JP2023123519A - 誘導性結合タンパク質及びその使用方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】CD3に結合するプロテアーゼ活性化ドメインと、少なくとも1つの半減期延長ドメインと、1つ以上の標的抗原に結合する2つ以上のドメインとを含む、条件的活性化ポリペプチド構築物を提供すること。【解決手段】二分型ポリペプチドを提供する。その薬学的組成物、ならびにこのようなポリペプチド構築物を作製するための核酸、組換え発現ベクター、及び宿主細胞もまた提供する。本発明の改善されたscFvは、二量体化合物を形成することによって、単一ユニットによって実証される結合活性の欠如を克服するという予想外の利点を有する。また、本明細書に記載のポリペプチド構築物を、疾患、状態、及び障害の予防、及び/または治療において使用する方法も提供する。【選択図】図3
Description
関連出願の相互参照
本出願は、2016年3月8日に出願された米国仮特許出願第62/305,092号の利益を主張するものであり、参照によりその全体が全ての目的のために明示的に組み込まれる。
本出願は、2016年3月8日に出願された米国仮特許出願第62/305,092号の利益を主張するものであり、参照によりその全体が全ての目的のために明示的に組み込まれる。
個々の細胞または特定の細胞型の選択的破壊は、しばしば様々な臨床状況において望ましい。例えば、腫瘍細胞を特異的に破壊しつつ、健常な細胞及び組織を、可能な限り無傷かつ未損傷のままにすることは、癌療法の主要な目標である。1つのそのような方法は、腫瘍に対する免疫応答を誘導して、ナチュラルキラー(NK)細胞または細胞毒性Tリンパ球(CTL)などの免疫エフェクター細胞に、腫瘍細胞を攻撃及び破壊させることによる。
腫瘍関連抗原に対する優れた結合特異性及び親和性を提供する無傷のモノクローナル抗体(MAb)の使用は、癌治療及び診断領域において成功裏に適用されている。しかしながら、無傷のMAbの大きいサイズ、それらの乏しい生体内分布、及び血液プールにおける長期持続性は、それらの臨床用途を制限している。例えば、無傷の抗体は、腫瘍領域内に特異的な蓄積を呈し得る。生体内分布研究において、腫瘍を正確に調べる際に、周辺部に一次蓄積を伴う不均一な抗体分布が認められる。腫瘍壊死、不均一な抗原分布、及び間質組織圧の増加に起因して、無傷の抗体構築物で腫瘍の中央部分に到達することは可能ではない。対照的に、より小さい抗体フラグメントは、迅速な腫瘍局在を示し、腫瘍により深く浸透し、また、血流から比較的迅速に除去される。
親MAbの小さい結合ドメインに由来する単一鎖フラグメント(scFv)は、臨床用途のために無傷のMAbよりも良好な生体内分布を提供し、腫瘍細胞をより効率的に標的化することができる。単一鎖フラグメントは、細菌から効率的に操作することができるが、ほとんどの操作されたscFvは、一価構造を有し、二価化合物が経験する結合活性の欠如に起因して、それらの親MAb((C(c)、D)と比較して、腫瘍蓄積の減少、例えば、腫瘍細胞上での短い滞留時間、及び特異性を示す。
scFvの有利な特性にもかかわらず、特定の特徴は、癌化学療法におけるそれらの完全な臨床的展開を妨げる。特に注目すべきは、罹患細胞及び健常組織の両方に共通の細胞表面受容体へのこれらの薬剤の標的化に起因する、罹患組織と健常組織との間の交差反応性である。改善された治療指数を有するScFvは、これらの薬剤の臨床的有用性において著しい前進をもたらすであろう。本発明は、このような改善されたscFv、ならびにその製造及び使用方法を提供する。本発明の改善されたscFvは、二量体化合物を形成することによって、単一ユニットによって実証される結合活性の欠如を克服するという予想外の利点を有する。
種々の実施形態では、本発明は、二分型ポリペプチドを提供する。図53を参照すると、例示的な実施形態では、ポリペプチドの2つの領域は、切断時に2つの領域の分離を可能にするように、単一結合から、1つ以上の切断可能なリンカー(CL)を含み得るより大きいポリペプチドドメインのサイズ範囲のscFv領域リンカー(RL)によって、1つ以上の切断部位と接続される。ポリペプチドの2つの領域の各々は、不活性化scFvへの少なくとも1つの切断不可能なリンカー(NCL1及びNCL2)を介して、T細胞活性化タンパク質(αCD3、αCD16、αTCRα、αTCRβ、αCD28など)に連結される、1つ以上の疾患標的化ドメイン(例えば、標的抗原結合ドメイン(scFv、sdAb、細胞受容体ドメイン、レクチンなどを含む単一鎖結合ドメインの任意の形式であり得る)を含有する。T細胞活性化ドメインを標的化するscFvは、そのVHまたはVLセグメントのいずれかで不活性化され、各scFvの2つのセグメントは、罹患組織で切断されやすい切断可能なリンカー(CL1及びCL2)を使用して接続される。
本明細書に記載される抗原結合ポリペプチド構築物は、従来のモノクローナル抗体及び他のより小さい二重特異性分子に勝る複数の治療上の利点をもたらす。特に注目すべきは、本発明のポリペプチド構築物の条件的活性化である。構築物は、本質的にそれらの意図された標的抗原に結合することができるままであるが、CD3シグナル伝達活性は、ポリペプチド自体の構造にプログラムされた独自のポリペプチド分解ステップに依存する。したがって、本発明の例示的なポリペプチドの非罹患正常組織に対する比活性は、類似の抗体及び抗体フラグメントの比活性と比較して、有意に低減される。この部位への進行中に「サイレント」状態のままでありつつ、所望の作用部位でポリペプチドが「オンになる」能力は、特異的に結合するポリペプチド治療剤の分野において、顕著な前進であり、容易に設計可能かつ表現可能なドラッガブルな形式を提供する。
一般に、組換えポリペプチド医薬品の有効性は、しばしば、ポリペプチド自体の内因性の迅速な薬物動態によって制限され、ポリペプチドの迅速なクリアランスにつながる。本発明の例示的な抗原結合ポリペプチドによって提供される追加の利点は、半減期延長ドメイン、例えばHSAに特異的に結合する結合ドメインを有することに起因する、延長された薬物動態学的排除半減期である。この点において、本発明の例示的な抗原結合ポリペプチドは、延長された血清滞留半減期を有する。このモチーフの例示的なポリペプチド構築物は、いくつかの実施形態では、約2、3、約5、約7、約10、約12、または約14日間の半減期を有する。これは、比較的短い排除半減期を有するBiTEまたはDART分子のような他の結合タンパク質とは有利に対照的である。例えば、BiTE CD19×CD3二重特異性scFv-scFv融合分子は、その短い排除半減期に起因して、連続静脈内注入(i.v.)薬物送達を必要とする。本発明の例示的な抗原結合ポリペプチドのより長い内因性半減期は、この欠点を改善し、それにより、低用量薬学的製剤、周期的投与の減少、及び/または本発明の化合物を組み込む新規の薬学的組成物のような治療可能性の増加を可能にする。
本発明の例示的な抗原結合ポリペプチドはまた、組織浸透及び分布の増強、ならびに初回通過腎クリアランスの低減のための最適なサイズを有する。腎臓は一般に約50kDa未満の分子を濾過するので、タンパク質治療の設計におけるクリアランスを低減する取り組みは、タンパク質融合、グリコシル化、またはポリエチレングリコールポリマー(すなわちPEG)の添加によって、分子サイズを増加させることに焦点を当てている。しかしながら、タンパク質治療薬のサイズを増加させることは、腎クリアランスを防止し得るが、より大きいサイズは、標的組織への分子の浸透も防止する。本明細書に記載される例示的な抗原結合ポリペプチドは、急速な腎クリアランスを防止するアルブミンと会合することによってこれを回避しつつ、組織の浸透及び分布の増強、ならびに最適な有効性を可能にする小さいサイズも有する。種々の実施形態では、半減期延長ドメインは、切断可能なリンカーによって治療活性成分から分離されている分子内の位置に配置される。したがって、例えば、リンカーを切断する作用物質(例えば、プロテアーゼ、エステラーゼ、還元または酸化微小環境)内の所望の標的に到達すると、半減期延長ドメインは、治療活性成分から切断され、治療成分のサイズを低減し、組織へのその浸透または細胞による取り込みを促進する。他の実施形態では、半減期延長ドメインは、抗原結合ドメインと活性抗CD3ドメインとの間に配置される。
したがって、例示的な実施形態では、本発明は、CD-3抗原に対する単一鎖scFvポリペプチドを提供する。scFvポリペプチドは、切断可能なscFvリンカーを通じて連結された第1のscFvドメイン及び第2のscFvドメインを含む。第1のscFvドメインは、第1の切断可能なscFvリンカー部分を通じて接合された第1のVH
1ドメイン及び第1のVL
1ドメインを含む。VLまたはVHの1つは、その用語が本明細書で定義される際(すなわち、VL1i、VH1i)、不活性である。第1のVHドメイン及び第1のVLドメインは、相互作用して、第1のscFvを形成するが、不活性な同族であるため、scFvは、CD-3に特異的に結合しない。第1のscFvリンカー部分(例えば、CL1)は、第1のVH
1及び第1のVL
1ドメイン間の第1のプロテアーゼ切断部位を含む。プロテアーゼ切断部位での第1のscFvリンカーのプロテアーゼ切断時に、不活性なVHiまたは不活性VLiドメインは、そのVLまたはVH結合パートナーから分離し、これは次いで、その活性な同族と対合し、適切に対合した抗CD-3ドメインを形成し、CD-3抗原に結合することを可能にする。標的抗原結合ドメインは、リンカーを介して、VH/VL対の活性な同族に接続される。
例示的な実施形態では、第1のscFvドメインは、第2の切断部位(例えば、プロテアーゼ切断部位)を任意選択に含む第1のリンカー部分を介して、第2のscFvドメインに接合される。第2のscFvドメインは、第1のドメインと非常に類似して構築され、第2のscFvリンカー部分を介して接合された第2のVHドメイン及び第2のVLドメインを含む。第2のscFvリンカー部分は、第2のVHドメインと第2のVLドメインとの間の第3のプロテアーゼ切断部位を任意選択で含む。第2のVHドメイン及び第2のVLドメインは、相互作用して、第2のVH/VL対を形成する。上に記載される第1のVH/VL対と同様に、第2のVHドメイン及び第2のVLのうちの1つは、不活性であり、そのため、第2のscFvドメインは、CD-3抗原に特異的に結合せず、かつ第1及び第2のscFv結合ドメイン間複合体にも結合しない。第2のscFvドメインは、第2のドメインリンカーを通じて、第2の標的抗原結合ドメインに接合される。この第2のドメインリンカーは、第1のVHドメイン及び第1のVLドメインから選択されたメンバーを、第2の標的抗原結合ドメインに接合する。標的抗原結合ドメインは、リンカーを介して、VH/VL対の活性な同族に接続される。
本発明のポリペプチド構築物は、切断可能なリンカーにおいて切断され、CD-3抗原を提示する細胞の存在下で、CD-3抗原に結合する活性CD-3結合ドメインが形成される。同様に、標的抗原結合ドメインは、標的抗原に結合する。
例示的な実施形態では、本発明は、CD-3抗原に対する単一のscFvドメインを有する単一鎖scFvポリペプチドを提供する。scFvポリペプチドは、第1のscFvリンカー部分を通じて接合された第1のVHドメイン及び第1のVLドメインを含む、第1のscFvドメインを含む。この第1のscFvリンカー部分は、第1のVHドメインと第1のVLドメインとの間の第1の切断部位、例えば、プロテアーゼ切断部位を含む。第1のVHドメイン及び第1のVLドメインは、相互作用して、第1のVHドメイン及び第1のVLドメインのうちの1つが不活性である、第1のVH/VL対を形成する。したがって、第1のscFvドメインは、CD-3抗原に特異的に結合することができない。第1のscFvポリペプチドは、第1のドメインリンカー部分を通じて、第1の標的抗原結合ドメインに接合される。第1のドメインリンカーは、第1のVHドメイン及び第1のVLドメインから選択されるメンバーを、第1の標的抗原結合ドメインに接合する。第1の標的抗原結合ドメインは、不活性VLまたは不活性VHに連結されていない。
例示的な実施形態では、上に記載される単一ドメインscFv構築物の一対が提供される。構築物の対は、それらの対合したCD-3結合ドメインを通じて、CD-3抗原に協働的に結合する。対の個々のscFv分子の対合したCD-3部位のCD-3抗原への結合は、対の各メンバーの標的抗原結合ドメインのその同族抗原への結合により、促進、増強、及び/または駆動される。
いくつかの実施形態では、抗原結合ポリペプチドが提供され、2つ以上の可逆的に不活性なCD3結合ドメインと、2つ以上の標的抗原結合ドメインと、任意選択で1つ以上の半減期延長ドメインと、1つ以上プロテアーゼ切断ドメインと、を含む、単一ポリペプチド鎖を含み、プロテアーゼ切断ドメインのプロテアーゼ切断時に、CD3結合ドメインは、活性になり、CD3に結合する。例示的な実施形態では、CD3結合ドメインは、活性になり、プロテアーゼ切断部位の切断に続いて、CD3に結合することができる。種々の実施形態では、CD3結合ドメインは、プロテアーゼ切断部位の切断、及び標的抗原結合ドメイン(複数可)による標的抗原(複数可)の結合後に、活性になる。いくつかの実施形態では、CD3への結合は、T細胞を活性化し、これは次に、罹患(例えば、癌性)細胞を破壊する。
例示的な実施形態では、本発明のポリペプチド構築物は、CD3に選択的に結合する結合ドメインを含むscFvを含む。CD3結合ドメインは、CD3に選択的に結合することができるVHまたはVLを含む。このVHまたはVLは、それぞれVLまたはVHと対合される。
本発明のポリペプチドは、CD3結合ドメイン(複数可)及びプロテアーゼ切断部位(複数可)を組み込むscFvを含む、条件的CD3結合ポリペプチドを参照して本明細書に例示されており、これは、プロテアーゼによる切断の際に、不活性VLまたはVHを、その対合した活性VHまたはVLからそれぞれ分離し、CD3結合ドメイン(複数可)を活性化し、CD3へのその(それらの)結合を可能にする。代表的なscFvは、プロテアーゼ切断部位を含むポリペプチドリンカーを介して連結されたVHドメイン及びVLドメインを含む。CD3結合ドメインは、可逆的に不活性であり、したがって、プロテアーゼ切断部位のプロテアーゼ切断まで、CD3に実質的に結合することができない。プロテアーゼ切断部位を切断することができる代表的なプロテアーゼは、癌細胞によって発現されるか、または腫瘍微小環境内に局在するプロテアーゼである。例示的な実施形態では、本発明のポリペプチドは、少なくとも1つの標的抗原結合部位をさらに含む。代表的な標的抗原は、癌細胞の表面に見出される抗原、例えば、EGFRである。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼ切断ドメインは、標的抗原結合ドメインが標的抗原(複数可)に結合する前に切断される。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ切断ドメインは、抗原結合ドメイン(複数可)が標的抗原に結合した後に切断される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、2つ以上の標的抗原結合ドメインを含む。2つ以上の抗原結合ドメインは、同じまたは異なるポリペプチド配列を有する。種々の実施形態では、2つ以上の抗原結合ドメインは、同じまたは異なるポリペプチド配列を有し、同じ標的抗原に結合する。例示的な実施形態では、2つ以上の抗原結合ドメインのポリペプチド配列は異なり、2つ以上のドメインは、同じ標的抗原または異なる標的抗原に結合する。いくつかの実施形態では、2つ以上の標的抗原結合ドメインの各々は、同じ細胞上の異なる配列または構造の標的抗原に結合する。例示的な実施形態では、2つ以上の標的抗原結合ドメインの各々は、2つ以上の細胞の各々の異なる配列の抗原に結合する。種々の実施形態では、2つ以上の抗原結合ドメインの各々は、2つ以上の細胞の各々上の同じ配列または異なる配列の抗原に結合する。
本明細書において、条件的に結合する抗原結合ポリペプチド、その薬学的組成物、ならびにそのような抗原結合ポリペプチドを作製するための核酸、組換え発現ベクター、及び宿主細胞、ならびに本発明の抗原結合ポリペプチドを使用する疾患、障害、または状態の治療のための方法が記載される。
本発明の他の目的、実施形態、及び利点は、以下の詳細な説明において明らかである。
本発明の新規な特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に記載されている。本発明の特徴及び利点のより良好な理解は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を記載する以下の詳細な説明、及び添付の図面を参照することによって得られるであろう。
導入
条件的に活性化可能な抗原結合ポリペプチドが本明細書に記載される。本発明の例示的なポリペプチドは、少なくとも1つの標的抗原結合ドメイン、VH及びVLのうちの少なくとも一方がCD-3への特異的結合に関して不活性である少なくとも1つのVH/VL対を有するCD-3に対する少なくとも1つのscFv、ポリペプチド構築物の構成要素と共有結合する種々のscFv及びドメインリンカー、ならびに1つ以上のドメイン及び/またはscFvリンカー及び任意選択で1つ以上の半減期延長ドメイン内の切断可能な部位を含む。例示的な切断可能な部位は、ポリペプチド構築物が指向される腫瘍の微小環境に位置するかまたは集中する血清酵素(例えば、エステラーゼ)または分解酵素(例えば、プロテアーゼ)によって切断可能である。例示的な分解酵素は、腫瘍によって、または腫瘍微小環境内で発現されるプロテアーゼである。構築物のリンカー中の少なくとも1つの切断可能な部位が切断されると、scFv対の不活性メンバー(複数可)が構築物から除去され、scFv対の活性メンバー(複数可)が、その活性同族体と相互作用する(例えば、VH 1/VLi1がVH 1となり、VHi2/VL 2がVL 2となり、VH 1及びVL 2が相互作用して、CD-3に特異的に結合する機能的scFvを形成する)。構築物はまた、標的抗原結合ドメインを介して選択された標的抗原に特異的に結合する。例示的な実施形態では、VH 1及びVL 2は、標的抗原結合ドメインをVH 1及びVL 2にさらに連結するドメインリンカーによって接合されたままである。本発明のある特定のポリペプチド構築物はまた、ポリペプチドの投与を、それを必要とする対象に行った後で、そのポリペプチドの半減期を増大させる、1つ以上の半減期延長ドメインを含む。例示的な半減期延長ドメインは、循環血漿タンパク質(例えば、HSA)に対する抗体または抗体フラグメントである。半減期延長ドメイン(複数可)は、半減期延長ドメインが、その目的、例えば、構築物の腫瘍への送達、または所望のインビボ循環半減期の完了を達成した後で構築物から切断されるように、半減期延長ドメインと構築物の残りとの間に1つ以上の切断可能なリンカーを有するポリペプチド配列中に含まれ得る。半減期延長ドメイン(複数可)は、半減期延長ドメインが、CD3結合ドメインの活性化の後でポリペプチド中に保持されるように、半減期延長ドメインと構築物の残りとの間に切断可能なリンカーを有しないポリペプチド配列中に含まれ得る。添付の図面は、本発明のポリペプチド構築物の多くの例示的なモチーフの構造を提供する。
条件的に活性化可能な抗原結合ポリペプチドが本明細書に記載される。本発明の例示的なポリペプチドは、少なくとも1つの標的抗原結合ドメイン、VH及びVLのうちの少なくとも一方がCD-3への特異的結合に関して不活性である少なくとも1つのVH/VL対を有するCD-3に対する少なくとも1つのscFv、ポリペプチド構築物の構成要素と共有結合する種々のscFv及びドメインリンカー、ならびに1つ以上のドメイン及び/またはscFvリンカー及び任意選択で1つ以上の半減期延長ドメイン内の切断可能な部位を含む。例示的な切断可能な部位は、ポリペプチド構築物が指向される腫瘍の微小環境に位置するかまたは集中する血清酵素(例えば、エステラーゼ)または分解酵素(例えば、プロテアーゼ)によって切断可能である。例示的な分解酵素は、腫瘍によって、または腫瘍微小環境内で発現されるプロテアーゼである。構築物のリンカー中の少なくとも1つの切断可能な部位が切断されると、scFv対の不活性メンバー(複数可)が構築物から除去され、scFv対の活性メンバー(複数可)が、その活性同族体と相互作用する(例えば、VH 1/VLi1がVH 1となり、VHi2/VL 2がVL 2となり、VH 1及びVL 2が相互作用して、CD-3に特異的に結合する機能的scFvを形成する)。構築物はまた、標的抗原結合ドメインを介して選択された標的抗原に特異的に結合する。例示的な実施形態では、VH 1及びVL 2は、標的抗原結合ドメインをVH 1及びVL 2にさらに連結するドメインリンカーによって接合されたままである。本発明のある特定のポリペプチド構築物はまた、ポリペプチドの投与を、それを必要とする対象に行った後で、そのポリペプチドの半減期を増大させる、1つ以上の半減期延長ドメインを含む。例示的な半減期延長ドメインは、循環血漿タンパク質(例えば、HSA)に対する抗体または抗体フラグメントである。半減期延長ドメイン(複数可)は、半減期延長ドメインが、その目的、例えば、構築物の腫瘍への送達、または所望のインビボ循環半減期の完了を達成した後で構築物から切断されるように、半減期延長ドメインと構築物の残りとの間に1つ以上の切断可能なリンカーを有するポリペプチド配列中に含まれ得る。半減期延長ドメイン(複数可)は、半減期延長ドメインが、CD3結合ドメインの活性化の後でポリペプチド中に保持されるように、半減期延長ドメインと構築物の残りとの間に切断可能なリンカーを有しないポリペプチド配列中に含まれ得る。添付の図面は、本発明のポリペプチド構築物の多くの例示的なモチーフの構造を提供する。
2つ以上のVH/VL対を有する本発明のポリペプチド構築物は、単一体として存在する。種々の実施形態において、本発明の化合物は、単一のVH/VL対を含む。これらの実施形態において、ポリペプチド構築物は、一般に、対で使用され、ここでは、対の一方のメンバーがVH/VLiを含み、他方がVHi/VLを含み、その結果、対の不活性の方の切断時に、VH/VLが対になりCD-3に結合することができるようになる。
本発明のポリペプチド構築物の例示的な実施形態において、疾患細胞標的化ドメインは、切断不可能なリンカー(NCL1及びNCL2)によって活性な抗T細胞結合セグメントに連結される。活性及び不活性抗T細胞scFvセグメントは、疾患組織微小環境(CL1及びCL2)に対して感受性である切断可能なリンカーによって連結される。2つの半分子またはタンパク質領域は、別の分解可能なリンカー(RL)によって連結される。図53。
種々の実施形態において、初期構築物は、体内への注入後に、局所リンカー(RL)での切断によって分離され得る2つのポリペプチド領域から構成される。疾患標的結合ドメインは先行して活性であり、それらの標的に結合することで、罹患細胞の表面上の不活性タンパク質を富化することができる。次いで、切断可能なリンカーを疾患組織微小環境において切断することができ、活性T細胞結合セグメント(標的化ドメイン及び切断不可能なリンカーによって罹患細胞に結合する)を再結合させて、活性T細胞結合scFvを罹患細胞の表面上に創出することができる。活性T細胞結合scFvを創出するためのこの組換えにより、T細胞が罹患細胞に結合し、それを殺滅する。1~2個の半減期延長ドメインは、罹患細胞に到達する前に分子の循環半減期を延長し、不活性抗T細胞ドメイン(VLiまたはVHi)と共に除去されて、それらが罹患組織を離れる場合には切断された/活性化された分子の半減期を制限する。罹患細胞上に蓄積するのに十分な半減期を有することを確実にするために、局所リンカーが腫瘍中で切断される場合には1個の半減期延長ドメインが望ましく、局所リンカーが血液中で切断される場合には2個が望ましい。腫瘍関連及び血液関連酵素によって切断可能なリンカーを含むポリペプチド構築物は、本発明の範囲内である。
ポリペプチド構築物の薬学的組成物、ならびにこれらの構築物を作製するための核酸、組換え発現ベクター、及び宿主細胞も本発明により提供される。疾患、状態、及び障害の予防及び/または治療において開示されるポリペプチドを使用する方法も提供される。
定義
本発明をより完全に理解できるようにするため、いくつかの定義を以下に示す。そのような定義は、文法的等価物を包含するものである。
本発明をより完全に理解できるようにするため、いくつかの定義を以下に示す。そのような定義は、文法的等価物を包含するものである。
「アミノ酸」及び「アミノ酸同一性」は、本明細書で使用される場合、特定の規定された位置に存在し得る20種の天然に存在するアミノ酸または任意の非天然類似体のうちの1つを意味する。本明細書における「タンパク質」は、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、及びペプチドを含む、少なくとも2つの共有結合したアミノ酸を意味する。このタンパク質は、天然に存在するアミノ酸及びペプチド結合、または合成ペプチド模倣構造、すなわち、特にLCペプチドが患者に投与される場合には、ペプトイド(Simon et al.,PNAS USA 89(20):9367(1992)を参照のこと)のような「類似体」で構成され得る。したがって、「アミノ酸」または「ペプチド残基」は、本明細書で使用される場合、天然アミノ酸及び合成アミノ酸の両方を意味する。例えば、ホモフェニルアラニン、シトルリン、及びノレオロイシンは、本発明の目的ではアミノ酸と見なされる。「アミノ酸」には、プロリン及びヒドロキシプロリンなどのイミノ酸残基も含まれる。側鎖は、(R)または(S)立体配置のいずれかであり得る。好ましい実施形態では、アミノ酸は(S)またはL立体配置である。天然に存在しない側鎖が使用される場合、非アミノ酸置換基が、例えば、インビボの分解を防止または遅延させるために使用され得る。
本明細書における「アミノ酸修飾」は、ポリペプチド配列におけるアミノ酸の置換、挿入、及び/もしくは欠失、またはタンパク質に化学的に連結された部分への改変を意味する。例えば、改変は、タンパク質に結合した改変された炭水化物またはPEG構造であってもよい。本明細書における「アミノ酸修飾」は、ポリペプチド配列中のアミノ酸の置換、挿入、及び/または欠失を意味する。明確にするために、別段の記載がない限り、アミノ酸修飾は、常に、DNAによってコードされるアミノ酸、例えば、DNA及びRNAにコドンを有する20個のアミノ酸に対するものである。本明細書における好ましいアミノ酸修飾は置換である。
本明細書における「アミノ酸置換」または「置換」は、親ポリペプチド配列中の特定の位置のアミノ酸を異なるアミノ酸で置換することを意味する。特に、いくつかの実施形態では、置換は、特定の位置で天然に存在しない(生物内で天然に存在しないか、またはいずれの生物中にも存在しない)アミノ酸に対するものである。例えば、置換E272Yは、272位のグルタミン酸がチロシンで置換されている変異体ポリペプチド、この場合はFc変異体を指す。明確にするために、核酸コード配列を変化させるが、出発アミノ酸を変化させない(例えば、宿主生物発現レベルを上昇させるためにCGG(アルギニンをコードする)をCGA(アルギニンをなおコードする)に交換する)ように操作されたタンパク質は、「アミノ酸置換」ではない。すなわち、同じタンパク質をコードする新しい遺伝子の創出にもかかわらず、タンパク質は、それが開始する特定の位置に同じアミノ酸を有する場合、それはアミノ酸置換ではない。
「アミノ酸挿入」または「挿入」は、本明細書で使用される場合、親ポリペプチド配列の特定の位置にアミノ酸配列を付加することを意味する。例えば、-233Eまたは233Eは、233位の後、及び234位の前のグルタミン酸の挿入を示す。さらに、-233ADEまたはA233ADEは、233位の後、及び234位の前のAlaAspGluの挿入を示す。
「アミノ酸欠失」または「欠失」は、本明細書で使用される場合、親ポリペプチド配列中の特定の位置でアミノ酸配列を除去することを意味する。例えば、E233-またはE233#、E233()またはE233delは、233位のグルタミン酸の欠失を示す。さらに、EDA233-またはEDA233#は、233位で始まる配列GluAspAlaの欠失を示す。
本明細書で使用される場合、本明細書における「ポリペプチド」は、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、及びペプチドを含む、少なくとも2つの共有結合したアミノ酸を意味する。ペプチジル基は、天然に存在するアミノ酸及びペプチド結合、または合成ペプチド模倣構造、すなわちペプトイド(全体が参照により組み込まれるSimon et al.,PNAS USA 89(20):9367(1992)を参照のこと)などの「類似体」を含んでもよい。アミノ酸は、当業者には理解されるであろうとおり、天然に存在するものでも合成物(例えば、DNAによってコードされるアミノ酸ではないもの)でもよい。例えば、ホモフェニルアラニン、シトルリン、オルニチン、及びノレオロイシンは、本発明の目的では合成アミノ酸と考えられ、D-及びL-(RまたはS)立体配置のアミノ酸の両方を利用することができる。本発明の変異体は、Cropp&Shultz,2004,Trends Genet.20(12):625-30、Anderson et al.,2004, Proc Natl Acad Sci USA 101(2):7566-71、Zhang et al.,2003,303(5656):371-3、及びChin et al.,2003,Science 301(5635):964-7によって説明されている方法が挙げられるがこれらに限定されない、Schultz及び共同研究者らによって開発された技術を使用して組み込まれた合成アミノ酸の使用を含む修飾を含み得る。さらに、ポリペプチドには、1つ以上の側鎖または末端の合成誘導体化、グリコシル化、PEG化、円順列、環化、他の分子へのリンカー、タンパク質またはタンパク質ドメインへの融合、及びペプチドタグまたは標識の付加が含まれ得る。
本明細書に概説されるように、本発明のポリペプチドは、CD3及び標的細胞受容体に特異的に結合する。本明細書における「特異的に結合する」は、ポリペプチドが、少なくとも10-4~10-6M-1の範囲、好ましくは、10-7~10-9M-1の範囲の結合定数を有することを意味する。
グリコシル化されたポリペプチドが「ポリペプチド」の定義内に特に含まれる。「アグリコシル化ポリペプチド」は、本明細書で使用される場合、Fc領域の297位に結合した炭水化物を欠くポリペプチドを意味し、番号付けはKabatのようにEUシステムに従う。アグリコシル化ポリペプチドは、脱グリコシル化ポリペプチド、つまり、Fc炭水化物が、例えば、化学的または酵素的に除去された、抗体または抗体フラグメントである。あるいは、アグリコシル化ポリペプチドは、グリコシル化パターンをコードする1つまたは残基の突然変異によって、またはタンパク質に炭水化物を結合させない生物、例えば、細菌における発現によって、Fc炭水化物なしで発現される非グリコシル化(nonglycosylated)または非グリコシル化(unglycosylated)抗体であってもよい。
「親ポリペプチド」または「前駆体ポリペプチド」(Fc親または前駆体を含む)は、本明細書で使用される場合、変異体を生成するために続いて修飾されるポリペプチドを意味する。該親ポリペプチドは、天然に存在するポリペプチド、または天然に存在するポリペプチドの変異体もしくは操作されたバージョンであってもよい。親ポリペプチドは、ポリペプチド自体、親ポリペプチドを含む組成物、またはそれをコードするアミノ酸配列を指してもよい。したがって、「親Fcポリペプチド」は、本明細書で使用される場合、変異体を生成するように修飾される非修飾Fcポリペプチドを意味し、「親抗体」は、本明細書で使用される場合、変異体抗体を生成するように修飾される非修飾抗体を意味する。
「位置」は、本明細書で使用される場合、タンパク質の配列中の場所を意味する。位置は、順番に、または確立されているフォーマット、例えば、抗体番号付けのためのEUインデックスに従って、番号付けされてもよい。
「標的抗原」は、本明細書で使用される場合、所与の抗体の可変領域によって特異的に結合される分子を意味する。標的抗原は、タンパク質、炭水化物、脂質、または他の化合物であってもよい。多岐にわたる好適な例示的標的抗原が本明細書に記載されている。
「標的細胞」は、本明細書で使用される場合、標的抗原を発現する細胞を意味する。
本明細書における「抗体」とは、認識された免疫グロブリン遺伝子の全部または一部によって実質的にコードされる1つ以上のポリペプチドからなるタンパク質を意味する。例えばヒトにおいて認識される免疫グロブリン遺伝子は、無数の可変領域遺伝子を共に構成する、カッパ(κ)、ラムダ(λ)、及び重鎖遺伝子座、ならびにIgM、IgD、IgG、IgE、及びIgAアイソタイプをそれぞれコードする、定常領域遺伝子のミュー(μ)、デルタ(δ)、ガンマ(γ)、シグマ(ε)、及びアルファ(α)を含む。本明細書の抗体は、全長抗体及び抗体フラグメントを含むことを意味し、任意の生物由来の天然抗体、操作された抗体、または以下にさらに定義される、実験目的、治療目的、または他の目的のために組換え生成される抗体を指してもよい。したがって、「抗体」には、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体(mAb)の両方が含まれる。モノクローナル及びポリクローナル抗体の調製方法及び精製方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、Harlow and Lane,Antibodies:A Laboratory Manual(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1988)に記載されている。本明細書で概説するように、「抗体」は、本明細書に記載のFc変異体、本明細書に記載のFc変異体フラグメントを含む「全長」抗体、及び本明細書に記載の他のタンパク質へのFc変異体融合体を特に含む。
「抗体」という用語には、当該技術分野で既知であるように、抗体フラグメント、例えば、抗体全体の修飾によって産生されるか、または組換えDNA技術を用いてデノボ合成される、単一鎖抗体(例えば、scFv)、キメラ抗体などの、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fcs、または抗体の他の抗原結合部分配列が含まれる。「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体及びアゴニストまたはアンタゴニスト抗体であり得るmAbをさらに含む。
