KR20190017826A - 당사슬 항원을 추출하고 측정하기 위한 면역크로마토그래피 시험편 및 검체 첨가용 디바이스, 및 그것을 이용한 면역크로마토그래피법 - Google Patents

당사슬 항원을 추출하고 측정하기 위한 면역크로마토그래피 시험편 및 검체 첨가용 디바이스, 및 그것을 이용한 면역크로마토그래피법 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 당사슬 항원을 특이적으로 측정하는 것을 가능하게 하는 면역크로마토그래피 시험편 및 검체 첨가용 디바이스, 및 그것을 이용한 면역크로마토그래피법을 제공하는 것을 목적으로 하는, 당사슬 항원을 측정하는 면역크로마토그래피 시험법으로서, 검체와 아질산염 용액을 혼합한 후, 주석산을 접촉시키고, 검체 중의 당사슬 항원을 추출하는 공정이 여과 공정으로 행해지는 방법이다.

Description

당사슬 항원을 추출하고 측정하기 위한 면역크로마토그래피 시험편 및 검체 첨가용 디바이스, 및 그것을 이용한 면역크로마토그래피법
본 발명은, 면역크로마토그래피 시험편 상에서 당사슬 항원의 아질산 추출 처리를 하는 것이 가능한, 당사슬 항원을 추출하고 측정하기 위한 면역크로마토그래피 시험편 및 검체 첨가용 디바이스, 및 그것을 이용한 면역크로마토그래피법에 관한 것이다.
당사슬 항원의 추출 방법으로서 아질산 추출법이 알려져 있다. 이 방법은 주로 A군 β용혈성 연쇄상구균, 구강내 연쇄상구균 등 스트렙토코커스속에게 속하는 미생물의 당사슬 항원 추출에 대하여 사용된다.
상기 아질산 추출법은 균체와 아질산 수용액을 혼합하고, 당사슬 항원을 노출시키는 방법이고, 일반적인 아질산 추출법은, 미생물을 포함하는 검체에 아질산나트륨 수용액과 아세트산, 염산 등의 산성 용액을 혼합함으로써 아질산을 생성시킨 아질산 추출액을 혼합하고, 미생물과 상기 아질산을 충분한 시간 반응시키는 것에 의해 실시된다. 상기의 추출액은 강산성이므로, 반응 후에 트리스, 수산화나트륨 등의 염기성 용액을 첨가하고, 추출액을 중화한 후에 분석하는 것이 일반적이다.
한편, 면역크로마토그래피를 원리로 하는 신속 진단약의 대부분은, 바이러스 또는 세균감염증을 신속·간편하게 측정하고, 치료 방침을 결정하는 하나의 수단으로서 널리 사용되고 있다.
일반적인 면역크로마토그래피를 원리로 하는 신속 진단약은, 검체를 검체 부유액에 부유시킨 후, 그 부유액을 면역크로마토그래피 시험편에 공급함으로써 신속·간편하게 측정할 수 있다.
그에 대하여, 예를 들면 A군 β용혈성 연쇄상구균의 당사슬 항원을 측정할 때는, 미리 아질산염 용액과 산성 용액의 2액을 측정 직전에 혼합하여 아질산 추출액을 조제하고, 검체와 혼합한다. 즉, A군 β용혈성 연쇄상구균과 아질산과 반응시킨 후, 염기성 수용액으로 중화한다. 중화한 추출액을 면역크로마토그래피 시험편에 공급한다.
상기 방법에서 사용하는 아질산 추출액은 장시간 보존할 수 없으므로, 아질산염 용액과 산 용액은 시험 직전에 혼합·조제를 할 필요가 있다. 또한, 상기 아질산 추출액은 pH가 지나치게 낮아 항원항체 반응에 지장을 초래하므로, 어느 정도의 pH까지 중화할 필요가 있다.
그러나, 2액을 혼합하는 공정과 더 중화하는 공정이 증가하므로, 일반적인 면역크로마토그래피법을 원리로 하는 신속 진단약과 비교하여 시약이 보다 많아지고, 조작이 번잡해지기 쉬워진다. 그러므로, 기존의 신속 진단 시약에서는, 중화 시약을 면역크로마토그래피 시험편에 미리 포함시키는 것에 의해, 아질산염 용액과 산성 용액을 혼합하는 조작만으로 검체 처리가 가능하도록 고안되어 있다. 그러나, 여전히 종래의 면역크로마토그래피법을 원리로 한 신속 진단 시약에 비하여 조작 공정이 많으므로, 혼합하는 액량의 차이나 혼합하는 용액의 혼동, 2액을 혼합하지 않고 추출하는 등, 바르게 조작되지 않으므로, 정확하게 측정할 수 없다는 문제가 있었다.
