SU1744112A1

SU1744112A1 - Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L - продуцент моноклонального антитела к щелочной фосфатазе тюлен

Info

Publication number: SU1744112A1
Application number: SU894791832A
Authority: SU
Inventors: Иван Юрьевич Сахаров; Евгений Борисович Мечетнер; Ирина Евгеньевна Степанова
Original assignee: Всесоюзный онкологический научный центр АМН СССР; Научно-исследовательская лаборатория биологически активных веществ гидробионтов
Priority date: 1989-12-26
Filing date: 1989-12-26
Publication date: 1992-06-30

Abstract

Изобретение относитс к гибридомной технологии и может быть использовано дл вы влени антигена щелочной фосфатазы тюлен , в медицинской и ветеринарной практике и научно-исследовательской работе , а также дл вы влени чистого фермента с помощью иммуносорбента. Цель изобретени - получение гибридомного штамма, продуцирующего моноклональное мышиное антитело к щелочной фосфатазе тюлен . Путем сли ни миеломы мыши Sp 2/0 с клетками селезенки мыши линии BALB/C, иммунизированной щелочной фосфатазой, выделенной из тонкого кишечника тюлен , получен штамм гибридных клеток, продуцирующих моноклональное антитело к щелочной фосфатазе тюлен в количестве 20-40 мкг/мл культу рал ьного супернатан- та, при выращивании в виде асцита - 5- 10 мг/мл. МонАТ принадлежит субклассу Ig61. Штамм гибридомы депонирован под IXh BCKK(II) 377 (Д). 3 табл. (Л С

Description

Изобретение относитс к биотехнологии и может быть использовано дл вы влени антигена - щелочной фосфатазы тюлен , в медицинской и ветеринарной практике и научно-исследовательской де тельности , а также дл выделени чистого фермента с помощью иммуносорбента.

Наиболее близким предлагаемому штамму АРР.1 вл етс штамм гибридных культивируемых клеток мыши МАМ-2108 (хранитс в коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером ВСКК 63Д.

Цель изобретени - получение гибридомного штамма, продуцирующего моноклональное мышиное антитело к щелочной фосфатазе тюлен (ШФТ).

Штамм характеризуетс следующими свойствами.

Криоконсервирование. Дл длительного хранени гибридомные клетки замораживают в эмбриональной тел чьей сыворотке с. добавлением 10% диметилсульфоксида в пластиковых ампулах. Замораживание ампул провод т в коробке из вспененного полистирола с толщиной стенок 1 см. Коробку с ампулами составл ют при -70°С и через 1 сут перенос т ампулы в жидкий азот дл хранени . Размораживают клетки, перенос ампулу из жидкого азота в вод ную баню на 37°С.

Культуральные свойства. Среда дл культивировани - среда RPMI-1640 с добавлением 10-15% тел чьей эмбриональ2

4

Ю

ной сыворотки, 4 мМ L-глютамина, 10 мМ пирувата натри , 40 мкг/мл гентамицина, 100 мкг/мл стрептомицина при 37°С в атмосфере 5%-ной углекислоты. Посевна доза - Ю5 клеток в 1 мл. Через 3-4 дн концентраци антитела в культуральной жидкости достигает 20-40 мкг/мл. Контаминаци бактери ми, грибками и микоплаз- мой не обнаружена.

Кариологическа характеристика. Модальное число хромосом-81. 1. Маркерна метацетрическа хромосома.

Дл выращивани гибридомы в асцит- ной форме клетки ввод т в брюшную полость мышей BALB/C, обработанных пристанем, в количестве 2-5x106 клеток на мышь. Опухоли развиваютс у мышей через 10-15 дней.

Характеристика целевого продукта. Мо- ноклональное антитело, продуцируемое штаммом, относитс к fgCI подклассу и св зывает щелочную фосфатазу тюлен , не затрагива его активный центр.

Продуктивность. Концентраци моно- клональных антител в культуральных супер- натантах - 20-40 мкг/мл, в асцитной жидкости мышей BALB/C - 5-10 мг/мл.

Полученный штамм назван АРР 1 Штамм депонирован в коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером ВСКК 377Д.

Изобретение иллюстрируетс следующими примерами.

Пример 1, Мышей линии BALB/C иммунизируют внутрибрюшинным введением 50 мкг препарата щелочной фосфата- зы, выделенного из тонкого кишечника тюлен , в 0,2 мл забуференного фосфатами физраствора (ЗФР), содержащем 30% полного адьюванта Фрейнда. Через 4, 28 и 42 дн иммунизацию повтор ют введением внутрибрюшинно 50 мкг ант.игена в ЗФР без адьюванта. Через 4 дн после этого Ю8 клеток селезенки иммунных мышей гибри- дизовали с 15х107 клеток миеломы мыши Sp 2/0 в присутствии 0,7 мл раствора, содержащего 50% (объем/объем) полиэтиленглико- л (ПЭГ) мол,массы 1500 в течение 1 мин. После гибридизации и отмывки клеток от ПЭГа клетки высевают в 96-луночные панели по 2x10 клеток в лунку. Дл культивировани и селекции гибридов используют среду RPVI-1640 с добавлением 10% те л чьей эмбриональной сыворотки, М гипоксантина, М аминоптерина и 1, М тимидина. Гибриды-продуценты клонируют 3 раза методом конечных разведений , высева по 1 клетке в лунку, содер- жащую4хЮ клеток макрофагов. После

2 клонировани 100% субклонов продуцируют антитела к щелочной фосфатазе тюлен . Продукци антитела сохран етс как минимум в течение 10 пассажей в культуре.