Fc変異体部分を含む全長抗体が、「抗体」の定義内に特に含まれる。本明細書における「全長抗体」は、可変領域及び定常領域を含む、抗体の天然の生物学的形態を構成する構造を意味する。例えば、ヒト及びマウスを含むほとんどの哺乳動物において、IgGクラスの全長抗体は四量体であり、2つの免疫グロブリン鎖の2つの同一の対からなり、各対は軽鎖及び重鎖を1つずつ有し、各軽鎖は免疫グロブリンドメインVL及びCLを含み、各重鎖は免疫グロブリンドメインVH、Cγ1、Cγ2、及びCγ3を含む。一部の哺乳動物、例えば、ラクダ及びラマでは、IgG抗体は2つの重鎖のみからなってもよく、各重鎖はFc領域に結合した可変ドメインを含む。「IgG」は、本明細書で使用される場合、認識された免疫グロブリンガンマ遺伝子によって実質的にコードされる抗体のクラスに属するポリペプチドを意味する。ヒトでは、このクラスは、IgG1、IgG2、IgG3、及びIgG4を含む。マウスでは、このクラスは、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3を含む。
好ましい実施形態では、本発明の抗体はヒト化されている。現在のモノクローナル抗体技術を用いることで、識別することができる事実上あらゆる標的抗原に対するヒト化抗体を産生させることができる[Stein,Trends Biotechnol.15:88-90(1997)]。非ヒト(例えばネズミ)抗体のヒト化形態は、免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはその断片(Fv、Fc、Fab、Fab’、F(ab’)2、または抗体の他の抗原結合部分配列など)のキメラ分子であり、これは非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含む。ヒト化抗体には、レシピエントの相補性決定領域(CDR)を形成する残基が、所望される特異性、親和性、及び能力を有する、マウス、ラット、またはウサギなどの非ヒト種(ドナー抗体)のCDR由来の残基によって代置される、ヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)が含まれる。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって代置される。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体にも、インポートされたCDRまたはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでもよい。一般に、ヒト化抗体は、CDR領域の全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応するか、あるいはFR領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含むことになる。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域(Fc)の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものを含むことになる[Jones et al.,Nature 321:522-525(1986)、Riechmann et al.,Nature 332:323-329(1988)、及びPresta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)]。
非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当技術分野で周知である。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から導入された1つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合、インポート残基(import residue)と呼ばれ、典型的にはインポート可変ドメインから取られる。ヒト化は、本質的に、Winter及び共同研究者らの方法[Jones et al.,上記、Riechmann et al.,上記、及びVerhoeyen et al.,Science,239:1534-1536(1988)]に従って、齧歯類のCDRまたはCDR配列でヒト抗体の対応する配列を置換することによって行うことができる。ヒト化ネズミモノクローナル抗体のさらなる例、例えば、ヒトプロテインCに結合する抗体[O’Connor et al.,Protein Eng.11:321-8(1998)]、インターロイキン2受容体[Queen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.86:10029-33(1989)]、及びヒト上皮成長因子受容体2[Carter et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:4285-9(1992)]も当該技術分野で既知である。したがって、そのようなヒト化抗体は、無傷を大幅に下回るヒト可変ドメインが、非ヒト種由来の対応する配列によって置換されている、キメラ抗体(米国特許第4,816,567号)である。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかのCDR残基及び場合によりいくつかのFR残基が、齧歯類抗体の類似部位由来の残基によって置換されているヒト抗体である。
好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドはヒト配列に基づいており、したがって、ヒト配列は、ラット、マウス、及びサルの配列などの他の配列を比較する「ベース」配列として使用される。一次配列または構造との相同性を確立するために、前駆体または親抗体またはscFvのアミノ酸配列は、対応するヒト配列と直接比較される。本明細書に記載の相同性アライメントプログラムのうちの1つ以上を使用して(例えば、保存された残基を間種(between species)として使用して)配列のアラインメントを行って、アラインメントを維持するために必要な挿入及び欠失を可能にした(すなわち、恣意的な欠失及び挿入による保存された残基の排除を避ける)後で、ヒトポリペプチドの一次配列における特定のアミノ酸に相当する残基が定義される。保存された残基のアラインメントは、好ましくは、そのような残基の100%を保存すべきである。しかしながら、75%を超える、またはわずか50%の保存された残基のアラインメントも、等価残基(本明細書では「対応する残基」と呼ばれることもある)を定義するためには十分である。
「残基」は、本明細書で使用される場合、タンパク質中の位置、及びその関連アミノ酸同一性を意味する。例えば、アスパラギン297(Asn297またはN297とも呼ばれる)は、ヒト抗体IgG1中の297位の残基である。
等価残基はまた、三次構造がX線結晶学によって決定されているscFvフラグメントについて、三次構造のレベルで相同性を決定することによって定義され得る。等価残基は、親または前駆体の特定のアミノ酸残基の2つ以上の主鎖原子(Nに対してN、CAに対してCA、Cに対してC、及びOに対してO)の原子座標が、アラインメントを行った後で、0.13nm、好ましくは0.1nm以内であるものとして定義される。scFv変異体フラグメントの非水素タンパク質原子の原子座標の重複が最大となるように配向され位置決めされると、アラインメントが達成される。
「Fv」または「Fvフラグメント」または「Fv領域」は、本明細書で使用される場合、単一抗体のVL及びVHドメインを含むポリペプチドを意味する。当業者には理解されるように、これらは一般に、2つの鎖で構成されているか、または組み合わさって(一般に、本明細書で考察されるようなリンカーによって)、scFvを形成することができる。
本明細書における「単一鎖Fv」または「scFv」は、一般に本明細書で考察されるようなscFvリンカーを使用して可変軽(VL)ドメインに共有結合し、scFvまたはscFvドメインを形成する、可変重(VH)ドメインを意味する。scFvドメインは、N-末端からC-末端(VH-リンカー-VLまたはVL-リンカー-VH)のいずれかの配向にあり得る。
「可変領域」は、本明細書で使用される場合、カッパ、ラムダ、ならびに重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子座をそれぞれ構成する、Vκ、Vλ、VL、及び/またはVH遺伝子のいずれかによって実質的にコードされる1つ以上のIgドメインを含む免疫グロブリンの領域を意味する。
本明細書で使用される場合、「不活性VH」及び「不活性VL」は、それらの同族のVLまたはVHパートナーと対になったときに、それぞれ、もし「不活性」ではない類似のVLまたはVHに結合したとしたら、「活性」VHまたは「活性」VLが結合する抗原に特異的に結合しない、結果として得られるVH/VL対を形成する、scFvの成分を指す。例示的な「不活性VH」及び「不活性VL」ドメインは、野生型VHまたはVL配列の突然変異によって形成される。例示的な突然変異は、VHまたはVLのCDR1、CDR2、またはCDR3内にある。例示的な突然変異は、CDR2内にドメインリンカーを配置することを含み、それによって「不活性VH」または「不活性VL」ドメインを形成する。対照的に、「活性VH」または「活性VL」は、その「活性」同族パートナー、すなわち、VLまたはVHとそれぞれ対合すると、その標的抗原に特異的に結合することができるものである。
対照的に、本明細書で使用される場合、「活性な」という用語は、CD-3に特異的に結合することができるCD-3結合ドメインを指す。この用語は2つの状況で使用される:(a)同族パートナーと対になり、CD-3に結合することができる配列のものである、scFv結合対(すなわち、VHまたはVL)の単一メンバーを指す場合;(b)CD-3に特異的に結合することができる配列の同族体(すなわち、VH及びVL)の対。例示的な「活性」VH、VL、またはVH/VL対は、野生型配列または親配列である。
「CD-x」は、表面抗原分類(CD)タンパク質を指す。例示的な実施形態では、CD-xは、本発明のポリペプチド構築物が投与された対象におけるT細胞の動員または活性化における役割を有するCDタンパク質から選択される。例示的な実施形態において、CD-xはCD3である。
「結合ドメイン」という用語は、本発明に関連して、標的分子(抗原)上の所与の標的エピトープまたは所与の標的部位に(特異的に)結合する/それと相互作用する/それを認識するドメイン、例えば、それぞれ、EGFR及びCD-3を述べる。標的抗原結合ドメイン(EGFRを認識する)の構造及び機能、好ましくはCD-3結合ドメイン(CD3を認識する)の構造及び/または機能も、抗体、例えば、全長または全免疫グロブリン分子の構造及び/または機能に基づいている。本発明によれば、標的抗原結合ドメインは、3つの軽鎖CDR(すなわち、VL領域のCDR1、CDR2、及びCDR3)及び/または3つの重鎖CDR(すなわち、VH領域のCDR1、CDR2、及びCDR3)を特徴とする。CD-3結合ドメインは、少なくとも、標的結合を可能にする抗体の最低限の構造要件も含むことが好ましい。より好ましくは、CD-3結合ドメインは、少なくとも3つの軽鎖CDR(すなわち、VL領域のCDR1、CDR2、及びCDR3)及び/または3つの重鎖CDR(すなわち、VH領域のCDR1、CDR2、及びCDR3)を含む。例示的な実施形態において、標的抗原及び/またはCD-3結合ドメインは、ファージディスプレイ法またはライブラリースクリーニング法によって産生されるか、または得ることが可能であると予測される。
「Fc」、「Fc領域」、「FCポリペプチド」などは、本明細書で使用される場合、最初の定常領域免疫グロブリンドメインを除く抗体の定常領域を含むポリペプチドを含むと本明細書に定義される抗体を意味する。したがって、Fcは、IgA、IgD、及びIgGの最後の2つの定常領域免疫グロブリンドメインと、IgE及びIgMの最後の3つの定常領域免疫グロブリンドメインと、これらのドメインに対する可撓性ヒンジN-末端とを指す。IgA及びIgMについては、FcはJ鎖を含んでもよい。IgGの場合、Fcは免疫グロブリンドメインCγ2及びCγ3、ならびにCγ1とCγ2との間のヒンジを含む。Fc領域の境界は異なり得るが、ヒトIgG重鎖Fc領域は、通常、そのカルボキシル末端に残基C226またはP230を含むと定義され、番号付けは、KabatのEUインデックスに従う。Fcは、孤立した本領域、または抗体、抗体フラグメント、もしくはFc融合体との関連における本領域を指し得る。Fcは、抗体、Fc融合体、またはFcを含むタンパク質もしくはタンパク質ドメインであってもよい。Fcの天然に存在しない変異体であるFc変異体が特に好ましい。
「IgG」は、本明細書で使用される場合、認識された免疫グロブリンガンマ遺伝子によって実質的にコードされる抗体のクラスに属するポリペプチドを意味する。ヒトでは、このクラスは、IgG1、IgG2、IgG3、及びIgG4を含む。マウスでは、このクラスは、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3を含む。本明細書における「免疫グロブリン(Ig)」とは、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされる1つ以上のポリペプチドからなるタンパク質を意味する。免疫グロブリンには、抗体が挙げられるが、これらに限定されない。免疫グロブリンは、全長抗体、抗体フラグメント、及び個々の免疫グロブリンドメインが挙げられるがこれらに限定されない、ある数の構造形態を有し得る。本明細書における「免疫グロブリン(Ig)ドメイン」は、タンパク質構造の当業者によって確認されるような別個の構造実体として存在する免疫グロブリンの領域を意味する。Igドメインは、典型的には、特徴的なサンドイッチ折り畳みトポロジーを有する。抗体のIgGクラスにおける既知のIgドメインは、VH、Cγ1、Cγ2、Cγ3、VL、及びCLである。
本明細書における「野生型またはWT」は、対立遺伝子変異を含む、自然界に見出されるアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を意味する。WTタンパク質は、意図的に修飾されていないアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を有する。
「変異体ポリペプチド」は、本明細書で使用される場合、少なくとも1つのアミノ酸修飾により親ポリペプチド配列のものとは異なるポリペプチド配列を意味する。修飾には、置換、欠失、及び付加が含まれ得る。変異体ポリペプチドは、ポリペプチド自体、ポリペプチドを含む組成物、またはそれをコードするアミノ配列を指してもよい。好ましくは、変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドと比較して少なくとも1つのアミノ酸修飾、例えば、親と比較して約1~約10のアミノ酸修飾、好ましくは約1~約5のアミノ酸修飾を有する。本明細書の変異体ポリペプチド配列は、好ましくは、親ポリペプチド配列と少なくとも約80%の相同性、最も好ましくは少なくとも約90%の相同性、より好ましくは少なくとも約95%の相同性を有することになる。したがって、「Fc変異体」は、本明細書で使用される場合、少なくとも1つのアミノ酸修飾によって親Fc配列のFc配列とは異なるFc配列を意味する。同様に、例示的な「不活性VLドメイン」または「不活性VHドメイン」は、親VLまたはVHポリペプチドの変異体である。
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチド構築物は、「単離された」または「実質的に純粋な」ポリペプチド構築物である。「単離された」または「実質的に純粋な」は、本明細書に開示されるポリペプチド構築物を説明するために使用される場合、その産生環境の成分から、識別、分離、及び/または回収されたポリペプチド構築物を意味する。好ましくは、ポリペプチド構築物は、その産生環境からの他の全ての成分との関連を有しないか、または実質的に有しない。産生環境の汚染成分、例えば、組換えのトランスフェクトされた細胞から生じるものなどは、ポリペプチドの診断的または治療的使用を典型的に妨げ得る物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含み得る。産生培地中の所望のポリペプチド構築物は、培地中の全ポリペプチドの少なくとも約5重量%、少なくとも約25重量%、または少なくとも約50重量%を構成し得る。
本発明の例示的な単離されたポリペプチド構築物は、物質を産生するために使用される成分を実質的にまたは本質的に含まない。本発明のペプチドコンジュゲートに関して、「単離された」という用語は、ペプチドコンジュゲートを調製するために使用される混合物中の物質に通常付随する成分を実質的にまたは本質的に含まない物質を指す。「単離された」及び「純粋な」は互換的に使用される。典型的には、本発明の単離されたポリペプチド構築物は、好ましくはある範囲として表されるレベルの純度を有する。ポリペプチド構築物の純度の範囲の下限は、約60%、約70%、または約80%であり、純度の範囲の上限は、約70%、約80%、約90%、または約90%超である。
ポリペプチド構築物が約90%超純粋である場合、それらの純度も好ましくはある範囲として表される。純度の範囲の下限は、約90%、約92%、約94%、約96%、または約98%である。純度の範囲の上限は、約92%、約94%、約96%、約98%、または約100%の純度である。
純度は、任意の当該技術分野で認められている分析方法(例えば、銀染色ゲル上のバンド強度、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、HPLC、または同様の手段)によって決定される。
本発明によれば、結合ドメインは、1つ以上のポリペプチドの形態である。かかるポリペプチドは、タンパク質性部分及び非タンパク質性部分(例えば、グルタルアルデヒドなどの化学的リンカーまたは化学的架橋剤)を含んでもよい。ポリペプチド(そのフラグメント、好ましくは生物学的に活性なフラグメント、及び通常30個超のアミノ酸を有するペプチド)は、共有ペプチド結合(アミノ酸の鎖を生じる)を介して互いに結合した2つ以上のアミノ酸を含む。
結合ドメインとエピトープまたはエピトープを含む領域との間の相互作用は、結合ドメインが、エピトープ/特定のタンパク質または抗原(例えば、それぞれ、EGFR及びCD3)上のエピトープを含む領域に対する認知可能な親和性を呈し、EGFRまたはCD3以外のタンパク質または抗原との顕著な反応性を呈しないことを示唆する。「認知可能な親和性」は、約10-6M(KD)以上の親和性での結合を含む。好ましくは、結合は、結合親和性が、約10-12~10-8 M、10-12~10-9M、10-12~10-10M、10-11~10-8M、好ましくは約10-11~10-8Mであるときに、特異的であると見なされる。結合ドメインが標的と特異的に反応または結合するかどうかは、とりわけ、該結合ドメインと標的タンパク質または抗原との反応を、該結合ドメインとEGFRまたはCD3以外のタンパク質または抗原との反応と比較することによって容易に試験することができる。好ましくは、本発明の結合ドメインは、EGFRまたはCD3以外のタンパク質または抗原に本質的にまたは実質的に特異的に結合しない(すなわち、第1の結合ドメインはEGFR以外のタンパク質に特異的に結合せず、第2の結合ドメインはCD3以外のタンパク質に特異的に結合しない)。
特異的結合は、結合ドメイン及び抗原のアミノ酸配列における特定のモチーフによって駆動されると考えられている。このため、それらの一次、二次、及び/または三次構造の結果、ならびに該構造の二次修飾の結果として結合が達成される。抗原相互作用部位とその特異的抗原との特異的相互作用により、該部位の抗原への単純な結合が生じ得る。さらに、抗原相互作用部位とその特異的抗原との特異的相互作用により、代替的または追加的に、例えば、抗原の立体構造の変化の誘導、抗原のオリゴマー化などに起因して、シグナルの始動が生じ得る。
「本質的に特異的に結合しない」、「実質的に特異的に結合しない」、または「特異的に結合することができない」という用語は、互換的に使用され、本発明の結合ドメインが、EGFRまたはCD3以外のタンパク質または抗原に結合しない、すなわち、EGFRまたはCD3以外のタンパク質または抗原との反応性が、30%を超えない、好ましくは20%を超えない、より好ましくは10%を超えない、特に好ましくは9%、8%、7%、6%、または5%を超えないことを意味し、このため、EGFRまたはCD3への結合は、それぞれ、100%に設定される。これらの用語は、VH/VLiまたはVL/VHi対の抗原結合特性に関しても使用される。
「二重特異性」という用語は、本明細書で使用される場合、「少なくとも二重特異性」である本発明のポリペプチド構築物(「Pro」または「Prodent」)を指し、すなわち、これは、少なくとも第1の結合ドメイン(例えば、標的抗原、例えば、EGFR)と、第2の結合ドメイン(例えば、CD-3、例えば、CD3)とを含み、ここでは、第1の結合ドメインが一方の抗原または標的に結合し、第2の結合ドメインが別の抗原または標的に結合する。したがって、本発明によるポリペプチド構築物は、少なくとも2つの異なる抗原または標的に対する特異性を含む。本発明の「二重特異性ポリペプチド構築物」という用語はまた、多重特異的ポリペプチド、例えば、三重特異的ポリペプチド構築物(後者は3つの結合ドメインを含む)、または3つ超(例えば、4つ、5つなど)の特性を有する構築物を包含する。
本発明によるポリペプチド構築物が(少なくとも)二重特異性であるとすれば、それらは天然に存在せず、それらは天然に存在する産物とは顕著に異なる。よって、「二重特異性」ポリペプチド構築物は、異なる特異性を有する少なくとも2つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッドポリペプチドである。二重特異性ポリペプチド構築物は、種々の方法によって産生されることができる。例えば、Songsivilai&Lachmann,Clin.Exp.Immunol.79:315-321(1990)を参照されたい。
本発明のポリペプチド構築物の少なくとも2つの結合ドメイン及び可変ドメインは、ペプチドリンカー(スペーサーペプチド)を含む場合も含まない場合もある。「ペプチドリンカー」という用語は、本発明によれば、アミノ酸配列を含み、このアミノ酸配列によって、本発明の抗体構築物の一方の(可変及び/または結合)ドメイン及び別の(可変及び/または結合)ドメインのアミノ酸配列が互いに結合する。そのようなペプチドリンカーの本質的な技術的特徴は、いかなる重合活性も含まないことである。好適なペプチドリンカーの中には、米国特許第4,751,180号及び同第4,935,233号またはWO88/09344に記載されているものがある。ペプチドリンカーはまた、他のドメインまたはモジュールまたは領域(半減期延長ドメインなど)を本発明の抗体構築物に結合させるために使用することができる。
リンカーが使用される実施形態では、このリンカーは、好ましくは、標的抗原及びCD-3結合ドメインの各々が、互いに独立して、それらの異なる結合特異性を保持できることを確実にするために十分な長さ及び配列である。本発明の抗体構築物中の少なくとも2つの結合ドメイン(または2つの可変ドメイン)を接続するペプチドリンカーについては、最適化された数のアミノ酸残基、例えば、12個以下のアミノ酸残基を含むペプチドリンカーが好ましい。このため、12、11、10、9、8、7、6、または5アミノ酸残基のペプチドリンカーが有用である。5個未満のアミノ酸を有する想定されるペプチドリンカーは、4、3、2、または1個のアミノ酸(複数可)を含み、Glyに富んだリンカーが好ましい。該「ペプチドリンカー」の文脈において特に好ましい「単一の」アミノ酸はGlyである。したがって、該ペプチドリンカーは単一のアミノ酸Glyで構成されてもよい。ペプチドリンカーの別の好ましい実施形態は、アミノ酸配列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser、すなわち、Gly4Ser(配列番号1)、またはそのポリマー、すなわち、(Gly4Ser)x(式中、xは1以上(例えば、2または3)の整数である)を特徴とする。二次構造の促進がないことを含む該ペプチドリンカーの特徴は、当該技術分野で既知であり、例えば、Dall’Acqua et al.(Biochem.(1998)37,9266-9273)、Cheadle et al.(Mol Immunol(1992)29,21-30)、及びRaag and Whitlow(FASEB(1995)9(1),73-80)に記載されている。さらにいずれの二次構造も促進しないペプチドリンカーも有用である。該ドメインの相互への結合は、実施例に記載のように、例えば遺伝子操作によって提供することができる。融合し動作可能に結合した二重特異性単一鎖構築物を調製し、哺乳動物細胞または細菌においてそれらを発現させる方法は、当該技術分野において周知である(例えば、WO99/54440、またはSambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,2001)。
本発明の例示的な実施形態は、天然には存在しないが、scFvリンカーによって共に結合した可変重鎖ドメインと可変軽鎖ドメインとを一般に含む、少なくとも1つのscFvドメインを含む。本明細書に概説されるように、scFvドメインは、一般に、VH-scFvリンカー-VLとして配向されたN末端からC末端にあるが、これは、scFvドメイン(または、Fab由来のVH及びVL配列を使用して構築されたドメイン)のいずれに関しても、フォーマットに応じて一方または両方の端部に任意のリンカーを用いて、VL-scFvリンカー-VHへと逆転させることができる。一般に、VLまたはVHの一方は「不活性」である。
本明細書に示されるように、組換え技術によって生成される従来のペプチド結合を含めて、使用され得る好適なscFvリンカーは、ある数存在する。リンカーペプチドは、主に、以下のアミノ酸残基:Gly、Ser、Ala、またはThrを含み得る。リンカーペプチドは、それらが所望の活性を保持するように互いに対して正しい立体配座をとるような方法で2つの分子を結合させるのに十分な長さを有するべきである。一実施形態では、リンカーは、長さが約1~50アミノ酸、好ましくは長さが約1~30アミノ酸である。一実施形態では、長さが1~20アミノ酸のリンカーが使用されてもよく、いくつかの実施形態では約5~約10アミノ酸が使用を見出す。有用なリンカーには、例えば、nが少なくとも1(及び一般に3~4)の整数である、(GS)n、(GSGGS)n、(GGGGS)n、及び(GGGS)nを含むグリシン-セリンポリマー、グリシン-アラニンポリマー、アラニン-セリンポリマー、ならびに他の可撓性リンカーが挙げられる。あるいは、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマーを含むが、これらに限定されない様々な非タンパク質性ポリマーが、リンカーとしての用途を見出し得る。
他のリンカー配列は、任意の長さのCL/CH1ドメインの任意の配列を含むが、CL/CH1ドメインの全ての残基を含まない場合がある。例えば、CL/CH1ドメインの最初の5~12アミノ酸残基である。リンカーは、免疫グロブリン軽鎖、例えば、CκまたはCλに由来し得る。リンカーは、例えば、Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cα1、Cα2、Cδ、Cε、及びCμを含む任意のアイソタイプの免疫グロブリン重鎖に由来し得る。リンカー配列はまた、Ig様タンパク質(例えば、TCR、FcR、KIR)、ヒンジ領域由来配列、及び他のタンパク質由来の他の天然配列などの他のタンパク質に由来してもよい。
いくつかの実施形態では、リンカーは、本明細書に概説される任意の2つのドメインを共に結合するために使用される「ドメインリンカー」である。任意の好適なリンカーを使用することができるが、多くの実施形態は、例えば、nが少なくとも1(及び一般に3~4~5)である、(GS)n、(GSGGS)n、(GGGGS)n、及び(GGGS)nを含むグリシン-セリンポリマー、ならびに各ドメインがその生物学的機能を保持できるように十分な長さ及び柔軟性を有する2つのドメインの組換え結合を可能にする任意のペプチド配列を利用する。いくつかの場合において、以下に概説するように、「鎖結合(strandedness)」に注意を払って、scFvリンカーのいくつかの実施形態において使用されるような荷電ドメインリンカーを使用することができる。例示的なドメインリンカーは、切断不可能なリンカーであり、これは、ポリペプチド構築物が、ポリペプチド構築物のインビボ半減期の間、例えば生理学的に関連するpH及び温度で利用される条件下では、実質的に切断されない。ドメインリンカーは、そのフレームワーク内に1つ以上の切断可能な部分を含むことができる。
いくつかの実施形態では、scFvリンカーまたはドメインは、荷電したscFvリンカーまたはドメインリンカーである。
本明細書における「コンピュータースクリーニング法」は、構築物の成分(例えば、VH、VL)における突然変異を含む、1つ以上の本発明のポリペプチド構築物を設計するための任意の方法を意味し、該方法は、コンピューターを利用して、可能性のあるアミノ酸側鎖置換の相互との及び/またはタンパク質の残りとの相互作用のエネルギーを評価する。当業者には理解されるように、エネルギー計算と呼ばれるエネルギーの評価は、1つ以上のアミノ酸修飾を採点する何らかの方法を指す。該方法は、物理的または化学的エネルギー項を伴ってもよく、あるいは知識、統計、配列を基にしたエネルギー項などを伴ってもよい。コンピュータースクリーニング法を構成する計算は、本明細書では「コンピュータースクリーニング計算」と呼ばれる。
実施形態
ポリペプチド構築物
好ましい実施形態によれば、また添付の実施例に記載されているように、本発明の例示的なポリペプチド構築物は、「二重特異性単一鎖ポリペプチド構築物」、より好ましくは、少なくとも1つの標的抗原結合ドメインを含み、任意選択で少なくとも1つの半減期延長ドメインにさらに結合する「単一鎖Fv」(scFv)である。Fvフラグメントの2つのドメイン、VL及びVHは、別々の遺伝子によってコードされているが、これらは、組換え方法を用いて、VL及びVH領域が対合して不活性VL/VH対を形成する単一タンパク質鎖としてこれらを作製することを可能にする、上記のような合成リンカーによって接合され得る(例えば、Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA 85:5879-5883を参照のこと)。これらのポリペプチドフラグメントは、当業者に既知の従来の技法を用いて得られ、それらのフラグメントは全抗体または全長抗体と同じ方様式で機能について評価される。よって、単一鎖可変断片(scFv)は、免疫グロブリンの重鎖可変領域(VH)及び軽鎖可変領域(VL)の融合タンパク質であり、これは、通常、約10~約25アミノ酸、好ましくは約15~20アミノ酸の短いリンカーペプチドで接続される。リンカーは、通常、柔軟性のためにグリシン、ならびに可溶性のためにセリンまたはトレオニンが豊富であり、VHのN-末端をVLのC-末端に接続するか、またはその逆を行うことができる。「不活性」とされないポリペプチドの部分は、定常領域の除去及びリンカーの導入にもかかわらず、元の免疫グロブリンの特異性を実質的に保持する。
ポリペプチド構築物
好ましい実施形態によれば、また添付の実施例に記載されているように、本発明の例示的なポリペプチド構築物は、「二重特異性単一鎖ポリペプチド構築物」、より好ましくは、少なくとも1つの標的抗原結合ドメインを含み、任意選択で少なくとも1つの半減期延長ドメインにさらに結合する「単一鎖Fv」(scFv)である。Fvフラグメントの2つのドメイン、VL及びVHは、別々の遺伝子によってコードされているが、これらは、組換え方法を用いて、VL及びVH領域が対合して不活性VL/VH対を形成する単一タンパク質鎖としてこれらを作製することを可能にする、上記のような合成リンカーによって接合され得る(例えば、Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA 85:5879-5883を参照のこと)。これらのポリペプチドフラグメントは、当業者に既知の従来の技法を用いて得られ、それらのフラグメントは全抗体または全長抗体と同じ方様式で機能について評価される。よって、単一鎖可変断片(scFv)は、免疫グロブリンの重鎖可変領域(VH)及び軽鎖可変領域(VL)の融合タンパク質であり、これは、通常、約10~約25アミノ酸、好ましくは約15~20アミノ酸の短いリンカーペプチドで接続される。リンカーは、通常、柔軟性のためにグリシン、ならびに可溶性のためにセリンまたはトレオニンが豊富であり、VHのN-末端をVLのC-末端に接続するか、またはその逆を行うことができる。「不活性」とされないポリペプチドの部分は、定常領域の除去及びリンカーの導入にもかかわらず、元の免疫グロブリンの特異性を実質的に保持する。
このため、例示的な実施形態では、本発明は、CD-3抗原に向けられた単一鎖scFvポリペプチドを提供する。scFvポリペプチドは、第1のリンカー部分(例えば、scFvリンカー)を介して接合した第1のVHドメインと第1のVLドメインとを含む、第1のscFvドメインを含む。第1のリンカー部分は、任意選択で、第1のVHドメインと第1のVLドメインとの間に第1のプロテアーゼ切断部位を含む。第1のVHドメイン及び第1のVLドメインは、相互作用して第1のVH/VL対を形成する。ポリペプチドにそのCD-3標的と条件的に結合する能力を与えるために、第1のVHドメイン及び第1のVLドメインの一方は、その用語が本明細書で定義されるように、不活性である(すなわち、VHiまたはVLi)。したがって、例示的な第1のscFvドメインは、CD-3抗原に特異的に結合しない。プロテアーゼ切断部位での第1のscFvリンカーのプロテアーゼ切断に際して、不活性VHドメインまたは不活性VLドメインは、その活性VL結合パートナーまたは活性VH結合パートナーから分離し、その後、その活性同族体と対合することで、適当に対合した抗CD-3ドメインの形成、及びCD-3抗原への結合が可能となる。例示的な実施形態では、2つの活性同族体は同じポリペプチド鎖上にある。種々の実施形態において、2つの活性同族体は別個のポリペプチド鎖上にあり、これらが一緒になって細胞表面上で相互作用して、CD-3に特異的に結合する活性CD-3結合ドメインを形成する。
第1のscFvポリペプチドは、任意選択で第2のプロテアーゼ切断部位を含む第1のドメインリンカー部分を介して第2のscFvドメインに接合される。第2のscFvドメインは、第2のscFvリンカー部分を介して接合された第2のVHドメイン及び第2のVLドメインを含む。第2のscFvリンカー部分は、第2のVHドメインと第2のVLドメインとの間の第3のプロテアーゼ切断部位を含む。第2のVHドメイン及び第2のVLドメインは、相互作用して、第2のVH/VL対を形成する。上記の第1のVH/VL対と同様に、該第2のVHドメイン及び該第2のVLのうちの一方は不活性であり、その結果、該第2のscFvドメインはCD-3抗原に特異的に結合しなくなる。第1のscFvドメインは、第2のドメインリンカーを介して第1の標的抗原結合ドメインに接合される。この第2のドメインリンカーは、第1のVHドメイン及び該第1のVLドメインから選択されたメンバーを第1の標的抗原結合ドメインに接合する。第2のscFvドメインは、第3のドメインリンカーを介して第2の標的抗原結合ドメインに接合される。この第3のドメインリンカーは、第2のVHドメイン及び第2のVLドメインから選択されたメンバーを第2の標的抗原結合ドメインに接合する。
