、形態変化及び分子変化は、血清不含培地及びβ−メルカプトエタノールに曝露後６０分程度の早期に起こりうる（Woodburyら、J. Neurosci. Res.第61巻、364〜370ページ）。ＲＴ／ＰＣＲを使用して、例えば神経増殖因子受容体及び神経フィラメント重鎖遺伝子の発現を評価しうる。
６．１０．２．脂肪細胞への分化の誘導
本実施例は、臍帯血細胞及び／又は胚様幹細胞の脂肪細胞への分化の誘導を説明する。以下のプロトコールを使用して、脂肪形成分化を誘導する：
１．胎盤幹細胞を、１５％臍帯血血清を添加したＭＳＣＧＭ（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）又はＤＭＥＭ中で増殖させる
２．誘導／維持のサイクルを３回行う。各サイクルは、脂質形成誘導培地（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）を用いた胎盤幹細胞の供給、３日間の細胞培養（３７℃、５％ＣＯ２）、その後、脂質形成維持培地（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）における１〜３日間の培養から構成される。誘導培地は、１μＭデキサメタゾン、０．２ｍＭインドメタシン、０．０１ｍｇ／ｍｌインスリン、０．５ｍＭ ＩＢＭＸ、ＤＭＥＭ−高グルコース、ＦＢＳ及び抗生物質を含むものを使用する
３．誘導／維持のサイクルを完全に３回実施した後、細胞を、脂質形成維持培地中で、２〜３日毎に培地を取り替えながらさらに７日間培養する
４．脂質形成は多数の細胞質内脂肪小胞の発生により評価することができ、これは、脂肪親和性染料のオイルレッドＯを使用することにより簡便に観察しうる。ＲＴ／ＰＣＲアッセイを使用して、リパーゼ及び脂肪酸結合タンパク質の遺伝子の発現を調べる。
６．１０．３．軟骨細胞への分化の誘導
本実施例は、臍帯血細胞及び／又は胚様幹細胞の軟骨細胞への分化の誘導を説明する。以下のプロトコールを使用して、軟骨形成分化を誘導する：
１．胎盤幹細胞を、１５％臍帯血血清を添加したＭＳＣＧＭ（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）又はＤＭＥＭ中で維持する
２．胎盤幹細胞を滅菌ポリプロピレンチューブに分注する。細胞を遠心（１５０×ｇ、５分）し、不完全軟骨形成培地（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）で２回洗浄する
３．最終洗浄後、細胞を、０．０１μｇ／ｍｌのＴＧＦ−β−３を含有する完全軟骨形成培地（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）に５×１０５細胞／ｌの濃度で再懸濁する
４．０．５ｍｌの細胞を１５ｍｌポリプロピレン培養チューブに分注する。細胞を１５０×ｇにて５分かけてペレット化する。ペレットを未処理のまま培地中で放置する
５．ゆるく締めたチューブを３７℃にて５％ＣＯ２で２４時間インキュベートする
６．細胞ペレットに、新たに調製した完全軟骨形成培地を２〜３日毎に供給する
７．ペレットを低速ボルテックスを用いて毎日振とうしながら培地中に懸濁して維持する
８．軟骨形成細胞のペレットを培養の１４〜２８日後に回収する
９．軟骨形成は、例えば、好酸性基質の産生の観察、細胞形態の評価、並びに／又はコラーゲン２及びコラーゲン９遺伝子発現を調べるためのＲＴ／ＰＣＲ、により特性決定しうる。
６．１０．４．骨細胞への分化の誘導
本実施例は、臍帯血細胞及び／又は胚様幹細胞の骨細胞への分化の誘導を説明する。以下のプロトコールを使用して、骨形成分化を誘導する：
１．胎盤幹細胞の接着培養物を、１５％臍帯血血清を添加したＭＳＣＧＭ（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）又はＤＭＥＭ中で培養する
２．培養物を組織培養フラスコ中で２４時間保管する
３．骨形成分化は、ＭＳＣＧＭを、０．１μＭデキサメタゾン、０．０５ｍＭアスコルビン酸−２−リン酸、１０ｍＭβ−グリセロリン酸を含有する骨形成誘導培地（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）に置き換えることにより誘導される
４．細胞に、２〜３週間にわたり、３〜４日毎に骨形成誘導培地を供給する
５．分化は、カルシウム特異的染色、並びにアルカリホスファターゼ及びオステオポンチン遺伝子発現についてのＲＴ／ＰＣＲを用いてアッセイする。
６．１０．５．肝細胞への分化の誘導
本実施例は、臍帯血細胞及び／又は胚様幹細胞の肝細胞への分化の誘導を説明する。以下のプロトコールを使用して、肝形成分化を誘導する：
１．胎盤幹細胞を、肝細胞増殖因子（２０ｎｇ／ｍｌ）及び上皮増殖因子（１００ｎｇ／ｍｌ）を添加したＤＭＥＭ／２０％ＣＢＳ中で培養する。ノックアウト血清置換（ＫｎｏｃｋＯｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）をＦＢＳの代わりに使用してもよい
２．ＩＬ−６（５０ｎｇ／ｍｌ）を誘導フラスコに添加する。
６．１０．６．膵臓細胞への分化の誘導
本実施例は、臍帯血細胞及び／又は胚様幹細胞の膵臓細胞への分化の誘導を説明する。以下のプロトコールを使用して、膵臓への分化を誘導する：
１．胎盤幹細胞を、塩基性線維芽細胞増殖因子（１０ｎｇ／ｍｌ）及びトランスフォーミング増殖因子β−１（２ｎｇ／ｍｌ）を添加したＤＭＥＭ／２０％ＣＢＳ中で培養する。ノックアウト血清置換をＣＢＳの代わりに使用してもよい
２．ネスチン陽性神経細胞培養物からの条件培地を５０／５０濃度で培地に添加する
３．細胞を３〜４日毎に培地を供給しながら１４〜２８日間培養する
４．分化は、ＲＴ／ＰＣＲを用いたインスリンタンパク質又はインスリン遺伝子発現についてのアッセイにより評価する。
６．１０．７．心臓細胞への分化の誘導
本実施例は、臍帯血細胞及び／又は胚様幹細胞の心臓細胞への分化の誘導を説明する。以下のプロトコールを使用して、筋組織への分化を誘導する：
１．胎盤幹細胞を、レチノイン酸（１μＭ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（１０ｎｇ／ｍｌ）及びトランスフォーミング増殖因子β−１（２ｎｇ／ｍｌ）、及び上皮増殖因子（１００ｎｇ／ｍｌ）を添加したＤＭＥＭ／２０％ＣＢＳ中で培養する。ノックアウト血清置換をＣＢＳの代わりに使用してもよい
２．あるいは、胎盤幹細胞を、５０ｎｇ／ｍｌカルジオトロピン−１を添加したＤＭＥＭ／２０％ＣＢＳ中で２４時間培養する
３．あるいは、胎盤幹細胞をタンパク質不含培地中で５〜７日間維持し、ヒト心筋抽出物で刺激（上昇する用量分析）する。心筋抽出物は、１％臍帯血血清を添加した１％ＨＥＰＥＳバッファー中で１ｇのヒト心筋をホモジネートすることにより調製する。懸濁液を６０分間インキュベートした後、遠心し、上清を回収する
４．細胞を、３〜４日毎に培地交換しながら１０〜１４日間培養する
５．分化は、ＲＴ／ＰＣＲによる心筋アクチンの遺伝子発現アッセイを用いて評価する。
６．１０．８．分化前及び／又は分化後の臍帯血細胞及び／又は胚様幹細胞の特性決定
胚様幹細胞、臍帯血細胞、及び／又は胚様幹細胞で刺激（spike）した臍帯血細胞集団を、その分化の前及び／又は後に、形態の変化及び細胞表面マーカーの変化をフローサイトメトリー及び免疫細胞化学などにより判定することにより、並びに遺伝子発現の変化をＰＣＲなどの技術を用いて測定することにより特性決定する。増殖因子に曝露し及び／又は分化した細胞は、以下の細胞表面マーカーの存在又は不在により特性決定する：ＣＤ１０＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ３４−、ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ５４＋、ＣＤ９０＋、ＳＨ２＋、ＳＨ３＋、ＳＨ４＋、ＳＳＥＡ３−、ＳＳＥＡ４−、ＯＣＴ−４＋、及びＡＢＣ−ｐ＋。好ましくは、胚様幹細胞を、分化の前に細胞表面マーカーＯＣＴ−４＋、ＡＰＣ−ｐ＋、ＣＤ３４−及びＣＤ３８−の存在により特性決定する。これらのマーカーを有する幹細胞は、ヒト胚幹細胞のように多目的（例えば分化多能性）である。臍帯血細胞は、分化の前に細胞表面マーカーＣＤ３４＋及びＣＤ３８＋の存在により特性決定する。胚様幹細胞、臍帯血細胞及び／又は胚様幹細胞で刺激した臍帯血細胞の集団から誘導される分化細胞は、好ましくはこれらのマーカーを発現しない。
本発明は本明細書に記載する特定の実施態様によりその範囲が限定されることはない。むしろ、上記の説明から本明細書で記載する改変のほかに本発明の様々な改変が当業者に明らかであろう。そのような改変は添付の特許請求の範囲の範囲内に入るものとする。
７．参考文献
本明細書において引用した全ての参考文献は、各刊行物、特許又は特許出願が全ての目的でその全体が参照によって組み入れられることが特にまた個々に示されているかのごとく同程度に、全ての目的で、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
いかなる刊行物の引用も本出願以前に公表されているものであり、本発明が先行技術に照らしてそのような刊行物に先行する資格を与えられないという承認として解釈されるべきではない。
１μｇ／ｍｌ及び１０μｇ／ｍｌの濃度におけるサリドマイド（ＴＨＤ）、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）及びＲｅｖｉｍｉｄ（商標）の存在下における臍帯血ＣＤ３４＋細胞の培養結果を示す棒グラフである。Ｙ軸：コロニー数。 フローサイトグラムを示す。Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）及びＲｅｖｉｍｉｄ（商標）へのヒト臍帯血ＣＤ４５＋細胞の曝露によって、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞の赤血球生成及び増殖が阻害される。 フローサイトグラムを示す。Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）又はＲｅｖｉｍｉｄ（商標）へのヒト臍帯血ＣＤ４５＋細胞の曝露によって、サイトカイン類ＩＬ３、ＫＬ及びＧ−ＣＳＦと共に１４日間培養したヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞上でのＣＸＣＲ４の発現が阻害される。 フローサイトグラムを示す。Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）又はＲｅｖｉｍｉｄ（商標）へのヒト臍帯血ＣＤ４５＋細胞の曝露によって、ＣＤ３４＋及び／又はＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞集団の増殖が促進される。 フローサイトグラムを示す。Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）又はＲｅｖｉｍｉｄ（商標）へのヒト臍帯血ＣＤ４５＋細胞の曝露によって、ヒト臍帯血前駆細胞の有意な保存（preservation）がもたらされる。 フローサイトグラムを示す。Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）及びＲｅｖｉｍｉｄ（商標）へのヒト臍帯血ＣＤ４５＋細胞の曝露によって、ＣＸＣＲ４の発現が阻害され、ＣＤ４５＋細胞の集団が増殖する。 フローサイトグラムを示す。Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）及びＲｅｖｉｍｉｄ（商標）へのヒト臍帯血ＣＤ４５＋細胞の曝露によって、ＣＤ３４＋前駆細胞数が増大し、顆粒球及び単球の産生が増大する。 フローサイトグラムを示す。Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）及びＲｅｖｉｍｉｄ（商標）へのヒト臍帯血ＣＤ４５＋細胞の曝露によって、ＣＤ３４＋前駆細胞が増殖し、単球産生のＤＭＳＯ媒介型抑制を妨害する。 フローサイトグラムを示す。Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）へのヒト臍帯血ＣＤ４５＋細胞の曝露によって、Ｂ細胞への分化に対するわずかな抑制的作用が示された。 フローサイトグラムを示す。Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）及びＲｅｖｉｍｉｄ（商標）へのヒト臍帯血ＣＤ４５＋細胞の曝露によって、ＤＭＳＯへの曝露によりもたらされるＣＸＣＲ５の抑制が回復する。 フローサイトグラムを示す。Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）及びＲｅｖｉｍｉｄ（商標）へのヒト臍帯血単核細胞（ＭＮＣ）の曝露によって、ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋細胞集団が増大する。 フローサイトグラムを示す。Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）及びＲｅｖｉｍｉｄ（商標）へのＭＮＣの曝露によって、ＣＸＣＲ４＋ＣＤ４５＋細胞集団がダウンレギュレートされるが、ＣＸＣＲ＋ＣＤ４５−細胞集団は増大する。 フローサイトグラムを示す。臍帯血の有核細胞画分における造血前駆細胞の分化の系統の方向付けに対する、サリドマイド、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）及びＲｅｖｉｍｉｄ（商標）の作用を示す。 ＣＤ３４＋細胞の分化とＤＣ細胞への成熟に対するＡｃｔｉｍｉｄ（商標）の作用の研究の概要を示す。 第１日からＡｃｔｉｍｉｄ（商標）に曝露したＣＤ３４＋細胞の第６日における表現型の特徴を示すフローサイトグラムである。 増殖期（第１日〜第６日）におけるＡｃｔｉｍｉｄ（商標）曝露がＣＤ３４＋細胞に及ぼす作用（第６日）を示すフローサイトグラムである。 Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）が第０日〜第６日における培養物からのＣＤ３４＋細胞由来細胞集団におけるシフトを誘導することを示す。 種々の時間にわたりＡｃｔｉｍｉｄ（商標）で処理したＣＤ３４＋細胞の第６日における表現型の変化を示す。 Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）の単回又は複数回投与で処理したＣＤ３４＋前駆細胞の第６日における表現型の変化を示す。