JP2022140856A - 誘導性結合タンパク質及びその使用方法 - Google Patents

誘導性結合タンパク質及びその使用方法 Download PDF

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Abstract

【課題】ＣＤ３に結合するプロテアーゼ活性化ドメインと、少なくとも１つの半減期延長ドメインと、１つ以上の標的抗原に結合する２つ以上のドメインとを含む、条件的活性化ポリペプチド構築物を提供すること。【解決手段】二分型ポリペプチドを提供する。その薬学的組成物、ならびにこのようなポリペプチド構築物を作製するための核酸、組換え発現ベクター、及び宿主細胞もまた提供する。本発明の改善されたｓｃＦｖは、二量体化合物を形成することによって、単一ユニットによって実証される結合活性の欠如を克服するという予想外の利点を有する。また、本明細書に記載のポリペプチド構築物を、疾患、状態、及び障害の予防、及び／または治療において使用する方法も提供する。【選択図】図３

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年３月８日に出願された米国仮特許出願第６２／３０５，０９２号の利益を主張するものであり、参照によりその全体が全ての目的のために明示的に組み込まれる。
個々の細胞または特定の細胞型の選択的破壊は、しばしば様々な臨床状況において望ましい。例えば、腫瘍細胞を特異的に破壊しつつ、健常な細胞及び組織を、可能な限り無傷かつ未損傷のままにすることは、癌療法の主要な目標である。１つのそのような方法は、腫瘍に対する免疫応答を誘導して、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞または細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）などの免疫エフェクター細胞に、腫瘍細胞を攻撃及び破壊させることによる。
腫瘍関連抗原に対する優れた結合特異性及び親和性を提供する無傷のモノクローナル抗体（ＭＡｂ）の使用は、癌治療及び診断領域において成功裏に適用されている。しかしながら、無傷のＭＡｂの大きいサイズ、それらの乏しい生体内分布、及び血液プールにおける長期持続性は、それらの臨床用途を制限している。例えば、無傷の抗体は、腫瘍領域内に特異的な蓄積を呈し得る。生体内分布研究において、腫瘍を正確に調べる際に、周辺部に一次蓄積を伴う不均一な抗体分布が認められる。腫瘍壊死、不均一な抗原分布、及び間質組織圧の増加に起因して、無傷の抗体構築物で腫瘍の中央部分に到達することは可能ではない。対照的に、より小さい抗体フラグメントは、迅速な腫瘍局在を示し、腫瘍により深く浸透し、また、血流から比較的迅速に除去される。
親ＭＡｂの小さい結合ドメインに由来する単一鎖フラグメント（ｓｃＦｖ）は、臨床用途のために無傷のＭＡｂよりも良好な生体内分布を提供し、腫瘍細胞をより効率的に標的化することができる。単一鎖フラグメントは、細菌から効率的に操作することができるが、ほとんどの操作されたｓｃＦｖは、一価構造を有し、二価化合物が経験する結合活性の欠如に起因して、それらの親ＭＡｂ（（Ｃ（ｃ）、Ｄ）と比較して、腫瘍蓄積の減少、例えば、腫瘍細胞上での短い滞留時間、及び特異性を示す。
ｓｃＦｖの有利な特性にもかかわらず、特定の特徴は、癌化学療法におけるそれらの完全な臨床的展開を妨げる。特に注目すべきは、罹患細胞及び健常組織の両方に共通の細胞表面受容体へのこれらの薬剤の標的化に起因する、罹患組織と健常組織との間の交差反応性である。改善された治療指数を有するＳｃＦｖは、これらの薬剤の臨床的有用性において著しい前進をもたらすであろう。本発明は、このような改善されたｓｃＦｖ、ならびにその製造及び使用方法を提供する。本発明の改善されたｓｃＦｖは、二量体化合物を形成することによって、単一ユニットによって実証される結合活性の欠如を克服するという予想外の利点を有する。
種々の実施形態では、本発明は、二分型ポリペプチドを提供する。図５３を参照すると、例示的な実施形態では、ポリペプチドの２つの領域は、切断時に２つの領域の分離を可能にするように、単一結合から、１つ以上の切断可能なリンカー（ＣＬ）を含み得るより大きいポリペプチドドメインのサイズ範囲のｓｃＦｖ領域リンカー（ＲＬ）によって、１つ以上の切断部位と接続される。ポリペプチドの２つの領域の各々は、不活性化ｓｃＦｖへの少なくとも１つの切断不可能なリンカー（ＮＣＬ１及びＮＣＬ２）を介して、Ｔ細胞活性化タンパク質（αＣＤ３、αＣＤ１６、αＴＣＲα、αＴＣＲβ、αＣＤ２８など）に連結される、１つ以上の疾患標的化ドメイン（例えば、標的抗原結合ドメイン（ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ、細胞受容体ドメイン、レクチンなどを含む単一鎖結合ドメインの任意の形式であり得る）を含有する。Ｔ細胞活性化ドメインを標的化するｓｃＦｖは、そのＶＨまたはＶＬセグメントのいずれかで不活性化され、各ｓｃＦｖの２つのセグメントは、罹患組織で切断されやすい切断可能なリンカー（ＣＬ１及びＣＬ２）を使用して接続される。
本明細書に記載される抗原結合ポリペプチド構築物は、従来のモノクローナル抗体及び他のより小さい二重特異性分子に勝る複数の治療上の利点をもたらす。特に注目すべきは、本発明のポリペプチド構築物の条件的活性化である。構築物は、本質的にそれらの意図された標的抗原に結合することができるままであるが、ＣＤ３シグナル伝達活性は、ポリペプチド自体の構造にプログラムされた独自のポリペプチド分解ステップに依存する。したがって、本発明の例示的なポリペプチドの非罹患正常組織に対する比活性は、類似の抗体及び抗体フラグメントの比活性と比較して、有意に低減される。この部位への進行中に「サイレント」状態のままでありつつ、所望の作用部位でポリペプチドが「オンになる」能力は、特異的に結合するポリペプチド治療剤の分野において、顕著な前進であり、容易に設計可能かつ表現可能なドラッガブルな形式を提供する。
一般に、組換えポリペプチド医薬品の有効性は、しばしば、ポリペプチド自体の内因性の迅速な薬物動態によって制限され、ポリペプチドの迅速なクリアランスにつながる。本発明の例示的な抗原結合ポリペプチドによって提供される追加の利点は、半減期延長ドメイン、例えばＨＳＡに特異的に結合する結合ドメインを有することに起因する、延長された薬物動態学的排除半減期である。この点において、本発明の例示的な抗原結合ポリペプチドは、延長された血清滞留半減期を有する。このモチーフの例示的なポリペプチド構築物は、いくつかの実施形態では、約２、３、約５、約７、約１０、約１２、または約１４日間の半減期を有する。これは、比較的短い排除半減期を有するＢｉＴＥまたはＤＡＲＴ分子のような他の結合タンパク質とは有利に対照的である。例えば、ＢｉＴＥ ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性ｓｃＦｖ－ｓｃＦｖ融合分子は、その短い排除半減期に起因して、連続静脈内注入（ｉ．ｖ．）薬物送達を必要とする。本発明の例示的な抗原結合ポリペプチドのより長い内因性半減期は、この欠点を改善し、それにより、低用量薬学的製剤、周期的投与の減少、及び／または本発明の化合物を組み込む新規の薬学的組成物のような治療可能性の増加を可能にする。
本発明の例示的な抗原結合ポリペプチドはまた、組織浸透及び分布の増強、ならびに初回通過腎クリアランスの低減のための最適なサイズを有する。腎臓は一般に約５０ｋＤａ未満の分子を濾過するので、タンパク質治療の設計におけるクリアランスを低減する取り組みは、タンパク質融合、グリコシル化、またはポリエチレングリコールポリマー（すなわちＰＥＧ）の添加によって、分子サイズを増加させることに焦点を当てている。しかしながら、タンパク質治療薬のサイズを増加させることは、腎クリアランスを防止し得るが、より大きいサイズは、標的組織への分子の浸透も防止する。本明細書に記載される例示的な抗原結合ポリペプチドは、急速な腎クリアランスを防止するアルブミンと会合することによってこれを回避しつつ、組織の浸透及び分布の増強、ならびに最適な有効性を可能にする小さいサイズも有する。種々の実施形態では、半減期延長ドメインは、切断可能なリンカーによって治療活性成分から分離されている分子内の位置に配置される。したがって、例えば、リンカーを切断する作用物質（例えば、プロテアーゼ、エステラーゼ、還元または酸化微小環境）内の所望の標的に到達すると、半減期延長ドメインは、治療活性成分から切断され、治療成分のサイズを低減し、組織へのその浸透または細胞による取り込みを促進する。他の実施形態では、半減期延長ドメインは、抗原結合ドメインと活性抗ＣＤ３ドメインとの間に配置される。
したがって、例示的な実施形態では、本発明は、ＣＤ－３抗原に対する単一鎖ｓｃＦｖポリペプチドを提供する。ｓｃＦｖポリペプチドは、切断可能なｓｃＦｖリンカーを通じて連結された第１のｓｃＦｖドメイン及び第２のｓｃＦｖドメインを含む。第１のｓｃＦｖドメインは、第１の切断可能なｓｃＦｖリンカー部分を通じて接合された第１のＶＨ １ドメイン及び第１のＶＬ １ドメインを含む。ＶＬまたはＶＨの１つは、その用語が本明細書で定義される際（すなわち、ＶＬ１ｉ、ＶＨ１ｉ）、不活性である。第１のＶＨドメイン及び第１のＶＬドメインは、相互作用して、第１のｓｃＦｖを形成するが、不活性な同族であるため、ｓｃＦｖは、ＣＤ－３に特異的に結合しない。第１のｓｃＦｖリンカー部分（例えば、ＣＬ１）は、第１のＶＨ １及び第１のＶＬ １ドメイン間の第１のプロテアーゼ切断部位を含む。プロテアーゼ切断部位での第１のｓｃＦｖリンカーのプロテアーゼ切断時に、不活性なＶＨｉまたは不活性ＶＬｉドメインは、そのＶＬまたはＶＨ結合パートナーから分離し、これは次いで、その活性な同族と対合し、適切に対合した抗ＣＤ－３ドメインを形成し、ＣＤ－３抗原に結合することを可能にする。標的抗原結合ドメインは、リンカーを介して、ＶＨ／ＶＬ対の活性な同族に接続される。
例示的な実施形態では、第１のｓｃＦｖドメインは、第２の切断部位（例えば、プロテアーゼ切断部位）を任意選択に含む第１のリンカー部分を介して、第２のｓｃＦｖドメインに接合される。第２のｓｃＦｖドメインは、第１のドメインと非常に類似して構築され、第２のｓｃＦｖリンカー部分を介して接合された第２のＶＨドメイン及び第２のＶＬドメインを含む。第２のｓｃＦｖリンカー部分は、第２のＶＨドメインと第２のＶＬドメインとの間の第３のプロテアーゼ切断部位を任意選択で含む。第２のＶＨドメイン及び第２のＶＬドメインは、相互作用して、第２のＶＨ／ＶＬ対を形成する。上に記載される第１のＶＨ／ＶＬ対と同様に、第２のＶＨドメイン及び第２のＶＬのうちの１つは、不活性であり、そのため、第２のｓｃＦｖドメインは、ＣＤ－３抗原に特異的に結合せず、かつ第１及び第２のｓｃＦｖ結合ドメイン間複合体にも結合しない。第２のｓｃＦｖドメインは、第２のドメインリンカーを通じて、第２の標的抗原結合ドメインに接合される。この第２のドメインリンカーは、第１のＶＨドメイン及び第１のＶＬドメインから選択されたメンバーを、第２の標的抗原結合ドメインに接合する。標的抗原結合ドメインは、リンカーを介して、ＶＨ／ＶＬ対の活性な同族に接続される。
本発明のポリペプチド構築物は、切断可能なリンカーにおいて切断され、ＣＤ－３抗原を提示する細胞の存在下で、ＣＤ－３抗原に結合する活性ＣＤ－３結合ドメインが形成される。同様に、標的抗原結合ドメインは、標的抗原に結合する。
例示的な実施形態では、本発明は、ＣＤ－３抗原に対する単一のｓｃＦｖドメインを有する単一鎖ｓｃＦｖポリペプチドを提供する。ｓｃＦｖポリペプチドは、第１のｓｃＦｖリンカー部分を通じて接合された第１のＶＨドメイン及び第１のＶＬドメインを含む、第１のｓｃＦｖドメインを含む。この第１のｓｃＦｖリンカー部分は、第１のＶＨドメインと第１のＶＬドメインとの間の第１の切断部位、例えば、プロテアーゼ切断部位を含む。第１のＶＨドメイン及び第１のＶＬドメインは、相互作用して、第１のＶＨドメイン及び第１のＶＬドメインのうちの１つが不活性である、第１のＶＨ／ＶＬ対を形成する。したがって、第１のｓｃＦｖドメインは、ＣＤ－３抗原に特異的に結合することができない。第１のｓｃＦｖポリペプチドは、第１のドメインリンカー部分を通じて、第１の標的抗原結合ドメインに接合される。第１のドメインリンカーは、第１のＶＨドメイン及び第１のＶＬドメインから選択されるメンバーを、第１の標的抗原結合ドメインに接合する。第１の標的抗原結合ドメインは、不活性ＶＬまたは不活性ＶＨに連結されていない。
例示的な実施形態では、上に記載される単一ドメインｓｃＦｖ構築物の一対が提供される。構築物の対は、それらの対合したＣＤ－３結合ドメインを通じて、ＣＤ－３抗原に協働的に結合する。対の個々のｓｃＦｖ分子の対合したＣＤ－３部位のＣＤ－３抗原への結合は、対の各メンバーの標的抗原結合ドメインのその同族抗原への結合により、促進、増強、及び／または駆動される。
いくつかの実施形態では、抗原結合ポリペプチドが提供され、２つ以上の可逆的に不活性なＣＤ３結合ドメインと、２つ以上の標的抗原結合ドメインと、任意選択で１つ以上の半減期延長ドメインと、１つ以上プロテアーゼ切断ドメインと、を含む、単一ポリペプチド鎖を含み、プロテアーゼ切断ドメインのプロテアーゼ切断時に、ＣＤ３結合ドメインは、活性になり、ＣＤ３に結合する。例示的な実施形態では、ＣＤ３結合ドメインは、活性になり、プロテアーゼ切断部位の切断に続いて、ＣＤ３に結合することができる。種々の実施形態では、ＣＤ３結合ドメインは、プロテアーゼ切断部位の切断、及び標的抗原結合ドメイン（複数可）による標的抗原（複数可）の結合後に、活性になる。いくつかの実施形態では、ＣＤ３への結合は、Ｔ細胞を活性化し、これは次に、罹患（例えば、癌性）細胞を破壊する。
例示的な実施形態では、本発明のポリペプチド構築物は、ＣＤ３に選択的に結合する結合ドメインを含むｓｃＦｖを含む。ＣＤ３結合ドメインは、ＣＤ３に選択的に結合することができるＶＨまたはＶＬを含む。このＶＨまたはＶＬは、それぞれＶＬまたはＶＨと対合される。
本発明のポリペプチドは、ＣＤ３結合ドメイン（複数可）及びプロテアーゼ切断部位（複数可）を組み込むｓｃＦｖを含む、条件的ＣＤ３結合ポリペプチドを参照して本明細書に例示されており、これは、プロテアーゼによる切断の際に、不活性ＶＬまたはＶＨを、その対合した活性ＶＨまたはＶＬからそれぞれ分離し、ＣＤ３結合ドメイン（複数可）を活性化し、ＣＤ３へのその（それらの）結合を可能にする。代表的なｓｃＦｖは、プロテアーゼ切断部位を含むポリペプチドリンカーを介して連結されたＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む。ＣＤ３結合ドメインは、可逆的に不活性であり、したがって、プロテアーゼ切断部位のプロテアーゼ切断まで、ＣＤ３に実質的に結合することができない。プロテアーゼ切断部位を切断することができる代表的なプロテアーゼは、癌細胞によって発現されるか、または腫瘍微小環境内に局在するプロテアーゼである。例示的な実施形態では、本発明のポリペプチドは、少なくとも１つの標的抗原結合部位をさらに含む。代表的な標的抗原は、癌細胞の表面に見出される抗原、例えば、ＥＧＦＲである。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼ切断ドメインは、標的抗原結合ドメインが標的抗原（複数可）に結合する前に切断される。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ切断ドメインは、抗原結合ドメイン（複数可）が標的抗原に結合した後に切断される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、２つ以上の標的抗原結合ドメインを含む。２つ以上の抗原結合ドメインは、同じまたは異なるポリペプチド配列を有する。種々の実施形態では、２つ以上の抗原結合ドメインは、同じまたは異なるポリペプチド配列を有し、同じ標的抗原に結合する。例示的な実施形態では、２つ以上の抗原結合ドメインのポリペプチド配列は異なり、２つ以上のドメインは、同じ標的抗原または異なる標的抗原に結合する。いくつかの実施形態では、２つ以上の標的抗原結合ドメインの各々は、同じ細胞上の異なる配列または構造の標的抗原に結合する。例示的な実施形態では、２つ以上の標的抗原結合ドメインの各々は、２つ以上の細胞の各々の異なる配列の抗原に結合する。種々の実施形態では、２つ以上の抗原結合ドメインの各々は、２つ以上の細胞の各々上の同じ配列または異なる配列の抗原に結合する。
本明細書において、条件的に結合する抗原結合ポリペプチド、その薬学的組成物、ならびにそのような抗原結合ポリペプチドを作製するための核酸、組換え発現ベクター、及び宿主細胞、ならびに本発明の抗原結合ポリペプチドを使用する疾患、障害、または状態の治療のための方法が記載される。
本発明の他の目的、実施形態、及び利点は、以下の詳細な説明において明らかである。
本発明の新規な特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に記載されている。本発明の特徴及び利点のより良好な理解は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を記載する以下の詳細な説明、及び添付の図面を参照することによって得られるであろう。
一時的に発現されるＰｒｏｄｅｎｔ１～４のＳＤＳ－ＰＡＧＥプロファイルを示す。 透析後に逆算したＰｒｏ１～４発現レベルを示す。 精製されたタンパク質の分析的サイズ排除クロマトグラフィーを示す。 精製されたタンパク質の分析的サイズ排除クロマトグラフィーを示す。 精製されたタンパク質の分析的サイズ排除クロマトグラフィーを示す。 精製されたタンパク質の分析的サイズ排除クロマトグラフィーを示す。 Ｐｒｏ５：Ｐｒｏｄｅｎｔプラットフォーム２を示す。 Ｐｒｏ６及びＰｒｏ７：二機能性パートナーを示す。図４は、抗ＣＤ３ｓｃＦｖ中のＶＨまたはＶＬのＣＤＲ２へのＥＫ切断部位の挿入が、ＣＤ－３結合及び活性を無効にすることを確認する。 Ｐｒｏ８：陽性対照を示す。図５は、ｓｃＦｖリンカーにおけるＥＫ部位の挿入が、ｓｃＦｖ折り畳み及びＣＤ－３結合に干渉しないことを確認する。 Ｅｘｐｉ２９３におけるＰｒｏｄｅｎｔ５～８－の一時的な発現を示す。 精製されたＰｒｏｄｅｎｔ５～８が、ＳＥＣ上のモノマープロファイルを示すことを実証するデータである。図７Ａは、Ｐｒｏ５－Ｇ８：（Ｉ２ｃｉ）ｘ２：Ｄ１２：：Ｈｉｓ６を示す。 精製されたＰｒｏｄｅｎｔ５～８が、ＳＥＣ上のモノマープロファイルを示すことを実証するデータである。図７Ｂは、Ｐｒｏ６－Ｇ８（ｓｄＡｂ）：Ｉ２Ｃｉ：：Ｈｉｓ６を示す。 精製されたＰｒｏｄｅｎｔ５～８が、ＳＥＣ上の単量体プロフィールを示すことを示す。図７Ｃは、Ｐｒｏ７－Ｉ２Ｃｉ：Ｄ１２（ｓｄＡｂ）：：Ｈｉｓ６を示す。 精製されたＰｒｏｄｅｎｔ５～８が、ＳＥＣ上のモノマープロファイルを示すことを実証するデータである。図７Ｄは、Ｐｒｏ８－Ｇ８（ｓｄＡｂ）：Ｉ２Ｃｆｌａｇ：：Ｈｉｓ６を示す。 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上のＮｉエクセル精製されたプラットフォーム２タンパク質を示す。 ４つのタイプの結合／活性アッセイを示す。 プラットフォーム２ ＰｒｏｄｅｎｔがｈＥＧＦＲに結合することを示す。図１０Ａは、ＥＧＦＲへのＰｒｏｄｅｎｔの結合を示す－ＥＬＩＳＡ（ｒｈＥＧＦＲ－Ｆｃ、抗Ｈｉｓ－ＨＲＰ検出。 プラットフォーム２ ＰｒｏｄｅｎｔがｈＥＧＦＲに結合することを示す。図１０Ｂは、ＥＧＦＲへのＰｒｏｄｅｎｔの結合を示す－ＦＡＣＳ ＯＶＣＡＲ８抗Ｈｉｓ ＦＩＴＣ検出。 不活性なプラットフォーム２ Ｐｒｏｄｅｎｔが、ＣＤ３に結合しないことを示す。図１１Ａは、ＣＤ３へのＰｒｏｄｅｎｔの結合を示す－ＥＬＩＳＡ（ＣｙＣＤ３－Ｆｌａｇ－Ｆｃ、抗Ｈｉｓ－ＨＲＰ検出。 不活性なプラットフォーム２ Ｐｒｏｄｅｎｔが、ＣＤ３に結合しないことを示す。図１１Ａは、ＣＤ３へのＰｒｏｄｅｎｔの結合を示す－ＦＡＣＳジャーカット抗Ｈｉｓ－ＦＩＴＣ検出を使用して判定。 Ｐｒｏ６及びＰｒｏ７：プロテアーゼ切断によるＣＤ３結合の活性化を示す。 組換えエンテロキナーゼによるＰｒｏｄｅｎｔの切断を示す。 ＥＫ切断後のＣＤ３へのｐｒｏｄｅｎｔの結合を試験するためのＥＬＩＳＡアッセイフォーマットを示す（サンドイッチＥＬＩＳＡ）。 Ｐｒｏ６が、ＥＫ切断後にＣＤ３に結合しないことを示す（サンドイッチＥＬＩＳＡ）。図１４Ｂは、ビオチン－ｃｙＣＤ３：：Ｆｌａｇ：：ｈｕＦＣ、ＳＡＶ－ＨＲＰで検出されたｒＥＧＦＲ：：ｈｕＦＣへのＰｒｏ６の結合を示す。 Ｐｒｏ７が、ＥＫ切断後にＣＤ３に結合しないことを示す（サンドイッチＥＬＩＳＡ）。図１４Ｃは、ビオチン－ｃｙＣＤ３：：Ｆｌａｇ：：ｈｕＦＣ、ＳＡＶ－ＨＲＰで検出されたｒＥＧＦＲ：：ｈｕＦＣへのＰｒｏ７の結合を示す。 Ｐｒｏ６＋Ｐｒｏ７が、ＥＫ切断後にＣＤ３と協働的に結合することを示す（サンドイッチＥＬＩＳＡ）。図１４Ｄは、ビオチン－ｃｙＣＤ３：：Ｆｌａｇ：：ｈｕＦＣ、ＳＡＶ－ＨＲＰで検出されたｒＥＧＦＲ：：ｈｕＦＣへのＰｒｏ６＋Ｐｒｏ７の結合を示す。 Ｐｒｏ６＋Ｐｒｏ７が、ＥＫ切断後にＣＤ３と協働的に結合することを示す（サンドイッチＥＬＩＳＡ）。 ＥＧＦＲ発現細胞の表面上のＥＫ切断後のＣＤ３への結合を試験するためのＦＡＣＳアッセイフォーマットを示す（サンドイッチＦＡＣＳ）。 Ｐｒｏ６が、ＥＫ切断後にＣＤ３に結合しないことを示す（サンドイッチＦＡＣＳ）。図１５Ｂは、Ａ４８８－ｃｙＣＤ３：：Ｆｌａｇ：：ｈＦＣで検出されたＯＶＣＡＲ－８へのＥＫ消化Ｐｒｏ６の結合を示す。 Ｐｒｏ７が、ＥＫ切断後にＣＤ３に結合しないことを示す（サンドイッチＦＡＣＳ）。図１５Ｃは、Ａ４８８－ｃｙＣＤ３：：Ｆｌａｇ：：ｈＦＣで検出されたＯＶＣＡＲ－８へのＥＫ消化Ｐｒｏ７の結合を示す。 Ｐｒｏ６＋Ｐｒｏ７が、ＥＫ切断後にＣＤ３に協働的に結合することを示す（サンドイッチＦＡＣＳ）。図１５Ｄは、Ａ４８８－ｃｙＣＤ３：：Ｆｌａｇ：：ｈｕＦＣで検出されたＯＶＣＡＲ－８へのＥＫ消化Ｐｒｏ６＋Ｐｒｏ７の結合を示す。 Ｐｒｏ６＋Ｐｒｏ７が、ＥＫ切断後にＣＤ３に協働的に結合することを示す（サンドイッチＦＡＣＳ）。 Ｐｒｏ５によるＣＤ３結合が、ＥＫによるタンパク質分解切断後に活性化されることを示す。Ｐｒｏ５によるＣＤ３結合は、ＥＫによるタンパク質分解切断後に活性化される。図１６は、Ａ４８８－ｃｙＣＤ３：：Ｆｌａｇ：：ｈｕＦＣで検出されたＯＶＣＡＲ－８へのＥＫ消化Ｐｒｏ５の結合を示す。 Ｐｒｏ８：対照分子を示す。図１７は、ｓｃＦｖリンカーにおけるＥＫ部位の挿入が、ｓｃＦｖ折り畳み及びＣＤ３結合に干渉しないことを確認する。 Ｐｒｏ８：対照分子を示す。図１８Ａは、ｓｃＦｖリンカーにおけるＥＫ部位の挿入が、ｓｃＦｖ折り畳み及びＣＤ３結合に干渉しないことを確認する。図１８Ａは、ビオチン－ｃｙＣＤ３：：Ｆｌａｇ：：ｈｕＦＣ、ＳＡＶ－ＨＲＰで検出されたｒｈＥＧＦＲ：：ｈＦＣへのＰｒｏ８の結合を示す。 Ｐｒｏ８：対照分子を示す。図１８Ｂは、ｓｃＦｖリンカーにおけるＥＫ部位の挿入が、ｓｃＦｖ折り畳み及びＣＤ３結合に干渉しないことを確認する。図１８Ｂは、Ａ４８８－ｃｙＣＤ３：：ｆｌａｇ：：ｈＦＣで検出されたＯＶＣＡＲ－８へのＥＫ消化Ｐｒｏ８の結合を示す。 Ｐｒｏ８：陽性対照分子を示す。 ＥＫ切断が、Ｐｒｏ６＋Ｐｒｏ７でＥＧＦＲ＋標的細胞のＴ細胞殺滅を協働的に活性化するが、Ｐｒｏ８による殺滅を低減させることを示す。図１９Ａは、Ｐｒｏ６の結果を示す。 ＥＫ切断が、Ｐｒｏ６＋Ｐｒｏ７でＥＧＦＲ＋標的細胞のＴ細胞殺滅を協働的に活性化するが、Ｐｒｏ８による殺滅を低減させることを示す。図１９Ｂは、Ｐｒｏ７の結果を示す。 ＥＫ切断が、Ｐｒｏ６＋Ｐｒｏ７でＥＧＦＲ＋標的細胞のＴ細胞殺滅を協働的に活性化するが、Ｐｒｏ８による殺滅を低減させることを示す。図１９Ｃは、Ｐｒｏ６＋Ｐｒｏ７の結果を示す。 ＥＫ切断が、Ｐｒｏ６＋Ｐｒｏ７でＥＧＦＲ＋標的細胞のＴ細胞殺滅を協働的に活性化するが、Ｐｒｏ８による殺滅を低減させることを示す。図１９Ｄは、Ｐｒｏ８の結果を示す。 Ｐｒｏ２５を示す。 Ｐｒｏ２６を示す。 Ｐｒｏ２７を示す。 活性ＣＤ３結合ドメインの生成が、両方のアームの標的結合に依存することを示す。ＧＦＰは、ＯｖＣａｒ８細胞の表面上に発現されない。図２１Ａは、ｂ－ｃｙＣＤ３：：Ｆｌａｇ：：ｈＦＣ、ＳＡＶ－ＨＲＰで検出されたｒｈＥＧＦＲへのＰｒｏ６＋Ｐｒｏ７の結合を示す。 活性ＣＤ３結合ドメインの生成が、両方のアームの標的結合に依存することを示す。ＧＦＰは、ＯｖＣａｒ８細胞の表面上に発現されない。図２１Ｂは、ｂ－ｃｙＣＤ４：：Ｆｌａｇ：：ｈＦＣ、ＳＡＶ－ＨＲＰで検出されたｒｈＥＧＦＲへのＰｒｏ６＋Ｐｒｏ９の結合を示す。 活性ＣＤ３結合ドメインの生成が、両方のアームの標的結合に依存することを示す。ＧＦＰは、ＯｖＣａｒ８細胞の表面上に発現されない。図２１Ｃは、ｂ－ｃｙＣＤ３：：Ｆｌａｇ：：ｈＦＣ、ＳＡＶ－ＨＲＰで検出されたｒｈＥＧＦＲへのＰｒｏ６＋Ｐｒｏ２６の結合を示す。 活性ＣＤ３結合ドメインの生成が、両方のアームの標的結合に依存することを示す。ＧＦＰは、ＯｖＣａｒ８細胞の表面上に発現されない。図２１Ｄは、ｂ－ｃｙＣＤ３：：Ｆｌａｇ：：ｈＦＣ、ＳＡＶ－ＨＲＰで検出されたｒｈＥＧＦＲへのＰｒｏ６＋Ｐｒｏ２７の結合を示す。 活性ＣＤ３結合ドメインの生成が、両方のアームの標的結合に依存することを示す。ＧＦＰは、ＯｖＣａｒ８細胞の表面上に発現されない。図２１Ｅは、ｂ－ｃｙＣＤ３：：Ｆｌａｇ：：ｈＦＣ、ＳＡＶ－ＨＲＰで検出されたｒｈＥＧＦＲへのＰｒｏ７＋Ｐｒｏ２５の結合を示す。 活性ＣＤ３結合ドメインの生成が、両方のアームの標的結合に依存することを示す。ＧＦＰは、ＯｖＣａｒ８細胞の表面上に発現されない。図２１Ｆは、ｂ－ｃｙＣＤ３：：Ｆｌａｇ：：ｈｕＦＣ、ＳＡＶ－ＨＲＰで検出されたｒｈＥＧＦＲへのＰｒｏ９＋Ｐｒｏ２５の結合を示す。 マトリパ－ゼ（ｍａｔｒｉｐａｓｅ）（Ｍ）切断部位を有するＰｒｏ８、及び親Ｐｒｏ８の切断後に癌細胞と相互作用する切断されたＰｒｏ８の生成物を示す。図２２は、αＣＤ３ｓｃＦｖリンカーが修飾されて、異なる長さ及びプロテアーゼ特異性を組み込むことができることを実証する。 ビオチン－ｃｙＣＤ３Ｅ：：Ｆｌａｇ：：ｈｕＦＣ、ＳＡＶ－ＨＲＰを用いたＥＫ切断前後に検出された、ｒｈＥＧＦＲ：：ｈＦＣへのサンドイッチＥＬＩＳＡのＰｒｏ８の結合からのデータを示す。 は、ビオチン－ｃｙＣＤ３Ｅ：：Ｆｌａｇ：：ｈｕＦＣ、ＳＡＶ－ＨＲＰを用いたマトリプターゼ切断前後に検出された、ｒｈＥＧＦＲ：：ｈＦＣへのサンドイッチＥＬＩＳＡのＰｒｏ８ ＭＳ（１４ａａリンカー）の結合からのデータを示す。 ビオチン－ｃｙＣＤ３Ｅ：：Ｆｌａｇ：：ｈｕＦＣ、ＳＡＶ－ＨＲＰを用いたＳＴ１４切断前後に検出された、ｒｈＥＧＦＲ：：ｈＦＣへのサンドイッチＥＬＩＳＡのＰｒｏ８ ＭＬ（２４ａａリンカー）の結合からのデータを示す。 ＡＦ４８８－ｃｙＣＤ３：：Ｆｌａｇ：：ｈＦＣで検出されたＯｖＣＡＲ８への、ＥＫによる切断前後のＰｒｏ８の結合からのＦＡＣＳデータである。 ＡＦ４８８－ｃｙＣＤ３：：Ｆｌａｇ：：ｈＦＣで検出されたＯｖＣＡＲ８への、ＳＴ１４による切断前後のＰｒｏ８ ＭＳ（１４ａａリンカー）の結合からのＦＡＣＳデータである。 ＡＦ４８８－ｃｙＣＤ３：：Ｆｌａｇ：：ｈＦＣで検出されたＯｖＣＡＲ８への、ＳＴ１４による切断前後のＰｒｏ８ ＭＬ（２４ａａリンカー）の結合からのＦＡＣＳデータである。 代表的なＰｒｏｄｅｎｔの概略図を示す。図２５は、完全に活性なαＣＤ３ ｓｃＦｖｓ Ｉ２Ｃ（Ｐｒｏ８、Ｐｒｏ１１）、及びＯＫＴ３（Ｐｒｏ１５）を示す。 活性ＣＤ３結合部位を欠いている、代表的な不完全なαＣＤ３ Ｐｒｏｄｅｎｔの組み合わせを示す。 ビオチン－ｃｙＣＤ４：：Ｆｌａｇ：：ＦＣ、ＳＡＶ－ＨＲＰで検出されたｒｈＥＧＦＲへのＰｒｏ６＋Ｐｒｏ１０の結合を示す。 ビオチン－ｃｙＣＤ４：：Ｆｌａｇ：：ＦＣ、ＳＡＶ－ＨＲＰで検出されたｒｈＥＧＦＲへのＰｒｏ６＋Ｐｒｏ１４の結合を示す。 ビオチン－ｃｙＣＤ４：：Ｆｌａｇ：：ＦＣ、ＳＡＶ－ＨＲＰで検出されたｒｈＥＧＦＲへのＰｒｏ７＋Ｐｒｏ９の結合を示す。 ビオチン－ｃｙＣＤ４：：Ｆｌａｇ：：ＦＣ、ＳＡＶ－ＨＲＰで検出されたｒｈＥＧＦＲへのＰｒｏ７＋Ｐｒｏ１２の結合を示す。 ビオチン－ｃｙＣＤ４：：Ｆｌａｇ：：ＦＣ、ＳＡＶ－ＨＲＰで検出されたｒｈＥＧＦＲへのＰｒｏ９＋Ｐｒｏ１２の結合を示す。 ビオチン－ｃｙＣＤ４：：Ｆｌａｇ：：ＦＣ、ＳＡＶ－ＨＲＰで検出されたｒｈＥＧＦＲへのＰｒｏ１０＋Ｐｒｏ１４の結合を示す。 Ｎ末端～Ｃ末端標的ドメインの位置、及びＣＤ３結合におけるＰｒｏドメインの配向の効果の変化を伴う、代表的なＰｒｏ構造を示す。 Ｃ末端対Ｎ末端の標的結合ドメインが、類似の活性を有することを示す。図２９Ａは、Ｐｒｏ６＋Ｐｒｏ９のＯＶＣＡＲ８結合からのＦＡＣＳデータを示す。 Ｃ末端対Ｎ末端の標的結合ドメインが、類似の活性を有することを示す。図２９Ｂは、Ａ４８８－ｃｙＣＤ３：：Ｆｌａｇ：：ｈｕＦＣで検出されたＯＶＣＡＲ－８へのＥＫ消化Ｐｒｏ６＋Ｐｒｏ７の結合を示す。 単一特異的対二重標的化ドメインの効果を調べるために使用される代表的なＰｒｏ構造を示す。 二重標的化は、別個の標的分子に結合しなければならないｓｄＡｂで実現可能である。図３１Ａは、ＡＦ４８８－ｃｙＣＤ３で検出されたＰｒｏ９＋Ｐｒｏ１４のＯＶＣＡＲ８への結合に関するＦＡＣＳデータを示す。 二重標的化は、別個の標的分子に結合しなければならないｓｄＡｂで実現可能である。図３１Ｂは、ＡＦ４８８－ｃｙＣＤ３：：Ｆｌａｇ：：ｈｕＦＣで検出されたＯＶＣＡＲ－８へのＥＫ消化Ｐｒｏ６＋Ｐｒｏ７の結合を示す。 相補的なαＣＤ３ドメインを有する代表的なＰｒｏｄｅｎｔの組み合わせを示す。 相補的なαＣＤ３ドメインを有する代表的なＰｒｏｄｅｎｔの組み合わせ、すなわち、Ｐｒｏ６＋Ｐｒｏ９（単一シス＋二重トランス分子標的化）を示す。 相補的なαＣＤ３ドメインを有する代表的なＰｒｏｄｅｎｔの組み合わせ、すなわち、Ｐｒｏ９＋Ｐｒｏ１４（二重分子－トランスのみの標的化）を示す。 ＡＦ４８８－ｃｙＣＤ３で検出されたＰｒｏ６＋Ｐｒｏ７のＯＶＣＡＲ８結合に関するＦＡＣＳデータを示す。 ＡＦ４８８－ｃｙＣＤ３で検出されたＰｒｏ９＋Ｐｒｏ１０のＯＶＣＡＲ８結合に関するＦＡＣＳデータを示す。 ＡＦ４８８－ｃｙＣＤ３で検出されたＰｒｏ１２＋Ｐｒｏ１４のＯＶＣＡＲ８結合に関するＦＡＣＳデータを示す。 ＡＦ４８８－ｃｙＣＤ３で検出されたＰｒｏ７＋Ｐｒｏ１０のＯＶＣＡＲ８結合に関するＦＡＣＳデータを示す。 ＡＦ４８８－ｃｙＣＤ３で検出されたＰｒｏ６＋Ｐｒｏ９のＯＶＣＡＲ８結合に関するＦＡＣＳデータを示す。 ＡＦ４８８－ｃｙＣＤ３で検出されたＰｒｏ６＋Ｐｒｏ１２のＯＶＣＡＲ８結合のサンドイッチＦＡＣＳ（トランスのみの結合）からのデータを示す。 ＡＦ４８８－ｃｙＣＤ３で検出されたＰｒｏ７＋Ｐｒｏ１４のＯＶＣＡＲ８結合のサンドイッチＦＡＣＳ（トランスのみの結合）のデータを示す。 ＡＦ４８８－ｃｙＣＤ３で検出されたＰｒｏ９＋Ｐｒｏ１４のＯＶＣＡＲ８結合のサンドイッチＦＡＣＳ（トランスのみの結合）のデータを示す。 ＡＦ４８８－ｃｙＣＤ３で検出されたＰｒｏ１０＋Ｐｒｏ１２のＯＶＣＡＲ８結合のサンドイッチＦＡＣＳ（トランスのみの結合）からのデータを示す。 ＴＤＣＣ：シス＋トランス及びトランスのみの活性が類似していることを示す。図３５Ａは、切断された、及び切断されていないＴＤＣＣ ＯＶＣＡＲ８ ＬｕｃＢシス結合Ｐｒｏｄｅｎｔを示す。（Ｐｒｏ６＋Ｐｒｏ７、Ｐｒｏ６＋Ｐｒｏ９、Ｐｒｏ７＋Ｐｒｏ１０）。 ＴＤＣＣ：シス＋トランス及びトランスのみの活性が類似していることを示す。図３５Ｂは、切断された、及び切断されていないＴＤＣＣ ＯＶＣＡＲ８ ＬｕｃＢトランス結合Ｐｒｏｄｅｎｔを示す。（Ｐｒｏ９＋Ｐｒｏ１４；Ｐｒｏ６＋Ｐｒｏ１８） ＴＤＣＣ－陽性対照Ｐｒｏｄｅｎｔが、ＥＫ切断後に活性を失うことを示す：切断された、及び切断されていないＰｒｏｄｅｎｔ８、１１、１５でのＯＶＣＡＲ８ ＬｕｃＢ細胞の死滅に関するＴＤＣＣデータ。 ＯＶＣＡＲ８－ｌｕｘ細胞の単一ピークにおけるＥＫ－Ｈｉｓ６の安定した発現は、非トランスフェクト細胞上のＥＫ発現に対して染色され、延長された曲線は、ＥＫ発現ベクターで安定的にトランスフェクトされた細胞上のＥＫ発現に対して染色される。 ＥＫ発現ＯＶＣＡＲ８クローン（高発現、中発現、及び低発現）を示す。 ＥＫ発現ＯＶＣＡＲ８細胞による用量依存的なＰｒｏｄｅｎｔ活性化を示す。図３９Ａは、標識されたｃｙＣＤ３εを使用して検出された、ＥＫ発現ＯＶＣＡＲ－８クローンへの切断されていないＰｒｏ６＋Ｐｒｏ９の結合を示す。 ＥＫ発現ＯＶＣＡＲ８細胞による用量依存的なＰｒｏｄｅｎｔ活性化を示す。図３９Ｂは、蛍光標識ｃｙＣＤ３εを使用したＥＫ発現ＯＶＣＡＲ－８クローンへの切断されていないＰｒｏ６＋Ｐｒｏ９の結合に関するＦＡＣＳデータを示す。 ＥＫを伴う、または伴わないＰｒｏ６＋Ｐｒｏ９によるＯＶＣＡＲ８細胞のＴＤＣＣ殺滅データを示す。 Ｐｒｏ６＋Ｐｒｏ９によるＥＫ発現ＯＶＣＡＲ８クローンに関するＴＤＣＣデータを示す。 αＣＤ３ ＶＨ及びＶＬにおけるＣＤＲ変化の不活性化を特定するために使用される構造モデルを示す：相同性モデルを示すαＣＤ３ｅ ｓｃＦｖの相同性モデリング、５ｆｘｃ．ｐｄｂを使用するＳｗｉｓｓ－Ｍｏｄｅｌ、ｓｃＦｖ－ＳＭ３、６９％同一性ＧＭＱＥ ０．７７ ＱＭＥＡＮ －１．１１。 αＣＤ３ ＶＨ及びＶＬにおけるＣＤＲ変化の不活性化を特定するために使用される構造モデルを示す：１ｘｉｗ．ｐｄｂ、ｓｃＦＶを有するヒトＣＤ３－ｅ／ｄ二量体とアライメントされる相同性モデルを示す、αＣＤ３ｅ ｓｃＦｖの相同性モデリング。 ＣＤ３ｅ結合（ＶＨドメイン）の代表的な配列、及び最も近いヒト生殖系列配列にアライメントさた不活性変異体を形成するための突然変異の領域を示す。 本発明の例示的なＰｒｏｄｅｎｔにおける不活性変異体ＣＤ３ｅ結合（ＶＨドメイン）の代表的な配列を示す。 ＣＤ３ｅ結合（ＶＬドメイン）の代表的な配列、及び不活性変異体を形成するための突然変異領域、ならびに最も近いヒト生殖系列配列にアライメントされた不活性変異体を形成するための例示的なアミノ酸部位を示す。 結合に関するｏｃｔｅｔアッセイにおける使用の例示的なＰｒｏｄｅｎｔを示す。 選択されたＰｒｏｄｅｎｔの結合活性を示す－ｏｃｔｅｔアッセイ。 Ｐｒｏ２３－２つの半分への血清切断を示し、Ｐｒｏ２３が、ＥＫ及びトロンビンによる切断に感受性であることを実証する。 Ｐｒｏ２４－２つの半分への腫瘍切断を示し、ＥＫ活性プロテアーゼ切断部位を示す。 （１）Ｐｒｏ２３の、ＥＫ（２）、ＥＫ及びトロンビン（３）、ならびにトロンビンのみ（４）による切断；Ｐｒｏ２４（５）のＥＫ（６）による切断を実証する、ＳＤＳ ＰＡＧＥからのデータを示す。 切断された、及び切断されていないＰｒｏ２３による、ＯＶＣＡＲ８の殺滅に関するＴＤＣＣデータを示す。 切断された、及び切断されていないＰｒｏ２４による、ＯＶＣＡＲ８の殺滅に関するＴＤＣＣデータを示す。 本発明のポリペプチド構築物における使用の代表的なｓｃＦｖ及びドメインリンカーの配列、ならびにこれらのリンカーの切断に関するデータを提供する。図４８Ａは、１ｎＭのＤａｂｃｙｌ－Ｅｄａｎｓ基質でのＭＭＰ９によるＭＭＰ９ペプチド基質の切断を示す。図４８Ｂは、マウス血清中のＭＭＰ９基質の切断を示す。図４８Ｃは、ヒト血清中のＭＭＰ９基質の切断を示す。図４８Ｄは、カニクイザル中のＭＭＰ９基質の切断を示す。 本発明のポリペプチド構築物における使用の代表的なリンカーに対する種々の例示的なポリペプチド配列のリストである。図４９Ａは、Ｍｅｐｒｉｎ１ａ ３ｎＭ）によるペプチド基質の切断を示す。図４９Ｂは、Ｍｅｐｒｉｎ１ｂ ３ｎＭ）によるペプチド基質の切断を示す。図４９Ｃは、Ｍｅｐｒｉｎ１ａ ３ｎＭ）によるペプチド基質の切断を示す。図４９Ｄは、ヒト血清中のペプチド基質の切断を示す。図４９Ｅは、マウス血清中のペプチド基質の切断を示す。図４９Ｆは、カニクイザル中のペプチド基質の切断を示す。 本発明のポリペプチド構築物における使用の代表的なリンカーに対する種々の例示的なポリペプチド配列のリストである。図５０Ａは、マトリプターゼＳＴ１４によるペプチド基質の切断を示す。図５０Ｂは、マウス血清中のペプチド基質の切断を示す。図５０Ｃは、ヒト血清中のペプチド基質の切断を示す。図５０Ｄは、カニクイザルにおけるペプチド基質の切断を示す。 血液プロテアーゼによって切断される本発明のポリペプチド構築物における使用の例示的なリンカー配列を示す。図５１Ａは、トロンビンによって切断された例示的なペプチド基質を示す。図５１Ｂは、フリンによって切断されたペプチド基質を示す。図５１Ｃは、好中球エラスターゼによって切断されたペプチド基質を示す。 血清によって切断される本発明のポリペプチド構築物における使用の例示的なリンカー配列を示す。