例示的な実施形態において、本発明は、CD-3抗原に向けられた単一鎖scFvポリペプチドを提供する。scFvポリペプチドは、第1のscFvリンカー部分を通じて接合された第1のVHドメイン及び第1のVLドメインを含む、第1のscFvドメインを含む。第1のscFvリンカー部分は、第1のVHドメインと該第1のVLドメインとの間の第1のプロテアーゼ切断部位を含む。上記のように、第1のVHドメイン及び第1のVLドメインは、相互作用して第1のVH/VL対を形成し、これにおいて、第1のVHドメイン及び第1のVLドメインのうちの一方は、不活性な第1のVHドメインまたは不活性な第1のVLドメインである。このため、第1のscFvドメインはCD-3抗原に特異的に結合しない。第1のscFvポリペプチドは、第2のプロテアーゼ切断部位を任意選択で含む第1のドメインリンカー部分を通じて接合され、第2のVHドメインと第2のVLドメインとの間の第3のプロテアーゼ切断部位を含む第2のscFvリンカー部分を介して接合される第2のVHドメイン及び第2のVLドメインを含む第2のscFvドメインに接合される。第2のVHドメイン及び該第2のVLドメインは、相互作用して、第2のVH/VL対を形成する。上記のように、第2のVHドメイン及び第2のVLのうちの一方は、不活性な第2のVHドメインまたは不活性な第2のVLドメインであり、第2のscFvドメインは、CD-3抗原に特異的に結合しない。
このポリペプチドの第1のscFvドメインは、第2ドメインリンカーを介して第1標的抗原結合ドメインに接合され、該第2ドメインリンカーは、第1のVHドメイン及び第1のVLドメインから選択されたメンバーを第1標的抗原結合ドメインに接合する。第2のscFvドメインは、第3のドメインリンカーを介して第2の標的抗原結合ドメインに接合される。第3のドメインリンカーは、第2のVHドメイン及び第2のVLドメインから選択されたメンバーを第2の標的抗原結合ドメインに接合する。単一鎖scFvを、第1のscFvリンカー部分の第1のプロテアーゼ切断部位を切断することができる第1のプロテアーゼと接触させると、不活性な第1のVHドメインまたは不活性な第1のVLドメインが単一鎖scFvポリペプチドから分離される。同様に、ポリペプチドが第2のscFvリンカー部分の第2のプロテアーゼ切断部位を切断することができる第2のプロテアーゼと接触すると、不活性な第2のVHドメインまたは不活性な第2のVLドメインが単一鎖scFvポリペプチドから分離される。ポリペプチドの活性ドメインから不活性ドメインを切断することにより、CD-3抗原に特異的に結合することができる活性単一鎖Fvが形成される。
例示的な実施形態において、本発明は、CD-3抗原に向けられた単一鎖scFvポリペプチドを提供する。scFvポリペプチドは、第1のscFvリンカー部分を通じて接合された第1のVHドメイン及び第1のVLドメインを含む、第1のscFvドメインを含む。この第1のリンカー部分は、第1のVHドメインと第1のVLドメインとの間の第1のプロテアーゼ切断部位を含む。第1のVHドメイン及び該第1のVLドメインは、相互作用して第1のVHドメイン及び第1のVLドメインの一方が不活性である第1のVH/VL対を形成し、これにおいて、第1のVHドメイン及び第1のVLドメインのうちの一方は不活性である。したがって、第1のscFvドメインはCD-3抗原に特異的に結合しない。第1のscFvポリペプチドは、任意選択で第2のプロテアーゼ切断部位を含む第1のドメインリンカー部分を介して第1の標的抗原結合ドメインに接合される。第1のドメインリンカーは、第1のVHドメイン及び第1のVLドメインから選択されるメンバーを、第1の標的抗原結合ドメインに接合する。
例示的な実施形態では、上記のようなscFv構築物の対が提供される。構築物の対は、それらの対合したCD-3結合ドメインを通じて、CD-3抗原に協働的に結合する。対の個々のscFv分子の対合したCD-3部位のCD-3抗原への結合は、対の各メンバーの標的抗原結合ドメインのその同族抗原への結合により、促進、増強、及び/または駆動される。
ポリペプチド構築物は、1つ以上の標的抗原、及びCD3、ならびに任意選択でHSA結合ドメインなどの半減期延長ドメインに特異的に結合することができる。CD3への結合は、プロテアーゼによって活性化され、標的抗原(複数可)に結合した後でのみ可能である。いくつかの実施形態では、標的抗原結合ドメインが標的抗原に結合する前に、プロテアーゼ切断ドメインのプロテアーゼ切断が生じることを理解されたい。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ切断ドメインのプロテアーゼ切断は、標的抗原結合ドメインが標的抗原に結合した後に生じることも理解されたい。
いくつかの実施形態では、scFvポリペプチドは、2つ以上のプロテアーゼ切断ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、1つ以上のCD3結合ドメインは、ヒトCD3に特異的な単一鎖可変フラグメント(scFv)に由来するポリペプチドを含む。例示的な実施形態では、このCD3結合ドメインは、プロテアーゼ切断ドメインが存在するリンカーによって連結されたVL部分とVH部分とを含む。このCD3結合ドメインにおいて、VLまたはVHのいずれかが、既知の技法、例えば、VLまたはVHにおける1つ以上の部位での突然変異、CDRの欠失などにより、不活性化される(すなわち、本質的にCD3に特異的に結合することができなくなる)。この突然変異したVLまたはVHは、対合することができ、対応するVHまたはVLとそれぞれ対合し、これは、突然変異した配列との対合(またはその適当な同族配列との対合)がない場合、本質的にCD3に選択的に結合することができる。不活性VLまたはVHを対応するCD3結合VHまたはVLと対合させることで、パートナーがリンカー中のプロテアーゼ切断ドメインのプロテアーゼ切断によって分離されるまで、CD3結合VHまたはVLが不活性となる。プロテアーゼ切断ドメインの切断時に、活性CD3結合種及びその不活性パートナーは「不対」であり、それにより、その活性相補的CD-3結合ドメインと対合したときに、CD3結合ドメインがCD3に本質的に特異的に結合することが可能となる。種々の実施形態において、不活性パートナーは、CD3結合VLまたはVHにおける1つ以上のアミノ酸の突然変異のために不活性にされ、この突然変異は、パートナーがCD3に特異的に結合する能力を実質的に破壊すると同時に、突然変異した種がCD3結合ドメインと対合する能力を残し、それにより、パートナーがプロテアーゼ切断ドメインの切断によって分離されるまで、CD3結合ドメインのCD3結合特性を実質的に不活性化する。
以下の実施例に示すように、発明者らは、本発明のポリペプチド構築物の活性及び有効性が、種々のドメインの配向にほとんど依存しないことを発見した。したがって、N末端からC末端へと読むと、VLはVHiの上流にあり得、あるいはその逆も同様であり得る。さらに、VLiはVHの上流にあってもよく、あるいはその逆も同様であり得る。半減期延長ドメインは、不活性CD-3結合ドメインのうちの1つにまたは標的抗原結合ドメインに接合することができる。例示的な実施形態において、半減期延長ドメインは、scFvリンカーの切断時に活性ポリペプチドから分離するポリペプチド構築物の成分に接合される。したがって、例えば、半減期延長領域はVLiまたはVHiに接合される。
いくつかの実施形態では、1つ以上の半減期延長ドメインは、ヒト血清アルブミンに対する結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の半減期延長ドメインは、scFv、可変重鎖ドメイン(VH)、可変軽鎖ドメイン(VL)、ナノボディ、ペプチド、リガンド、または小分子を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の半減期延長ドメインはscFvを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の半減期延長ドメインはFcドメインを含む。いくつかの実施形態では、半減期延長ドメインは、プロテアーゼ切断前のポリペプチドのN末端にある。いくつかの実施形態では、半減期延長ドメインは、プロテアーゼ切断前のポリペプチドのC末端にある。いくつかの実施形態では、半減期延長ドメインは、プロテアーゼ切断前のポリペプチドのC末端にもN末端にもない。
半減期延長領域により、適当な薬物動態パラメータを達成するため、ポリペプチド構築物のサイズを本質的にいかなる望ましいサイズにも調節することが可能となる。したがって、本明細書に記載されるポリペプチド構築物は、いくつかの実施形態では、約50kD~約150kD、50kD~約100kD、50kD~約80kD、約50kD~約75kD、約50kD~約70kD、または約50kD~約65kDのサイズを有する。このため、抗原結合ポリペプチドのサイズは、約150kDであるIgG抗体、及び約55kDであるが、半減期延長されていないため腎臓を通して迅速に除去されるBiTE及びDARTダイアボディ分子よりも有利である。本明細書に記載される抗原結合ポリペプチドの別の特徴は、それらがそのドメインの柔軟な結合を有する単一ポリペプチド設計であることである。これにより、ポリペプチド構築物がベクターに容易に組み込まれる単一のcDNA分子によってコードされ得るため、その容易な産生及び製造が可能となる。さらに、本明細書に記載される抗原結合ポリペプチドは単量体の単一ポリペプチド鎖であるため、鎖対合の問題または二量化の要件はない。本明細書中に記載される抗原結合ポリペプチドは、二重特異性BiTEタンパク質などの他の報告されている分子とは異なり、凝集する傾向が低いことが企図される。
二重特異性単一鎖分子は当該分野で既知であり、WO99/54440,Mack,J.Immunol.(1997),158,3965-3970,Mack,PNAS,(1995),92,7021-7025,Kufer,Cancer Immunol.Immunother.,(1997),45,193-197,Loffler,Blood,(2000),95,6,2098-2103,Bruhl,Immunol.,(2001),166,2420-2426,Kipriyanov,J.Mol.Biol.,(1999),293,41-56に記載されている。単一鎖抗体(とりわけ米国特許第4,946,778号を参照のこと)の産生のために記載された技術は、選択された標的(単数または複数)を特異的に認識する単一鎖ポリペプチド構築物を産生するように適合させることができる。
二価抗体に類似したより高い原子価のポリペプチドもまた、本発明の範囲内である。例えば、T細胞レセプター中の2つのCD-3、例えば、3つの分子または2つのCD3サブユニットに結合するポリペプチド構築物が、本発明に包含される。同様に、本発明のポリペプチド構築物は、2つ以上の標的抗原結合ドメインを含むことができる。したがって、本発明の構築物は、2つ以上の同一のまたは2つ以上の異なる抗EGFR結合ドメインを含み得る。そのような分子は、二価(bivalent)(二価(divalent)とも呼ばれる)または二重特異性単一鎖可変フラグメント(フォーマット(scFv)2を有するbi-scFvまたはdi-scFv)に類似していると考えることができる。そのような構築物は、2つのscFv分子を結合させること(例えば、上記のようなリンカーを用いて)によって操作することができる。これらの2つのscFv分子が同じ結合特異性を有する場合、結果として得られる(scFv)2分子は、一般に、「二価」(すなわち、それが同じ標的エピトープに対して2つの原子価を有する)として知られている。2つのscFv分子が異なる結合特異性を有する場合、結果として得られる(scFv)2分子は、一般に、二重特異性であると称される。この結合は、2つのVH領域及び2つのVL領域を有する単一ペプチド鎖を生成し、タンデムscFvを生じさせることによって行うことができる(例えば、Kufer P.et al.,(2004)Trends in Biotechnology 22(5):238-244を参照のこと)。
本明細書に記載される抗原結合scFvポリペプチドは、細胞傷害性T細胞を動員することによって標的抗原を発現する細胞の特異的標的化を可能にするように設計される。CD3結合ドメインは、VH及びVLiまたはVHi及びVLのいずれかの間に位置するプロテアーゼ切断部位のプロテアーゼ切断によって活性化されるまで不活性のままであり、ここで「i」は、VHまたはVLのいずれかの親ポリペプチド配列の突然変異により不活性化されるサブユニットを示す。これにより、腫瘍細胞または癌細胞などの標的細胞によって発現される場合もされない場合もあるCD3及び標的抗原に結合する二重特異性T細胞エンゲージャー治療薬と比較して、特異性が改善する。対照的に、標的抗原及びプロテアーゼが高度に発現される標的細胞の微小環境において特異的にCD3結合を活性化することにより、ポリペプチド構築物は、細胞傷害性T細胞と、標的抗原を発現する細胞とを高度に特異的な様式で架橋し、それによりT細胞の細胞傷害能力を標的細胞に向かわせる。本明細書に記載されるポリペプチド構築物は、T細胞受容体複合体の一部を形成する表面発現CD3に対するプロテアーゼ活性化結合を介して細胞傷害性T細胞を従事させる。いくつかのポリペプチド構築物をCD3及び特定の細胞の表面上に発現される標的抗原に同時に結合させると、T細胞の活性化が引き起こされ、その後の特定の標的抗原発現細胞の溶解が媒介される。このため、ポリペプチド構築物は、強力で特異的かつ効率的な標的細胞死滅を示すことが企図される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチド構築物は、細胞傷害性T細胞による標的細胞殺滅を刺激して、プロテアーゼに富む微小環境(例えば、腫瘍細胞、ウイルスまたは細菌感染細胞、自己反応性T細胞など)における病原性細胞を排除する。そのような実施形態のうちのいくつかにおいて、細胞は選択的に排除され、それにより有毒な副作用の可能性が低減される。他の実施形態では、同じポリペプチドを使用して、治療効果のための内因性細胞、例えば、自己免疫疾患のBリンパ球もしくはTリンパ球、または幹細胞移植のための造血幹細胞(HSC)の排除を強化し得る。罹患細胞または組織に関連することが知られているプロテアーゼには、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、アスパラギンペプチドリアーゼ、血清プロテアーゼ、カテプシン、カテプシンB、カテプシンC、カテプシンD、カテプシンE、カテプシンK、カテプシンL、カリクレイン、hK1、hK10、hK15、プラスミン、コラゲナーゼ、IV型コラゲナーゼ、ストロメリシン、第Xa因子、キモトリプシン様プロテアーゼ、トリプシン様プロテアーゼ、エラスターゼ様プロテアーゼ、サブチリシン様プロテアーゼ、アクチニダイン、ブロメライン、カルパイン、カスパーゼ、カスパーゼ-3、Mir1-CP、パパイン、HIV-1プロテアーゼ、HSVプロテアーゼ、CMVプロテアーゼ、キモシン、レニン、ペプシン、マトリプターゼ、レグマイン、プラスメプシン、ネペンテシン、メタロエキソペプチダーゼ、メタロエンドペプチターゼ、マトリックスメタロペプチターゼ(MMP)、MMP1、MMP2、MMP3、MMP8、MMP9、MMP13、MMP11、MMP14、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子(uPA)、エンテロキナーゼ、前立腺特異抗原(PSA、hK3)、インターロイキン-1β変換酵素、トロンビン、FAP(FAP-α)、ジペプチジルペプチダーゼ、メプリン、グランザイム、及びジペプチジルペプチダーゼIV(DPPIV/CD26)が挙げられる。
本明細書に記載される抗原結合ポリペプチドは、認識されたモノクローナル抗体及び他のより小さな二重特異性分子よりもさらに治療上の利点をもたらす。二重特異性分子は、病原性細胞に関連する細胞特異的マーカーを介して標的細胞に結合するように設計される。場合によっては、健常な細胞または組織が病原性細胞と同じマーカーを発現する場合、毒性が起こり得る。本発明の抗原結合ポリペプチド構築物の1つの利益は、CD-3への結合が、腫瘍細胞などの標的細胞によって発現されるプロテアーゼによる活性化、及び1つ以上の標的抗原、例えば、腫瘍抗原への抗原結合ドメインの結合に依存することである。ポリペプチド構築物は、1つ以上のプロテアーゼ切断部位によって分離されたVH及びVLiまたはVHi及びVLドメインを含む、不活性CD-3結合ドメインを含む。標的細胞のプロテアーゼに富む環境では、プロテアーゼ切断部位が切断され、VH及びVLiまたはVHi及びVLが分離され、VH及びVLまたはVL及びVHの相互作用が可能となり、1つ以上の標的抗原が結合されるときに、活性CD-3結合ドメインを形成し、構築物をCD-3に結合させる。プロテアーゼ切断がない場合、CD-3結合ドメインは不活性であり、CD-3に結合することができない。
プロテアーゼ切断後に対になって活性な抗CD-3 scFvを形成する別々の分子であるポリペプチド構築物も提供される。このため、対の第1のメンバーであるポリペプチド構築物は、VH/VLiまたはVHi/VLドメインを含み、VLiまたはVHiは、対の第1のメンバーからプロテアーゼによって切断される。対応するVLiまたはVHiは、対の第2のメンバーから切断され、CD-3標的上の2つの別々の分子の対合によるVL/VHドメインの形成を可能にする。一態様では、これらの「ハーフプロ(half-Pro)」分子は、対を形成する2つの分子の容易な変化を可能にすること、ならびにこれらの実験から得られた情報の翻訳を対応する「フルプロ(full-Pro)」ポリペプチド構築物の設計及び調製に変換することにより、「フルプロ」分子を操作するためのツールとして有用である。種々の実施形態において、「ハーフプロ」分子は、機能的抗CD-3 VL/VH対を形成するために、CD-3標的と標的抗原との両方に結合しなければならない。
したがって、鎖を第1のCD-3結合領域と第2のCD-3結合領域とに分離するプロテアーゼ切断ドメイン(P)を含む単一ポリペプチド鎖をタンパク質が含む、ポリペプチド構築物も、本明細書で提供され、ここでは、第1の領域は抗CD3 VH結合ドメイン(CVH)及び標的抗原結合ドメイン(T1)を含み、第2の領域は抗CD3 VL結合ドメイン(CVL)及び標的抗原結合ドメイン(T2)を含み、タンパク質は、第1の領域または第2の領域に半減期延長ドメイン(H)を任意選択で含み、Pのプロテアーゼ切断による活性化、ならびにT1及びT2による標的抗原の結合時に、第1の領域と第2の領域とが会合して、CD3に結合する完全な抗CD3 VL/VH結合ドメインを形成する。
本明細書において、特定の局面では、前記タンパク質を、前記鎖を第1及び第2の領域に分離するプロテアーゼ切断ドメイン(P)を含む単一ポリペプチド鎖を含むポリペプチド構築物を提供する。第1領域は、抗CD-3 VL結合ドメイン(CVL)及び標的抗原結合ドメイン(T1)を含み、第2領域は、抗CD3 VH結合ドメイン(CVH)及び標的抗原結合ドメイン(T2);第1または第2の領域に半減期延長領域(H)を任意選択で含み、Pのプロテアーゼ切断による活性化及びT1及びT2による標的抗原の結合により、第1及び第2の領域が会合して、CD3に結合する完全な抗CD3 VL/VH結合ドメインを形成する。
ある特定の態様では、タンパク質が、第1の領域及び第2の領域を含む単一ポリペプチド鎖を含む、ポリペプチド構築物も、本明細書で提供され、ここでは、第1の領域は、抗CD3 VH結合ドメイン(CVH)、CVH及び標的抗原結合ドメイン(T1)と会合する不活性抗CD3 VL結合ドメイン(CVLi)を含み、第2の領域は、抗CD3 VL結合ドメイン(CVL)、CVL及び標的抗原結合ドメイン(T2)と会合する不活性抗CD3 VH結合ドメイン(CVHi)を含み、タンパク質は、第1の領域及び/または第2の領域に半減期延長ドメイン(H)を任意選択で含み、CVLi及びCVHiは、各々、少なくとも1つのプロテアーゼ切断ドメインを含み、プロテアーゼ切断ドメインのプロテアーゼ切断による活性化、ならびにT1及びT2による標的抗原の結合時に、第1の領域と第2の領域とが会合して、CD3に結合する完全な抗CD3 VL/VH結合ドメインを形成する。
ある特定の態様では、タンパク質が、第1の領域及び第2の領域を含む単一ポリペプチド鎖を含む、ポリペプチド構築物も、本明細書で提供され、ここでは、第1の領域は、抗CD3 VL結合ドメイン(CVL)、CVL及び標的抗原結合ドメイン(T1)と会合する不活性抗CD3 VH結合ドメイン(CVHi)を含み、第2の領域は、抗CD3 VH結合ドメイン(CVH)、CVH及び標的抗原結合ドメイン(T2)と会合する不活性抗CD3 VL結合ドメイン(CVLi)を含み、タンパク質は、第1の領域及び/または第2の領域に半減期延長ドメイン(H)を任意選択で含み、CVLi及びCVHiは、各々、少なくとも1つのプロテアーゼ切断ドメインを含み、プロテアーゼ切断ドメインのプロテアーゼ切断による活性化、ならびにT1及びT2による標的抗原の結合時に、第1の領域と第2の領域とが会合して、CD3に結合する完全な抗CD3 VL/VH結合ドメインを形成する。
一態様では、予め活性化された形態の抗原結合タンパク質は、少なくとも1つの抗CD3結合ドメインを含む第1のドメインと、少なくとも1つの抗標的結合ドメインを含む第2の領域とを含む単一ポリペプチド鎖を含む。第1の領域及び第2の領域は、ポリペプチドリンカーによって分離され、このポリペプチドリンカーは、その配列中に1つ以上の切断可能な部分、例えば、少なくとも1つのプロテアーゼ切断ドメイン(P)を任意選択で含む。例示的な実施形態では、第1の領域は、抗CD3 VH結合ドメイン(CVH)及び標的抗原結合ドメイン(T1)を含む。一実施形態では、第2の領域は、抗CD3 VL結合ドメイン(CVL)及び標的抗原結合ドメイン(T2)を含む。一実施形態では、抗原結合ドメインは、第1の領域に半減期延長ドメイン(H)を任意選択で含む。一実施形態では、抗原結合ドメインは、第2の領域に半減期延長ドメイン(H)を任意選択で含む。プロテアーゼ切断ドメイン(P)、ならびに標的抗原に結合する標的抗原結合ドメインT1及びT2を切断するプロテアーゼによって活性化されると、抗CD3結合ドメインCVH及びCVLが活性化されて、T細胞上のCD3に結合する。抗原結合タンパク質中のドメインは、予め活性化されたポリペプチドの中心にプロテアーゼ切断ドメイン(P)を有して、各領域内で任意の順序で配置されることが企図される。さらに、各領域は、予め活性化されたポリペプチド内でいずれの順序であってもよい。このため、ほんの一例として、ポリペプチド構築物の例示的なドメイン順序には、以下が含まれるが、これらに限定されない:
a)CVH-T1-P-T2-CVL、
b)T1-CVH-P-T2-CVL、
c)CVH-T1-P-CVL-T2、
d)T1-CVH-P-CVL-T2、
e)H-CVH-T1-P-T2-CVL、
f)CVH-H-T1-P-T2-CVL、
g)CVH-T1-H-P-T2-CVL、
h)CVH-T1-P-H-T2-CVL、
i)CVH-T1-P-T2-H-CVL、
j)CVH-T1-P-T2-CVL-H、
k)H-T1-CVH-P-T2-CVL、
l)T1-H-CVH-P-T2-CVL、
m)T1-CVH-H-P-T2-CVL、
n)T1-CVH-P-H-T2-CVL、
o)T1-CVH-P-T2-H-CVL、
p)T1-CVH-P-T2-CVL-H、
q)H-CVH-T1-P-CVL-T2、
r)CVH-H-T1-P-CVL-T2、
s)CVH-T1-H-P-CVL-T2、
t)CVH-T1-P-H-CVL-T2、
u)CVH-T1-P-CVL-H-T2、
v)CVH-T1-P-CVL-T2-H、
w)H-T1-CVH-P-CVL-T2、
x)T1-H-CVH-P-CVL-T2、
y)T1-CVH-H-P-CVL-T2、
z)T1-CVH-P-H-CVL-T2、
aa)T1-CVH-P-CVL-H-T2、及び
bb)T1-CVH-P-CVL-T2-H。
a)CVH-T1-P-T2-CVL、
b)T1-CVH-P-T2-CVL、
c)CVH-T1-P-CVL-T2、
d)T1-CVH-P-CVL-T2、
e)H-CVH-T1-P-T2-CVL、
f)CVH-H-T1-P-T2-CVL、
g)CVH-T1-H-P-T2-CVL、
h)CVH-T1-P-H-T2-CVL、
i)CVH-T1-P-T2-H-CVL、
j)CVH-T1-P-T2-CVL-H、
k)H-T1-CVH-P-T2-CVL、
l)T1-H-CVH-P-T2-CVL、
m)T1-CVH-H-P-T2-CVL、
n)T1-CVH-P-H-T2-CVL、
o)T1-CVH-P-T2-H-CVL、
p)T1-CVH-P-T2-CVL-H、
q)H-CVH-T1-P-CVL-T2、
r)CVH-H-T1-P-CVL-T2、
s)CVH-T1-H-P-CVL-T2、
t)CVH-T1-P-H-CVL-T2、
u)CVH-T1-P-CVL-H-T2、
v)CVH-T1-P-CVL-T2-H、
w)H-T1-CVH-P-CVL-T2、
x)T1-H-CVH-P-CVL-T2、
y)T1-CVH-H-P-CVL-T2、
z)T1-CVH-P-H-CVL-T2、
aa)T1-CVH-P-CVL-H-T2、及び
bb)T1-CVH-P-CVL-T2-H。
当業者には理解されるように、上記のa-bbの各々において、CVH及びCVLの一方は、不活性、すなわち、CVHiまたはCVLiである。a-bbにおける個々の成分の順序は、「ハーフプロ」分子及び「フルプロ」分子の両方に関連する。「フルプロ」分子については、「T」及び他の部分の数は、本発明の有用なポリペプチド構築物を形成するために所望されるように変化させることができる。一般に、HがCVLまたはCVHの不活性バージョンに結合されていることが好ましい。図53に例示されているように、本発明のポリペプチド構築物の成分は、ある範囲の順序で、種々の特性のリンカーがそれらの間に離間して、結合され得る。
種々の実施形態において、本発明は、プロドラッグであるポリペプチド構築物(またはそのようなポリペプチドの発現を指令する核酸ベクター)を提供する。このため、以下を含むプロドラッグ組成物が提供される:i)第1のscFvドメインがCD-3に特異的に結合しないように、第1のプロテアーゼ切断部位を含む第1のscFvリンカー部分を通して接合される第1のVHドメイン及び第1のVLドメインを含む第1のscFvドメインを含むCD-3結合ドメインをコードする第1のポリペプチド配列;ii)第2のscFvドメインが腫瘍抗原に特異的に結合しないように、第2のプロテアーゼ切断部位を含む第2のscFvリンカー部分を通して接合される第2のVHドメイン及び第2のVLドメインを含む第2のscFvドメインを含む腫瘍抗原結合ドメインをコードする第2のポリペプチド配列;ならびにiii)任意選択で少なくとも1つの半減期延長ドメイン。
例示的な実施形態では、プロドラッグ組成物において、第1のポリペプチド配列及び第2のポリペプチド配列は、プロテアーゼ切断部位を任意選択で含む第1のドメインリンカー部分によって動作可能に結合される。
種々の実施形態において、以下を含むプロドラッグが提供される:i)第1のポリペプチド配列であって、a)第1のCD-3結合ドメインであって、第1のプロテアーゼ切断部位を含む第1のscFvリンカー部分を通して接合される第1のVHドメイン及び第1のVLドメインを含む第1のscFvドメインを含み、該第1のscFvドメインがCD-3に特異的に結合しない、第1のCD-3結合ドメインと、b)第1の腫瘍抗原結合ドメインと、を含む、第1のポリペプチド配列;ii)第2のポリペプチド配列であって、a)第2のCD-3結合ドメインであって、第2のプロテアーゼ切断部位を含む第2のscFvリンカー部分を通して接合される第2のVHドメイン及び第2のVLドメインを含む第2のscFvドメインを含み、該第2のscFvドメインがCD-3に特異的に結合しない、第2のCD-3結合ドメインと、b)第2の腫瘍抗原結合ドメインと、を含む、第2のポリペプチド配列;ならびにiii)任意選択で少なくとも1つの半減期延長ドメイン。例示的な実施形態では、第1のVHドメイン及び第2のVLドメインは、CD-3及び/または第2のVHドメインに特異的に結合し、第1のVLドメインはCD-3に特異的に結合する。
プロドラッグ組成物において、第1の腫瘍抗原結合ドメイン及び第2の腫瘍抗原結合ドメインは、同じ腫瘍抗原に結合する。種々の実施形態では、第1の腫瘍抗原結合ドメイン及び第2の腫瘍抗原結合ドメインは、異なる腫瘍抗原タンパク質に結合する。種々の実施形態では、第1の腫瘍抗原結合ドメインは、第1の腫瘍細胞上に存在する第1の腫瘍抗原に結合し、第2の腫瘍抗原結合ドメインは、第1の腫瘍細胞上に存在する第2の腫瘍抗原に結合する。
CD-3結合ドメイン
T細胞の応答の特異性は、T細胞受容体複合体による抗原(主要組織適合性複合体、MHCの文脈で提示される)の認識によって媒介される。T細胞受容体複合体の一部として、CD-3は、細胞表面上に存在する、CD-3γ(ガンマ)鎖、CD-3δ(デルタ)鎖、及び2つのCD-3ε(イプシロン)鎖を含むタンパク質複合体である。CD-3は、T細胞受容体(TCR)のα(アルファ)及びβ(ベータ)鎖、ならびに及びCD-3ζ(ゼータ)全てと会合して、T細胞受容体複合体を構成する。固定された抗CD-3抗体などによるT細胞上のCD-3のクラスタリングにより、T細胞受容体の関与と同様であるがそのクローンに特有の特異性とは無関係のT細胞活性化が生じる。いくつかの実施形態では、抗CD-3抗体のCD-3への結合は、プロテアーゼが高レベルである罹患細胞または組織の微小環境、例えば、腫瘍微小環境においてのみCD-3抗体のCD-3への結合を制限するプロテアーゼ切断ドメインによって調節される。
T細胞の応答の特異性は、T細胞受容体複合体による抗原(主要組織適合性複合体、MHCの文脈で提示される)の認識によって媒介される。T細胞受容体複合体の一部として、CD-3は、細胞表面上に存在する、CD-3γ(ガンマ)鎖、CD-3δ(デルタ)鎖、及び2つのCD-3ε(イプシロン)鎖を含むタンパク質複合体である。CD-3は、T細胞受容体(TCR)のα(アルファ)及びβ(ベータ)鎖、ならびに及びCD-3ζ(ゼータ)全てと会合して、T細胞受容体複合体を構成する。固定された抗CD-3抗体などによるT細胞上のCD-3のクラスタリングにより、T細胞受容体の関与と同様であるがそのクローンに特有の特異性とは無関係のT細胞活性化が生じる。いくつかの実施形態では、抗CD-3抗体のCD-3への結合は、プロテアーゼが高レベルである罹患細胞または組織の微小環境、例えば、腫瘍微小環境においてのみCD-3抗体のCD-3への結合を制限するプロテアーゼ切断ドメインによって調節される。
一態様では、本明細書に記載されるポリペプチド構築物は、プロテアーゼによって活性化された場合にCD-3に特異的に結合するドメインを含む。一態様では、本明細書に記載されるポリペプチド構築物は、プロテアーゼによって活性化された場合にヒトCD-3に特異的に結合する2つ以上のドメインを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチド構築物は、プロテアーゼによって活性化された場合にCD-3γに特異的に結合する2つ以上のドメインを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチド構築物は、プロテアーゼによって活性化された場合にCD-3δに特異的に結合する2つ以上のドメインを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチド構築物は、プロテアーゼによって活性化された場合にCD-3εに特異的に結合する2つ以上のドメインを含む。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼ切断部位は、抗CD-3 VHドメインとVLドメインとの間にあり、それらがT細胞上で折り畳まれ、CD-3に結合することを防ぐ。プロテアーゼ切断部位が標的細胞に存在するプロテアーゼによって切断されると、抗CD-3 VH及びVLドメインは、T細胞上で折り畳まれ、CD-3に結合することができるようになる。代替的な実施形態では、プロテアーゼ切断部位は、抗CD-3 VH及びVLドメインに結合する、CD-3に結合しないVL及びVHドメインに設計される。標的細胞に存在するプロテアーゼによるプロテアーゼ切断部位の切断は、CD-3に結合しないVL及びVHドメインを除去し、抗CD-3 VH及びVLドメインが、T細胞上で折り畳まれ、CD-3に結合できるようにする。
本明細書に記載される抗原結合タンパク質は、プロテアーゼによって活性化された場合にCD-3に特異的に結合するドメインを含む。一実施形態では、CD-3に特異的に結合するドメインは、少なくとも1つのプロテアーゼ切断部位によって分離されたVHドメインとVLドメインとを含む。プロテアーゼ切断部位が切断されると、VHドメイン及びVLドメインは、折り畳みが可能となり、それによりCD-3に結合する。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ切断部位はループ領域にある。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ切断部位はVHドメイン及び/またはVLドメイン内にあり、プロテアーゼ切断部位が切断されて、VHドメイン及び/またはVLドメインを暴露することで、それらの折り畳みが可能となり、それによりCD-3に結合する。
さらなる実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチド構築物は、プロテアーゼによって活性化された場合にT細胞受容体(TCR)に特異的に結合する2つ以上のドメインを含む。ある特定の例では、本明細書に記載されるポリペプチド構築物は、プロテアーゼによって活性化された場合にTCRの鎖に特異的に結合する2つ以上のドメインを含む。ある特定の例では、本明細書に記載されるポリペプチド構築物は、プロテアーゼによって活性化された場合にTCRのβ鎖に特異的に結合する2つ以上のドメインを含む。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチド構築物のCD-3結合ドメインは、ヒトCD-3との強力なCD-3結合親和性を呈するだけでなく、それぞれのカニクイザルCD-3タンパク質との優れた交差反応性も示す。いくつかの例では、ポリペプチド構築物のCD-3結合ドメインは、カニクイザル由来のCD-3と交差反応性である。ある特定の例では、CD-3のヒト:カニクイザルKD比は5~0.2である。
いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質のCD-3結合ドメインは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体由来のドメインが挙げられるがこれらに限定されない、CD-3に結合する任意のドメインであることができる。いくつかの例では、CD-3結合ドメインは、抗原結合タンパク質が最終的に使用されることになる同じ種に由来することが有益である。例えば、ヒトでの使用のためには、抗原結合タンパク質のCD-3結合ドメインが、抗体または抗体フラグメントの抗原結合ドメイン由来のヒトまたはヒト化残基を含むことが有益であり得る。