図１９Ａ：条件１：第０日におけるＡｃｔｉｍｉｄ（商標）の単回投与、条件２：第０日及び第４日におけるＡｃｔｉｍｉｄ（商標）の投与、条件３：第０日、第２日及び第４日におけるＡｃｔｉｍｉｄ（商標）の投与。 Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）の単回又は複数回投与で処理したＣＤ３４＋前駆細胞の第６日における表現型の変化を示す。図１９Ｂ：条件１：第０日におけるＡｃｔｉｍｉｄ（商標）の単回投与、条件２：第０日、第４日、第６日及び第８日におけるＡｃｔｉｍｉｄ（商標）の投与、条件３：第０日、第２日、第４日、第６日及び第８日におけるＡｃｔｉｍｉｄ（商標）の投与。 第１日〜第１２日にＡｃｔｉｍｉｄ（商標）（１μＭ）に曝露したＣＤ３４＋細胞から生成された第１２日における樹状細胞のフローサイトグラムである。 第１日〜第１２日にＡｃｔｉｍｉｄ（商標）（１μＭ）に曝露したＣＤ３４＋細胞から生成された第１２日における樹状細胞のフローサイトグラムである。 Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）がＣＤ３４＋前駆細胞からの顆粒球への分化を促進することを示す。 Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）がＣＤ１ａ＋又はＣＤ１４＋前駆細胞のアポトーシスを誘導しないことを示す。 Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）の存在下又は不在下で１２日間増殖させたＣＤ３４＋細胞のフローサイトグラムである。 １２日間培養し、第６日〜第１２日にＡｃｔｉｍｉｄ（商標）の存在下又は不在下で培養したＣＤ３４＋細胞のフローサイトグラムである。 Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）が１２日間培養したＣＤ３４＋細胞の抗原提示能を低減することを示す。 Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）が、第６日〜第１２日にＡｃｔｉｍｉｄ（商標）中で培養したＣＤ３４＋細胞に及ぼすＡＰＣ低減活性をほとんど有しないことを示す。 ＧＭ−ＣＳＦ及びＴＮＦ−αの存在下で培養したＣＤ３４＋造血前駆細胞の分化経路を示す。 ＧＭ−ＣＳＦ及びＴＮＦ−αの存在下で培養したＣＤ３４＋造血前駆細胞の分化経路に対するＡｃｔｉｍｉｄ（商標）の作用を示す図である。 ネズミＳｃａ＋Ｌｉｎ造血前駆細胞の成熟条件を示すダイアグラムである。 正常培養条件における第９日に存在するネズミ細胞を示す（実施例１の材料及び方法、図３０の説明を参照）。 ＤＭＳＯ、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）又はＡＴＲＡで処理したネズミ細胞の第１２日におけるフローサイトグラムを示す。

Claims (107)

  1. 哺乳動物の幹細胞の分化をモジュレートする方法であって、適切な条件下及びＴＮＦ−α活性を阻害する化合物の存在下で幹細胞を分化させるステップを含み、前記化合物が、ポリペプチド、ペプチド、タンパク質、ホルモン、サイトカイン、オリゴヌクレオチド、又は核酸ではない、上記方法。
  2. 前記幹細胞を造血細胞に分化させる、請求項１に記載の方法。
  3. 前記幹細胞が、胚幹細胞、胎盤幹細胞、臍帯血幹細胞、末梢血幹細胞、及び骨髄幹細胞からなる群より選択されるものである、請求項１に記載の方法。
  4. 前記化合物がアミノ置換サリドマイド類似体又はアミノ置換イソインドリンである、請求項１に記載の方法。
  5. 前記アミノ置換サリドマイド類似体又はアミノ置換イソインドリンが、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）、Ｒｅｖｉｍｉｄ（商標）、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）の類似体若しくはプロドラッグ、Ｒｅｖｉｍｉｄ（商標）の類似体若しくはプロドラッグ、及び下記式の化合物：
    Figure 2006500911
     〔式中、Ｘ及びＹの一方がＣ＝Ｏであり、Ｘ及びＹの他方がＣ＝Ｏ又はＣＨ２である。〕
    からなる群より選択されるものである、請求項４に記載の方法。
  6. 前記アミノ置換サリドマイドが、１−オキソ−２−（２，６−ジオキソピペリジン−３−イル）−５−アミノイソインドリン、１−オキソ−２−（２，６−ジオキソピペリジン−３−イル）−４−アミノイソインドリン、１−オキソ−２−（２，６−ジオキソピペリジン−３−イル）−６−アミノイソインドリン、１−オキソ−２−（２，６−ジオキソピペリジン−３−イル）−５−アミノイソインドリン、１，３−ジオキソ−２−（２，６−ジオキソピペリジン−３−イル）−４−アミノイソインドリン、及び１，３−ジオキソ−２−（２，６−ジオキソピペリジン−３−イル）−５−アミノイソインドリンからなる群より選択されるものである、請求項４に記載の方法。
  7. 前記接触ステップが細胞培養物において行われる、請求項１に記載の方法。
  8. 前記接触ステップが個体内で行われる、請求項１に記載の方法。
  9. 前記化合物の濃度が約０．００５μｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌである、請求項１に記載の方法。
  10. 前記幹細胞がヒト幹細胞である、請求項１に記載の方法。
  11. 哺乳動物のＣＤ３４＋若しくはＣＤ１３３＋前駆細胞の増殖又は分化をモジュレートする方法であって、増殖又は分化に適する条件下及びＴＮＦ−α活性を阻害する化合物の存在下で前記細胞を増殖又は分化させるステップを含み、前記化合物が、ポリペプチド、ペプチド、タンパク質、ホルモン、サイトカイン、オリゴヌクレオチド、又は核酸ではない、上記方法。
  12. 前記前駆細胞がＣＤ３４＋前駆細胞及びＣＤ１３３＋前駆細胞からなる群より選択されるものである、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記前駆細胞をＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３３＋又はＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３３−細胞に分化させる、請求項１１に記載の方法。
  14. 前記化合物類似体がアミノ置換サリドマイド類似体又はアミノ置換イソインドリンである、請求項１１に記載の方法。
  15. 前記化合物が、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）、Ｒｅｖｉｍｉｄ（商標）、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）の類似体若しくはプロドラッグ、Ｒｅｖｉｍｉｄ（商標）の類似体若しくはプロドラッグ、及び下記式の化合物：
    Figure 2006500911
     〔式中、Ｘ及びＹの一方がＣ＝Ｏであり、Ｘ及びＹの他方がＣ＝Ｏ又はＣＨ２である。〕
    からなる群より選択されるものである、請求項１１に記載の方法。
  16. 前記化合物が、１−オキソ−２−（２，６−ジオキソピペリジン−３−イル）−５−アミノイソインドリン、１−オキソ−２−（２，６−ジオキソピペリジン−３−イル）−４−アミノイソインドリン、１−オキソ−２−（２，６−ジオキソピペリジン−３−イル）−６−アミノイソインドリン、１−オキソ−２−（２，６−ジオキソピペリジン−３−イル）−５−アミノイソインドリン、１，３−ジオキソ−２−（２，６−ジオキソピペリジン−３−イル）−４−アミノイソインドリン、及び１，３−ジオキソ−２−（２，６−ジオキソピペリジン−３−イル）−５−アミノイソインドリンからなる群より選択されるものである、請求項１１に記載の方法。
  17. 前記接触ステップが細胞培養物において行われる、請求項１１に記載の方法。
  18. 前記接触ステップが個体内で行われる、請求項１１に記載の方法。
  19. 前記前駆細胞が前記個体に移植された細胞である、請求項１７に記載の方法。
  20. 前記接触ステップが、対照と比較して分化又は増殖に検出可能な差異を生じるのに十分である、請求項１１に記載の方法。
  21. 前記ＣＤ３４＋又はＣＤ１３３＋前駆細胞が前記分化ステップの前に凍結保存し解凍したものである、請求項１１に記載の方法。
  22. ＣＤ３４＋又はＣＤ１３３＋前駆細胞の分化をモジュレートする方法であって、
    （ａ）分化が起こり得る条件下で前記前駆細胞の集団を準備するステップ、
    （ｂ）前記前駆細胞と、アミノ置換サリドマイド類似体又はアミノ置換イソインドリンである化合物とを接触させるステップ、
    （ｃ）分化に適した条件下で前記前駆細胞を分化させるステップであって、前記化合物が、前記前駆細胞が分化する期間の少なくとも一時期の間にわたり前記前駆細胞と接触させて配置される、分化ステップ、
    を含む、上記方法。
  23. ステップ（ｂ）において、前記接触を培養第０日〜第６日の間の任意の時期に実施する、請求項２２に記載の方法。
  24. ステップ（ｂ）において、前記接触を前記前駆細胞の培養開始時に実施する、請求項２２に記載の方法。
  25. ステップ（ｂ）において、前記接触を前記前駆細胞を少なくとも２日間増殖させた後に実施する、請求項２２に記載の方法。
  26. ステップ（ｂ）において、前記接触を前記前駆細胞を少なくとも６日間増殖させた後に実施する、請求項２２に記載の方法。
  27. 前記前駆細胞がＣＤ３４＋前駆細胞である、請求項２２に記載の方法。
  28. 前記前駆細胞を、
    対照と比較してＣＤ１１ｃの発現が低減、
    対照と比較してＣＤ３８の発現が低減、
    対照と比較してＣＤ８０の発現が低減、
    対照と比較してＣＤ８６の発現が低減、
    対照と比較してＣＤ１ａの発現が低減、
    対照と比較してＣＤ１４の発現が低減、
    対照と比較してＣＤ５４ｂｒｉｇｈｔの発現が低減、
    対照と比較してＨＬＡ−ＤＲの発現が低減、
    対照と比較してＣＤ１５の発現が増大、
    対照と比較してＣＤ３３の発現が増大、
    対照と比較してＣＤ５４ｄｉｍの発現が増大、
    対照と比較してＣＤ１３３の発現が増大、及び
    上記マーカー特性のいずれかの組合せ、
    からなる群より選択される細胞表面マーカー特性を示す細胞へと分化させるものであり、
    ここで前記対照は、前記化合物の不在下で前記前駆細胞と同じ条件下で培養したＣＤ３４＋前駆細胞である、請求項２２に記載の方法。
  29. 前記前駆細胞をＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３３＋又はＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３３−細胞へと分化させる、請求項２２に記載の方法。
  30. 前記サリドマイド類似体がＡｃｔｉｍｉｄ（商標）又はＲｅｖｉｍｉｄ（商標）である、請求項２２に記載の方法。
  31. 哺乳動物被験体において前駆細胞集団を増殖させる方法であって、治療上有効な量のＣＤ３４＋前駆細胞とＴＮＦ−α活性を阻害する化合物とを前記哺乳動物被験体に投与するステップを含み、前記化合物が、ポリペプチド、ペプチド、タンパク質、ホルモン、サイトカイン、オリゴヌクレオチド、又は核酸ではない、上記方法。
  32. 前記ＣＤ３４＋前駆細胞を前記哺乳動物被験体中で分化させる、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記ＣＤ３４＋前駆細胞を、赤血球を実質的に含まない細胞調製物の形態で前記哺乳動物被験体に投与する、請求項３１に記載の方法。
  34. 前記ＣＤ３４＋前駆細胞を、骨髄細胞、胎盤細胞、又は臍帯血細胞を含む細胞調製物の形態で前記哺乳動物被験体に投与する、請求項３１に記載の方法。
  35. 前記ＣＤ３４＋前駆細胞を、担体と共に前記哺乳動物被験体に投与する、請求項３１に記載の方法。
  36. 前記ＣＤ３４＋前駆細胞がＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３３＋又はＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３３−前駆細胞である、請求項３１に記載の方法。
  37. 前記ＣＤ３４＋細胞がＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋前駆細胞である、請求項３１に記載の方法。
  38. 前記前駆細胞が組み込まれている目的の遺伝物質を発現するものである、請求項３１に記載の方法。
  39. 哺乳動物幹細胞及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物であって、前記幹細胞が、前記幹細胞の分化又は増殖をモジュレートするのに十分な時間にわたりＴＮＦ−α活性を阻害する化合物と接触させたものであって、前記化合物は、ポリペプチド、ペプチド、タンパク質、ホルモン、サイトカイン、オリゴヌクレオチド、又は核酸ではない、上記医薬組成物。
  40. 前記幹細胞が、胚幹細胞、胎盤幹細胞、臍帯血幹細胞、末梢血幹細胞、及び骨髄幹細胞からなる群より選択されるものである、請求項３９に記載の医薬組成物。
  41. 前記化合物が、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）、Ｒｅｖｉｍｉｄ（商標）、Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）の類似体、Ｒｅｖｉｍｉｄ（商標）の類似体、及び下記式の化合物：
    Figure 2006500911
     〔式中、Ｘ及びＹの一方がＣ＝Ｏであり、Ｘ及びＹの他方がＣ＝Ｏ又はＣＨ２である。〕
    からなる群より選択されるものである、請求項３９に記載の医薬組成物。
  42. 前記接触ステップが細胞培養物において行われる、請求項３９に記載の医薬組成物。
  43. 前記化合物の濃度が約０．００５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌである、請求項３９に記載の医薬組成物。
  44. 前記幹細胞がヒト幹細胞である、請求項３９に記載の医薬組成物。
  45. 前記分化が造血細胞への分化である、請求項３９に記載の医薬組成物。
  46. 前記造血細胞がＣＤ３４＋又はＣＤ３８＋造血細胞である、請求項４５に記載の医薬組成物。
  47. 前記造血細胞がＣＤ１１ｂ＋細胞である、請求項４５に記載の医薬組成物。