전술한 바와 같이 면역크로마토그래피를 원리로 하는 신속 진단약에 있어서, 잘못된 방법으로 조작된 경우, 그 신속성·간편성 때문에 잘못된 진단·치료를 독촉하고, 치료를 지연시켜, 환자에게 불이익이 생기는 경우도 있다.
그래서, 면역크로마토그래피 시험편에 미리 아질산나트륨과 중화 시약을 포함시키는 것에 의해, 검체를 아세트산 등의 산성 용액에 부유시켜 면역크로마토그래피 시험편에 공급하는 조작만으로 아질산 추출 처리를 면역크로마토그래피 시험편 상에서 행하는 방법이 보고되어 있다(특허문헌 1).
그러나, 아질산나트륨은 독물 및 극물 취체법에서 극물로 지정되고, 소방법에서 위험물 제1류에 속하고, 또한 수질 오염 방지법에서 시행령 제2조 유해 물질로 지정되어 있으므로, 취급이 어려운 약품이다. 상기 면역크로마토그래피 시험편을 제조함에 있어서, 고농도의 아질산나트륨 수용액을 면역크로마토그래피 시험편의 부재에 도포한 후에 건조시키는 제조 공정이 필요하지만, 그 작업은 위험이 수반된다.
그래서, 아질산나트륨이 아니라, 산성 용액을 미리 면역크로마토그래피 시험편에 포함시키는 것이 고려되지만, 일반적으로 산성 용액으로서 사용되는 염산이나 아세트산으로는 종래의 사전에 2액을 혼합한 아질산 추출액으로 처리하여 중화하는 방법과 비교하여, 현저하게 뒤떨어지는 성능밖에 나타낼 수 없었다. 또한, 액상 산성 시약 대신에 구연산 등의 고형상 산성 시약을 함침시킨 면역크로마토그래피 시험편을 사용하는 방법도 존재하지만(특허문헌 2), 장기의 보존 안정성에 적합하지 않고, 비특이적인 반응이 생기는 등의 문제가 있었다.
국제공개 WO2005/121794호 공보 일본공표특허 제2008-509384호 공보
본 발명의 목적은, 보다 효율적으로 당사슬 항원을 추출하기 위하여, 당사슬 항원의 추출 공정을 여과 공정에서 행하는 것에 의해, 아질산 추출의 조작을 간편화하고, 또한 종래의 아질산 추출법과 비교해도 성능에 손색없이 정확하게, 당사슬 항원을 특이적으로 측정하는 것을 가능하게 하는 면역크로마토그래피 시험편 및 검체 첨가용 디바이스, 및 그것을 이용한 면역크로마토그래피법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은, 당사슬 항원을 추출하고, 면역크로마토그래피 시험편을 이용하여 측정함에 있어서, 추출에 필요한 공정수가 많아지지 않도록, 아질산염 및 산성 시약을 사용하여 당사슬 항원을 추출하는 방법에 대하여 예의(銳意) 검토를 행하였다. 면역크로마토그래피 시험편을 이용하여 피검 물질을 측정할 때, 미리 필터 등을 포함하는 검체 첨가용 디바이스를 이용하여 피검출 물질이 포함되는 시료를 여과하는 경우가 있지만, 이 디바이스 중에서 당사슬 항원을 추출하는 것에 의해, 신속·간편하게 측정할 수 있는 것을 발견하였다. 또한, 이 때, 산성 시약을 다공질 재료에 건조시킨 상태로 포함시키고 그 다공질 재료를 디바이스 중에 포함시키는 것에 대하여 검토를 행하였다. 그러나, 염산이나 아세트산 등의 액상 산성 시약은 건조 상태의 다공질 재료 상에서는 휘발하여 소실되므로, 다공질 재료 상에는 정착되지 않고, 충분한 아질산 추출이 행해지지 않는 것에 착안하였다. 그래서, 주석산, 사과산, 말론산, 말레산, 구연산 등의 고형상 산성 시약을 사용하는 것에 의해 산성 시약을 건조 상태의 다공질 재료 상에서도 휘발하지 않고 정착시켜, 종래의 미리 아질산나트륨과 액상 산성 시약에 2액을 혼합한 아질산 추출액으로 처리한 후에 중화하는 방법과 비교하여, 신속·간편하게 측정할 수 있고, 또한 성능도 손색없이 측정하는 것이 가능하며, 또한 상기 고형상 산성 시약 중에서도 주석산을 사용함으로써, 충분히 항원을 추출할 수 있고, 보존성이 안정되고, 또한 비특이적인 반응이 생기기 어려운 것을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명은, 당사슬 항원을 측정하는 면역크로마토그래피 시험법으로서, 검체와 아질산염 용액을 혼합한 후, 고형상 산성 시약으로서 주석산을 접촉시키는 공정이 여과 공정으로 행해지는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
본 발명은 이하와 같다.