このため、一態様では、抗原結合ドメインは、ヒト化もしくはヒト抗体、または抗体フラグメント、あるいはネズミ抗体または抗体フラグメントを含む。一実施形態では、ヒト化またはヒト抗CD-3結合ドメインは、本明細書に記載されるヒト化もしくはヒト抗CD-3結合ドメインの1つ以上(例えば、3つ全て)の軽鎖相補性決定領域1(LC CDR1)、軽鎖相補性決定領域2(LC CDR2)、及び軽鎖相補性決定領域3(LC CDR3)、ならびに/または本明細書に記載されるヒト化もしくはヒト抗CD-3結合ドメインの1つ以上(例えば、3つ全て)の重鎖相補性決定領域1(HC CDR1)、重鎖相補性決定領域2(HC CDR2)、及び重鎖相補性決定領域3(HC CDR3)、例えば、1つ以上、例えば3つ全てのLC CDRと、1つ以上、例えば3つ全てのHC CDRとを含む、ヒト化またはヒト抗CD-3結合ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、ヒト化またはヒト抗CD-3結合ドメインは、CD-3に特異的なヒト化またはヒト軽鎖可変領域を含み、ここで、このCD-3に特異的な軽鎖可変領域は、ヒト軽鎖フレームワーク領域にヒトまたは非ヒト軽鎖CDRを含む。ある特定の例では、軽鎖フレームワーク領域は、λ(ラムダ)軽鎖フレームワークである。他の例では、軽鎖フレームワーク領域は、κ(カッパ)軽鎖フレームワークである。
いくつかの実施形態では、1つ以上のCD-3結合ドメインは、CD-3ε(イプシロン)に特異的である。いくつかの実施形態では、1つ以上のCD-3結合ドメインは、CD-3δ(デルタ)に特異的である。いくつかの実施形態では、1つ以上のCD-3結合ドメインは、CD-3γ(ガンマ)に特異的である。
いくつかの実施形態では、1つ以上のCD-3結合ドメインは、ヒト化または完全なヒトである。いくつかの実施形態では、1つ以上の活性化CD-3結合ドメインは、CD-3を発現している細胞上のCD-3に対して1000nM以下のKD結合を有する。いくつかの実施形態では、1つ以上の活性化CD-3結合ドメインは、CD-3を発現している細胞上のCD-3に対して100nM以下のKD結合を有する。いくつかの実施形態では、1つ以上の活性化CD-3結合ドメインは、CD-3を発現している細胞上のCD-3に対して10nM以下のKD結合を有する。いくつかの実施形態では、1つ以上のCD-3結合ドメインは、カニクイザルCD-3との交差反応性を有する。いくつかの実施形態では、1つ以上のCD-3結合ドメインは、本明細書で提供されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ヒト化またはヒト抗CD-3結合ドメインは、CD-3に特異的なヒト化またはヒト重鎖可変領域を含み、ここで、このCD-3に特異的な重鎖可変領域は、ヒト重鎖フレームワーク領域にヒトまたは非ヒト重鎖CDRを含む。
ある特定の例では、重鎖及び/または軽鎖の相補性決定領域は、既知の抗CD-3抗体、例えば、ムロモナブ-CD-3(OKT3)、オテリキシズマブ(TRX4)、テプリズマブ(MGA031)、ビジリズマブ(Nuvion)、SP34またはI2C、TR-66またはX35-3、VIT3、BMA030(BW264/56)、CLB-T3/3、CRIS7、YTH12.5、F111-409、CLB-T3.4.2、TR-66、WT32、SPv-T3b、11D8、XIII-141、XIII-46、XIII-87、12F6、T3/RW2-8C8、T3/RW2-4B6、OKT3D、M-T301、SMC2、F101.01、UCHT-1、及びWT-31などに由来する。
一実施形態では、抗CD-3結合ドメインは、本明細書で提供されるアミノ酸配列の軽鎖及び重鎖を含む単一鎖可変フラグメント(scFv)である。一実施形態では、抗CD-3結合ドメインは、本明細書で提供される軽鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも1、2、もしくは3個の修飾(例えば、置換)を有するが、30、20、もしくは10個以下の修飾(例えば、置換)を有するアミノ酸配列、または本明細書で提供されるアミノ酸配列と95~99%の同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域;及び/あるいは本明細書で提供される重鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも1、2、もしくは3個の修飾(例えば、置換)を有するが、30、20、もしくは10個以下の修飾(例えば、置換)を有するアミノ酸配列、または本明細書で提供されるアミノ酸配列と95~99%の同一性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む。一実施形態では、ヒト化またはヒト抗CD-3結合ドメインはscFvであり、本明細書に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域は、本明細書に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域に、scFvリンカーを介して結合する。scFvの軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、例えば、軽鎖可変領域-scFvリンカー-重鎖可変領域、または重鎖可変領域-scFvリンカー-軽鎖可変領域の配向のうちのいずれかであり得る。
いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質のCD-3結合ドメインは、1000nM以下、100nM以下、50nM以下、20nM以下、10nM以下、5nM以下、1nM以下、または0.5nM以下のKDで、CD-3を発現している細胞上のCD-3に対する親和性を有する。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質のCD-3結合ドメインは、1000nM以下、100nM以下、50nM以下、20nM以下、10nM以下、5nM以下、1nM以下、または0.5nM以下のKDで、CD-3ε、γ、またはδに対する親和性を有する。さらなる実施形態では、抗原結合タンパク質のCD-3結合ドメインは、CD-3に対する低い、すなわち、約100nM以上の親和性を有する。
CD-3に結合する親和性は、例えば、抗原結合タンパク質それ自体またはそのCD-3結合ドメインが、アッセイプレート上にコーティングされた;微生物細胞表面に提示される;溶液中などで、CD-3に結合する能力によって決定することができる。本開示の抗原結合タンパク質それ自体またはそのCD-3結合ドメインのCD-3への結合活性は、リガンド(例えば、CD-3)または抗原結合タンパク質自体もしくはそのCD-3結合ドメインを、ビーズ、基質、細胞などに固定することによってアッセイすることができる。薬剤を適切な緩衝液に添加し、結合パートナーを所与の温度である時間インキュベートすることができる。洗浄して結合していない物質を除去した後、結合したタンパク質を、例えば、SDS、高pHの緩衝液などで放出させ、例えば、表面プラズモン共鳴(SPR)によって分析することができる。
リンカー
2つのドメインは、任意選択で切断可能であるリンカーによって一緒に接合される。例示的な切断部位は、プロテアーゼ切断部位である。ドメイン間リンカーを切断する例示的なプロテアーゼには、血漿中に見られるもの、例えば、トロンビン、及び腫瘍微小環境において過剰発現するものが含まれる。
2つのドメインは、任意選択で切断可能であるリンカーによって一緒に接合される。例示的な切断部位は、プロテアーゼ切断部位である。ドメイン間リンカーを切断する例示的なプロテアーゼには、血漿中に見られるもの、例えば、トロンビン、及び腫瘍微小環境において過剰発現するものが含まれる。
本明細書に記載される抗原結合ポリペプチドにおいて、ドメインは、ドメインリンカー、例えば、L1、L2、L3、及びL4によって連結され、ここで、L1は、ポリペプチド構築物の第1及び第2のドメインを連結し、L2は、ポリペプチド構築物の第2及び第3のドメインを連結し、L3は、ポリペプチド構築物の第3及び第4のドメインを連結し、L4は、プロテアーゼ活性化ポリペプチド構築物の第4及び第5のドメインを連結する。リンカー、例えばL1、L2、L3、及びL4は、最適化された長さ及び/またはアミノ酸組成を有する。いくつかの実施形態では、リンカー、例えば、L1、L2、L3、及びL4は、同じ長さ及びアミノ酸組成である。他の実施形態では、リンカー、例えば、L1、L2、L3、及びL4は、異なる。特定の実施形態では、内部リンカーL1、L2、L3、及び/またはL4は、「短い」、すなわち、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12個のアミノ酸残基からなる。したがって、場合によっては、内部リンカーは、約12個以下のアミノ酸残基からなる。0アミノ酸残基の場合、ドメインリンカーは、ペプチド結合である。特定の実施形態では、ドメインリンカーL1、L2、L3、及び/またはL4は、「長い」、すなわち、15、20、または25アミノ酸残基からなる。いくつかの実施形態では、これらのドメインリンカーは、約3~約15個、例えば、8、9、または10個の連続したアミノ酸残基からなる。ドメインリンカーのアミノ酸組成に関して、ペプチドは、ポリペプチド構築物に可撓性を与え、結合ドメインに干渉せず、任意選択で、プロテアーゼからの切断に抵抗する特性を有するように選択される。例えば、グリシン及びセリン残基は、一般に、プロテアーゼ抵抗性を提供する。本発明のポリペプチドのドメインを連結するために好適な内部リンカーの例としては、(GS)n、(GGS)n、(GGSG)n、(GGSG)n、(GGSGG)n、または(GGGGS)n(nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10である)が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、内部リンカーL1、L2、及び/またはL3は、(GGGGS)4または(GGGGS)3である。
いくつかの例では、CD3に結合するscFvは、既知の方法に従って調製される。例えば、scFv分子は、可撓性ポリペプチドリンカーを使用してVH領域とVL領域とを一緒に連結することによって産生され得る。scFv分子は、最適な長さ及び/またはアミノ酸組成を有するscFvリンカー(例えば、Ser-Glyリンカー)を含む。したがって、いくつかの実施形態では、scFvリンカーの長さは、VHドメインまたはVLドメインが他の可変ドメインと分子内で会合してCD-3結合部位を形成することができるような長さである。ある特定の実施形態では、そのようなscFvリンカーは、「短い」、すなわち、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12個のアミノ酸残基からなる。したがって、ある特定の例では、scFvリンカーは、約12個以下のアミノ酸残基からなる。アミノ酸残基が0の場合、scFvリンカーはペプチド結合である。いくつかの実施形態では、これらのscFvリンカーは、約3~約15個、例えば、8、9、または10個の連続したアミノ酸残基からなる。例えば、グリシン及びセリン残基を含むscFvリンカーは、一般に、プロテアーゼ耐性を提供する。いくつかの実施形態では、scFv中のリンカーは、グリシン及びセリン残基を含む。scFvリンカーのアミノ酸配列は、例えば、ファージディスプレイ法によって、scFvのCD-3結合及び産生収率を改善するために最適化することができる。scFv中の可変軽鎖ドメイン及び可変重鎖ドメインを連結するのに好適なペプチドscFvリンカーの例には、(GS)n、(GGS)n、(GGGS)n、(GGSG)n、(GGSGG)n、または(GGGGS)nが挙げられるがこれらに限定されず、式中、nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10である。一実施形態では、scFvリンカーは、(GGGGS)4または(GGGGS)3であり得る。リンカーの長さの変動は、活性を保持するかまたは強化し得る、活性研究において優れた有効性を生む。
さらなる例示的なドメイン及びscFvリンカーを図56に示す。
プロテアーゼ切断ドメイン
本明細書に記載される抗原結合ポリペプチドは、少なくとも1つのプロテアーゼによって切断されるアミノ酸配列を含む少なくとも1つのプロテアーゼ切断部位を含む。いくつかの場合には、本明細書に記載される抗原結合タンパク質は、少なくとも1つのプロテアーゼによって切断される、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個、またはそれ以上のプロテアーゼ切断部位を含む。いくつかの場合には、プロテアーゼ切断部位は、プロテアーゼによって認識されるアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列LEATAを有するポリペプチドを含むMMP9切断部位である。
本明細書に記載される抗原結合ポリペプチドは、少なくとも1つのプロテアーゼによって切断されるアミノ酸配列を含む少なくとも1つのプロテアーゼ切断部位を含む。いくつかの場合には、本明細書に記載される抗原結合タンパク質は、少なくとも1つのプロテアーゼによって切断される、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個、またはそれ以上のプロテアーゼ切断部位を含む。いくつかの場合には、プロテアーゼ切断部位は、プロテアーゼによって認識されるアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列LEATAを有するポリペプチドを含むMMP9切断部位である。
プロテアーゼ切断ドメインは、配列特異的な様式で認識され切断される配列を有するポリペプチドである。本明細書で企図される抗原結合タンパク質は、いくつかの場合には、マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)、例えば、MMP9により、配列特異的な様式で認識されるプロテアーゼ切断ドメインを含む。いくつかの場合には、MMP9によって認識されるプロテアーゼ切断ドメインは、アミノ酸配列PR(S/T)(L/I)(S/T)を有するポリペプチドを含む。いくつかの場合には、MMP9によって認識されるプロテアーゼ切断ドメインは、アミノ酸配列LEATAを有するポリペプチドを含む。いくつかの場合には、プロテアーゼ切断ドメインは、MMP11によって配列特異的な様式で認識される。いくつかの場合には、MMP11によって認識されるプロテアーゼ切断ドメインは、アミノ酸配列GGAANLVRGGを有するポリペプチドを含む。いくつかの場合には、プロテアーゼ切断ドメインは、表1に開示されるプロテアーゼによって認識される。いくつかの場合には、表1に開示されるプロテアーゼによって認識されるプロテアーゼ切断ドメインは、表1に開示される配列から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
プロテアーゼは、タンパク質を、いくつかの場合には、配列特異的な様式で切断するタンパク質である。プロテアーゼには、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、アスパラギンペプチドリアーゼ、血清プロテアーゼ、カテプシン、カテプシンB、カテプシンC、カテプシンD、カテプシンE、カテプシンK、カテプシンL、カリクレイン、hK1、hK10、hK15、プラスミン、コラゲナーゼ、IV型コラゲナーゼ、ストロメリシン、第Xa因子、キモトリプシン様プロテアーゼ、トリプシン様プロテアーゼ、エラスターゼ様プロテアーゼ、サブチリシン様プロテアーゼ、アクチニダイン、ブロメライン、カルパイン、カスパーゼ、カスパーゼ-3、Mir1-CP、パパイン、HIV-1プロテアーゼ、HSVプロテアーゼ、CMVプロテアーゼ、キモシン、レニン、ペプシン、マトリプターゼ、レグマイン、プラスメプシン、ネペンテシン、メタロエキソペプチダーゼ、メタロエンドペプチターゼ、マトリックスメタロペプチターゼ(MMP)、MMP1、MMP2、MMP3、MMP8、MMP9、MMP13、MMP11、MMP14、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子(uPA)、エンテロキナーゼ、前立腺特異抗原(PSA、hK3)、インターロイキン-1β変換酵素、トロンビン、FAP(FAP-α)、ジペプチジルペプチダーゼ、及びジペプチジルペプチダーゼIV(DPPIV/CD26)が挙げられる。
プロテアーゼは、いくつかの罹患した細胞及び組織、例えば、腫瘍または癌細胞によって分泌されて、プロテアーゼが豊富な微小環境(microenvironment that is rich in proteases)またはプロテアーゼに富む微小環境(protease-rich microenvironment)を創出することが知られている。いくつかの場合には、対象の血液にはプロテアーゼが豊富である。いくつかの場合には、腫瘍を取り囲む細胞がプロテアーゼを腫瘍微小環境に分泌する。プロテアーゼを分泌する腫瘍を取り囲む細胞には、腫瘍間質細胞、筋繊維芽細胞、血液細胞、肥満細胞、B細胞、NK細胞、制御性T細胞、マクロファージ、細胞傷害性Tリンパ球、樹状細胞、間葉系幹細胞、多形核細胞、及び他の細胞が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの場合には、プロテアーゼ、例えば、微生物ペプチド中に見出されるアミノ酸配列を標的とするプロテアーゼは、対象の血液中に存在する。この特徴により、標的細胞または組織のプロテアーゼに富む微小環境以外ではT細胞が抗原結合タンパク質によって結合されないため、抗原結合タンパク質などの標的治療薬がさらなる特異性を有するようになる。
例示的な実施形態では、ポリペプチド構築物は、1つ以上のプロテアーゼ切断部位、例えば、上記の表1に記載の部位を含む。これらの部位は、種々の実施形態において、1つ以上のVLiまたはVHiと1つ以上のVHまたはVLとの間に位置することで、関連するプロテアーゼによる部位の切断の際に、VLiがVHから分離し、かつ/またはVHiがVLから分離するようにする。当業者には理解されるように、プロテアーゼ切断部位は、VLドメインとVHドメインとの間の連結ポリペプチドscFvリンカー配列全体を含むことができ、あるいは、切断部位は、一方または両方の末端で、アミノ酸またはペプチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼ切断ドメインは、半減期延長ドメインまたはCD3結合ドメインにある。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ切断ドメインは、半減期延長ドメインまたはCD3結合ドメインにはない。
半減期延長ドメイン
本明細書では、抗原結合ドメインの半減期を延長させるドメインが企図される。そのようなドメインには、HSA結合ドメイン、Fcドメイン、小分子、及び当該技術分野で既知の他の半減期延長ドメインが含まれるが、これらに限定されないことが意図される。
本明細書では、抗原結合ドメインの半減期を延長させるドメインが企図される。そのようなドメインには、HSA結合ドメイン、Fcドメイン、小分子、及び当該技術分野で既知の他の半減期延長ドメインが含まれるが、これらに限定されないことが意図される。
ヒト血清アルブミン(HSA)(分子量約67kDa)は、約50mg/ml(600μM)で存在する血漿中で最も豊富なタンパク質であり、ヒトにおいて約20日間の半減期を有する。HSAは、血漿pHを維持する働きをし、コロイド血圧に寄与し、多くの代謝産物及び脂肪酸の担体として機能し、血漿中の主要な薬物輸送タンパク質として働く。
アルブミンとの非共有結合は、短命のタンパク質の消失半減期を延長する。例えば、アルブミン結合ドメインのFabフラグメントへの組換え融合により、Fabフラグメントのみの投与と比較して、マウス及びウサギに静脈内投与した場合、それぞれ、25倍及び58倍のインビボクリアランスの減少、ならびに26倍及び37倍の半減期延長がもたらされた。別の例では、インスリンが、アルブミンとの会合を促進するために脂肪酸でアシル化される場合、ウサギまたはブタに皮下注射されると長期にわたる効果が観察された。総合すると、これらの研究により、アルブミン結合と長期作用との間の関連が実証される。
一態様では、本明細書に記載される抗原結合タンパク質は、半減期延長ドメイン、例えば、HSAに特異的に結合するドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質のHSA結合ドメインは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体に由来するドメインが挙げられるがこれらに限定されない、HSAに結合する任意のドメインであり得る。いくつかの実施形態では、HSA結合ドメインは、単一鎖可変フラグメント(scFv)、単一ドメイン抗体、例えば、HSAに特異的なラクダ由来のナノボディ、ペプチド、リガンド、または小分子の重鎖可変ドメイン(VH)、軽鎖可変ドメイン(VL)、及び可変ドメイン(VHH)である。ある特定の実施形態において、HSA結合ドメインは、単一ドメイン抗体である。他の実施形態では、HSA結合ドメインはペプチドである。さらなる実施形態では、HSA結合ドメインは小分子である。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質のHSA結合ドメインは、かなり小さく、25kD以下、20kD以下、15kD以下、または10kD以下であることが企図される。ある特定の例では、ペプチドまたは小分子である場合、HSA結合は5kD以下である。
抗原結合タンパク質の半減期延長ドメインにより、抗原結合タンパク質それ自体の薬力学及び薬物動態の変化が提供される。上記のように、半減期延長領域は、消失半減期を延長する。半減期延長領域はまた、薬力学的特性を改変し、これには、抗原結合タンパク質の組織分布、浸透、及び拡散の改変が含まれる。いくつかの実施形態では、半減期延長ドメインは、半減期延長結合ドメインを有しないタンパク質と比較して、改善された組織(腫瘍を含む)標的化、組織浸透、組織分布、組織内の拡散、及び強化された有効性を提供する。一実施形態では、治療方法は、減少した量の抗原結合タンパク質を効果的かつ効率的に利用することで、減少した非腫瘍細胞の細胞傷害性などの副作用の減少をもたらす。
さらに、半減期延長ドメイン、例えば、HSA結合ドメインの特徴には、HSAに対するHSA結合ドメインの結合親和性が含まれる。該HSA結合ドメインの親和性は、特定のポリペプチド構築物における特異的な消失半減期を標的とするように選択することができる。このため、いくつかの実施形態では、HSA結合ドメインは高い結合親和性を有する。他の実施形態において、HSA結合ドメインは、中程度の結合親和性を有する。さらに他の実施形態では、HSA結合ドメインは、低いまたは最低限の結合親和性を有する。例示的な結合親和性には、10nM以下(高)、10nM~100nM(中)、及び100nM(低)超のK D濃度が挙げられる。上記のように、HSAに対する結合親和性は、表面プラズモン共鳴(SPR)などの既知の方法によって決定される。
標的抗原結合ドメイン
記載のCD3及び半減期延長ドメインに加えて、本明細書に記載されるポリペプチド構築物はまた、1つ以上の標的抗原または単一の標的抗原上の1つ以上の領域に結合する少なくとも1つまたは少なくとも2つ以上のドメインを含む。本明細書では、本発明のポリペプチド構築物は、例えば、プロテアーゼ切断ドメインにて、疾患特異的微小環境においてまたは対象の血液中で切断され、各標的抗原結合ドメインは、標的細胞上で標的抗原に結合することで、CD3結合ドメインを活性化してT細胞に結合することが企図される。少なくとも1つの標的抗原は、疾患、障害、または病状に関与し、かつ/または関連する。例示的な標的抗原には、増殖性疾患、腫瘍性疾患、炎症性疾患、免疫学的障害、自己免疫疾患、感染性疾患、ウイルス性疾患、アレルギー性反応、寄生虫反応、移植片対宿主病、または宿主対移植片疾患に関連するものが挙げられる。いくつかの実施形態では、標的抗原は、腫瘍細胞上に発現される腫瘍抗原である。あるいは、いくつかの実施形態では、標的抗原は、ウイルスまたは細菌などの病原体と関連する。少なくとも1つの標的抗原は、健康な組織に対しても指向され得る。
記載のCD3及び半減期延長ドメインに加えて、本明細書に記載されるポリペプチド構築物はまた、1つ以上の標的抗原または単一の標的抗原上の1つ以上の領域に結合する少なくとも1つまたは少なくとも2つ以上のドメインを含む。本明細書では、本発明のポリペプチド構築物は、例えば、プロテアーゼ切断ドメインにて、疾患特異的微小環境においてまたは対象の血液中で切断され、各標的抗原結合ドメインは、標的細胞上で標的抗原に結合することで、CD3結合ドメインを活性化してT細胞に結合することが企図される。少なくとも1つの標的抗原は、疾患、障害、または病状に関与し、かつ/または関連する。例示的な標的抗原には、増殖性疾患、腫瘍性疾患、炎症性疾患、免疫学的障害、自己免疫疾患、感染性疾患、ウイルス性疾患、アレルギー性反応、寄生虫反応、移植片対宿主病、または宿主対移植片疾患に関連するものが挙げられる。いくつかの実施形態では、標的抗原は、腫瘍細胞上に発現される腫瘍抗原である。あるいは、いくつかの実施形態では、標的抗原は、ウイルスまたは細菌などの病原体と関連する。少なくとも1つの標的抗原は、健康な組織に対しても指向され得る。
いくつかの実施形態では、標的抗原は、タンパク質、脂質、または多糖などの細胞表面分子である。いくつかの実施形態では、標的抗原は、腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、細菌感染細胞、損傷赤血球、動脈プラーク細胞、または線維化組織細胞上にある。本明細書では、2つ以上の標的抗原が結合すると、2つの不活性CD3結合ドメインが共局在し、標的細胞の表面上に活性CD3結合ドメインを形成することが企図される。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、抗原結合タンパク質中の不活性CD3結合ドメインを活性化するための2つ以上の標的抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、標的細胞への結合の強度を増強するために、2つ以上の標的抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、標的細胞への結合の強度を増強するために、2つ以上の標的抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、2つ以上の抗原結合ドメインは、同じ抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、2つ以上の抗原結合ドメインは、異なる抗原結合ドメインを含む。例えば、罹患細胞または組織、例えば、腫瘍または癌細胞において二重に発現することが知られている2つの異なる抗原結合ドメインは、標的に対する抗原結合タンパク質の結合または選択性を増強することができる。
本明細書で企図されるポリペプチド構築物は、少なくとも1つの抗原結合ドメインを含み、ここで、抗原結合ドメインは、少なくとも1つの標的抗原に結合する。標的抗原は、いくつかの場合には、罹患細胞または組織、例えば腫瘍または癌細胞の表面上に発現される。標的抗原には、EpCAM、EGFR、HER-2、HER-3、c-Met、FoIR、及びCEAが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に開示されるポリペプチド構築物はまた、罹患細胞または組織上で発現されることが知られている2つの異なる標的抗原に結合する2つの抗原結合ドメインを含むタンパク質も含む。例示的な対の抗原結合ドメインには、EGFR/CEA、EpCAM/CEA、及びHER-2/HER-3が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書に記載されるポリペプチド構築物の設計により、1つ以上の標的抗原に対する結合ドメインは、標的抗原に対する結合ドメインが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体を含むがこれらに限定されない、いかなるの種類の結合ドメインでもあり得るという点で、柔軟になる。いくつかの実施形態では、標的抗原に対する結合ドメインは、単一鎖可変フラグメント(scFv)、単一ドメイン抗体、例えば、ラクダ由来ナノボディの重鎖可変ドメイン(VH)、軽鎖可変ドメイン(VL)、及び可変ドメイン(VHH)である。他の実施形態では、標的抗原に対する結合ドメインは、非Ig結合ドメイン、すなわち、アンチカリン、アフィリン、アフィボディ分子、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アビマー、DARPin、フィノマー、クニッツドメインペプチド、及びモノボディーなどの抗体模倣物である。さらなる実施形態では、1つ以上の標的抗原に対する結合ドメインは、1つ以上の標的抗原に結合または会合する、リガンド、受容体ドメイン、レクチン、またはペプチドである。
いくつかの実施形態では、標的細胞抗原結合ドメインは、scFv、VHドメイン、VLドメイン、非Igドメイン、または標的抗原に特異的に結合するリガンドを独立して含む。いくつかの実施形態では、標的抗原結合ドメインは、細胞表面分子に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、標的抗原結合ドメインは、腫瘍抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、標的抗原結合ドメインは、EpCAM、EGFR、HER-2、HER-3、cMet、CEA、及びFoIRのうちの少なくとも1つから選択される抗原に特異的にかつ独立して結合する。いくつかの実施形態では、標的抗原結合ドメインは、抗原の少なくとも1つが、EpCAM、EGFR、HER-2、HER-3、cMet、CEA、及びFoIRのうちの1つから選択される、2つの異なる抗原に特異的にかつ独立して結合する。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ切断ドメインの切断前のタンパク質は、約100kDa未満である。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ切断ドメインの切断後のタンパク質は、約25~約75kDaである。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ切断前のタンパク質は、初回通過クリアランスの腎閾値を上回るサイズを有する。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ切断前のタンパク質は、少なくとも約50時間の消失半減期を有する。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ切断前のタンパク質は、少なくとも約100時間の消失半減期を有する。いくつかの実施形態では、タンパク質は、同じ標的抗原に対するIgGと比較して組織浸透が増加している。いくつかの実施形態では、タンパク質は、同じ標的抗原に対するIgGと比較して組織分布が増加している。
ポリペプチド構築物の薬物動態
本明細書に記載されるポリペプチド構築物は、当業者に認識されるある特定の利点を有する。例えば、本明細書に記載されるポリペプチド構築物は、従来の抗体治療薬よりも改善された薬物動態を有する。本明細書のポリペプチド構築物の改善された薬物動態は、少なくとも半減期延長ドメイン及びCD3結合ドメインに起因する。本明細書中に開示される半減期延長ドメインは、限定されないが、Fcドメイン及びHSAに結合するポリペプチドが挙げられるがこれらに限定されない種々のポリペプチドを含む。本明細書のCD3結合ドメインは、優れた薬物動態を付与する固有の特性を有する。本明細書のCD3結合ドメインは、少なくとも、少なくとも1つのプロテアーゼ切断ドメインの切断、及び標的抗原への抗原結合ドメインの結合によって活性化されるまで、CD3に結合しない。したがって、本明細書の抗原結合タンパク質の薬物動態の増強は、ヒトの循環におけるCD3結合を介した標的媒介性薬物体内動態の減少または排除に少なくとも部分的に起因する。改善された薬物動態は、より浅いアルファ相、及びベータ相におけるより高い曝露のうちの少なくとも一方を含む。したがって、本明細書に記載される抗原結合タンパク質は、従来の抗体治療薬と比較した場合、曝露におけるピーク/トラフ差がより小さい、より大きな治療ウインドウを有する。
本明細書に記載されるポリペプチド構築物は、当業者に認識されるある特定の利点を有する。例えば、本明細書に記載されるポリペプチド構築物は、従来の抗体治療薬よりも改善された薬物動態を有する。本明細書のポリペプチド構築物の改善された薬物動態は、少なくとも半減期延長ドメイン及びCD3結合ドメインに起因する。本明細書中に開示される半減期延長ドメインは、限定されないが、Fcドメイン及びHSAに結合するポリペプチドが挙げられるがこれらに限定されない種々のポリペプチドを含む。本明細書のCD3結合ドメインは、優れた薬物動態を付与する固有の特性を有する。本明細書のCD3結合ドメインは、少なくとも、少なくとも1つのプロテアーゼ切断ドメインの切断、及び標的抗原への抗原結合ドメインの結合によって活性化されるまで、CD3に結合しない。したがって、本明細書の抗原結合タンパク質の薬物動態の増強は、ヒトの循環におけるCD3結合を介した標的媒介性薬物体内動態の減少または排除に少なくとも部分的に起因する。改善された薬物動態は、より浅いアルファ相、及びベータ相におけるより高い曝露のうちの少なくとも一方を含む。したがって、本明細書に記載される抗原結合タンパク質は、従来の抗体治療薬と比較した場合、曝露におけるピーク/トラフ差がより小さい、より大きな治療ウインドウを有する。
ポリペプチド構築物の修飾
本明細書に記載されるポリペプチド構築物は、(i)アミノ酸が、遺伝暗号によりコードされているものではないアミノ酸残基で置換されているか、(ii)成熟ポリペプチドが、ポリエチレングリコールなどの別の化合物と融合しているか、あるいは(iii)さらなるアミノ酸が、リーダーもしくは分泌配列またはタンパク質の精製のための配列などのタンパク質に融合している、誘導体または類似体を包含する。
本明細書に記載されるポリペプチド構築物は、(i)アミノ酸が、遺伝暗号によりコードされているものではないアミノ酸残基で置換されているか、(ii)成熟ポリペプチドが、ポリエチレングリコールなどの別の化合物と融合しているか、あるいは(iii)さらなるアミノ酸が、リーダーもしくは分泌配列またはタンパク質の精製のための配列などのタンパク質に融合している、誘導体または類似体を包含する。