Гибридомные клетки помещают в пластиковый флакон площадью 25 см по 5x10 в 5 мл среды RPVI-1640 с 10% эмбриональной тел чьей сывороткой, 4 мМ глютамина, 10 мМ пирувата натри , 40 мкг/мл гентамицинаи культивируют 4 дн при 37°С в атмосфере , содержащей 5% СОа. Дл получени асцитной опухоли 5х106 гибридомных клеток ввод т в брюшную полость мышей BALB/C, обработанных пристанем. Через

2-3 недели собирают асцитную жидкость и иммуноглобулины осаждают сульфатом натри . Осадок раствор т в 0,2 М боратном буфере (рН 8,1) с 0,15 М NaCI и диализуют против того же буфера.

Культуральную жидкость, содержащую

антитела, используют как реагент дл изучени специфичности взаимодействи антитела с щелочной фосфатазой тюлен . Дл этого на полистироловый 96 чеечный планшет дл микротитровани сорбируют ШФТ- 1 мкг на чейку в 100 мкл карбонатного буфера (100 мМ, рН 9,6) при 4°С в течение ночи (Elisa метод). После насыщени планшета 0,2%-ным раствором бычьего сывороточного альбумина (БСА) дл уменьшени неспецифического св зывани антител пластиком , в чейки планшета внос т 100 мкл культуральной жидкости штаппа в различных разведени х (1 ч, 37°С) (табл.1). Планшет отмывают 4 раза по 100 мкл ЗФР с 0,2% БСА и 0,05% Твин-20 и внос т конъюгат антител кролика против иммуноглобулинов мыши, ковалентно св занных с пероксида- зой (2 мкг/мл, 37°С, 1 ч). После окончани

инкубации несв завшиес продукты реакции отмывают указанным способом, а св - зующуюс пероксидазу определ ют количественно по расщеплению субстрата (Н202) в присутствии хромогена - ортофенилендиамина . Положительна реакци про вл етс при 490 нм.

Результаты опыта по изучению специфичности св зывани иммуноглобулинов

штамма с щелочной фосфатазой тюлен , сорбированной на пластике, представлены в табл. 1. Данные представлены как среднее и ошибка среднего, н-3.

Результаты этого примера свидетельствуют о высокой специфичности монокло- нального антитела, вырабатываемого клетками штамма АРР.1 и показывают возможность применени этого монокло- нального антитела дл вы влени иммобилизованной щелочной фосфатазы тюлен с

помощью твердофазного иммунофермент- ного метода.

Специфичность взаимодействи МкАТс щелочной фосфатазой тюлен в растворе исследована также с помощью метода обогащени . На полистироловый 96- чеечный планшет дл микротитровани сорбируют антитела кролика против иммуноглобулинов мыши: 200 мкл на чейку в концентрации 10 мкг/мл (4°С, ночь), затем сорбируют иммуноглобулины мыши из культуральной жидкости штамма ААР.1 в различных разведени х (1 ч, 37ЬС). После отмывки панели 0,05%-ным раствором Твина-20 от несв завшихс иммуноглобулинов, в чейки внос т раствор ШФТ (200 мкл, концентраци фермента 10 ед/мл). ШФТ, св зующуюс с моноклональным антителом, определ ют количественно в чейках дл микротитровани спектрофотометрически по расщеплению п-нитрофенилфосфата при 405 нм. Результаты опыта по изучению специфичности взаимодействи МкАТ, вырабатываемых клетками штамма ААР.1 с ШФТ в растворе, показаны на табл. 2. Данные представлены как среднее и ошибка среднего , н-3.

Результаты этого примера свидетельствуют о высокой специфичности монокло- нального антитела, вырабатываемого клетками штамма ААР.1, по отношению к ШФТ и показывают возможности применени этого моноклонального антитела дл вы влени активности ШФТ в растворах.

Пример 2. Отличие моноклональных антител АРР.1 и МАМ-2108.

Известно, что антитула МАМ-2108 взаимодействуют исключительно с ШФ теле0

5

нка и не св зываютс с ферментом тюлен , Аналогичное исследование проведено дл антител АРР.1. Дл этого на полистироловый 96- чеечный планшет дл микротитровани сорбируют антитела кролика против иммуноглобулинов мыши: 200 мкл на чейку в концентрации 10 мкг/мл (4°С, ночь), затем сорбируют иммуноглобулины мыши из культуральной жидкости штамма ААР.1 в различных разведени х (1 ч, 37°С). После отмывки панели 0,05%-ным раствором Твина-20 с несв завшихс иммуноглобулинов в чейки внос т раствор ШФ тюлен или теленка (200 мкл, концентраци фермента 10 ед/мл). ШФ, св завшуюс с моноклональным антителом, определ ют количественно в чейках дл микротитровани спектрофотометрически по расщеплению п- нитрофенилфосфата при 405 нм. Результа- 0 ты эксперимента показаны на табл. 3.

Данные представлены как среднее и ошибка среднего, н-3.

Результаты этого примера свидетельствуют о том. что антитела АРР.1, как и антитела МАМ-2108, различают ШФ тюлен и теленка.

Однако, обнаруживаемое отличие в случае АРР.1 имеет совершенно другой характер , нежели в случае МАМ-2108, что позвол ет утверждать, что антитела АРР. 1 и МАМ-2108 обладают различной эпитопной специфичностью

5

0

Claims

Формула изобретени Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L (ВСКК (П) 377 (Д)-продуцент моноклонального антитела к щелочной фосфатазе тюлен .

Таблица 1

Таблица 2

Таблица 3