[1] 당사슬 항원을 측정하는 면역크로마토그래피 시험법으로서, 검체와 아질산염 용액을 혼합한 후, 주석산을 접촉시키고, 검체 중의 당사슬 항원을 추출하는 공정이 여과 공정으로 행해지는 방법
[2] 여과 공정이, 주석산을 함침시킨 다공질 재료 및 필터를 포함하는 검체 첨가용 디바이스 중에서 행해지는, [1]의 방법
[3] 검체와 아질산염 용액을 혼합한 후, 주석산을 접촉시키는 공정 후의 중화 공정이 면역크로마토그래피 시험편과 분리된 부위에서 행해지는, [1] 또는 [2]의 방법
[4] 검체와 아질산염 용액을 혼합한 후, 주석산을 접촉시키는 공정 후의 중화 공정이, 면역크로마토그래피 시험편 상에서 행해지는, [1] 또는 [2]의 방법
[5] 중화 시약이 트리스히드록실메틸아미노메탄 또는 수산화나트륨인, [1]∼[4] 중 어느 하나의 면역크로마토그래피법에 의해 검체 중의 당사슬 항원을 측정하는 방법
[6] 당사슬 항원이 원생동물, 진균, 세균, 마이코플라스마, 리케차, 클라미디아 또는 바이러스의 당사슬 항원인, [1]∼[5] 중 어느 하나의 면역크로마토그래피법에 의해 검체 중의 당사슬 항원을 측정하는 방법
[7] 당사슬 항원을 측정하는 면역크로마토그래피 시험편과 주석산을 함침시킨 다공질 재료 및 필터를 포함하는 검체 첨가용 디바이스를 가지는 키트
[8] 검체 첨가용 디바이스에 중화 시약을 더 함침시킨 다공질 재료가 포함되는, [7]의 키트
[9] 중화 시약이 트리스히드록실메틸아미노메탄 또는 수산화나트륨인, [7] 또는 [8]의 키트
[10] 당사슬 항원이 원생동물, 진균, 세균, 마이코플라스마, 리케차, 클라미디아 또는 바이러스의 당사슬 항원인, [7]∼[9] 중 어느 하나의 키트
본 명세서는 본원의 우선권의 기초인 일본특허출 제2016-115697호의 명세서 및/또는 도면에 기재되는 내용을 포함한다.
본 발명의 면역크로마토그래피 시험편 및 검체 첨가용 디바이스를 이용하면, 종래의 미리 아질산염과 액상 산성 시약에 2액을 혼합한 아질산 추출액으로 처리한 후에 중합하는 방법과 비교하여, 신속·간편하게 측정할 수 있고, 또한 성능도 손색없이 측정할 수 있다.
[도 1] 여과 공정에서 당사슬 항원의 추출을 행하기 위한, 여과용의 검체 첨가용 디바이스의 구조를 나타내는 도면이다.
[도 2] 중화 시약 영역을 가지는 면역크로마토그래피 시험편(제1 예)의 구조를 모식적으로 나타내는 도면이다.
[도 3] 중화 시약 영역을 가지는 면역크로마토그래피 시험편(제2 예)의 구조를 모식적으로 나타내는 도면이다.
본 발명은, 당사슬 항원의 아질산 추출 처리를 여과 공정에서 행함으로써 간편화하고, 피검출 물질인 당사슬 항원을 신속하고 또한 정확하게 측정하는 것을 가능하게 하는 방법에 관한 것이다.