  48. 単離された臍帯血細胞と単離された白血球集団とを含む医薬組成物であって、前記白血球が、適切な条件下及びＴＮＦ−α活性を阻害する化合物の存在下で幹細胞を分化させるステップであって、前記化合物が、ポリペプチド、ペプチド、タンパク質、ホルモン、サイトカイン、オリゴヌクレオチド、又は核酸ではない上記分化ステップと、それによって分化した前記白血球を単離するステップとを含む方法によって生成されるものである、上記医薬組成物。
  49. 前記化合物がイミド又はアミドである、請求項４８に記載の医薬組成物。
  50. 前記分化ステップが細胞培養物において行われる、請求項４８に記載の医薬組成物。
  51. 前記化合物の濃度が約０．００５μｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌである、請求項４８に記載の医薬組成物。
  52. 前記幹細胞がヒト幹細胞である、請求項４８に記載の医薬組成物。
  53. 前記幹細胞が前駆細胞である、請求項４８に記載の医薬組成物。
  54. 前記前駆細胞を特定の細胞系統にする（committed）、請求項５３に記載の医薬組成物。
  55. 前記前駆細胞が造血前駆細胞である、請求項５４に記載の医薬組成物。
  56. 培養されたＣＤ３４＋又はＣＤ１３３＋前駆細胞及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物であって、前記前駆細胞が、培養して最初の６日間以内に、前記前駆細胞の増殖及び分化を促進する条件下でＴＮＦ−α活性を阻害する化合物と接触させたものである、上記医薬組成物。
  57. 前記前駆細胞が培養して６日後に回収され凍結保存されたものである、請求項５６に記載の医薬組成物。
  58. 前記前駆細胞がＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３４−又はＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３４＋細胞である、請求項５６に記載の医薬組成物。
  59. 前記化合物がサリドマイド又はサリドマイド類似体である、請求項５６に記載の医薬組成物。
  60. 前記化合物がＡｃｔｉｍｉｄ（商標）又はＲｅｖｉｍｉｄ（商標）である、請求項５６に記載の医薬組成物。
  61. 哺乳動物幹細胞の移植方法であって、
    （ａ）前記幹細胞とサリドマイド又はサリドマイド類似体とを接触させて、処理幹細胞を生成するステップであって、その接触が前記幹細胞の分化をモジュレートするのに十分である、上記ステップ、
    （ｂ）前記処理幹細胞を個体に投与するステップ、
    を含む、上記方法。
  62. ステップ（ｂ）が、前記処理幹細胞と併せて未処理細胞を投与することを含む、請求項６１に記載の方法。
  63. 前記未処理細胞が、胚幹細胞、胎盤細胞、臍帯血細胞、末梢血細胞、及び骨髄細胞からなる群より選択されるものである、請求項６１に記載の方法。
  64. 前記幹細胞が前記投与ステップの前に凍結保存し解凍されたものである、請求項６１に記載の方法。
  65. 哺乳動物前駆細胞の移植方法であって、
    （ａ）前記前駆細胞とサリドマイド又はサリドマイド類似体とを接触させて、処理前駆細胞を生成するステップであって、その接触が前記前駆細胞の分化をモジュレートするのに十分である、上記ステップ、
    （ｂ）前記処理前駆細胞を個体に投与するステップ、
    を含む、上記方法。
  66. ステップ（ｂ）が、前記処理前駆細胞と併せて未処理細胞を投与することを含む、請求項６５に記載の方法。
  67. 前記未処理細胞が、胚幹細胞、胎盤細胞、臍帯血細胞、末梢血細胞、及び骨髄細胞からなる群より選択されるものである、請求項６５に記載の方法。
  68. 前記幹細胞が前記投与の前に凍結保存し解凍されたものである、請求項６５に記載の方法。
  69. ある症状に罹患している個体の治療方法であって、前記個体に、
    （ａ）前記幹細胞の分化又は増殖をモジュレートするのに十分な時間にわたる、ポリペプチド、ペプチド、タンパク質、ホルモン、サイトカイン、オリゴヌクレオチド、又は核酸ではない、ＴＮＦ−α活性を阻害する化合物、
    （ｂ）前記化合物の存在下で分化させた幹細胞、及び
    （ｃ）前記化合物の存在下で分化させた前駆細胞、
    からなる群より選択される作用物質を投与するステップを含み、
    前記作用物質が、前記症状を検出可能な程度に軽減又は改善するものである、上記方法。
  70. 前記症状が炎症である、請求項６９に記載の方法。
  71. 個体の治療方法であって、レシピエント哺乳動物被験体に治療上有効な量の白血球を投与するステップを含み、前記白血球が、適切な条件下及びＴＮＦ−α活性を阻害する化合物の存在下で幹細胞を分化させるステップであって、前記化合物が、ポリペプチド、ペプチド、タンパク質、ホルモン、サイトカイン、オリゴヌクレオチド、又は核酸ではない、分化ステップを含む方法によって生成されるものである、上記方法。
  72. 前記幹細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで分化させる、請求項７１に記載の方法。
  73. 前記幹細胞を、灌流を行った分娩後胎盤において分化させる、請求項７１に記載の方法。
  74. 前記白血球を、赤血球を実質的に含まない細胞調製物の形態で前記個体に投与する、請求項７１に記載の方法。
  75. 前記白血球を、臍帯血細胞を含む細胞調製物の形態で前記個体に投与する、請求項７１に記載の方法。
  76. 前記白血球細胞を担体と共に前記個体に投与する、請求項７１に記載の方法。
  77. 前記白血球を投与して、レシピエント哺乳動物被験体の欠陥を治療又は修復する、請求項７１に記載の方法。
  78. 前記欠陥が造血細胞又は血球の増殖異常である、請求項７７に記載の方法。
  79. 前記造血細胞又は血球の増殖異常が好中球減少又は白血球減少である、請求項７７に記載の方法。
  80. 前記白血球を全身投与する、請求項７７に記載の方法。
  81. 前記白血球を静脈内投与する、請求項７７に記載の方法。
  82. 前記白血球が組み込まれている目的の遺伝物質を発現するものである、請求項７７に記載の方法。
  83. 前記白血球が同種異系である、請求項７１に記載の方法。
  84. 前記レシピエント哺乳動物被験体がヒトである、請求項７１に記載の方法。
  85. ＣＤ３４＋前駆細胞から分化細胞を作製する方法であって、増殖及び分化を可能にする培地中で前記細胞を培養するステップ、並びに前記前駆細胞とＡｃｔｉｍｉｄ（商標）若しくはＲｅｖｉｍｉｄ（商標）とを接触させるステップを含む、上記方法。
  86. 前記接触ステップを前記培養の初日に実施する、請求項８５に記載の方法。
  87. 前記接触ステップを前記培養の最初の６日間に少なくとも２回実施する、請求項８５に記載の方法。
  88. 前記接触ステップを前記培養初日よりも早期に実施しない、請求項８５に記載の方法。
  89. 前記分化細胞が、樹状細胞、顆粒球、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３３＋又はＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３３−細胞である、請求項８５に記載の方法。
  90. 前記ＣＤ３４＋前駆細胞がＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋前駆細胞である、請求項８５に記載の方法。
  91. 前記分化細胞を培養第６日に単離する、請求項８５に記載の方法。
  92. 前記分化細胞を培養第１２日に単離する、請求項８５に記載の方法。
  93. 前記ＣＤ３４＋細胞が前記培養ステップの前に他の血球から単離されたものである、請求項８５に記載の方法。
  94. 前記培地がさらにＧＭ−ＣＳＦ及びＴＮＦ−αを含有する、請求項８５に記載の方法。
  95. 前記Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）が０．１μＭ〜１０．０μＭの濃度で存在する、請求項８５に記載の方法。
  96. 前記Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）が１．０μＭの濃度で存在する、請求項８５に記載の方法。
  97. 医薬組成物の製造方法であって、
    （ａ）ＣＤ３４＋又はＣＤ１３３＋前駆細胞とＴＮＦ−α活性を阻害する化合物とを接触させるステップであって、前記前駆細胞を、その増殖及び分化を可能にする培養条件下で６日間培養するものである、接触ステップ、
    （ｂ）培養して６日後に前記細胞を回収するステップ、
    （ｃ）前記細胞を薬学的に許容される担体中に配置するステップ、
    を含む、上記方法。
  98. 前記接触ステップを培養初日に実施する、請求項９７に記載の方法。
  99. 前記接触ステップを、前記培養の６日間に少なくとも２回実施する、請求項９７に記載の方法。
  100. 前記化合物がサリドマイド又はサリドマイド類似体である、請求項９７に記載の方法。
  101. 前記化合物がＡｃｔｉｍｉｄ（商標）又はＲｅｖｉｍｉｄ（商標）である、請求項９７に記載の方法。
  102. 前記前駆細胞が前記培養の前に他の血球から単離されたものである、請求項９７に記載の方法。
  103. 前記培地がさらにＧＭ−ＣＳＦ及びＴＮＦ−αを含有する、請求項９７に記載の方法。
  104. 前記Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）又はＲｅｖｉｍｉｄ（商標）が０．１μＭ〜１０．０μＭの濃度で存在する、請求項１０１に記載の方法。
  105. 前記Ａｃｔｉｍｉｄ（商標）又はＲｅｖｉｍｉｄ（商標）が１．０μＭの濃度で存在する、請求項１０１に記載の方法。
  106. 前記細胞を前記回収ステップの後に凍結保存する、請求項６に記載の方法。
  107. 請求項９７に記載の方法によって製造された医薬組成物。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009536824A (ja) * 2006-05-11 2009-10-22 直子 武部 臍帯血幹細胞の回収方法及び使用方法
JP2009538318A (ja) * 2006-05-26 2009-11-05 セルジーン・コーポレーション 併用療法において免疫調節化合物を用いる方法及び組成物

Families Citing this family (198)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HU228769B1 (en) * 1996-07-24 2013-05-28 Celgene Corp Substituted 2(2,6-dioxopiperidin-3-yl)phthalimides and -1-oxoisoindolines and their use for production of pharmaceutical compositions for mammals to reduce the level of tnf-alpha
US5635517B1 (en) 1996-07-24 1999-06-29 Celgene Corp Method of reducing TNFalpha levels with amino substituted 2-(2,6-dioxopiperidin-3-YL)-1-oxo-and 1,3-dioxoisoindolines
BR9914465A (pt) 1998-09-29 2001-10-09 Gamida Cell Ltd Métodos para controlar a proliferação e a diferenciação de células-tronco e células progenitoras e uma composição farmacêutica para induzir a diferenciação em uma população de células
EP2311938B1 (en) * 1999-02-04 2016-04-06 Pluristem Ltd. Method and apparatus for maintenance and expansion of hemopoietic stem cells and/or progenitor cells
US7629360B2 (en) * 1999-05-07 2009-12-08 Celgene Corporation Methods for the treatment of cachexia and graft v. host disease
US6458810B1 (en) 2000-11-14 2002-10-01 George Muller Pharmaceutically active isoindoline derivatives
NZ526683A (en) 2000-11-30 2008-03-28 Childrens Medical Center Synthesis of 4-amino-thalidomide and its enantiomers that are suitable for inhibiting angiogenesis
US7311905B2 (en) * 2002-02-13 2007-12-25 Anthrogenesis Corporation Embryonic-like stem cells derived from post-partum mammalian placenta, and uses and methods of treatment using said cells
US20080152629A1 (en) * 2000-12-06 2008-06-26 James Edinger Placental stem cell populations
WO2002046373A1 (en) * 2000-12-06 2002-06-13 Hariri Robert J Method of collecting placental stem cells
ES2549161T3 (es) 2001-02-14 2015-10-23 Anthrogenesis Corporation Placenta post-parto de mamífero, su uso y células madre placentarias de la misma