図５２Ａは、ヒト血清中のペプチド基質の切断を示す。図５２Ｂは、マウス血清中のペプチド基質の切断を示す。図５２Ｃは、カニクイザル中のペプチド基質の切断を示す。 本発明の例示的なポリペプチド構築物の構成要素部分の配置の柔軟性を実証する。 ＮからＣ末端に向かって読み取ると、第１の標的抗原結合ドメイン（α－Ｔ１）が、ドメインリンカーを通じて、第１のＣＤ－３ ＶＬ結合ドメインに結合され、これが、次に、切断可能なドメインリンカー（ＣＬ１）を通じて、第１の不活性ＣＤ－３ ＶＨｉ結合ドメインに結合される、第１のフォーマットを表示する。ＣＬ１はまた、第１の半減期延長ドメイン（ＨＥＤ）にも結合しており、これは、それ自体が、第２のＣＤ－３ ＶＨ結合ドメインに結合した、第２の標的抗原結合ドメイン（α－Ｔ２）に、ドメインリンカーを通じて結合している。第２のＣＤ－３ ＶＨ結合ドメインは、不活性であり、第２の半減期延長ドメインにも結合している第２のＣＤ－３ ＶＬ結合ドメイン（ＶＬｉ）に、切断可能なドメインリンカー（ＣＬ２）を通じて結合する。ポリペプチドのＣ末端は、１、２、３、４、５、６、７、８、９ １０個以上のアミノ酸のブロック基、例えば、Ｈｉｓ６を任意選択で含む。 ＮからＣ末端に向かって読み取ると、第２の標的抗原結合ドメイン（α－Ｔ２）が、第１のＣＤ－３ ＶＬ結合ドメインに結合され、これが、次に、切断可能なドメインリンカー（ＣＬ１）を通じて、第１の不活性ＣＤ－３ ＶＨｉ結合ドメインに結合される、第２のフォーマットを表示する。ＣＤ－３ ＶＨはまた、第１の半減期延長ドメインにも結合しており、これは、それ自体が、第２のＣＤ－３ ＶＨ結合ドメインに結合した、第１の標的抗原結合ドメイン（α－Ｔ１）に、ドメインリンカーを通じて結合している。第２のＣＤ－３ ＶＨ結合ドメインは、不活性であり、第２の半減期延長ドメインにも結合している第２のＣＤ－３ ＶＬ結合ドメイン（ＶＬｉ）に、切断可能なリンカー（ＣＬ２）を通じて結合する。ポリペプチドのＣ末端は、１、２、３、４、５、６、７、８、９ １０個以上のアミノ酸のブロック基、例えば、Ｈｉｓ６を任意選択で含む。 ＮからＣ末端に向かって読み取ると、第１の標的抗原結合ドメイン（α－Ｔ１）が、第１のＣＤ－３ ＶＨ結合ドメインに結合され、これが、次に、切断可能なドメインリンカー（ＣＬ１）を通じて、第１の不活性ＣＤ－３ ＶＬｉ結合ドメインに結合される、第３のフォーマットを表示する。ＣＤ３ ＶＬｉはまた、第１の半減期延長ドメインにも結合しており、これは、それ自体が、第２のＣＤ－３ ＶＬ結合ドメインに結合した、第２の標的抗原結合ドメイン（α－Ｔ２）に、ドメインリンカーを通じて結合している。第２のＣＤ－３ ＶＬ結合ドメインは、不活性であり、第２の半減期延長ドメインにも結合している第２のＣＤ－３ ＶＨ結合ドメイン（ＶＨｉ）に、切断可能なリンカー（ＣＬ２）を通じて結合する。ポリペプチドのＣ末端は、１、２、３、４、５、６、７、８、９ １０個以上のアミノ酸のブロック基、例えば、Ｈｉｓ６を任意選択に含む。 ＮからＣ末端に向かって読み取ると、第２の標的抗原結合ドメイン（α－Ｔ２）が、第１のＣＤ－３ ＶＨ結合ドメインに結合され、これが、次に、切断可能なリンカー（ＣＬ１）を通じて、第１の不活性ＣＤ－３ ＶＬｉ結合ドメインに結合される、第４のフォーマットを表示する。ＣＤ－３ ＶＬｉはまた、第１の半減期延長ドメインにも結合しており、これは、それ自体が、第２のＣＤ－３ ＶＬ結合ドメインに結合した、第１の標的抗原結合（α－Ｔ１）に、ドメインリンカーを通じて結合している。第２のＣＤ－３ ＶＨ結合ドメインは、不活性であり、第２の半減期延長ドメインにも結合している第２のＣＤ－３ ＶＨ結合ドメイン（ＶＨｉ）に、切断可能なドメインリンカー（ＣＬ２）を通じて結合する。ポリペプチドのＣ末端は、１、２、３、４、５、６、７、８、９ １０個以上のアミノ酸のブロック基、例えば、Ｈｉｓ６を任意選択で含む。 ＮからＣ末端に向かって読み取ると、第１の半減期延長ドメインが、不活性であり、かつ第１の切断可能なリンカー（ＣＬ１）を通じて、第１の標的抗原結合ドメイン（α－Ｔ１）に連結された第１のＣＤ－３ ＶＬ結合ドメインに連結されている、第１のＣＤ－３ ＶＨ結合ドメイン（ＶＨｉ）に連結されている、第５のフォーマットを表示する。第１の標的抗原結合ドメインは、ドメインリンカーを通じて、第２の半減期延長ドメインに連結され、これは、不活性であり、かつそれ自体が、第２の標的抗原結合ドメイン（α－Ｔ２）に結合した第２のＣＤ－３ ＶＨドメインに、第２の切断可能なドメインリンカー（ＣＬ２）を通じて結合されている、第２のＣＤ－３ ＶＬ結合ドメイン（ＶＬｉ）に連結される。ポリペプチドのＣ末端は、１、２、３、４、５、６、７、８、９ １０個以上のアミノ酸のブロック基、例えば、Ｈｉｓ６を任意選択で含む。 ＮからＣ末端に向かって読み取ると、第１の半減期延長ドメインが、不活性であり、かつ第１の切断可能なリンカー（ＣＬ１）を通じて、第２の標的抗原結合（α－Ｔ２）に連結された第１のＣＤ－３ ＶＬ結合ドメインに結合されている、第１のＣＤ－３ ＶＨ結合ドメイン（ＶＨｉ）に連結されている、本発明のポリペプチド構築物の例示的なフォーマットを示す。第２の標的抗原結合ドメインは、ドメインリンカーを通じて、第２の半減期延長ドメインに連結され、これは、不活性であり、かつ、それ自体が、第１の標的抗原結合ドメイン（α－Ｔ１）に結合した第２のＣＤ－３ ＶＨドメインに、第２の切断可能なドメインリンカー（ＣＬ２）を通じて結合されている、第２のＣＤ－３ ＶＬ結合ドメイン（ＶＬｉ）に連結される。ポリペプチドのＣ末端は、１、２、３、４、５、６、７、８、９ １０個以上のアミノ酸のブロック基、例えば、Ｈｉｓ６を任意選択で含む。 ＮからＣ末端に向かって読み取ると、第１の半減期延長ドメインが、不活性であり、かつ第１の切断可能なリンカー（ＣＬ１）を通じて、第１の標的抗原結合ドメイン（α－Ｔ１）に連結された第１のＣＤ－３ ＶＨ結合ドメインに結合されている、第１のＣＤ－３ ＶＬ結合ドメイン（ＶＬｉ）に連結されている、本発明のポリペプチド構築物の第７の例示的なフォーマットを示す。第１の標的抗原結合ドメインは、ドメインリンカーを通じて、第２の半減期延長ドメインに連結され、これは、不活性であり、かつそれ自体が、第２の標的抗原結合ドメイン（α－Ｔ２）に結合した第２のＣＤ－３ ＶＬドメインに、第２の切断可能なリンカー（ＣＬ２）を通じて結合されている、ＣＤ－３ ＶＨ結合ドメイン（ＶＨｉ）に連結される。ポリペプチドのＣ末端は、１、２、３、４、５、６、７、８、９ １０個以上のアミノ酸のブロック基、例えば、Ｈｉｓ６を任意選択で含む。 ＮからＣ末端に向かって読み取ると、第１の半減期延長ドメインが、不活性であり、かつ第１の切断可能なリンカー（ＣＬ１）を通じて、第２の標的抗原結合ドメイン（α－Ｔ２）に連結された第１のＣＤ－３ ＶＨ結合ドメインに結合されている、第１のＣＤ－３ ＶＬ結合ドメイン（ＶＬｉ）に連結されている、本発明のポリペプチド構築物の第８の例示的なフォーマットを示す。第２の標的抗原結合ドメインは、ドメインリンカーを通じて、第２の半減期延長ドメインに連結され、これは、不活性であり、かつそれ自体が、第１の標的抗原結合ドメイン（α－Ｔ１）に結合した第２のＣＤ－３ ＶＬドメインに、第２の切断可能なリンカー（ＣＬ－２）を通じて結合されている、第２のＣＤ－３ ＶＨ結合ドメイン（ＶＨｉ）に結合される。ポリペプチドのＣ末端は、１、２、３、４、５、６、７、８、９ １０個以上のアミノ酸のブロック基、例えば、Ｈｉｓ６を任意選択で含む。 ＮからＣ末端に向かって読み取ると、第１の標的抗原結合ドメイン（α－Ｔ１）が、第１のＣＤ－３ ＶＬドメインに連結され、これは、第１の切断可能なリンカー（ＣＬ１）を通じて、不活性であり、かつドメインリンカーを通じて第２の半減期延長ドメインに連結されている第１の半減期延長ドメインに結合されている、第１のＣＤ－３ ＶＨドメイン（ＶＨｉ）に連結される、本発明のポリペプチド複合体の別の例示的なフォーマットを示す。第２の半減期延長ドメインは、第２のＣＤ－３ ＶＬドメイン（ＶＬｉ）に連結され、これは、不活性であり、かつ第２の標的抗原結合ドメイン（α－Ｔ２）に連結されている第２のＣＤ－３ ＶＨドメインに、第２の切断可能なリンカー（ＣＬ２）を通じて連結されている。ポリペプチドのＣ末端は、１、２、３、４、５、６、７、８、９ １０個以上のアミノ酸のブロック基、例えば、Ｈｉｓ６を任意選択で含む。 ＮからＣ末端に向かって読み取ると、第２の標的抗原結合（α－Ｔ２）が、第１のＣＤ－３ ＶＬドメインに連結され、これは、第１の切断可能なリンカー（ＣＬ１）を通じて、不活性であり、かつドメインリンカーを介して第２の半減期延長ドメインに連結されている、第１の半減期延長ドメインに結合されている、第１のＣＤ－３ ＶＨドメイン（ＶＨｉ）に連結されている、本発明のポリペプチド複合体の別の例示的なフォーマットを示す。第２の半減期延長ドメインは、ｓｃＦｖと、不活性であり、かつ第１の標的抗原結合（α－Ｔ１）に連結されている第２のＣＤ－３ ＶＨドメインに、第２の切断可能なリンカー（ＣＬ２）を通じて連結されている、第２のＣＤ－３ ＶＬドメイン（ＶＬｉ）と、に連結されている。ポリペプチドのＣ末端は、１、２、３、４、５、６、７、８、９ １０個以上のアミノ酸のブロック基、例えば、Ｈｉｓ６を任意選択で含む。 ＮからＣ末端に向かって読み取ると、第１の標的抗原結合ドメイン（α－Ｔ１）が、第１のＣＤ－３ ＶＨドメインに連結され、これは、第１の切断可能なリンカー（ＣＬ１）を通じて、不活性であり、かつドメインリンカーを通じて第２の半減期延長ドメインに連結されている第１の半減期延長ドメインに結合されている、第１のＣＤ－３ ＶＬドメイン（ＶＬｉ）に連結される、本発明のポリペプチド複合体の別の例示的なフォーマットを示す。第２の半減期延長ドメインは、第２のＣＤ－３ ＶＨドメイン（ＶＨｉ）に連結され、これは、不活性であり、かつ第２の標的抗原結合ドメイン（α－Ｔ２）に連結されている第２のＣＤ－３ ＶＬドメインに、第２の切断可能なリンカー（ＣＬ２）を通じて連結されている。ポリペプチドのＣ末端は、１、２、３、４、５、６、７、８、９ １０個以上のアミノ酸のブロック基、例えば、Ｈｉｓ６を任意選択で含む。 ＮからＣ末端に向かって読み取ると、第２の標的抗原結合（α－Ｔ２）が、第１のＣＤ－３ ＶＨドメインに連結され、これは、第１の切断可能なリンカー（ＣＬ１）を通じて、不活性であり、かつドメインリンカーを介して第２の半減期延長ドメインに連結されている、第１の半減期延長ドメインに結合されている、第１のＣＤ－３ ＶＬドメイン（ＶＬｉ）に連結されている、本発明のポリペプチド複合体の別の例示的なフォーマットを示す。第２の半減期延長ドメインは、第２のＣＤ－３ ＶＨドメイン（ＶＨｉ）に連結され、これは、不活性であり、かつ第１の標的抗原結合ドメイン（α－Ｔ１）に連結されている第２のＣＤ－３ ＶＬドメインに、第２の切断可能なリンカー（ＣＬ２）を通じて連結されている。ポリペプチドのＣ末端は、１、２、３、４、５、６、７、８、９ １０個以上のアミノ酸のブロック基、例えば、Ｈｉｓ６を任意選択で含む。 ＮからＣ末端に向かって読み取ると、第１の半減期延長ドメインが、第１のＣＤ－３ ＶＨドメイン（ＶＨｉ）に連結され、これは、不活性であり、かつ第１の切断可能なリンカー（ＣＬ１）を通じて、第１のＣＤ－３ ＶＬドメインに連結されている、本発明のポリペプチド複合体の別の例示的なフォーマットを示す。ＣＤ－３ ＶＬドメインは、第１の標的抗原結合（α－Ｔ１）に連結され、これは、ドメインリンカーを介して第２の標的抗原結合ドメイン（α－Ｔ２）に連結され、これは、不活性であり、かつ第２の半減期延長ドメインに連結されている第２のＣＤ３－ＶＬドメイン（ＶＬｉ）に、第２の切断可能なドメインリンカーを通じて連結された、第２のＣＤ－３ ＶＨドメインに連結されている。ポリペプチドのＣ末端は、１、２、３、４、５、６、７、８、９ １０個以上のアミノ酸のブロック基、例えば、Ｈｉｓ６を任意選択で含む。 ＮからＣ末端に向かって読み取ると、第１の半減期延長ドメインが、第１のＣＤ－３ ＶＨドメイン（ＶＨｉ）に連結され、これは、不活性であり、かつ第１の切断可能なリンカー（ＣＬ１）を通じて、第１のＣＤ－３ ＶＬドメインに連結されている、本発明のポリペプチド複合体の別の例示的なフォーマットを示す。ＣＤ－３ ＶＬドメインは、第２の抗原結合ドメイン（α－Ｔ２）に連結され、これは、ドメインリンカーを介して第１の抗原結合ドメイン（α－Ｔ１）に連結され、これは、不活性であり、かつ第２の半減期延長ドメインに連結されている第２のＣＤ３－ＶＬドメイン（ＶＬｉ）に、第２の切断可能なドメインリンカー（ＣＬ２）を通じて連結された、第２のＣＤ－３ ＶＨドメインに連結されている。ポリペプチドのＣ末端は、１、２、３、４、５、６、７、８、９ １０個以上のアミノ酸のブロック基、例えば、Ｈｉｓ６を任意選択で含む。 ＮからＣ末端に向かって読み取ると、第１の半減期延長ドメインが、第１のＣＤ－３ ＶＬドメイン（ＶＬｉ）に連結され、これは、不活性であり、かつ第１の切断可能なリンカー（ＣＬ１）を通じて、第１のＣＤ－３ ＶＨドメインに連結されている、本発明のポリペプチド複合体の別の例示的なフォーマットを示す。ＣＤ－３ ＶＨドメインは、第１の標的抗原結合ドメイン（α－Ｔ１）に連結され、これは、ドメインリンカーを介して第２の標的抗原結合（α－Ｔ２）に連結され、これは、不活性であり、かつ第２の半減期延長ドメインに連結されている第２のＣＤ－３ ＶＨドメイン（ＶＨｉ）に連結された第２のＣＤ－３ ＶＬドメインに連結されている。ポリペプチドのＣ末端は、１、２、３、４、５、６、７、８、９ １０個以上のアミノ酸のブロック基、例えば、Ｈｉｓ６を任意選択で含む。 ＮからＣ末端に向かって読み取ると、第１の半減期延長ドメインが、第１のＣＤ－３ ＶＬドメイン（ＶＬｉ）に連結され、これは、不活性であり、かつ第１の切断可能なリンカー（ＣＬ１）を通じて、第１のＣＤ－３ ＶＨドメインに連結されている、本発明のポリペプチド複合体の別の例示的なフォーマットを示す。第１のＣＤ－３ ＶＨドメインは、第２の標的抗原結合ドメイン（α－Ｔ２）に連結され、これは、ドメインリンカーを介して第１の標的抗原結合ドメイン（α－Ｔ１）に連結され、これは、不活性であり、かつ第２の半減期延長ドメインに結合されている第２のＣＤ３ ＶＨドメイン（ＶＨｉ）に、第２の切断可能なリンカー（ＣＬ２）を介して連結されている第２のＣＤ－３ ＶＬドメインに連結されている。ポリペプチドのＣ末端は、１、２、３、４、５、６、７、８、９ １０個以上のアミノ酸のブロック基、例えば、Ｈｉｓ６を任意選択で含む。 本発明の例示的なポリペプチド構築物に関する代表的な核酸及びポリペプチド配列を提供する。本発明における使用の例示的なポリペプチドは、Ｃ末端でブロックされており、そのため、Ｈｉｓｘ Ｃ末端タグで示される配列は、これらのタグ、これらのタグのより短いまたはより長いバージョン、またはタグなしで利用することができる。 本発明の種々のポリペプチド構築物に対する配列番号、及びこれらの構築物に対する省略名称の用語索引を提供する。 本発明の実施形態における使用のリンカーに関する例示的なリンカー配列を提供する。
導入
条件的に活性化可能な抗原結合ポリペプチドが本明細書に記載される。本発明の例示的なポリペプチドは、少なくとも１つの標的抗原結合ドメイン、ＶＨ及びＶＬのうちの少なくとも一方がＣＤ－３への特異的結合に関して不活性である少なくとも１つのＶＨ／ＶＬ対を有するＣＤ－３に対する少なくとも１つのｓｃＦｖ、ポリペプチド構築物の構成要素と共有結合する種々のｓｃＦｖ及びドメインリンカー、ならびに１つ以上のドメイン及び／またはｓｃＦｖリンカー及び任意選択で１つ以上の半減期延長ドメイン内の切断可能な部位を含む。例示的な切断可能な部位は、ポリペプチド構築物が指向される腫瘍の微小環境に位置するかまたは集中する血清酵素（例えば、エステラーゼ）または分解酵素（例えば、プロテアーゼ）によって切断可能である。例示的な分解酵素は、腫瘍によって、または腫瘍微小環境内で発現されるプロテアーゼである。構築物のリンカー中の少なくとも１つの切断可能な部位が切断されると、ｓｃＦｖ対の不活性メンバー（複数可）が構築物から除去され、ｓｃＦｖ対の活性メンバー（複数可）が、その活性同族体と相互作用する（例えば、ＶＨ １／ＶＬｉ１がＶＨ １となり、ＶＨｉ２／ＶＬ ２がＶＬ ２となり、ＶＨ １及びＶＬ ２が相互作用して、ＣＤ－３に特異的に結合する機能的ｓｃＦｖを形成する）。構築物はまた、標的抗原結合ドメインを介して選択された標的抗原に特異的に結合する。例示的な実施形態では、ＶＨ １及びＶＬ ２は、標的抗原結合ドメインをＶＨ １及びＶＬ ２にさらに連結するドメインリンカーによって接合されたままである。本発明のある特定のポリペプチド構築物はまた、ポリペプチドの投与を、それを必要とする対象に行った後で、そのポリペプチドの半減期を増大させる、１つ以上の半減期延長ドメインを含む。例示的な半減期延長ドメインは、循環血漿タンパク質（例えば、ＨＳＡ）に対する抗体または抗体フラグメントである。半減期延長ドメイン（複数可）は、半減期延長ドメインが、その目的、例えば、構築物の腫瘍への送達、または所望のインビボ循環半減期の完了を達成した後で構築物から切断されるように、半減期延長ドメインと構築物の残りとの間に１つ以上の切断可能なリンカーを有するポリペプチド配列中に含まれ得る。半減期延長ドメイン（複数可）は、半減期延長ドメインが、ＣＤ３結合ドメインの活性化の後でポリペプチド中に保持されるように、半減期延長ドメインと構築物の残りとの間に切断可能なリンカーを有しないポリペプチド配列中に含まれ得る。添付の図面は、本発明のポリペプチド構築物の多くの例示的なモチーフの構造を提供する。
２つ以上のＶＨ／ＶＬ対を有する本発明のポリペプチド構築物は、単一体として存在する。種々の実施形態において、本発明の化合物は、単一のＶＨ／ＶＬ対を含む。これらの実施形態において、ポリペプチド構築物は、一般に、対で使用され、ここでは、対の一方のメンバーがＶＨ／ＶＬｉを含み、他方がＶＨｉ／ＶＬを含み、その結果、対の不活性の方の切断時に、ＶＨ／ＶＬが対になりＣＤ－３に結合することができるようになる。
本発明のポリペプチド構築物の例示的な実施形態において、疾患細胞標的化ドメインは、切断不可能なリンカー（ＮＣＬ１及びＮＣＬ２）によって活性な抗Ｔ細胞結合セグメントに連結される。活性及び不活性抗Ｔ細胞ｓｃＦｖセグメントは、疾患組織微小環境（ＣＬ１及びＣＬ２）に対して感受性である切断可能なリンカーによって連結される。２つの半分子またはタンパク質領域は、別の分解可能なリンカー（ＲＬ）によって連結される。図５３。
種々の実施形態において、初期構築物は、体内への注入後に、局所リンカー（ＲＬ）での切断によって分離され得る２つのポリペプチド領域から構成される。疾患標的結合ドメインは先行して活性であり、それらの標的に結合することで、罹患細胞の表面上の不活性タンパク質を富化することができる。次いで、切断可能なリンカーを疾患組織微小環境において切断することができ、活性Ｔ細胞結合セグメント（標的化ドメイン及び切断不可能なリンカーによって罹患細胞に結合する）を再結合させて、活性Ｔ細胞結合ｓｃＦｖを罹患細胞の表面上に創出することができる。活性Ｔ細胞結合ｓｃＦｖを創出するためのこの組換えにより、Ｔ細胞が罹患細胞に結合し、それを殺滅する。１～２個の半減期延長ドメインは、罹患細胞に到達する前に分子の循環半減期を延長し、不活性抗Ｔ細胞ドメイン（ＶＬｉまたはＶＨｉ）と共に除去されて、それらが罹患組織を離れる場合には切断された／活性化された分子の半減期を制限する。罹患細胞上に蓄積するのに十分な半減期を有することを確実にするために、局所リンカーが腫瘍中で切断される場合には１個の半減期延長ドメインが望ましく、局所リンカーが血液中で切断される場合には２個が望ましい。腫瘍関連及び血液関連酵素によって切断可能なリンカーを含むポリペプチド構築物は、本発明の範囲内である。
ポリペプチド構築物の薬学的組成物、ならびにこれらの構築物を作製するための核酸、組換え発現ベクター、及び宿主細胞も本発明により提供される。疾患、状態、及び障害の予防及び／または治療において開示されるポリペプチドを使用する方法も提供される。
定義
本発明をより完全に理解できるようにするため、いくつかの定義を以下に示す。そのような定義は、文法的等価物を包含するものである。
「アミノ酸」及び「アミノ酸同一性」は、本明細書で使用される場合、特定の規定された位置に存在し得る２０種の天然に存在するアミノ酸または任意の非天然類似体のうちの１つを意味する。本明細書における「タンパク質」は、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、及びペプチドを含む、少なくとも２つの共有結合したアミノ酸を意味する。このタンパク質は、天然に存在するアミノ酸及びペプチド結合、または合成ペプチド模倣構造、すなわち、特にＬＣペプチドが患者に投与される場合には、ペプトイド（Ｓｉｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９（２０）：９３６７（１９９２）を参照のこと）のような「類似体」で構成され得る。したがって、「アミノ酸」または「ペプチド残基」は、本明細書で使用される場合、天然アミノ酸及び合成アミノ酸の両方を意味する。例えば、ホモフェニルアラニン、シトルリン、及びノレオロイシンは、本発明の目的ではアミノ酸と見なされる。「アミノ酸」には、プロリン及びヒドロキシプロリンなどのイミノ酸残基も含まれる。側鎖は、（Ｒ）または（Ｓ）立体配置のいずれかであり得る。好ましい実施形態では、アミノ酸は（Ｓ）またはＬ立体配置である。天然に存在しない側鎖が使用される場合、非アミノ酸置換基が、例えば、インビボの分解を防止または遅延させるために使用され得る。
本明細書における「アミノ酸修飾」は、ポリペプチド配列におけるアミノ酸の置換、挿入、及び／もしくは欠失、またはタンパク質に化学的に連結された部分への改変を意味する。例えば、改変は、タンパク質に結合した改変された炭水化物またはＰＥＧ構造であってもよい。本明細書における「アミノ酸修飾」は、ポリペプチド配列中のアミノ酸の置換、挿入、及び／または欠失を意味する。明確にするために、別段の記載がない限り、アミノ酸修飾は、常に、ＤＮＡによってコードされるアミノ酸、例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡにコドンを有する２０個のアミノ酸に対するものである。本明細書における好ましいアミノ酸修飾は置換である。
本明細書における「アミノ酸置換」または「置換」は、親ポリペプチド配列中の特定の位置のアミノ酸を異なるアミノ酸で置換することを意味する。特に、いくつかの実施形態では、置換は、特定の位置で天然に存在しない（生物内で天然に存在しないか、またはいずれの生物中にも存在しない）アミノ酸に対するものである。例えば、置換Ｅ２７２Ｙは、２７２位のグルタミン酸がチロシンで置換されている変異体ポリペプチド、この場合はＦｃ変異体を指す。明確にするために、核酸コード配列を変化させるが、出発アミノ酸を変化させない（例えば、宿主生物発現レベルを上昇させるためにＣＧＧ（アルギニンをコードする）をＣＧＡ（アルギニンをなおコードする）に交換する）ように操作されたタンパク質は、「アミノ酸置換」ではない。すなわち、同じタンパク質をコードする新しい遺伝子の創出にもかかわらず、タンパク質は、それが開始する特定の位置に同じアミノ酸を有する場合、それはアミノ酸置換ではない。
「アミノ酸挿入」または「挿入」は、本明細書で使用される場合、親ポリペプチド配列の特定の位置にアミノ酸配列を付加することを意味する。例えば、－２３３Ｅまたは２３３Ｅは、２３３位の後、及び２３４位の前のグルタミン酸の挿入を示す。さらに、－２３３ＡＤＥまたはＡ２３３ＡＤＥは、２３３位の後、及び２３４位の前のＡｌａＡｓｐＧｌｕの挿入を示す。
「アミノ酸欠失」または「欠失」は、本明細書で使用される場合、親ポリペプチド配列中の特定の位置でアミノ酸配列を除去することを意味する。例えば、Ｅ２３３－またはＥ２３３＃、Ｅ２３３（）またはＥ２３３ｄｅｌは、２３３位のグルタミン酸の欠失を示す。さらに、ＥＤＡ２３３－またはＥＤＡ２３３＃は、２３３位で始まる配列ＧｌｕＡｓｐＡｌａの欠失を示す。
本明細書で使用される場合、本明細書における「ポリペプチド」は、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、及びペプチドを含む、少なくとも２つの共有結合したアミノ酸を意味する。ペプチジル基は、天然に存在するアミノ酸及びペプチド結合、または合成ペプチド模倣構造、すなわちペプトイド（全体が参照により組み込まれるＳｉｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９（２０）：９３６７（１９９２）を参照のこと）などの「類似体」を含んでもよい。アミノ酸は、当業者には理解されるであろうとおり、天然に存在するものでも合成物（例えば、ＤＮＡによってコードされるアミノ酸ではないもの）でもよい。例えば、ホモフェニルアラニン、シトルリン、オルニチン、及びノレオロイシンは、本発明の目的では合成アミノ酸と考えられ、Ｄ－及びＬ－（ＲまたはＳ）立体配置のアミノ酸の両方を利用することができる。本発明の変異体は、Ｃｒｏｐｐ＆Ｓｈｕｌｔｚ，２００４，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．２０（１２）：６２５－３０、Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００４， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０１（２）：７５６６－７１、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００３，３０３（５６５６）：３７１－３、及びＣｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１（５６３５）：９６４－７によって説明されている方法が挙げられるがこれらに限定されない、Ｓｃｈｕｌｔｚ及び共同研究者らによって開発された技術を使用して組み込まれた合成アミノ酸の使用を含む修飾を含み得る。さらに、ポリペプチドには、１つ以上の側鎖または末端の合成誘導体化、グリコシル化、ＰＥＧ化、円順列、環化、他の分子へのリンカー、タンパク質またはタンパク質ドメインへの融合、及びペプチドタグまたは標識の付加が含まれ得る。
本明細書に概説されるように、本発明のポリペプチドは、ＣＤ３及び標的細胞受容体に特異的に結合する。本明細書における「特異的に結合する」は、ポリペプチドが、少なくとも１０－４～１０－６Ｍ－１の範囲、好ましくは、１０－７～１０－９Ｍ－１の範囲の結合定数を有することを意味する。
グリコシル化されたポリペプチドが「ポリペプチド」の定義内に特に含まれる。「アグリコシル化ポリペプチド」は、本明細書で使用される場合、Ｆｃ領域の２９７位に結合した炭水化物を欠くポリペプチドを意味し、番号付けはＫａｂａｔのようにＥＵシステムに従う。アグリコシル化ポリペプチドは、脱グリコシル化ポリペプチド、つまり、Ｆｃ炭水化物が、例えば、化学的または酵素的に除去された、抗体または抗体フラグメントである。あるいは、アグリコシル化ポリペプチドは、グリコシル化パターンをコードする１つまたは残基の突然変異によって、またはタンパク質に炭水化物を結合させない生物、例えば、細菌における発現によって、Ｆｃ炭水化物なしで発現される非グリコシル化（ｎｏｎｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）または非グリコシル化（ｕｎｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）抗体であってもよい。
「親ポリペプチド」または「前駆体ポリペプチド」（Ｆｃ親または前駆体を含む）は、本明細書で使用される場合、変異体を生成するために続いて修飾されるポリペプチドを意味する。該親ポリペプチドは、天然に存在するポリペプチド、または天然に存在するポリペプチドの変異体もしくは操作されたバージョンであってもよい。親ポリペプチドは、ポリペプチド自体、親ポリペプチドを含む組成物、またはそれをコードするアミノ酸配列を指してもよい。したがって、「親Ｆｃポリペプチド」は、本明細書で使用される場合、変異体を生成するように修飾される非修飾Ｆｃポリペプチドを意味し、「親抗体」は、本明細書で使用される場合、変異体抗体を生成するように修飾される非修飾抗体を意味する。
「位置」は、本明細書で使用される場合、タンパク質の配列中の場所を意味する。位置は、順番に、または確立されているフォーマット、例えば、抗体番号付けのためのＥＵインデックスに従って、番号付けされてもよい。
「標的抗原」は、本明細書で使用される場合、所与の抗体の可変領域によって特異的に結合される分子を意味する。標的抗原は、タンパク質、炭水化物、脂質、または他の化合物であってもよい。多岐にわたる好適な例示的標的抗原が本明細書に記載されている。
「標的細胞」は、本明細書で使用される場合、標的抗原を発現する細胞を意味する。
本明細書における「抗体」とは、認識された免疫グロブリン遺伝子の全部または一部によって実質的にコードされる１つ以上のポリペプチドからなるタンパク質を意味する。例えばヒトにおいて認識される免疫グロブリン遺伝子は、無数の可変領域遺伝子を共に構成する、カッパ（κ）、ラムダ（λ）、及び重鎖遺伝子座、ならびにＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、及びＩｇＡアイソタイプをそれぞれコードする、定常領域遺伝子のミュー（μ）、デルタ（δ）、ガンマ（γ）、シグマ（ε）、及びアルファ（α）を含む。本明細書の抗体は、全長抗体及び抗体フラグメントを含むことを意味し、任意の生物由来の天然抗体、操作された抗体、または以下にさらに定義される、実験目的、治療目的、または他の目的のために組換え生成される抗体を指してもよい。したがって、「抗体」には、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の両方が含まれる。モノクローナル及びポリクローナル抗体の調製方法及び精製方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８８）に記載されている。本明細書で概説するように、「抗体」は、本明細書に記載のＦｃ変異体、本明細書に記載のＦｃ変異体フラグメントを含む「全長」抗体、及び本明細書に記載の他のタンパク質へのＦｃ変異体融合体を特に含む。
「抗体」という用語には、当該技術分野で既知であるように、抗体フラグメント、例えば、抗体全体の修飾によって産生されるか、または組換えＤＮＡ技術を用いてデノボ合成される、単一鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、キメラ抗体などの、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃｓ、または抗体の他の抗原結合部分配列が含まれる。「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体及びアゴニストまたはアンタゴニスト抗体であり得るｍＡｂをさらに含む。
Ｆｃ変異体部分を含む全長抗体が、「抗体」の定義内に特に含まれる。本明細書における「全長抗体」は、可変領域及び定常領域を含む、抗体の天然の生物学的形態を構成する構造を意味する。例えば、ヒト及びマウスを含むほとんどの哺乳動物において、ＩｇＧクラスの全長抗体は四量体であり、２つの免疫グロブリン鎖の２つの同一の対からなり、各対は軽鎖及び重鎖を１つずつ有し、各軽鎖は免疫グロブリンドメインＶＬ及びＣＬを含み、各重鎖は免疫グロブリンドメインＶＨ、Ｃγ１、Ｃγ２、及びＣγ３を含む。一部の哺乳動物、例えば、ラクダ及びラマでは、ＩｇＧ抗体は２つの重鎖のみからなってもよく、各重鎖はＦｃ領域に結合した可変ドメインを含む。「ＩｇＧ」は、本明細書で使用される場合、認識された免疫グロブリンガンマ遺伝子によって実質的にコードされる抗体のクラスに属するポリペプチドを意味する。ヒトでは、このクラスは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含む。マウスでは、このクラスは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３を含む。
好ましい実施形態では、本発明の抗体はヒト化されている。現在のモノクローナル抗体技術を用いることで、識別することができる事実上あらゆる標的抗原に対するヒト化抗体を産生させることができる［Ｓｔｅｉｎ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：８８－９０（１９９７）］。非ヒト（例えばネズミ）抗体のヒト化形態は、免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはその断片（Ｆｖ、Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または抗体の他の抗原結合部分配列など）のキメラ分子であり、これは非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含む。ヒト化抗体には、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）を形成する残基が、所望される特異性、親和性、及び能力を有する、マウス、ラット、またはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基によって代置される、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）が含まれる。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって代置される。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体にも、インポートされたＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでもよい。一般に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応するか、あるいはＦＲ領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むことになる。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものを含むことになる［Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２９（１９８８）、及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３－５９６（１９９２）］。
非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当技術分野で周知である。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合、インポート残基（ｉｍｐｏｒｔ ｒｅｓｉｄｕｅ）と呼ばれ、典型的にはインポート可変ドメインから取られる。ヒト化は、本質的に、Ｗｉｎｔｅｒ及び共同研究者らの方法［Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，上記、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，上記、及びＶｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４－１５３６（１９８８）］に従って、齧歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列でヒト抗体の対応する配列を置換することによって行うことができる。ヒト化ネズミモノクローナル抗体のさらなる例、例えば、ヒトプロテインＣに結合する抗体［Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１１：３２１－８（１９９８）］、インターロイキン２受容体［Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：１００２９－３３（１９８９）］、及びヒト上皮成長因子受容体２［Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：４２８５－９（１９９２）］も当該技術分野で既知である。したがって、そのようなヒト化抗体は、無傷を大幅に下回るヒト可変ドメインが、非ヒト種由来の対応する配列によって置換されている、キメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）である。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかのＣＤＲ残基及び場合によりいくつかのＦＲ残基が、齧歯類抗体の類似部位由来の残基によって置換されているヒト抗体である。