이하에, 본 발명의 방법에 대하여, 보다 구체적인 순서의 일례를 제시하여, 본 발명을 설명한다.
(1) 바이러스나 세균 등에 감염된 환자의 인두 또는 비강 등으로부터 채취한 검체를 후술하는 바와 같은 아질산염 용액에 부유시킨다.
(2) 이 아질산염 부유액(시료)을 여과 수단에 의해 여과하고, 여과 시에 산성 시약으로 처리하여 당사슬 항원을 추출한다.
(3) 이 여과액을, 면역크로마토그래피 시험편에 적가(滴加)하여, 당사슬 항원의 유무를 검출하는 것에 의해, 검체 중의 피검출물의 유무를 측정한다.
상기 순서는 일례이고, 상기 순서에 한정되지 않는다.
본 발명의 여과 공정은 검체 첨가용 디바이스에서 행해진다. 검체 첨가용 디바이스는 면역크로마토그래피 시험편 외의 부속 부품이고, 채취한 검체의 아질산 처리를 행하기 위한 용기로서도 이용할 수 있다. 당사슬 항원 추출을 위한 검체의 아질산 처리는 검체를 아질산염과 혼합하고, 산성 시약을 더 혼합하는 것에 의해, 아질산을 생성시켜 행한다. 이를 위해, 시료 첨가용 디바이스에는, 미리 아질산염 용액이 넣어 있어도 된다. 또는, 미리 검체를 아질산 용액과 혼합하고, 혼합액을 검체 첨가용 디바이스에 넣어도 된다. 상기 디바이스에는 바이알, 시린지, 튜브 등이 포함된다. 또한, 상기 디바이스는 용기뿐만 아니라, 검체를 면역크로마토그래피 시험편에 첨가 공급할 때 검체를 여과하기 위한 여과 수단을 포함하고 있다. 검체 첨가용 디바이스는, 검체와 아질산염 용액을 수용하는 용기 부분과 용기 내의 검체를 면역크로마토그래피 시험편에 첨가 공급하는 부분을 포함한다. 후자의 검체를 첨가 공급하는 부분은, 검체를 용기 내로부터 배출하기 위한 노즐(개구부)을 가지는 부분을 가지고, 이 부분은 용기 부분의 커버를 겸할 수도 있다. 후자의 검체를 면역크로마토그래피 시험편에 첨가 공급하는 부분은, 노즐 부분 또는 커버 부분이라고도 한다. 또한, 검체 첨가용 디바이스가 여과 수단을 포함하는 경우, 후술하는 바와 같이 검체 첨가용 디바이스는 여과 필터를 포함하는 필터 하우징으로 이루어지는 노즐 부분과 용기 부분의 2개의 부품으로 구성되어 있어도 된다. 이 경우의 필터 하우징은, 검체를 필터에 통과시키는 개구부와 필터를 통과한 검체를 배출하는 개구부를 가지고, 양쪽 개구부의 사이에 필터가 존재한다. 용기는 예를 들면, 검체를 필터에 압력을 가하여 통과시킬 수 있는 시린지 등을 이용하면 된다.
아질산 처리에 필요한 산성 시약은 검체 첨가용 디바이스에 미리 포함시켜 두어도 되고, 검체의 아질산 처리를 행할 때 첨가해도 된다.
산성 시약으로서는 고형상 산성 시약이 사용된다.
본 발명에서 사용되는 고형상 산성 시약은 상온에서 고형상인 것이고, 고온에서 휘발하지 않는 성질을 가지고, 또한 면역크로마토그래피 시험편 상에서 착색되지 않는 시약, 구체적으로는 건조 상태에서 백색 또는 건조 열이나 산화로 착색되기 어려운 시약이 바람직하다.
또한, 항원 추출 능력이라는 관점에서는, 가수가 많은 산을 이용하면 보다 적은 양으로 추출할 수 있다. 또한, 같은 가수이면 보다 산 해리상수가 작은 시약 쪽이 효율적으로 항원을 추출할 수 있다.
이들 특성을 가지는 고형상 산성 시약으로서는 주석산, 말론산, 사과산, 말레산, 구연산 등을 들 수 있으나, 본 발명에 있어서 상기 특성을 모두 가지고, 또한 액상 산성 시약과 동등한 항원 추출 능력을 가지는 고형상 산성 시약은 주석산뿐이다.