US6942802B2 (en) * 2001-04-13 2005-09-13 Wyeth Holdings Corporation Removal of bacterial endotoxin in a protein solution by immobilized metal affinity chromatography
IL152904A0 (en) 2002-01-24 2003-06-24 Gamida Cell Ltd Utilization of retinoid and vitamin d receptor antagonists for expansion of renewable stem cell populations
EP1465982A4 (en) 2002-01-25 2006-06-07 Gamida Cell Ltd PROCESS FOR EXPANSION OF STEM AND PRESERVATIVE CELLS AND EXPANDED CELL POPULATIONS THEREWITH OBTAINED
US7351729B2 (en) * 2002-03-08 2008-04-01 Signal Pharmaceuticals, Llc JNK inhibitors for use in combination therapy for treating or managing proliferative disorders and cancers
JP2005520511A (ja) * 2002-03-18 2005-07-14 ガミダ セル リミテッド エクスビボ拡大培養された幹細胞における分化を誘導する方法
NZ536050A (en) * 2002-04-12 2007-11-30 Celgene Corp Methods of identifying modulators of angiogenesis using stem cells with the proviso the stems cells are not totipotent
US7498171B2 (en) 2002-04-12 2009-03-03 Anthrogenesis Corporation Modulation of stem and progenitor cell differentiation, assays, and uses thereof
US7323479B2 (en) * 2002-05-17 2008-01-29 Celgene Corporation Methods for treatment and management of brain cancer using 1-oxo-2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-4-methylisoindoline
US7393862B2 (en) 2002-05-17 2008-07-01 Celgene Corporation Method using 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihydro-isoindol-2-yl)-piperidine-2,6-dione for treatment of certain leukemias
NZ570777A (en) 2002-05-17 2009-04-30 Celgene Corp Methods and compositions using selective cytokine inhibitory drugs for treatment and management of cancers and other diseases
US7968569B2 (en) 2002-05-17 2011-06-28 Celgene Corporation Methods for treatment of multiple myeloma using 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihydro-isoindol-2-yl)-piperidine-2,6-dione
USRE48890E1 (en) 2002-05-17 2022-01-11 Celgene Corporation Methods for treating multiple myeloma with 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihydroisoindol-2-yl)-piperidine-2,6-dione after stem cell transplantation
CN1668733A (zh) * 2002-05-30 2005-09-14 细胞基因公司 利用jnk或mkk抑制剂调节细胞分化并治疗骨髓增生异常和脊髓发育不良综合症的方法
US11116782B2 (en) 2002-10-15 2021-09-14 Celgene Corporation Methods of treating myelodysplastic syndromes with a combination therapy using lenalidomide and azacitidine
US7189740B2 (en) * 2002-10-15 2007-03-13 Celgene Corporation Methods of using 3-(4-amino-oxo-1,3-dihydro-isoindol-2-yl)-piperidine-2,6-dione for the treatment and management of myelodysplastic syndromes
US8404717B2 (en) * 2002-10-15 2013-03-26 Celgene Corporation Methods of treating myelodysplastic syndromes using lenalidomide
US8404716B2 (en) * 2002-10-15 2013-03-26 Celgene Corporation Methods of treating myelodysplastic syndromes with a combination therapy using lenalidomide and azacitidine
NZ539534A (en) 2002-10-15 2008-06-30 Celgene Corp Selective cytokine inhibitory drugs for treating myelodysplastic syndrome
US20050203142A1 (en) * 2002-10-24 2005-09-15 Zeldis Jerome B. Methods of using and compositions comprising immunomodulatory compounds for treatment, modification and management of pain
US20040091455A1 (en) * 2002-10-31 2004-05-13 Zeldis Jerome B. Methods of using and compositions comprising immunomodulatory compounds for treatment and management of macular degeneration
US8034831B2 (en) 2002-11-06 2011-10-11 Celgene Corporation Methods for the treatment and management of myeloproliferative diseases using 4-(amino)-2-(2,6-Dioxo(3-piperidyl)-isoindoline-1,3-dione in combination with other therapies
US7563810B2 (en) * 2002-11-06 2009-07-21 Celgene Corporation Methods of using 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihydroisoindol-2-yl)-piperidine-2,6-dione for the treatment and management of myeloproliferative diseases
US20050054097A1 (en) * 2002-11-17 2005-03-10 Tony Peled EX-VIVO expansion of hematopoietic system cell populations in mononuclear cell cultures
EP1571910A4 (en) 2002-11-26 2009-10-28 Anthrogenesis Corp CYTOTHERAPEUTIC AGENTS, CYTOTHERAPEUTIC UNITS AND METHODS OF TREATMENT IN WHICH THEY INTERVENE
US8491883B2 (en) 2003-06-27 2013-07-23 Advanced Technologies And Regenerative Medicine, Llc Treatment of amyotrophic lateral sclerosis using umbilical derived cells
US20060223177A1 (en) 2003-06-27 2006-10-05 Ethicon Inc. Postpartum cells derived from umbilical cord tissue, and methods of making and using the same
US9592258B2 (en) 2003-06-27 2017-03-14 DePuy Synthes Products, Inc. Treatment of neurological injury by administration of human umbilical cord tissue-derived cells
US8790637B2 (en) 2003-06-27 2014-07-29 DePuy Synthes Products, LLC Repair and regeneration of ocular tissue using postpartum-derived cells
US7875273B2 (en) 2004-12-23 2011-01-25 Ethicon, Incorporated Treatment of Parkinson's disease and related disorders using postpartum derived cells
US9572840B2 (en) 2003-06-27 2017-02-21 DePuy Synthes Products, Inc. Regeneration and repair of neural tissue using postpartum-derived cells
US8518390B2 (en) 2003-06-27 2013-08-27 Advanced Technologies And Regenerative Medicine, Llc Treatment of stroke and other acute neural degenerative disorders via intranasal administration of umbilical cord-derived cells
US7875272B2 (en) 2003-06-27 2011-01-25 Ethicon, Incorporated Treatment of stroke and other acute neuraldegenerative disorders using postpartum derived cells
ES2564044T3 (es) * 2003-06-27 2016-03-17 DePuy Synthes Products, Inc. Células posparto derivadas de tejido del cordón umbilical y métodos de preparación y uso de las mismas
IL161903A0 (en) * 2003-07-17 2005-11-20 Gamida Cell Ltd Ex vivo progenitor and stem cell expansion for usein the treatment of disease of endodermally- deri ved organs
UA83504C2 (en) 2003-09-04 2008-07-25 Селджин Корпорейшн Polymorphic forms of 3-(4-amino-1-oxo-1,3 dihydro-isoindol-2-yl)-piperidine-2,6-dione
GB0321337D0 (en) * 2003-09-11 2003-10-15 Massone Mobile Advertising Sys Method and system for distributing advertisements
US20080027113A1 (en) * 2003-09-23 2008-01-31 Zeldis Jerome B Methods of Using and Compositions Comprising Immunomodulatory Compounds for Treatment and Management of Macular Degeneration
US7612096B2 (en) * 2003-10-23 2009-11-03 Celgene Corporation Methods for treatment, modification and management of radiculopathy using 1-oxo-2-(2,6-dioxopiperidin-3yl)-4-aminoisoindoline
OA13284A (en) * 2003-11-06 2007-01-31 Corporation Celgene Methods and compositions using thalidomide for thetreatment and management of cancers and other dis eases.