典型的な修飾には、アセチル化、アシル化、ADP-リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化などのタンパク質へのアミノ酸の転移RNA介在性付加、及びユビキチン化を含むが、これらに限定されない。
修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、及びアミノ末端またはカルボキシル末端を含む、本明細書に記載されるポリペプチド構築物の任意の場所で行われる。ポリペプチド構築物の修飾に有用なある特定の一般的なペプチド修飾には、グリコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ-カルボキシル化、ヒドロキシル化、ポリペプチド中のアミノ基またはカルボキシル基のブロック、及びADPリボシル化が挙げられる。
抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子も提供される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド分子はDNA構築物として提供される。他の実施形態では、ポリヌクレオチド分子は、メッセンジャーRNA転写産物として提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子も提供される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド分子はDNA構築物として提供される。他の実施形態では、ポリヌクレオチド分子は、メッセンジャーRNA転写産物として提供される。
ポリヌクレオチド分子は、ペプチドリンカーによって分離されるか、または他の実施形態ではペプチド結合によって直接的に連結される3つの結合ドメインをコードする遺伝子を、好適なプロモーターに動作可能に連結された単一の遺伝子構築物、及び任意選択で好適な転写終結因子に組み合わせ、それを、細菌中、または例えばCHO細胞などの他の適切な発現系中で発現させることなどによる既知の方法によって構築される。標的結合ドメインが小分子である実施形態では、ポリヌクレオチドは、CD-3及びHSAに結合するドメインをコードする遺伝子を含む。半減期延長ドメインが小分子である実施形態では、ポリヌクレオチドは、CD-3及び標的抗原に結合するドメインをコードする遺伝子を含む。利用されるベクター系及び宿主に応じて、構成的プロモーター及び誘導性プロモーターを含む任意の数の好適な転写及び翻訳要素を使用し得る。プロモーターは、それがそれぞれの宿主細胞におけるポリヌクレオチドの発現を駆動するように選択される。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ベクター、好ましくは発現ベクターに挿入され、これは、さらなる実施形態を表す。この組換えベクターは、既知の方法に従って構築することができる。特に関心があるベクターには、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、ウイルス(例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルスなど)及びコスミドが挙げられる。
様々な発現ベクター/宿主系を利用して、記載されるポリペプチド構築物のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有及び発現させることができる。E.coliにおける発現のための発現ベクターの例は、哺乳動物細胞における発現のためのpSKK(Le Gall et al.,J Immunol Methods.(2004)285(1):111-27)またはpcDNA5(Invitrogen)である。
このため、本明細書に記載されるポリペプチド構築物は、いくつかの実施形態では、上記のタンパク質をコードするベクターを宿主細胞に導入し、タンパク質ドメインが発現される条件下で該宿主細胞を培養し、場合により単離し、任意選択でさらに精製することによって産生される。
薬学的組成物
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗原結合タンパク質、ポリペプチド構築物のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターまたはこのベクターによって形質転換された宿主細胞、及び少なくとも1つの薬学的に許容される担体、を含む、薬学的組成物も提供される。「薬学的に許容される担体」という用語は、成分の生物学的活性の有効性を妨害せず、かつそれが投与される患者にとって有害でない任意の担体を含むが、これに限定されない。好適な薬学的担体の例は、当該技術分野で周知であり、リン酸緩衝生理食塩水、水、油/水エマルションなどのエマルション、様々な種類の湿潤剤、無菌溶液などが挙げられる。このような担体は、従来の方法によって製剤化することができ、好適な用量で対象に投与することができる。好ましくは、組成物は無菌である。これらの組成物はまた、保存剤、乳化剤、及び分散剤などのアジュバントを含有してもよい。種々の抗菌剤及び抗真菌剤を含めることによって、微生物の作用の防止が確実となり得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗原結合タンパク質、ポリペプチド構築物のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターまたはこのベクターによって形質転換された宿主細胞、及び少なくとも1つの薬学的に許容される担体、を含む、薬学的組成物も提供される。「薬学的に許容される担体」という用語は、成分の生物学的活性の有効性を妨害せず、かつそれが投与される患者にとって有害でない任意の担体を含むが、これに限定されない。好適な薬学的担体の例は、当該技術分野で周知であり、リン酸緩衝生理食塩水、水、油/水エマルションなどのエマルション、様々な種類の湿潤剤、無菌溶液などが挙げられる。このような担体は、従来の方法によって製剤化することができ、好適な用量で対象に投与することができる。好ましくは、組成物は無菌である。これらの組成物はまた、保存剤、乳化剤、及び分散剤などのアジュバントを含有してもよい。種々の抗菌剤及び抗真菌剤を含めることによって、微生物の作用の防止が確実となり得る。
本薬学的組成物のいくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗原結合タンパク質は、ナノ粒子にカプセル化される。いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、フラーレン、液晶、リポソーム、量子ドット、超常磁性ナノ粒子、デンドリマー、またはナノロッドである。薬学的組成物の他の実施形態では、抗原結合タンパク質はリポソームに結合される。いくつかの例では、抗原結合タンパク質は、リポソームの表面にコンジュゲートされる。いくつかの例では、抗原結合タンパク質は、リポソームのシェルの中にカプセル化される。いくつかの例では、リポソームはカチオン性リポソームである。
本明細書に記載されるポリペプチド構築物は、医薬品としての使用が企図される。投与は、様々な方法、例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所、または皮内投与によって行われる。いくつかの実施形態では、投与経路は、治療の種類及び薬学的組成物に含有される化合物の種類に依存する。投薬レジメンは、主治医及び他の臨床的要因によって決定されることになる。いずれの患者のための投薬量も、患者のサイズ、体表面積、年齢、性別、投与される特定の化合物、投与の時間及び経路、治療の種類、全体的な健康、ならびに同時投与される他の薬物を含む多くの因子に依存する。「有効用量」は、疾患の経過及び重症度に影響を及ぼして、そのような病状の軽減または寛解をもたらすのに十分な活性成分の量を指し、既知の方法を用いて決定され得る。
治療の方法
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗原結合タンパク質の投与を含む、それを必要とする個体の免疫系を刺激するための方法及び使用も提供される。いくつかの場合には、本明細書に記載される抗原結合タンパク質の投与により、標的抗原を発現する細胞が増加したレベルのプロテアーゼ活性を有する微小環境にある、標的抗原を発現する細胞に対して細胞傷害性が誘導され、かつ/または持続する。いくつかの場合には、標的抗原を発現する細胞は、癌または腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、細菌感染細胞、自己反応性T細胞もしくはB細胞、損傷赤血球、動脈プラーク、または線維化組織である。いくつかの場合には、対象の血液にはプロテアーゼが豊富である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗原結合タンパク質の投与を含む、それを必要とする個体の免疫系を刺激するための方法及び使用も提供される。いくつかの場合には、本明細書に記載される抗原結合タンパク質の投与により、標的抗原を発現する細胞が増加したレベルのプロテアーゼ活性を有する微小環境にある、標的抗原を発現する細胞に対して細胞傷害性が誘導され、かつ/または持続する。いくつかの場合には、標的抗原を発現する細胞は、癌または腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、細菌感染細胞、自己反応性T細胞もしくはB細胞、損傷赤血球、動脈プラーク、または線維化組織である。いくつかの場合には、対象の血液にはプロテアーゼが豊富である。
本明細書に記載される抗原結合タンパク質を、それを必要とする個体に投与することを含む、標的抗原に関連する疾患、障害、または病床の治療のための方法及び使用も本明細書で提供される。標的抗原に関連する疾患、障害、または病状には、ウイルス感染、細菌感染、自己免疫疾患、移植拒絶、アテローム性動脈硬化症、または線維症が挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態では、標的抗原に関連する疾患、障害、または病状は、増殖性疾患、腫瘍性疾患、炎症性疾患、免疫学的障害、自己免疫疾患、感染性疾患、ウイルス性疾患、アレルギー性反応、寄生虫反応、移植片対宿主病、または宿主対移植片疾患である。一実施形態では、標的抗原に関連する疾患、障害、または病状は、癌である。一例では、癌は血液癌である。別の例では、癌は固形腫瘍癌である。
本明細書で使用される場合、いくつかの実施形態では、「治療」または「治療する」または「治療される」は、目的が望ましくない生理学的病状、障害、または疾患を遅らせる(軽減する)か、あるいは有益なまたは望ましい臨床結果を得る、治療処置を指す。本明細書に記載される目的では、有益なまたは望ましい臨床結果には、症状の緩和;病状、障害、または疾患の程度の減衰;病状、障害、または疾患の状態の安定化(すなわち、悪化しない);病状、障害、または疾患の発症の遅延または進行の減速;病状、障害、または疾患の状態の改善; 及び検出の可能不可能にかかわらず、病状、障害、または疾患の(部分的または全体的な)寛解、または増強もしくは向上を含むが、これらに限定されない。治療には、過剰なレベルの副作用なしに臨床的に有意な応答を誘起することが含まれる。治療はまた、治療を受けていない場合に予想される生存と比較して、生存期間を延長することを含む。他の実施形態では、「治療」または「治療する」または「治療される」は、目的が、例えば、疾患に罹りやすいヒト(例えば、乳癌などの疾患に関する遺伝的マーカーを有する個体)において、望ましくない生理学的病状、障害、もしくは疾患の発症を遅延させるか、またはそれらの重症度を低下させることである、予防措置を指す。
本発明の方法において、治療は、疾患または病状に関して肯定的な治療応答を提供するために使用される。「肯定的な治療応答」は、疾患もしくは病状の改善、及び/または疾患または病状に関連する症状の改善を意図する。例えば、肯定的な治療応答は、疾患における以下の改善のうちの1つ以上を指し得る:(1)腫瘍細胞の数の減少、(2)腫瘍細胞死の増加、(3)腫瘍細胞の生存の阻害、(5)腫瘍増殖の阻害(すなわち、ある程度の減速、好ましくは停止)、(6)患者生存率の増加、及び(7)疾患または病状に関連する1つ以上の症状からのいくらかの解放。
任意の所与の疾患または病状における肯定的な治療応答は、その疾患または病状に特有の標準化された応答基準によって決定され得る。腫瘍応答は、磁気共鳴画像(MRI)スキャン、X線撮影、コンピューター断層撮影(CT)スキャン、骨スキャン撮影、内視鏡検査、ならびに骨髄穿刺(BMA)及び循環中の腫瘍細胞の計数を含む腫瘍生検サンプリングなどのスクリーニング技法を使用して、腫瘍形態(すなわち、全身腫瘍組織量、腫瘍サイズなど)の変化について評定され得る。
これらの肯定的な治療応答に加えて、治療を受けている対象は、疾患に関連する症状の改善の有益な効果を経験し得る。
本発明に従う治療には、使用される医薬品の「治療有効量」が含まれる。「治療有効量」は、所望の治療結果を達成するために、必要な用量及び期間で有効な量をいう。
治療有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別、及び体重、ならびに個体において所望の応答を誘発する薬剤の能力などの因子によって異なり得る。治療有効量はまた、抗体または抗体部分のいずれの毒性または有害な効果よりも治療上有益な効果が勝る量である。
腫瘍療法のための「治療有効量」は、疾患の進行を安定化する能力によっても測定することができる。癌を阻害する化合物の能力は、ヒト腫瘍における有効性を予測する動物モデル系において評価してもよい。
あるいは、組成物のこの特性は、当業者に知られているインビトロアッセイによって、化合物が細胞増殖を阻害するか、またはアポトーシスを誘導する能力を検査することによって評価してもよい。治療有効量の治療用化合物は、腫瘍サイズを減少させるか、さもなければ対象の症状を軽減し得る。当業者であれば、対象のサイズ、対象の症状の重症度、及び選択される特定の組成物または投与経路などの因子に基づいて、そのような量を決定することができるであろう。
投薬レジメンは、最適な所望の応答(例えば、治療応答)を提供するように調節される。例えば、単回のボーラスを投与してもよく、いくつかの分割用量を経時的に投与してもよく、または治療状況の緊急性によって示されるように用量を比例して減少または増加させてもよい。非経口組成物は、投与の容易性及び投与量の均一性のために、単位剤形で処方され得る。本明細書で使用される単位剤形は、処置される対象のための単一用量として好適な物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要とされる薬学的担体に関連して所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を含有する。
本発明の単位剤形形態の仕様は、(a)活性化合物の固有の特徴及び達成すべき特定の治療効果、ならびに(b)個体における感受性の治療に対してそのような活性化合物を調合する分野に付いて回る制限に影響され、またそれらに直接的に依存する。
本発明で使用される二重特異性抗体の効率的な投薬量及び投薬レジメンは、治療される疾患または病状に依存し、当業者によって決定され得る。
本発明で使用される二重特異性抗体の治療有効量の例示的かつ非限定的な範囲は、約0.1~100mg/kgである。
本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態では、ポリペプチド構築物は、特定の疾患、障害、または病状の治療のための薬剤と組み合わせて投与される。薬剤には、抗体、小分子(例えば、化学療法剤)、ホルモン(ステロイド性、ペプチドなど)を伴う療法、放射線療法(γ線、X線、及び/または放射性同位体、マイクロ波、UV照射などの指向性送達)、遺伝子療法(例えば、アンチセンス、レトロウイルス療法など)、及び他の免疫療法が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ポリペプチド構築物は、抗下痢剤、制吐剤、鎮痛剤、オピオイド、及び/または非ステロイド性抗炎症剤と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、ポリペプチド構築物は、外科手術の前、際中、または後に投与される。
全ての引用文献は、本明細書にそれらの全体が参考として明示的に援用される。
材料及び方法
材料及び方法
ポリペプチド構築物をコードするDNA発現構築物のクローニング:プロテアーゼ切断部位ドメインを有する抗CD-3 scFvを使用して、抗CD-3 scFvドメイン及び半減期延長ドメイン(例えば、HSA結合ペプチドまたはVHドメイン)を、ドメインが図53に示すように組織化されるように構築する。CHO細胞における抗原結合タンパク質の発現のために、全てのタンパク質ドメインのコード配列を哺乳動物発現ベクター系にクローニングする。簡潔には、CD3結合ドメイン、半減期延長ドメイン、及びペプチドリンカーのL1及びL2を伴うCD3結合ドメインをコードする遺伝子配列を、別々に合成し、サブクローニングする。次いで、得られた構築物を、標的結合ドメイン-L1-VH CD-3結合ドメイン-L2- プロテアーゼ切断ドメイン-L3-VLi CD-3結合ドメイン-L4-標的結合ドメイン-L5-VL CD-3結合ドメイン-L6-プロテアーゼ切断ドメイン-L7-VHi CD-3結合ドメイン-L8-半減期延長ドメインの順で共にライゲーションし、最終構築物を得る。全ての発現構築物は、タンパク質分泌及び精製を容易にするために、それぞれ、N末端シグナルペプチド及びC末端ヘキサ-またはデカ-ヒスチジン(6x-または10x-His)タグのコード配列を含むように設計されている。
材料及び方法
ポリペプチド構築物をコードするDNA発現構築物のクローニング:プロテアーゼ切断部位ドメインを有する抗CD-3 scFvを使用して、抗CD-3 scFvドメイン及び半減期延長ドメイン(例えば、HSA結合ペプチドまたはVHドメイン)を、ドメインが図53に示すように組織化されるように構築する。CHO細胞における抗原結合タンパク質の発現のために、全てのタンパク質ドメインのコード配列を哺乳動物発現ベクター系にクローニングする。簡潔には、CD3結合ドメイン、半減期延長ドメイン、及びペプチドリンカーのL1及びL2を伴うCD3結合ドメインをコードする遺伝子配列を、別々に合成し、サブクローニングする。次いで、得られた構築物を、標的結合ドメイン-L1-VH CD-3結合ドメイン-L2- プロテアーゼ切断ドメイン-L3-VLi CD-3結合ドメイン-L4-標的結合ドメイン-L5-VL CD-3結合ドメイン-L6-プロテアーゼ切断ドメイン-L7-VHi CD-3結合ドメイン-L8-半減期延長ドメインの順で共にライゲーションし、最終構築物を得る。全ての発現構築物は、タンパク質分泌及び精製を容易にするために、それぞれ、N末端シグナルペプチド及びC末端ヘキサ-またはデカ-ヒスチジン(6x-または10x-His)タグのコード配列を含むように設計されている。
安定にトランスフェクトされたCHO細胞におけるポリペプチド構築物の発現:CHO-K1チャイニーズハムスター卵巣細胞(ATCC、CCL-61)の誘導体であるCHO細胞発現系(Flp-In(登録商標)、Life Technologies)(Kao and Puck,Proc.Natl.Acad Sci USA 1968; 60(4):1275-81)を使用する。付着細胞は、Life Technologiesによって提供される標準的な細胞培養プロトコールに従って継代培養する。
懸濁液中での増殖に適合させるために、細胞を組織培養フラスコから剥がし、無血清培地に入れる。懸濁液適合細胞を、10%のDMSOを含む培地中で凍結保存する。
分泌されたポリペプチド構築物を安定に発現する組換えCHO細胞株を、懸濁液適合細胞のトランスフェクションによって生成する。抗生物質ハイグロマイシンBによる選択の間、生存細胞密度を週に2回測定し、細胞を遠心分離し、新鮮な選択培地に0.1×106生存細胞/mLの最大密度で再懸濁する。ポリペプチド構築物を安定に発現する細胞プールを、2~3週間の選択後に回収し、この時点で、細胞は、振とうフラスコ中の標準培地に移す。組換え分泌タンパク質の発現を、タンパク質ゲル電気泳動またはフローサイトメトリーを行うことによって確認する。安定な細胞のプールを、DMSO含有培地中で凍結保存する。
ポリペプチド構築物を、細胞培養上清中への分泌によって、安定にトランスフェクトされたCHO細胞株の10日間流加培養で産生させる。細胞培養上清は、典型的には、75%超の培養生存率で10日後に採集する。試料を産生培養物から毎日収集し、細胞密度及び生存率を評評定する。採集日に、細胞培養上清を、遠心分離及び真空濾過により、その後の使用の前に除去する。
細胞培養上清中のタンパク質発現力価及び産物完全性をSDS-PAGEにより分析する。
ポリペプチド構築物の精製:ポリペプチド構築物を、CHO細胞培養上清から2段階手順で精製する。構築物を、第1のステップで親和性クロマトグラフィーに供し、続いて第2のステップでSuperdex 200の分取サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)に供する。試料を緩衝液交換し、限外濾過によって1mg/mL超の典型的な濃度に濃縮する。最終試料の純度及び均質性(典型的には90%超)を還元条件及び非還元条件下でSDS PAGEにより評定し、続いて抗HSAまたは抗イディオタイプ抗体ならびに分析SECを用いた免疫ブロッティングをそれぞれ行う。精製されたタンパク質は、使用まで-80℃にてアリコートで保存する。
CD3結合を示すサンドイッチELISA:96ウェルEIAプレートをPBS中1μg/mLのアカゲザルEGFR::hFCでコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートを0.05%のTween-20を含むPBSで3回洗浄し、SuperBlock(PBS)を用いて室温で1時間ブロックした。さらに3回洗浄した後、連続希釈したProdentを適切なウェルに添加し、室温で1時間インキュベートした。プレートを再度洗浄し、ビオチン結合したカニクイザルCD3E::hFCを最終濃度1μg/mLになるように添加し、室温で1時間インキュベートした。プレートをさらに3回洗浄した後、HRP結合ストレプトアビジンを0.1μg/mLの濃度で添加し、30分間インキュベートした。最後に、プレートを再び洗浄し、Surmodics1成分TMB基質を用いて5分間現像した。Surmodics 650停止溶液で反応を停止させ、プレートを650nmで読み取った。
CD3結合を示すサンドイッチFACS:約80%の密集度まで増殖させたOvCAR8細胞をPBS中20nMのEDTAで分離した。次いで、細胞を10%のFBSを含むPBSでブロックし、96ウェル丸底細胞培養プレートに2×105細胞/ウェルで播種した。以降全ての工程は氷上で行った。プレートを800×gで5分間遠心分離して、細胞をペレット化した。上清を捨て、細胞を連続希釈したProdentに再懸濁した。Prodentを氷上で1時間インキュベートした後、細胞を1%のFBSを含むPBSで3回洗浄した。次いで、AF488標識されたカニクイザルCD3E::hFCを0.5μg/1x106細胞の濃度で加え、暗所において氷上で30分間インキュベートした。細胞をさらに3回洗浄し、1%のFBS及び0.5μg/mLのヨウ化プロピジウムを含む150μLのPBSに再懸濁し、フローサイトメーターで分析した。
TDCCアッセイ:ルシフェラーゼで形質導入されたOvCAR8細胞を約80%の密集度まで増殖させ、TrypLE Expressで分離した。細胞を遠心分離し、1×106/mLまで培地中に再懸濁した。精製されたヒトPan T細胞を解凍し、遠心分離し、培地に再懸濁した。最後に、OvCAR8細胞とT細胞との共培養物を384ウェル細胞培養プレートに添加した。次いで、連続希釈したProdentを共培養物に添加し、48時間インキュベートした。最後に、同量のSteadyGloルシフェラーゼアッセイ試薬をプレートに添加し、20分間インキュベートした。プレートを読み取り、全発光を記録した。
EK切断のためのSDS-PAGE:2mMのCaCl2を含有するHBS中にProdentを緩衝液交換し、2つの濃度で組換えエンテロキナーゼ(NEB、P8070L)によって切断した。切断反応を室温で2時間行い、過剰のベンズアミジンセファロースで停止させた。切断産物を4~20%のトリス-グリシンゲル上で泳動させ、Coomassie G-250で染色した。
未精製タンパク質のSDS-PAGE:発現レベルを決定するために、一時的にトランスフェクトされたExpi293細胞からの馴化培地をSDS-PAGEにより評価した。各トランスフェクションからの上清10μLを、10~20%のトリス-グリシンゲル上で還元条件及び非還元条件下で泳動させた。ゲルをCoomassie G-250で染色し、予想されたバンドを適切な分子量で観察した。
精製タンパク質のSDS-PAGE:精製後、2μgの各Prodentを10~20%のトリス-グリシンゲル上で非還元条件下で泳動させ、純度及び安定性を評価した。ゲルをCoomassie G-250で染色し、予想されたバンドを適切な分子量で観察した。
間接的ELISA-EGFRまたはCD3に結合するProdent:96ウェルEIAプレートをPBS中1μg/mLのアカゲザルEGFR::hFCまたはカニクイザルCD3E::Flag::hFCのいずれかの捕捉抗原でコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートを0.05%のTween-20を含むPBSで3回洗浄し、SuperBlock(PBS)を用いて室温で1時間ブロックした。さらに3回洗浄した後、連続希釈したProdentを適切なウェルに添加し、室温で1時間インキュベートした。プレートを再度洗浄し、HRP結合した抗6xHis Tag抗体を1μg/mLの濃度で加え、室温で1時間インキュベートした。最後に、プレートを再び洗浄し、Surmodics1成分TMB基質を用いて5分間現像した。Surmodics 650停止溶液で反応を停止させ、プレートを650nmで読み取った。
FACS-OvCAR8またはJurkatに結合するProdent:未切断Procentを、FACSを用いて評定して、OvCAR8細胞上のEGFR結合及びJurkats上のCD3結合を確認した。細胞を10%のFBSを含むPBSでブロックし、96ウェル丸底細胞培養プレートに2×105細胞/ウェルで播種した。以降全ての工程は氷上で行った。プレートを800×gで5分間遠心分離して、細胞をペレット化した。上清を捨て、細胞を連続希釈したProdentに再懸濁した。Prodentを氷上で1時間インキュベートした後、細胞を1%のFBSを含むPBSで3回洗浄した。細胞を、0.5μg/mLの濃度でFITC標識抗6xHis Tag抗体に再懸濁し、30分間インキュベートした。細胞をさらに3回洗浄し、1%のFBS及び0.5μg/mLのヨウ化プロピジウムを含む150μLのPBSに再懸濁し、フローサイトメーターで分析した。
FACS及びMSD-EKトランスフェクト細胞によるProdentの切断:EKトランスフェクトOvCAR8クローンによるProdentの切断を、FACS及びMSDによって評価した。細胞を約80%の密集度まで増殖させ、PBS中20nMのEDTAで分離した。MSDについては、2×104個の細胞を96ウェルSector MSDプレートの各ウェルに37℃で2時間固定化した。次いで、ウェルを、10%のFBSを含むPBSによって室温で1時間ブロックした。プレートをアッセイ緩衝液(1%のFBSを含むPBS)で3回洗浄した。連続希釈した未切断プロドラッグを添加し、室温で1時間インキュベートした。プレートをさらに3回洗浄し、Sulfo-Tag標識したカニクイザルCD3E::Flag::hFCを最終濃度1μg/mLになるように添加し、室温で1時間インキュベートした。プレートをさらに3回洗浄した。界面活性剤を含まない読み取り緩衝液Tを加え、すぐに全発光を測定した。
FACSについては、細胞を、10%のFBSを含むPBSでブロックし、96ウェル丸底細胞培養プレートに2×105細胞/ウェルで播種した。以降全ての工程は氷上で行った。プレートを800×gで5分間遠心分離して、細胞をペレット化した。上清を捨て、細胞を連続希釈した未切断Prodentに再懸濁した。Prodentを氷上で1時間インキュベートした後、細胞を1%のFBSを含むPBSで3回洗浄した。次いで、AF488標識されたカニクイザルCD3E::hFCを0.5μg/1x106細胞の濃度で加え、暗所において氷上で30分間インキュベートした。細胞をさらに3回洗浄し、1%のFBS及び0.5μg/mLのヨウ化プロピジウムを含む150μLのPBSに再懸濁し、フローサイトメーターで分析した。
FACS-EKを発現しているOvCar8細胞の生成:細胞外6xHis Tagを有するエンテロキナーゼをコードするベクターでトランスフェクトした細胞を選択下で増殖させた。クローンを選び取り、FACSによって分析して、EK発現の相対レベルを決定した。細胞を約80%の密集度まで増殖させ、PBS中20nMのEDTAで分離し、10%のFBSを含むPBSでブロッキングした。以降全ての工程は氷上で行った。各クローンを、0.5μg/mLの濃度のFITC標識したネズミIgG1抗6xHis Tag抗体で二重染色した。FITC標識したネズミIgG1アイソタイプ対照を陰性染色として使用した。トランスフェクトされていないOvCAR8細胞も、陰性対照として両方の抗体で染色した。氷上で1時間インキュベートした後、細胞を3回洗浄し、1%のFBS及び0.5μg/mLのヨウ化プロピジウムを含む150μLのPBSに再懸濁した。クローンをフローサイトメーターで分析し、EK発現に従ってランク付けした。
オクテットによる選択されたProdentの結合親和性:親和性測定のためのオクテットアッセイ構成:抗ヒトIgG捕捉(AHC)バイオセンサー→huEGFR.huFcまたはhCD3e.flag.hFc→Prodent.6his。オクテットアッセイステップ:ベースライン60秒、ローディング120秒、ベースライン2 60秒、会合180秒、解離300秒。100nMのhuEGFR.huFcまたはhCD3e.flag.hFcタンパク質をAHCセンサーチップ上にロードする。Prodent濃度は100nMであった。緩衝液:PBS緩衝液中のカゼイン0.25%、これはセンサーの水和、試料の希釈、ならびに全てのベースライン及び解離工程に使用した。温度30℃。シェーカー速度1000rpm。陽性対照、BD Pharmingenカタログ番号555996由来の抗huEGFR mAb及びBD Pharmingenカタログ番号551916由来の抗hCD3e mAb。陰性対照:マウスIgG2b、IgG1、及びエンブレル。Octet RED96計器をデータ生成に使用した。
プロテインA定量アッセイ構成:プロテインAバイオセンサー→Prodent。オクテットアッセイステップ:プロテインAセンサーを試料に120秒間浸し、再生を3回行い、全ての試料について繰り返す。緩衝液:PBS緩衝液または発現培地中の0.25%カゼイン、センサーの水和及び試料の希釈用の同じ緩衝液。温度30℃。シェーカー速度400rpm。標準曲線範囲100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78μg/mlの精製Prodent
マトリプターゼ切断反応:タンパク質分解反応のために、26kDaタンパク質であるマトリプターゼST14(R&D、カタログ番号3946-SE)のヒト組換え触媒ドメインを、69uMのPro8MS及び81uMのPro8ML試料に添加し、最終濃度0.3μMとした。反応を室温で24時間放置し、過剰のベンズアミジンセファロースで停止させた。試料をSDS PAGE(10~20%のトリス/グリシンゲル、Invitrogen、非還元条件)で分析した。切断は95%超完了したようであった。Pro8MS及びPro8MLの未処理試料を、処理した試料と同じ時間、室温で保持した。反応は、25mMのクエン酸ナトリウム、75mMのL-アルギニン、75mMの塩化ナトリウム、4%のスクロース緩衝液(pH7.0)を含む緩衝液中で行った。
Prodent SECプロファイル:HPLCシステム(Ailient Technologies 1290 Infinity II)でYarra 3um SEC-2000カラム(Phenomenex)を使用して分析サイズ排除クロマトグラフィーを行った。分取サイズ排除クロマトグラフィーは、31.25mMのクエン酸ナトリウム、94mMのL-アルギニン、94mMのNaCl(pH7.0)緩衝液中のAKTA純クロマトグラフィーシステム(GE)でHiLoad 26/600 Superdex 200カラム(GE)を用いて行った。
プロテアーゼ活性アッセイ:市販の組換えまたは精製プロテアーゼ、ならびにヒト、マウス、及びカニクイザル血清のタンパク質分解活性を、フルオロフォア対標識ペプチド(FRETペプチド)を基質として用いて測定した。Abz-Dnp標識ペプチドの蛍光を、320nm及び420nmの励起/発光波長でそれぞれ測定した。Dabcyl-EDANS標識ペプチドの蛍光を、340nm及び490nmの励起/発光波長でそれぞれ測定した。ペプチドを、DMSO中の20mMストックから、プロテアーゼ特異的緩衝液または血清のいずれかを含む反応ウェルに添加して、最終濃度3~120μMとした。添加されたプロテアーゼの濃度は1~10nMであった。線状蛍光感度範囲内の96ウェルプレートリーダーを用いて、蛍光を記録した。
実施例1:初期PROプラットフォームの調製と特性
この調査の目的は、T細胞活性化及び細胞傷害性が腫瘍微小環境において増強される「条件的活性」T細胞エンゲージャーを開発することであった。戦略は、腫瘍特異的プロテアーゼ切断部位を独自のαX/αCD3分子に挿入し、切断及び腫瘍結合により活性分子が生じるようにすることであった。αXは、1個または好ましくは2個の腫瘍抗原に対する結合ドメインである。分子設計は、相補的活性抗CD3ドメイン(VH及びVL)を含む一対の不活性抗CD3 scFvのscFvリンカーに位置するプロテアーゼ切断部位を利用する。原則として、腫瘍細胞の表面への2つの抗腫瘍結合ドメインの結合後に、2つの結合した機能的な抗CD3結合ドメインが会合して、活性CD3結合ドメインを生成し、T細胞媒介性の腫瘍の死滅を始動する。
プラットフォーム1(不対αCD3 scFv)
・Pro1-αEGFR G8 sdAb-I2C VH-His10
・Pro2-I2C VL -αEGFR D12 sdAb-His10
・Pro3-αEGFR G8 sdAb-I2C scFv(VH -(GS)3-VL)-αEGFR D12 sdAb-His10
・Pro4-αEGFR G8 sdAb-I2C VH-Flag*-I2C VL-αEGFR D12 sdAb-His10
(短いscFvリンカーは、CD3のVH及びVLの対合を妨げる)
Flag*は、プロテアーゼ-エンテロキナーゼ(EK)の8アミノ酸切断部位である。