주석산은 다공질 재료에 함침시키고 건조시켜 사용한다. 다공질 재료로서는, 일반적으로 사용되는 여과지, 유리 섬유, 부직포 등을 사용할 수 있다.
주석산을 다공질 재료에 함침시키기 위해서는, 주석산을 한번 용해시켜 도포하고 건조시킨다.
본 발명에 사용되는 주석산의 사용량, 즉 다공질 재료에 함침시키는 양은 특별히 한정되지 않지만, 통상, 면역크로마토그래피 시험편의 1시험편당 0.01㎍∼1㎎ 정도이고, 바람직하게는 0.1㎍∼0.1㎎ 정도이다. 다만, 검체 부유액의 조성이나 적가량 등에 의해 효과를 얻을 수 있는 최적인 양을 선택하는 것이 바람직하다.
도 1에는 여과 수단과 주석산을 포함하는 검체 첨가용 디바이스의 예를 제시하지만, 본 발명의 검체 첨가용 디바이스는 도 1에 나타낸 것에는 한정되지 않고, 검체를 수용할 수 있고, 검체를 면역크로마토그래피 시험편의 검체 첨가 부위에 첨가할 수 있는 디바이스라면 어떠한 형태의 것도 포함된다. 도 1의 검체 첨가용 디바이스 중, 아래 부분이 검체를 수용하는 용기 부분이고, 윗 부분이 검체 첨가 노즐을 가지는 용기의 커버 부분(노즐 부분이라고도 함)이며, 이 커버 부분에 필터를 세팅할 수 있다.
도 1의 A는 여과 수단인 여과 필터와 주석산을 포함시킨 다공질 재료가 접촉하지 않고 분리되어 있고, 여과 필터보다도 상류 측에 주석산을 포함시킨 다공질 재료가 존재한다. 이 경우, 주석산을 포함시킨 다공질 재료는 디바이스 내부, 예를 들면 용기부 내부에 적당한 고정 수단에 의해 고정해 두어도 되고, 고정하지 않고 넣어 두어도 된다. 또는, 아질산 처리를 행할 때 디바이스에 첨가해도 된다. 여기에서, 상류란 검체 첨가용 디바이스를 이용하여 검체를 첨가할 때의 상기 디바이스에 수용한 검체 유체의 흐름에 관한 상류를 말하고, 디바이스 중에 있어서 검체 첨가 노즐로부터 보다 떨어진 부분을 상류라고 하고, 검체 첨가 노즐에 가까운 부분을 하류라고 한다. 도 1의 A의 디바이스를 이용할 때는, 디바이스 중의 아질산염 용액에 검체를 넣고, 전도(轉倒) 혼화하여 검체와 아질산염 용액과 다공질 재료 중의 주석산을 접촉 혼합하는 것에 의해, 검체의 아질산 처리가 행해진다. 또한, 검체와 아질산 용액을 미리 혼합하고, 혼합액을 디바이스 중의 주석산을 수용한 용기에 첨가하여, 검체와 아질산염 용액과 다공질 재료 중의 주석산을 접촉 혼합할 수도 있다. 얻어진 혼합물은 필터를 통과하여 노즐 부분부터 면역크로마토그래피 시험편에 첨가된다.
도 1의 B는, 여과 필터와 주석산을 포함시킨 다공질 재료가 접촉하여 일체화되어 있고, 주석산을 포함시킨 다공질 재료는 필터의 상류 측에 형성되어 있다. 상기 디바이스에 있어서는, 주석산을 포함시킨 다공질 재료를 1층 또는 복수 층의 필터로 이루어지는 여과 필터의 1층으로서 포함할 수 있다. 도 1의 B에 나타내는 디바이스에 있어서는, 디바이스 하부의 용기 중에 아질산염 용액이 포함되어 있고, 최초로 검체가 아질산 용액과 혼합된다. 혼합한 검체를 면역크로마토그래피 시험편에 첨가할 때 검체가 주석산을 포함시킨 다공질 재료를 통과하고, 이 때 함침한 주석산이 검체 중에 용해된다. 검체와 주석산이 접촉 혼합되는 것에 의해, 검체의 아질산 처리가 행해진다. 이 혼합물은 필터를 통과하여 노즐 부분부터 면역크로마토그래피 시험편에 첨가된다.