US20050123525A1 (en) * 2003-11-13 2005-06-09 Ulrich Martin Composition and method for inducing immune tolerance towards cell, tissue and/or organ transplants
CN101966183A (zh) * 2003-12-02 2011-02-09 细胞基因公司 用于治疗和控制血红蛋白病和贫血病的方法和组合物
US20050143344A1 (en) * 2003-12-30 2005-06-30 Zeldis Jerome B. Methods and compositions using immunomodulatory compounds for the treatment and management of central nervous system disorders or diseases
US20070037276A1 (en) 2004-02-23 2007-02-15 Eudes Francois Marie De Crecy Continuous culture apparatus with mobile vessel, allowing selection of fitter cell variants and producing a culture in a continuous manner
JP2007530543A (ja) * 2004-03-22 2007-11-01 オシリス セラピューティクス，インコーポレイテッド 間葉幹細胞及びその使用法
CN1956718A (zh) * 2004-03-22 2007-05-02 细胞基因公司 用于治疗和控制皮肤疾病和病症的含免疫调节化合物的组合物和使用方法
KR20070002067A (ko) * 2004-03-26 2007-01-04 셀진 코포레이션 줄기 세포 은행의 제공 시스템 및 제공 방법
US20050222209A1 (en) * 2004-04-01 2005-10-06 Zeldis Jerome B Methods and compositions for the treatment, prevention or management of dysfunctional sleep and dysfunctional sleep associated with disease
CN1968695A (zh) * 2004-04-14 2007-05-23 细胞基因公司 含有用于治疗和控制骨髓发育不良综合征的免疫调节化合物的组合物和使用方法
ATE506431T1 (de) 2004-04-23 2011-05-15 Bioe Llc Mehrfachlinien-vorläuferzellen
US7622108B2 (en) 2004-04-23 2009-11-24 Bioe, Inc. Multi-lineage progenitor cells
CN101163489A (zh) * 2004-04-23 2008-04-16 细胞基因公司 用于治疗和控制肺高血压的包含免疫调节化合物的组合物及其使用方法
US20050265980A1 (en) * 2004-05-14 2005-12-01 Becton, Dickinson And Company Cell culture environments for the serum-free expansion of mesenchymal stem cells
WO2006030442A2 (en) 2004-09-16 2006-03-23 Gamida-Cell Ltd. Methods of ex vivo progenitor and stem cell expansion by co-culture with mesenchymal cells
KR100823090B1 (ko) 2004-11-22 2008-04-18 한훈 제대혈 유래 줄기세포를 이용한 척수하반신 마비의 세포치료용 조성물
US20060122228A1 (en) * 2004-11-23 2006-06-08 Zeldis Jerome B Methods and compositions using immunomodulatory compounds for treatment and management of central nervous system injury
EP1838842A2 (en) * 2004-12-23 2007-10-03 Ethicon, Incorporated Treatment of osteochondral diseases using postpartum-derived cells and products thereof
US7931891B2 (en) * 2005-02-24 2011-04-26 The Scripps Research Institute Isolated myeloid-like bone marrow cell populations and methods of treatment therewith
WO2006093881A2 (en) * 2005-02-28 2006-09-08 Regenetech, Inc. Method and composition for repairing epithelial and other cells and tissue
US20060270707A1 (en) * 2005-05-24 2006-11-30 Zeldis Jerome B Methods and compositions using 4-[(cyclopropanecarbonylamino)methyl]-2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)isoindole-1,3-dione for the treatment or prevention of cutaneous lupus
WO2007005807A2 (en) * 2005-06-30 2007-01-11 Anthrogenesis Corporation Repair of tympanic membrane using placenta derived collagen biofabric
US7928280B2 (en) * 2005-07-13 2011-04-19 Anthrogenesis Corporation Treatment of leg ulcers using placenta derived collagen biofabric
WO2007009061A2 (en) * 2005-07-13 2007-01-18 Anthrogenesis Corporation Ocular plug formed from placenta derived collagen biofabric
US20070059824A1 (en) * 2005-09-12 2007-03-15 Yong Zhao Human umbilical cord blood-derived pluripotent fibroblast-like-macrophages
WO2007044314A2 (en) 2005-10-05 2007-04-19 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Isolated embryonic-like stem cells derived from human umbilical cord blood
US9388382B2 (en) * 2005-10-05 2016-07-12 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Isolation of CD14 negative, CD45 positive and CD117 positive embryonic-like stem cells free of monocytes from human umbilical cord blood mononuclear cells
WO2007047465A1 (en) * 2005-10-13 2007-04-26 Anthrogenesis Corporation Production of oligodendrocytes from placenta-derived stem cells
WO2007047468A2 (en) * 2005-10-13 2007-04-26 Anthrogenesis Corporation Immunomodulation using placental stem cells
US8846393B2 (en) 2005-11-29 2014-09-30 Gamida-Cell Ltd. Methods of improving stem cell homing and engraftment
PL1971681T3 (pl) 2005-12-16 2018-01-31 Depuy Synthes Products Inc Kompozycje oraz sposoby do hamowania niepożądanej odpowiedzi immunologicznej w przypadku transplantacji z brakiem zgodności tkankowej
WO2007073552A1 (en) 2005-12-19 2007-06-28 Ethicon, Inc. In vitro expansion of postpartum derived cells in roller bottles
US9125906B2 (en) 2005-12-28 2015-09-08 DePuy Synthes Products, Inc. Treatment of peripheral vascular disease using umbilical cord tissue-derived cells
NZ595786A (en) * 2005-12-29 2013-05-31 Anthrogenesis Corp Placental stem cell populations
AU2006332680A1 (en) 2005-12-29 2007-07-12 Anthrogenesis Corporation Improved composition for collecting and preserving placental stem cells and methods of using the composition
AU2014201181B2 (en) * 2005-12-29 2017-07-20 Celularity Inc. Placental stem cell populations
ZA200804718B (en) 2005-12-29 2010-04-28 Anthrogenesis Corp Co-culture of placental stem cells and stem cells from a second source
DK2626417T3 (en) * 2006-03-23 2015-11-02 Pluristem Ltd Methods for cell expansion and use of the thus produced cells and conditioned media for the therapy
US20110171182A1 (en) * 2006-03-23 2011-07-14 Pluristem Ltd. Methods for cell expansion and uses of cells and conditioned media produced thereby for therapy
EP2019858B1 (en) 2006-04-17 2012-06-13 BioE LLC Differentiation of multi-lineage progenitor cells to respiratory epithelial cells
CL2007002218A1 (es) * 2006-08-03 2008-03-14 Celgene Corp Soc Organizada Ba Uso de 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il)-piperidina 2,6-diona para la preparacion de un medicamento util para el tratamiento de linfoma de celula de capa.
US7993918B2 (en) 2006-08-04 2011-08-09 Anthrogenesis Corporation Tumor suppression using placental stem cells
WO2008021391A1 (en) 2006-08-15 2008-02-21 Anthrogenesis Corporation Umbilical cord biomaterial for medical use
US8372437B2 (en) 2006-08-17 2013-02-12 Mimedx Group, Inc. Placental tissue grafts
KR100825864B1 (ko) * 2006-09-21 2008-04-28 부산대학교 산학협력단 피부 유래 줄기세포를 함유하는 신경질환 치료용세포치료제
WO2008060377A2 (en) 2006-10-04 2008-05-22 Anthrogenesis Corporation Placental or umbilical cord tissue compositions
EP2076279B1 (en) 2006-10-06 2014-08-27 Anthrogenesis Corporation Native (telopeptide) placental collagen compositions
US8835163B2 (en) * 2006-10-18 2014-09-16 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Embryonic-like stem cells derived from adult human peripheral blood and methods of use
WO2008051568A2 (en) 2006-10-23 2008-05-02 Anthrogenesis Corporation Methods and compositions for treatment of bone defects with placental cell populations
WO2008056368A2 (en) * 2006-11-09 2008-05-15 Gamida-Cell Ltd. Use of ex-vivo cultured hematopoietic cells for treatment of peripheral vascular diseases
EP2630959A1 (en) 2007-02-12 2013-08-28 Anthrogenesis Corporation Treatment of inflammatory diseases using placental stem cells
EP2129775A1 (en) 2007-02-12 2009-12-09 Anthrogenesis Corporation Hepatocytes and chondrocytes from adherent placental stem cells; and cd34+, cd45- placental stem cell-enriched cell populations
CA2688504A1 (en) 2007-06-18 2008-12-24 Children's Hospital & Research Center At Oakland Method of isolating stem and progenitor cells from placenta
CN101835479A (zh) * 2007-07-25 2010-09-15 佰欧益有限公司 多系祖细胞分化为软骨细胞
US9200253B1 (en) * 2007-08-06 2015-12-01 Anthrogenesis Corporation Method of producing erythrocytes
US7893045B2 (en) * 2007-08-07 2011-02-22 Celgene Corporation Methods for treating lymphomas in certain patient populations and screening patients for said therapy
EP2197270B8 (en) 2007-09-07 2020-03-04 Surgical Biologics, LLC Placental tissue grafts and improved methods of preparing and using the same
WO2009037690A1 (en) 2007-09-19 2009-03-26 Pluristem Ltd. Adherent cells from adipose or placenta tissues and use thereof in therapy
WO2009042201A1 (en) * 2007-09-26 2009-04-02 Celgene Cellular Therapeutics Angiogenic cells from human placental perfusate
KR20230065354A (ko) 2007-09-28 2023-05-11 셀룰래리티 인코포레이티드 인간 태반 관류액 및 인간 태반-유래 중간체 천연 킬러 세포를 사용한 종양 억제 방법
ES2525718T3 (es) 2007-10-05 2014-12-29 DePuy Synthes Products, LLC Reparación y regeneración de tejido renal mediante células derivadas de tejido de cordón umbilical humano
WO2009061447A2 (en) * 2007-11-07 2009-05-14 Anthrogenesis Corporation Treatment of premature birth complications
US20090155207A1 (en) * 2007-11-29 2009-06-18 Hariri Robert J Use of Immunomodulatory Compounds for the Treatment of Transverse Myelitis, Multiple Sclerosis, and Other Disorders
US8236538B2 (en) 2007-12-20 2012-08-07 Advanced Technologies And Regenerative Medicine, Llc Methods for sterilizing materials containing biologically active agents
WO2009097120A1 (en) * 2008-01-29 2009-08-06 Celgene Corporation Methods using immunomodulatory compounds for modulating level of cd59
PE20110399A1 (es) * 2008-08-20 2011-06-22 Anthrogenesis Corp Tratamiento de la apoplejia utilizando celulas placentarias aisladas
CA2734236C (en) 2008-08-20 2020-08-25 Anthrogenesis Corporation Improved cell composition and methods of making the same
NZ591293A (en) 2008-08-22 2012-10-26 Anthrogenesis Corp Methods and compositions for treatment of bone defects with osteogenic placental adherent cells (OPACs)
AU2009288781B2 (en) 2008-09-02 2015-01-29 Pluri Biotech Ltd Adherent cells from placenta tissue and use thereof in therapy
NZ602455A (en) 2008-11-19 2014-03-28 Anthrogenesis Corp Amnion derived adherent cells
BRPI0921999B8 (pt) * 2008-11-21 2021-05-25 Anthrogenesis Corp uso de uma quantidade terapeuticamente eficaz de células tronco placentárias
WO2010062999A1 (en) * 2008-11-28 2010-06-03 Stematix, Inc Diabetes cell therapy
CA2747794C (en) 2008-12-19 2018-10-30 Advanced Technologies And Regenerative Medicine, Llc Treatment of lung and pulmonary diseases and disorders
US10179900B2 (en) 2008-12-19 2019-01-15 DePuy Synthes Products, Inc. Conditioned media and methods of making a conditioned media
US8771677B2 (en) * 2008-12-29 2014-07-08 Vladimir B Serikov Colony-forming unit cell of human chorion and method to obtain and use thereof
SG174551A1 (en) 2009-03-26 2011-10-28 Ethicon Inc Human umbilical cord tissue cells as therapy for alzheimer' s disease
AU2010266263B2 (en) 2009-07-02 2016-05-19 Celularity Inc. Method of producing erythrocytes without feeder cells
CA2787992A1 (en) 2010-01-26 2011-08-04 Anthrogenesis Corporation Treatment of bone-related cancers using placental stem cells
KR20200047797A (ko) 2010-04-07 2020-05-07 안트로제네시스 코포레이션 태반 줄기 세포를 사용한 혈관신생
CN102933221A (zh) 2010-04-08 2013-02-13 人类起源公司 使用胎盘干细胞治疗结节病
US9352003B1 (en) 2010-05-14 2016-05-31 Musculoskeletal Transplant Foundation Tissue-derived tissuegenic implants, and methods of fabricating and using same
US10130736B1 (en) 2010-05-14 2018-11-20 Musculoskeletal Transplant Foundation Tissue-derived tissuegenic implants, and methods of fabricating and using same