この調査の目的は、T細胞活性化及び細胞傷害性が腫瘍微小環境において増強される「条件的活性」T細胞エンゲージャーを開発することであった。戦略は、腫瘍特異的プロテアーゼ切断部位を独自のαX/αCD3分子に挿入し、切断及び腫瘍結合により活性分子が生じるようにすることであった。αXは、1個または好ましくは2個の腫瘍抗原に対する結合ドメインである。分子設計は、相補的活性抗CD3ドメイン(VH及びVL)を含む一対の不活性抗CD3 scFvのscFvリンカーに位置するプロテアーゼ切断部位を利用する。原則として、腫瘍細胞の表面への2つの抗腫瘍結合ドメインの結合後に、2つの結合した機能的な抗CD3結合ドメインが会合して、活性CD3結合ドメインを生成し、T細胞媒介性の腫瘍の死滅を始動する。
プラットフォーム1(不対αCD3 scFv)
・Pro1-αEGFR G8 sdAb-I2C VH-His10
・Pro2-I2C VL -αEGFR D12 sdAb-His10
・Pro3-αEGFR G8 sdAb-I2C scFv(VH -(GS)3-VL)-αEGFR D12 sdAb-His10
・Pro4-αEGFR G8 sdAb-I2C VH-Flag*-I2C VL-αEGFR D12 sdAb-His10
(短いscFvリンカーは、CD3のVH及びVLの対合を妨げる)
Flag*は、プロテアーゼ-エンテロキナーゼ(EK)の8アミノ酸切断部位である。
プラットフォーム1の構築物は以下のように調製した。Prodent1~4をコードする遺伝子を哺乳動物発現ベクターにクローニングし、プラスミドDNAを産生させた。タンパク質を、振とうフラスコ中の成長培地25mL中のHEK293及びCHO-S細胞株において一時的に発現させた。各ポリHisタグタンパク質を、Ni-excel樹脂を用いて精製した。結果を図1A及び図1Bに示す。
scFv CD3結合ドメインの生成
ヒトCD3ε鎖標準配列は、Uniprot受託番号P07766である。ヒトCD3γ鎖標準配列は、Uniprot受託番号P09693である。ヒトCD3δ鎖標準配列は、Uniprot受託番号P043234である。CD3ε、CD3γ、またはCD3δに対する抗体は、親和性成熟などの既知の技術を介して生成される。マウス抗CD3抗体を出発物質として使用する場合、マウス特異的残基が本明細書に記載される抗原結合タンパク質の治療を受ける対象においてヒト抗マウス抗原(HAMA)応答を誘発し得る臨床の場では、マウスのヒト化が所望される。ヒト化は、マウス抗CD3抗体由来のCDR領域を適切なヒト生殖系列アクセプターフレームワーク上にグラフトし、任意選択でCDR及び/またはフレームワーク領域に対する他の修飾を含めることによって達成される。本明細書で提供されるように、抗体及び抗体断片の残基番号付けは、Kabat(Kabat E.A.et al,1991、Chothia et al,1987)に従う。
ヒトCD3ε鎖標準配列は、Uniprot受託番号P07766である。ヒトCD3γ鎖標準配列は、Uniprot受託番号P09693である。ヒトCD3δ鎖標準配列は、Uniprot受託番号P043234である。CD3ε、CD3γ、またはCD3δに対する抗体は、親和性成熟などの既知の技術を介して生成される。マウス抗CD3抗体を出発物質として使用する場合、マウス特異的残基が本明細書に記載される抗原結合タンパク質の治療を受ける対象においてヒト抗マウス抗原(HAMA)応答を誘発し得る臨床の場では、マウスのヒト化が所望される。ヒト化は、マウス抗CD3抗体由来のCDR領域を適切なヒト生殖系列アクセプターフレームワーク上にグラフトし、任意選択でCDR及び/またはフレームワーク領域に対する他の修飾を含めることによって達成される。本明細書で提供されるように、抗体及び抗体断片の残基番号付けは、Kabat(Kabat E.A.et al,1991、Chothia et al,1987)に従う。
したがって、ヒトまたはヒト化抗CD3抗体を使用して、ポリペプチド構築物のCD3結合ドメインのscFv配列を生成する。ヒトまたはヒト化VL及びVHドメインをコードするDNA配列が得られ、構築物のコドンは、任意選択で、ホモサピエンス由来の細胞における発現のために最適化する。プロテアーゼ切断部位は、VH及びVLドメインの間に含める。scFv中でVL及びVHドメインが現れる順序(すなわち、VL-VH配向またはVH-VL配向)ならびに「G4S」または「G4S」サブユニットの3つのコピー(G4S)3は、可変ドメインを接続してscFvドメインを創出する。抗CD3 scFvプラスミド構築物は、任意選択のFlag、His、または他の親和性タグを有することができ、これをHEK293または他の好適なヒトまたは哺乳動物細胞株にエレクトロポレーションし、タンパク質を発現させ、精製を行う。検証アッセイには、FACSによる結合分析、Proteonを用いた動態分析、及びCD-3または標的発現細胞の染色が含まれる。
発現させたポリペプチドをサイズ排除クロマトグラフィーに供したところ、凝集体、おそらくダイアボディを形成することが判明した。図2。
上記の実験により、以下の結果及び結論を得た。HEK293細胞中のPro1を除いて、4つのポリHis標識Prodentタンパク質の各々の発現が観察された。このため、ポリペプチドは発現可能であった。Ni-excel樹脂は、発現培地からポリペプチドを精製するのに有用であった。次いで、試料をPBSに対して透析し、ポリペプチド濃度をA280によって決定し、発現レベルを逆算した。精製されたポリHis標識タンパク質の各々は、SDS-PAGEゲル上に泳動させたときに予想される分子量を有した。透析したNi-excel溶出試料について分析SECを実施したが、Pro1及びPro2は凝集傾向が強かった。ELISAアッセイにおいて、制限されたαCD3scFvリンカーを有するPro4は、Pro3陽性対照タンパク質と同等にCD3εタンパク質に結合したため、リンカー制限により、条件的に活性なT細胞エンゲージャーは創出されなかった。
実施例2:第2世代PROプラットフォームの調製及び特性
第2世代PROプラットフォームポリペプチドは、VLまたはVHドメインを有するように設計し、このVLまたはVHドメインは、そのポリペプチド配列を変化させることによって不活性(すなわち、本質的にCD3結合がない)にした。例示的な第2世代Proポリペプチドを以下に示す。
プラットフォーム2(不活性化αCD3 scFv)
・Pro5-αEGFR G8 sdAb-I2C VH-Flag-I2CVLi-Flag-
I2CVHi-Flag-I2CVL-αEGFR D12 sdAb-His6
・Pro6-αEGFR G8 sdAb-I2C VH-Flag-I2 CVLi-His6
・Pro7-I2CVHi-Flag-I2CVL-αEGFR D12 sdAb-His6
・Pro8-αEGFR G8 sdAb-I2C VH-Flag-I2CVL-His6
第2世代PROプラットフォームポリペプチドは、VLまたはVHドメインを有するように設計し、このVLまたはVHドメインは、そのポリペプチド配列を変化させることによって不活性(すなわち、本質的にCD3結合がない)にした。例示的な第2世代Proポリペプチドを以下に示す。
プラットフォーム2(不活性化αCD3 scFv)
・Pro5-αEGFR G8 sdAb-I2C VH-Flag-I2CVLi-Flag-
I2CVHi-Flag-I2CVL-αEGFR D12 sdAb-His6
・Pro6-αEGFR G8 sdAb-I2C VH-Flag-I2 CVLi-His6
・Pro7-I2CVHi-Flag-I2CVL-αEGFR D12 sdAb-His6
・Pro8-αEGFR G8 sdAb-I2C VH-Flag-I2CVL-His6
Pro5の構造を図3に示す。Pro5は、未切断ポリペプチドがEGFRに良好に結合し、CD3に結合せず、かつT細胞依存性細胞傷害(TDCC)アッセイにおいて活性ではないと予想された。切断後、活性な抗CD-3 scFvの半分の両方がEGFRへの結合を介して癌細胞に繋留されることが予想された。2つの活性scFvドメインが相互作用して、TDCCアッセイにおいて活性を示す構築物と共に活性CD-3結合scFvを形成する。
図4には、二官能性パートナーであるPro6及びPro7の構造が示されている。本明細書に記載される実験は、抗CD3 scFv中のVHまたはVLのCDR2へのモデルプロテアーゼ切断部位(EK切断部位)の挿入により、CD3結合及び活性が無効になることを示した。切断されていない分子はEGFRに結合し、CD3に結合せず、かつTDCCアッセイにおいて活性ではないと予想された。切断後、Pro6及びPro7は、無傷のVH及びVLが両方ともEGFRを介して癌細胞に繋留されるため、活性分子を産生することになる。
不活性VHを有する抗CD3e scFvを産生させるために、Pro21(N30S、K31G、Y32S、A49G、Y55A、N57S、Y61A、D64A、N97K、N100K、S110A、Y111F)において以下の突然変異を作製した。Pro29(Y32S、Y61A、D64A、S110A、Y111F);Pro30(Y32S、Y61A、S110T、Y111F);Pro31(N30S、K31G、Y55A、N57S、Y61E、D64A、F104A、Y108A);Pro32(N30S、K31G、Y32H、Y55A、N57S、N103A、F104N)である。突然変異をVHのCDR領域に配置した:CDR1中-N30S、K31G、Y32S、Y32H;CDR2中-A49G、Y55A、N57S、Y61A、D64A、Y55A、N57S、Y61E;CDR3中-N97K、N100K、N103A、F104N、F104A、Y108A、S110A、S110T、Y111F。突然変異N30S、K31G、Y32S、Y32H、A49G、Y55A、N57S、Y61A、D64A、Y55A、N57S、Y61Eは、ヒト生殖系列配列中の残基の出現、及び複合体中のCD3に結合するときの界面上のそれらの可能性のある位置に基づいて選択した。CDR3領域中の突然変異N103A、F104N、F104A、Y108Aを選んで、可能性のあるVH-VL界面から離れ、CD3e相互作用との可能性のある界面上のCDR3の表面露出部分上にあるようにした。突然変異S110A、S110T、Y111Fを選んで、可能性のあるVH-VL界面を軽度に不安定化させ、領域のわずかな再構築を引き起こした。
発現時に、Pro29~32は、DSFによって測定して、Tm53~55℃で安定なタンパク質を産生した。Pro21はうまく発現しなかった。
不活性VLを有する抗CD3e scFvを産生させるために、Pro20(N32H、K54S、F55N、L56K、A57H、P58S、G59W、W94G、N96R)において以下の突然変異を作製した。突然変異をVLのCDR領域に配置した:CDR1中-N32H;CDR2中-K54S、F55N、L56K、A57H、P58S、G59W;CDR3中-W94G、N96R。突然変異N32H、K54S、F55N、L56K、A57H、P58S、G59Wを、ヒト生殖系列配列中の残基の出現、及び複合体中のCD3の結合に好ましくない影響を及ぼす界面上のそれらの可能性のある位置に基づいて選択した。CDR3領域の突然変異W94G、N96Rを選んで、可能性のあるVH-VL界面から離れたCDR3の表面露出部分上にあるようにした。
発現時に、Pro20は安定したタンパク質を産生した。
Pro8は陽性対照である。Pro8を使用して、scFvリンカー中のモデルプロテアーゼ切断部位(EK切断部位)の挿入がscFvの折り畳み及びCD3結合を妨害しないことを確認した。図5。Pro8の切断されていない分子は、EGFRに結合し、CD3に結合し、かつTDCCアッセイにおいて活性であるはずである。切断後、Pro8は、EGFRへの結合を介して細胞表面に結合している切断された分子の各半分の協働的な影響がないことによってVHとVLとが分離するため、CD3結合を失うはずである。
4種類の結合/活性アッセイをポリペプチドに対して行った。例示的なアッセイを図9に示す。
モデルプロテアーゼ、エンテロキナーゼを利用して、活性及び不活性VHドメイン及びVLドメインの間のプロテアーゼ切断部位で本発明の構築物を切断した。
結果
図6は、本発明の未精製ポリペプチド及び種々の対照のSDS-PAGEを示す。PAGEによって示されるように、ポリペプチドは十分に発現される。Pro5~8のサイズ排除クロマトグラフィーにより、凝集の欠如が示され、これらのPro構造がモノマー種を形成する傾向があることを確認する。図7。ポリペプチドをNi-excelクロマトグラフィーによって精製すると、各ポリペプチドは、SDS-PAGE上で本質的に単一のバンドをもたらした。図8の表は、タンパク質の発現及び精製の結果を示す。
図6は、本発明の未精製ポリペプチド及び種々の対照のSDS-PAGEを示す。PAGEによって示されるように、ポリペプチドは十分に発現される。Pro5~8のサイズ排除クロマトグラフィーにより、凝集の欠如が示され、これらのPro構造がモノマー種を形成する傾向があることを確認する。図7。ポリペプチドをNi-excelクロマトグラフィーによって精製すると、各ポリペプチドは、SDS-PAGE上で本質的に単一のバンドをもたらした。図8の表は、タンパク質の発現及び精製の結果を示す。
EGFR-ELISAアッセイにより、プラットフォーム2のポリペプチドが、ELISAアッセイ(図10A)においてEGFRに、また細胞上(図10B)でEGFRに結合できることが示された。プラットフォーム2の不活性(すなわち、未切断)ポリペプチドは、Jurkat細胞上のCD3-ELISA及びCD3-FACSによって確認されるように、CD3に結合しない。図11A及び図11B。
Pro6及びPro7は、プロテアーゼ切断によって活性化され、Pro6の不活性VLi及びPro7の不活性VHiを構築物中のそれらの対応するVH及びVLパートナーから分離することが示された。切断されていない分子はEGFRに結合し、CD3に結合せず、かつTDCCアッセイにおいて活性ではなかった。切断後、Pro6とPro7との混合物は、無傷のVH及びVLが両方ともEGFRとの結合を介して癌細胞に繋留されるため、活性抗CD3ドメインを産生した。図12。
エンテロキナーゼ(EK)はSDS-PAGEによって示されるようにPro5~8を切断することが示された。図13.Pro6及びPro7は、ELISAによって、EK切断後にCD3に協働的に結合することが示された。図14。図14B及び図14Cは、それぞれ、個々のPro6及びPRO7のCD3への最小の結合を示す。アッセイと共に加えると、Pro6及びPro7は、EK切断後に活性CD3結合ドメインの形成時にCD3に協働的に結合した(図14D)。このシナリオは、図14Eに概略的に示されている。Pro6及びPro7はまた、サンドイッチFACSによって、EK切断後にCD3に協働的に結合することが示された。したがって、図15B及び図15Cは、個々のPro構築物がCD3に結合しないことを示しているが、これらが組み合わされてEGFRを発現しているOvCar8細胞の表面上に活性CD3結合ドメインを形成する場合、これらは協働してCD3に結合することができる(図15D)。
全長構築物Pro5のCD3結合は、EKによる構築物のタンパク質分解的切断後に活性化される。図16。
Pro8は、単一の標的結合ドメイン(抗EGFR)を有する陽性対照モデルである。このため、この構築物がプロテアーゼ切断部位で切断されるとき、活性CD3結合ドメインが形成されないため、CD3に結合する能力が失われる。標的結合ドメインに繋留されていないVL部分は、活性なCD3結合ドメインを生成するために、VHとVLとの間の協働的な相互作用を生むのに十分に有効な様式で細胞に結合しない。切断の前に、Pro8は唯一のEGFR結合ドメインを介してEGFRに結合し、活性CD3結合ドメインを介してCD3に結合し、その結果、TDCCアッセイにおいて活性である。切断後、切断された構築物は、scFv成分間の弱い相互作用に起因してCD3に結合する能力を失う。図17。この結果を図18A及び図18Bに示す。
Pro6、Pro7、及びPro8のTDCCアッセイを図19(A~D)に示す。図19A及び図19Bにおいて、Pro6及びPro7単独についてのTDCCアッセイの結果が示される。EK切断後にこれらの単一構築物によって誘発されたT細胞媒介性細胞傷害性は本質的に存在しない。著しく対照的に、Pro6及びPro7が組み合わされて切断されると、図19Cに示されるように、顕著なT細胞の細胞傷害性が生じる。対照的に、Pro8がEKによって切断されると、細胞傷害性は減少する(図19D)。
実施例3:複数の標的結合ドメインに対する結合依存性の評価
CD3に結合する構築物の能力に対する2つ以上の標的結合ドメインの重要性を評価するために実験を設計した。Pro25~27は、EGFR標的結合ドメインなしで設計され、これらのドメインは緑色蛍光タンパク質(GFP)結合ドメインによって置換されている。図20。抗GFP結合ドメインを使用する動機の一部は、GFPがOvCar8細胞の表面上に発現しないことであった。抗GFP含有PRO構築物をPro6及びPro7と組み合わせ、EKを用いてプロテアーゼ切断に供した。図21C(Pro6+Pro26)、図21D(Pro6+Pro27)、図21E(図7+25)、及び図21F(Pro9+25)に示されるように、EK切断後、これらの構築物によるCD3の結合は本質的に存在しない。このため、切断された構築物が結合して活性CD3結合ドメインを形成するためには、各Pro成分が少なくとも1つの標的結合ドメインを含むことが必要である。
CD3に結合する構築物の能力に対する2つ以上の標的結合ドメインの重要性を評価するために実験を設計した。Pro25~27は、EGFR標的結合ドメインなしで設計され、これらのドメインは緑色蛍光タンパク質(GFP)結合ドメインによって置換されている。図20。抗GFP結合ドメインを使用する動機の一部は、GFPがOvCar8細胞の表面上に発現しないことであった。抗GFP含有PRO構築物をPro6及びPro7と組み合わせ、EKを用いてプロテアーゼ切断に供した。図21C(Pro6+Pro26)、図21D(Pro6+Pro27)、図21E(図7+25)、及び図21F(Pro9+25)に示されるように、EK切断後、これらの構築物によるCD3の結合は本質的に存在しない。このため、切断された構築物が結合して活性CD3結合ドメインを形成するためには、各Pro成分が少なくとも1つの標的結合ドメインを含むことが必要である。
実施例4:代替プロテアーゼ及び切断部位の評価
上で考察した現象がEK及びそのコンセンサス切断部位のみに依存しないことを確認するために、Pro構築物を、マトリプターゼを含む代替プロテアーゼのためのプロテアーゼ切断部位を用いて設計した。Pro8 MS及びPro8MLは、それぞれ、14アミノ酸マトリプターゼ感受性リンカーと、24アミノ酸マトリプターゼ感受性リンカーとを含む。リンカーは、構築物のVHドメインとVLドメインとの間にある。前の実施例に記載した方法を使用して、Pro8、Pro8 MS、及びPro8 MLは全て、関連するリンカー特異的プロテアーゼによる切断の前後で同等の結合特性を有することが示された。このため、切断の前に、構築物の各々は、EGFRに結合し、CD3に結合し、かつTDCCアッセイにおいて活性である。切断後、CD3結合活性及びTDCCアッセイにおける活性は、弱いscFv相互作用に起因して失われる。この実験の結果を、サンドイッチELISAアッセイの結果を示す図23、FACSアッセイの結果を示す図24に示す。
上で考察した現象がEK及びそのコンセンサス切断部位のみに依存しないことを確認するために、Pro構築物を、マトリプターゼを含む代替プロテアーゼのためのプロテアーゼ切断部位を用いて設計した。Pro8 MS及びPro8MLは、それぞれ、14アミノ酸マトリプターゼ感受性リンカーと、24アミノ酸マトリプターゼ感受性リンカーとを含む。リンカーは、構築物のVHドメインとVLドメインとの間にある。前の実施例に記載した方法を使用して、Pro8、Pro8 MS、及びPro8 MLは全て、関連するリンカー特異的プロテアーゼによる切断の前後で同等の結合特性を有することが示された。このため、切断の前に、構築物の各々は、EGFRに結合し、CD3に結合し、かつTDCCアッセイにおいて活性である。切断後、CD3結合活性及びTDCCアッセイにおける活性は、弱いscFv相互作用に起因して失われる。この実験の結果を、サンドイッチELISAアッセイの結果を示す図23、FACSアッセイの結果を示す図24に示す。
上で考察した結果により、本発明の構築物が真核生物のプラットフォームにおいて良好に発現されることが示される。α-CD3 scFv(VHまたはVL)のCDR(例えば、CDR2)への例示的なプロテアーゼ(例えば、EK)切断部位(Flag)の挿入により、α-CD3 scFvは効率的に不活性化される。プロテアーゼ切断部位での切断により、機能的CD3結合部位の形成が生じる。例示的なPro対(Pro6及びPro7)において、CD3結合部位は、Pro6及びPro7が近接している場合にのみ形成される。これらの結果は、標的抗原をコーティングしたELISAプレート及び標的抗原を発現している癌細胞を使用して得た(ELISA、FACS、及びTDCCデータに基づく)。
実施例5:結合に対するPro配向の関連性の検討
Proの配向(N-末端からC-末端へのドメインの順序)がProの結合能に深く関連するかどうかを、追加のProモチーフを利用して検討した(図25)。この図において、Pro10はPro6の逆位類似体であり、Pro9はPro7の逆位類似体である。Pro8、Pro11、及びPro15(OKT3)は、完全に活性なα-CD3 scFvである。図25は、不完全であり、EGFRに結合するがCD3に結合しない、Pro6、Pro7、Pro9、Pro10、Pro12、及びPro14の組み合わせを示す表である。不完全なCD3対のCD3結合の欠如は、サンドイッチELISAによって示された(図26)。
Proの配向(N-末端からC-末端へのドメインの順序)がProの結合能に深く関連するかどうかを、追加のProモチーフを利用して検討した(図25)。この図において、Pro10はPro6の逆位類似体であり、Pro9はPro7の逆位類似体である。Pro8、Pro11、及びPro15(OKT3)は、完全に活性なα-CD3 scFvである。図25は、不完全であり、EGFRに結合するがCD3に結合しない、Pro6、Pro7、Pro9、Pro10、Pro12、及びPro14の組み合わせを示す表である。不完全なCD3対のCD3結合の欠如は、サンドイッチELISAによって示された(図26)。
Pro6とPro9とが組み合わされてプロテアーゼ切断に供されると、それらは機能的CD3結合ドメインを形成する(図27)。Pro6+Pro9は、Pro6+Pro7と比較して同等の結合特性を示す(図28、29)。
Pro構築物の結合及び活性における単一特異的ドメイン対二重標的化ドメインの関連性も検討した。Pro9及びPro14は、各々同じEGFR結合ドメインを有し、これらを組み合わせて切断した(図30)。図31Aは、非切断型及びEK切断型Pro9+Pro14のFACSデータを示し、図31Bは、Pro6+Pro7の同様のデータを示す。
各Proが異なるEGFR結合ドメインを有するPro構築物対も調製し、試験した。図32Aは、EGFR及びCD3結合ドメインを有するPro対を提示する表を提供する。その対の各メンバーが異なるEGFR結合ドメインを示す第1のPro対のセットも調製し、切断した。この対のメンバーは、異なる結合ドメインを介して同じEGFR分子への結合(「シス」結合)を受け、異なる結合ドメインを介して異なるEGFR分子への結合(「トランス」結合)を受けると仮定される(図32B)。対の各メンバー上で同じEGFR結合ドメインを示す第2のPro構築物のセットを組み立てた。このシナリオでは、EGFR部位上の標的結合部位がその対の一方のメンバーのEGFR結合ドメインによって占有されるため、対のメンバーは異なるEGFR分子に結合しなければならない(「トランス」結合)。図32C。これらの対についてのサンドイッチELISAは、Pro6+Pro7(図33A)、Pro9+Pro10(図33B)、Pro12+Pro14(図33C)、Pro7+Pro10(図33D)、及びPro6+Pro9(図33E)でシス及びトランス両方の結合を示した。対照的に、トランスのみの結合は、Pro6+Pro12(図34A)、Pro7+Pro14(図34B)、Pro9+Pro14(図34C)、及びPro10+Pro12(図34D)で示された。興味深いことに、シス及びトランス結合するPro対の切断後の活性と、トランス結合のみのものとは類似している。TDCCアッセイの結果を図35に示す。図35A(シス+トランス)、図35B(トランスのみ)。図36に示すように、陽性対照Pro構築物は、おそらく、CD3結合ドメインの2つの成分を近接させるために機能的なEGFR結合部位を有する対の各メンバーなくして機能的なCD3結合部位を形成することができないため、EK切断後に活性を失う。
実施例6:プロテアーゼを発現している細胞による切断
この実施例では、EKを発現しているベクターをルシフェラーゼ+OVCAR8細胞にトランスフェクトし、タンパク質を安定に発現しているクローンを選択した。100個のクローンを選択し、FACS(α-His6-FITC)により陽性を確認した。高、中、及び低発現細胞に対応する細胞試料を保存した。これらの細胞試料を、サンドイッチFACS、サンドイッチMSD、及びTDCCを使用して、選定した本発明のポリペプチド構築物に対して試験した。
この実施例では、EKを発現しているベクターをルシフェラーゼ+OVCAR8細胞にトランスフェクトし、タンパク質を安定に発現しているクローンを選択した。100個のクローンを選択し、FACS(α-His6-FITC)により陽性を確認した。高、中、及び低発現細胞に対応する細胞試料を保存した。これらの細胞試料を、サンドイッチFACS、サンドイッチMSD、及びTDCCを使用して、選定した本発明のポリペプチド構築物に対して試験した。
図37は、OvCar8-lux細胞におけるEK-His6の安定した発現を示す。高、中、及び低発現コロニーを識別した。図38。本発明の活性化されていないPro構築物を細胞と接触させ、これはPro構築物に用量依存的活性化を及ぼすことが示された(図39)。MSD(図39A)及びFACS(図39B)の結果は同等である。EK発現のFACSランキングは、Pro切断の予測因子である。
EKを過剰発現するOvCAR8細胞を使用するTDCCは、未切断Pro構築物の存在下でT細胞細胞傷害性を活性化することが示された。図40。EKを過剰発現しない野生型OVCAR8細胞は、顕著にPro構築物を感知できるほどには活性化せず、未切断タンパク質を使用して最小限のT細胞媒介性細胞傷害性を生んだ(図40A)。対照的に、EKを過剰発現するOvCAR8細胞は、未切断タンパク質を使用してT細胞媒介細胞傷害性を示した(図40B)。
実施例7:α-CD3 VH及びVLの不活性化
図41は、α-CD3 scFvの相同性モデルを示す。親VHポリペプチドの配列及び最も相同な生殖系列配列に対するその一般的な整列を図42Aに示す。CD3への結合に対してこのポリペプチドを不活性化するように設計された例示的な変異体を図42Bに示す。同様に、図43は、CD3の親VLポリペプチドの配列及び最も相同な生殖系列配列に対するその一般的な整列を示し、ポリペプチドをそのCD3への結合に関して不活性にするように設計された例示的な変異体配列を提供する。
図41は、α-CD3 scFvの相同性モデルを示す。親VHポリペプチドの配列及び最も相同な生殖系列配列に対するその一般的な整列を図42Aに示す。CD3への結合に対してこのポリペプチドを不活性化するように設計された例示的な変異体を図42Bに示す。同様に、図43は、CD3の親VLポリペプチドの配列及び最も相同な生殖系列配列に対するその一般的な整列を示し、ポリペプチドをそのCD3への結合に関して不活性にするように設計された例示的な変異体配列を提供する。
図44Aは、EGFR結合ドメイン、一方が不活性化されるVLドメイン及びVHドメイン(すなわち、VLi、VHi)、半減期延長ドメイン(α-HAS)、ならびにVHドメインとVLドメインとの間のプロテアーゼ切断性Flag部位を含む、本発明のある特定のポリペプチドPro構築物の模式図を提供する。図44Bは、これらの例示的なPro種の結合活性を示す表である。Pro22は、不活性化されたVHドメインもVLドメインも有しない陽性対照である。このProは、活性化の前にEGFRとCD3との両方に結合する。表に示されるように、他のPro種のいずれも、プロテアーゼ活性化の前にCD3に結合しない。
図45はPro23(図45A)及びPro24(図45B)の模式図を示し、それぞれが2つ以上のFlag EK切断部位を含む。Pro23はまた、トロンビン切断部位を含むことで、血漿中で切断されやすくなる。Pro23の各「アーム」は、プロテアーゼ切断性Flag部位によって分離された活性及び不活性CD3結合ドメインを含む。各「アーム」はまた、半減期延長ドメイン、例えば、α-HSAを含む。Pro24から明らかなように、トロンビン切断性部位は、別の切断性部位、例えば、EK切断性部位によって代置することができる。図46は、Pro23及びPro24のプロテアーゼ切断に関するSDS-PAGEデータを提供する。Pro23及びPro24の活性に関するデータを図47に提供する。図47Aは、Pro23のTDCC活性がトロンビンではなくEK切断によって活性化され、その不活性パートナーからの活性CD3結合ドメインの分離がポリペプチド結合CD3に対する条件であることを示している。同様に、Pro24はEK切断によって活性化される(図47B)。
実施例8:EK以外のプロテアーゼを使用した切断による活性化
Proポリペプチドで観察される切断/結合現象がEK切断に限定されないことを確認するために、非EKプロテアーゼ切断部位を有する追加のPro種を設計し、試験した。試験化合物は、プロテアーゼ切断部位でポリペプチドの切断時にシグナルを生じる蛍光エネルギー移動対を含むように操作した。図48~52は、本研究のデータを示す。プロテアーゼMMP9は、腫瘍細胞において過剰発現されることが知られている。ペプチドは、MMP9切断部位を含むように操作した。ペプチドGPSGPAGLKGAPG及びGPPGPAGMKGLPGは、血清中で安定であり、組換えMMP9によって切断され、組換えマトリプターゼST14、TACE(ADAM17)精製カテプシンB及びD(図48)によって切断されない。
Proポリペプチドで観察される切断/結合現象がEK切断に限定されないことを確認するために、非EKプロテアーゼ切断部位を有する追加のPro種を設計し、試験した。試験化合物は、プロテアーゼ切断部位でポリペプチドの切断時にシグナルを生じる蛍光エネルギー移動対を含むように操作した。図48~52は、本研究のデータを示す。プロテアーゼMMP9は、腫瘍細胞において過剰発現されることが知られている。ペプチドは、MMP9切断部位を含むように操作した。ペプチドGPSGPAGLKGAPG及びGPPGPAGMKGLPGは、血清中で安定であり、組換えMMP9によって切断され、組換えマトリプターゼST14、TACE(ADAM17)精製カテプシンB及びD(図48)によって切断されない。
プロテアーゼであるメプリンの切断部位を含む追加のペプチドも設計し、試験した。図49。ペプチドGYVADAPK及びKKLADEPEは、血清中で安定であり、組換えMep1A及びMep1Bによって切断され、組換えMMP9、TACE(ADAM17)、カテプシンBによって切断されない。ペプチドGGSRPAHLRDSGKはヒト血清中で安定であり、マウス及びカニクイザル血清中ではあまり安定ではなく、組換えMep1Aによって切断され、組換えMMP9によって部分的に切断されるが、ADAM17、カテプシンB、マトリプターゼST14によって切断されない。
マトリプターゼ切断に感受性のペプチドも設計し、試験した。図50に示すように、いずれのペプチドも血清中で安定ではない。ペプチドSFTQARVVGG及びLSGRSDNHは、組換えマトリプターゼST14によって切断されるが、MMP9、TACE(ADAM17)、カテプシンBによって切断されない。
血液プロテアーゼ(トロンビン、ニュートロフィルエラスターゼ、及びフリン)による切断に感受性のポリペプチドを設計し、試験した(図51)。トロンビン-1ペプチド基質は、トロンビン(ヒト血漿から精製)によって非常に効果的に(低いKm及び高いVmaxで)切断される。エラスターゼ-1ペプチド基質は、組換え好中球エラスターゼによって非常に効果的に切断される。図52は、血清中の血液プロテアーゼペプチド基質の切断に関するデータを示す。ペプチドであるトロンビン-1、トロンビン-2、及びフリン-2の切断は、ヒト血清中で最も効率的であった。好中球エラスターゼ基質の切断は、血清中に活性プロテアーゼを保有する好中球が存在しないために観察されなかった。
本発明の例示的な実施形態を本明細書に示し説明してきたが、そのような実施形態が例示としてのみ提供されることは、当業者には明らかであろう。当業者には、本発明から逸脱することなく、数多くの変形、変更、及び置換が想起されるであろう。本明細書に記載される本発明の実施形態に対する種々の代替物が、本発明の実施において採用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲内の方法及び構造、ならびにそれらの均等物がそれによって網羅されることが意図される。
本発明の実施形態をさらに記載する:
[項1]
CD-3抗原に対する単一鎖scFvポリペプチドであって、前記scFvポリペプチドが、第1のVHドメインと第1のVLドメインとの間の第1のプロテアーゼ切断部位を含む第1のscFvリンカー部分を通じて接合される、前記第1のVHドメイン及び前記第1のVLドメインを含む、第1のscFvドメインであって、前記第1のVHドメイン及び前記第1のVLドメインが、相互作用して、第1のVH/VL対を形成し、前記第1のVHドメイン及び前記第1のVLドメインのうちの一方が、不活性であり、そのため、前記第1のscFvドメインが、前記CD-3抗原に特異的に結合せず、前記第1のscFvポリペプチドが、第2のプロテアーゼ切断部位を任意選択で含む第1のドメインリンカー部分を通じて接合される、第1のscFvドメインと、
第2のVHドメインと第2のVLドメインとの間の第3のプロテアーゼ切断部位を含む第2のscFvリンカー部分を介して接合される、前記第2のVHドメイン及び前記第2のVLドメインを含む第2のscFvドメインであって、前記第2のVHドメイン及び前記第2のVLドメインが、相互作用して、第2のVH/VL対を形成し、前記第2のVHドメイン及び前記第2のVLのうちの一方が、不活性であり、そのため、前記第2のscFvドメインが、前記CD-3抗原に特異的に結合しない、第2のscFvドメインと、を含み、
前記第1のscFvドメインが、第2のドメインリンカーを通じて、第1の標的抗原結合ドメインに接合され、前記第2のドメインリンカーが、前記第1のVHドメイン及び前記第1のVLドメインから選択されるメンバーを、前記第1の標的抗原結合ドメインに接合し、
前記第2のscFvドメインが、第3のドメインリンカーを通じて、第2の標的抗原結合ドメインに接合され、前記第3のドメインリンカーが、前記第2のVHドメイン及び前記第2のVLドメインから選択されるメンバーを、前記第2の標的抗原結合ドメインに接合する、単一鎖scFvポリペプチド。