도 1의 C는, 여과 필터와 주석산을 포함시킨 다공질 재료가 접촉하여 일체화되어 있고, 주석산을 포함시킨 다공질 재료는 필터의 하류 측에 형성되어 있다. 도 1의 C에 나타내는 디바이스에 있어서는, 디바이스 하부의 용기 중에 아질산염 용액이 포함되어 있고, 최초로 검체가 아질산 용액과 혼합된다. 혼합한 검체를 면역크로마토그래피 시험편에 첨가하면, 혼합한 검체는 필터를 통과하여, 주석산을 포함시킨 다공질 재료를 통과하고, 이 때에 함침한 주석산이 검체 중에 용해된다. 검체와 주석산이 접촉 혼합되는 것에 의해, 검체의 아질산 처리가 행해진다. 이 혼합물은 필터를 통과하여 노즐 부분부터 면역크로마토그래피 시험편에 첨가된다.
도 1의 D는, 여과 수단인 여과 필터와 주석산을 포함시킨 다공질 재료가 접촉하지 않고 분리되어 있고, 여과 필터보다 하류 측에 주석산을 포함시킨 다공질 재료가 존재한다. 도 1의 D의 디바이스에 있어서, 필터와 노즐 사이에 적당한 공간을 형성하고 그 공간 내에 주석산을 넣은 다공질 재료를 포함시키면 된다. 디바이스 하부의 용기 중에 아질산염 용액이 포함되어 있고, 최초로 검체가 아질산 용액과 혼합된다. 혼합한 검체를 면역크로마토그래피 시험편에 첨가할 때 검체는 필터를 통과하여, 주석산을 포함시킨 다공질 재료가 존재하는 공간에서 주석산과 검체가 접촉 혼합되는 것에 의해, 검체의 아질산 처리가 행해진다. 검체는 상기 공간 내에 일시적으로 저류(貯留)하기 때문에 검체와 주석산을 포함시킨 다공질 재료의 접촉 시간을 길게 할 수 있고, 검체와 주석산의 충분한 접촉이 달성된다. 그리고, 이 때 공간 부분과 디바이스 외측을 연락하는 공기 구멍을 형성해 두는 것이 바람직하다. 이를 위해서는, 도 1의 D에 나타낸 바와 같이, 노즐 부분과 필터를 포함한 부분을 별체로 하면 된다. 검체와 주석산의 혼합물을 면역크로마토그래피 시험편에 첨가할 때는, 노즐 부분을 필터 포함 부분에 내리누르면 되고, 공기 구멍이 막아지는 동시에 노즐로부터 검체가 적가된다(도 1의 E). 이와 같이, 여과 수단에 주석산을 포함하는 것에 의해 시료와 주석산의 접촉 혼합과 여과가 하나의 공정에서 대략 동시에 행할 수 있다. 또한, 검체 첨가용 디바이스에 주석산을 넣은 여과 수단을 포함시킴으로써, 검체 중과 주석산과의 접촉 혼합, 불순물의 여과, 및 검체와 주석산의 혼합물의 면역크로마토그래피 시험편으로의 첨가를 하나의 공정에서 거의 동시에 행할 수 있다. 여기에서, 「하나의 공정에서 행할 수 있다」란 검체의 첨가라는 하나의 조작으로, 검체와 아질산염 용액과 주석산의 접촉 혼합과 여과, 또는 검체와 아질산염 용액과 주석산의 접촉 혼합, 불순물의 여과, 및 검체와 아질산염 용액과 주석산의 혼합물의 면역크로마토그래피 시험편으로의 첨가를 연속적으로 행할 수 있다는 의미이고, 이들을 동시에 행하는 것은 필요로 하지 않는다. 그리고, 주석산은, 사용할 때까지 빠지지 않도록 넣어 둘 필요가 있다.
검체 첨가용 디바이스의 크기는 한정되지 않지만, 예를 들면 높이 몇㎝, 가장 굵은 부분의 직경이 몇㎝ 정도이다. 디바이스 중에 포함시키는 필터, 주석산을 포함하는 다공질 재료, 중화 시약을 포함하는 다공질 재료의 크기도 한정되지 않지만, 예를 들면 원형의 경우, 직경 몇㎜∼몇㎝ 정도이다.