US8883210B1 (en) 2010-05-14 2014-11-11 Musculoskeletal Transplant Foundation Tissue-derived tissuegenic implants, and methods of fabricating and using same
KR20230096132A (ko) 2010-07-13 2023-06-29 셀룰래리티 인코포레이티드 천연 킬러 세포의 생성 방법
US8895291B2 (en) 2010-10-08 2014-11-25 Terumo Bct, Inc. Methods and systems of growing and harvesting cells in a hollow fiber bioreactor system with control conditions
US8574899B2 (en) 2010-12-22 2013-11-05 Vladimir B Serikov Methods for augmentation collection of placental hematopoietic stem cells and uses thereof
US20120171180A1 (en) 2010-12-30 2012-07-05 Sascha Abramson Compositions comprising amnion derived adherent cells and platelet-rich plasma
WO2012092458A2 (en) 2010-12-30 2012-07-05 Anthrogenesis Corporation Compositions comprising placental stem cells and platelet rich plasma, and methods of use thereof
US8969315B2 (en) 2010-12-31 2015-03-03 Anthrogenesis Corporation Enhancement of placental stem cell potency using modulatory RNA molecules
BR112013023277A2 (pt) 2011-03-11 2017-06-27 Celgene Corp métodos de tratamento de câncer usando 3-(5-amino-2-metil-4-oxo-4h-quinazolin-3-il)-piperidibna-2,6-diona
EP2689008B1 (en) 2011-03-22 2017-09-27 Pluristem Ltd. Methods for treating radiation or chemical injury
US9633751B2 (en) 2011-04-01 2017-04-25 The Boeing Company Liquid lithium first walls for electromagnetic control of plasmas in fusion power reactor environments
ES2707579T3 (es) 2011-06-01 2019-04-04 Celularity Inc Tratamiento del dolor usando citoblastos placentarios
US9925221B2 (en) 2011-09-09 2018-03-27 Celularity, Inc. Treatment of amyotrophic lateral sclerosis using placental stem cells
PL2794854T3 (pl) 2011-12-23 2018-12-31 DePuy Synthes Products, Inc. Wykrywanie ludzkich komórek pochodzących z tkanki pępowinowej
US10047345B2 (en) 2012-02-13 2018-08-14 Gamida-Cell Ltd. Culturing of mesenchymal stem cells with FGF4 and nicotinamide
RU2482870C1 (ru) * 2012-02-27 2013-05-27 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина" Российской академии медицинских наук (ФГБУ "РОНЦ им. Н.Н. Блохина" РАМН) Средство, индуцирующее дифференцировку стволовых кроветворных клеток в тромбоциты
KR101508323B1 (ko) * 2012-02-28 2015-04-14 건국대학교 산학협력단 세포 배양액
WO2013158819A2 (en) * 2012-04-20 2013-10-24 St. Jude Children's Research Hospital Method for generation of conditionally immortalized hematopoietic progenitor cell lines with multiple lineage potential
US9175266B2 (en) 2012-07-23 2015-11-03 Gamida Cell Ltd. Enhancement of natural killer (NK) cell proliferation and activity
US9567569B2 (en) 2012-07-23 2017-02-14 Gamida Cell Ltd. Methods of culturing and expanding mesenchymal stem cells
TWI723266B (zh) 2012-08-09 2021-04-01 美商西建公司 利用3-(4-((4-(嗎啉基甲基)苄基)氧基)-1-氧異吲哚啉-2-基)六氫吡啶-2,6-二酮治療癌症之方法
BR112015003149A2 (pt) 2012-08-13 2017-08-08 Anthrogenesis Corp células natural killer e usos das mesmas.
AU2013204922B2 (en) 2012-12-20 2015-05-14 Celgene Corporation Chimeric antigen receptors
EP3622960A1 (en) 2013-02-05 2020-03-18 Celularity, Inc. Natural killer cells from placenta
EP2970178B1 (en) * 2013-03-15 2017-06-14 F. Hoffmann-La Roche AG Compounds for improved stem cell differentiation into hepatocytes
BR112015025252A2 (pt) 2013-04-02 2017-07-18 Celgene Corp métodos e composições usando 4-amino-2-(2,6-dioxo-piperidina-3-il)-isoindolina-1,3-diona para tratamento e gestão de cânceres de sistema nervoso central
UA117141C2 (uk) 2013-10-08 2018-06-25 Селджин Корпорейшн Склади (s)-3-(4-((4-(морфолінометил)бензил)оксі)-1-оксоізоіндолін-2-іл)піперидин-2,6-діону
RU2016123361A (ru) * 2013-11-15 2017-12-20 Антродженезис Корпорейшн Композиции, включающие клетки плацентарного перфузата человека
US9617506B2 (en) 2013-11-16 2017-04-11 Terumo Bct, Inc. Expanding cells in a bioreactor
US20150196562A1 (en) 2014-01-15 2015-07-16 Celgene Corporation Formulations of 3-(5-amino-2-methyl-4-oxo-4h-quinazolin-3-yl)-piperidine-2,6-dione
EP3613841B1 (en) 2014-03-25 2022-04-20 Terumo BCT, Inc. Passive replacement of media
US10006005B2 (en) * 2014-06-27 2018-06-26 National University Corporation Chiba University Culture medium and method for inducing differentiation of pluripotent stem cells to hepatoblasts
US9499514B2 (en) 2014-07-11 2016-11-22 Celgene Corporation Antiproliferative compounds and methods of use thereof
EA201790439A1 (ru) 2014-08-22 2017-07-31 Селджин Корпорейшн Способы лечения множественной миеломы с применением иммуномодулирующих соединений в комбинации с антителами
CN106715676A (zh) 2014-09-26 2017-05-24 泰尔茂比司特公司 按计划供养
US10531957B2 (en) 2015-05-21 2020-01-14 Musculoskeletal Transplant Foundation Modified demineralized cortical bone fibers
SI3313818T1 (sl) 2015-06-26 2024-03-29 Celgene Corporation Postopki zdravljenja Kaposijevega sarkoma ali s KSHV povzročenega limfoma, z uporabo imunomodulatornih spojin in uporabe biomarkerjev
WO2017004592A1 (en) 2015-07-02 2017-01-05 Terumo Bct, Inc. Cell growth with mechanical stimuli
ES2865289T3 (es) 2015-08-27 2021-10-15 Celgene Corp Composiciones farmacéuticas que comprenden 3-(5-amino-2-metil-4-oxo-4H-quinazolin-3-il)-piperidin-2,6-diona
AU2016364753A1 (en) 2015-12-02 2018-06-14 Celgene Corporation Cycling therapy using 3-(5-amino-2-methyl-4-oxo-4H-quinazolin-3-yl)-piperidine-2,6-dione
EP3397263B1 (en) 2015-12-30 2023-09-20 Celgene Corporation T lymphocyte production methods and t lymphocytes produced thereby
JP7071922B2 (ja) 2016-01-08 2022-05-19 セルジーン コーポレイション ２－（４－クロロフェニル）－ｎ－（（２－（２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）－１－オキソイソインドリン－５－イル）メチル）－２，２－ジフルオロアセトアミドの固体形態、ならびにそれらの薬学的組成物及び使用
CA3010797C (en) 2016-01-08 2024-01-02 Celgene Corporation Formulations of 2-(4-chlorophenyl)-n-((2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1-oxoisoindolin-5-yl)methyl)-2,2-difluoroacetamide
PL3399978T3 (pl) 2016-01-08 2021-04-06 Celgene Corporation Związki antyproliferacyjne oraz ich kompozycje farmaceutyczne i zastosowania
US11965175B2 (en) 2016-05-25 2024-04-23 Terumo Bct, Inc. Cell expansion
US11104874B2 (en) 2016-06-07 2021-08-31 Terumo Bct, Inc. Coating a bioreactor
US11685883B2 (en) 2016-06-07 2023-06-27 Terumo Bct, Inc. Methods and systems for coating a cell growth surface
WO2018013693A1 (en) 2016-07-13 2018-01-18 Celgene Corporation Solid dispersions and cocrystals comprising 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihydro-isoindol-2-yl)-piperidine-2,6-dione compositions and methods of use thereof
GB201618106D0 (en) 2016-10-26 2016-12-07 Lift Biosciences Ltd Cancer-killing cells
WO2018140671A1 (en) 2017-01-27 2018-08-02 Celgene Corporation 3-(1-oxo-4-((4-((3-oxomorpholino) methyl)benzyl)oxy)isoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione and isotopologues thereof
WO2018165142A1 (en) 2017-03-07 2018-09-13 Celgene Corporation Solid forms of 3-(5-amino-2-methyl-4-oxo-4h-quinazolin-3-yl)-piperidine-2,6-dione, and their pharmaceutical compositions and uses
US11702634B2 (en) 2017-03-31 2023-07-18 Terumo Bct, Inc. Expanding cells in a bioreactor
US11624046B2 (en) 2017-03-31 2023-04-11 Terumo Bct, Inc. Cell expansion
PL3644999T3 (pl) 2017-06-30 2023-05-08 Celgene Corporation Kompozycje i sposoby zastosowania 2-(4-chlorofenylo)-n-((2-(2,6-dioksopiperydyn-3-ylo)-1-oksoizoindolin-5-ylo)metylo)-2,2-difluoroacetamidu
WO2020113182A1 (en) 2018-11-30 2020-06-04 Celularity, Inc. Expansion of natural killer cells and ilc3 cells with novel aromatic compounds
US20220265712A1 (en) 2019-06-14 2022-08-25 Celularity Inc. Populations of natural killer cells for treating cancers
WO2021016621A1 (en) 2019-07-25 2021-01-28 Celularity Inc. Populations of natural killer cells comprising a cd38 chimeric antigen receptor
US20230355759A1 (en) 2019-07-31 2023-11-09 Celularity Inc. Populations of natural killer cells comprising a cleavage resistant cd16
WO2021113849A1 (en) 2019-12-05 2021-06-10 Celularity Inc. Her2+ cancer treatment with populations of natural killer cells comprising a cleavage resistant cd16
GB201918341D0 (en) * 2019-12-12 2020-01-29 Lift Biosciences Ltd Cells for treating infections
WO2021155312A1 (en) 2020-01-29 2021-08-05 Celularity Inc. Placental derived natural killer cells for treatment of coronavirus infections
KR102384905B1 (ko) 2020-11-25 2022-04-11 (주)신한메탈 파이프 절단 마킹장치
WO2023278628A1 (en) 2021-06-29 2023-01-05 Celularity Inc. Human placental hematopoietic stem cell derived natural killer cells in acute myeloid leukemia (aml) remission with minimal residual disease (mrd) or relapsed/refractory aml
WO2023010123A1 (en) 2021-07-29 2023-02-02 Celularity Inc. Placenta-dervied nk cells as a senolytic for therapeutic and other uses
WO2023043827A2 (en) * 2021-09-14 2023-03-23 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Methods and compositions for perturbing monocyte and neutrophil lineages
WO2023137344A1 (en) 2022-01-11 2023-07-20 Celularity Inc. Cleavage resistant cd16 constructs and uses thereof
TW202406901A (zh) 2022-04-14 2024-02-16 美商必治妥美雅史谷比公司 新穎gspt1化合物以及新穎化合物之使用方法
WO2024064646A1 (en) 2022-09-20 2024-03-28 Celgene Corporation Salts and solid forms of (s)- or racemic 3-(4-((4-(morpholinomethyl)benzyl)oxy)-1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione and methods of using the same

Family Cites Families (149)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3228601A (en) 1964-02-20 1966-01-11 Monarch Marking Systems Inc Controls for marking machine
IL47062A (en) * 1975-04-10 1979-07-25 Yeda Res & Dev Process for diminishing antigenicity of tissues to be usedas transplants by treatment with glutaraldehyde
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4615699A (en) 1985-05-03 1986-10-07 Alza Corporation Transdermal delivery system for delivering nitroglycerin at high transdermal fluxes
CA1340843C (en) 1987-07-31 1999-12-07 J. Lawrence Burg Selective amplification of target polynucleotide sequences
US5004681B1 (en) * 1987-11-12 2000-04-11 Biocyte Corp Preservation of fetal and neonatal hematopoietic stem and progenitor cells of the blood
US5130238A (en) 1988-06-24 1992-07-14 Cangene Corporation Enhanced nucleic acid amplification process
FR2646438B1 (fr) 1989-03-20 2007-11-02 Pasteur Institut Procede de remplacement specifique d'une copie d'un gene present dans le genome receveur par l'integration d'un gene different de celui ou se fait l'integration
US5399493A (en) * 1989-06-15 1995-03-21 The Regents Of The University Of Michigan Methods and compositions for the optimization of human hematopoietic progenitor cell cultures
CA2020958C (en) 1989-07-11 2005-01-11 Daniel L. Kacian Nucleic acid sequence amplification methods
JPH04501510A (ja) 1989-07-25 1992-03-19 セル　ジェネシス，インコーポレイティド 普遍的なドナー細胞及びキメラ性哺乳類宿主のための相同性組換え
US5464764A (en) 1989-08-22 1995-11-07 University Of Utah Research Foundation Positive-negative selection methods and vectors
US5545522A (en) 1989-09-22 1996-08-13 Van Gelder; Russell N. Process for amplifying a target polynucleotide sequence using a single primer-promoter complex
ES2127458T3 (es) 1989-11-06 1999-04-16 Cell Genesys Inc Produccion de proteinas utilizando recombinacion homologa.