[項2]
CD-3抗原に対する単一鎖scFvポリペプチドであって、前記scFvポリペプチドが、第1のVHドメインと第1のVLドメインとの間の第1のプロテアーゼ切断部位を含む第1のscFvリンカー部分を通じて接合される、前記第1のVHドメイン及び前記第1のVLドメインを含む、第1のscFvドメインであって、前記第1のVHドメイン及び前記第1のVLドメインが、相互作用して、第1のVH/VL対を形成し、前記第1のVHドメイン及び前記第1のVLドメインのうちの一方が、不活性な第1のVHドメインまたは不活性な第1のVLドメインであり、そのため、前記第1のscFvドメインが、前記CD-3抗原に特異的に結合せず、前記第1のscFvポリペプチドが、第2のプロテアーゼ切断部位を任意選択で含む第1のドメインリンカー部分を通じて接合される、第1のscFvドメインと、
第2のVHドメインと第2のVLドメインとの間の第3のプロテアーゼ切断部位を含む第2のscFvリンカー部分を介して接合される、前記第2のVHドメイン及び前記第2のVLドメインを含む第2のscFvドメインであって、前記第2のVHドメイン及び前記第2のVLが、相互作用して、第2のVH/VL対を形成し、前記第2のVHドメイン及び前記第2のVLドメインのうちの一方が、不活性な第2のVHドメインまたは不活性な第2のVLドメインであり、そのため、前記第2のscFvドメインが、前記CD-3抗原に特異的に結合しない、第2のscFvドメインと、を含み、
前記第1のscFvドメインが、第2のドメインリンカーを通じて、第1の標的抗原結合ドメインに接合され、前記第2のドメインリンカーが、前記第1のVHドメイン及び前記第1のVLドメインから選択されるメンバーを、前記第1の標的抗原結合ドメインに接合し、
前記第2のscFvドメインが、第3のドメインリンカーを通じて、第2の標的抗原結合ドメインに接合され、前記第3のドメインリンカーが、前記第2のVHドメイン及び前記第2のVLドメインから選択されるメンバーを、前記第2の標的抗原結合ドメインに接合し、
前記単一鎖scFvを、前記第1のscFvリンカー部分の前記第1のプロテアーゼ切断部位を切断することができる第1のプロテアーゼと接触させると、前記不活性な第1のVHドメインまたは前記不活性な第1のVLドメインが、前記単一鎖scFvポリペプチドから分離され、
第2のプロテアーゼが、前記第2のscFvリンカー部分の前記第2のプロテアーゼ切断部位を切断することができ、前記不活性な第2のVHドメインまたは前記不活性な第2のVLドメインが、前記単一鎖scFvポリペプチドから分離され、
それにより、前記CD-3抗原に結合することができる活性な単一鎖scFvを形成する、単一鎖scFvポリペプチド。
[項3]
CD-3抗原に対する単一鎖scFvポリペプチドであって、前記scFvポリペプチドが、第1のVHドメインと第1のVLドメインとの間の第1のプロテアーゼ切断部位を含む第1のscFvリンカー部分を通じて接合される、前記第1のVHドメイン及び前記第1のVLドメインを含む、第1のscFvドメインであって、前記第1のVHドメイン及び前記第1のVLドメインが、相互作用して、第1のVH/VL対を形成し、前記第1のVHドメイン及び前記第1のVLドメインのうちの一方が、不活性であり、そのため、前記第1のscFvドメインが、前記CD-3抗原に特異的に結合せず、前記第1のscFvポリペプチドが、第2のプロテアーゼ切断部位を任意選択で含む第1のドメインリンカー部分を通じて接合される、第1のscFvドメインと、
第1の標的抗原結合ドメインであって、前記第1のドメインリンカーが、前記第1のVHドメイン及び前記第1のVLドメインから選択されるメンバーを、前記第1の標的抗原結合ドメインに接合する、第1の標的抗原結合ドメインと、を含む、単一鎖scFvポリペプチド。
[項4]
前記第1のVLドメイン、前記第1のVHドメイン、前記第1の標的抗原結合ドメイン、及びこれらの組み合わせから選択されるメンバーに接合される、少なくとも1つの半減期延長ドメインをさらに含む、上記項1~3のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項5]
前記第1のVLドメイン、前記第1のVHドメイン、前記第2のVLドメイン、前記第2のVHドメイン、前記第1の標的抗原結合ドメイン、前記第2の標的抗原結合ドメイン、及びこれらの組み合わせから選択されるメンバーに接合される、少なくとも1つの半減期延長ドメインをさらに含む、上記項1~2のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項6]
前記少なくとも1つの半減期延長ドメインが、前記不活性なVHドメイン及び前記不活性なVLドメイン以外のドメインに結合されている、上記項5に記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項7]
前記少なくとも1つの半減期延長ドメインが、血清タンパク質に結合することができる部分を含む、上記項5~6のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項8]
前記血清タンパク質が、血清アルブミンである、上記項7に記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項9]
前記少なくとも1つの半減期延長ドメインが、scFv、可変重ドメイン(VH)、可変軽ドメイン(VL)、ナノボディ、ペプチド、リガンド、または小分子を含む、上記項5~8のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項10]
少なくとも1つの半減期延長ドメインが、プロテアーゼ切断の前に、前記単一鎖scFvのN末端、C末端、及びこれらの組み合わせから選択されるメンバーに位置する、上記項5~9のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項11]
少なくとも1つの半減期延長ドメインが、プロテアーゼ切断の前に、前記scFvポリペプチドのC末端またはN末端にない、上記項5~9のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項12]
前記半減期延長ドメインが、その中に切断可能な部分を含むリンカーを通じて、前記第1のVLドメイン、前記第1のVHドメイン、前記第2のVLドメイン、前記第2のVHドメイン、前記第1の標的抗原結合ドメイン、前記第2の標的抗原結合ドメイン、及びこれらの組み合わせから選択されるメンバーに結合される、上記項5~11のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項13]
前記CD-3抗原が、1つ以上のCD3抗原から選択される、上記項1~12のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項14]
前記標的抗原結合ドメインが、異常細胞によって発現される抗原に結合する、上記項1~13のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項15]
前記異常細胞が、悪性細胞である、上記項14に記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項16]
前記標的抗原結合ドメインが、細胞表面受容体に結合する、上記項1~15のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項17]
前記標的抗原結合ドメインが、scFv、VHドメイン、VLドメイン、非Igドメイン、または前記標的抗原に特異的に結合するリガンドを含む、上記項1~16のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項18]
少なくとも1つの標的抗原結合ドメインが、腫瘍抗原に特異的に結合する、上記項1~17のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項19]
前記細胞表面受容体が、EpCAM、EGFR、HER-2、HER-3、cMet、CEA、FoIR、及びこれらの組み合わせから選択されるメンバーである、上記項16に記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項20]
前記第1のscFvリンカー及び前記第2のscFvリンカーが、同じ配列または異なる配列のポリペプチドリンカーである、上記項1~19のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項21]
前記第1のプロテアーゼ切断部位及び前記第2のプロテアーゼ切断部位が、同じプロテアーゼまたは異なるプロテアーゼに対する切断部位である、上記項1~20のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項22]
前記第1のプロテアーゼ切断部位及び前記第2のプロテアーゼ切断部位が、同じ配列または異なる配列である、上記項1~21のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項23]
前記第1のドメインリンカー及び前記第2のドメインリンカーが、同じ配列または異なる配列のポリペプチドリンカーである、上記項1~2及び4~22のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項24]
前記プロテアーゼ切断部位が、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、メタロプロテイナーゼ、ゼラチナーゼ、及びアスパラギンペプチドリアーゼのうちの少なくとも1つによって切断される、上記項1~23のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項25]
前記プロテアーゼ切断部位が、カテプシンB、カテプシンC、カテプシンD、カテプシンE、カテプシンK、カテプシンL、カリクレイン、hK1、hK10、hK15、プラスミン、コラゲナーゼ、IV型コラゲナーゼ、ストロメリシン、Xa因子、キモトリプシン様プロテアーゼ、トリプシン様プロテアーゼ、エラスターゼ様プロテアーゼ、スブチリシン様プロテアーゼ、アクチニダイン(actinidain)、ブロメライン、カルパイン、カスパーゼ、カスパーゼ-3、Mir1-CP、パパイン、HIV-1プロテアーゼ、HSVプロテアーゼ、CMVプロテアーゼ、キモシン、レニン、ペプシン、マトリプターゼ、レグマイン、プラスメプシン、ネペンテシン、メタロエキソペプチダーゼ、メタロエンドペプチダーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)、MMP1、MMP2、MMP3、MMP8、MMP9、MMP10、MMP11、MMP12、MMP13、MMP14、ADAM10、ADAM12、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子(uPA)、エンテロキナーゼ、前立腺特異抗原(PSA、hK3)、インターロイキン-1β変換酵素、トロンビン、FAP(FAP-α)、メプルン(meprn)、グランザイム、ジペプチジルペプチダーゼ、及びジペプチジルペプチダーゼIV(DPPIV/CD26)のうちの少なくとも1つによって切断される、上記項1~24のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項26]
前記プロテアーゼ切断ドメインが、腫瘍の部位で切断される、上記項1~25のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項27]
前記プロテアーゼ切断部位を切断する前記プロテアーゼが、前記腫瘍の微小環境内の細胞によって発現される、上記項1~26のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項28]
前記プロテアーゼ切断部位が、前記単一鎖scFvポリペプチドが投与される対象の血液中で切断される、上記項1~27のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項29]
前記scFvポリペプチドが、2つ以上のプロテアーゼ切断ドメインをさらに含む、上記項1~28のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項30]
前記プロテアーゼ切断ドメインが、前記半減期延長ドメインまたは前記CD-3結合ドメイン内にある、上記項5~29のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項31]
前記プロテアーゼ切断ドメインが、前記半減期延長ドメインまたは前記CD-3結合ドメイン内にない、上記項5~29のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項32]
1つ以上のCD-3結合ドメインが、ヒトCD-3に特異的な単一鎖可変フラグメント(scFv)に由来するポリペプチドを含む、上記項1~31のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項33]
前記CD-3結合ドメインが、CD3ε(イプシロン)、CD3δ(デルタ)、及びCD3γ(ガンマ)から選択されるメンバーに特異的なCD3結合ドメインである、上記項1~32のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項34]
1つ以上のCD3結合ドメインが、ムロモナブ-CD3(OKT3)、オテリキシズマブ(TRX4)、テプリズマブ(MGA031)、ビジリズマブ(Nuvion)、SP34、I2C、X35、VIT3、BMA030(BW264/56)、CLB-T3/3、CRIS7、YTH12.5、F111-409、CLB-T3.4.2、TR-66、WT32、SPv-T3b、11D8、XIII-141、XIII-46、XIII-87、12F6、T3/RW2-8C8、T3/RW2-4B6、OKT3D、M-T301、SMC2、F101.01、UCHT-1、及びWT-31からなる群から選択される相補性決定領域(CDR)を含む、上記項33に記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項35]
1つ以上のCD-3結合ドメインが、ヒト化されている、上記項1~34のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項36]
前記プロテアーゼ切断部位のプロテアーゼ切断に続いて、1つ以上の前記CD3結合ドメインが、CD3発現細胞上のCD3に対して1000nM以下のKD結合を有する、上記項33に記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項37]
前記プロテアーゼ切断部位のプロテアーゼ切断に続いて、1つ以上の活性化CD3結合ドメインが、CD3発現細胞上のCD3に対して100nM以下のKD結合を有する、上記項36に記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項38]
前記プロテアーゼ切断部位のプロテアーゼ切断に続いて、1つ以上の活性化CD3結合ドメインが、CD3発現細胞上のCD3に対して10nM以下のKD結合を有する、上記項37に記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項39]
1つ以上のCD-3結合ドメインが、カニクイザルCD3との交差反応性を有する、上記項1~38のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項40]
1つ以上のCD-3結合ドメインが、本明細書で提供されるアミノ酸配列を含むCD3結合ドメインである、上記項1~39のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項41]
前記標的抗原結合ドメインが、EGFR結合ドメインである、上記項1~40のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項42]
前記VLドメイン及び前記VHドメインが、3つのCDRを各々含む、上記項1~41のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項43]
前記不活性なVL及び前記不活性なVHから選択されるメンバーが、前記VL及びVHの親配列に対して突然変異した少なくとも1つのアミノ酸を含む少なくとも1つのCDRを含む、上記項1~42のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項44]
前記不活性なVL及び前記不活性なVHから選択されるメンバーが、前記VL及びVHの前記CDR2の親配列に対して突然変異した少なくとも1つのアミノ酸を含むCDR2ドメインを含む、上記項1~43のいずれかの単一鎖scFvポリペプチド。
[項45]
前記不活性なVL及び前記不活性なVHから選択されるメンバーが、前記第1のドメインリンカー及び前記第1のscFvリンカーから選択されるメンバーを、前記CDRに組み込むことによって、前記VL及びVHの前記CDRの親配列に対して突然変異した少なくとも1つのCDRを含む、上記項1~44のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項46]
上記項1~45のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
[項47]
上記項46に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
[項48]
上記項47に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
[項49]
薬学的組成物であって、
(i)上記項1~45のいずれか1項に記載の単一鎖scFvポリペプチド、
(ii)上記項46に記載のポリヌクレオチド、
(iii)上記項47に記載のベクター、
(iv)上記項48に記載の宿主細胞、及びその組み合わせ、ならびに
(v)薬学的に許容される担体、から選択されるメンバーを含む、薬学的組成物。
[項50]
上記項1~45のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチドを生成するためのプロセスであって、上記項1~45に記載の単一鎖scFvポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を、前記単一鎖scFvポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養することと、前記生成された単一鎖scFvポリペプチドを、前記培養物から回収及び精製することと、を含む、プロセス。
[項51]
増殖性疾患、腫瘍性疾患、炎症性疾患、免疫学的障害、自己免疫疾患、感染性疾患、ウイルス性疾患、アレルギー反応、寄生虫反応、移植片対宿主疾患、もしくは宿主対移植片疾患の治療または改善のための方法であって、そのような治療または改善を必要とする対象への、上記項1~45のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチドの投与を含む、方法。
[項52]
前記対象が、ヒトである、上記項52に記載の方法。
[項53]
プロドラッグ組成物であって、
i)第1のプロテアーゼ切断部位を含む第1のscFvリンカー部分を通じて接合される、第1のVHドメイン及び第1のVLドメインを含む、第1のscFvドメインを含む、CD3結合ドメインをコードする、第1のポリペプチド配列であって、前記第1のscFvドメインがCD3に特異的に結合しないようにする、第1のポリペプチド配列と、
ii)第2のプロテアーゼ切断部位を含む第2のscFvリンカー部分を通じて接合される、第2のVHドメイン及び第2のVLドメインを含む、第2のscFvドメインを含む、腫瘍抗原結合ドメインをコードする、第2のポリペプチド配列であって、前記第2のscFvドメインが腫瘍抗原に特異的に結合しないようにする、第2のポリペプチド配列と、
iii)任意選択で少なくとも1つの半減期延長ドメインと、を含む、プロドラッグ組成物。
[項54]
前記第1のポリペプチド配列及び前記第2のポリペプチド配列が、プロテアーゼ切断部位を任意選択で含む第1のドメインリンカー部分によって動作可能に連結されている、上記項54に記載のプロドラッグ組成物。
[項55]
プロドラッグ組成物であって、
i)第1のポリペプチド配列であって、a)第1のプロテアーゼ切断部位を含む第1のscFvリンカー部分を通じて接合される、第1のVHドメイン及び第1のVLドメインを含む、第1のscFvドメインを含む、第1のCD3結合ドメインであって、前記第1のscFvドメインが、CD3に特異的に結合しない、第1のCD3結合ドメイン、及びb)第1の腫瘍抗原結合ドメインを含む、第1のポリペプチド配列と、
ii)第2のポリペプチド配列であって、a)第2のプロテアーゼ切断部位を含む第2のscFvリンカー部分を通じて接合される、第2のVHドメイン及び第2のVLドメインを含む、第2のscFvドメインを含む、第2のCD3結合ドメインであって、前記第2のscFvドメインが、CD3に特異的に結合しない、第2のCD3結合ドメイン、及びb)第2の腫瘍抗原結合ドメインを含む、第2のポリペプチド配列と、
iii)任意選択で少なくとも1つの半減期延長ドメインと、を含み、
前記第1のVHドメイン及び前記第2のVLドメインが、CD3に特異的に結合する、ならびに/または前記第2のVHドメイン及び前記第1のVLドメインが、CD3に特異的に結合する、プロドラッグ組成物。
[項56]
前記第1の腫瘍抗原結合ドメイン及び前記第2の腫瘍抗原結合ドメインが、同じ腫瘍抗原に結合する、上記項56に記載のプロドラッグ組成物。
[項57]
前記第1の腫瘍抗原結合ドメイン及び前記第2の腫瘍抗原結合ドメインが、異なる腫瘍抗原タンパク質に結合する、上記項56に記載のプロドラッグ組成物。
[項58]
前記第1の腫瘍抗原結合ドメインが、第1の腫瘍細胞上に存在する第1の腫瘍抗原に結合し、前記第2の腫瘍抗原結合ドメインが、前記第1の腫瘍細胞上に存在する第2の腫瘍抗原に結合する、上記項56に記載のプロドラッグ組成物。
全ての引用文献は、本明細書にそれらの全体が参考として明示的に援用される。
[項1]
CD-3抗原に対する単一鎖scFvポリペプチドであって、前記scFvポリペプチドが、第1のVHドメインと第1のVLドメインとの間の第1のプロテアーゼ切断部位を含む第1のscFvリンカー部分を通じて接合される、前記第1のVHドメイン及び前記第1のVLドメインを含む、第1のscFvドメインであって、前記第1のVHドメイン及び前記第1のVLドメインが、相互作用して、第1のVH/VL対を形成し、前記第1のVHドメイン及び前記第1のVLドメインのうちの一方が、不活性であり、そのため、前記第1のscFvドメインが、前記CD-3抗原に特異的に結合せず、前記第1のscFvポリペプチドが、第2のプロテアーゼ切断部位を任意選択で含む第1のドメインリンカー部分を通じて接合される、第1のscFvドメインと、
第2のVHドメインと第2のVLドメインとの間の第3のプロテアーゼ切断部位を含む第2のscFvリンカー部分を介して接合される、前記第2のVHドメイン及び前記第2のVLドメインを含む第2のscFvドメインであって、前記第2のVHドメイン及び前記第2のVLドメインが、相互作用して、第2のVH/VL対を形成し、前記第2のVHドメイン及び前記第2のVLのうちの一方が、不活性であり、そのため、前記第2のscFvドメインが、前記CD-3抗原に特異的に結合しない、第2のscFvドメインと、を含み、
前記第1のscFvドメインが、第2のドメインリンカーを通じて、第1の標的抗原結合ドメインに接合され、前記第2のドメインリンカーが、前記第1のVHドメイン及び前記第1のVLドメインから選択されるメンバーを、前記第1の標的抗原結合ドメインに接合し、
前記第2のscFvドメインが、第3のドメインリンカーを通じて、第2の標的抗原結合ドメインに接合され、前記第3のドメインリンカーが、前記第2のVHドメイン及び前記第2のVLドメインから選択されるメンバーを、前記第2の標的抗原結合ドメインに接合する、単一鎖scFvポリペプチド。
[項2]
CD-3抗原に対する単一鎖scFvポリペプチドであって、前記scFvポリペプチドが、第1のVHドメインと第1のVLドメインとの間の第1のプロテアーゼ切断部位を含む第1のscFvリンカー部分を通じて接合される、前記第1のVHドメイン及び前記第1のVLドメインを含む、第1のscFvドメインであって、前記第1のVHドメイン及び前記第1のVLドメインが、相互作用して、第1のVH/VL対を形成し、前記第1のVHドメイン及び前記第1のVLドメインのうちの一方が、不活性な第1のVHドメインまたは不活性な第1のVLドメインであり、そのため、前記第1のscFvドメインが、前記CD-3抗原に特異的に結合せず、前記第1のscFvポリペプチドが、第2のプロテアーゼ切断部位を任意選択で含む第1のドメインリンカー部分を通じて接合される、第1のscFvドメインと、
第2のVHドメインと第2のVLドメインとの間の第3のプロテアーゼ切断部位を含む第2のscFvリンカー部分を介して接合される、前記第2のVHドメイン及び前記第2のVLドメインを含む第2のscFvドメインであって、前記第2のVHドメイン及び前記第2のVLが、相互作用して、第2のVH/VL対を形成し、前記第2のVHドメイン及び前記第2のVLドメインのうちの一方が、不活性な第2のVHドメインまたは不活性な第2のVLドメインであり、そのため、前記第2のscFvドメインが、前記CD-3抗原に特異的に結合しない、第2のscFvドメインと、を含み、
前記第1のscFvドメインが、第2のドメインリンカーを通じて、第1の標的抗原結合ドメインに接合され、前記第2のドメインリンカーが、前記第1のVHドメイン及び前記第1のVLドメインから選択されるメンバーを、前記第1の標的抗原結合ドメインに接合し、
前記第2のscFvドメインが、第3のドメインリンカーを通じて、第2の標的抗原結合ドメインに接合され、前記第3のドメインリンカーが、前記第2のVHドメイン及び前記第2のVLドメインから選択されるメンバーを、前記第2の標的抗原結合ドメインに接合し、
前記単一鎖scFvを、前記第1のscFvリンカー部分の前記第1のプロテアーゼ切断部位を切断することができる第1のプロテアーゼと接触させると、前記不活性な第1のVHドメインまたは前記不活性な第1のVLドメインが、前記単一鎖scFvポリペプチドから分離され、
第2のプロテアーゼが、前記第2のscFvリンカー部分の前記第2のプロテアーゼ切断部位を切断することができ、前記不活性な第2のVHドメインまたは前記不活性な第2のVLドメインが、前記単一鎖scFvポリペプチドから分離され、
それにより、前記CD-3抗原に結合することができる活性な単一鎖scFvを形成する、単一鎖scFvポリペプチド。
[項3]
CD-3抗原に対する単一鎖scFvポリペプチドであって、前記scFvポリペプチドが、第1のVHドメインと第1のVLドメインとの間の第1のプロテアーゼ切断部位を含む第1のscFvリンカー部分を通じて接合される、前記第1のVHドメイン及び前記第1のVLドメインを含む、第1のscFvドメインであって、前記第1のVHドメイン及び前記第1のVLドメインが、相互作用して、第1のVH/VL対を形成し、前記第1のVHドメイン及び前記第1のVLドメインのうちの一方が、不活性であり、そのため、前記第1のscFvドメインが、前記CD-3抗原に特異的に結合せず、前記第1のscFvポリペプチドが、第2のプロテアーゼ切断部位を任意選択で含む第1のドメインリンカー部分を通じて接合される、第1のscFvドメインと、
第1の標的抗原結合ドメインであって、前記第1のドメインリンカーが、前記第1のVHドメイン及び前記第1のVLドメインから選択されるメンバーを、前記第1の標的抗原結合ドメインに接合する、第1の標的抗原結合ドメインと、を含む、単一鎖scFvポリペプチド。
[項4]
前記第1のVLドメイン、前記第1のVHドメイン、前記第1の標的抗原結合ドメイン、及びこれらの組み合わせから選択されるメンバーに接合される、少なくとも1つの半減期延長ドメインをさらに含む、上記項1~3のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項5]
前記第1のVLドメイン、前記第1のVHドメイン、前記第2のVLドメイン、前記第2のVHドメイン、前記第1の標的抗原結合ドメイン、前記第2の標的抗原結合ドメイン、及びこれらの組み合わせから選択されるメンバーに接合される、少なくとも1つの半減期延長ドメインをさらに含む、上記項1~2のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項6]
前記少なくとも1つの半減期延長ドメインが、前記不活性なVHドメイン及び前記不活性なVLドメイン以外のドメインに結合されている、上記項5に記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項7]
前記少なくとも1つの半減期延長ドメインが、血清タンパク質に結合することができる部分を含む、上記項5~6のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項8]
前記血清タンパク質が、血清アルブミンである、上記項7に記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項9]
前記少なくとも1つの半減期延長ドメインが、scFv、可変重ドメイン(VH)、可変軽ドメイン(VL)、ナノボディ、ペプチド、リガンド、または小分子を含む、上記項5~8のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項10]
少なくとも1つの半減期延長ドメインが、プロテアーゼ切断の前に、前記単一鎖scFvのN末端、C末端、及びこれらの組み合わせから選択されるメンバーに位置する、上記項5~9のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項11]
少なくとも1つの半減期延長ドメインが、プロテアーゼ切断の前に、前記scFvポリペプチドのC末端またはN末端にない、上記項5~9のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項12]
前記半減期延長ドメインが、その中に切断可能な部分を含むリンカーを通じて、前記第1のVLドメイン、前記第1のVHドメイン、前記第2のVLドメイン、前記第2のVHドメイン、前記第1の標的抗原結合ドメイン、前記第2の標的抗原結合ドメイン、及びこれらの組み合わせから選択されるメンバーに結合される、上記項5~11のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項13]
前記CD-3抗原が、1つ以上のCD3抗原から選択される、上記項1~12のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項14]
前記標的抗原結合ドメインが、異常細胞によって発現される抗原に結合する、上記項1~13のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項15]
前記異常細胞が、悪性細胞である、上記項14に記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項16]
前記標的抗原結合ドメインが、細胞表面受容体に結合する、上記項1~15のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項17]
前記標的抗原結合ドメインが、scFv、VHドメイン、VLドメイン、非Igドメイン、または前記標的抗原に特異的に結合するリガンドを含む、上記項1~16のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項18]
少なくとも1つの標的抗原結合ドメインが、腫瘍抗原に特異的に結合する、上記項1~17のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項19]
前記細胞表面受容体が、EpCAM、EGFR、HER-2、HER-3、cMet、CEA、FoIR、及びこれらの組み合わせから選択されるメンバーである、上記項16に記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項20]
前記第1のscFvリンカー及び前記第2のscFvリンカーが、同じ配列または異なる配列のポリペプチドリンカーである、上記項1~19のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項21]
前記第1のプロテアーゼ切断部位及び前記第2のプロテアーゼ切断部位が、同じプロテアーゼまたは異なるプロテアーゼに対する切断部位である、上記項1~20のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項22]
前記第1のプロテアーゼ切断部位及び前記第2のプロテアーゼ切断部位が、同じ配列または異なる配列である、上記項1~21のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項23]
前記第1のドメインリンカー及び前記第2のドメインリンカーが、同じ配列または異なる配列のポリペプチドリンカーである、上記項1~2及び4~22のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項24]
前記プロテアーゼ切断部位が、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、メタロプロテイナーゼ、ゼラチナーゼ、及びアスパラギンペプチドリアーゼのうちの少なくとも1つによって切断される、上記項1~23のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項25]