好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドはヒト配列に基づいており、したがって、ヒト配列は、ラット、マウス、及びサルの配列などの他の配列を比較する「ベース」配列として使用される。一次配列または構造との相同性を確立するために、前駆体または親抗体またはｓｃＦｖのアミノ酸配列は、対応するヒト配列と直接比較される。本明細書に記載の相同性アライメントプログラムのうちの１つ以上を使用して（例えば、保存された残基を間種（ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ）として使用して）配列のアラインメントを行って、アラインメントを維持するために必要な挿入及び欠失を可能にした（すなわち、恣意的な欠失及び挿入による保存された残基の排除を避ける）後で、ヒトポリペプチドの一次配列における特定のアミノ酸に相当する残基が定義される。保存された残基のアラインメントは、好ましくは、そのような残基の１００％を保存すべきである。しかしながら、７５％を超える、またはわずか５０％の保存された残基のアラインメントも、等価残基（本明細書では「対応する残基」と呼ばれることもある）を定義するためには十分である。
「残基」は、本明細書で使用される場合、タンパク質中の位置、及びその関連アミノ酸同一性を意味する。例えば、アスパラギン２９７（Ａｓｎ２９７またはＮ２９７とも呼ばれる）は、ヒト抗体ＩｇＧ１中の２９７位の残基である。
等価残基はまた、三次構造がＸ線結晶学によって決定されているｓｃＦｖフラグメントについて、三次構造のレベルで相同性を決定することによって定義され得る。等価残基は、親または前駆体の特定のアミノ酸残基の２つ以上の主鎖原子（Ｎに対してＮ、ＣＡに対してＣＡ、Ｃに対してＣ、及びＯに対してＯ）の原子座標が、アラインメントを行った後で、０．１３ｎｍ、好ましくは０．１ｎｍ以内であるものとして定義される。ｓｃＦｖ変異体フラグメントの非水素タンパク質原子の原子座標の重複が最大となるように配向され位置決めされると、アラインメントが達成される。
「Ｆｖ」または「Ｆｖフラグメント」または「Ｆｖ領域」は、本明細書で使用される場合、単一抗体のＶＬ及びＶＨドメインを含むポリペプチドを意味する。当業者には理解されるように、これらは一般に、２つの鎖で構成されているか、または組み合わさって（一般に、本明細書で考察されるようなリンカーによって）、ｓｃＦｖを形成することができる。
本明細書における「単一鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」は、一般に本明細書で考察されるようなｓｃＦｖリンカーを使用して可変軽（ＶＬ）ドメインに共有結合し、ｓｃＦｖまたはｓｃＦｖドメインを形成する、可変重（ＶＨ）ドメインを意味する。ｓｃＦｖドメインは、Ｎ－末端からＣ－末端（ＶＨ－リンカー－ＶＬまたはＶＬ－リンカー－ＶＨ）のいずれかの配向にあり得る。
「可変領域」は、本明細書で使用される場合、カッパ、ラムダ、ならびに重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子座をそれぞれ構成する、Ｖκ、Ｖλ、ＶＬ、及び／またはＶＨ遺伝子のいずれかによって実質的にコードされる１つ以上のＩｇドメインを含む免疫グロブリンの領域を意味する。
本明細書で使用される場合、「不活性ＶＨ」及び「不活性ＶＬ」は、それらの同族のＶＬまたはＶＨパートナーと対になったときに、それぞれ、もし「不活性」ではない類似のＶＬまたはＶＨに結合したとしたら、「活性」ＶＨまたは「活性」ＶＬが結合する抗原に特異的に結合しない、結果として得られるＶＨ／ＶＬ対を形成する、ｓｃＦｖの成分を指す。例示的な「不活性ＶＨ」及び「不活性ＶＬ」ドメインは、野生型ＶＨまたはＶＬ配列の突然変異によって形成される。例示的な突然変異は、ＶＨまたはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３内にある。例示的な突然変異は、ＣＤＲ２内にドメインリンカーを配置することを含み、それによって「不活性ＶＨ」または「不活性ＶＬ」ドメインを形成する。対照的に、「活性ＶＨ」または「活性ＶＬ」は、その「活性」同族パートナー、すなわち、ＶＬまたはＶＨとそれぞれ対合すると、その標的抗原に特異的に結合することができるものである。
対照的に、本明細書で使用される場合、「活性な」という用語は、ＣＤ－３に特異的に結合することができるＣＤ－３結合ドメインを指す。この用語は２つの状況で使用される：（ａ）同族パートナーと対になり、ＣＤ－３に結合することができる配列のものである、ｓｃＦｖ結合対（すなわち、ＶＨまたはＶＬ）の単一メンバーを指す場合；（ｂ）ＣＤ－３に特異的に結合することができる配列の同族体（すなわち、ＶＨ及びＶＬ）の対。例示的な「活性」ＶＨ、ＶＬ、またはＶＨ／ＶＬ対は、野生型配列または親配列である。
「ＣＤ－ｘ」は、表面抗原分類（ＣＤ）タンパク質を指す。例示的な実施形態では、ＣＤ－ｘは、本発明のポリペプチド構築物が投与された対象におけるＴ細胞の動員または活性化における役割を有するＣＤタンパク質から選択される。例示的な実施形態において、ＣＤ－ｘはＣＤ３である。
「結合ドメイン」という用語は、本発明に関連して、標的分子（抗原）上の所与の標的エピトープまたは所与の標的部位に（特異的に）結合する／それと相互作用する／それを認識するドメイン、例えば、それぞれ、ＥＧＦＲ及びＣＤ－３を述べる。標的抗原結合ドメイン（ＥＧＦＲを認識する）の構造及び機能、好ましくはＣＤ－３結合ドメイン（ＣＤ３を認識する）の構造及び／または機能も、抗体、例えば、全長または全免疫グロブリン分子の構造及び／または機能に基づいている。本発明によれば、標的抗原結合ドメインは、３つの軽鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）及び／または３つの重鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）を特徴とする。ＣＤ－３結合ドメインは、少なくとも、標的結合を可能にする抗体の最低限の構造要件も含むことが好ましい。より好ましくは、ＣＤ－３結合ドメインは、少なくとも３つの軽鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）及び／または３つの重鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）を含む。例示的な実施形態において、標的抗原及び／またはＣＤ－３結合ドメインは、ファージディスプレイ法またはライブラリースクリーニング法によって産生されるか、または得ることが可能であると予測される。
「Ｆｃ」、「Ｆｃ領域」、「ＦＣポリペプチド」などは、本明細書で使用される場合、最初の定常領域免疫グロブリンドメインを除く抗体の定常領域を含むポリペプチドを含むと本明細書に定義される抗体を意味する。したがって、Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメインと、ＩｇＥ及びＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメインと、これらのドメインに対する可撓性ヒンジＮ－末端とを指す。ＩｇＡ及びＩｇＭについては、ＦｃはＪ鎖を含んでもよい。ＩｇＧの場合、Ｆｃは免疫グロブリンドメインＣγ２及びＣγ３、ならびにＣγ１とＣγ２との間のヒンジを含む。Ｆｃ領域の境界は異なり得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、そのカルボキシル末端に残基Ｃ２２６またはＰ２３０を含むと定義され、番号付けは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従う。Ｆｃは、孤立した本領域、または抗体、抗体フラグメント、もしくはＦｃ融合体との関連における本領域を指し得る。Ｆｃは、抗体、Ｆｃ融合体、またはＦｃを含むタンパク質もしくはタンパク質ドメインであってもよい。Ｆｃの天然に存在しない変異体であるＦｃ変異体が特に好ましい。
「ＩｇＧ」は、本明細書で使用される場合、認識された免疫グロブリンガンマ遺伝子によって実質的にコードされる抗体のクラスに属するポリペプチドを意味する。ヒトでは、このクラスは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含む。マウスでは、このクラスは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３を含む。本明細書における「免疫グロブリン（Ｉｇ）」とは、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされる１つ以上のポリペプチドからなるタンパク質を意味する。免疫グロブリンには、抗体が挙げられるが、これらに限定されない。免疫グロブリンは、全長抗体、抗体フラグメント、及び個々の免疫グロブリンドメインが挙げられるがこれらに限定されない、ある数の構造形態を有し得る。本明細書における「免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン」は、タンパク質構造の当業者によって確認されるような別個の構造実体として存在する免疫グロブリンの領域を意味する。Ｉｇドメインは、典型的には、特徴的なサンドイッチ折り畳みトポロジーを有する。抗体のＩｇＧクラスにおける既知のＩｇドメインは、ＶＨ、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、ＶＬ、及びＣＬである。
本明細書における「野生型またはＷＴ」は、対立遺伝子変異を含む、自然界に見出されるアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を意味する。ＷＴタンパク質は、意図的に修飾されていないアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を有する。
「変異体ポリペプチド」は、本明細書で使用される場合、少なくとも１つのアミノ酸修飾により親ポリペプチド配列のものとは異なるポリペプチド配列を意味する。修飾には、置換、欠失、及び付加が含まれ得る。変異体ポリペプチドは、ポリペプチド自体、ポリペプチドを含む組成物、またはそれをコードするアミノ配列を指してもよい。好ましくは、変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドと比較して少なくとも１つのアミノ酸修飾、例えば、親と比較して約１～約１０のアミノ酸修飾、好ましくは約１～約５のアミノ酸修飾を有する。本明細書の変異体ポリペプチド配列は、好ましくは、親ポリペプチド配列と少なくとも約８０％の相同性、最も好ましくは少なくとも約９０％の相同性、より好ましくは少なくとも約９５％の相同性を有することになる。したがって、「Ｆｃ変異体」は、本明細書で使用される場合、少なくとも１つのアミノ酸修飾によって親Ｆｃ配列のＦｃ配列とは異なるＦｃ配列を意味する。同様に、例示的な「不活性ＶＬドメイン」または「不活性ＶＨドメイン」は、親ＶＬまたはＶＨポリペプチドの変異体である。
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチド構築物は、「単離された」または「実質的に純粋な」ポリペプチド構築物である。「単離された」または「実質的に純粋な」は、本明細書に開示されるポリペプチド構築物を説明するために使用される場合、その産生環境の成分から、識別、分離、及び／または回収されたポリペプチド構築物を意味する。好ましくは、ポリペプチド構築物は、その産生環境からの他の全ての成分との関連を有しないか、または実質的に有しない。産生環境の汚染成分、例えば、組換えのトランスフェクトされた細胞から生じるものなどは、ポリペプチドの診断的または治療的使用を典型的に妨げ得る物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含み得る。産生培地中の所望のポリペプチド構築物は、培地中の全ポリペプチドの少なくとも約５重量％、少なくとも約２５重量％、または少なくとも約５０重量％を構成し得る。
本発明の例示的な単離されたポリペプチド構築物は、物質を産生するために使用される成分を実質的にまたは本質的に含まない。本発明のペプチドコンジュゲートに関して、「単離された」という用語は、ペプチドコンジュゲートを調製するために使用される混合物中の物質に通常付随する成分を実質的にまたは本質的に含まない物質を指す。「単離された」及び「純粋な」は互換的に使用される。典型的には、本発明の単離されたポリペプチド構築物は、好ましくはある範囲として表されるレベルの純度を有する。ポリペプチド構築物の純度の範囲の下限は、約６０％、約７０％、または約８０％であり、純度の範囲の上限は、約７０％、約８０％、約９０％、または約９０％超である。
ポリペプチド構築物が約９０％超純粋である場合、それらの純度も好ましくはある範囲として表される。純度の範囲の下限は、約９０％、約９２％、約９４％、約９６％、または約９８％である。純度の範囲の上限は、約９２％、約９４％、約９６％、約９８％、または約１００％の純度である。
純度は、任意の当該技術分野で認められている分析方法（例えば、銀染色ゲル上のバンド強度、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ、または同様の手段）によって決定される。
本発明によれば、結合ドメインは、１つ以上のポリペプチドの形態である。かかるポリペプチドは、タンパク質性部分及び非タンパク質性部分（例えば、グルタルアルデヒドなどの化学的リンカーまたは化学的架橋剤）を含んでもよい。ポリペプチド（そのフラグメント、好ましくは生物学的に活性なフラグメント、及び通常３０個超のアミノ酸を有するペプチド）は、共有ペプチド結合（アミノ酸の鎖を生じる）を介して互いに結合した２つ以上のアミノ酸を含む。
結合ドメインとエピトープまたはエピトープを含む領域との間の相互作用は、結合ドメインが、エピトープ／特定のタンパク質または抗原（例えば、それぞれ、ＥＧＦＲ及びＣＤ３）上のエピトープを含む領域に対する認知可能な親和性を呈し、ＥＧＦＲまたはＣＤ３以外のタンパク質または抗原との顕著な反応性を呈しないことを示唆する。「認知可能な親和性」は、約１０－６Ｍ（ＫＤ）以上の親和性での結合を含む。好ましくは、結合は、結合親和性が、約１０－１２～１０－８ Ｍ、１０－１２～１０－９Ｍ、１０－１２～１０－１０Ｍ、１０－１１～１０－８Ｍ、好ましくは約１０－１１～１０－８Ｍであるときに、特異的であると見なされる。結合ドメインが標的と特異的に反応または結合するかどうかは、とりわけ、該結合ドメインと標的タンパク質または抗原との反応を、該結合ドメインとＥＧＦＲまたはＣＤ３以外のタンパク質または抗原との反応と比較することによって容易に試験することができる。好ましくは、本発明の結合ドメインは、ＥＧＦＲまたはＣＤ３以外のタンパク質または抗原に本質的にまたは実質的に特異的に結合しない（すなわち、第１の結合ドメインはＥＧＦＲ以外のタンパク質に特異的に結合せず、第２の結合ドメインはＣＤ３以外のタンパク質に特異的に結合しない）。
特異的結合は、結合ドメイン及び抗原のアミノ酸配列における特定のモチーフによって駆動されると考えられている。このため、それらの一次、二次、及び／または三次構造の結果、ならびに該構造の二次修飾の結果として結合が達成される。抗原相互作用部位とその特異的抗原との特異的相互作用により、該部位の抗原への単純な結合が生じ得る。さらに、抗原相互作用部位とその特異的抗原との特異的相互作用により、代替的または追加的に、例えば、抗原の立体構造の変化の誘導、抗原のオリゴマー化などに起因して、シグナルの始動が生じ得る。
「本質的に特異的に結合しない」、「実質的に特異的に結合しない」、または「特異的に結合することができない」という用語は、互換的に使用され、本発明の結合ドメインが、ＥＧＦＲまたはＣＤ３以外のタンパク質または抗原に結合しない、すなわち、ＥＧＦＲまたはＣＤ３以外のタンパク質または抗原との反応性が、３０％を超えない、好ましくは２０％を超えない、より好ましくは１０％を超えない、特に好ましくは９％、８％、７％、６％、または５％を超えないことを意味し、このため、ＥＧＦＲまたはＣＤ３への結合は、それぞれ、１００％に設定される。これらの用語は、ＶＨ／ＶＬｉまたはＶＬ／ＶＨｉ対の抗原結合特性に関しても使用される。
「二重特異性」という用語は、本明細書で使用される場合、「少なくとも二重特異性」である本発明のポリペプチド構築物（「Ｐｒｏ」または「Ｐｒｏｄｅｎｔ」）を指し、すなわち、これは、少なくとも第１の結合ドメイン（例えば、標的抗原、例えば、ＥＧＦＲ）と、第２の結合ドメイン（例えば、ＣＤ－３、例えば、ＣＤ３）とを含み、ここでは、第１の結合ドメインが一方の抗原または標的に結合し、第２の結合ドメインが別の抗原または標的に結合する。したがって、本発明によるポリペプチド構築物は、少なくとも２つの異なる抗原または標的に対する特異性を含む。本発明の「二重特異性ポリペプチド構築物」という用語はまた、多重特異的ポリペプチド、例えば、三重特異的ポリペプチド構築物（後者は３つの結合ドメインを含む）、または３つ超（例えば、４つ、５つなど）の特性を有する構築物を包含する。
本発明によるポリペプチド構築物が（少なくとも）二重特異性であるとすれば、それらは天然に存在せず、それらは天然に存在する産物とは顕著に異なる。よって、「二重特異性」ポリペプチド構築物は、異なる特異性を有する少なくとも２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッドポリペプチドである。二重特異性ポリペプチド構築物は、種々の方法によって産生されることができる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ＆Ｌａｃｈｍａｎｎ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５－３２１（１９９０）を参照されたい。
本発明のポリペプチド構築物の少なくとも２つの結合ドメイン及び可変ドメインは、ペプチドリンカー（スペーサーペプチド）を含む場合も含まない場合もある。「ペプチドリンカー」という用語は、本発明によれば、アミノ酸配列を含み、このアミノ酸配列によって、本発明の抗体構築物の一方の（可変及び／または結合）ドメイン及び別の（可変及び／または結合）ドメインのアミノ酸配列が互いに結合する。そのようなペプチドリンカーの本質的な技術的特徴は、いかなる重合活性も含まないことである。好適なペプチドリンカーの中には、米国特許第４，７５１，１８０号及び同第４，９３５，２３３号またはＷＯ８８／０９３４４に記載されているものがある。ペプチドリンカーはまた、他のドメインまたはモジュールまたは領域（半減期延長ドメインなど）を本発明の抗体構築物に結合させるために使用することができる。
リンカーが使用される実施形態では、このリンカーは、好ましくは、標的抗原及びＣＤ－３結合ドメインの各々が、互いに独立して、それらの異なる結合特異性を保持できることを確実にするために十分な長さ及び配列である。本発明の抗体構築物中の少なくとも２つの結合ドメイン（または２つの可変ドメイン）を接続するペプチドリンカーについては、最適化された数のアミノ酸残基、例えば、１２個以下のアミノ酸残基を含むペプチドリンカーが好ましい。このため、１２、１１、１０、９、８、７、６、または５アミノ酸残基のペプチドリンカーが有用である。５個未満のアミノ酸を有する想定されるペプチドリンカーは、４、３、２、または１個のアミノ酸（複数可）を含み、Ｇｌｙに富んだリンカーが好ましい。該「ペプチドリンカー」の文脈において特に好ましい「単一の」アミノ酸はＧｌｙである。したがって、該ペプチドリンカーは単一のアミノ酸Ｇｌｙで構成されてもよい。ペプチドリンカーの別の好ましい実施形態は、アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ、すなわち、Ｇｌｙ４Ｓｅｒ（配列番号１）、またはそのポリマー、すなわち、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｘ（式中、ｘは１以上（例えば、２または３）の整数である）を特徴とする。二次構造の促進がないことを含む該ペプチドリンカーの特徴は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９８）３７，９２６６－９２７３）、Ｃｈｅａｄｌｅ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９２）２９，２１－３０）、及びＲａａｇ ａｎｄ Ｗｈｉｔｌｏｗ（ＦＡＳＥＢ（１９９５）９（１），７３－８０）に記載されている。さらにいずれの二次構造も促進しないペプチドリンカーも有用である。該ドメインの相互への結合は、実施例に記載のように、例えば遺伝子操作によって提供することができる。融合し動作可能に結合した二重特異性単一鎖構築物を調製し、哺乳動物細胞または細菌においてそれらを発現させる方法は、当該技術分野において周知である（例えば、ＷＯ９９／５４４４０、またはＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，２００１）。
本発明の例示的な実施形態は、天然には存在しないが、ｓｃＦｖリンカーによって共に結合した可変重鎖ドメインと可変軽鎖ドメインとを一般に含む、少なくとも１つのｓｃＦｖドメインを含む。本明細書に概説されるように、ｓｃＦｖドメインは、一般に、ＶＨ－ｓｃＦｖリンカー－ＶＬとして配向されたＮ末端からＣ末端にあるが、これは、ｓｃＦｖドメイン（または、Ｆａｂ由来のＶＨ及びＶＬ配列を使用して構築されたドメイン）のいずれに関しても、フォーマットに応じて一方または両方の端部に任意のリンカーを用いて、ＶＬ－ｓｃＦｖリンカー－ＶＨへと逆転させることができる。一般に、ＶＬまたはＶＨの一方は「不活性」である。
本明細書に示されるように、組換え技術によって生成される従来のペプチド結合を含めて、使用され得る好適なｓｃＦｖリンカーは、ある数存在する。リンカーペプチドは、主に、以下のアミノ酸残基：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、またはＴｈｒを含み得る。リンカーペプチドは、それらが所望の活性を保持するように互いに対して正しい立体配座をとるような方法で２つの分子を結合させるのに十分な長さを有するべきである。一実施形態では、リンカーは、長さが約１～５０アミノ酸、好ましくは長さが約１～３０アミノ酸である。一実施形態では、長さが１～２０アミノ酸のリンカーが使用されてもよく、いくつかの実施形態では約５～約１０アミノ酸が使用を見出す。有用なリンカーには、例えば、ｎが少なくとも１（及び一般に３～４）の整数である、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、及び（ＧＧＧＳ）ｎを含むグリシン－セリンポリマー、グリシン－アラニンポリマー、アラニン－セリンポリマー、ならびに他の可撓性リンカーが挙げられる。あるいは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマーを含むが、これらに限定されない様々な非タンパク質性ポリマーが、リンカーとしての用途を見出し得る。
他のリンカー配列は、任意の長さのＣＬ／ＣＨ１ドメインの任意の配列を含むが、ＣＬ／ＣＨ１ドメインの全ての残基を含まない場合がある。例えば、ＣＬ／ＣＨ１ドメインの最初の５～１２アミノ酸残基である。リンカーは、免疫グロブリン軽鎖、例えば、ＣκまたはＣλに由来し得る。リンカーは、例えば、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４、Ｃα１、Ｃα２、Ｃδ、Ｃε、及びＣμを含む任意のアイソタイプの免疫グロブリン重鎖に由来し得る。リンカー配列はまた、Ｉｇ様タンパク質（例えば、ＴＣＲ、ＦｃＲ、ＫＩＲ）、ヒンジ領域由来配列、及び他のタンパク質由来の他の天然配列などの他のタンパク質に由来してもよい。
いくつかの実施形態では、リンカーは、本明細書に概説される任意の２つのドメインを共に結合するために使用される「ドメインリンカー」である。任意の好適なリンカーを使用することができるが、多くの実施形態は、例えば、ｎが少なくとも１（及び一般に３～４～５）である、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、及び（ＧＧＧＳ）ｎを含むグリシン－セリンポリマー、ならびに各ドメインがその生物学的機能を保持できるように十分な長さ及び柔軟性を有する２つのドメインの組換え結合を可能にする任意のペプチド配列を利用する。いくつかの場合において、以下に概説するように、「鎖結合（ｓｔｒａｎｄｅｄｎｅｓｓ）」に注意を払って、ｓｃＦｖリンカーのいくつかの実施形態において使用されるような荷電ドメインリンカーを使用することができる。例示的なドメインリンカーは、切断不可能なリンカーであり、これは、ポリペプチド構築物が、ポリペプチド構築物のインビボ半減期の間、例えば生理学的に関連するｐＨ及び温度で利用される条件下では、実質的に切断されない。ドメインリンカーは、そのフレームワーク内に１つ以上の切断可能な部分を含むことができる。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖリンカーまたはドメインは、荷電したｓｃＦｖリンカーまたはドメインリンカーである。
本明細書における「コンピュータースクリーニング法」は、構築物の成分（例えば、ＶＨ、ＶＬ）における突然変異を含む、１つ以上の本発明のポリペプチド構築物を設計するための任意の方法を意味し、該方法は、コンピューターを利用して、可能性のあるアミノ酸側鎖置換の相互との及び／またはタンパク質の残りとの相互作用のエネルギーを評価する。当業者には理解されるように、エネルギー計算と呼ばれるエネルギーの評価は、１つ以上のアミノ酸修飾を採点する何らかの方法を指す。該方法は、物理的または化学的エネルギー項を伴ってもよく、あるいは知識、統計、配列を基にしたエネルギー項などを伴ってもよい。コンピュータースクリーニング法を構成する計算は、本明細書では「コンピュータースクリーニング計算」と呼ばれる。
実施形態
ポリペプチド構築物
好ましい実施形態によれば、また添付の実施例に記載されているように、本発明の例示的なポリペプチド構築物は、「二重特異性単一鎖ポリペプチド構築物」、より好ましくは、少なくとも１つの標的抗原結合ドメインを含み、任意選択で少なくとも１つの半減期延長ドメインにさらに結合する「単一鎖Ｆｖ」（ｓｃＦｖ）である。Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、ＶＬ及びＶＨは、別々の遺伝子によってコードされているが、これらは、組換え方法を用いて、ＶＬ及びＶＨ領域が対合して不活性ＶＬ／ＶＨ対を形成する単一タンパク質鎖としてこれらを作製することを可能にする、上記のような合成リンカーによって接合され得る（例えば、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３を参照のこと）。これらのポリペプチドフラグメントは、当業者に既知の従来の技法を用いて得られ、それらのフラグメントは全抗体または全長抗体と同じ方様式で機能について評価される。よって、単一鎖可変断片（ｓｃＦｖ）は、免疫グロブリンの重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）の融合タンパク質であり、これは、通常、約１０～約２５アミノ酸、好ましくは約１５～２０アミノ酸の短いリンカーペプチドで接続される。リンカーは、通常、柔軟性のためにグリシン、ならびに可溶性のためにセリンまたはトレオニンが豊富であり、ＶＨのＮ－末端をＶＬのＣ－末端に接続するか、またはその逆を行うことができる。「不活性」とされないポリペプチドの部分は、定常領域の除去及びリンカーの導入にもかかわらず、元の免疫グロブリンの特異性を実質的に保持する。
このため、例示的な実施形態では、本発明は、ＣＤ－３抗原に向けられた単一鎖ｓｃＦｖポリペプチドを提供する。ｓｃＦｖポリペプチドは、第１のリンカー部分（例えば、ｓｃＦｖリンカー）を介して接合した第１のＶＨドメインと第１のＶＬドメインとを含む、第１のｓｃＦｖドメインを含む。第１のリンカー部分は、任意選択で、第１のＶＨドメインと第１のＶＬドメインとの間に第１のプロテアーゼ切断部位を含む。第１のＶＨドメイン及び第１のＶＬドメインは、相互作用して第１のＶＨ／ＶＬ対を形成する。ポリペプチドにそのＣＤ－３標的と条件的に結合する能力を与えるために、第１のＶＨドメイン及び第１のＶＬドメインの一方は、その用語が本明細書で定義されるように、不活性である（すなわち、ＶＨｉまたはＶＬｉ）。したがって、例示的な第１のｓｃＦｖドメインは、ＣＤ－３抗原に特異的に結合しない。プロテアーゼ切断部位での第１のｓｃＦｖリンカーのプロテアーゼ切断に際して、不活性ＶＨドメインまたは不活性ＶＬドメインは、その活性ＶＬ結合パートナーまたは活性ＶＨ結合パートナーから分離し、その後、その活性同族体と対合することで、適当に対合した抗ＣＤ－３ドメインの形成、及びＣＤ－３抗原への結合が可能となる。例示的な実施形態では、２つの活性同族体は同じポリペプチド鎖上にある。種々の実施形態において、２つの活性同族体は別個のポリペプチド鎖上にあり、これらが一緒になって細胞表面上で相互作用して、ＣＤ－３に特異的に結合する活性ＣＤ－３結合ドメインを形成する。
第１のｓｃＦｖポリペプチドは、任意選択で第２のプロテアーゼ切断部位を含む第１のドメインリンカー部分を介して第２のｓｃＦｖドメインに接合される。第２のｓｃＦｖドメインは、第２のｓｃＦｖリンカー部分を介して接合された第２のＶＨドメイン及び第２のＶＬドメインを含む。第２のｓｃＦｖリンカー部分は、第２のＶＨドメインと第２のＶＬドメインとの間の第３のプロテアーゼ切断部位を含む。第２のＶＨドメイン及び第２のＶＬドメインは、相互作用して、第２のＶＨ／ＶＬ対を形成する。上記の第１のＶＨ／ＶＬ対と同様に、該第２のＶＨドメイン及び該第２のＶＬのうちの一方は不活性であり、その結果、該第２のｓｃＦｖドメインはＣＤ－３抗原に特異的に結合しなくなる。第１のｓｃＦｖドメインは、第２のドメインリンカーを介して第１の標的抗原結合ドメインに接合される。この第２のドメインリンカーは、第１のＶＨドメイン及び該第１のＶＬドメインから選択されたメンバーを第１の標的抗原結合ドメインに接合する。第２のｓｃＦｖドメインは、第３のドメインリンカーを介して第２の標的抗原結合ドメインに接合される。この第３のドメインリンカーは、第２のＶＨドメイン及び第２のＶＬドメインから選択されたメンバーを第２の標的抗原結合ドメインに接合する。
例示的な実施形態において、本発明は、ＣＤ－３抗原に向けられた単一鎖ｓｃＦｖポリペプチドを提供する。ｓｃＦｖポリペプチドは、第１のｓｃＦｖリンカー部分を通じて接合された第１のＶＨドメイン及び第１のＶＬドメインを含む、第１のｓｃＦｖドメインを含む。第１のｓｃＦｖリンカー部分は、第１のＶＨドメインと該第１のＶＬドメインとの間の第１のプロテアーゼ切断部位を含む。上記のように、第１のＶＨドメイン及び第１のＶＬドメインは、相互作用して第１のＶＨ／ＶＬ対を形成し、これにおいて、第１のＶＨドメイン及び第１のＶＬドメインのうちの一方は、不活性な第１のＶＨドメインまたは不活性な第１のＶＬドメインである。このため、第１のｓｃＦｖドメインはＣＤ－３抗原に特異的に結合しない。第１のｓｃＦｖポリペプチドは、第２のプロテアーゼ切断部位を任意選択で含む第１のドメインリンカー部分を通じて接合され、第２のＶＨドメインと第２のＶＬドメインとの間の第３のプロテアーゼ切断部位を含む第２のｓｃＦｖリンカー部分を介して接合される第２のＶＨドメイン及び第２のＶＬドメインを含む第２のｓｃＦｖドメインに接合される。第２のＶＨドメイン及び該第２のＶＬドメインは、相互作用して、第２のＶＨ／ＶＬ対を形成する。上記のように、第２のＶＨドメイン及び第２のＶＬのうちの一方は、不活性な第２のＶＨドメインまたは不活性な第２のＶＬドメインであり、第２のｓｃＦｖドメインは、ＣＤ－３抗原に特異的に結合しない。
このポリペプチドの第１のｓｃＦｖドメインは、第２ドメインリンカーを介して第１標的抗原結合ドメインに接合され、該第２ドメインリンカーは、第１のＶＨドメイン及び第１のＶＬドメインから選択されたメンバーを第１標的抗原結合ドメインに接合する。第２のｓｃＦｖドメインは、第３のドメインリンカーを介して第２の標的抗原結合ドメインに接合される。第３のドメインリンカーは、第２のＶＨドメイン及び第２のＶＬドメインから選択されたメンバーを第２の標的抗原結合ドメインに接合する。単一鎖ｓｃＦｖを、第１のｓｃＦｖリンカー部分の第１のプロテアーゼ切断部位を切断することができる第１のプロテアーゼと接触させると、不活性な第１のＶＨドメインまたは不活性な第１のＶＬドメインが単一鎖ｓｃＦｖポリペプチドから分離される。同様に、ポリペプチドが第２のｓｃＦｖリンカー部分の第２のプロテアーゼ切断部位を切断することができる第２のプロテアーゼと接触すると、不活性な第２のＶＨドメインまたは不活性な第２のＶＬドメインが単一鎖ｓｃＦｖポリペプチドから分離される。ポリペプチドの活性ドメインから不活性ドメインを切断することにより、ＣＤ－３抗原に特異的に結合することができる活性単一鎖Ｆｖが形成される。
例示的な実施形態において、本発明は、ＣＤ－３抗原に向けられた単一鎖ｓｃＦｖポリペプチドを提供する。ｓｃＦｖポリペプチドは、第１のｓｃＦｖリンカー部分を通じて接合された第１のＶＨドメイン及び第１のＶＬドメインを含む、第１のｓｃＦｖドメインを含む。この第１のリンカー部分は、第１のＶＨドメインと第１のＶＬドメインとの間の第１のプロテアーゼ切断部位を含む。第１のＶＨドメイン及び該第１のＶＬドメインは、相互作用して第１のＶＨドメイン及び第１のＶＬドメインの一方が不活性である第１のＶＨ／ＶＬ対を形成し、これにおいて、第１のＶＨドメイン及び第１のＶＬドメインのうちの一方は不活性である。したがって、第１のｓｃＦｖドメインはＣＤ－３抗原に特異的に結合しない。第１のｓｃＦｖポリペプチドは、任意選択で第２のプロテアーゼ切断部位を含む第１のドメインリンカー部分を介して第１の標的抗原結合ドメインに接合される。第１のドメインリンカーは、第１のＶＨドメイン及び第１のＶＬドメインから選択されるメンバーを、第１の標的抗原結合ドメインに接合する。
例示的な実施形態では、上記のようなｓｃＦｖ構築物の対が提供される。構築物の対は、それらの対合したＣＤ－３結合ドメインを通じて、ＣＤ－３抗原に協働的に結合する。対の個々のｓｃＦｖ分子の対合したＣＤ－３部位のＣＤ－３抗原への結合は、対の各メンバーの標的抗原結合ドメインのその同族抗原への結合により、促進、増強、及び／または駆動される。