US5272071A (en) 1989-12-22 1993-12-21 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Method for the modification of the expression characteristics of an endogenous gene of a given cell line
US6326198B1 (en) 1990-06-14 2001-12-04 Regents Of The University Of Michigan Methods and compositions for the ex vivo replication of stem cells, for the optimization of hematopoietic progenitor cell cultures, and for increasing the metabolism, GM-CSF secretion and/or IL-6 secretion of human stromal cells
AU1531492A (en) * 1991-02-14 1992-09-15 Rockefeller University, The Method for controlling abnormal concentration tnf alpha in human tissues
US5367057A (en) * 1991-04-02 1994-11-22 The Trustees Of Princeton University Tyrosine kinase receptor flk-2 and fragments thereof
US6046019A (en) * 1991-07-09 2000-04-04 Goumeniouk; Alexander P. Diagnostic kits and methods for making granulocyte cell counts
WO1993004169A1 (en) 1991-08-20 1993-03-04 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
EP0627003A1 (en) * 1991-12-23 1994-12-07 British Bio-Technology Limited Stem cell inhibiting proteins
US5672346A (en) * 1992-07-27 1997-09-30 Indiana University Foundation Human stem cell compositions and methods
US5436142A (en) 1992-11-12 1995-07-25 Cold Spring Harbor Laboratory Methods for producing probes capable of distingushing variant genomic sequences
PT691988E (pt) * 1993-03-31 2003-02-28 Wellstat Therapeutics Corp Inibidor da proliferacao de celulas estaminais e suas utilizacoes
GB9308271D0 (en) * 1993-04-21 1993-06-02 Univ Edinburgh Method of isolating and/or enriching and/or selectively propagating pluripotential animal cells and animals for use in said method
US5709854A (en) 1993-04-30 1998-01-20 Massachusetts Institute Of Technology Tissue formation by injecting a cell-polymeric solution that gels in vivo
US5605914A (en) * 1993-07-02 1997-02-25 Celgene Corporation Imides
US5463063A (en) 1993-07-02 1995-10-31 Celgene Corporation Ring closure of N-phthaloylglutamines
US5698579A (en) * 1993-07-02 1997-12-16 Celgene Corporation Cyclic amides
US5665754A (en) * 1993-09-20 1997-09-09 Glaxo Wellcome Inc. Substituted pyrrolidines
US5599703A (en) * 1993-10-28 1997-02-04 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy In vitro amplification/expansion of CD34+ stem and progenitor cells
CA2175578A1 (en) 1993-11-03 1995-05-11 Alec Sehon Cell control and suppression
IL107483A0 (en) 1993-11-03 1994-02-27 Yeda Res & Dev Bone marrow transplantation
US5942496A (en) 1994-02-18 1999-08-24 The Regent Of The University Of Michigan Methods and compositions for multiple gene transfer into bone cells
US5683693A (en) 1994-04-25 1997-11-04 Trustees Of Dartmouth College Method for inducing T cell unresponsiveness to a tissue or organ graft with anti-CD40 ligand antibody or soluble CD40
US5516532A (en) 1994-08-05 1996-05-14 Children's Medical Center Corporation Injectable non-immunogenic cartilage and bone preparation
US5627025A (en) 1994-08-12 1997-05-06 The Rockefeller University Method for the identification of compounds capable of abrogating human immunodeficiency virus (HIV) infection of dendritic cells and T-lymphocytes
US5698679A (en) 1994-09-19 1997-12-16 National Jewish Center For Immunology And Respiratory Medicine Product and process for targeting an immune response
US5525471A (en) 1994-10-12 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Enzymatic degrading subtraction hybridization
US5874301A (en) * 1994-11-21 1999-02-23 National Jewish Center For Immunology And Respiratory Medicine Embryonic cell populations and methods to isolate such populations
HU226558B1 (en) 1994-12-30 2009-03-30 Celgene Corp Immunotherapeutic imides/amides and their use for reducing levels of tnfalpha
US5703098A (en) * 1994-12-30 1997-12-30 Celgene Corporation Immunotherapeutic imides/amides
US5801195A (en) * 1994-12-30 1998-09-01 Celgene Corporation Immunotherapeutic aryl amides
US6429221B1 (en) 1994-12-30 2002-08-06 Celgene Corporation Substituted imides
US5925567A (en) * 1995-05-19 1999-07-20 T. Breeders, Inc. Selective expansion of target cell populations
US5731325A (en) * 1995-06-06 1998-03-24 Andrulis Pharmaceuticals Corp. Treatment of melanomas with thalidomide alone or in combination with other anti-melanoma agents
US5643915A (en) * 1995-06-06 1997-07-01 Andrulis Pharmaceuticals Corp. Treatment of ischemia/reperfusion injury with thalidomide alone or in combination with other therapies
US5830708A (en) 1995-06-06 1998-11-03 Advanced Tissue Sciences, Inc. Methods for production of a naturally secreted extracellular matrix
WO1996040875A1 (en) * 1995-06-07 1996-12-19 Novartis Ag Methods for obtaining compositions enriched for hematopoietic stem cells and antibodies for use therein
US5654312A (en) * 1995-06-07 1997-08-05 Andrulis Pharmaceuticals Treatment of inflammatory and/or autoimmune dermatoses with thalidomide alone or in combination with other agents
US5654381A (en) 1995-06-16 1997-08-05 Massachusetts Institute Of Technology Functionalized polyester graft copolymers
US6306575B1 (en) * 1995-06-16 2001-10-23 Stemcell Technologies, Inc. Methods for preparing enriched human hematopoietic cell preparations
US5788963A (en) 1995-07-31 1998-08-04 Pacific Northwest Cancer Foundation Isolation and/or preservation of dendritic cells for prostate cancer immunotherapy
US5635365A (en) * 1995-08-07 1997-06-03 Emory University Noninvasive diagnosis for allograft rejection
US5728845A (en) * 1995-08-29 1998-03-17 Celgene Corporation Immunotherapeutic nitriles
US5728844A (en) 1995-08-29 1998-03-17 Celgene Corporation Immunotherapeutic agents
US5658940A (en) 1995-10-06 1997-08-19 Celgene Corporation Succinimide and maleimide cytokine inhibitors
US5800539A (en) 1995-11-08 1998-09-01 Emory University Method of allogeneic hematopoietic stem cell transplantation without graft failure or graft vs. host disease
US6337387B1 (en) * 1995-11-17 2002-01-08 Asahi Kasei Kabushiki Kaisha Differentiation-suppressive polypeptide
US6080409A (en) 1995-12-28 2000-06-27 Dendreon Corporation Immunostimulatory method
JP2000505650A (ja) 1996-02-08 2000-05-16 アメリカ合衆国 樹状突起細胞を形質転換し、そしてｔ細胞を活性化するための方法及び組成物
US7659119B2 (en) 1996-02-12 2010-02-09 Argos Therapeutics, Inc. Method and compositions for obtaining mature dendritic cells
US5635517B1 (en) * 1996-07-24 1999-06-29 Celgene Corp Method of reducing TNFalpha levels with amino substituted 2-(2,6-dioxopiperidin-3-YL)-1-oxo-and 1,3-dioxoisoindolines
US6281230B1 (en) 1996-07-24 2001-08-28 Celgene Corporation Isoindolines, method of use, and pharmaceutical compositions
ATE530542T1 (de) 1996-07-24 2011-11-15 Celgene Corp Amino substituierte 2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)- phthalimide zur verringerung der tnf-alpha-stufen
US5798368A (en) 1996-08-22 1998-08-25 Celgene Corporation Tetrasubstituted 2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1-oxoisoindolines and method of reducing TNFα levels
HU228769B1 (en) 1996-07-24 2013-05-28 Celgene Corp Substituted 2(2,6-dioxopiperidin-3-yl)phthalimides and -1-oxoisoindolines and their use for production of pharmaceutical compositions for mammals to reduce the level of tnf-alpha
WO1998006692A1 (en) * 1996-08-12 1998-02-19 Celgene Corporation Novel immunotherapeutic agents and their use in the reduction of cytokine levels
US5851984A (en) * 1996-08-16 1998-12-22 Genentech, Inc. Method of enhancing proliferation or differentiation of hematopoietic stem cells using Wnt polypeptides
US5945337A (en) * 1996-10-18 1999-08-31 Quality Biological, Inc. Method for culturing CD34+ cells in a serum-free medium
US6335195B1 (en) * 1997-01-28 2002-01-01 Maret Corporation Method for promoting hematopoietic and mesenchymal cell proliferation and differentiation
US5958738A (en) 1997-03-24 1999-09-28 Roche Diagnostics Corporation Procedure for subtractive hybridization and difference analysis
KR100716475B1 (ko) 1997-07-31 2007-05-10 셀진 코오퍼레이션 치환된 알카노하이드록삼산 및 ＴＮＦα 농도 감소화 방법
US6093531A (en) * 1997-09-29 2000-07-25 Neurospheres Holdings Ltd. Generation of hematopoietic cells from multipotent neural stem cells
US5874448A (en) * 1997-11-18 1999-02-23 Celgene Corporation Substituted 2-(2,6 dioxo-3-fluoropiperidin-3-yl)-isoindolines and method of reducing TNFα levels
US5955476A (en) 1997-11-18 1999-09-21 Celgene Corporation Substituted 2-(2,6-dioxo-3-fluoropiperidin-3-yl)-isoindolines and method of reducing inflammatory cytokine levels
BR9908811A (pt) 1998-03-16 2000-12-05 Celgene Corp Composto, composição farmacêutica e seu uso no tratamento de mamìferos
WO1999057303A1 (en) * 1998-05-07 1999-11-11 University Of Maryland, Baltimore A method for diagnosing and treating chronic pelvic pain syndrome
EP1084230B1 (en) * 1998-06-08 2007-10-17 Osiris Therapeutics, Inc. Regulation of hematopoietic stem cell differentiation by the use of human mesenchymal stem cells
US6020358A (en) * 1998-10-30 2000-02-01 Celgene Corporation Substituted phenethylsulfones and method of reducing TNFα levels
CA2351889A1 (en) 1998-11-12 2000-05-18 Cell Science Therapeutics, Inc. Lymphoid tissue-specific cell production from hematopoietic progenitor cells in three-dimensional devices
CA2361806C (en) 1999-03-18 2012-03-13 Celgene Corporation Substituted 1-oxo- and 1,3-dioxoisoindolines and their use in pharmaceutical compositions for reducing inflammatory cytokine levels