면역크로마토그래피 시험편은, 피검출 물질(항원 등)을 포착하는 항체(항체 1)가 고정화된 검출 영역을 가지는 지지체, 이동 가능한 표식 항체(항체 2)를 가지는 표식체 영역, 검체를 적가하는 샘플 패드, 전개된 검체액을 흡수하는 흡수대, 이들 부재를 하나에 접합시키기 위한 배킹 시트(backing sheet) 등을 구비한다.
본 발명의 면역크로마토그래피 시험편은, 저장 용기 내에 수용되어 있어도 되고, 상기 저장 용기에 의해, 예를 들면 자외선이나 공기 중의 습기에 의한 열화를 방지할 수 있다. 또한, 오염성, 감염성이 있는 검체 시료를 사용하는 경우, 저장 용기에 의해 어세이를 행하는 시험자가 오염 또는 감염하는 것을 방지할 수 있다. 예를 들면, 적당한 크기의 수지제 케이스를 저장 용기로서 사용하고, 이 케이스 내에 본 발명의 장치를 수납하면 된다. 또한, 항원 또는 항체를 고정화한 시험편의 표면을 수지제 필름 등(톱 라미네이트)으로 피복해도 된다. 저장 용기와 그 내에 수용된 시험편을, 일체로서 면역크로마토그래피 디바이스라고 하는 경우가 있다.
그리고, 검출 영역의 수 및 표식체 영역에 포함되는 표식 항체의 종류는 하나에 한정되지 않고, 복수의 피검출 물질에 대응하는 항체를 사용함으로써, 2개 이상의 항원을 동일한 시험편에 의해 측정할 수 있다.
지지체는, 피검출 물질(항원)을 포착하기 위한 항체를 고정화하는 성능을 가지는 재료이고, 또한 액체가 수평 방향으로 통행하는 것을 방해하지 않는 성능을 갖는다. 바람직하게는, 모세관 작용을 가지는 다공성 박막이고, 액체 및 그것에 분산된 성분을 흡수에 의해 수송 가능한 재료이다. 지지체를 이루는 재질은 특별히 한정되는 것은 아니고, 예를 들면 셀룰로오스, 니트로셀룰로오스, 셀룰로오스아세테이트, 폴리비닐리덴플루오라이드(PVDF), 유리 섬유, 나일론, 폴리케톤 등을 들 수 있다. 이 중 니트로셀룰로오스를 사용하여 박막으로 한 것이 보다 바람직하다. 항체를 고정화한 멤브레인을 항체 고정화 멤브레인이라고 한다.
표식체 영역은 표식 항체를 포함하는 다공성 기재(基材)로 이루어지고, 기재의 재질은 일반적으로 사용되고 있는 유리 섬유나 부직포 등을 사용할 수 있다. 상기기재는 다량의 표식 항체를 함침시키기 위해, 두께 0.3㎜∼0.6㎜ 정도의 패드형인 것이 바람직하다. 표식 항체를 함침시키고 건조시킨 다공성 기재를 건조 패드라고도 한다.
표식 항체의 표식에는, 알칼리 포스파타아제나 서양고추냉이 페록시다아제와 같은 효소, 금 콜로이드와 같은 금속 콜로이드, 실리카 입자, 셀룰로오스 입자, 착색 폴리스티렌 입자 및 착색 라텍스 입자 등이 사용되는 경우가 많다. 금속 콜로이드 입자, 착색 폴리스티렌 입자나 착색 라텍스 입자 등의 착색 입자를 사용하는 경우에는, 이들 표식 시약이 응집함으로써 착색이 생기므로, 이 착색을 측정한다. 항체를 고정화한 입자를 항체 고정화 입자라고 한다.
검출 영역은, 피검출 물질(항원)을 포착하는 항체가 고정화된 지지체의 일부 영역을 가리킨다. 검출 영역은, 항원을 포착하기 위한 항체를 고정화한 영역을 적어도 하나 형성한다. 검출 영역은 지지체에 포함되어 있으면 되고, 지지체 상에 항체를 고정화하면 된다.