ポリペプチド構築物は、１つ以上の標的抗原、及びＣＤ３、ならびに任意選択でＨＳＡ結合ドメインなどの半減期延長ドメインに特異的に結合することができる。ＣＤ３への結合は、プロテアーゼによって活性化され、標的抗原（複数可）に結合した後でのみ可能である。いくつかの実施形態では、標的抗原結合ドメインが標的抗原に結合する前に、プロテアーゼ切断ドメインのプロテアーゼ切断が生じることを理解されたい。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ切断ドメインのプロテアーゼ切断は、標的抗原結合ドメインが標的抗原に結合した後に生じることも理解されたい。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖポリペプチドは、２つ以上のプロテアーゼ切断ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＣＤ３結合ドメインは、ヒトＣＤ３に特異的な単一鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）に由来するポリペプチドを含む。例示的な実施形態では、このＣＤ３結合ドメインは、プロテアーゼ切断ドメインが存在するリンカーによって連結されたＶＬ部分とＶＨ部分とを含む。このＣＤ３結合ドメインにおいて、ＶＬまたはＶＨのいずれかが、既知の技法、例えば、ＶＬまたはＶＨにおける１つ以上の部位での突然変異、ＣＤＲの欠失などにより、不活性化される（すなわち、本質的にＣＤ３に特異的に結合することができなくなる）。この突然変異したＶＬまたはＶＨは、対合することができ、対応するＶＨまたはＶＬとそれぞれ対合し、これは、突然変異した配列との対合（またはその適当な同族配列との対合）がない場合、本質的にＣＤ３に選択的に結合することができる。不活性ＶＬまたはＶＨを対応するＣＤ３結合ＶＨまたはＶＬと対合させることで、パートナーがリンカー中のプロテアーゼ切断ドメインのプロテアーゼ切断によって分離されるまで、ＣＤ３結合ＶＨまたはＶＬが不活性となる。プロテアーゼ切断ドメインの切断時に、活性ＣＤ３結合種及びその不活性パートナーは「不対」であり、それにより、その活性相補的ＣＤ－３結合ドメインと対合したときに、ＣＤ３結合ドメインがＣＤ３に本質的に特異的に結合することが可能となる。種々の実施形態において、不活性パートナーは、ＣＤ３結合ＶＬまたはＶＨにおける１つ以上のアミノ酸の突然変異のために不活性にされ、この突然変異は、パートナーがＣＤ３に特異的に結合する能力を実質的に破壊すると同時に、突然変異した種がＣＤ３結合ドメインと対合する能力を残し、それにより、パートナーがプロテアーゼ切断ドメインの切断によって分離されるまで、ＣＤ３結合ドメインのＣＤ３結合特性を実質的に不活性化する。
以下の実施例に示すように、発明者らは、本発明のポリペプチド構築物の活性及び有効性が、種々のドメインの配向にほとんど依存しないことを発見した。したがって、Ｎ末端からＣ末端へと読むと、ＶＬはＶＨｉの上流にあり得、あるいはその逆も同様であり得る。さらに、ＶＬｉはＶＨの上流にあってもよく、あるいはその逆も同様であり得る。半減期延長ドメインは、不活性ＣＤ－３結合ドメインのうちの１つにまたは標的抗原結合ドメインに接合することができる。例示的な実施形態において、半減期延長ドメインは、ｓｃＦｖリンカーの切断時に活性ポリペプチドから分離するポリペプチド構築物の成分に接合される。したがって、例えば、半減期延長領域はＶＬｉまたはＶＨｉに接合される。
いくつかの実施形態では、１つ以上の半減期延長ドメインは、ヒト血清アルブミンに対する結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の半減期延長ドメインは、ｓｃＦｖ、可変重鎖ドメイン（ＶＨ）、可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）、ナノボディ、ペプチド、リガンド、または小分子を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の半減期延長ドメインはｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の半減期延長ドメインはＦｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、半減期延長ドメインは、プロテアーゼ切断前のポリペプチドのＮ末端にある。いくつかの実施形態では、半減期延長ドメインは、プロテアーゼ切断前のポリペプチドのＣ末端にある。いくつかの実施形態では、半減期延長ドメインは、プロテアーゼ切断前のポリペプチドのＣ末端にもＮ末端にもない。
半減期延長領域により、適当な薬物動態パラメータを達成するため、ポリペプチド構築物のサイズを本質的にいかなる望ましいサイズにも調節することが可能となる。したがって、本明細書に記載されるポリペプチド構築物は、いくつかの実施形態では、約５０ｋＤ～約１５０ｋＤ、５０ｋＤ～約１００ｋＤ、５０ｋＤ～約８０ｋＤ、約５０ｋＤ～約７５ｋＤ、約５０ｋＤ～約７０ｋＤ、または約５０ｋＤ～約６５ｋＤのサイズを有する。このため、抗原結合ポリペプチドのサイズは、約１５０ｋＤであるＩｇＧ抗体、及び約５５ｋＤであるが、半減期延長されていないため腎臓を通して迅速に除去されるＢｉＴＥ及びＤＡＲＴダイアボディ分子よりも有利である。本明細書に記載される抗原結合ポリペプチドの別の特徴は、それらがそのドメインの柔軟な結合を有する単一ポリペプチド設計であることである。これにより、ポリペプチド構築物がベクターに容易に組み込まれる単一のｃＤＮＡ分子によってコードされ得るため、その容易な産生及び製造が可能となる。さらに、本明細書に記載される抗原結合ポリペプチドは単量体の単一ポリペプチド鎖であるため、鎖対合の問題または二量化の要件はない。本明細書中に記載される抗原結合ポリペプチドは、二重特異性ＢｉＴＥタンパク質などの他の報告されている分子とは異なり、凝集する傾向が低いことが企図される。
二重特異性単一鎖分子は当該分野で既知であり、ＷＯ９９／５４４４０，Ｍａｃｋ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９７），１５８，３９６５－３９７０，Ｍａｃｋ，ＰＮＡＳ，（１９９５），９２，７０２１－７０２５，Ｋｕｆｅｒ，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，（１９９７），４５，１９３－１９７，Ｌｏｆｆｌｅｒ，Ｂｌｏｏｄ，（２０００），９５，６，２０９８－２１０３，Ｂｒｕｈｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，（２００１），１６６，２４２０－２４２６，Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，（１９９９），２９３，４１－５６に記載されている。単一鎖抗体（とりわけ米国特許第４，９４６，７７８号を参照のこと）の産生のために記載された技術は、選択された標的（単数または複数）を特異的に認識する単一鎖ポリペプチド構築物を産生するように適合させることができる。
二価抗体に類似したより高い原子価のポリペプチドもまた、本発明の範囲内である。例えば、Ｔ細胞レセプター中の２つのＣＤ－３、例えば、３つの分子または２つのＣＤ３サブユニットに結合するポリペプチド構築物が、本発明に包含される。同様に、本発明のポリペプチド構築物は、２つ以上の標的抗原結合ドメインを含むことができる。したがって、本発明の構築物は、２つ以上の同一のまたは２つ以上の異なる抗ＥＧＦＲ結合ドメインを含み得る。そのような分子は、二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）（二価（ｄｉｖａｌｅｎｔ）とも呼ばれる）または二重特異性単一鎖可変フラグメント（フォーマット（ｓｃＦｖ）２を有するｂｉ－ｓｃＦｖまたはｄｉ－ｓｃＦｖ）に類似していると考えることができる。そのような構築物は、２つのｓｃＦｖ分子を結合させること（例えば、上記のようなリンカーを用いて）によって操作することができる。これらの２つのｓｃＦｖ分子が同じ結合特異性を有する場合、結果として得られる（ｓｃＦｖ）２分子は、一般に、「二価」（すなわち、それが同じ標的エピトープに対して２つの原子価を有する）として知られている。２つのｓｃＦｖ分子が異なる結合特異性を有する場合、結果として得られる（ｓｃＦｖ）２分子は、一般に、二重特異性であると称される。この結合は、２つのＶＨ領域及び２つのＶＬ領域を有する単一ペプチド鎖を生成し、タンデムｓｃＦｖを生じさせることによって行うことができる（例えば、Ｋｕｆｅｒ Ｐ．ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２２（５）：２３８－２４４を参照のこと）。
本明細書に記載される抗原結合ｓｃＦｖポリペプチドは、細胞傷害性Ｔ細胞を動員することによって標的抗原を発現する細胞の特異的標的化を可能にするように設計される。ＣＤ３結合ドメインは、ＶＨ及びＶＬｉまたはＶＨｉ及びＶＬのいずれかの間に位置するプロテアーゼ切断部位のプロテアーゼ切断によって活性化されるまで不活性のままであり、ここで「ｉ」は、ＶＨまたはＶＬのいずれかの親ポリペプチド配列の突然変異により不活性化されるサブユニットを示す。これにより、腫瘍細胞または癌細胞などの標的細胞によって発現される場合もされない場合もあるＣＤ３及び標的抗原に結合する二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー治療薬と比較して、特異性が改善する。対照的に、標的抗原及びプロテアーゼが高度に発現される標的細胞の微小環境において特異的にＣＤ３結合を活性化することにより、ポリペプチド構築物は、細胞傷害性Ｔ細胞と、標的抗原を発現する細胞とを高度に特異的な様式で架橋し、それによりＴ細胞の細胞傷害能力を標的細胞に向かわせる。本明細書に記載されるポリペプチド構築物は、Ｔ細胞受容体複合体の一部を形成する表面発現ＣＤ３に対するプロテアーゼ活性化結合を介して細胞傷害性Ｔ細胞を従事させる。いくつかのポリペプチド構築物をＣＤ３及び特定の細胞の表面上に発現される標的抗原に同時に結合させると、Ｔ細胞の活性化が引き起こされ、その後の特定の標的抗原発現細胞の溶解が媒介される。このため、ポリペプチド構築物は、強力で特異的かつ効率的な標的細胞死滅を示すことが企図される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチド構築物は、細胞傷害性Ｔ細胞による標的細胞殺滅を刺激して、プロテアーゼに富む微小環境（例えば、腫瘍細胞、ウイルスまたは細菌感染細胞、自己反応性Ｔ細胞など）における病原性細胞を排除する。そのような実施形態のうちのいくつかにおいて、細胞は選択的に排除され、それにより有毒な副作用の可能性が低減される。他の実施形態では、同じポリペプチドを使用して、治療効果のための内因性細胞、例えば、自己免疫疾患のＢリンパ球もしくはＴリンパ球、または幹細胞移植のための造血幹細胞（ＨＳＣ）の排除を強化し得る。罹患細胞または組織に関連することが知られているプロテアーゼには、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、アスパラギンペプチドリアーゼ、血清プロテアーゼ、カテプシン、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＫ、カテプシンＬ、カリクレイン、ｈＫ１、ｈＫ１０、ｈＫ１５、プラスミン、コラゲナーゼ、ＩＶ型コラゲナーゼ、ストロメリシン、第Ｘａ因子、キモトリプシン様プロテアーゼ、トリプシン様プロテアーゼ、エラスターゼ様プロテアーゼ、サブチリシン様プロテアーゼ、アクチニダイン、ブロメライン、カルパイン、カスパーゼ、カスパーゼ－３、Ｍｉｒ１－ＣＰ、パパイン、ＨＩＶ－１プロテアーゼ、ＨＳＶプロテアーゼ、ＣＭＶプロテアーゼ、キモシン、レニン、ペプシン、マトリプターゼ、レグマイン、プラスメプシン、ネペンテシン、メタロエキソペプチダーゼ、メタロエンドペプチターゼ、マトリックスメタロペプチターゼ（ＭＭＰ）、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１１、ＭＭＰ１４、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、エンテロキナーゼ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ、ｈＫ３）、インターロイキン－１β変換酵素、トロンビン、ＦＡＰ（ＦＡＰ－α）、ジペプチジルペプチダーゼ、メプリン、グランザイム、及びジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６）が挙げられる。
本明細書に記載される抗原結合ポリペプチドは、認識されたモノクローナル抗体及び他のより小さな二重特異性分子よりもさらに治療上の利点をもたらす。二重特異性分子は、病原性細胞に関連する細胞特異的マーカーを介して標的細胞に結合するように設計される。場合によっては、健常な細胞または組織が病原性細胞と同じマーカーを発現する場合、毒性が起こり得る。本発明の抗原結合ポリペプチド構築物の１つの利益は、ＣＤ－３への結合が、腫瘍細胞などの標的細胞によって発現されるプロテアーゼによる活性化、及び１つ以上の標的抗原、例えば、腫瘍抗原への抗原結合ドメインの結合に依存することである。ポリペプチド構築物は、１つ以上のプロテアーゼ切断部位によって分離されたＶＨ及びＶＬｉまたはＶＨｉ及びＶＬドメインを含む、不活性ＣＤ－３結合ドメインを含む。標的細胞のプロテアーゼに富む環境では、プロテアーゼ切断部位が切断され、ＶＨ及びＶＬｉまたはＶＨｉ及びＶＬが分離され、ＶＨ及びＶＬまたはＶＬ及びＶＨの相互作用が可能となり、１つ以上の標的抗原が結合されるときに、活性ＣＤ－３結合ドメインを形成し、構築物をＣＤ－３に結合させる。プロテアーゼ切断がない場合、ＣＤ－３結合ドメインは不活性であり、ＣＤ－３に結合することができない。
プロテアーゼ切断後に対になって活性な抗ＣＤ－３ ｓｃＦｖを形成する別々の分子であるポリペプチド構築物も提供される。このため、対の第１のメンバーであるポリペプチド構築物は、ＶＨ／ＶＬｉまたはＶＨｉ／ＶＬドメインを含み、ＶＬｉまたはＶＨｉは、対の第１のメンバーからプロテアーゼによって切断される。対応するＶＬｉまたはＶＨｉは、対の第２のメンバーから切断され、ＣＤ－３標的上の２つの別々の分子の対合によるＶＬ／ＶＨドメインの形成を可能にする。一態様では、これらの「ハーフプロ（ｈａｌｆ－Ｐｒｏ）」分子は、対を形成する２つの分子の容易な変化を可能にすること、ならびにこれらの実験から得られた情報の翻訳を対応する「フルプロ（ｆｕｌｌ－Ｐｒｏ）」ポリペプチド構築物の設計及び調製に変換することにより、「フルプロ」分子を操作するためのツールとして有用である。種々の実施形態において、「ハーフプロ」分子は、機能的抗ＣＤ－３ ＶＬ／ＶＨ対を形成するために、ＣＤ－３標的と標的抗原との両方に結合しなければならない。
したがって、鎖を第１のＣＤ－３結合領域と第２のＣＤ－３結合領域とに分離するプロテアーゼ切断ドメイン（Ｐ）を含む単一ポリペプチド鎖をタンパク質が含む、ポリペプチド構築物も、本明細書で提供され、ここでは、第１の領域は抗ＣＤ３ ＶＨ結合ドメイン（ＣＶＨ）及び標的抗原結合ドメイン（Ｔ１）を含み、第２の領域は抗ＣＤ３ ＶＬ結合ドメイン（ＣＶＬ）及び標的抗原結合ドメイン（Ｔ２）を含み、タンパク質は、第１の領域または第２の領域に半減期延長ドメイン（Ｈ）を任意選択で含み、Ｐのプロテアーゼ切断による活性化、ならびにＴ１及びＴ２による標的抗原の結合時に、第１の領域と第２の領域とが会合して、ＣＤ３に結合する完全な抗ＣＤ３ ＶＬ／ＶＨ結合ドメインを形成する。
本明細書において、特定の局面では、前記タンパク質を、前記鎖を第１及び第２の領域に分離するプロテアーゼ切断ドメイン（Ｐ）を含む単一ポリペプチド鎖を含むポリペプチド構築物を提供する。第１領域は、抗ＣＤ－３ ＶＬ結合ドメイン（ＣＶＬ）及び標的抗原結合ドメイン（Ｔ１）を含み、第２領域は、抗ＣＤ３ ＶＨ結合ドメイン（ＣＶＨ）及び標的抗原結合ドメイン（Ｔ２）；第１または第２の領域に半減期延長領域（Ｈ）を任意選択で含み、Ｐのプロテアーゼ切断による活性化及びＴ１及びＴ２による標的抗原の結合により、第１及び第２の領域が会合して、ＣＤ３に結合する完全な抗ＣＤ３ ＶＬ／ＶＨ結合ドメインを形成する。
ある特定の態様では、タンパク質が、第１の領域及び第２の領域を含む単一ポリペプチド鎖を含む、ポリペプチド構築物も、本明細書で提供され、ここでは、第１の領域は、抗ＣＤ３ ＶＨ結合ドメイン（ＣＶＨ）、ＣＶＨ及び標的抗原結合ドメイン（Ｔ１）と会合する不活性抗ＣＤ３ ＶＬ結合ドメイン（ＣＶＬｉ）を含み、第２の領域は、抗ＣＤ３ ＶＬ結合ドメイン（ＣＶＬ）、ＣＶＬ及び標的抗原結合ドメイン（Ｔ２）と会合する不活性抗ＣＤ３ ＶＨ結合ドメイン（ＣＶＨｉ）を含み、タンパク質は、第１の領域及び／または第２の領域に半減期延長ドメイン（Ｈ）を任意選択で含み、ＣＶＬｉ及びＣＶＨｉは、各々、少なくとも１つのプロテアーゼ切断ドメインを含み、プロテアーゼ切断ドメインのプロテアーゼ切断による活性化、ならびにＴ１及びＴ２による標的抗原の結合時に、第１の領域と第２の領域とが会合して、ＣＤ３に結合する完全な抗ＣＤ３ ＶＬ／ＶＨ結合ドメインを形成する。
ある特定の態様では、タンパク質が、第１の領域及び第２の領域を含む単一ポリペプチド鎖を含む、ポリペプチド構築物も、本明細書で提供され、ここでは、第１の領域は、抗ＣＤ３ ＶＬ結合ドメイン（ＣＶＬ）、ＣＶＬ及び標的抗原結合ドメイン（Ｔ１）と会合する不活性抗ＣＤ３ ＶＨ結合ドメイン（ＣＶＨｉ）を含み、第２の領域は、抗ＣＤ３ ＶＨ結合ドメイン（ＣＶＨ）、ＣＶＨ及び標的抗原結合ドメイン（Ｔ２）と会合する不活性抗ＣＤ３ ＶＬ結合ドメイン（ＣＶＬｉ）を含み、タンパク質は、第１の領域及び／または第２の領域に半減期延長ドメイン（Ｈ）を任意選択で含み、ＣＶＬｉ及びＣＶＨｉは、各々、少なくとも１つのプロテアーゼ切断ドメインを含み、プロテアーゼ切断ドメインのプロテアーゼ切断による活性化、ならびにＴ１及びＴ２による標的抗原の結合時に、第１の領域と第２の領域とが会合して、ＣＤ３に結合する完全な抗ＣＤ３ ＶＬ／ＶＨ結合ドメインを形成する。
一態様では、予め活性化された形態の抗原結合タンパク質は、少なくとも１つの抗ＣＤ３結合ドメインを含む第１のドメインと、少なくとも１つの抗標的結合ドメインを含む第２の領域とを含む単一ポリペプチド鎖を含む。第１の領域及び第２の領域は、ポリペプチドリンカーによって分離され、このポリペプチドリンカーは、その配列中に１つ以上の切断可能な部分、例えば、少なくとも１つのプロテアーゼ切断ドメイン（Ｐ）を任意選択で含む。例示的な実施形態では、第１の領域は、抗ＣＤ３ ＶＨ結合ドメイン（ＣＶＨ）及び標的抗原結合ドメイン（Ｔ１）を含む。一実施形態では、第２の領域は、抗ＣＤ３ ＶＬ結合ドメイン（ＣＶＬ）及び標的抗原結合ドメイン（Ｔ２）を含む。一実施形態では、抗原結合ドメインは、第１の領域に半減期延長ドメイン（Ｈ）を任意選択で含む。一実施形態では、抗原結合ドメインは、第２の領域に半減期延長ドメイン（Ｈ）を任意選択で含む。プロテアーゼ切断ドメイン（Ｐ）、ならびに標的抗原に結合する標的抗原結合ドメインＴ１及びＴ２を切断するプロテアーゼによって活性化されると、抗ＣＤ３結合ドメインＣＶＨ及びＣＶＬが活性化されて、Ｔ細胞上のＣＤ３に結合する。抗原結合タンパク質中のドメインは、予め活性化されたポリペプチドの中心にプロテアーゼ切断ドメイン（Ｐ）を有して、各領域内で任意の順序で配置されることが企図される。さらに、各領域は、予め活性化されたポリペプチド内でいずれの順序であってもよい。このため、ほんの一例として、ポリペプチド構築物の例示的なドメイン順序には、以下が含まれるが、これらに限定されない：
ａ）ＣＶＨ－Ｔ１－Ｐ－Ｔ２－ＣＶＬ、
ｂ）Ｔ１－ＣＶＨ－Ｐ－Ｔ２－ＣＶＬ、
ｃ）ＣＶＨ－Ｔ１－Ｐ－ＣＶＬ－Ｔ２、
ｄ）Ｔ１－ＣＶＨ－Ｐ－ＣＶＬ－Ｔ２、
ｅ）Ｈ－ＣＶＨ－Ｔ１－Ｐ－Ｔ２－ＣＶＬ、
ｆ）ＣＶＨ－Ｈ－Ｔ１－Ｐ－Ｔ２－ＣＶＬ、
ｇ）ＣＶＨ－Ｔ１－Ｈ－Ｐ－Ｔ２－ＣＶＬ、
ｈ）ＣＶＨ－Ｔ１－Ｐ－Ｈ－Ｔ２－ＣＶＬ、
ｉ）ＣＶＨ－Ｔ１－Ｐ－Ｔ２－Ｈ－ＣＶＬ、
ｊ）ＣＶＨ－Ｔ１－Ｐ－Ｔ２－ＣＶＬ－Ｈ、
ｋ）Ｈ－Ｔ１－ＣＶＨ－Ｐ－Ｔ２－ＣＶＬ、
ｌ）Ｔ１－Ｈ－ＣＶＨ－Ｐ－Ｔ２－ＣＶＬ、
ｍ）Ｔ１－ＣＶＨ－Ｈ－Ｐ－Ｔ２－ＣＶＬ、
ｎ）Ｔ１－ＣＶＨ－Ｐ－Ｈ－Ｔ２－ＣＶＬ、
ｏ）Ｔ１－ＣＶＨ－Ｐ－Ｔ２－Ｈ－ＣＶＬ、
ｐ）Ｔ１－ＣＶＨ－Ｐ－Ｔ２－ＣＶＬ－Ｈ、
ｑ）Ｈ－ＣＶＨ－Ｔ１－Ｐ－ＣＶＬ－Ｔ２、
ｒ）ＣＶＨ－Ｈ－Ｔ１－Ｐ－ＣＶＬ－Ｔ２、
ｓ）ＣＶＨ－Ｔ１－Ｈ－Ｐ－ＣＶＬ－Ｔ２、
ｔ）ＣＶＨ－Ｔ１－Ｐ－Ｈ－ＣＶＬ－Ｔ２、
ｕ）ＣＶＨ－Ｔ１－Ｐ－ＣＶＬ－Ｈ－Ｔ２、
ｖ）ＣＶＨ－Ｔ１－Ｐ－ＣＶＬ－Ｔ２－Ｈ、
ｗ）Ｈ－Ｔ１－ＣＶＨ－Ｐ－ＣＶＬ－Ｔ２、
ｘ）Ｔ１－Ｈ－ＣＶＨ－Ｐ－ＣＶＬ－Ｔ２、
ｙ）Ｔ１－ＣＶＨ－Ｈ－Ｐ－ＣＶＬ－Ｔ２、
ｚ）Ｔ１－ＣＶＨ－Ｐ－Ｈ－ＣＶＬ－Ｔ２、
ａａ）Ｔ１－ＣＶＨ－Ｐ－ＣＶＬ－Ｈ－Ｔ２、及び
ｂｂ）Ｔ１－ＣＶＨ－Ｐ－ＣＶＬ－Ｔ２－Ｈ。
当業者には理解されるように、上記のａ－ｂｂの各々において、ＣＶＨ及びＣＶＬの一方は、不活性、すなわち、ＣＶＨｉまたはＣＶＬｉである。ａ－ｂｂにおける個々の成分の順序は、「ハーフプロ」分子及び「フルプロ」分子の両方に関連する。「フルプロ」分子については、「Ｔ」及び他の部分の数は、本発明の有用なポリペプチド構築物を形成するために所望されるように変化させることができる。一般に、ＨがＣＶＬまたはＣＶＨの不活性バージョンに結合されていることが好ましい。図５３に例示されているように、本発明のポリペプチド構築物の成分は、ある範囲の順序で、種々の特性のリンカーがそれらの間に離間して、結合され得る。
種々の実施形態において、本発明は、プロドラッグであるポリペプチド構築物（またはそのようなポリペプチドの発現を指令する核酸ベクター）を提供する。このため、以下を含むプロドラッグ組成物が提供される：ｉ）第１のｓｃＦｖドメインがＣＤ－３に特異的に結合しないように、第１のプロテアーゼ切断部位を含む第１のｓｃＦｖリンカー部分を通して接合される第１のＶＨドメイン及び第１のＶＬドメインを含む第１のｓｃＦｖドメインを含むＣＤ－３結合ドメインをコードする第１のポリペプチド配列；ｉｉ）第２のｓｃＦｖドメインが腫瘍抗原に特異的に結合しないように、第２のプロテアーゼ切断部位を含む第２のｓｃＦｖリンカー部分を通して接合される第２のＶＨドメイン及び第２のＶＬドメインを含む第２のｓｃＦｖドメインを含む腫瘍抗原結合ドメインをコードする第２のポリペプチド配列；ならびにｉｉｉ）任意選択で少なくとも１つの半減期延長ドメイン。
例示的な実施形態では、プロドラッグ組成物において、第１のポリペプチド配列及び第２のポリペプチド配列は、プロテアーゼ切断部位を任意選択で含む第１のドメインリンカー部分によって動作可能に結合される。
種々の実施形態において、以下を含むプロドラッグが提供される：ｉ）第１のポリペプチド配列であって、ａ）第１のＣＤ－３結合ドメインであって、第１のプロテアーゼ切断部位を含む第１のｓｃＦｖリンカー部分を通して接合される第１のＶＨドメイン及び第１のＶＬドメインを含む第１のｓｃＦｖドメインを含み、該第１のｓｃＦｖドメインがＣＤ－３に特異的に結合しない、第１のＣＤ－３結合ドメインと、ｂ）第１の腫瘍抗原結合ドメインと、を含む、第１のポリペプチド配列；ｉｉ）第２のポリペプチド配列であって、ａ）第２のＣＤ－３結合ドメインであって、第２のプロテアーゼ切断部位を含む第２のｓｃＦｖリンカー部分を通して接合される第２のＶＨドメイン及び第２のＶＬドメインを含む第２のｓｃＦｖドメインを含み、該第２のｓｃＦｖドメインがＣＤ－３に特異的に結合しない、第２のＣＤ－３結合ドメインと、ｂ）第２の腫瘍抗原結合ドメインと、を含む、第２のポリペプチド配列；ならびにｉｉｉ）任意選択で少なくとも１つの半減期延長ドメイン。例示的な実施形態では、第１のＶＨドメイン及び第２のＶＬドメインは、ＣＤ－３及び／または第２のＶＨドメインに特異的に結合し、第１のＶＬドメインはＣＤ－３に特異的に結合する。
プロドラッグ組成物において、第１の腫瘍抗原結合ドメイン及び第２の腫瘍抗原結合ドメインは、同じ腫瘍抗原に結合する。種々の実施形態では、第１の腫瘍抗原結合ドメイン及び第２の腫瘍抗原結合ドメインは、異なる腫瘍抗原タンパク質に結合する。種々の実施形態では、第１の腫瘍抗原結合ドメインは、第１の腫瘍細胞上に存在する第１の腫瘍抗原に結合し、第２の腫瘍抗原結合ドメインは、第１の腫瘍細胞上に存在する第２の腫瘍抗原に結合する。
ＣＤ－３結合ドメイン
Ｔ細胞の応答の特異性は、Ｔ細胞受容体複合体による抗原（主要組織適合性複合体、ＭＨＣの文脈で提示される）の認識によって媒介される。Ｔ細胞受容体複合体の一部として、ＣＤ－３は、細胞表面上に存在する、ＣＤ－３γ（ガンマ）鎖、ＣＤ－３δ（デルタ）鎖、及び２つのＣＤ－３ε（イプシロン）鎖を含むタンパク質複合体である。ＣＤ－３は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のα（アルファ）及びβ（ベータ）鎖、ならびに及びＣＤ－３ζ（ゼータ）全てと会合して、Ｔ細胞受容体複合体を構成する。固定された抗ＣＤ－３抗体などによるＴ細胞上のＣＤ－３のクラスタリングにより、Ｔ細胞受容体の関与と同様であるがそのクローンに特有の特異性とは無関係のＴ細胞活性化が生じる。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ－３抗体のＣＤ－３への結合は、プロテアーゼが高レベルである罹患細胞または組織の微小環境、例えば、腫瘍微小環境においてのみＣＤ－３抗体のＣＤ－３への結合を制限するプロテアーゼ切断ドメインによって調節される。
一態様では、本明細書に記載されるポリペプチド構築物は、プロテアーゼによって活性化された場合にＣＤ－３に特異的に結合するドメインを含む。一態様では、本明細書に記載されるポリペプチド構築物は、プロテアーゼによって活性化された場合にヒトＣＤ－３に特異的に結合する２つ以上のドメインを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチド構築物は、プロテアーゼによって活性化された場合にＣＤ－３γに特異的に結合する２つ以上のドメインを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチド構築物は、プロテアーゼによって活性化された場合にＣＤ－３δに特異的に結合する２つ以上のドメインを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチド構築物は、プロテアーゼによって活性化された場合にＣＤ－３εに特異的に結合する２つ以上のドメインを含む。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼ切断部位は、抗ＣＤ－３ ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にあり、それらがＴ細胞上で折り畳まれ、ＣＤ－３に結合することを防ぐ。プロテアーゼ切断部位が標的細胞に存在するプロテアーゼによって切断されると、抗ＣＤ－３ ＶＨ及びＶＬドメインは、Ｔ細胞上で折り畳まれ、ＣＤ－３に結合することができるようになる。代替的な実施形態では、プロテアーゼ切断部位は、抗ＣＤ－３ ＶＨ及びＶＬドメインに結合する、ＣＤ－３に結合しないＶＬ及びＶＨドメインに設計される。標的細胞に存在するプロテアーゼによるプロテアーゼ切断部位の切断は、ＣＤ－３に結合しないＶＬ及びＶＨドメインを除去し、抗ＣＤ－３ ＶＨ及びＶＬドメインが、Ｔ細胞上で折り畳まれ、ＣＤ－３に結合できるようにする。
本明細書に記載される抗原結合タンパク質は、プロテアーゼによって活性化された場合にＣＤ－３に特異的に結合するドメインを含む。一実施形態では、ＣＤ－３に特異的に結合するドメインは、少なくとも１つのプロテアーゼ切断部位によって分離されたＶＨドメインとＶＬドメインとを含む。プロテアーゼ切断部位が切断されると、ＶＨドメイン及びＶＬドメインは、折り畳みが可能となり、それによりＣＤ－３に結合する。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ切断部位はループ領域にある。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ切断部位はＶＨドメイン及び／またはＶＬドメイン内にあり、プロテアーゼ切断部位が切断されて、ＶＨドメイン及び／またはＶＬドメインを暴露することで、それらの折り畳みが可能となり、それによりＣＤ－３に結合する。
さらなる実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチド構築物は、プロテアーゼによって活性化された場合にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に特異的に結合する２つ以上のドメインを含む。ある特定の例では、本明細書に記載されるポリペプチド構築物は、プロテアーゼによって活性化された場合にＴＣＲの鎖に特異的に結合する２つ以上のドメインを含む。ある特定の例では、本明細書に記載されるポリペプチド構築物は、プロテアーゼによって活性化された場合にＴＣＲのβ鎖に特異的に結合する２つ以上のドメインを含む。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチド構築物のＣＤ－３結合ドメインは、ヒトＣＤ－３との強力なＣＤ－３結合親和性を呈するだけでなく、それぞれのカニクイザルＣＤ－３タンパク質との優れた交差反応性も示す。いくつかの例では、ポリペプチド構築物のＣＤ－３結合ドメインは、カニクイザル由来のＣＤ－３と交差反応性である。ある特定の例では、ＣＤ－３のヒト：カニクイザルＫＤ比は５～０．２である。
いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質のＣＤ－３結合ドメインは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体由来のドメインが挙げられるがこれらに限定されない、ＣＤ－３に結合する任意のドメインであることができる。いくつかの例では、ＣＤ－３結合ドメインは、抗原結合タンパク質が最終的に使用されることになる同じ種に由来することが有益である。例えば、ヒトでの使用のためには、抗原結合タンパク質のＣＤ－３結合ドメインが、抗体または抗体フラグメントの抗原結合ドメイン由来のヒトまたはヒト化残基を含むことが有益であり得る。
このため、一態様では、抗原結合ドメインは、ヒト化もしくはヒト抗体、または抗体フラグメント、あるいはネズミ抗体または抗体フラグメントを含む。一実施形態では、ヒト化またはヒト抗ＣＤ－３結合ドメインは、本明細書に記載されるヒト化もしくはヒト抗ＣＤ－３結合ドメインの１つ以上（例えば、３つ全て）の軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ ＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ ＣＤＲ２）、及び軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ ＣＤＲ３）、ならびに／または本明細書に記載されるヒト化もしくはヒト抗ＣＤ－３結合ドメインの１つ以上（例えば、３つ全て）の重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）、及び重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）、例えば、１つ以上、例えば３つ全てのＬＣ ＣＤＲと、１つ以上、例えば３つ全てのＨＣ ＣＤＲとを含む、ヒト化またはヒト抗ＣＤ－３結合ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、ヒト化またはヒト抗ＣＤ－３結合ドメインは、ＣＤ－３に特異的なヒト化またはヒト軽鎖可変領域を含み、ここで、このＣＤ－３に特異的な軽鎖可変領域は、ヒト軽鎖フレームワーク領域にヒトまたは非ヒト軽鎖ＣＤＲを含む。ある特定の例では、軽鎖フレームワーク領域は、λ（ラムダ）軽鎖フレームワークである。他の例では、軽鎖フレームワーク領域は、κ（カッパ）軽鎖フレームワークである。
いくつかの実施形態では、１つ以上のＣＤ－３結合ドメインは、ＣＤ－３ε（イプシロン）に特異的である。いくつかの実施形態では、１つ以上のＣＤ－３結合ドメインは、ＣＤ－３δ（デルタ）に特異的である。いくつかの実施形態では、１つ以上のＣＤ－３結合ドメインは、ＣＤ－３γ（ガンマ）に特異的である。
いくつかの実施形態では、１つ以上のＣＤ－３結合ドメインは、ヒト化または完全なヒトである。いくつかの実施形態では、１つ以上の活性化ＣＤ－３結合ドメインは、ＣＤ－３を発現している細胞上のＣＤ－３に対して１０００ｎＭ以下のＫＤ結合を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上の活性化ＣＤ－３結合ドメインは、ＣＤ－３を発現している細胞上のＣＤ－３に対して１００ｎＭ以下のＫＤ結合を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上の活性化ＣＤ－３結合ドメインは、ＣＤ－３を発現している細胞上のＣＤ－３に対して１０ｎＭ以下のＫＤ結合を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のＣＤ－３結合ドメインは、カニクイザルＣＤ－３との交差反応性を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のＣＤ－３結合ドメインは、本明細書で提供されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ヒト化またはヒト抗ＣＤ－３結合ドメインは、ＣＤ－３に特異的なヒト化またはヒト重鎖可変領域を含み、ここで、このＣＤ－３に特異的な重鎖可変領域は、ヒト重鎖フレームワーク領域にヒトまたは非ヒト重鎖ＣＤＲを含む。
ある特定の例では、重鎖及び／または軽鎖の相補性決定領域は、既知の抗ＣＤ－３抗体、例えば、ムロモナブ－ＣＤ－３（ＯＫＴ３）、オテリキシズマブ（ＴＲＸ４）、テプリズマブ（ＭＧＡ０３１）、ビジリズマブ（Ｎｕｖｉｏｎ）、ＳＰ３４またはＩ２Ｃ、ＴＲ－６６またはＸ３５－３、ＶＩＴ３、ＢＭＡ０３０（ＢＷ２６４／５６）、ＣＬＢ－Ｔ３／３、ＣＲＩＳ７、ＹＴＨ１２．５、Ｆ１１１－４０９、ＣＬＢ－Ｔ３．４．２、ＴＲ－６６、ＷＴ３２、ＳＰｖ－Ｔ３ｂ、１１Ｄ８、ＸＩＩＩ－１４１、ＸＩＩＩ－４６、ＸＩＩＩ－８７、１２Ｆ６、Ｔ３／ＲＷ２－８Ｃ８、Ｔ３／ＲＷ２－４Ｂ６、ＯＫＴ３Ｄ、Ｍ－Ｔ３０１、ＳＭＣ２、Ｆ１０１．０１、ＵＣＨＴ－１、及びＷＴ－３１などに由来する。
一実施形態では、抗ＣＤ－３結合ドメインは、本明細書で提供されるアミノ酸配列の軽鎖及び重鎖を含む単一鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。一実施形態では、抗ＣＤ－３結合ドメインは、本明細書で提供される軽鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１、２、もしくは３個の修飾（例えば、置換）を有するが、３０、２０、もしくは１０個以下の修飾（例えば、置換）を有するアミノ酸配列、または本明細書で提供されるアミノ酸配列と９５～９９％の同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域；及び／あるいは本明細書で提供される重鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１、２、もしくは３個の修飾（例えば、置換）を有するが、３０、２０、もしくは１０個以下の修飾（例えば、置換）を有するアミノ酸配列、または本明細書で提供されるアミノ酸配列と９５～９９％の同一性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む。一実施形態では、ヒト化またはヒト抗ＣＤ－３結合ドメインはｓｃＦｖであり、本明細書に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域は、本明細書に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域に、ｓｃＦｖリンカーを介して結合する。ｓｃＦｖの軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、例えば、軽鎖可変領域－ｓｃＦｖリンカー－重鎖可変領域、または重鎖可変領域－ｓｃＦｖリンカー－軽鎖可変領域の配向のうちのいずれかであり得る。
いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質のＣＤ－３結合ドメインは、１０００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、１ｎＭ以下、または０．５ｎＭ以下のＫＤで、ＣＤ－３を発現している細胞上のＣＤ－３に対する親和性を有する。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質のＣＤ－３結合ドメインは、１０００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、１ｎＭ以下、または０．５ｎＭ以下のＫＤで、ＣＤ－３ε、γ、またはδに対する親和性を有する。さらなる実施形態では、抗原結合タンパク質のＣＤ－３結合ドメインは、ＣＤ－３に対する低い、すなわち、約１００ｎＭ以上の親和性を有する。