前記プロテアーゼ切断部位が、カテプシンB、カテプシンC、カテプシンD、カテプシンE、カテプシンK、カテプシンL、カリクレイン、hK1、hK10、hK15、プラスミン、コラゲナーゼ、IV型コラゲナーゼ、ストロメリシン、Xa因子、キモトリプシン様プロテアーゼ、トリプシン様プロテアーゼ、エラスターゼ様プロテアーゼ、スブチリシン様プロテアーゼ、アクチニダイン(actinidain)、ブロメライン、カルパイン、カスパーゼ、カスパーゼ-3、Mir1-CP、パパイン、HIV-1プロテアーゼ、HSVプロテアーゼ、CMVプロテアーゼ、キモシン、レニン、ペプシン、マトリプターゼ、レグマイン、プラスメプシン、ネペンテシン、メタロエキソペプチダーゼ、メタロエンドペプチダーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)、MMP1、MMP2、MMP3、MMP8、MMP9、MMP10、MMP11、MMP12、MMP13、MMP14、ADAM10、ADAM12、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子(uPA)、エンテロキナーゼ、前立腺特異抗原(PSA、hK3)、インターロイキン-1β変換酵素、トロンビン、FAP(FAP-α)、メプルン(meprn)、グランザイム、ジペプチジルペプチダーゼ、及びジペプチジルペプチダーゼIV(DPPIV/CD26)のうちの少なくとも1つによって切断される、上記項1~24のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項26]
前記プロテアーゼ切断ドメインが、腫瘍の部位で切断される、上記項1~25のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項27]
前記プロテアーゼ切断部位を切断する前記プロテアーゼが、前記腫瘍の微小環境内の細胞によって発現される、上記項1~26のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項28]
前記プロテアーゼ切断部位が、前記単一鎖scFvポリペプチドが投与される対象の血液中で切断される、上記項1~27のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項29]
前記scFvポリペプチドが、2つ以上のプロテアーゼ切断ドメインをさらに含む、上記項1~28のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項30]
前記プロテアーゼ切断ドメインが、前記半減期延長ドメインまたは前記CD-3結合ドメイン内にある、上記項5~29のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項31]
前記プロテアーゼ切断ドメインが、前記半減期延長ドメインまたは前記CD-3結合ドメイン内にない、上記項5~29のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項32]
1つ以上のCD-3結合ドメインが、ヒトCD-3に特異的な単一鎖可変フラグメント(scFv)に由来するポリペプチドを含む、上記項1~31のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項33]
前記CD-3結合ドメインが、CD3ε(イプシロン)、CD3δ(デルタ)、及びCD3γ(ガンマ)から選択されるメンバーに特異的なCD3結合ドメインである、上記項1~32のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項34]
1つ以上のCD3結合ドメインが、ムロモナブ-CD3(OKT3)、オテリキシズマブ(TRX4)、テプリズマブ(MGA031)、ビジリズマブ(Nuvion)、SP34、I2C、X35、VIT3、BMA030(BW264/56)、CLB-T3/3、CRIS7、YTH12.5、F111-409、CLB-T3.4.2、TR-66、WT32、SPv-T3b、11D8、XIII-141、XIII-46、XIII-87、12F6、T3/RW2-8C8、T3/RW2-4B6、OKT3D、M-T301、SMC2、F101.01、UCHT-1、及びWT-31からなる群から選択される相補性決定領域(CDR)を含む、上記項33に記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項35]
1つ以上のCD-3結合ドメインが、ヒト化されている、上記項1~34のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項36]
前記プロテアーゼ切断部位のプロテアーゼ切断に続いて、1つ以上の前記CD3結合ドメインが、CD3発現細胞上のCD3に対して1000nM以下のKD結合を有する、上記項33に記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項37]
前記プロテアーゼ切断部位のプロテアーゼ切断に続いて、1つ以上の活性化CD3結合ドメインが、CD3発現細胞上のCD3に対して100nM以下のKD結合を有する、上記項36に記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項38]
前記プロテアーゼ切断部位のプロテアーゼ切断に続いて、1つ以上の活性化CD3結合ドメインが、CD3発現細胞上のCD3に対して10nM以下のKD結合を有する、上記項37に記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項39]
1つ以上のCD-3結合ドメインが、カニクイザルCD3との交差反応性を有する、上記項1~38のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項40]
1つ以上のCD-3結合ドメインが、本明細書で提供されるアミノ酸配列を含むCD3結合ドメインである、上記項1~39のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項41]
前記標的抗原結合ドメインが、EGFR結合ドメインである、上記項1~40のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項42]
前記VLドメイン及び前記VHドメインが、3つのCDRを各々含む、上記項1~41のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項43]
前記不活性なVL及び前記不活性なVHから選択されるメンバーが、前記VL及びVHの親配列に対して突然変異した少なくとも1つのアミノ酸を含む少なくとも1つのCDRを含む、上記項1~42のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項44]
前記不活性なVL及び前記不活性なVHから選択されるメンバーが、前記VL及びVHの前記CDR2の親配列に対して突然変異した少なくとも1つのアミノ酸を含むCDR2ドメインを含む、上記項1~43のいずれかの単一鎖scFvポリペプチド。
[項45]
前記不活性なVL及び前記不活性なVHから選択されるメンバーが、前記第1のドメインリンカー及び前記第1のscFvリンカーから選択されるメンバーを、前記CDRに組み込むことによって、前記VL及びVHの前記CDRの親配列に対して突然変異した少なくとも1つのCDRを含む、上記項1~44のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
[項46]
上記項1~45のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
[項47]
上記項46に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
[項48]
上記項47に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
[項49]
薬学的組成物であって、
(i)上記項1~45のいずれか1項に記載の単一鎖scFvポリペプチド、
(ii)上記項46に記載のポリヌクレオチド、
(iii)上記項47に記載のベクター、
(iv)上記項48に記載の宿主細胞、及びその組み合わせ、ならびに
(v)薬学的に許容される担体、から選択されるメンバーを含む、薬学的組成物。
[項50]
上記項1~45のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチドを生成するためのプロセスであって、上記項1~45に記載の単一鎖scFvポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を、前記単一鎖scFvポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養することと、前記生成された単一鎖scFvポリペプチドを、前記培養物から回収及び精製することと、を含む、プロセス。
[項51]
増殖性疾患、腫瘍性疾患、炎症性疾患、免疫学的障害、自己免疫疾患、感染性疾患、ウイルス性疾患、アレルギー反応、寄生虫反応、移植片対宿主疾患、もしくは宿主対移植片疾患の治療または改善のための方法であって、そのような治療または改善を必要とする対象への、上記項1~45のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチドの投与を含む、方法。
[項52]
前記対象が、ヒトである、上記項52に記載の方法。
[項53]
プロドラッグ組成物であって、
i)第1のプロテアーゼ切断部位を含む第1のscFvリンカー部分を通じて接合される、第1のVHドメイン及び第1のVLドメインを含む、第1のscFvドメインを含む、CD3結合ドメインをコードする、第1のポリペプチド配列であって、前記第1のscFvドメインがCD3に特異的に結合しないようにする、第1のポリペプチド配列と、
ii)第2のプロテアーゼ切断部位を含む第2のscFvリンカー部分を通じて接合される、第2のVHドメイン及び第2のVLドメインを含む、第2のscFvドメインを含む、腫瘍抗原結合ドメインをコードする、第2のポリペプチド配列であって、前記第2のscFvドメインが腫瘍抗原に特異的に結合しないようにする、第2のポリペプチド配列と、
iii)任意選択で少なくとも1つの半減期延長ドメインと、を含む、プロドラッグ組成物。
[項54]
前記第1のポリペプチド配列及び前記第2のポリペプチド配列が、プロテアーゼ切断部位を任意選択で含む第1のドメインリンカー部分によって動作可能に連結されている、上記項54に記載のプロドラッグ組成物。
[項55]
プロドラッグ組成物であって、
i)第1のポリペプチド配列であって、a)第1のプロテアーゼ切断部位を含む第1のscFvリンカー部分を通じて接合される、第1のVHドメイン及び第1のVLドメインを含む、第1のscFvドメインを含む、第1のCD3結合ドメインであって、前記第1のscFvドメインが、CD3に特異的に結合しない、第1のCD3結合ドメイン、及びb)第1の腫瘍抗原結合ドメインを含む、第1のポリペプチド配列と、
ii)第2のポリペプチド配列であって、a)第2のプロテアーゼ切断部位を含む第2のscFvリンカー部分を通じて接合される、第2のVHドメイン及び第2のVLドメインを含む、第2のscFvドメインを含む、第2のCD3結合ドメインであって、前記第2のscFvドメインが、CD3に特異的に結合しない、第2のCD3結合ドメイン、及びb)第2の腫瘍抗原結合ドメインを含む、第2のポリペプチド配列と、
iii)任意選択で少なくとも1つの半減期延長ドメインと、を含み、
前記第1のVHドメイン及び前記第2のVLドメインが、CD3に特異的に結合する、ならびに/または前記第2のVHドメイン及び前記第1のVLドメインが、CD3に特異的に結合する、プロドラッグ組成物。
[項56]
前記第1の腫瘍抗原結合ドメイン及び前記第2の腫瘍抗原結合ドメインが、同じ腫瘍抗原に結合する、上記項56に記載のプロドラッグ組成物。
[項57]
前記第1の腫瘍抗原結合ドメイン及び前記第2の腫瘍抗原結合ドメインが、異なる腫瘍抗原タンパク質に結合する、上記項56に記載のプロドラッグ組成物。
[項58]
前記第1の腫瘍抗原結合ドメインが、第1の腫瘍細胞上に存在する第1の腫瘍抗原に結合し、前記第2の腫瘍抗原結合ドメインが、前記第1の腫瘍細胞上に存在する第2の腫瘍抗原に結合する、上記項56に記載のプロドラッグ組成物。
全ての引用文献は、本明細書にそれらの全体が参考として明示的に援用される。
Claims (58)
- CD-3抗原に対する単一鎖scFvポリペプチドであって、前記scFvポリペプチドが、第1のVHドメインと第1のVLドメインとの間の第1のプロテアーゼ切断部位を含む第1のscFvリンカー部分を通じて接合される、前記第1のVHドメイン及び前記第1のVLドメインを含む、第1のscFvドメインであって、前記第1のVHドメイン及び前記第1のVLドメインが、相互作用して、第1のVH/VL対を形成し、前記第1のVHドメイン及び前記第1のVLドメインのうちの一方が、不活性であり、そのため、前記第1のscFvドメインが、前記CD-3抗原に特異的に結合せず、前記第1のscFvポリペプチドが、第2のプロテアーゼ切断部位を任意選択で含む第1のドメインリンカー部分を通じて接合される、第1のscFvドメインと、
第2のVHドメインと第2のVLドメインとの間の第3のプロテアーゼ切断部位を含む第2のscFvリンカー部分を介して接合される、前記第2のVHドメイン及び前記第2のVLドメインを含む第2のscFvドメインであって、前記第2のVHドメイン及び前記第2のVLドメインが、相互作用して、第2のVH/VL対を形成し、前記第2のVHドメイン及び前記第2のVLのうちの一方が、不活性であり、そのため、前記第2のscFvドメインが、前記CD-3抗原に特異的に結合しない、第2のscFvドメインと、を含み、
前記第1のscFvドメインが、第2のドメインリンカーを通じて、第1の標的抗原結合ドメインに接合され、前記第2のドメインリンカーが、前記第1のVHドメイン及び前記第1のVLドメインから選択されるメンバーを、前記第1の標的抗原結合ドメインに接合し、
前記第2のscFvドメインが、第3のドメインリンカーを通じて、第2の標的抗原結合ドメインに接合され、前記第3のドメインリンカーが、前記第2のVHドメイン及び前記第2のVLドメインから選択されるメンバーを、前記第2の標的抗原結合ドメインに接合する、単一鎖scFvポリペプチド。 - CD-3抗原に対する単一鎖scFvポリペプチドであって、前記scFvポリペプチドが、第1のVHドメインと第1のVLドメインとの間の第1のプロテアーゼ切断部位を含む第1のscFvリンカー部分を通じて接合される、前記第1のVHドメイン及び前記第1のVLドメインを含む、第1のscFvドメインであって、前記第1のVHドメイン及び前記第1のVLドメインが、相互作用して、第1のVH/VL対を形成し、前記第1のVHドメイン及び前記第1のVLドメインのうちの一方が、不活性な第1のVHドメインまたは不活性な第1のVLドメインであり、そのため、前記第1のscFvドメインが、前記CD-3抗原に特異的に結合せず、前記第1のscFvポリペプチドが、第2のプロテアーゼ切断部位を任意選択で含む第1のドメインリンカー部分を通じて接合される、第1のscFvドメインと、
第2のVHドメインと第2のVLドメインとの間の第3のプロテアーゼ切断部位を含む第2のscFvリンカー部分を介して接合される、前記第2のVHドメイン及び前記第2のVLドメインを含む第2のscFvドメインであって、前記第2のVHドメイン及び前記第2のVLが、相互作用して、第2のVH/VL対を形成し、前記第2のVHドメイン及び前記第2のVLドメインのうちの一方が、不活性な第2のVHドメインまたは不活性な第2のVLドメインであり、そのため、前記第2のscFvドメインが、前記CD-3抗原に特異的に結合しない、第2のscFvドメインと、を含み、
前記第1のscFvドメインが、第2のドメインリンカーを通じて、第1の標的抗原結合ドメインに接合され、前記第2のドメインリンカーが、前記第1のVHドメイン及び前記第1のVLドメインから選択されるメンバーを、前記第1の標的抗原結合ドメインに接合し、
前記第2のscFvドメインが、第3のドメインリンカーを通じて、第2の標的抗原結合ドメインに接合され、前記第3のドメインリンカーが、前記第2のVHドメイン及び前記第2のVLドメインから選択されるメンバーを、前記第2の標的抗原結合ドメインに接合し、
前記単一鎖scFvを、前記第1のscFvリンカー部分の前記第1のプロテアーゼ切断部位を切断することができる第1のプロテアーゼと接触させると、前記不活性な第1のVHドメインまたは前記不活性な第1のVLドメインが、前記単一鎖scFvポリペプチドから分離され、
第2のプロテアーゼが、前記第2のscFvリンカー部分の前記第2のプロテアーゼ切断部位を切断することができ、前記不活性な第2のVHドメインまたは前記不活性な第2のVLドメインが、前記単一鎖scFvポリペプチドから分離され、
それにより、前記CD-3抗原に結合することができる活性な単一鎖scFvを形成する、単一鎖scFvポリペプチド。 - CD-3抗原に対する単一鎖scFvポリペプチドであって、前記scFvポリペプチドが、第1のVHドメインと第1のVLドメインとの間の第1のプロテアーゼ切断部位を含む第1のscFvリンカー部分を通じて接合される、前記第1のVHドメイン及び前記第1のVLドメインを含む、第1のscFvドメインであって、前記第1のVHドメイン及び前記第1のVLドメインが、相互作用して、第1のVH/VL対を形成し、前記第1のVHドメイン及び前記第1のVLドメインのうちの一方が、不活性であり、そのため、前記第1のscFvドメインが、前記CD-3抗原に特異的に結合せず、前記第1のscFvポリペプチドが、第2のプロテアーゼ切断部位を任意選択で含む第1のドメインリンカー部分を通じて接合される、第1のscFvドメインと、
第1の標的抗原結合ドメインであって、前記第1のドメインリンカーが、前記第1のVHドメイン及び前記第1のVLドメインから選択されるメンバーを、前記第1の標的抗原結合ドメインに接合する、第1の標的抗原結合ドメインと、を含む、単一鎖scFvポリペプチド。 - 前記第1のVLドメイン、前記第1のVHドメイン、前記第1の標的抗原結合ドメイン、及びこれらの組み合わせから選択されるメンバーに接合される、少なくとも1つの半減期延長ドメインをさらに含む、請求項1~3のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
- 前記第1のVLドメイン、前記第1のVHドメイン、前記第2のVLドメイン、前記第2のVHドメイン、前記第1の標的抗原結合ドメイン、前記第2の標的抗原結合ドメイン、及びこれらの組み合わせから選択されるメンバーに接合される、少なくとも1つの半減期延長ドメインをさらに含む、請求項1~2のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
- 前記少なくとも1つの半減期延長ドメインが、前記不活性なVHドメイン及び前記不活性なVLドメイン以外のドメインに結合されている、請求項5に記載の単一鎖scFvポリペプチド。
- 前記少なくとも1つの半減期延長ドメインが、血清タンパク質に結合することができる部分を含む、請求項5~6のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
- 前記血清タンパク質が、血清アルブミンである、請求項7に記載の単一鎖scFvポリペプチド。
- 前記少なくとも1つの半減期延長ドメインが、scFv、可変重ドメイン(VH)、可変軽ドメイン(VL)、ナノボディ、ペプチド、リガンド、または小分子を含む、請求項5~8のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
- 少なくとも1つの半減期延長ドメインが、プロテアーゼ切断の前に、前記単一鎖scFvのN末端、C末端、及びこれらの組み合わせから選択されるメンバーに位置する、請求項5~9のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
- 少なくとも1つの半減期延長ドメインが、プロテアーゼ切断の前に、前記scFvポリペプチドのC末端またはN末端にない、請求項5~9のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
- 前記半減期延長ドメインが、その中に切断可能な部分を含むリンカーを通じて、前記第1のVLドメイン、前記第1のVHドメイン、前記第2のVLドメイン、前記第2のVHドメイン、前記第1の標的抗原結合ドメイン、前記第2の標的抗原結合ドメイン、及びこれらの組み合わせから選択されるメンバーに結合される、請求項5~11のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
- 前記CD-3抗原が、1つ以上のCD3抗原から選択される、請求項1~12のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
- 前記標的抗原結合ドメインが、異常細胞によって発現される抗原に結合する、請求項1~13のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
- 前記異常細胞が、悪性細胞である、請求項14に記載の単一鎖scFvポリペプチド。
- 前記標的抗原結合ドメインが、細胞表面受容体に結合する、請求項1~15のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
- 前記標的抗原結合ドメインが、scFv、VHドメイン、VLドメイン、非Igドメイン、または前記標的抗原に特異的に結合するリガンドを含む、請求項1~16のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
- 少なくとも1つの標的抗原結合ドメインが、腫瘍抗原に特異的に結合する、請求項1~17のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
- 前記細胞表面受容体が、EpCAM、EGFR、HER-2、HER-3、cMet、CEA、FoIR、及びこれらの組み合わせから選択されるメンバーである、請求項16に記載の単一鎖scFvポリペプチド。
- 前記第1のscFvリンカー及び前記第2のscFvリンカーが、同じ配列または異なる配列のポリペプチドリンカーである、請求項1~19のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
- 前記第1のプロテアーゼ切断部位及び前記第2のプロテアーゼ切断部位が、同じプロテアーゼまたは異なるプロテアーゼに対する切断部位である、請求項1~20のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
- 前記第1のプロテアーゼ切断部位及び前記第2のプロテアーゼ切断部位が、同じ配列または異なる配列である、請求項1~21のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
- 前記第1のドメインリンカー及び前記第2のドメインリンカーが、同じ配列または異なる配列のポリペプチドリンカーである、請求項1~2及び4~22のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
- 前記プロテアーゼ切断部位が、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、メタロプロテイナーゼ、ゼラチナーゼ、及びアスパラギンペプチドリアーゼのうちの少なくとも1つによって切断される、請求項1~23のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
- 前記プロテアーゼ切断部位が、カテプシンB、カテプシンC、カテプシンD、カテプシンE、カテプシンK、カテプシンL、カリクレイン、hK1、hK10、hK15、プラスミン、コラゲナーゼ、IV型コラゲナーゼ、ストロメリシン、Xa因子、キモトリプシン様プロテアーゼ、トリプシン様プロテアーゼ、エラスターゼ様プロテアーゼ、スブチリシン様プロテアーゼ、アクチニダイン(actinidain)、ブロメライン、カルパイン、カスパーゼ、カスパーゼ-3、Mir1-CP、パパイン、HIV-1プロテアーゼ、HSVプロテアーゼ、CMVプロテアーゼ、キモシン、レニン、ペプシン、マトリプターゼ、レグマイン、プラスメプシン、ネペンテシン、メタロエキソペプチダーゼ、メタロエンドペプチダーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)、MMP1、MMP2、MMP3、MMP8、MMP9、MMP10、MMP11、MMP12、MMP13、MMP14、ADAM10、ADAM12、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子(uPA)、エンテロキナーゼ、前立腺特異抗原(PSA、hK3)、インターロイキン-1β変換酵素、トロンビン、FAP(FAP-α)、メプルン(meprn)、グランザイム、ジペプチジルペプチダーゼ、及びジペプチジルペプチダーゼIV(DPPIV/CD26)のうちの少なくとも1つによって切断される、請求項1~24のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
- 前記プロテアーゼ切断ドメインが、腫瘍の部位で切断される、請求項1~25のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
- 前記プロテアーゼ切断部位を切断する前記プロテアーゼが、前記腫瘍の微小環境内の細胞によって発現される、請求項1~26のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
- 前記プロテアーゼ切断部位が、前記単一鎖scFvポリペプチドが投与される対象の血液中で切断される、請求項1~27のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
- 前記scFvポリペプチドが、2つ以上のプロテアーゼ切断ドメインをさらに含む、請求項1~28のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
- 前記プロテアーゼ切断ドメインが、前記半減期延長ドメインまたは前記CD-3結合ドメイン内にある、請求項5~29のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
- 前記プロテアーゼ切断ドメインが、前記半減期延長ドメインまたは前記CD-3結合ドメイン内にない、請求項5~29のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
- 1つ以上のCD-3結合ドメインが、ヒトCD-3に特異的な単一鎖可変フラグメント(scFv)に由来するポリペプチドを含む、請求項1~31のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
- 前記CD-3結合ドメインが、CD3ε(イプシロン)、CD3δ(デルタ)、及びCD3γ(ガンマ)から選択されるメンバーに特異的なCD3結合ドメインである、請求項1~32のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
- 1つ以上のCD3結合ドメインが、ムロモナブ-CD3(OKT3)、オテリキシズマブ(TRX4)、テプリズマブ(MGA031)、ビジリズマブ(Nuvion)、SP34、I2C、X35、VIT3、BMA030(BW264/56)、CLB-T3/3、CRIS7、YTH12.5、F111-409、CLB-T3.4.2、TR-66、WT32、SPv-T3b、11D8、XIII-141、XIII-46、XIII-87、12F6、T3/RW2-8C8、T3/RW2-4B6、OKT3D、M-T301、SMC2、F101.01、UCHT-1、及びWT-31からなる群から選択される相補性決定領域(CDR)を含む、請求項33に記載の単一鎖scFvポリペプチド。
- 1つ以上のCD-3結合ドメインが、ヒト化されている、請求項1~34のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
- 前記プロテアーゼ切断部位のプロテアーゼ切断に続いて、1つ以上の前記CD3結合ドメインが、CD3発現細胞上のCD3に対して1000nM以下のKD結合を有する、請求項33に記載の単一鎖scFvポリペプチド。
- 前記プロテアーゼ切断部位のプロテアーゼ切断に続いて、1つ以上の活性化CD3結合ドメインが、CD3発現細胞上のCD3に対して100nM以下のKD結合を有する、請求項36に記載の単一鎖scFvポリペプチド。
- 前記プロテアーゼ切断部位のプロテアーゼ切断に続いて、1つ以上の活性化CD3結合ドメインが、CD3発現細胞上のCD3に対して10nM以下のKD結合を有する、請求項37に記載の単一鎖scFvポリペプチド。
- 1つ以上のCD-3結合ドメインが、カニクイザルCD3との交差反応性を有する、請求項1~38のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
- 1つ以上のCD-3結合ドメインが、本明細書で提供されるアミノ酸配列を含むCD3結合ドメインである、請求項1~39のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
- 前記標的抗原結合ドメインが、EGFR結合ドメインである、請求項1~40のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
- 前記VLドメイン及び前記VHドメインが、3つのCDRを各々含む、請求項1~41のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
- 前記不活性なVL及び前記不活性なVHから選択されるメンバーが、前記VL及びVHの親配列に対して突然変異した少なくとも1つのアミノ酸を含む少なくとも1つのCDRを含む、請求項1~42のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
- 前記不活性なVL及び前記不活性なVHから選択されるメンバーが、前記VL及びVHの前記CDR2の親配列に対して突然変異した少なくとも1つのアミノ酸を含むCDR2ドメインを含む、請求項1~43のいずれかの単一鎖scFvポリペプチド。
- 前記不活性なVL及び前記不活性なVHから選択されるメンバーが、前記第1のドメインリンカー及び前記第1のscFvリンカーから選択されるメンバーを、前記CDRに組み込むことによって、前記VL及びVHの前記CDRの親配列に対して突然変異した少なくとも1つのCDRを含む、請求項1~44のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチド。
- 請求項1~45のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 請求項46に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項47に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
- 薬学的組成物であって、
(i)請求項1~45のいずれか1項に記載の単一鎖scFvポリペプチド、
(ii)請求項46に記載のポリヌクレオチド、
(iii)請求項47に記載のベクター、
(iv)請求項48に記載の宿主細胞、及びその組み合わせ、ならびに
(v)薬学的に許容される担体、から選択されるメンバーを含む、薬学的組成物。 - 請求項1~45のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチドを生成するためのプロセスであって、請求項1~45に記載の単一鎖scFvポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を、前記単一鎖scFvポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養することと、前記生成された単一鎖scFvポリペプチドを、前記培養物から回収及び精製することと、を含む、プロセス。
- 増殖性疾患、腫瘍性疾患、炎症性疾患、免疫学的障害、自己免疫疾患、感染性疾患、ウイルス性疾患、アレルギー反応、寄生虫反応、移植片対宿主疾患、もしくは宿主対移植片疾患の治療または改善のための方法であって、そのような治療または改善を必要とする対象への、請求項1~45のいずれかに記載の単一鎖scFvポリペプチドの投与を含む、方法。
- 前記対象が、ヒトである、請求項52に記載の方法。
- プロドラッグ組成物であって、
i)第1のプロテアーゼ切断部位を含む第1のscFvリンカー部分を通じて接合される、第1のVHドメイン及び第1のVLドメインを含む、第1のscFvドメインを含む、CD3結合ドメインをコードする、第1のポリペプチド配列であって、前記第1のscFvドメインがCD3に特異的に結合しないようにする、第1のポリペプチド配列と、
ii)第2のプロテアーゼ切断部位を含む第2のscFvリンカー部分を通じて接合される、第2のVHドメイン及び第2のVLドメインを含む、第2のscFvドメインを含む、腫瘍抗原結合ドメインをコードする、第2のポリペプチド配列であって、前記第2のscFvドメインが腫瘍抗原に特異的に結合しないようにする、第2のポリペプチド配列と、
iii)任意選択で少なくとも1つの半減期延長ドメインと、を含む、プロドラッグ組成物。 - 前記第1のポリペプチド配列及び前記第2のポリペプチド配列が、プロテアーゼ切断部位を任意選択で含む第1のドメインリンカー部分によって動作可能に連結されている、請求項54に記載のプロドラッグ組成物。
- プロドラッグ組成物であって、
i)第1のポリペプチド配列であって、a)第1のプロテアーゼ切断部位を含む第1のscFvリンカー部分を通じて接合される、第1のVHドメイン及び第1のVLドメインを含む、第1のscFvドメインを含む、第1のCD3結合ドメインであって、前記第1のscFvドメインが、CD3に特異的に結合しない、第1のCD3結合ドメイン、及びb)第1の腫瘍抗原結合ドメインを含む、第1のポリペプチド配列と、
ii)第2のポリペプチド配列であって、a)第2のプロテアーゼ切断部位を含む第2のscFvリンカー部分を通じて接合される、第2のVHドメイン及び第2のVLドメインを含む、第2のscFvドメインを含む、第2のCD3結合ドメインであって、前記第2のscFvドメインが、CD3に特異的に結合しない、第2のCD3結合ドメイン、及びb)第2の腫瘍抗原結合ドメインを含む、第2のポリペプチド配列と、
iii)任意選択で少なくとも1つの半減期延長ドメインと、を含み、
前記第1のVHドメイン及び前記第2のVLドメインが、CD3に特異的に結合する、ならびに/または前記第2のVHドメイン及び前記第1のVLドメインが、CD3に特異的に結合する、プロドラッグ組成物。 - 前記第1の腫瘍抗原結合ドメイン及び前記第2の腫瘍抗原結合ドメインが、同じ腫瘍抗原に結合する、請求項56に記載のプロドラッグ組成物。
- 前記第1の腫瘍抗原結合ドメイン及び前記第2の腫瘍抗原結合ドメインが、異なる腫瘍抗原タンパク質に結合する、請求項56に記載のプロドラッグ組成物。
- 前記第1の腫瘍抗原結合ドメインが、第1の腫瘍細胞上に存在する第1の腫瘍抗原に結合し、前記第2の腫瘍抗原結合ドメインが、前記第1の腫瘍細胞上に存在する第2の腫瘍抗原に結合する、請求項56に記載のプロドラッグ組成物。
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