IN191359B (ja) * 1999-04-20 2003-11-29 Nat Inst Immunology
US6132997A (en) 1999-05-28 2000-10-17 Agilent Technologies Method for linear mRNA amplification
AU4860900A (en) 1999-06-02 2000-12-18 Lifebank Services, L.L.C. Methods of isolation, cryopreservation, and therapeutic use of human amniotic epithelial cells
US6271002B1 (en) 1999-10-04 2001-08-07 Rosetta Inpharmatics, Inc. RNA amplification method
US6280718B1 (en) * 1999-11-08 2001-08-28 Wisconsin Alumni Reasearch Foundation Hematopoietic differentiation of human pluripotent embryonic stem cells
US7182953B2 (en) * 1999-12-15 2007-02-27 Celgene Corporation Methods and compositions for the prevention and treatment of atherosclerosis restenosis and related disorders
AU2001261474B2 (en) 2000-05-15 2006-03-09 Celgene Corporation Compositions and methods for the treatment of cancer
US6576464B2 (en) * 2000-11-27 2003-06-10 Geron Corporation Methods for providing differentiated stem cells
WO2002046373A1 (en) 2000-12-06 2002-06-13 Hariri Robert J Method of collecting placental stem cells
US20080152629A1 (en) * 2000-12-06 2008-06-26 James Edinger Placental stem cell populations
US7311905B2 (en) * 2002-02-13 2007-12-25 Anthrogenesis Corporation Embryonic-like stem cells derived from post-partum mammalian placenta, and uses and methods of treatment using said cells
US20030045552A1 (en) 2000-12-27 2003-03-06 Robarge Michael J. Isoindole-imide compounds, compositions, and uses thereof
ES2549161T3 (es) 2001-02-14 2015-10-23 Anthrogenesis Corporation Placenta post-parto de mamífero, su uso y células madre placentarias de la misma
EP2336299A1 (en) * 2001-02-14 2011-06-22 Anthrogenesis Corporation Post-partum mammalian placenta, its use and placental stem cells therefrom
CN1639058A (zh) * 2001-06-29 2005-07-13 昭和电工株式会社 高纯氟气体、其生产方法和用途和分析高纯氟气体中的痕量不纯物的方法
AU2002352696A1 (en) 2001-11-16 2003-06-10 University Of North Carolina At Chapel Hill Cell substrates and methods of use thereof
KR101176146B1 (ko) 2002-02-13 2012-08-22 안트로제네시스 코포레이션 산후 포유류 태반으로부터 유래한 배아-유사 줄기 세포와그 세포를 사용한 용도 및 치료방법
US20030187515A1 (en) * 2002-03-26 2003-10-02 Hariri Robert J. Collagen biofabric and methods of preparing and using the collagen biofabric
US7498171B2 (en) 2002-04-12 2009-03-03 Anthrogenesis Corporation Modulation of stem and progenitor cell differentiation, assays, and uses thereof
NZ536050A (en) 2002-04-12 2007-11-30 Celgene Corp Methods of identifying modulators of angiogenesis using stem cells with the proviso the stems cells are not totipotent
AU2003262187A1 (en) * 2002-04-12 2003-10-27 Celgene Corporation Modulation of stem and progenitor cell differentiation, assays, and uses thereof
CN1668733A (zh) * 2002-05-30 2005-09-14 细胞基因公司 利用jnk或mkk抑制剂调节细胞分化并治疗骨髓增生异常和脊髓发育不良综合症的方法
US7189740B2 (en) 2002-10-15 2007-03-13 Celgene Corporation Methods of using 3-(4-amino-oxo-1,3-dihydro-isoindol-2-yl)-piperidine-2,6-dione for the treatment and management of myelodysplastic syndromes
EP1571910A4 (en) * 2002-11-26 2009-10-28 Anthrogenesis Corp CYTOTHERAPEUTIC AGENTS, CYTOTHERAPEUTIC UNITS AND METHODS OF TREATMENT IN WHICH THEY INTERVENE
NZ542127A (en) * 2003-02-13 2008-04-30 Anthrogenesis Corp Use of umbilical cord blood to treat individuals having a disease, disorder or condition
CN101966183A (zh) 2003-12-02 2011-02-09 细胞基因公司 用于治疗和控制血红蛋白病和贫血病的方法和组合物
US20050266391A1 (en) 2004-01-15 2005-12-01 Bennett Brydon L Methods for preserving tissue
KR20070002067A (ko) 2004-03-26 2007-01-04 셀진 코포레이션 줄기 세포 은행의 제공 시스템 및 제공 방법
US7244759B2 (en) * 2004-07-28 2007-07-17 Celgene Corporation Isoindoline compounds and methods of making and using the same
US7147626B2 (en) * 2004-09-23 2006-12-12 Celgene Corporation Cord blood and placenta collection kit
US7909806B2 (en) * 2004-09-23 2011-03-22 Anthrogenesis Corporation Cord blood and placenta collection kit
BRPI0611739A2 (pt) * 2005-06-10 2011-12-20 Celgene Corp colágeno de atelopeptìdeo, composição, método e kit para aumentar, avolumar ou substituir tecido de um mamìfero, e, processos para preparar e para reticular colágeno de atelopeptìdeo, e para reduzir a quantidade de partìculas virais em uma composição de colágeno
WO2007005807A2 (en) * 2005-06-30 2007-01-11 Anthrogenesis Corporation Repair of tympanic membrane using placenta derived collagen biofabric
US7928280B2 (en) * 2005-07-13 2011-04-19 Anthrogenesis Corporation Treatment of leg ulcers using placenta derived collagen biofabric
WO2007009061A2 (en) * 2005-07-13 2007-01-18 Anthrogenesis Corporation Ocular plug formed from placenta derived collagen biofabric
JP4562618B2 (ja) 2005-08-18 2010-10-13 陽一 佐藤 空き缶処理車
WO2007047465A1 (en) 2005-10-13 2007-04-26 Anthrogenesis Corporation Production of oligodendrocytes from placenta-derived stem cells
WO2007047468A2 (en) * 2005-10-13 2007-04-26 Anthrogenesis Corporation Immunomodulation using placental stem cells
ZA200804718B (en) * 2005-12-29 2010-04-28 Anthrogenesis Corp Co-culture of placental stem cells and stem cells from a second source
NZ595786A (en) * 2005-12-29 2013-05-31 Anthrogenesis Corp Placental stem cell populations
AU2006332680A1 (en) * 2005-12-29 2007-07-12 Anthrogenesis Corporation Improved composition for collecting and preserving placental stem cells and methods of using the composition
CN101501185A (zh) * 2006-06-09 2009-08-05 人类起源公司 胎盘巢(placental niche)及其培养干细胞的用途
US7993918B2 (en) * 2006-08-04 2011-08-09 Anthrogenesis Corporation Tumor suppression using placental stem cells
WO2008021391A1 (en) * 2006-08-15 2008-02-21 Anthrogenesis Corporation Umbilical cord biomaterial for medical use
WO2008042441A1 (en) * 2006-10-03 2008-04-10 Anthrogenesis Corporation Use of umbilical cord biomaterial for ocular surgery
WO2008060377A2 (en) * 2006-10-04 2008-05-22 Anthrogenesis Corporation Placental or umbilical cord tissue compositions
EP2076279B1 (en) * 2006-10-06 2014-08-27 Anthrogenesis Corporation Native (telopeptide) placental collagen compositions
WO2008051568A2 (en) 2006-10-23 2008-05-02 Anthrogenesis Corporation Methods and compositions for treatment of bone defects with placental cell populations
EP2129775A1 (en) 2007-02-12 2009-12-09 Anthrogenesis Corporation Hepatocytes and chondrocytes from adherent placental stem cells; and cd34+, cd45- placental stem cell-enriched cell populations
EP2630959A1 (en) 2007-02-12 2013-08-28 Anthrogenesis Corporation Treatment of inflammatory diseases using placental stem cells
US20100172830A1 (en) * 2007-03-29 2010-07-08 Cellx Inc. Extraembryonic Tissue cells and method of use thereof
WO2009042201A1 (en) * 2007-09-26 2009-04-02 Celgene Cellular Therapeutics Angiogenic cells from human placental perfusate
KR20230065354A (ko) 2007-09-28 2023-05-11 셀룰래리티 인코포레이티드 인간 태반 관류액 및 인간 태반-유래 중간체 천연 킬러 세포를 사용한 종양 억제 방법
WO2009061447A2 (en) * 2007-11-07 2009-05-14 Anthrogenesis Corporation Treatment of premature birth complications
CA2734236C (en) * 2008-08-20 2020-08-25 Anthrogenesis Corporation Improved cell composition and methods of making the same
PE20110399A1 (es) * 2008-08-20 2011-06-22 Anthrogenesis Corp Tratamiento de la apoplejia utilizando celulas placentarias aisladas
NZ591293A (en) * 2008-08-22 2012-10-26 Anthrogenesis Corp Methods and compositions for treatment of bone defects with osteogenic placental adherent cells (OPACs)
NZ602455A (en) * 2008-11-19 2014-03-28 Anthrogenesis Corp Amnion derived adherent cells
BRPI0921999B8 (pt) * 2008-11-21 2021-05-25 Anthrogenesis Corp uso de uma quantidade terapeuticamente eficaz de células tronco placentárias
WO2010141654A1 (en) 2009-06-05 2010-12-09 Anthrogenesis Corporation Improved method of collecting placental cells
AU2010266263B2 (en) * 2009-07-02 2016-05-19 Celularity Inc. Method of producing erythrocytes without feeder cells
CA2787992A1 (en) * 2010-01-26 2011-08-04 Anthrogenesis Corporation Treatment of bone-related cancers using placental stem cells
US20110280849A1 (en) 2010-03-26 2011-11-17 Anthrogenesis Corporation Tumor suppression using human placenta-derived intermediate natural killer cells and immunomodulatory compounds
KR20200047797A (ko) 2010-04-07 2020-05-07 안트로제네시스 코포레이션 태반 줄기 세포를 사용한 혈관신생
CN102933221A (zh) 2010-04-08 2013-02-13 人类起源公司 使用胎盘干细胞治疗结节病
KR20230096132A (ko) 2010-07-13 2023-06-29 셀룰래리티 인코포레이티드 천연 킬러 세포의 생성 방법
US9713375B1 (en) 2015-02-26 2017-07-25 Brett Einar Rahm Collapsible portable table

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009536824A (ja) * 2006-05-11 2009-10-22 直子 武部 臍帯血幹細胞の回収方法及び使用方法
JP2009538318A (ja) * 2006-05-26 2009-11-05 セルジーン・コーポレーション 併用療法において免疫調節化合物を用いる方法及び組成物

Also Published As

Publication number Publication date
EP1551953A4 (en) 2007-07-18
WO2003087392A9 (en) 2004-12-29
KR101218663B1 (ko) 2013-01-04
NZ536049A (en) 2010-04-30
JP5349188B2 (ja) 2013-11-20
EP1551953B8 (en) 2017-02-15
WO2003087392A2 (en) 2003-10-23
US7498171B2 (en) 2009-03-03
EP1551953A2 (en) 2005-07-13
CA2481386C (en) 2015-01-27
MXPA04009998A (es) 2004-12-13
US20170000779A1 (en) 2017-01-05
JP2013053156A (ja) 2013-03-21
KR20120128710A (ko) 2012-11-27
EP2390311B1 (en) 2018-08-08
EP2390311A1 (en) 2011-11-30
US20030235909A1 (en) 2003-12-25
CA2481386A1 (en) 2003-10-23
KR20180014222A (ko) 2018-02-07
KR101873663B1 (ko) 2018-07-02
JP2009256369A (ja) 2009-11-05
HK1090086A1 (en) 2006-12-15
AU2009200256B2 (en) 2012-03-08
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