ＣＤ－３に結合する親和性は、例えば、抗原結合タンパク質それ自体またはそのＣＤ－３結合ドメインが、アッセイプレート上にコーティングされた；微生物細胞表面に提示される；溶液中などで、ＣＤ－３に結合する能力によって決定することができる。本開示の抗原結合タンパク質それ自体またはそのＣＤ－３結合ドメインのＣＤ－３への結合活性は、リガンド（例えば、ＣＤ－３）または抗原結合タンパク質自体もしくはそのＣＤ－３結合ドメインを、ビーズ、基質、細胞などに固定することによってアッセイすることができる。薬剤を適切な緩衝液に添加し、結合パートナーを所与の温度である時間インキュベートすることができる。洗浄して結合していない物質を除去した後、結合したタンパク質を、例えば、ＳＤＳ、高ｐＨの緩衝液などで放出させ、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって分析することができる。
リンカー
２つのドメインは、任意選択で切断可能であるリンカーによって一緒に接合される。例示的な切断部位は、プロテアーゼ切断部位である。ドメイン間リンカーを切断する例示的なプロテアーゼには、血漿中に見られるもの、例えば、トロンビン、及び腫瘍微小環境において過剰発現するものが含まれる。
本明細書に記載される抗原結合ポリペプチドにおいて、ドメインは、ドメインリンカー、例えば、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４によって連結され、ここで、Ｌ１は、ポリペプチド構築物の第１及び第２のドメインを連結し、Ｌ２は、ポリペプチド構築物の第２及び第３のドメインを連結し、Ｌ３は、ポリペプチド構築物の第３及び第４のドメインを連結し、Ｌ４は、プロテアーゼ活性化ポリペプチド構築物の第４及び第５のドメインを連結する。リンカー、例えばＬ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４は、最適化された長さ及び／またはアミノ酸組成を有する。いくつかの実施形態では、リンカー、例えば、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４は、同じ長さ及びアミノ酸組成である。他の実施形態では、リンカー、例えば、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４は、異なる。特定の実施形態では、内部リンカーＬ１、Ｌ２、Ｌ３、及び／またはＬ４は、「短い」、すなわち、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個のアミノ酸残基からなる。したがって、場合によっては、内部リンカーは、約１２個以下のアミノ酸残基からなる。０アミノ酸残基の場合、ドメインリンカーは、ペプチド結合である。特定の実施形態では、ドメインリンカーＬ１、Ｌ２、Ｌ３、及び／またはＬ４は、「長い」、すなわち、１５、２０、または２５アミノ酸残基からなる。いくつかの実施形態では、これらのドメインリンカーは、約３～約１５個、例えば、８、９、または１０個の連続したアミノ酸残基からなる。ドメインリンカーのアミノ酸組成に関して、ペプチドは、ポリペプチド構築物に可撓性を与え、結合ドメインに干渉せず、任意選択で、プロテアーゼからの切断に抵抗する特性を有するように選択される。例えば、グリシン及びセリン残基は、一般に、プロテアーゼ抵抗性を提供する。本発明のポリペプチドのドメインを連結するために好適な内部リンカーの例としては、（ＧＳ）ｎ、（ＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＳＧ）ｎ、（ＧＧＳＧ）ｎ、（ＧＧＳＧＧ）ｎ、または（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である）が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、内部リンカーＬ１、Ｌ２、及び／またはＬ３は、（ＧＧＧＧＳ）４または（ＧＧＧＧＳ）３である。
いくつかの例では、ＣＤ３に結合するｓｃＦｖは、既知の方法に従って調製される。例えば、ｓｃＦｖ分子は、可撓性ポリペプチドリンカーを使用してＶＨ領域とＶＬ領域とを一緒に連結することによって産生され得る。ｓｃＦｖ分子は、最適な長さ及び／またはアミノ酸組成を有するｓｃＦｖリンカー（例えば、Ｓｅｒ－Ｇｌｙリンカー）を含む。したがって、いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖリンカーの長さは、ＶＨドメインまたはＶＬドメインが他の可変ドメインと分子内で会合してＣＤ－３結合部位を形成することができるような長さである。ある特定の実施形態では、そのようなｓｃＦｖリンカーは、「短い」、すなわち、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個のアミノ酸残基からなる。したがって、ある特定の例では、ｓｃＦｖリンカーは、約１２個以下のアミノ酸残基からなる。アミノ酸残基が０の場合、ｓｃＦｖリンカーはペプチド結合である。いくつかの実施形態では、これらのｓｃＦｖリンカーは、約３～約１５個、例えば、８、９、または１０個の連続したアミノ酸残基からなる。例えば、グリシン及びセリン残基を含むｓｃＦｖリンカーは、一般に、プロテアーゼ耐性を提供する。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖ中のリンカーは、グリシン及びセリン残基を含む。ｓｃＦｖリンカーのアミノ酸配列は、例えば、ファージディスプレイ法によって、ｓｃＦｖのＣＤ－３結合及び産生収率を改善するために最適化することができる。ｓｃＦｖ中の可変軽鎖ドメイン及び可変重鎖ドメインを連結するのに好適なペプチドｓｃＦｖリンカーの例には、（ＧＳ）ｎ、（ＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＳＧ）ｎ、（ＧＧＳＧＧ）ｎ、または（ＧＧＧＧＳ）ｎが挙げられるがこれらに限定されず、式中、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。一実施形態では、ｓｃＦｖリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）４または（ＧＧＧＧＳ）３であり得る。リンカーの長さの変動は、活性を保持するかまたは強化し得る、活性研究において優れた有効性を生む。
さらなる例示的なドメイン及びｓｃＦｖリンカーを図５６に示す。
プロテアーゼ切断ドメイン
本明細書に記載される抗原結合ポリペプチドは、少なくとも１つのプロテアーゼによって切断されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのプロテアーゼ切断部位を含む。いくつかの場合には、本明細書に記載される抗原結合タンパク質は、少なくとも１つのプロテアーゼによって切断される、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、またはそれ以上のプロテアーゼ切断部位を含む。いくつかの場合には、プロテアーゼ切断部位は、プロテアーゼによって認識されるアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列ＬＥＡＴＡを有するポリペプチドを含むＭＭＰ９切断部位である。
プロテアーゼ切断ドメインは、配列特異的な様式で認識され切断される配列を有するポリペプチドである。本明細書で企図される抗原結合タンパク質は、いくつかの場合には、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、例えば、ＭＭＰ９により、配列特異的な様式で認識されるプロテアーゼ切断ドメインを含む。いくつかの場合には、ＭＭＰ９によって認識されるプロテアーゼ切断ドメインは、アミノ酸配列ＰＲ（Ｓ／Ｔ）（Ｌ／Ｉ）（Ｓ／Ｔ）を有するポリペプチドを含む。いくつかの場合には、ＭＭＰ９によって認識されるプロテアーゼ切断ドメインは、アミノ酸配列ＬＥＡＴＡを有するポリペプチドを含む。いくつかの場合には、プロテアーゼ切断ドメインは、ＭＭＰ１１によって配列特異的な様式で認識される。いくつかの場合には、ＭＭＰ１１によって認識されるプロテアーゼ切断ドメインは、アミノ酸配列ＧＧＡＡＮＬＶＲＧＧを有するポリペプチドを含む。いくつかの場合には、プロテアーゼ切断ドメインは、表１に開示されるプロテアーゼによって認識される。いくつかの場合には、表１に開示されるプロテアーゼによって認識されるプロテアーゼ切断ドメインは、表１に開示される配列から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
プロテアーゼは、タンパク質を、いくつかの場合には、配列特異的な様式で切断するタンパク質である。プロテアーゼには、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、アスパラギンペプチドリアーゼ、血清プロテアーゼ、カテプシン、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＫ、カテプシンＬ、カリクレイン、ｈＫ１、ｈＫ１０、ｈＫ１５、プラスミン、コラゲナーゼ、ＩＶ型コラゲナーゼ、ストロメリシン、第Ｘａ因子、キモトリプシン様プロテアーゼ、トリプシン様プロテアーゼ、エラスターゼ様プロテアーゼ、サブチリシン様プロテアーゼ、アクチニダイン、ブロメライン、カルパイン、カスパーゼ、カスパーゼ－３、Ｍｉｒ１－ＣＰ、パパイン、ＨＩＶ－１プロテアーゼ、ＨＳＶプロテアーゼ、ＣＭＶプロテアーゼ、キモシン、レニン、ペプシン、マトリプターゼ、レグマイン、プラスメプシン、ネペンテシン、メタロエキソペプチダーゼ、メタロエンドペプチターゼ、マトリックスメタロペプチターゼ（ＭＭＰ）、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１１、ＭＭＰ１４、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、エンテロキナーゼ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ、ｈＫ３）、インターロイキン－１β変換酵素、トロンビン、ＦＡＰ（ＦＡＰ－α）、ジペプチジルペプチダーゼ、及びジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６）が挙げられる。
Figure 2022140856000002
プロテアーゼは、いくつかの罹患した細胞及び組織、例えば、腫瘍または癌細胞によって分泌されて、プロテアーゼが豊富な微小環境（ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｔｈａｔ ｉｓ ｒｉｃｈ ｉｎ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ）またはプロテアーゼに富む微小環境（ｐｒｏｔｅａｓｅ－ｒｉｃｈ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）を創出することが知られている。いくつかの場合には、対象の血液にはプロテアーゼが豊富である。いくつかの場合には、腫瘍を取り囲む細胞がプロテアーゼを腫瘍微小環境に分泌する。プロテアーゼを分泌する腫瘍を取り囲む細胞には、腫瘍間質細胞、筋繊維芽細胞、血液細胞、肥満細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、制御性Ｔ細胞、マクロファージ、細胞傷害性Ｔリンパ球、樹状細胞、間葉系幹細胞、多形核細胞、及び他の細胞が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの場合には、プロテアーゼ、例えば、微生物ペプチド中に見出されるアミノ酸配列を標的とするプロテアーゼは、対象の血液中に存在する。この特徴により、標的細胞または組織のプロテアーゼに富む微小環境以外ではＴ細胞が抗原結合タンパク質によって結合されないため、抗原結合タンパク質などの標的治療薬がさらなる特異性を有するようになる。
例示的な実施形態では、ポリペプチド構築物は、１つ以上のプロテアーゼ切断部位、例えば、上記の表１に記載の部位を含む。これらの部位は、種々の実施形態において、１つ以上のＶＬｉまたはＶＨｉと１つ以上のＶＨまたはＶＬとの間に位置することで、関連するプロテアーゼによる部位の切断の際に、ＶＬｉがＶＨから分離し、かつ／またはＶＨｉがＶＬから分離するようにする。当業者には理解されるように、プロテアーゼ切断部位は、ＶＬドメインとＶＨドメインとの間の連結ポリペプチドｓｃＦｖリンカー配列全体を含むことができ、あるいは、切断部位は、一方または両方の末端で、アミノ酸またはペプチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼ切断ドメインは、半減期延長ドメインまたはＣＤ３結合ドメインにある。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ切断ドメインは、半減期延長ドメインまたはＣＤ３結合ドメインにはない。
半減期延長ドメイン
本明細書では、抗原結合ドメインの半減期を延長させるドメインが企図される。そのようなドメインには、ＨＳＡ結合ドメイン、Ｆｃドメイン、小分子、及び当該技術分野で既知の他の半減期延長ドメインが含まれるが、これらに限定されないことが意図される。
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（分子量約６７ｋＤａ）は、約５０ｍｇ／ｍｌ（６００μＭ）で存在する血漿中で最も豊富なタンパク質であり、ヒトにおいて約２０日間の半減期を有する。ＨＳＡは、血漿ｐＨを維持する働きをし、コロイド血圧に寄与し、多くの代謝産物及び脂肪酸の担体として機能し、血漿中の主要な薬物輸送タンパク質として働く。
アルブミンとの非共有結合は、短命のタンパク質の消失半減期を延長する。例えば、アルブミン結合ドメインのＦａｂフラグメントへの組換え融合により、Ｆａｂフラグメントのみの投与と比較して、マウス及びウサギに静脈内投与した場合、それぞれ、２５倍及び５８倍のインビボクリアランスの減少、ならびに２６倍及び３７倍の半減期延長がもたらされた。別の例では、インスリンが、アルブミンとの会合を促進するために脂肪酸でアシル化される場合、ウサギまたはブタに皮下注射されると長期にわたる効果が観察された。総合すると、これらの研究により、アルブミン結合と長期作用との間の関連が実証される。
一態様では、本明細書に記載される抗原結合タンパク質は、半減期延長ドメイン、例えば、ＨＳＡに特異的に結合するドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質のＨＳＡ結合ドメインは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体に由来するドメインが挙げられるがこれらに限定されない、ＨＳＡに結合する任意のドメインであり得る。いくつかの実施形態では、ＨＳＡ結合ドメインは、単一鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、例えば、ＨＳＡに特異的なラクダ由来のナノボディ、ペプチド、リガンド、または小分子の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、及び可変ドメイン（ＶＨＨ）である。ある特定の実施形態において、ＨＳＡ結合ドメインは、単一ドメイン抗体である。他の実施形態では、ＨＳＡ結合ドメインはペプチドである。さらなる実施形態では、ＨＳＡ結合ドメインは小分子である。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質のＨＳＡ結合ドメインは、かなり小さく、２５ｋＤ以下、２０ｋＤ以下、１５ｋＤ以下、または１０ｋＤ以下であることが企図される。ある特定の例では、ペプチドまたは小分子である場合、ＨＳＡ結合は５ｋＤ以下である。
抗原結合タンパク質の半減期延長ドメインにより、抗原結合タンパク質それ自体の薬力学及び薬物動態の変化が提供される。上記のように、半減期延長領域は、消失半減期を延長する。半減期延長領域はまた、薬力学的特性を改変し、これには、抗原結合タンパク質の組織分布、浸透、及び拡散の改変が含まれる。いくつかの実施形態では、半減期延長ドメインは、半減期延長結合ドメインを有しないタンパク質と比較して、改善された組織（腫瘍を含む）標的化、組織浸透、組織分布、組織内の拡散、及び強化された有効性を提供する。一実施形態では、治療方法は、減少した量の抗原結合タンパク質を効果的かつ効率的に利用することで、減少した非腫瘍細胞の細胞傷害性などの副作用の減少をもたらす。
さらに、半減期延長ドメイン、例えば、ＨＳＡ結合ドメインの特徴には、ＨＳＡに対するＨＳＡ結合ドメインの結合親和性が含まれる。該ＨＳＡ結合ドメインの親和性は、特定のポリペプチド構築物における特異的な消失半減期を標的とするように選択することができる。このため、いくつかの実施形態では、ＨＳＡ結合ドメインは高い結合親和性を有する。他の実施形態において、ＨＳＡ結合ドメインは、中程度の結合親和性を有する。さらに他の実施形態では、ＨＳＡ結合ドメインは、低いまたは最低限の結合親和性を有する。例示的な結合親和性には、１０ｎＭ以下（高）、１０ｎＭ～１００ｎＭ（中）、及び１００ｎＭ（低）超のＫ Ｄ濃度が挙げられる。上記のように、ＨＳＡに対する結合親和性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）などの既知の方法によって決定される。
標的抗原結合ドメイン
記載のＣＤ３及び半減期延長ドメインに加えて、本明細書に記載されるポリペプチド構築物はまた、１つ以上の標的抗原または単一の標的抗原上の１つ以上の領域に結合する少なくとも１つまたは少なくとも２つ以上のドメインを含む。本明細書では、本発明のポリペプチド構築物は、例えば、プロテアーゼ切断ドメインにて、疾患特異的微小環境においてまたは対象の血液中で切断され、各標的抗原結合ドメインは、標的細胞上で標的抗原に結合することで、ＣＤ３結合ドメインを活性化してＴ細胞に結合することが企図される。少なくとも１つの標的抗原は、疾患、障害、または病状に関与し、かつ／または関連する。例示的な標的抗原には、増殖性疾患、腫瘍性疾患、炎症性疾患、免疫学的障害、自己免疫疾患、感染性疾患、ウイルス性疾患、アレルギー性反応、寄生虫反応、移植片対宿主病、または宿主対移植片疾患に関連するものが挙げられる。いくつかの実施形態では、標的抗原は、腫瘍細胞上に発現される腫瘍抗原である。あるいは、いくつかの実施形態では、標的抗原は、ウイルスまたは細菌などの病原体と関連する。少なくとも１つの標的抗原は、健康な組織に対しても指向され得る。
いくつかの実施形態では、標的抗原は、タンパク質、脂質、または多糖などの細胞表面分子である。いくつかの実施形態では、標的抗原は、腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、細菌感染細胞、損傷赤血球、動脈プラーク細胞、または線維化組織細胞上にある。本明細書では、２つ以上の標的抗原が結合すると、２つの不活性ＣＤ３結合ドメインが共局在し、標的細胞の表面上に活性ＣＤ３結合ドメインを形成することが企図される。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、抗原結合タンパク質中の不活性ＣＤ３結合ドメインを活性化するための２つ以上の標的抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、標的細胞への結合の強度を増強するために、２つ以上の標的抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、標的細胞への結合の強度を増強するために、２つ以上の標的抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、２つ以上の抗原結合ドメインは、同じ抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、２つ以上の抗原結合ドメインは、異なる抗原結合ドメインを含む。例えば、罹患細胞または組織、例えば、腫瘍または癌細胞において二重に発現することが知られている２つの異なる抗原結合ドメインは、標的に対する抗原結合タンパク質の結合または選択性を増強することができる。
本明細書で企図されるポリペプチド構築物は、少なくとも１つの抗原結合ドメインを含み、ここで、抗原結合ドメインは、少なくとも１つの標的抗原に結合する。標的抗原は、いくつかの場合には、罹患細胞または組織、例えば腫瘍または癌細胞の表面上に発現される。標的抗原には、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ－２、ＨＥＲ－３、ｃ－Ｍｅｔ、ＦｏＩＲ、及びＣＥＡが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に開示されるポリペプチド構築物はまた、罹患細胞または組織上で発現されることが知られている２つの異なる標的抗原に結合する２つの抗原結合ドメインを含むタンパク質も含む。例示的な対の抗原結合ドメインには、ＥＧＦＲ／ＣＥＡ、ＥｐＣＡＭ／ＣＥＡ、及びＨＥＲ－２／ＨＥＲ－３が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書に記載されるポリペプチド構築物の設計により、１つ以上の標的抗原に対する結合ドメインは、標的抗原に対する結合ドメインが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体を含むがこれらに限定されない、いかなるの種類の結合ドメインでもあり得るという点で、柔軟になる。いくつかの実施形態では、標的抗原に対する結合ドメインは、単一鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、例えば、ラクダ由来ナノボディの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、及び可変ドメイン（ＶＨＨ）である。他の実施形態では、標的抗原に対する結合ドメインは、非Ｉｇ結合ドメイン、すなわち、アンチカリン、アフィリン、アフィボディ分子、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アビマー、ＤＡＲＰｉｎ、フィノマー、クニッツドメインペプチド、及びモノボディーなどの抗体模倣物である。さらなる実施形態では、１つ以上の標的抗原に対する結合ドメインは、１つ以上の標的抗原に結合または会合する、リガンド、受容体ドメイン、レクチン、またはペプチドである。
いくつかの実施形態では、標的細胞抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、非Ｉｇドメイン、または標的抗原に特異的に結合するリガンドを独立して含む。いくつかの実施形態では、標的抗原結合ドメインは、細胞表面分子に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、標的抗原結合ドメインは、腫瘍抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、標的抗原結合ドメインは、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ－２、ＨＥＲ－３、ｃＭｅｔ、ＣＥＡ、及びＦｏＩＲのうちの少なくとも１つから選択される抗原に特異的にかつ独立して結合する。いくつかの実施形態では、標的抗原結合ドメインは、抗原の少なくとも１つが、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ－２、ＨＥＲ－３、ｃＭｅｔ、ＣＥＡ、及びＦｏＩＲのうちの１つから選択される、２つの異なる抗原に特異的にかつ独立して結合する。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ切断ドメインの切断前のタンパク質は、約１００ｋＤａ未満である。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ切断ドメインの切断後のタンパク質は、約２５～約７５ｋＤａである。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ切断前のタンパク質は、初回通過クリアランスの腎閾値を上回るサイズを有する。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ切断前のタンパク質は、少なくとも約５０時間の消失半減期を有する。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ切断前のタンパク質は、少なくとも約１００時間の消失半減期を有する。いくつかの実施形態では、タンパク質は、同じ標的抗原に対するＩｇＧと比較して組織浸透が増加している。いくつかの実施形態では、タンパク質は、同じ標的抗原に対するＩｇＧと比較して組織分布が増加している。
ポリペプチド構築物の薬物動態
本明細書に記載されるポリペプチド構築物は、当業者に認識されるある特定の利点を有する。例えば、本明細書に記載されるポリペプチド構築物は、従来の抗体治療薬よりも改善された薬物動態を有する。本明細書のポリペプチド構築物の改善された薬物動態は、少なくとも半減期延長ドメイン及びＣＤ３結合ドメインに起因する。本明細書中に開示される半減期延長ドメインは、限定されないが、Ｆｃドメイン及びＨＳＡに結合するポリペプチドが挙げられるがこれらに限定されない種々のポリペプチドを含む。本明細書のＣＤ３結合ドメインは、優れた薬物動態を付与する固有の特性を有する。本明細書のＣＤ３結合ドメインは、少なくとも、少なくとも１つのプロテアーゼ切断ドメインの切断、及び標的抗原への抗原結合ドメインの結合によって活性化されるまで、ＣＤ３に結合しない。したがって、本明細書の抗原結合タンパク質の薬物動態の増強は、ヒトの循環におけるＣＤ３結合を介した標的媒介性薬物体内動態の減少または排除に少なくとも部分的に起因する。改善された薬物動態は、より浅いアルファ相、及びベータ相におけるより高い曝露のうちの少なくとも一方を含む。したがって、本明細書に記載される抗原結合タンパク質は、従来の抗体治療薬と比較した場合、曝露におけるピーク／トラフ差がより小さい、より大きな治療ウインドウを有する。
ポリペプチド構築物の修飾
本明細書に記載されるポリペプチド構築物は、（ｉ）アミノ酸が、遺伝暗号によりコードされているものではないアミノ酸残基で置換されているか、（ｉｉ）成熟ポリペプチドが、ポリエチレングリコールなどの別の化合物と融合しているか、あるいは（ｉｉｉ）さらなるアミノ酸が、リーダーもしくは分泌配列またはタンパク質の精製のための配列などのタンパク質に融合している、誘導体または類似体を包含する。
典型的な修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ－リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化などのタンパク質へのアミノ酸の転移ＲＮＡ介在性付加、及びユビキチン化を含むが、これらに限定されない。
修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、及びアミノ末端またはカルボキシル末端を含む、本明細書に記載されるポリペプチド構築物の任意の場所で行われる。ポリペプチド構築物の修飾に有用なある特定の一般的なペプチド修飾には、グリコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ－カルボキシル化、ヒドロキシル化、ポリペプチド中のアミノ基またはカルボキシル基のブロック、及びＡＤＰリボシル化が挙げられる。
抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子も提供される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド分子はＤＮＡ構築物として提供される。他の実施形態では、ポリヌクレオチド分子は、メッセンジャーＲＮＡ転写産物として提供される。
ポリヌクレオチド分子は、ペプチドリンカーによって分離されるか、または他の実施形態ではペプチド結合によって直接的に連結される３つの結合ドメインをコードする遺伝子を、好適なプロモーターに動作可能に連結された単一の遺伝子構築物、及び任意選択で好適な転写終結因子に組み合わせ、それを、細菌中、または例えばＣＨＯ細胞などの他の適切な発現系中で発現させることなどによる既知の方法によって構築される。標的結合ドメインが小分子である実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＣＤ－３及びＨＳＡに結合するドメインをコードする遺伝子を含む。半減期延長ドメインが小分子である実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＣＤ－３及び標的抗原に結合するドメインをコードする遺伝子を含む。利用されるベクター系及び宿主に応じて、構成的プロモーター及び誘導性プロモーターを含む任意の数の好適な転写及び翻訳要素を使用し得る。プロモーターは、それがそれぞれの宿主細胞におけるポリヌクレオチドの発現を駆動するように選択される。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ベクター、好ましくは発現ベクターに挿入され、これは、さらなる実施形態を表す。この組換えベクターは、既知の方法に従って構築することができる。特に関心があるベクターには、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、ウイルス（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルスなど）及びコスミドが挙げられる。
様々な発現ベクター／宿主系を利用して、記載されるポリペプチド構築物のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有及び発現させることができる。Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のための発現ベクターの例は、哺乳動物細胞における発現のためのｐＳＫＫ（Ｌｅ Ｇａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．（２００４）２８５（１）：１１１－２７）またはｐｃＤＮＡ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。
このため、本明細書に記載されるポリペプチド構築物は、いくつかの実施形態では、上記のタンパク質をコードするベクターを宿主細胞に導入し、タンパク質ドメインが発現される条件下で該宿主細胞を培養し、場合により単離し、任意選択でさらに精製することによって産生される。
薬学的組成物
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗原結合タンパク質、ポリペプチド構築物のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターまたはこのベクターによって形質転換された宿主細胞、及び少なくとも１つの薬学的に許容される担体、を含む、薬学的組成物も提供される。「薬学的に許容される担体」という用語は、成分の生物学的活性の有効性を妨害せず、かつそれが投与される患者にとって有害でない任意の担体を含むが、これに限定されない。好適な薬学的担体の例は、当該技術分野で周知であり、リン酸緩衝生理食塩水、水、油／水エマルションなどのエマルション、様々な種類の湿潤剤、無菌溶液などが挙げられる。このような担体は、従来の方法によって製剤化することができ、好適な用量で対象に投与することができる。好ましくは、組成物は無菌である。これらの組成物はまた、保存剤、乳化剤、及び分散剤などのアジュバントを含有してもよい。種々の抗菌剤及び抗真菌剤を含めることによって、微生物の作用の防止が確実となり得る。
本薬学的組成物のいくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗原結合タンパク質は、ナノ粒子にカプセル化される。いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、フラーレン、液晶、リポソーム、量子ドット、超常磁性ナノ粒子、デンドリマー、またはナノロッドである。薬学的組成物の他の実施形態では、抗原結合タンパク質はリポソームに結合される。いくつかの例では、抗原結合タンパク質は、リポソームの表面にコンジュゲートされる。いくつかの例では、抗原結合タンパク質は、リポソームのシェルの中にカプセル化される。いくつかの例では、リポソームはカチオン性リポソームである。
本明細書に記載されるポリペプチド構築物は、医薬品としての使用が企図される。投与は、様々な方法、例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所、または皮内投与によって行われる。いくつかの実施形態では、投与経路は、治療の種類及び薬学的組成物に含有される化合物の種類に依存する。投薬レジメンは、主治医及び他の臨床的要因によって決定されることになる。いずれの患者のための投薬量も、患者のサイズ、体表面積、年齢、性別、投与される特定の化合物、投与の時間及び経路、治療の種類、全体的な健康、ならびに同時投与される他の薬物を含む多くの因子に依存する。「有効用量」は、疾患の経過及び重症度に影響を及ぼして、そのような病状の軽減または寛解をもたらすのに十分な活性成分の量を指し、既知の方法を用いて決定され得る。
治療の方法
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗原結合タンパク質の投与を含む、それを必要とする個体の免疫系を刺激するための方法及び使用も提供される。いくつかの場合には、本明細書に記載される抗原結合タンパク質の投与により、標的抗原を発現する細胞が増加したレベルのプロテアーゼ活性を有する微小環境にある、標的抗原を発現する細胞に対して細胞傷害性が誘導され、かつ／または持続する。いくつかの場合には、標的抗原を発現する細胞は、癌または腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、細菌感染細胞、自己反応性Ｔ細胞もしくはＢ細胞、損傷赤血球、動脈プラーク、または線維化組織である。いくつかの場合には、対象の血液にはプロテアーゼが豊富である。
本明細書に記載される抗原結合タンパク質を、それを必要とする個体に投与することを含む、標的抗原に関連する疾患、障害、または病床の治療のための方法及び使用も本明細書で提供される。標的抗原に関連する疾患、障害、または病状には、ウイルス感染、細菌感染、自己免疫疾患、移植拒絶、アテローム性動脈硬化症、または線維症が挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態では、標的抗原に関連する疾患、障害、または病状は、増殖性疾患、腫瘍性疾患、炎症性疾患、免疫学的障害、自己免疫疾患、感染性疾患、ウイルス性疾患、アレルギー性反応、寄生虫反応、移植片対宿主病、または宿主対移植片疾患である。一実施形態では、標的抗原に関連する疾患、障害、または病状は、癌である。一例では、癌は血液癌である。別の例では、癌は固形腫瘍癌である。
本明細書で使用される場合、いくつかの実施形態では、「治療」または「治療する」または「治療される」は、目的が望ましくない生理学的病状、障害、または疾患を遅らせる（軽減する）か、あるいは有益なまたは望ましい臨床結果を得る、治療処置を指す。本明細書に記載される目的では、有益なまたは望ましい臨床結果には、症状の緩和；病状、障害、または疾患の程度の減衰；病状、障害、または疾患の状態の安定化（すなわち、悪化しない）；病状、障害、または疾患の発症の遅延または進行の減速；病状、障害、または疾患の状態の改善； 及び検出の可能不可能にかかわらず、病状、障害、または疾患の（部分的または全体的な）寛解、または増強もしくは向上を含むが、これらに限定されない。治療には、過剰なレベルの副作用なしに臨床的に有意な応答を誘起することが含まれる。治療はまた、治療を受けていない場合に予想される生存と比較して、生存期間を延長することを含む。他の実施形態では、「治療」または「治療する」または「治療される」は、目的が、例えば、疾患に罹りやすいヒト（例えば、乳癌などの疾患に関する遺伝的マーカーを有する個体）において、望ましくない生理学的病状、障害、もしくは疾患の発症を遅延させるか、またはそれらの重症度を低下させることである、予防措置を指す。
本発明の方法において、治療は、疾患または病状に関して肯定的な治療応答を提供するために使用される。「肯定的な治療応答」は、疾患もしくは病状の改善、及び／または疾患または病状に関連する症状の改善を意図する。例えば、肯定的な治療応答は、疾患における以下の改善のうちの１つ以上を指し得る：（１）腫瘍細胞の数の減少、（２）腫瘍細胞死の増加、（３）腫瘍細胞の生存の阻害、（５）腫瘍増殖の阻害（すなわち、ある程度の減速、好ましくは停止）、（６）患者生存率の増加、及び（７）疾患または病状に関連する１つ以上の症状からのいくらかの解放。
任意の所与の疾患または病状における肯定的な治療応答は、その疾患または病状に特有の標準化された応答基準によって決定され得る。腫瘍応答は、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）スキャン、Ｘ線撮影、コンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャン、骨スキャン撮影、内視鏡検査、ならびに骨髄穿刺（ＢＭＡ）及び循環中の腫瘍細胞の計数を含む腫瘍生検サンプリングなどのスクリーニング技法を使用して、腫瘍形態（すなわち、全身腫瘍組織量、腫瘍サイズなど）の変化について評定され得る。
これらの肯定的な治療応答に加えて、治療を受けている対象は、疾患に関連する症状の改善の有益な効果を経験し得る。
本発明に従う治療には、使用される医薬品の「治療有効量」が含まれる。「治療有効量」は、所望の治療結果を達成するために、必要な用量及び期間で有効な量をいう。
治療有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別、及び体重、ならびに個体において所望の応答を誘発する薬剤の能力などの因子によって異なり得る。治療有効量はまた、抗体または抗体部分のいずれの毒性または有害な効果よりも治療上有益な効果が勝る量である。
腫瘍療法のための「治療有効量」は、疾患の進行を安定化する能力によっても測定することができる。癌を阻害する化合物の能力は、ヒト腫瘍における有効性を予測する動物モデル系において評価してもよい。
あるいは、組成物のこの特性は、当業者に知られているインビトロアッセイによって、化合物が細胞増殖を阻害するか、またはアポトーシスを誘導する能力を検査することによって評価してもよい。治療有効量の治療用化合物は、腫瘍サイズを減少させるか、さもなければ対象の症状を軽減し得る。当業者であれば、対象のサイズ、対象の症状の重症度、及び選択される特定の組成物または投与経路などの因子に基づいて、そのような量を決定することができるであろう。
投薬レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療応答）を提供するように調節される。例えば、単回のボーラスを投与してもよく、いくつかの分割用量を経時的に投与してもよく、または治療状況の緊急性によって示されるように用量を比例して減少または増加させてもよい。非経口組成物は、投与の容易性及び投与量の均一性のために、単位剤形で処方され得る。本明細書で使用される単位剤形は、処置される対象のための単一用量として好適な物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要とされる薬学的担体に関連して所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を含有する。
本発明の単位剤形形態の仕様は、（ａ）活性化合物の固有の特徴及び達成すべき特定の治療効果、ならびに（ｂ）個体における感受性の治療に対してそのような活性化合物を調合する分野に付いて回る制限に影響され、またそれらに直接的に依存する。
本発明で使用される二重特異性抗体の効率的な投薬量及び投薬レジメンは、治療される疾患または病状に依存し、当業者によって決定され得る。
本発明で使用される二重特異性抗体の治療有効量の例示的かつ非限定的な範囲は、約０．１～１００ｍｇ／ｋｇである。
本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態では、ポリペプチド構築物は、特定の疾患、障害、または病状の治療のための薬剤と組み合わせて投与される。薬剤には、抗体、小分子（例えば、化学療法剤）、ホルモン（ステロイド性、ペプチドなど）を伴う療法、放射線療法（γ線、Ｘ線、及び／または放射性同位体、マイクロ波、ＵＶ照射などの指向性送達）、遺伝子療法（例えば、アンチセンス、レトロウイルス療法など）、及び他の免疫療法が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ポリペプチド構築物は、抗下痢剤、制吐剤、鎮痛剤、オピオイド、及び／または非ステロイド性抗炎症剤と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、ポリペプチド構築物は、外科手術の前、際中、または後に投与される。
全ての引用文献は、本明細書にそれらの全体が参考として明示的に援用される。
材料及び方法
材料及び方法
ポリペプチド構築物をコードするＤＮＡ発現構築物のクローニング：プロテアーゼ切断部位ドメインを有する抗ＣＤ－３ ｓｃＦｖを使用して、抗ＣＤ－３ ｓｃＦｖドメイン及び半減期延長ドメイン（例えば、ＨＳＡ結合ペプチドまたはＶＨドメイン）を、ドメインが図５３に示すように組織化されるように構築する。ＣＨＯ細胞における抗原結合タンパク質の発現のために、全てのタンパク質ドメインのコード配列を哺乳動物発現ベクター系にクローニングする。簡潔には、ＣＤ３結合ドメイン、半減期延長ドメイン、及びペプチドリンカーのＬ１及びＬ２を伴うＣＤ３結合ドメインをコードする遺伝子配列を、別々に合成し、サブクローニングする。次いで、得られた構築物を、標的結合ドメイン－Ｌ１－ＶＨ ＣＤ－３結合ドメイン－Ｌ２－ プロテアーゼ切断ドメイン－Ｌ３－ＶＬｉ ＣＤ－３結合ドメイン－Ｌ４－標的結合ドメイン－Ｌ５－ＶＬ ＣＤ－３結合ドメイン－Ｌ６－プロテアーゼ切断ドメイン－Ｌ７－ＶＨｉ ＣＤ－３結合ドメイン－Ｌ８－半減期延長ドメインの順で共にライゲーションし、最終構築物を得る。全ての発現構築物は、タンパク質分泌及び精製を容易にするために、それぞれ、Ｎ末端シグナルペプチド及びＣ末端ヘキサ－またはデカ－ヒスチジン（６ｘ－または１０ｘ－Ｈｉｓ）タグのコード配列を含むように設計されている。
安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞におけるポリペプチド構築物の発現：ＣＨＯ－Ｋ１チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ－６１）の誘導体であるＣＨＯ細胞発現系（Ｆｌｐ－Ｉｎ（登録商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（Ｋａｏ ａｎｄ Ｐｕｃｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９６８； ６０（４）：１２７５－８１）を使用する。付着細胞は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって提供される標準的な細胞培養プロトコールに従って継代培養する。
懸濁液中での増殖に適合させるために、細胞を組織培養フラスコから剥がし、無血清培地に入れる。懸濁液適合細胞を、１０％のＤＭＳＯを含む培地中で凍結保存する。
分泌されたポリペプチド構築物を安定に発現する組換えＣＨＯ細胞株を、懸濁液適合細胞のトランスフェクションによって生成する。抗生物質ハイグロマイシンＢによる選択の間、生存細胞密度を週に２回測定し、細胞を遠心分離し、新鮮な選択培地に０．１×１０６生存細胞／ｍＬの最大密度で再懸濁する。ポリペプチド構築物を安定に発現する細胞プールを、２～３週間の選択後に回収し、この時点で、細胞は、振とうフラスコ中の標準培地に移す。組換え分泌タンパク質の発現を、タンパク質ゲル電気泳動またはフローサイトメトリーを行うことによって確認する。安定な細胞のプールを、ＤＭＳＯ含有培地中で凍結保存する。
ポリペプチド構築物を、細胞培養上清中への分泌によって、安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞株の１０日間流加培養で産生させる。細胞培養上清は、典型的には、７５％超の培養生存率で１０日後に採集する。試料を産生培養物から毎日収集し、細胞密度及び生存率を評評定する。採集日に、細胞培養上清を、遠心分離及び真空濾過により、その後の使用の前に除去する。
細胞培養上清中のタンパク質発現力価及び産物完全性をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析する。
ポリペプチド構築物の精製：ポリペプチド構築物を、ＣＨＯ細胞培養上清から２段階手順で精製する。構築物を、第１のステップで親和性クロマトグラフィーに供し、続いて第２のステップでＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００の分取サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）に供する。試料を緩衝液交換し、限外濾過によって１ｍｇ／ｍＬ超の典型的な濃度に濃縮する。最終試料の純度及び均質性（典型的には９０％超）を還元条件及び非還元条件下でＳＤＳ ＰＡＧＥにより評定し、続いて抗ＨＳＡまたは抗イディオタイプ抗体ならびに分析ＳＥＣを用いた免疫ブロッティングをそれぞれ行う。精製されたタンパク質は、使用まで－８０℃にてアリコートで保存する。
ＣＤ３結合を示すサンドイッチＥＬＩＳＡ：９６ウェルＥＩＡプレートをＰＢＳ中１μｇ／ｍＬのアカゲザルＥＧＦＲ：：ｈＦＣでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートを０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳで３回洗浄し、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（ＰＢＳ）を用いて室温で１時間ブロックした。さらに３回洗浄した後、連続希釈したＰｒｏｄｅｎｔを適切なウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートを再度洗浄し、ビオチン結合したカニクイザルＣＤ３Ｅ：：ｈＦＣを最終濃度１μｇ／ｍＬになるように添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートをさらに３回洗浄した後、ＨＲＰ結合ストレプトアビジンを０．１μｇ／ｍＬの濃度で添加し、３０分間インキュベートした。最後に、プレートを再び洗浄し、Ｓｕｒｍｏｄｉｃｓ１成分ＴＭＢ基質を用いて５分間現像した。Ｓｕｒｍｏｄｉｃｓ ６５０停止溶液で反応を停止させ、プレートを６５０ｎｍで読み取った。
ＣＤ３結合を示すサンドイッチＦＡＣＳ：約８０％の密集度まで増殖させたＯｖＣＡＲ８細胞をＰＢＳ中２０ｎＭのＥＤＴＡで分離した。次いで、細胞を１０％のＦＢＳを含むＰＢＳでブロックし、９６ウェル丸底細胞培養プレートに２×１０５細胞／ウェルで播種した。以降全ての工程は氷上で行った。プレートを８００×ｇで５分間遠心分離して、細胞をペレット化した。上清を捨て、細胞を連続希釈したＰｒｏｄｅｎｔに再懸濁した。Ｐｒｏｄｅｎｔを氷上で１時間インキュベートした後、細胞を１％のＦＢＳを含むＰＢＳで３回洗浄した。次いで、ＡＦ４８８標識されたカニクイザルＣＤ３Ｅ：：ｈＦＣを０．５μｇ／１ｘ１０６細胞の濃度で加え、暗所において氷上で３０分間インキュベートした。細胞をさらに３回洗浄し、１％のＦＢＳ及び０．５μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウムを含む１５０μＬのＰＢＳに再懸濁し、フローサイトメーターで分析した。
ＴＤＣＣアッセイ：ルシフェラーゼで形質導入されたＯｖＣＡＲ８細胞を約８０％の密集度まで増殖させ、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓで分離した。細胞を遠心分離し、１×１０６／ｍＬまで培地中に再懸濁した。精製されたヒトＰａｎ Ｔ細胞を解凍し、遠心分離し、培地に再懸濁した。最後に、ＯｖＣＡＲ８細胞とＴ細胞との共培養物を３８４ウェル細胞培養プレートに添加した。次いで、連続希釈したＰｒｏｄｅｎｔを共培養物に添加し、４８時間インキュベートした。最後に、同量のＳｔｅａｄｙＧｌｏルシフェラーゼアッセイ試薬をプレートに添加し、２０分間インキュベートした。プレートを読み取り、全発光を記録した。
ＥＫ切断のためのＳＤＳ－ＰＡＧＥ：２ｍＭのＣａＣｌ２を含有するＨＢＳ中にＰｒｏｄｅｎｔを緩衝液交換し、２つの濃度で組換えエンテロキナーゼ（ＮＥＢ、Ｐ８０７０Ｌ）によって切断した。切断反応を室温で２時間行い、過剰のベンズアミジンセファロースで停止させた。切断産物を４～２０％のトリス－グリシンゲル上で泳動させ、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｇ－２５０で染色した。
未精製タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ：発現レベルを決定するために、一時的にトランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３細胞からの馴化培地をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより評価した。各トランスフェクションからの上清１０μＬを、１０～２０％のトリス－グリシンゲル上で還元条件及び非還元条件下で泳動させた。ゲルをＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｇ－２５０で染色し、予想されたバンドを適切な分子量で観察した。
精製タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ：精製後、２μｇの各Ｐｒｏｄｅｎｔを１０～２０％のトリス－グリシンゲル上で非還元条件下で泳動させ、純度及び安定性を評価した。ゲルをＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｇ－２５０で染色し、予想されたバンドを適切な分子量で観察した。
間接的ＥＬＩＳＡ－ＥＧＦＲまたはＣＤ３に結合するＰｒｏｄｅｎｔ：９６ウェルＥＩＡプレートをＰＢＳ中１μｇ／ｍＬのアカゲザルＥＧＦＲ：：ｈＦＣまたはカニクイザルＣＤ３Ｅ：：Ｆｌａｇ：：ｈＦＣのいずれかの捕捉抗原でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートを０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳで３回洗浄し、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（ＰＢＳ）を用いて室温で１時間ブロックした。さらに３回洗浄した後、連続希釈したＰｒｏｄｅｎｔを適切なウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートを再度洗浄し、ＨＲＰ結合した抗６ｘＨｉｓ Ｔａｇ抗体を１μｇ／ｍＬの濃度で加え、室温で１時間インキュベートした。最後に、プレートを再び洗浄し、Ｓｕｒｍｏｄｉｃｓ１成分ＴＭＢ基質を用いて５分間現像した。Ｓｕｒｍｏｄｉｃｓ ６５０停止溶液で反応を停止させ、プレートを６５０ｎｍで読み取った。
ＦＡＣＳ－ＯｖＣＡＲ８またはＪｕｒｋａｔに結合するＰｒｏｄｅｎｔ：未切断Ｐｒｏｃｅｎｔを、ＦＡＣＳを用いて評定して、ＯｖＣＡＲ８細胞上のＥＧＦＲ結合及びＪｕｒｋａｔｓ上のＣＤ３結合を確認した。細胞を１０％のＦＢＳを含むＰＢＳでブロックし、９６ウェル丸底細胞培養プレートに２×１０５細胞／ウェルで播種した。以降全ての工程は氷上で行った。プレートを８００×ｇで５分間遠心分離して、細胞をペレット化した。上清を捨て、細胞を連続希釈したＰｒｏｄｅｎｔに再懸濁した。Ｐｒｏｄｅｎｔを氷上で１時間インキュベートした後、細胞を１％のＦＢＳを含むＰＢＳで３回洗浄した。細胞を、０．５μｇ／ｍＬの濃度でＦＩＴＣ標識抗６ｘＨｉｓ Ｔａｇ抗体に再懸濁し、３０分間インキュベートした。細胞をさらに３回洗浄し、１％のＦＢＳ及び０．５μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウムを含む１５０μＬのＰＢＳに再懸濁し、フローサイトメーターで分析した。
ＦＡＣＳ及びＭＳＤ－ＥＫトランスフェクト細胞によるＰｒｏｄｅｎｔの切断：ＥＫトランスフェクトＯｖＣＡＲ８クローンによるＰｒｏｄｅｎｔの切断を、ＦＡＣＳ及びＭＳＤによって評価した。細胞を約８０％の密集度まで増殖させ、ＰＢＳ中２０ｎＭのＥＤＴＡで分離した。ＭＳＤについては、２×１０４個の細胞を９６ウェルＳｅｃｔｏｒ ＭＳＤプレートの各ウェルに３７℃で２時間固定化した。次いで、ウェルを、１０％のＦＢＳを含むＰＢＳによって室温で１時間ブロックした。プレートをアッセイ緩衝液（１％のＦＢＳを含むＰＢＳ）で３回洗浄した。連続希釈した未切断プロドラッグを添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートをさらに３回洗浄し、Ｓｕｌｆｏ－Ｔａｇ標識したカニクイザルＣＤ３Ｅ：：Ｆｌａｇ：：ｈＦＣを最終濃度１μｇ／ｍＬになるように添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートをさらに３回洗浄した。界面活性剤を含まない読み取り緩衝液Ｔを加え、すぐに全発光を測定した。
ＦＡＣＳについては、細胞を、１０％のＦＢＳを含むＰＢＳでブロックし、９６ウェル丸底細胞培養プレートに２×１０５細胞／ウェルで播種した。以降全ての工程は氷上で行った。プレートを８００×ｇで５分間遠心分離して、細胞をペレット化した。上清を捨て、細胞を連続希釈した未切断Ｐｒｏｄｅｎｔに再懸濁した。Ｐｒｏｄｅｎｔを氷上で１時間インキュベートした後、細胞を１％のＦＢＳを含むＰＢＳで３回洗浄した。次いで、ＡＦ４８８標識されたカニクイザルＣＤ３Ｅ：：ｈＦＣを０．５μｇ／１ｘ１０６細胞の濃度で加え、暗所において氷上で３０分間インキュベートした。細胞をさらに３回洗浄し、１％のＦＢＳ及び０．５μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウムを含む１５０μＬのＰＢＳに再懸濁し、フローサイトメーターで分析した。
ＦＡＣＳ－ＥＫを発現しているＯｖＣａｒ８細胞の生成：細胞外６ｘＨｉｓ Ｔａｇを有するエンテロキナーゼをコードするベクターでトランスフェクトした細胞を選択下で増殖させた。クローンを選び取り、ＦＡＣＳによって分析して、ＥＫ発現の相対レベルを決定した。細胞を約８０％の密集度まで増殖させ、ＰＢＳ中２０ｎＭのＥＤＴＡで分離し、１０％のＦＢＳを含むＰＢＳでブロッキングした。以降全ての工程は氷上で行った。各クローンを、０．５μｇ／ｍＬの濃度のＦＩＴＣ標識したネズミＩｇＧ１抗６ｘＨｉｓ Ｔａｇ抗体で二重染色した。ＦＩＴＣ標識したネズミＩｇＧ１アイソタイプ対照を陰性染色として使用した。トランスフェクトされていないＯｖＣＡＲ８細胞も、陰性対照として両方の抗体で染色した。氷上で１時間インキュベートした後、細胞を３回洗浄し、１％のＦＢＳ及び０．５μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウムを含む１５０μＬのＰＢＳに再懸濁した。クローンをフローサイトメーターで分析し、ＥＫ発現に従ってランク付けした。
オクテットによる選択されたＰｒｏｄｅｎｔの結合親和性：親和性測定のためのオクテットアッセイ構成：抗ヒトＩｇＧ捕捉（ＡＨＣ）バイオセンサー→ｈｕＥＧＦＲ．ｈｕＦｃまたはｈＣＤ３ｅ．ｆｌａｇ．ｈＦｃ→Ｐｒｏｄｅｎｔ．６ｈｉｓ。オクテットアッセイステップ：ベースライン６０秒、ローディング１２０秒、ベースライン２ ６０秒、会合１８０秒、解離３００秒。１００ｎＭのｈｕＥＧＦＲ．ｈｕＦｃまたはｈＣＤ３ｅ．ｆｌａｇ．ｈＦｃタンパク質をＡＨＣセンサーチップ上にロードする。Ｐｒｏｄｅｎｔ濃度は１００ｎＭであった。緩衝液：ＰＢＳ緩衝液中のカゼイン０．２５％、これはセンサーの水和、試料の希釈、ならびに全てのベースライン及び解離工程に使用した。温度３０℃。シェーカー速度１０００ｒｐｍ。陽性対照、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎカタログ番号５５５９９６由来の抗ｈｕＥＧＦＲ ｍＡｂ及びＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎカタログ番号５５１９１６由来の抗ｈＣＤ３ｅ ｍＡｂ。陰性対照：マウスＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ１、及びエンブレル。Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ９６計器をデータ生成に使用した。
プロテインＡ定量アッセイ構成：プロテインＡバイオセンサー→Ｐｒｏｄｅｎｔ。オクテットアッセイステップ：プロテインＡセンサーを試料に１２０秒間浸し、再生を３回行い、全ての試料について繰り返す。緩衝液：ＰＢＳ緩衝液または発現培地中の０．２５％カゼイン、センサーの水和及び試料の希釈用の同じ緩衝液。温度３０℃。シェーカー速度４００ｒｐｍ。標準曲線範囲１００、５０、２５、１２．５、６．２５、３．１２５、１．５６、０．７８μｇ／ｍｌの精製Ｐｒｏｄｅｎｔ
マトリプターゼ切断反応：タンパク質分解反応のために、２６ｋＤａタンパク質であるマトリプターゼＳＴ１４（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号３９４６－ＳＥ）のヒト組換え触媒ドメインを、６９ｕＭのＰｒｏ８ＭＳ及び８１ｕＭのＰｒｏ８ＭＬ試料に添加し、最終濃度０．３μＭとした。反応を室温で２４時間放置し、過剰のベンズアミジンセファロースで停止させた。試料をＳＤＳ ＰＡＧＥ（１０～２０％のトリス／グリシンゲル、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、非還元条件）で分析した。切断は９５％超完了したようであった。Ｐｒｏ８ＭＳ及びＰｒｏ８ＭＬの未処理試料を、処理した試料と同じ時間、室温で保持した。反応は、２５ｍＭのクエン酸ナトリウム、７５ｍＭのＬ－アルギニン、７５ｍＭの塩化ナトリウム、４％のスクロース緩衝液（ｐＨ７．０）を含む緩衝液中で行った。
Ｐｒｏｄｅｎｔ ＳＥＣプロファイル：ＨＰＬＣシステム（Ａｉｌｉｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ）でＹａｒｒａ ３ｕｍ ＳＥＣ－２０００カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を使用して分析サイズ排除クロマトグラフィーを行った。分取サイズ排除クロマトグラフィーは、３１．２５ｍＭのクエン酸ナトリウム、９４ｍＭのＬ－アルギニン、９４ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．０）緩衝液中のＡＫＴＡ純クロマトグラフィーシステム（ＧＥ）でＨｉＬｏａｄ ２６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥ）を用いて行った。
プロテアーゼ活性アッセイ：市販の組換えまたは精製プロテアーゼ、ならびにヒト、マウス、及びカニクイザル血清のタンパク質分解活性を、フルオロフォア対標識ペプチド（ＦＲＥＴペプチド）を基質として用いて測定した。Ａｂｚ－Ｄｎｐ標識ペプチドの蛍光を、３２０ｎｍ及び４２０ｎｍの励起／発光波長でそれぞれ測定した。Ｄａｂｃｙｌ－ＥＤＡＮＳ標識ペプチドの蛍光を、３４０ｎｍ及び４９０ｎｍの励起／発光波長でそれぞれ測定した。ペプチドを、ＤＭＳＯ中の２０ｍＭストックから、プロテアーゼ特異的緩衝液または血清のいずれかを含む反応ウェルに添加して、最終濃度３～１２０μＭとした。添加されたプロテアーゼの濃度は１～１０ｎＭであった。線状蛍光感度範囲内の９６ウェルプレートリーダーを用いて、蛍光を記録した。
実施例１：初期ＰＲＯプラットフォームの調製と特性
この調査の目的は、Ｔ細胞活性化及び細胞傷害性が腫瘍微小環境において増強される「条件的活性」Ｔ細胞エンゲージャーを開発することであった。戦略は、腫瘍特異的プロテアーゼ切断部位を独自のαＸ／αＣＤ３分子に挿入し、切断及び腫瘍結合により活性分子が生じるようにすることであった。αＸは、１個または好ましくは２個の腫瘍抗原に対する結合ドメインである。分子設計は、相補的活性抗ＣＤ３ドメイン（ＶＨ及びＶＬ）を含む一対の不活性抗ＣＤ３ ｓｃＦｖのｓｃＦｖリンカーに位置するプロテアーゼ切断部位を利用する。原則として、腫瘍細胞の表面への２つの抗腫瘍結合ドメインの結合後に、２つの結合した機能的な抗ＣＤ３結合ドメインが会合して、活性ＣＤ３結合ドメインを生成し、Ｔ細胞媒介性の腫瘍の死滅を始動する。
プラットフォーム１（不対αＣＤ３ ｓｃＦｖ）
・Ｐｒｏ１－αＥＧＦＲ Ｇ８ ｓｄＡｂ－Ｉ２Ｃ ＶＨ－Ｈｉｓ１０
・Ｐｒｏ２－Ｉ２Ｃ ＶＬ －αＥＧＦＲ Ｄ１２ ｓｄＡｂ－Ｈｉｓ１０
・Ｐｒｏ３－αＥＧＦＲ Ｇ８ ｓｄＡｂ－Ｉ２Ｃ ｓｃＦｖ（ＶＨ －（ＧＳ）３－ＶＬ）－αＥＧＦＲ Ｄ１２ ｓｄＡｂ－Ｈｉｓ１０
・Ｐｒｏ４－αＥＧＦＲ Ｇ８ ｓｄＡｂ－Ｉ２Ｃ ＶＨ－Ｆｌａｇ＊－Ｉ２Ｃ ＶＬ－αＥＧＦＲ Ｄ１２ ｓｄＡｂ－Ｈｉｓ１０
（短いｓｃＦｖリンカーは、ＣＤ３のＶＨ及びＶＬの対合を妨げる）
Ｆｌａｇ＊は、プロテアーゼ－エンテロキナーゼ（ＥＫ）の８アミノ酸切断部位である。
プラットフォーム１の構築物は以下のように調製した。Ｐｒｏｄｅｎｔ１～４をコードする遺伝子を哺乳動物発現ベクターにクローニングし、プラスミドＤＮＡを産生させた。タンパク質を、振とうフラスコ中の成長培地２５ｍＬ中のＨＥＫ２９３及びＣＨＯ－Ｓ細胞株において一時的に発現させた。各ポリＨｉｓタグタンパク質を、Ｎｉ－ｅｘｃｅｌ樹脂を用いて精製した。結果を図１Ａ及び図１Ｂに示す。
ｓｃＦｖ ＣＤ３結合ドメインの生成
ヒトＣＤ３ε鎖標準配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ０７７６６である。ヒトＣＤ３γ鎖標準配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ０９６９３である。ヒトＣＤ３δ鎖標準配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ０４３２３４である。ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、またはＣＤ３δに対する抗体は、親和性成熟などの既知の技術を介して生成される。マウス抗ＣＤ３抗体を出発物質として使用する場合、マウス特異的残基が本明細書に記載される抗原結合タンパク質の治療を受ける対象においてヒト抗マウス抗原（ＨＡＭＡ）応答を誘発し得る臨床の場では、マウスのヒト化が所望される。ヒト化は、マウス抗ＣＤ３抗体由来のＣＤＲ領域を適切なヒト生殖系列アクセプターフレームワーク上にグラフトし、任意選択でＣＤＲ及び／またはフレームワーク領域に対する他の修飾を含めることによって達成される。本明細書で提供されるように、抗体及び抗体断片の残基番号付けは、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ，１９９１、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ，１９８７）に従う。
したがって、ヒトまたはヒト化抗ＣＤ３抗体を使用して、ポリペプチド構築物のＣＤ３結合ドメインのｓｃＦｖ配列を生成する。ヒトまたはヒト化ＶＬ及びＶＨドメインをコードするＤＮＡ配列が得られ、構築物のコドンは、任意選択で、ホモサピエンス由来の細胞における発現のために最適化する。プロテアーゼ切断部位は、ＶＨ及びＶＬドメインの間に含める。ｓｃＦｖ中でＶＬ及びＶＨドメインが現れる順序（すなわち、ＶＬ－ＶＨ配向またはＶＨ－ＶＬ配向）ならびに「Ｇ４Ｓ」または「Ｇ４Ｓ」サブユニットの３つのコピー（Ｇ４Ｓ）３は、可変ドメインを接続してｓｃＦｖドメインを創出する。抗ＣＤ３ ｓｃＦｖプラスミド構築物は、任意選択のＦｌａｇ、Ｈｉｓ、または他の親和性タグを有することができ、これをＨＥＫ２９３または他の好適なヒトまたは哺乳動物細胞株にエレクトロポレーションし、タンパク質を発現させ、精製を行う。検証アッセイには、ＦＡＣＳによる結合分析、Ｐｒｏｔｅｏｎを用いた動態分析、及びＣＤ－３または標的発現細胞の染色が含まれる。
発現させたポリペプチドをサイズ排除クロマトグラフィーに供したところ、凝集体、おそらくダイアボディを形成することが判明した。図２。
上記の実験により、以下の結果及び結論を得た。ＨＥＫ２９３細胞中のＰｒｏ１を除いて、４つのポリＨｉｓ標識Ｐｒｏｄｅｎｔタンパク質の各々の発現が観察された。このため、ポリペプチドは発現可能であった。Ｎｉ－ｅｘｃｅｌ樹脂は、発現培地からポリペプチドを精製するのに有用であった。次いで、試料をＰＢＳに対して透析し、ポリペプチド濃度をＡ２８０によって決定し、発現レベルを逆算した。精製されたポリＨｉｓ標識タンパク質の各々は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上に泳動させたときに予想される分子量を有した。透析したＮｉ－ｅｘｃｅｌ溶出試料について分析ＳＥＣを実施したが、Ｐｒｏ１及びＰｒｏ２は凝集傾向が強かった。ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、制限されたαＣＤ３ｓｃＦｖリンカーを有するＰｒｏ４は、Ｐｒｏ３陽性対照タンパク質と同等にＣＤ３εタンパク質に結合したため、リンカー制限により、条件的に活性なＴ細胞エンゲージャーは創出されなかった。
実施例２：第２世代ＰＲＯプラットフォームの調製及び特性
第２世代ＰＲＯプラットフォームポリペプチドは、ＶＬまたはＶＨドメインを有するように設計し、このＶＬまたはＶＨドメインは、そのポリペプチド配列を変化させることによって不活性（すなわち、本質的にＣＤ３結合がない）にした。例示的な第２世代Ｐｒｏポリペプチドを以下に示す。
プラットフォーム２（不活性化αＣＤ３ ｓｃＦｖ）
・Ｐｒｏ５－αＥＧＦＲ Ｇ８ ｓｄＡｂ－Ｉ２Ｃ ＶＨ－Ｆｌａｇ－Ｉ２ＣＶＬｉ－Ｆｌａｇ－
Ｉ２ＣＶＨｉ－Ｆｌａｇ－Ｉ２ＣＶＬ－αＥＧＦＲ Ｄ１２ ｓｄＡｂ－Ｈｉｓ６
・Ｐｒｏ６－αＥＧＦＲ Ｇ８ ｓｄＡｂ－Ｉ２Ｃ ＶＨ－Ｆｌａｇ－Ｉ２ ＣＶＬｉ－Ｈｉｓ６
・Ｐｒｏ７－Ｉ２ＣＶＨｉ－Ｆｌａｇ－Ｉ２ＣＶＬ－αＥＧＦＲ Ｄ１２ ｓｄＡｂ－Ｈｉｓ６
・Ｐｒｏ８－αＥＧＦＲ Ｇ８ ｓｄＡｂ－Ｉ２Ｃ ＶＨ－Ｆｌａｇ－Ｉ２ＣＶＬ－Ｈｉｓ６
Ｐｒｏ５の構造を図３に示す。Ｐｒｏ５は、未切断ポリペプチドがＥＧＦＲに良好に結合し、ＣＤ３に結合せず、かつＴ細胞依存性細胞傷害（ＴＤＣＣ）アッセイにおいて活性ではないと予想された。切断後、活性な抗ＣＤ－３ ｓｃＦｖの半分の両方がＥＧＦＲへの結合を介して癌細胞に繋留されることが予想された。２つの活性ｓｃＦｖドメインが相互作用して、ＴＤＣＣアッセイにおいて活性を示す構築物と共に活性ＣＤ－３結合ｓｃＦｖを形成する。
図４には、二官能性パートナーであるＰｒｏ６及びＰｒｏ７の構造が示されている。本明細書に記載される実験は、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ中のＶＨまたはＶＬのＣＤＲ２へのモデルプロテアーゼ切断部位（ＥＫ切断部位）の挿入により、ＣＤ３結合及び活性が無効になることを示した。切断されていない分子はＥＧＦＲに結合し、ＣＤ３に結合せず、かつＴＤＣＣアッセイにおいて活性ではないと予想された。切断後、Ｐｒｏ６及びＰｒｏ７は、無傷のＶＨ及びＶＬが両方ともＥＧＦＲを介して癌細胞に繋留されるため、活性分子を産生することになる。
不活性ＶＨを有する抗ＣＤ３ｅ ｓｃＦｖを産生させるために、Ｐｒｏ２１（Ｎ３０Ｓ、Ｋ３１Ｇ、Ｙ３２Ｓ、Ａ４９Ｇ、Ｙ５５Ａ、Ｎ５７Ｓ、Ｙ６１Ａ、Ｄ６４Ａ、Ｎ９７Ｋ、Ｎ１００Ｋ、Ｓ１１０Ａ、Ｙ１１１Ｆ）において以下の突然変異を作製した。Ｐｒｏ２９（Ｙ３２Ｓ、Ｙ６１Ａ、Ｄ６４Ａ、Ｓ１１０Ａ、Ｙ１１１Ｆ）；Ｐｒｏ３０（Ｙ３２Ｓ、Ｙ６１Ａ、Ｓ１１０Ｔ、Ｙ１１１Ｆ）；Ｐｒｏ３１（Ｎ３０Ｓ、Ｋ３１Ｇ、Ｙ５５Ａ、Ｎ５７Ｓ、Ｙ６１Ｅ、Ｄ６４Ａ、Ｆ１０４Ａ、Ｙ１０８Ａ）；Ｐｒｏ３２（Ｎ３０Ｓ、Ｋ３１Ｇ、Ｙ３２Ｈ、Ｙ５５Ａ、Ｎ５７Ｓ、Ｎ１０３Ａ、Ｆ１０４Ｎ）である。突然変異をＶＨのＣＤＲ領域に配置した：ＣＤＲ１中－Ｎ３０Ｓ、Ｋ３１Ｇ、Ｙ３２Ｓ、Ｙ３２Ｈ；ＣＤＲ２中－Ａ４９Ｇ、Ｙ５５Ａ、Ｎ５７Ｓ、Ｙ６１Ａ、Ｄ６４Ａ、Ｙ５５Ａ、Ｎ５７Ｓ、Ｙ６１Ｅ；ＣＤＲ３中－Ｎ９７Ｋ、Ｎ１００Ｋ、Ｎ１０３Ａ、Ｆ１０４Ｎ、Ｆ１０４Ａ、Ｙ１０８Ａ、Ｓ１１０Ａ、Ｓ１１０Ｔ、Ｙ１１１Ｆ。突然変異Ｎ３０Ｓ、Ｋ３１Ｇ、Ｙ３２Ｓ、Ｙ３２Ｈ、Ａ４９Ｇ、Ｙ５５Ａ、Ｎ５７Ｓ、Ｙ６１Ａ、Ｄ６４Ａ、Ｙ５５Ａ、Ｎ５７Ｓ、Ｙ６１Ｅは、ヒト生殖系列配列中の残基の出現、及び複合体中のＣＤ３に結合するときの界面上のそれらの可能性のある位置に基づいて選択した。ＣＤＲ３領域中の突然変異Ｎ１０３Ａ、Ｆ１０４Ｎ、Ｆ１０４Ａ、Ｙ１０８Ａを選んで、可能性のあるＶＨ－ＶＬ界面から離れ、ＣＤ３ｅ相互作用との可能性のある界面上のＣＤＲ３の表面露出部分上にあるようにした。突然変異Ｓ１１０Ａ、Ｓ１１０Ｔ、Ｙ１１１Ｆを選んで、可能性のあるＶＨ－ＶＬ界面を軽度に不安定化させ、領域のわずかな再構築を引き起こした。
発現時に、Ｐｒｏ２９～３２は、ＤＳＦによって測定して、Ｔｍ５３～５５℃で安定なタンパク質を産生した。Ｐｒｏ２１はうまく発現しなかった。
不活性ＶＬを有する抗ＣＤ３ｅ ｓｃＦｖを産生させるために、Ｐｒｏ２０（Ｎ３２Ｈ、Ｋ５４Ｓ、Ｆ５５Ｎ、Ｌ５６Ｋ、Ａ５７Ｈ、Ｐ５８Ｓ、Ｇ５９Ｗ、Ｗ９４Ｇ、Ｎ９６Ｒ）において以下の突然変異を作製した。突然変異をＶＬのＣＤＲ領域に配置した：ＣＤＲ１中－Ｎ３２Ｈ；ＣＤＲ２中－Ｋ５４Ｓ、Ｆ５５Ｎ、Ｌ５６Ｋ、Ａ５７Ｈ、Ｐ５８Ｓ、Ｇ５９Ｗ；ＣＤＲ３中－Ｗ９４Ｇ、Ｎ９６Ｒ。突然変異Ｎ３２Ｈ、Ｋ５４Ｓ、Ｆ５５Ｎ、Ｌ５６Ｋ、Ａ５７Ｈ、Ｐ５８Ｓ、Ｇ５９Ｗを、ヒト生殖系列配列中の残基の出現、及び複合体中のＣＤ３の結合に好ましくない影響を及ぼす界面上のそれらの可能性のある位置に基づいて選択した。ＣＤＲ３領域の突然変異Ｗ９４Ｇ、Ｎ９６Ｒを選んで、可能性のあるＶＨ－ＶＬ界面から離れたＣＤＲ３の表面露出部分上にあるようにした。
発現時に、Ｐｒｏ２０は安定したタンパク質を産生した。
Ｐｒｏ８は陽性対照である。Ｐｒｏ８を使用して、ｓｃＦｖリンカー中のモデルプロテアーゼ切断部位（ＥＫ切断部位）の挿入がｓｃＦｖの折り畳み及びＣＤ３結合を妨害しないことを確認した。図５。Ｐｒｏ８の切断されていない分子は、ＥＧＦＲに結合し、ＣＤ３に結合し、かつＴＤＣＣアッセイにおいて活性であるはずである。切断後、Ｐｒｏ８は、ＥＧＦＲへの結合を介して細胞表面に結合している切断された分子の各半分の協働的な影響がないことによってＶＨとＶＬとが分離するため、ＣＤ３結合を失うはずである。
４種類の結合／活性アッセイをポリペプチドに対して行った。例示的なアッセイを図９に示す。
モデルプロテアーゼ、エンテロキナーゼを利用して、活性及び不活性ＶＨドメイン及びＶＬドメインの間のプロテアーゼ切断部位で本発明の構築物を切断した。
結果
図６は、本発明の未精製ポリペプチド及び種々の対照のＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。ＰＡＧＥによって示されるように、ポリペプチドは十分に発現される。Ｐｒｏ５～８のサイズ排除クロマトグラフィーにより、凝集の欠如が示され、これらのＰｒｏ構造がモノマー種を形成する傾向があることを確認する。図７。ポリペプチドをＮｉ－ｅｘｃｅｌクロマトグラフィーによって精製すると、各ポリペプチドは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上で本質的に単一のバンドをもたらした。図８の表は、タンパク質の発現及び精製の結果を示す。
ＥＧＦＲ－ＥＬＩＳＡアッセイにより、プラットフォーム２のポリペプチドが、ＥＬＩＳＡアッセイ（図１０Ａ）においてＥＧＦＲに、また細胞上（図１０Ｂ）でＥＧＦＲに結合できることが示された。プラットフォーム２の不活性（すなわち、未切断）ポリペプチドは、Ｊｕｒｋａｔ細胞上のＣＤ３－ＥＬＩＳＡ及びＣＤ３－ＦＡＣＳによって確認されるように、ＣＤ３に結合しない。図１１Ａ及び図１１Ｂ。
Ｐｒｏ６及びＰｒｏ７は、プロテアーゼ切断によって活性化され、Ｐｒｏ６の不活性ＶＬｉ及びＰｒｏ７の不活性ＶＨｉを構築物中のそれらの対応するＶＨ及びＶＬパートナーから分離することが示された。切断されていない分子はＥＧＦＲに結合し、ＣＤ３に結合せず、かつＴＤＣＣアッセイにおいて活性ではなかった。切断後、Ｐｒｏ６とＰｒｏ７との混合物は、無傷のＶＨ及びＶＬが両方ともＥＧＦＲとの結合を介して癌細胞に繋留されるため、活性抗ＣＤ３ドメインを産生した。図１２。
エンテロキナーゼ（ＥＫ）はＳＤＳ－ＰＡＧＥによって示されるようにＰｒｏ５～８を切断することが示された。図１３．Ｐｒｏ６及びＰｒｏ７は、ＥＬＩＳＡによって、ＥＫ切断後にＣＤ３に協働的に結合することが示された。図１４。図１４Ｂ及び図１４Ｃは、それぞれ、個々のＰｒｏ６及びＰＲＯ７のＣＤ３への最小の結合を示す。アッセイと共に加えると、Ｐｒｏ６及びＰｒｏ７は、ＥＫ切断後に活性ＣＤ３結合ドメインの形成時にＣＤ３に協働的に結合した（図１４Ｄ）。このシナリオは、図１４Ｅに概略的に示されている。Ｐｒｏ６及びＰｒｏ７はまた、サンドイッチＦＡＣＳによって、ＥＫ切断後にＣＤ３に協働的に結合することが示された。したがって、図１５Ｂ及び図１５Ｃは、個々のＰｒｏ構築物がＣＤ３に結合しないことを示しているが、これらが組み合わされてＥＧＦＲを発現しているＯｖＣａｒ８細胞の表面上に活性ＣＤ３結合ドメインを形成する場合、これらは協働してＣＤ３に結合することができる（図１５Ｄ）。
全長構築物Ｐｒｏ５のＣＤ３結合は、ＥＫによる構築物のタンパク質分解的切断後に活性化される。図１６。
Ｐｒｏ８は、単一の標的結合ドメイン（抗ＥＧＦＲ）を有する陽性対照モデルである。このため、この構築物がプロテアーゼ切断部位で切断されるとき、活性ＣＤ３結合ドメインが形成されないため、ＣＤ３に結合する能力が失われる。標的結合ドメインに繋留されていないＶＬ部分は、活性なＣＤ３結合ドメインを生成するために、ＶＨとＶＬとの間の協働的な相互作用を生むのに十分に有効な様式で細胞に結合しない。切断の前に、Ｐｒｏ８は唯一のＥＧＦＲ結合ドメインを介してＥＧＦＲに結合し、活性ＣＤ３結合ドメインを介してＣＤ３に結合し、その結果、ＴＤＣＣアッセイにおいて活性である。切断後、切断された構築物は、ｓｃＦｖ成分間の弱い相互作用に起因してＣＤ３に結合する能力を失う。図１７。この結果を図１８Ａ及び図１８Ｂに示す。
Ｐｒｏ６、Ｐｒｏ７、及びＰｒｏ８のＴＤＣＣアッセイを図１９（Ａ～Ｄ）に示す。図１９Ａ及び図１９Ｂにおいて、Ｐｒｏ６及びＰｒｏ７単独についてのＴＤＣＣアッセイの結果が示される。ＥＫ切断後にこれらの単一構築物によって誘発されたＴ細胞媒介性細胞傷害性は本質的に存在しない。著しく対照的に、Ｐｒｏ６及びＰｒｏ７が組み合わされて切断されると、図１９Ｃに示されるように、顕著なＴ細胞の細胞傷害性が生じる。対照的に、Ｐｒｏ８がＥＫによって切断されると、細胞傷害性は減少する（図１９Ｄ）。
実施例３：複数の標的結合ドメインに対する結合依存性の評価
ＣＤ３に結合する構築物の能力に対する２つ以上の標的結合ドメインの重要性を評価するために実験を設計した。Ｐｒｏ２５～２７は、ＥＧＦＲ標的結合ドメインなしで設計され、これらのドメインは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）結合ドメインによって置換されている。図２０。抗ＧＦＰ結合ドメインを使用する動機の一部は、ＧＦＰがＯｖＣａｒ８細胞の表面上に発現しないことであった。抗ＧＦＰ含有ＰＲＯ構築物をＰｒｏ６及びＰｒｏ７と組み合わせ、ＥＫを用いてプロテアーゼ切断に供した。図２１Ｃ（Ｐｒｏ６＋Ｐｒｏ２６）、図２１Ｄ（Ｐｒｏ６＋Ｐｒｏ２７）、図２１Ｅ（図７＋２５）、及び図２１Ｆ（Ｐｒｏ９＋２５）に示されるように、ＥＫ切断後、これらの構築物によるＣＤ３の結合は本質的に存在しない。このため、切断された構築物が結合して活性ＣＤ３結合ドメインを形成するためには、各Ｐｒｏ成分が少なくとも１つの標的結合ドメインを含むことが必要である。
実施例４：代替プロテアーゼ及び切断部位の評価
上で考察した現象がＥＫ及びそのコンセンサス切断部位のみに依存しないことを確認するために、Ｐｒｏ構築物を、マトリプターゼを含む代替プロテアーゼのためのプロテアーゼ切断部位を用いて設計した。Ｐｒｏ８ ＭＳ及びＰｒｏ８ＭＬは、それぞれ、１４アミノ酸マトリプターゼ感受性リンカーと、２４アミノ酸マトリプターゼ感受性リンカーとを含む。リンカーは、構築物のＶＨドメインとＶＬドメインとの間にある。前の実施例に記載した方法を使用して、Ｐｒｏ８、Ｐｒｏ８ ＭＳ、及びＰｒｏ８ ＭＬは全て、関連するリンカー特異的プロテアーゼによる切断の前後で同等の結合特性を有することが示された。このため、切断の前に、構築物の各々は、ＥＧＦＲに結合し、ＣＤ３に結合し、かつＴＤＣＣアッセイにおいて活性である。切断後、ＣＤ３結合活性及びＴＤＣＣアッセイにおける活性は、弱いｓｃＦｖ相互作用に起因して失われる。この実験の結果を、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す図２３、ＦＡＣＳアッセイの結果を示す図２４に示す。
上で考察した結果により、本発明の構築物が真核生物のプラットフォームにおいて良好に発現されることが示される。α－ＣＤ３ ｓｃＦｖ（ＶＨまたはＶＬ）のＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ２）への例示的なプロテアーゼ（例えば、ＥＫ）切断部位（Ｆｌａｇ）の挿入により、α－ＣＤ３ ｓｃＦｖは効率的に不活性化される。プロテアーゼ切断部位での切断により、機能的ＣＤ３結合部位の形成が生じる。例示的なＰｒｏ対（Ｐｒｏ６及びＰｒｏ７）において、ＣＤ３結合部位は、Ｐｒｏ６及びＰｒｏ７が近接している場合にのみ形成される。これらの結果は、標的抗原をコーティングしたＥＬＩＳＡプレート及び標的抗原を発現している癌細胞を使用して得た（ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、及びＴＤＣＣデータに基づく）。
実施例５：結合に対するＰｒｏ配向の関連性の検討
Ｐｒｏの配向（Ｎ－末端からＣ－末端へのドメインの順序）がＰｒｏの結合能に深く関連するかどうかを、追加のＰｒｏモチーフを利用して検討した（図２５）。この図において、Ｐｒｏ１０はＰｒｏ６の逆位類似体であり、Ｐｒｏ９はＰｒｏ７の逆位類似体である。Ｐｒｏ８、Ｐｒｏ１１、及びＰｒｏ１５（ＯＫＴ３）は、完全に活性なα－ＣＤ３ ｓｃＦｖである。図２５は、不完全であり、ＥＧＦＲに結合するがＣＤ３に結合しない、Ｐｒｏ６、Ｐｒｏ７、Ｐｒｏ９、Ｐｒｏ１０、Ｐｒｏ１２、及びＰｒｏ１４の組み合わせを示す表である。不完全なＣＤ３対のＣＤ３結合の欠如は、サンドイッチＥＬＩＳＡによって示された（図２６）。
Ｐｒｏ６とＰｒｏ９とが組み合わされてプロテアーゼ切断に供されると、それらは機能的ＣＤ３結合ドメインを形成する（図２７）。Ｐｒｏ６＋Ｐｒｏ９は、Ｐｒｏ６＋Ｐｒｏ７と比較して同等の結合特性を示す（図２８、２９）。
Ｐｒｏ構築物の結合及び活性における単一特異的ドメイン対二重標的化ドメインの関連性も検討した。Ｐｒｏ９及びＰｒｏ１４は、各々同じＥＧＦＲ結合ドメインを有し、これらを組み合わせて切断した（図３０）。図３１Ａは、非切断型及びＥＫ切断型Ｐｒｏ９＋Ｐｒｏ１４のＦＡＣＳデータを示し、図３１Ｂは、Ｐｒｏ６＋Ｐｒｏ７の同様のデータを示す。
各Ｐｒｏが異なるＥＧＦＲ結合ドメインを有するＰｒｏ構築物対も調製し、試験した。図３２Ａは、ＥＧＦＲ及びＣＤ３結合ドメインを有するＰｒｏ対を提示する表を提供する。その対の各メンバーが異なるＥＧＦＲ結合ドメインを示す第１のＰｒｏ対のセットも調製し、切断した。この対のメンバーは、異なる結合ドメインを介して同じＥＧＦＲ分子への結合（「シス」結合）を受け、異なる結合ドメインを介して異なるＥＧＦＲ分子への結合（「トランス」結合）を受けると仮定される（図３２Ｂ）。対の各メンバー上で同じＥＧＦＲ結合ドメインを示す第２のＰｒｏ構築物のセットを組み立てた。このシナリオでは、ＥＧＦＲ部位上の標的結合部位がその対の一方のメンバーのＥＧＦＲ結合ドメインによって占有されるため、対のメンバーは異なるＥＧＦＲ分子に結合しなければならない（「トランス」結合）。図３２Ｃ。これらの対についてのサンドイッチＥＬＩＳＡは、Ｐｒｏ６＋Ｐｒｏ７（図３３Ａ）、Ｐｒｏ９＋Ｐｒｏ１０（図３３Ｂ）、Ｐｒｏ１２＋Ｐｒｏ１４（図３３Ｃ）、Ｐｒｏ７＋Ｐｒｏ１０（図３３Ｄ）、及びＰｒｏ６＋Ｐｒｏ９（図３３Ｅ）でシス及びトランス両方の結合を示した。対照的に、トランスのみの結合は、Ｐｒｏ６＋Ｐｒｏ１２（図３４Ａ）、Ｐｒｏ７＋Ｐｒｏ１４（図３４Ｂ）、Ｐｒｏ９＋Ｐｒｏ１４（図３４Ｃ）、及びＰｒｏ１０＋Ｐｒｏ１２（図３４Ｄ）で示された。興味深いことに、シス及びトランス結合するＰｒｏ対の切断後の活性と、トランス結合のみのものとは類似している。ＴＤＣＣアッセイの結果を図３５に示す。図３５Ａ（シス＋トランス）、図３５Ｂ（トランスのみ）。図３６に示すように、陽性対照Ｐｒｏ構築物は、おそらく、ＣＤ３結合ドメインの２つの成分を近接させるために機能的なＥＧＦＲ結合部位を有する対の各メンバーなくして機能的なＣＤ３結合部位を形成することができないため、ＥＫ切断後に活性を失う。
実施例６：プロテアーゼを発現している細胞による切断
この実施例では、ＥＫを発現しているベクターをルシフェラーゼ＋ＯＶＣＡＲ８細胞にトランスフェクトし、タンパク質を安定に発現しているクローンを選択した。１００個のクローンを選択し、ＦＡＣＳ（α－Ｈｉｓ６－ＦＩＴＣ）により陽性を確認した。高、中、及び低発現細胞に対応する細胞試料を保存した。これらの細胞試料を、サンドイッチＦＡＣＳ、サンドイッチＭＳＤ、及びＴＤＣＣを使用して、選定した本発明のポリペプチド構築物に対して試験した。
図３７は、ＯｖＣａｒ８－ｌｕｘ細胞におけるＥＫ－Ｈｉｓ６の安定した発現を示す。高、中、及び低発現コロニーを識別した。図３８。本発明の活性化されていないＰｒｏ構築物を細胞と接触させ、これはＰｒｏ構築物に用量依存的活性化を及ぼすことが示された（図３９）。ＭＳＤ（図３９Ａ）及びＦＡＣＳ（図３９Ｂ）の結果は同等である。ＥＫ発現のＦＡＣＳランキングは、Ｐｒｏ切断の予測因子である。
ＥＫを過剰発現するＯｖＣＡＲ８細胞を使用するＴＤＣＣは、未切断Ｐｒｏ構築物の存在下でＴ細胞細胞傷害性を活性化することが示された。図４０。ＥＫを過剰発現しない野生型ＯＶＣＡＲ８細胞は、顕著にＰｒｏ構築物を感知できるほどには活性化せず、未切断タンパク質を使用して最小限のＴ細胞媒介性細胞傷害性を生んだ（図４０Ａ）。対照的に、ＥＫを過剰発現するＯｖＣＡＲ８細胞は、未切断タンパク質を使用してＴ細胞媒介細胞傷害性を示した（図４０Ｂ）。
実施例７：α－ＣＤ３ ＶＨ及びＶＬの不活性化
図４１は、α－ＣＤ３ ｓｃＦｖの相同性モデルを示す。親ＶＨポリペプチドの配列及び最も相同な生殖系列配列に対するその一般的な整列を図４２Ａに示す。ＣＤ３への結合に対してこのポリペプチドを不活性化するように設計された例示的な変異体を図４２Ｂに示す。同様に、図４３は、ＣＤ３の親ＶＬポリペプチドの配列及び最も相同な生殖系列配列に対するその一般的な整列を示し、ポリペプチドをそのＣＤ３への結合に関して不活性にするように設計された例示的な変異体配列を提供する。
図４４Ａは、ＥＧＦＲ結合ドメイン、一方が不活性化されるＶＬドメイン及びＶＨドメイン（すなわち、ＶＬｉ、ＶＨｉ）、半減期延長ドメイン（α－ＨＡＳ）、ならびにＶＨドメインとＶＬドメインとの間のプロテアーゼ切断性Ｆｌａｇ部位を含む、本発明のある特定のポリペプチドＰｒｏ構築物の模式図を提供する。図４４Ｂは、これらの例示的なＰｒｏ種の結合活性を示す表である。Ｐｒｏ２２は、不活性化されたＶＨドメインもＶＬドメインも有しない陽性対照である。このＰｒｏは、活性化の前にＥＧＦＲとＣＤ３との両方に結合する。表に示されるように、他のＰｒｏ種のいずれも、プロテアーゼ活性化の前にＣＤ３に結合しない。
図４５はＰｒｏ２３（図４５Ａ）及びＰｒｏ２４（図４５Ｂ）の模式図を示し、それぞれが２つ以上のＦｌａｇ ＥＫ切断部位を含む。Ｐｒｏ２３はまた、トロンビン切断部位を含むことで、血漿中で切断されやすくなる。Ｐｒｏ２３の各「アーム」は、プロテアーゼ切断性Ｆｌａｇ部位によって分離された活性及び不活性ＣＤ３結合ドメインを含む。各「アーム」はまた、半減期延長ドメイン、例えば、α－ＨＳＡを含む。Ｐｒｏ２４から明らかなように、トロンビン切断性部位は、別の切断性部位、例えば、ＥＫ切断性部位によって代置することができる。図４６は、Ｐｒｏ２３及びＰｒｏ２４のプロテアーゼ切断に関するＳＤＳ－ＰＡＧＥデータを提供する。Ｐｒｏ２３及びＰｒｏ２４の活性に関するデータを図４７に提供する。図４７Ａは、Ｐｒｏ２３のＴＤＣＣ活性がトロンビンではなくＥＫ切断によって活性化され、その不活性パートナーからの活性ＣＤ３結合ドメインの分離がポリペプチド結合ＣＤ３に対する条件であることを示している。同様に、Ｐｒｏ２４はＥＫ切断によって活性化される（図４７Ｂ）。
実施例８：ＥＫ以外のプロテアーゼを使用した切断による活性化
Ｐｒｏポリペプチドで観察される切断／結合現象がＥＫ切断に限定されないことを確認するために、非ＥＫプロテアーゼ切断部位を有する追加のＰｒｏ種を設計し、試験した。試験化合物は、プロテアーゼ切断部位でポリペプチドの切断時にシグナルを生じる蛍光エネルギー移動対を含むように操作した。図４８～５２は、本研究のデータを示す。プロテアーゼＭＭＰ９は、腫瘍細胞において過剰発現されることが知られている。ペプチドは、ＭＭＰ９切断部位を含むように操作した。ペプチドＧＰＳＧＰＡＧＬＫＧＡＰＧ及びＧＰＰＧＰＡＧＭＫＧＬＰＧは、血清中で安定であり、組換えＭＭＰ９によって切断され、組換えマトリプターゼＳＴ１４、ＴＡＣＥ（ＡＤＡＭ１７）精製カテプシンＢ及びＤ（図４８）によって切断されない。
プロテアーゼであるメプリンの切断部位を含む追加のペプチドも設計し、試験した。図４９。ペプチドＧＹＶＡＤＡＰＫ及びＫＫＬＡＤＥＰＥは、血清中で安定であり、組換えＭｅｐ１Ａ及びＭｅｐ１Ｂによって切断され、組換えＭＭＰ９、ＴＡＣＥ（ＡＤＡＭ１７）、カテプシンＢによって切断されない。ペプチドＧＧＳＲＰＡＨＬＲＤＳＧＫはヒト血清中で安定であり、マウス及びカニクイザル血清中ではあまり安定ではなく、組換えＭｅｐ１Ａによって切断され、組換えＭＭＰ９によって部分的に切断されるが、ＡＤＡＭ１７、カテプシンＢ、マトリプターゼＳＴ１４によって切断されない。
マトリプターゼ切断に感受性のペプチドも設計し、試験した。図５０に示すように、いずれのペプチドも血清中で安定ではない。ペプチドＳＦＴＱＡＲＶＶＧＧ及びＬＳＧＲＳＤＮＨは、組換えマトリプターゼＳＴ１４によって切断されるが、ＭＭＰ９、ＴＡＣＥ（ＡＤＡＭ１７）、カテプシンＢによって切断されない。
血液プロテアーゼ（トロンビン、ニュートロフィルエラスターゼ、及びフリン）による切断に感受性のポリペプチドを設計し、試験した（図５１）。トロンビン－１ペプチド基質は、トロンビン（ヒト血漿から精製）によって非常に効果的に（低いＫｍ及び高いＶｍａｘで）切断される。エラスターゼ－１ペプチド基質は、組換え好中球エラスターゼによって非常に効果的に切断される。図５２は、血清中の血液プロテアーゼペプチド基質の切断に関するデータを示す。ペプチドであるトロンビン－１、トロンビン－２、及びフリン－２の切断は、ヒト血清中で最も効率的であった。好中球エラスターゼ基質の切断は、血清中に活性プロテアーゼを保有する好中球が存在しないために観察されなかった。
本発明の例示的な実施形態を本明細書に示し説明してきたが、そのような実施形態が例示としてのみ提供されることは、当業者には明らかであろう。当業者には、本発明から逸脱することなく、数多くの変形、変更、及び置換が想起されるであろう。本明細書に記載される本発明の実施形態に対する種々の代替物が、本発明の実施において採用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲内の方法及び構造、ならびにそれらの均等物がそれによって網羅されることが意図される。
一時的に発現されるＰｒｏｄｅｎｔ１～４のＳＤＳ－ＰＡＧＥプロファイルを示す。 透析後に逆算したＰｒｏ１～４発現レベルを示す。 精製されたタンパク質の分析的サイズ排除クロマトグラフィーを示す。 精製されたタンパク質の分析的サイズ排除クロマトグラフィーを示す。 精製されたタンパク質の分析的サイズ排除クロマトグラフィーを示す。 精製されたタンパク質の分析的サイズ排除クロマトグラフィーを示す。 Ｐｒｏ５：Ｐｒｏｄｅｎｔプラットフォーム２を示す。 Ｐｒｏ６及びＰｒｏ７：二機能性パートナーを示す。図４は、抗ＣＤ３ｓｃＦｖ中のＶＨまたはＶＬのＣＤＲ２へのＥＫ切断部位の挿入が、ＣＤ－３結合及び活性を無効にすることを確認する。 Ｐｒｏ８：陽性対照を示す。図５は、ｓｃＦｖリンカーにおけるＥＫ部位の挿入が、ｓｃＦｖ折り畳み及びＣＤ－３結合に干渉しないことを確認する。 Ｅｘｐｉ２９３におけるＰｒｏｄｅｎｔ５～８－の一時的な発現を示す。 精製されたＰｒｏｄｅｎｔ５～８が、ＳＥＣ上のモノマープロファイルを示すことを実証するデータである。図７Ａは、Ｐｒｏ５－Ｇ８：（Ｉ２ｃｉ）ｘ２：Ｄ１２：：Ｈｉｓ６を示す。 精製されたＰｒｏｄｅｎｔ５～８が、ＳＥＣ上のモノマープロファイルを示すことを実証するデータである。図７Ｂは、Ｐｒｏ６－Ｇ８（ｓｄＡｂ）：Ｉ２Ｃｉ：：Ｈｉｓ６を示す。 精製されたＰｒｏｄｅｎｔ５～８が、ＳＥＣ上の単量体プロフィールを示すことを示す。図７Ｃは、Ｐｒｏ７－Ｉ２Ｃｉ：Ｄ１２（ｓｄＡｂ）：：Ｈｉｓ６を示す。 精製されたＰｒｏｄｅｎｔ５～８が、ＳＥＣ上のモノマープロファイルを示すことを実証するデータである。図７Ｄは、Ｐｒｏ８－Ｇ８（ｓｄＡｂ）：Ｉ２Ｃｆｌａｇ：：Ｈｉｓ６を示す。 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上のＮｉエクセル精製されたプラットフォーム２タンパク質を示す。 ４つのタイプの結合／活性アッセイを示す。 プラットフォーム２ ＰｒｏｄｅｎｔがｈＥＧＦＲに結合することを示す。図１０Ａは、ＥＧＦＲへのＰｒｏｄｅｎｔの結合を示す－ＥＬＩＳＡ（ｒｈＥＧＦＲ－Ｆｃ、抗Ｈｉｓ－ＨＲＰ検出。 プラットフォーム２ ＰｒｏｄｅｎｔがｈＥＧＦＲに結合することを示す。図１０Ｂは、ＥＧＦＲへのＰｒｏｄｅｎｔの結合を示す－ＦＡＣＳ ＯＶＣＡＲ８抗Ｈｉｓ ＦＩＴＣ検出。 不活性なプラットフォーム２ Ｐｒｏｄｅｎｔが、ＣＤ３に結合しないことを示す。図１１Ａは、ＣＤ３へのＰｒｏｄｅｎｔの結合を示す－ＥＬＩＳＡ（ＣｙＣＤ３－Ｆｌａｇ－Ｆｃ、抗Ｈｉｓ－ＨＲＰ検出。 不活性なプラットフォーム２ Ｐｒｏｄｅｎｔが、ＣＤ３に結合しないことを示す。図１１Ａは、ＣＤ３へのＰｒｏｄｅｎｔの結合を示す－ＦＡＣＳジャーカット抗Ｈｉｓ－ＦＩＴＣ検出を使用して判定。 Ｐｒｏ６及びＰｒｏ７：プロテアーゼ切断によるＣＤ３結合の活性化を示す。 組換えエンテロキナーゼによるＰｒｏｄｅｎｔの切断を示す。 ＥＫ切断後のＣＤ３へのｐｒｏｄｅｎｔの結合を試験するためのＥＬＩＳＡアッセイフォーマットを示す（サンドイッチＥＬＩＳＡ）。 Ｐｒｏ６が、ＥＫ切断後にＣＤ３に結合しないことを示す（サンドイッチＥＬＩＳＡ）。図１４Ｂは、ビオチン－ｃｙＣＤ３：：Ｆｌａｇ：：ｈｕＦＣ、ＳＡＶ－ＨＲＰで検出されたｒＥＧＦＲ：：ｈｕＦＣへのＰｒｏ６の結合を示す。 Ｐｒｏ７が、ＥＫ切断後にＣＤ３に結合しないことを示す（サンドイッチＥＬＩＳＡ）。図１４Ｃは、ビオチン－ｃｙＣＤ３：：Ｆｌａｇ：：ｈｕＦＣ、ＳＡＶ－ＨＲＰで検出されたｒＥＧＦＲ：：ｈｕＦＣへのＰｒｏ７の結合を示す。 Ｐｒｏ６＋Ｐｒｏ７が、ＥＫ切断後にＣＤ３と協働的に結合することを示す（サンドイッチＥＬＩＳＡ）。図１４Ｄは、ビオチン－ｃｙＣＤ３：：Ｆｌａｇ：：ｈｕＦＣ、ＳＡＶ－ＨＲＰで検出されたｒＥＧＦＲ：：ｈｕＦＣへのＰｒｏ６＋Ｐｒｏ７の結合を示す。 Ｐｒｏ６＋Ｐｒｏ７が、ＥＫ切断後にＣＤ３と協働的に結合することを示す（サンドイッチＥＬＩＳＡ）。 ＥＧＦＲ発現細胞の表面上のＥＫ切断後のＣＤ３への結合を試験するためのＦＡＣＳアッセイフォーマットを示す（サンドイッチＦＡＣＳ）。 Ｐｒｏ６が、ＥＫ切断後にＣＤ３に結合しないことを示す（サンドイッチＦＡＣＳ）。図１５Ｂは、Ａ４８８－ｃｙＣＤ３：：Ｆｌａｇ：：ｈＦＣで検出されたＯＶＣＡＲ－８へのＥＫ消化Ｐｒｏ６の結合を示す。 Ｐｒｏ７が、ＥＫ切断後にＣＤ３に結合しないことを示す（サンドイッチＦＡＣＳ）。図１５Ｃは、Ａ４８８－ｃｙＣＤ３：：Ｆｌａｇ：：ｈＦＣで検出されたＯＶＣＡＲ－８へのＥＫ消化Ｐｒｏ７の結合を示す。 Ｐｒｏ６＋Ｐｒｏ７が、ＥＫ切断後にＣＤ３に協働的に結合することを示す（サンドイッチＦＡＣＳ）。図１５Ｄは、Ａ４８８－ｃｙＣＤ３：：Ｆｌａｇ：：ｈｕＦＣで検出されたＯＶＣＡＲ－８へのＥＫ消化Ｐｒｏ６＋Ｐｒｏ７の結合を示す。 Ｐｒｏ６＋Ｐｒｏ７が、ＥＫ切断後にＣＤ３に協働的に結合することを示す（サンドイッチＦＡＣＳ）。 Ｐｒｏ５によるＣＤ３結合が、ＥＫによるタンパク質分解切断後に活性化されることを示す。Ｐｒｏ５によるＣＤ３結合は、ＥＫによるタンパク質分解切断後に活性化される。図１６は、Ａ４８８－ｃｙＣＤ３：：Ｆｌａｇ：：ｈｕＦＣで検出されたＯＶＣＡＲ－８へのＥＫ消化Ｐｒｏ５の結合を示す。 Ｐｒｏ８：対照分子を示す。図１７は、ｓｃＦｖリンカーにおけるＥＫ部位の挿入が、ｓｃＦｖ折り畳み及びＣＤ３結合に干渉しないことを確認する。 Ｐｒｏ８：対照分子を示す。図１８Ａは、ｓｃＦｖリンカーにおけるＥＫ部位の挿入が、ｓｃＦｖ折り畳み及びＣＤ３結合に干渉しないことを確認する。図１８Ａは、ビオチン－ｃｙＣＤ３：：Ｆｌａｇ：：ｈｕＦＣ、ＳＡＶ－ＨＲＰで検出されたｒｈＥＧＦＲ：：ｈＦＣへのＰｒｏ８の結合を示す。 Ｐｒｏ８：対照分子を示す。図１８Ｂは、ｓｃＦｖリンカーにおけるＥＫ部位の挿入が、ｓｃＦｖ折り畳み及びＣＤ３結合に干渉しないことを確認する。図１８Ｂは、Ａ４８８－ｃｙＣＤ３：：ｆｌａｇ：：ｈＦＣで検出されたＯＶＣＡＲ－８へのＥＫ消化Ｐｒｏ８の結合を示す。 Ｐｒｏ８：陽性対照分子を示す。 ＥＫ切断が、Ｐｒｏ６＋Ｐｒｏ７でＥＧＦＲ＋標的細胞のＴ細胞殺滅を協働的に活性化するが、Ｐｒｏ８による殺滅を低減させることを示す。図１９Ａは、Ｐｒｏ６の結果を示す。 ＥＫ切断が、Ｐｒｏ６＋Ｐｒｏ７でＥＧＦＲ＋標的細胞のＴ細胞殺滅を協働的に活性化するが、Ｐｒｏ８による殺滅を低減させることを示す。図１９Ｂは、Ｐｒｏ７の結果を示す。 ＥＫ切断が、Ｐｒｏ６＋Ｐｒｏ７でＥＧＦＲ＋標的細胞のＴ細胞殺滅を協働的に活性化するが、Ｐｒｏ８による殺滅を低減させることを示す。図１９Ｃは、Ｐｒｏ６＋Ｐｒｏ７の結果を示す。 ＥＫ切断が、Ｐｒｏ６＋Ｐｒｏ７でＥＧＦＲ＋標的細胞のＴ細胞殺滅を協働的に活性化するが、Ｐｒｏ８による殺滅を低減させることを示す。図１９Ｄは、Ｐｒｏ８の結果を示す。 Ｐｒｏ２５を示す。 Ｐｒｏ２６を示す。 Ｐｒｏ２７を示す。 活性ＣＤ３結合ドメインの生成が、両方のアームの標的結合に依存することを示す。ＧＦＰは、ＯｖＣａｒ８細胞の表面上に発現されない。図２１Ａは、ｂ－ｃｙＣＤ３：：Ｆｌａｇ：：ｈＦＣ、ＳＡＶ－ＨＲＰで検出されたｒｈＥＧＦＲへのＰｒｏ６＋Ｐｒｏ７の結合を示す。 活性ＣＤ３結合ドメインの生成が、両方のアームの標的結合に依存することを示す。ＧＦＰは、ＯｖＣａｒ８細胞の表面上に発現されない。図２１Ｂは、ｂ－ｃｙＣＤ４：：Ｆｌａｇ：：ｈＦＣ、ＳＡＶ－ＨＲＰで検出されたｒｈＥＧＦＲへのＰｒｏ６＋Ｐｒｏ９の結合を示す。 活性ＣＤ３結合ドメインの生成が、両方のアームの標的結合に依存することを示す。ＧＦＰは、ＯｖＣａｒ８細胞の表面上に発現されない。図２１Ｃは、ｂ－ｃｙＣＤ３：：Ｆｌａｇ：：ｈＦＣ、ＳＡＶ－ＨＲＰで検出されたｒｈＥＧＦＲへのＰｒｏ６＋Ｐｒｏ２６の結合を示す。 活性ＣＤ３結合ドメインの生成が、両方のアームの標的結合に依存することを示す。ＧＦＰは、ＯｖＣａｒ８細胞の表面上に発現されない。図２１Ｄは、ｂ－ｃｙＣＤ３：：Ｆｌａｇ：：ｈＦＣ、ＳＡＶ－ＨＲＰで検出されたｒｈＥＧＦＲへのＰｒｏ６＋Ｐｒｏ２７の結合を示す。 活性ＣＤ３結合ドメインの生成が、両方のアームの標的結合に依存することを示す。ＧＦＰは、ＯｖＣａｒ８細胞の表面上に発現されない。図２１Ｅは、ｂ－ｃｙＣＤ３：：Ｆｌａｇ：：ｈＦＣ、ＳＡＶ－ＨＲＰで検出されたｒｈＥＧＦＲへのＰｒｏ７＋Ｐｒｏ２５の結合を示す。 活性ＣＤ３結合ドメインの生成が、両方のアームの標的結合に依存することを示す。ＧＦＰは、ＯｖＣａｒ８細胞の表面上に発現されない。図２１Ｆは、ｂ－ｃｙＣＤ３：：Ｆｌａｇ：：ｈｕＦＣ、ＳＡＶ－ＨＲＰで検出されたｒｈＥＧＦＲへのＰｒｏ９＋Ｐｒｏ２５の結合を示す。 マトリパ－ゼ（ｍａｔｒｉｐａｓｅ）（Ｍ）切断部位を有するＰｒｏ８、及び親Ｐｒｏ８の切断後に癌細胞と相互作用する切断されたＰｒｏ８の生成物を示す。図２２は、αＣＤ３ｓｃＦｖリンカーが修飾されて、異なる長さ及びプロテアーゼ特異性を組み込むことができることを実証する。 ビオチン－ｃｙＣＤ３Ｅ：：Ｆｌａｇ：：ｈｕＦＣ、ＳＡＶ－ＨＲＰを用いたＥＫ切断前後に検出された、ｒｈＥＧＦＲ：：ｈＦＣへのサンドイッチＥＬＩＳＡのＰｒｏ８の結合からのデータを示す。 は、ビオチン－ｃｙＣＤ３Ｅ：：Ｆｌａｇ：：ｈｕＦＣ、ＳＡＶ－ＨＲＰを用いたマトリプターゼ切断前後に検出された、ｒｈＥＧＦＲ：：ｈＦＣへのサンドイッチＥＬＩＳＡのＰｒｏ８ ＭＳ（１４ａａリンカー）の結合からのデータを示す。 ビオチン－ｃｙＣＤ３Ｅ：：Ｆｌａｇ：：ｈｕＦＣ、ＳＡＶ－ＨＲＰを用いたＳＴ１４切断前後に検出された、ｒｈＥＧＦＲ：：ｈＦＣへのサンドイッチＥＬＩＳＡのＰｒｏ８ ＭＬ（２４ａａリンカー）の結合からのデータを示す。 ＡＦ４８８－ｃｙＣＤ３：：Ｆｌａｇ：：ｈＦＣで検出されたＯｖＣＡＲ８への、ＥＫによる切断前後のＰｒｏ８の結合からのＦＡＣＳデータである。 ＡＦ４８８－ｃｙＣＤ３：：Ｆｌａｇ：：ｈＦＣで検出されたＯｖＣＡＲ８への、ＳＴ１４による切断前後のＰｒｏ８ ＭＳ（１４ａａリンカー）の結合からのＦＡＣＳデータである。 ＡＦ４８８－ｃｙＣＤ３：：Ｆｌａｇ：：ｈＦＣで検出されたＯｖＣＡＲ８への、ＳＴ１４による切断前後のＰｒｏ８ ＭＬ（２４ａａリンカー）の結合からのＦＡＣＳデータである。 代表的なＰｒｏｄｅｎｔの概略図を示す。図２５は、完全に活性なαＣＤ３ ｓｃＦｖｓ Ｉ２Ｃ（Ｐｒｏ８、Ｐｒｏ１１）、及びＯＫＴ３（Ｐｒｏ１５）を示す。 活性ＣＤ３結合部位を欠いている、代表的な不完全なαＣＤ３ Ｐｒｏｄｅｎｔの組み合わせを示す。 ビオチン－ｃｙＣＤ４：：Ｆｌａｇ：：ＦＣ、ＳＡＶ－ＨＲＰで検出されたｒｈＥＧＦＲへのＰｒｏ６＋Ｐｒｏ１０の結合を示す。 ビオチン－ｃｙＣＤ４：：Ｆｌａｇ：：ＦＣ、ＳＡＶ－ＨＲＰで検出されたｒｈＥＧＦＲへのＰｒｏ６＋Ｐｒｏ１４の結合を示す。 ビオチン－ｃｙＣＤ４：：Ｆｌａｇ：：ＦＣ、ＳＡＶ－ＨＲＰで検出されたｒｈＥＧＦＲへのＰｒｏ７＋Ｐｒｏ９の結合を示す。 ビオチン－ｃｙＣＤ４：：Ｆｌａｇ：：ＦＣ、ＳＡＶ－ＨＲＰで検出されたｒｈＥＧＦＲへのＰｒｏ７＋Ｐｒｏ１２の結合を示す。 ビオチン－ｃｙＣＤ４：：Ｆｌａｇ：：ＦＣ、ＳＡＶ－ＨＲＰで検出されたｒｈＥＧＦＲへのＰｒｏ９＋Ｐｒｏ１２の結合を示す。 ビオチン－ｃｙＣＤ４：：Ｆｌａｇ：：ＦＣ、ＳＡＶ－ＨＲＰで検出されたｒｈＥＧＦＲへのＰｒｏ１０＋Ｐｒｏ１４の結合を示す。 Ｎ末端～Ｃ末端標的ドメインの位置、及びＣＤ３結合におけるＰｒｏドメインの配向の効果の変化を伴う、代表的なＰｒｏ構造を示す。 Ｃ末端対Ｎ末端の標的結合ドメインが、類似の活性を有することを示す。図２９Ａは、Ｐｒｏ６＋Ｐｒｏ９のＯＶＣＡＲ８結合からのＦＡＣＳデータを示す。 Ｃ末端対Ｎ末端の標的結合ドメインが、類似の活性を有することを示す。図２９Ｂは、Ａ４８８－ｃｙＣＤ３：：Ｆｌａｇ：：ｈｕＦＣで検出されたＯＶＣＡＲ－８へのＥＫ消化Ｐｒｏ６＋Ｐｒｏ７の結合を示す。 単一特異的対二重標的化ドメインの効果を調べるために使用される代表的なＰｒｏ構造を示す。 二重標的化は、別個の標的分子に結合しなければならないｓｄＡｂで実現可能である。図３１Ａは、ＡＦ４８８－ｃｙＣＤ３で検出されたＰｒｏ９＋Ｐｒｏ１４のＯＶＣＡＲ８への結合に関するＦＡＣＳデータを示す。 二重標的化は、別個の標的分子に結合しなければならないｓｄＡｂで実現可能である。図３１Ｂは、ＡＦ４８８－ｃｙＣＤ３：：Ｆｌａｇ：：ｈｕＦＣで検出されたＯＶＣＡＲ－８へのＥＫ消化Ｐｒｏ６＋Ｐｒｏ７の結合を示す。 相補的なαＣＤ３ドメインを有する代表的なＰｒｏｄｅｎｔの組み合わせを示す。 相補的なαＣＤ３ドメインを有する代表的なＰｒｏｄｅｎｔの組み合わせ、すなわち、Ｐｒｏ６＋Ｐｒｏ９（単一シス＋二重トランス分子標的化）を示す。 相補的なαＣＤ３ドメインを有する代表的なＰｒｏｄｅｎｔの組み合わせ、すなわち、Ｐｒｏ９＋Ｐｒｏ１４（二重分子－トランスのみの標的化）を示す。 ＡＦ４８８－ｃｙＣＤ３で検出されたＰｒｏ６＋Ｐｒｏ７のＯＶＣＡＲ８結合に関するＦＡＣＳデータを示す。 ＡＦ４８８－ｃｙＣＤ３で検出されたＰｒｏ９＋Ｐｒｏ１０のＯＶＣＡＲ８結合に関するＦＡＣＳデータを示す。 ＡＦ４８８－ｃｙＣＤ３で検出されたＰｒｏ１２＋Ｐｒｏ１４のＯＶＣＡＲ８結合に関するＦＡＣＳデータを示す。 ＡＦ４８８－ｃｙＣＤ３で検出されたＰｒｏ７＋Ｐｒｏ１０のＯＶＣＡＲ８結合に関するＦＡＣＳデータを示す。 ＡＦ４８８－ｃｙＣＤ３で検出されたＰｒｏ６＋Ｐｒｏ９のＯＶＣＡＲ８結合に関するＦＡＣＳデータを示す。 ＡＦ４８８－ｃｙＣＤ３で検出されたＰｒｏ６＋Ｐｒｏ１２のＯＶＣＡＲ８結合のサンドイッチＦＡＣＳ（トランスのみの結合）からのデータを示す。 ＡＦ４８８－ｃｙＣＤ３で検出されたＰｒｏ７＋Ｐｒｏ１４のＯＶＣＡＲ８結合のサンドイッチＦＡＣＳ（トランスのみの結合）のデータを示す。 ＡＦ４８８－ｃｙＣＤ３で検出されたＰｒｏ９＋Ｐｒｏ１４のＯＶＣＡＲ８結合のサンドイッチＦＡＣＳ（トランスのみの結合）のデータを示す。 ＡＦ４８８－ｃｙＣＤ３で検出されたＰｒｏ１０＋Ｐｒｏ１２のＯＶＣＡＲ８結合のサンドイッチＦＡＣＳ（トランスのみの結合）からのデータを示す。 ＴＤＣＣ：シス＋トランス及びトランスのみの活性が類似していることを示す。図３５Ａは、切断された、及び切断されていないＴＤＣＣ ＯＶＣＡＲ８ ＬｕｃＢシス結合Ｐｒｏｄｅｎｔを示す。（Ｐｒｏ６＋Ｐｒｏ７、Ｐｒｏ６＋Ｐｒｏ９、Ｐｒｏ７＋Ｐｒｏ１０）。 ＴＤＣＣ：シス＋トランス及びトランスのみの活性が類似していることを示す。図３５Ｂは、切断された、及び切断されていないＴＤＣＣ ＯＶＣＡＲ８ ＬｕｃＢトランス結合Ｐｒｏｄｅｎｔを示す。（Ｐｒｏ９＋Ｐｒｏ１４；Ｐｒｏ６＋Ｐｒｏ１８） ＴＤＣＣ－陽性対照Ｐｒｏｄｅｎｔが、ＥＫ切断後に活性を失うことを示す：切断された、及び切断されていないＰｒｏｄｅｎｔ８、１１、１５でのＯＶＣＡＲ８ ＬｕｃＢ細胞の死滅に関するＴＤＣＣデータ。 ＯＶＣＡＲ８－ｌｕｘ細胞の単一ピークにおけるＥＫ－Ｈｉｓ６の安定した発現は、非トランスフェクト細胞上のＥＫ発現に対して染色され、延長された曲線は、ＥＫ発現ベクターで安定的にトランスフェクトされた細胞上のＥＫ発現に対して染色される。 ＥＫ発現ＯＶＣＡＲ８クローン（高発現、中発現、及び低発現）を示す。 ＥＫ発現ＯＶＣＡＲ８細胞による用量依存的なＰｒｏｄｅｎｔ活性化を示す。図３９Ａは、標識されたｃｙＣＤ３εを使用して検出された、ＥＫ発現ＯＶＣＡＲ－８クローンへの切断されていないＰｒｏ６＋Ｐｒｏ９の結合を示す。 ＥＫ発現ＯＶＣＡＲ８細胞による用量依存的なＰｒｏｄｅｎｔ活性化を示す。図３９Ｂは、蛍光標識ｃｙＣＤ３εを使用したＥＫ発現ＯＶＣＡＲ－８クローンへの切断されていないＰｒｏ６＋Ｐｒｏ９の結合に関するＦＡＣＳデータを示す。 ＥＫを伴う、または伴わないＰｒｏ６＋Ｐｒｏ９によるＯＶＣＡＲ８細胞のＴＤＣＣ殺滅データを示す。 Ｐｒｏ６＋Ｐｒｏ９によるＥＫ発現ＯＶＣＡＲ８クローンに関するＴＤＣＣデータを示す。 αＣＤ３ ＶＨ及びＶＬにおけるＣＤＲ変化の不活性化を特定するために使用される構造モデルを示す：相同性モデルを示すαＣＤ３ｅ ｓｃＦｖの相同性モデリング、５ｆｘｃ．ｐｄｂを使用するＳｗｉｓｓ－Ｍｏｄｅｌ、ｓｃＦｖ－ＳＭ３、６９％同一性ＧＭＱＥ ０．７７ ＱＭＥＡＮ －１．１１。 αＣＤ３ ＶＨ及びＶＬにおけるＣＤＲ変化の不活性化を特定するために使用される構造モデルを示す：１ｘｉｗ．ｐｄｂ、ｓｃＦＶを有するヒトＣＤ３－ｅ／ｄ二量体とアライメントされる相同性モデルを示す、αＣＤ３ｅ ｓｃＦｖの相同性モデリング。 ＣＤ３ｅ結合（ＶＨドメイン）の代表的な配列、及び最も近いヒト生殖系列配列にアライメントさた不活性変異体を形成するための突然変異の領域を示す。 本発明の例示的なＰｒｏｄｅｎｔにおける不活性変異体ＣＤ３ｅ結合（ＶＨドメイン）の代表的な配列を示す。 ＣＤ３ｅ結合（ＶＬドメイン）の代表的な配列、及び不活性変異体を形成するための突然変異領域、ならびに最も近いヒト生殖系列配列にアライメントされた不活性変異体を形成するための例示的なアミノ酸部位を示す。 結合に関するｏｃｔｅｔアッセイにおける使用の例示的なＰｒｏｄｅｎｔを示す。 選択されたＰｒｏｄｅｎｔの結合活性を示す－ｏｃｔｅｔアッセイ。 Ｐｒｏ２３－２つの半分への血清切断を示し、Ｐｒｏ２３が、ＥＫ及びトロンビンによる切断に感受性であることを実証する。 Ｐｒｏ２４－２つの半分への腫瘍切断を示し、ＥＫ活性プロテアーゼ切断部位を示す。 （１）Ｐｒｏ２３の、ＥＫ（２）、ＥＫ及びトロンビン（３）、ならびにトロンビンのみ（４）による切断；Ｐｒｏ２４（５）のＥＫ（６）による切断を実証する、ＳＤＳ ＰＡＧＥからのデータを示す。 切断された、及び切断されていないＰｒｏ２３による、ＯＶＣＡＲ８の殺滅に関するＴＤＣＣデータを示す。 切断された、及び切断されていないＰｒｏ２４による、ＯＶＣＡＲ８の殺滅に関するＴＤＣＣデータを示す。 本発明のポリペプチド構築物における使用の代表的なｓｃＦｖ及びドメインリンカーの配列、ならびにこれらのリンカーの切断に関するデータを提供する。図４８Ａは、１ｎＭのＤａｂｃｙｌ－Ｅｄａｎｓ基質でのＭＭＰ９によるＭＭＰ９ペプチド基質の切断を示す。図４８Ｂは、マウス血清中のＭＭＰ９基質の切断を示す。図４８Ｃは、ヒト血清中のＭＭＰ９基質の切断を示す。図４８Ｄは、カニクイザル中のＭＭＰ９基質の切断を示す。 本発明のポリペプチド構築物における使用の代表的なリンカーに対する種々の例示的なポリペプチド配列のリストである。図４９Ａは、Ｍｅｐｒｉｎ１ａ ３ｎＭ）によるペプチド基質の切断を示す。図４９Ｂは、Ｍｅｐｒｉｎ１ｂ ３ｎＭ）によるペプチド基質の切断を示す。図４９Ｃは、Ｍｅｐｒｉｎ１ａ ３ｎＭ）によるペプチド基質の切断を示す。図４９Ｄは、ヒト血清中のペプチド基質の切断を示す。図４９Ｅは、マウス血清中のペプチド基質の切断を示す。図４９Ｆは、カニクイザル中のペプチド基質の切断を示す。 本発明のポリペプチド構築物における使用の代表的なリンカーに対する種々の例示的なポリペプチド配列のリストである。図５０Ａは、マトリプターゼＳＴ１４によるペプチド基質の切断を示す。図５０Ｂは、マウス血清中のペプチド基質の切断を示す。図５０Ｃは、ヒト血清中のペプチド基質の切断を示す。図５０Ｄは、カニクイザルにおけるペプチド基質の切断を示す。 血液プロテアーゼによって切断される本発明のポリペプチド構築物における使用の例示的なリンカー配列を示す。図５１Ａは、トロンビンによって切断された例示的なペプチド基質を示す。図５１Ｂは、フリンによって切断されたペプチド基質を示す。図５１Ｃは、好中球エラスターゼによって切断されたペプチド基質を示す。 血清によって切断される本発明のポリペプチド構築物における使用の例示的なリンカー配列を示す。図５２Ａは、ヒト血清中のペプチド基質の切断を示す。図５２Ｂは、マウス血清中のペプチド基質の切断を示す。図５２Ｃは、カニクイザル中のペプチド基質の切断を示す。 本発明の例示的なポリペプチド構築物の構成要素部分の配置の柔軟性を実証する。 ＮからＣ末端に向かって読み取ると、第１の標的抗原結合ドメイン（α－Ｔ１）が、ドメインリンカーを通じて、第１のＣＤ－３ ＶＬ結合ドメインに結合され、これが、次に、切断可能なドメインリンカー（ＣＬ１）を通じて、第１の不活性ＣＤ－３ ＶＨｉ結合ドメインに結合される、第１のフォーマットを表示する。ＣＬ１はまた、第１の半減期延長ドメイン（ＨＥＤ）にも結合しており、これは、それ自体が、第２のＣＤ－３ ＶＨ結合ドメインに結合した、第２の標的抗原結合ドメイン（α－Ｔ２）に、ドメインリンカーを通じて結合している。第２のＣＤ－３ ＶＨ結合ドメインは、不活性であり、第２の半減期延長ドメインにも結合している第２のＣＤ－３ ＶＬ結合ドメイン（ＶＬｉ）に、切断可能なドメインリンカー（ＣＬ２）を通じて結合する。ポリペプチドのＣ末端は、１、２、３、４、５、６、７、８、９ １０個以上のアミノ酸のブロック基、例えば、Ｈｉｓ６を任意選択で含む。 ＮからＣ末端に向かって読み取ると、第２の標的抗原結合ドメイン（α－Ｔ２）が、第１のＣＤ－３ ＶＬ結合ドメインに結合され、これが、次に、切断可能なドメインリンカー（ＣＬ１）を通じて、第１の不活性ＣＤ－３ ＶＨｉ結合ドメインに結合される、第２のフォーマットを表示する。ＣＤ－３ ＶＨはまた、第１の半減期延長ドメインにも結合しており、これは、それ自体が、第２のＣＤ－３ ＶＨ結合ドメインに結合した、第１の標的抗原結合ドメイン（α－Ｔ１）に、ドメインリンカーを通じて結合している。第２のＣＤ－３ ＶＨ結合ドメインは、不活性であり、第２の半減期延長ドメインにも結合している第２のＣＤ－３ ＶＬ結合ドメイン（ＶＬｉ）に、切断可能なリンカー（ＣＬ２）を通じて結合する。ポリペプチドのＣ末端は、１、２、３、４、５、６、７、８、９ １０個以上のアミノ酸のブロック基、例えば、Ｈｉｓ６を任意選択で含む。 ＮからＣ末端に向かって読み取ると、第１の標的抗原結合ドメイン（α－Ｔ１）が、第１のＣＤ－３ ＶＨ結合ドメインに結合され、これが、次に、切断可能なドメインリンカー（ＣＬ１）を通じて、第１の不活性ＣＤ－３ ＶＬｉ結合ドメインに結合される、第３のフォーマットを表示する。ＣＤ３ ＶＬｉはまた、第１の半減期延長ドメインにも結合しており、これは、それ自体が、第２のＣＤ－３ ＶＬ結合ドメインに結合した、第２の標的抗原結合ドメイン（α－Ｔ２）に、ドメインリンカーを通じて結合している。第２のＣＤ－３ ＶＬ結合ドメインは、不活性であり、第２の半減期延長ドメインにも結合している第２のＣＤ－３ ＶＨ結合ドメイン（ＶＨｉ）に、切断可能なリンカー（ＣＬ２）を通じて結合する。ポリペプチドのＣ末端は、１、２、３、４、５、６、７、８、９ １０個以上のアミノ酸のブロック基、例えば、Ｈｉｓ６を任意選択に含む。 ＮからＣ末端に向かって読み取ると、第２の標的抗原結合ドメイン（α－Ｔ２）が、第１のＣＤ－３ ＶＨ結合ドメインに結合され、これが、次に、切断可能なリンカー（ＣＬ１）を通じて、第１の不活性ＣＤ－３ ＶＬｉ結合ドメインに結合される、第４のフォーマットを表示する。ＣＤ－３ ＶＬｉはまた、第１の半減期延長ドメインにも結合しており、これは、それ自体が、第２のＣＤ－３ ＶＬ結合ドメインに結合した、第１の標的抗原結合（α－Ｔ１）に、ドメインリンカーを通じて結合している。第２のＣＤ－３ ＶＨ結合ドメインは、不活性であり、第２の半減期延長ドメインにも結合している第２のＣＤ－３ ＶＨ結合ドメイン（ＶＨｉ）に、切断可能なドメインリンカー（ＣＬ２）を通じて結合する。ポリペプチドのＣ末端は、１、２、３、４、５、６、７、８、９ １０個以上のアミノ酸のブロック基、例えば、Ｈｉｓ６を任意選択で含む。 ＮからＣ末端に向かって読み取ると、第１の半減期延長ドメインが、不活性であり、かつ第１の切断可能なリンカー（ＣＬ１）を通じて、第１の標的抗原結合ドメイン（α－Ｔ１）に連結された第１のＣＤ－３ ＶＬ結合ドメインに連結されている、第１のＣＤ－３ ＶＨ結合ドメイン（ＶＨｉ）に連結されている、第５のフォーマットを表示する。第１の標的抗原結合ドメインは、ドメインリンカーを通じて、第２の半減期延長ドメインに連結され、これは、不活性であり、かつそれ自体が、第２の標的抗原結合ドメイン（α－Ｔ２）に結合した第２のＣＤ－３ ＶＨドメインに、第２の切断可能なドメインリンカー（ＣＬ２）を通じて結合されている、第２のＣＤ－３ ＶＬ結合ドメイン（ＶＬｉ）に連結される。ポリペプチドのＣ末端は、１、２、３、４、５、６、７、８、９ １０個以上のアミノ酸のブロック基、例えば、Ｈｉｓ６を任意選択で含む。 ＮからＣ末端に向かって読み取ると、第１の半減期延長ドメインが、不活性であり、かつ第１の切断可能なリンカー（ＣＬ１）を通じて、第２の標的抗原結合（α－Ｔ２）に連結された第１のＣＤ－３ ＶＬ結合ドメインに結合されている、第１のＣＤ－３ ＶＨ結合ドメイン（ＶＨｉ）に連結されている、本発明のポリペプチド構築物の例示的なフォーマットを示す。第２の標的抗原結合ドメインは、ドメインリンカーを通じて、第２の半減期延長ドメインに連結され、これは、不活性であり、かつ、それ自体が、第１の標的抗原結合ドメイン（α－Ｔ１）に結合した第２のＣＤ－３ ＶＨドメインに、第２の切断可能なドメインリンカー（ＣＬ２）を通じて結合されている、第２のＣＤ－３ ＶＬ結合ドメイン（ＶＬｉ）に連結される。ポリペプチドのＣ末端は、１、２、３、４、５、６、７、８、９ １０個以上のアミノ酸のブロック基、例えば、Ｈｉｓ６を任意選択で含む。 ＮからＣ末端に向かって読み取ると、第１の半減期延長ドメインが、不活性であり、かつ第１の切断可能なリンカー（ＣＬ１）を通じて、第１の標的抗原結合ドメイン（α－Ｔ１）に連結された第１のＣＤ－３ ＶＨ結合ドメインに結合されている、第１のＣＤ－３ ＶＬ結合ドメイン（ＶＬｉ）に連結されている、本発明のポリペプチド構築物の第７の例示的なフォーマットを示す。第１の標的抗原結合ドメインは、ドメインリンカーを通じて、第２の半減期延長ドメインに連結され、これは、不活性であり、かつそれ自体が、第２の標的抗原結合ドメイン（α－Ｔ２）に結合した第２のＣＤ－３ ＶＬドメインに、第２の切断可能なリンカー（ＣＬ２）を通じて結合されている、ＣＤ－３ ＶＨ結合ドメイン（ＶＨｉ）に連結される。ポリペプチドのＣ末端は、１、２、３、４、５、６、７、８、９ １０個以上のアミノ酸のブロック基、例えば、Ｈｉｓ６を任意選択で含む。 ＮからＣ末端に向かって読み取ると、第１の半減期延長ドメインが、不活性であり、かつ第１の切断可能なリンカー（ＣＬ１）を通じて、第２の標的抗原結合ドメイン（α－Ｔ２）に連結された第１のＣＤ－３ ＶＨ結合ドメインに結合されている、第１のＣＤ－３ ＶＬ結合ドメイン（ＶＬｉ）に連結されている、本発明のポリペプチド構築物の第８の例示的なフォーマットを示す。第２の標的抗原結合ドメインは、ドメインリンカーを通じて、第２の半減期延長ドメインに連結され、これは、不活性であり、かつそれ自体が、第１の標的抗原結合ドメイン（α－Ｔ１）に結合した第２のＣＤ－３ ＶＬドメインに、第２の切断可能なリンカー（ＣＬ－２）を通じて結合されている、第２のＣＤ－３ ＶＨ結合ドメイン（ＶＨｉ）に結合される。ポリペプチドのＣ末端は、１、２、３、４、５、６、７、８、９ １０個以上のアミノ酸のブロック基、例えば、Ｈｉｓ６を任意選択で含む。 ＮからＣ末端に向かって読み取ると、第１の標的抗原結合ドメイン（α－Ｔ１）が、第１のＣＤ－３ ＶＬドメインに連結され、これは、第１の切断可能なリンカー（ＣＬ１）を通じて、不活性であり、かつドメインリンカーを通じて第２の半減期延長ドメインに連結されている第１の半減期延長ドメインに結合されている、第１のＣＤ－３ ＶＨドメイン（ＶＨｉ）に連結される、本発明のポリペプチド複合体の別の例示的なフォーマットを示す。第２の半減期延長ドメインは、第２のＣＤ－３ ＶＬドメイン（ＶＬｉ）に連結され、これは、不活性であり、かつ第２の標的抗原結合ドメイン（α－Ｔ２）に連結されている第２のＣＤ－３ ＶＨドメインに、第２の切断可能なリンカー（ＣＬ２）を通じて連結されている。ポリペプチドのＣ末端は、１、２、３、４、５、６、７、８、９ １０個以上のアミノ酸のブロック基、例えば、Ｈｉｓ６を任意選択で含む。 ＮからＣ末端に向かって読み取ると、第２の標的抗原結合（α－Ｔ２）が、第１のＣＤ－３ ＶＬドメインに連結され、これは、第１の切断可能なリンカー（ＣＬ１）を通じて、不活性であり、かつドメインリンカーを介して第２の半減期延長ドメインに連結されている、第１の半減期延長ドメインに結合されている、第１のＣＤ－３ ＶＨドメイン（ＶＨｉ）に連結されている、本発明のポリペプチド複合体の別の例示的なフォーマットを示す。第２の半減期延長ドメインは、ｓｃＦｖと、不活性であり、かつ第１の標的抗原結合（α－Ｔ１）に連結されている第２のＣＤ－３ ＶＨドメインに、第２の切断可能なリンカー（ＣＬ２）を通じて連結されている、第２のＣＤ－３ ＶＬドメイン（ＶＬｉ）と、に連結されている。ポリペプチドのＣ末端は、１、２、３、４、５、６、７、８、９ １０個以上のアミノ酸のブロック基、例えば、Ｈｉｓ６を任意選択で含む。 ＮからＣ末端に向かって読み取ると、第１の標的抗原結合ドメイン（α－Ｔ１）が、第１のＣＤ－３ ＶＨドメインに連結され、これは、第１の切断可能なリンカー（ＣＬ１）を通じて、不活性であり、かつドメインリンカーを通じて第２の半減期延長ドメインに連結されている第１の半減期延長ドメインに結合されている、第１のＣＤ－３ ＶＬドメイン（ＶＬｉ）に連結される、本発明のポリペプチド複合体の別の例示的なフォーマットを示す。第２の半減期延長ドメインは、第２のＣＤ－３ ＶＨドメイン（ＶＨｉ）に連結され、これは、不活性であり、かつ第２の標的抗原結合ドメイン（α－Ｔ２）に連結されている第２のＣＤ－３ ＶＬドメインに、第２の切断可能なリンカー（ＣＬ２）を通じて連結されている。ポリペプチドのＣ末端は、１、２、３、４、５、６、７、８、９ １０個以上のアミノ酸のブロック基、例えば、Ｈｉｓ６を任意選択で含む。 ＮからＣ末端に向かって読み取ると、第２の標的抗原結合（α－Ｔ２）が、第１のＣＤ－３ ＶＨドメインに連結され、これは、第１の切断可能なリンカー（ＣＬ１）を通じて、不活性であり、かつドメインリンカーを介して第２の半減期延長ドメインに連結されている、第１の半減期延長ドメインに結合されている、第１のＣＤ－３ ＶＬドメイン（ＶＬｉ）に連結されている、本発明のポリペプチド複合体の別の例示的なフォーマットを示す。第２の半減期延長ドメインは、第２のＣＤ－３ ＶＨドメイン（ＶＨｉ）に連結され、これは、不活性であり、かつ第１の標的抗原結合ドメイン（α－Ｔ１）に連結されている第２のＣＤ－３ ＶＬドメインに、第２の切断可能なリンカー（ＣＬ２）を通じて連結されている。ポリペプチドのＣ末端は、１、２、３、４、５、６、７、８、９ １０個以上のアミノ酸のブロック基、例えば、Ｈｉｓ６を任意選択で含む。 ＮからＣ末端に向かって読み取ると、第１の半減期延長ドメインが、第１のＣＤ－３ ＶＨドメイン（ＶＨｉ）に連結され、これは、不活性であり、かつ第１の切断可能なリンカー（ＣＬ１）を通じて、第１のＣＤ－３ ＶＬドメインに連結されている、本発明のポリペプチド複合体の別の例示的なフォーマットを示す。ＣＤ－３ ＶＬドメインは、第１の標的抗原結合（α－Ｔ１）に連結され、これは、ドメインリンカーを介して第２の標的抗原結合ドメイン（α－Ｔ２）に連結され、これは、不活性であり、かつ第２の半減期延長ドメインに連結されている第２のＣＤ３－ＶＬドメイン（ＶＬｉ）に、第２の切断可能なドメインリンカーを通じて連結された、第２のＣＤ－３ ＶＨドメインに連結されている。ポリペプチドのＣ末端は、１、２、３、４、５、６、７、８、９ １０個以上のアミノ酸のブロック基、例えば、Ｈｉｓ６を任意選択で含む。 ＮからＣ末端に向かって読み取ると、第１の半減期延長ドメインが、第１のＣＤ－３ ＶＨドメイン（ＶＨｉ）に連結され、これは、不活性であり、かつ第１の切断可能なリンカー（ＣＬ１）を通じて、第１のＣＤ－３ ＶＬドメインに連結されている、本発明のポリペプチド複合体の別の例示的なフォーマットを示す。ＣＤ－３ ＶＬドメインは、第２の抗原結合ドメイン（α－Ｔ２）に連結され、これは、ドメインリンカーを介して第１の抗原結合ドメイン（α－Ｔ１）に連結され、これは、不活性であり、かつ第２の半減期延長ドメインに連結されている第２のＣＤ３－ＶＬドメイン（ＶＬｉ）に、第２の切断可能なドメインリンカー（ＣＬ２）を通じて連結された、第２のＣＤ－３ ＶＨドメインに連結されている。ポリペプチドのＣ末端は、１、２、３、４、５、６、７、８、９ １０個以上のアミノ酸のブロック基、例えば、Ｈｉｓ６を任意選択で含む。 ＮからＣ末端に向かって読み取ると、第１の半減期延長ドメインが、第１のＣＤ－３ ＶＬドメイン（ＶＬｉ）に連結され、これは、不活性であり、かつ第１の切断可能なリンカー（ＣＬ１）を通じて、第１のＣＤ－３ ＶＨドメインに連結されている、本発明のポリペプチド複合体の別の例示的なフォーマットを示す。ＣＤ－３ ＶＨドメインは、第１の標的抗原結合ドメイン（α－Ｔ１）に連結され、これは、ドメインリンカーを介して第２の標的抗原結合（α－Ｔ２）に連結され、これは、不活性であり、かつ第２の半減期延長ドメインに連結されている第２のＣＤ－３ ＶＨドメイン（ＶＨｉ）に連結された第２のＣＤ－３ ＶＬドメインに連結されている。ポリペプチドのＣ末端は、１、２、３、４、５、６、７、８、９ １０個以上のアミノ酸のブロック基、例えば、Ｈｉｓ６を任意選択で含む。 ＮからＣ末端に向かって読み取ると、第１の半減期延長ドメインが、第１のＣＤ－３ ＶＬドメイン（ＶＬｉ）に連結され、これは、不活性であり、かつ第１の切断可能なリンカー（ＣＬ１）を通じて、第１のＣＤ－３ ＶＨドメインに連結されている、本発明のポリペプチド複合体の別の例示的なフォーマットを示す。第１のＣＤ－３ ＶＨドメインは、第２の標的抗原結合ドメイン（α－Ｔ２）に連結され、これは、ドメインリンカーを介して第１の標的抗原結合ドメイン（α－Ｔ１）に連結され、これは、不活性であり、かつ第２の半減期延長ドメインに結合されている第２のＣＤ３ ＶＨドメイン（ＶＨｉ）に、第２の切断可能なリンカー（ＣＬ２）を介して連結されている第２のＣＤ－３ ＶＬドメインに連結されている。ポリペプチドのＣ末端は、１、２、３、４、５、６、７、８、９ １０個以上のアミノ酸のブロック基、例えば、Ｈｉｓ６を任意選択で含む。 本発明の例示的なポリペプチド構築物に関する代表的な核酸及びポリペプチド配列を提供する。本発明における使用の例示的なポリペプチドは、Ｃ末端でブロックされており、そのため、Ｈｉｓｘ Ｃ末端タグで示される配列は、これらのタグ、これらのタグのより短いまたはより長いバージョン、またはタグなしで利用することができる。 本発明の種々のポリペプチド構築物に対する配列番号、及びこれらの構築物に対する省略名称の用語索引を提供する。 本発明の実施形態における使用のリンカーに関する例示的なリンカー配列を提供する。

Claims (58)

  1. ＣＤ－３抗原に対する単一鎖ｓｃＦｖポリペプチドであって、前記ｓｃＦｖポリペプチドが、第１のＶＨドメインと第１のＶＬドメインとの間の第１のプロテアーゼ切断部位を含む第１のｓｃＦｖリンカー部分を通じて接合される、前記第１のＶＨドメイン及び前記第１のＶＬドメインを含む、第１のｓｃＦｖドメインであって、前記第１のＶＨドメイン及び前記第１のＶＬドメインが、相互作用して、第１のＶＨ／ＶＬ対を形成し、前記第１のＶＨドメイン及び前記第１のＶＬドメインのうちの一方が、不活性であり、そのため、前記第１のｓｃＦｖドメインが、前記ＣＤ－３抗原に特異的に結合せず、前記第１のｓｃＦｖポリペプチドが、第２のプロテアーゼ切断部位を任意選択で含む第１のドメインリンカー部分を通じて接合される、第１のｓｃＦｖドメインと、
    第２のＶＨドメインと第２のＶＬドメインとの間の第３のプロテアーゼ切断部位を含む第２のｓｃＦｖリンカー部分を介して接合される、前記第２のＶＨドメイン及び前記第２のＶＬドメインを含む第２のｓｃＦｖドメインであって、前記第２のＶＨドメイン及び前記第２のＶＬドメインが、相互作用して、第２のＶＨ／ＶＬ対を形成し、前記第２のＶＨドメイン及び前記第２のＶＬのうちの一方が、不活性であり、そのため、前記第２のｓｃＦｖドメインが、前記ＣＤ－３抗原に特異的に結合しない、第２のｓｃＦｖドメインと、を含み、
    前記第１のｓｃＦｖドメインが、第２のドメインリンカーを通じて、第１の標的抗原結合ドメインに接合され、前記第２のドメインリンカーが、前記第１のＶＨドメイン及び前記第１のＶＬドメインから選択されるメンバーを、前記第１の標的抗原結合ドメインに接合し、
    前記第２のｓｃＦｖドメインが、第３のドメインリンカーを通じて、第２の標的抗原結合ドメインに接合され、前記第３のドメインリンカーが、前記第２のＶＨドメイン及び前記第２のＶＬドメインから選択されるメンバーを、前記第２の標的抗原結合ドメインに接合する、単一鎖ｓｃＦｖポリペプチド。
  2. ＣＤ－３抗原に対する単一鎖ｓｃＦｖポリペプチドであって、前記ｓｃＦｖポリペプチドが、第１のＶＨドメインと第１のＶＬドメインとの間の第１のプロテアーゼ切断部位を含む第１のｓｃＦｖリンカー部分を通じて接合される、前記第１のＶＨドメイン及び前記第１のＶＬドメインを含む、第１のｓｃＦｖドメインであって、前記第１のＶＨドメイン及び前記第１のＶＬドメインが、相互作用して、第１のＶＨ／ＶＬ対を形成し、前記第１のＶＨドメイン及び前記第１のＶＬドメインのうちの一方が、不活性な第１のＶＨドメインまたは不活性な第１のＶＬドメインであり、そのため、前記第１のｓｃＦｖドメインが、前記ＣＤ－３抗原に特異的に結合せず、前記第１のｓｃＦｖポリペプチドが、第２のプロテアーゼ切断部位を任意選択で含む第１のドメインリンカー部分を通じて接合される、第１のｓｃＦｖドメインと、
    第２のＶＨドメインと第２のＶＬドメインとの間の第３のプロテアーゼ切断部位を含む第２のｓｃＦｖリンカー部分を介して接合される、前記第２のＶＨドメイン及び前記第２のＶＬドメインを含む第２のｓｃＦｖドメインであって、前記第２のＶＨドメイン及び前記第２のＶＬが、相互作用して、第２のＶＨ／ＶＬ対を形成し、前記第２のＶＨドメイン及び前記第２のＶＬドメインのうちの一方が、不活性な第２のＶＨドメインまたは不活性な第２のＶＬドメインであり、そのため、前記第２のｓｃＦｖドメインが、前記ＣＤ－３抗原に特異的に結合しない、第２のｓｃＦｖドメインと、を含み、
    前記第１のｓｃＦｖドメインが、第２のドメインリンカーを通じて、第１の標的抗原結合ドメインに接合され、前記第２のドメインリンカーが、前記第１のＶＨドメイン及び前記第１のＶＬドメインから選択されるメンバーを、前記第１の標的抗原結合ドメインに接合し、
    前記第２のｓｃＦｖドメインが、第３のドメインリンカーを通じて、第２の標的抗原結合ドメインに接合され、前記第３のドメインリンカーが、前記第２のＶＨドメイン及び前記第２のＶＬドメインから選択されるメンバーを、前記第２の標的抗原結合ドメインに接合し、
    前記単一鎖ｓｃＦｖを、前記第１のｓｃＦｖリンカー部分の前記第１のプロテアーゼ切断部位を切断することができる第１のプロテアーゼと接触させると、前記不活性な第１のＶＨドメインまたは前記不活性な第１のＶＬドメインが、前記単一鎖ｓｃＦｖポリペプチドから分離され、
    第２のプロテアーゼが、前記第２のｓｃＦｖリンカー部分の前記第２のプロテアーゼ切断部位を切断することができ、前記不活性な第２のＶＨドメインまたは前記不活性な第２のＶＬドメインが、前記単一鎖ｓｃＦｖポリペプチドから分離され、
    それにより、前記ＣＤ－３抗原に結合することができる活性な単一鎖ｓｃＦｖを形成する、単一鎖ｓｃＦｖポリペプチド。
  3. ＣＤ－３抗原に対する単一鎖ｓｃＦｖポリペプチドであって、前記ｓｃＦｖポリペプチドが、第１のＶＨドメインと第１のＶＬドメインとの間の第１のプロテアーゼ切断部位を含む第１のｓｃＦｖリンカー部分を通じて接合される、前記第１のＶＨドメイン及び前記第１のＶＬドメインを含む、第１のｓｃＦｖドメインであって、前記第１のＶＨドメイン及び前記第１のＶＬドメインが、相互作用して、第１のＶＨ／ＶＬ対を形成し、前記第１のＶＨドメイン及び前記第１のＶＬドメインのうちの一方が、不活性であり、そのため、前記第１のｓｃＦｖドメインが、前記ＣＤ－３抗原に特異的に結合せず、前記第１のｓｃＦｖポリペプチドが、第２のプロテアーゼ切断部位を任意選択で含む第１のドメインリンカー部分を通じて接合される、第１のｓｃＦｖドメインと、
    第１の標的抗原結合ドメインであって、前記第１のドメインリンカーが、前記第１のＶＨドメイン及び前記第１のＶＬドメインから選択されるメンバーを、前記第１の標的抗原結合ドメインに接合する、第１の標的抗原結合ドメインと、を含む、単一鎖ｓｃＦｖポリペプチド。
  4. 前記第１のＶＬドメイン、前記第１のＶＨドメイン、前記第１の標的抗原結合ドメイン、及びこれらの組み合わせから選択されるメンバーに接合される、少なくとも１つの半減期延長ドメインをさらに含む、請求項１～３のいずれかに記載の単一鎖ｓｃＦｖポリペプチド。
  5. 前記第１のＶＬドメイン、前記第１のＶＨドメイン、前記第２のＶＬドメイン、前記第２のＶＨドメイン、前記第１の標的抗原結合ドメイン、前記第２の標的抗原結合ドメイン、及びこれらの組み合わせから選択されるメンバーに接合される、少なくとも１つの半減期延長ドメインをさらに含む、請求項１～２のいずれかに記載の単一鎖ｓｃＦｖポリペプチド。
  6. 前記少なくとも１つの半減期延長ドメインが、前記不活性なＶＨドメイン及び前記不活性なＶＬドメイン以外のドメインに結合されている、請求項５に記載の単一鎖ｓｃＦｖポリペプチド。
  7. 前記少なくとも１つの半減期延長ドメインが、血清タンパク質に結合することができる部分を含む、請求項５～６のいずれかに記載の単一鎖ｓｃＦｖポリペプチド。
  8. 前記血清タンパク質が、血清アルブミンである、請求項７に記載の単一鎖ｓｃＦｖポリペプチド。
  9. 前記少なくとも１つの半減期延長ドメインが、ｓｃＦｖ、可変重ドメイン（ＶＨ）、可変軽ドメイン（ＶＬ）、ナノボディ、ペプチド、リガンド、または小分子を含む、請求項５～８のいずれかに記載の単一鎖ｓｃＦｖポリペプチド。
  10. 少なくとも１つの半減期延長ドメインが、プロテアーゼ切断の前に、前記単一鎖ｓｃＦｖのＮ末端、Ｃ末端、及びこれらの組み合わせから選択されるメンバーに位置する、請求項５～９のいずれかに記載の単一鎖ｓｃＦｖポリペプチド。
  11. 少なくとも１つの半減期延長ドメインが、プロテアーゼ切断の前に、前記ｓｃＦｖポリペプチドのＣ末端またはＮ末端にない、請求項５～９のいずれかに記載の単一鎖ｓｃＦｖポリペプチド。
  12. 前記半減期延長ドメインが、その中に切断可能な部分を含むリンカーを通じて、前記第１のＶＬドメイン、前記第１のＶＨドメイン、前記第２のＶＬドメイン、前記第２のＶＨドメイン、前記第１の標的抗原結合ドメイン、前記第２の標的抗原結合ドメイン、及びこれらの組み合わせから選択されるメンバーに結合される、請求項５～１１のいずれかに記載の単一鎖ｓｃＦｖポリペプチド。
  13. 前記ＣＤ－３抗原が、１つ以上のＣＤ３抗原から選択される、請求項１～１２のいずれかに記載の単一鎖ｓｃＦｖポリペプチド。
  14. 前記標的抗原結合ドメインが、異常細胞によって発現される抗原に結合する、請求項１～１３のいずれかに記載の単一鎖ｓｃＦｖポリペプチド。
  15. 前記異常細胞が、悪性細胞である、請求項１４に記載の単一鎖ｓｃＦｖポリペプチド。
  16. 前記標的抗原結合ドメインが、細胞表面受容体に結合する、請求項１～１５のいずれかに記載の単一鎖ｓｃＦｖポリペプチド。
  17. 前記標的抗原結合ドメインが、ｓｃＦｖ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、非Ｉｇドメイン、または前記標的抗原に特異的に結合するリガンドを含む、請求項１～１６のいずれかに記載の単一鎖ｓｃＦｖポリペプチド。
  18. 少なくとも１つの標的抗原結合ドメインが、腫瘍抗原に特異的に結合する、請求項１～１７のいずれかに記載の単一鎖ｓｃＦｖポリペプチド。
  19. 前記細胞表面受容体が、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ－２、ＨＥＲ－３、ｃＭｅｔ、ＣＥＡ、ＦｏＩＲ、及びこれらの組み合わせから選択されるメンバーである、請求項１６に記載の単一鎖ｓｃＦｖポリペプチド。
  20. 前記第１のｓｃＦｖリンカー及び前記第２のｓｃＦｖリンカーが、同じ配列または異なる配列のポリペプチドリンカーである、請求項１～１９のいずれかに記載の単一鎖ｓｃＦｖポリペプチド。
  21. 前記第１のプロテアーゼ切断部位及び前記第２のプロテアーゼ切断部位が、同じプロテアーゼまたは異なるプロテアーゼに対する切断部位である、請求項１～２０のいずれかに記載の単一鎖ｓｃＦｖポリペプチド。
  22. 前記第１のプロテアーゼ切断部位及び前記第２のプロテアーゼ切断部位が、同じ配列または異なる配列である、請求項１～２１のいずれかに記載の単一鎖ｓｃＦｖポリペプチド。
  23. 前記第１のドメインリンカー及び前記第２のドメインリンカーが、同じ配列または異なる配列のポリペプチドリンカーである、請求項１～２及び４～２２のいずれかに記載の単一鎖ｓｃＦｖポリペプチド。
  24. 前記プロテアーゼ切断部位が、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、メタロプロテイナーゼ、ゼラチナーゼ、及びアスパラギンペプチドリアーゼのうちの少なくとも１つによって切断される、請求項１～２３のいずれかに記載の単一鎖ｓｃＦｖポリペプチド。
  25. 前記プロテアーゼ切断部位が、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＫ、カテプシンＬ、カリクレイン、ｈＫ１、ｈＫ１０、ｈＫ１５、プラスミン、コラゲナーゼ、ＩＶ型コラゲナーゼ、ストロメリシン、Ｘａ因子、キモトリプシン様プロテアーゼ、トリプシン様プロテアーゼ、エラスターゼ様プロテアーゼ、スブチリシン様プロテアーゼ、アクチニダイン（ａｃｔｉｎｉｄａｉｎ）、ブロメライン、カルパイン、カスパーゼ、カスパーゼ－３、Ｍｉｒ１－ＣＰ、パパイン、ＨＩＶ－１プロテアーゼ、ＨＳＶプロテアーゼ、ＣＭＶプロテアーゼ、キモシン、レニン、ペプシン、マトリプターゼ、レグマイン、プラスメプシン、ネペンテシン、メタロエキソペプチダーゼ、メタロエンドペプチダーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ１１、ＭＭＰ１２、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１４、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１２、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、エンテロキナーゼ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ、ｈＫ３）、インターロイキン－１β変換酵素、トロンビン、ＦＡＰ（ＦＡＰ－α）、メプルン（ｍｅｐｒｎ）、グランザイム、ジペプチジルペプチダーゼ、及びジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６）のうちの少なくとも１つによって切断される、請求項１～２４のいずれかに記載の単一鎖ｓｃＦｖポリペプチド。
  26. 前記プロテアーゼ切断ドメインが、腫瘍の部位で切断される、請求項１～２５のいずれかに記載の単一鎖ｓｃＦｖポリペプチド。
  27. 前記プロテアーゼ切断部位を切断する前記プロテアーゼが、前記腫瘍の微小環境内の細胞によって発現される、請求項１～２６のいずれかに記載の単一鎖ｓｃＦｖポリペプチド。
  28. 前記プロテアーゼ切断部位が、前記単一鎖ｓｃＦｖポリペプチドが投与される対象の血液中で切断される、請求項１～２７のいずれかに記載の単一鎖ｓｃＦｖポリペプチド。
  29. 前記ｓｃＦｖポリペプチドが、２つ以上のプロテアーゼ切断ドメインをさらに含む、請求項１～２８のいずれかに記載の単一鎖ｓｃＦｖポリペプチド。
  30. 前記プロテアーゼ切断ドメインが、前記半減期延長ドメインまたは前記ＣＤ－３結合ドメイン内にある、請求項５～２９のいずれかに記載の単一鎖ｓｃＦｖポリペプチド。
  31. 前記プロテアーゼ切断ドメインが、前記半減期延長ドメインまたは前記ＣＤ－３結合ドメイン内にない、請求項５～２９のいずれかに記載の単一鎖ｓｃＦｖポリペプチド。
  32. １つ以上のＣＤ－３結合ドメインが、ヒトＣＤ－３に特異的な単一鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）に由来するポリペプチドを含む、請求項１～３１のいずれかに記載の単一鎖ｓｃＦｖポリペプチド。
  33. 前記ＣＤ－３結合ドメインが、ＣＤ３ε（イプシロン）、ＣＤ３δ（デルタ）、及びＣＤ３γ（ガンマ）から選択されるメンバーに特異的なＣＤ３結合ドメインである、請求項１～３２のいずれかに記載の単一鎖ｓｃＦｖポリペプチド。
  34. １つ以上のＣＤ３結合ドメインが、ムロモナブ－ＣＤ３（ＯＫＴ３）、オテリキシズマブ（ＴＲＸ４）、テプリズマブ（ＭＧＡ０３１）、ビジリズマブ（Ｎｕｖｉｏｎ）、ＳＰ３４、Ｉ２Ｃ、Ｘ３５、ＶＩＴ３、ＢＭＡ０３０（ＢＷ２６４／５６）、ＣＬＢ－Ｔ３／３、ＣＲＩＳ７、ＹＴＨ１２．５、Ｆ１１１－４０９、ＣＬＢ－Ｔ３．４．２、ＴＲ－６６、ＷＴ３２、ＳＰｖ－Ｔ３ｂ、１１Ｄ８、ＸＩＩＩ－１４１、ＸＩＩＩ－４６、ＸＩＩＩ－８７、１２Ｆ６、Ｔ３／ＲＷ２－８Ｃ８、Ｔ３／ＲＷ２－４Ｂ６、ＯＫＴ３Ｄ、Ｍ－Ｔ３０１、ＳＭＣ２、Ｆ１０１．０１、ＵＣＨＴ－１、及びＷＴ－３１からなる群から選択される相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、請求項３３に記載の単一鎖ｓｃＦｖポリペプチド。
  35. １つ以上のＣＤ－３結合ドメインが、ヒト化されている、請求項１～３４のいずれかに記載の単一鎖ｓｃＦｖポリペプチド。
  36. 前記プロテアーゼ切断部位のプロテアーゼ切断に続いて、１つ以上の前記ＣＤ３結合ドメインが、ＣＤ３発現細胞上のＣＤ３に対して１０００ｎＭ以下のＫＤ結合を有する、請求項３３に記載の単一鎖ｓｃＦｖポリペプチド。
  37. 前記プロテアーゼ切断部位のプロテアーゼ切断に続いて、１つ以上の活性化ＣＤ３結合ドメインが、ＣＤ３発現細胞上のＣＤ３に対して１００ｎＭ以下のＫＤ結合を有する、請求項３６に記載の単一鎖ｓｃＦｖポリペプチド。
  38. 前記プロテアーゼ切断部位のプロテアーゼ切断に続いて、１つ以上の活性化ＣＤ３結合ドメインが、ＣＤ３発現細胞上のＣＤ３に対して１０ｎＭ以下のＫＤ結合を有する、請求項３７に記載の単一鎖ｓｃＦｖポリペプチド。
  39. １つ以上のＣＤ－３結合ドメインが、カニクイザルＣＤ３との交差反応性を有する、請求項１～３８のいずれかに記載の単一鎖ｓｃＦｖポリペプチド。
  40. １つ以上のＣＤ－３結合ドメインが、本明細書で提供されるアミノ酸配列を含むＣＤ３結合ドメインである、請求項１～３９のいずれかに記載の単一鎖ｓｃＦｖポリペプチド。
  41. 前記標的抗原結合ドメインが、ＥＧＦＲ結合ドメインである、請求項１～４０のいずれかに記載の単一鎖ｓｃＦｖポリペプチド。
  42. 前記ＶＬドメイン及び前記ＶＨドメインが、３つのＣＤＲを各々含む、請求項１～４１のいずれかに記載の単一鎖ｓｃＦｖポリペプチド。
  43. 前記不活性なＶＬ及び前記不活性なＶＨから選択されるメンバーが、前記ＶＬ及びＶＨの親配列に対して突然変異した少なくとも１つのアミノ酸を含む少なくとも１つのＣＤＲを含む、請求項１～４２のいずれかに記載の単一鎖ｓｃＦｖポリペプチド。
  44. 前記不活性なＶＬ及び前記不活性なＶＨから選択されるメンバーが、前記ＶＬ及びＶＨの前記ＣＤＲ２の親配列に対して突然変異した少なくとも１つのアミノ酸を含むＣＤＲ２ドメインを含む、請求項１～４３のいずれかの単一鎖ｓｃＦｖポリペプチド。
  45. 前記不活性なＶＬ及び前記不活性なＶＨから選択されるメンバーが、前記第１のドメインリンカー及び前記第１のｓｃＦｖリンカーから選択されるメンバーを、前記ＣＤＲに組み込むことによって、前記ＶＬ及びＶＨの前記ＣＤＲの親配列に対して突然変異した少なくとも１つのＣＤＲを含む、請求項１～４４のいずれかに記載の単一鎖ｓｃＦｖポリペプチド。
  46. 請求項１～４５のいずれかに記載の単一鎖ｓｃＦｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
  47. 請求項４６に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  48. 請求項４７に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
  49. 薬学的組成物であって、
    （ｉ）請求項１～４５のいずれか１項に記載の単一鎖ｓｃＦｖポリペプチド、
    （ｉｉ）請求項４６に記載のポリヌクレオチド、
    （ｉｉｉ）請求項４７に記載のベクター、
    （ｉｖ）請求項４８に記載の宿主細胞、及びその組み合わせ、ならびに
    （ｖ）薬学的に許容される担体、から選択されるメンバーを含む、薬学的組成物。
  50. 請求項１～４５のいずれかに記載の単一鎖ｓｃＦｖポリペプチドを生成するためのプロセスであって、請求項１～４５に記載の単一鎖ｓｃＦｖポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を、前記単一鎖ｓｃＦｖポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養することと、前記生成された単一鎖ｓｃＦｖポリペプチドを、前記培養物から回収及び精製することと、を含む、プロセス。
  51. 増殖性疾患、腫瘍性疾患、炎症性疾患、免疫学的障害、自己免疫疾患、感染性疾患、ウイルス性疾患、アレルギー反応、寄生虫反応、移植片対宿主疾患、もしくは宿主対移植片疾患の治療または改善のための方法であって、そのような治療または改善を必要とする対象への、請求項１～４５のいずれかに記載の単一鎖ｓｃＦｖポリペプチドの投与を含む、方法。
  52. 前記対象が、ヒトである、請求項５２に記載の方法。
  53. プロドラッグ組成物であって、
    ｉ）第１のプロテアーゼ切断部位を含む第１のｓｃＦｖリンカー部分を通じて接合される、第１のＶＨドメイン及び第１のＶＬドメインを含む、第１のｓｃＦｖドメインを含む、ＣＤ３結合ドメインをコードする、第１のポリペプチド配列であって、前記第１のｓｃＦｖドメインがＣＤ３に特異的に結合しないようにする、第１のポリペプチド配列と、
    ｉｉ）第２のプロテアーゼ切断部位を含む第２のｓｃＦｖリンカー部分を通じて接合される、第２のＶＨドメイン及び第２のＶＬドメインを含む、第２のｓｃＦｖドメインを含む、腫瘍抗原結合ドメインをコードする、第２のポリペプチド配列であって、前記第２のｓｃＦｖドメインが腫瘍抗原に特異的に結合しないようにする、第２のポリペプチド配列と、
    ｉｉｉ）任意選択で少なくとも１つの半減期延長ドメインと、を含む、プロドラッグ組成物。
  54. 前記第１のポリペプチド配列及び前記第２のポリペプチド配列が、プロテアーゼ切断部位を任意選択で含む第１のドメインリンカー部分によって動作可能に連結されている、請求項５４に記載のプロドラッグ組成物。
  55. プロドラッグ組成物であって、
    ｉ）第１のポリペプチド配列であって、ａ）第１のプロテアーゼ切断部位を含む第１のｓｃＦｖリンカー部分を通じて接合される、第１のＶＨドメイン及び第１のＶＬドメインを含む、第１のｓｃＦｖドメインを含む、第１のＣＤ３結合ドメインであって、前記第１のｓｃＦｖドメインが、ＣＤ３に特異的に結合しない、第１のＣＤ３結合ドメイン、及びｂ）第１の腫瘍抗原結合ドメインを含む、第１のポリペプチド配列と、
    ｉｉ）第２のポリペプチド配列であって、ａ）第２のプロテアーゼ切断部位を含む第２のｓｃＦｖリンカー部分を通じて接合される、第２のＶＨドメイン及び第２のＶＬドメインを含む、第２のｓｃＦｖドメインを含む、第２のＣＤ３結合ドメインであって、前記第２のｓｃＦｖドメインが、ＣＤ３に特異的に結合しない、第２のＣＤ３結合ドメイン、及びｂ）第２の腫瘍抗原結合ドメインを含む、第２のポリペプチド配列と、
    ｉｉｉ）任意選択で少なくとも１つの半減期延長ドメインと、を含み、
    前記第１のＶＨドメイン及び前記第２のＶＬドメインが、ＣＤ３に特異的に結合する、ならびに／または前記第２のＶＨドメイン及び前記第１のＶＬドメインが、ＣＤ３に特異的に結合する、プロドラッグ組成物。
  56. 前記第１の腫瘍抗原結合ドメイン及び前記第２の腫瘍抗原結合ドメインが、同じ腫瘍抗原に結合する、請求項５６に記載のプロドラッグ組成物。
  57. 前記第１の腫瘍抗原結合ドメイン及び前記第２の腫瘍抗原結合ドメインが、異なる腫瘍抗原タンパク質に結合する、請求項５６に記載のプロドラッグ組成物。
  58. 前記第１の腫瘍抗原結合ドメインが、第１の腫瘍細胞上に存在する第１の腫瘍抗原に結合し、前記第２の腫瘍抗原結合ドメインが、前記第１の腫瘍細胞上に存在する第２の腫瘍抗原に結合する、請求項５６に記載のプロドラッグ組成物。
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