샘플 패드는 검체를 적가하기 위한 부위이고, 다공성 재료이다. 샘플 패드는 면역크로마토그래피 시험편의 가장 상류에 있는 부위다. 상기 재료로는 일반적으로 사용되는 여과지, 유리 섬유, 부직포 등을 사용할 수 있다. 다량의 검체를 면역 측정에 사용하기 위해, 두께 0.3㎜∼1㎜ 정도의 패드형인 것이 바람직하다. 검체에는, 검체를 다른 용액에 부유하여 얻어지는 시료 등, 검체를 이용하여 조제된 시료도 포함한다.
흡수대는, 지지체에 공급되어 검출 영역에서 반응에 관여하지 않았던 성분을 흡수하기 위한 부재이다. 상기 재료에는 일반적인 천연 고분자 화합물, 합성 고분자 화합물 등으로 이루어지는 보수성이 높은 여과지, 스폰지 등을 사용할 수 있으나, 검체의 전개 촉진을 위해서는 흡수성이 높은 것이 바람직하다.
배킹 시트는 전술한 모든 재료, 즉 지지체, 샘플 패드, 표식체 영역, 흡수대 등이, 부분적인 중첩에 의해 첩부·고정되기 위한 부재이다. 배킹 시트는, 이들 재료들이 최적인 간격으로 배치·고정되는 것이면 반드시 필요하지 않지만, 제조상 또는 사용상의 접근성으로부터, 일반적으로는 사용한 쪽이 바람직하다.
본 발명의 면역크로마토그래피 장치에는, 대조 표시 영역(부재)이 더 존재하고 있어도 된다. 대조 표시 영역은 시험이 정확하게 실시된 것을 나타내는 부위다. 예를 들면, 대조 표시 영역은 검출 영역의 하류에 존재하고, 검체 시료가 검출 영역을 통과하고, 대조 표시 영역에 도달했을 때 착색 등에 의해 시그널을 발한다. 대조 표시 영역에는, 표식 담체를 결합시킨 항체에 결합하는 물질을 고상화해 두어도 되고, 검체가 도달했을 때 색이 변화되는 pH 인디케이터 등의 시약을 고상화해 두어도 된다. 표식 담체를 결합시킨 항체가 마우스 모노클로널 항체인 경우, 항마우스 IgG 항체를 이용하면 된다.
면역크로마토그래피 시험편의 크기는 한정되지 않지만, 예를 들면 세로의 길이 몇㎝∼십몇㎝, 가로의 길이 몇㎜∼몇㎝ 정도이다.
상기 형태의 시험편에 있어서, 검체는 샘플 패드, 표식체 영역, 지지체, 검출 영역, 흡수대의 일련의 접속에 의해 형성된 다공성 유로를 통과한다. 따라서, 본 형태에 있어서는, 이들 모두가 검체 이동 영역으로 된다. 각 구성 재료의 재질이나 형태에 의해, 검체가 재료 내부를 침투하지 않고 계면을 통행하는 형태도 있을 수 있지만, 본 명세서에서 정의한 검체 이동 영역은 재료의 내부인지 계면인지를 불문하기 때문에, 상기 형태의 시험편도 본 명세서의 범위에 포함된다.
본 발명의 면역크로마토그래피 시험편 및 검체 첨가용 디바이스를 이용하여, 당사슬 항원을 추출하여 측정하는 경우, 아질산염 용액과 주석산을 사용하여 아질산을 생성시켜 당사슬 항원을 추출한다. 추출 당사슬 항원 용액은 산성이므로, 그대로로는 항원 항체 반응이 저해되어 버리므로, 주석산 용액을 중화할 필요가 있다. 주석산 용액의 중화에는 중화 시약을 사용한다. 중화 시약은 면역크로마토그래피 시험편 상에 포함시켜도 되고, 전술한 검체 첨가용 디바이스 중에 포함시켜도 된다. 즉, 중화 공정은 면역크로마토그래피 시험편 상에서 행해지거나, 또는, 검체 첨가용 디바이스 내 등의 면역크로마토그래피 시험편과 분리된 부위에서 행해진다.
중화 시약은 샘플 패드에 함침시켜도 되고, 지지체에 함침시켜도 되고, 지지체와는 별도의 부직포 등의 다공질 재료에 함침시켜, 얻어진 중화 시약 함침 다공질 재료를 표식체 영역보다도 상류에 배치해도 된다. 또는, 중화 시약을 함침시킨 면역크로마토그래피 시험편 상의 영역을 중화 시약 영역 또는 염기성 시약 영역이라고 한다.
중화 시약 영역을 가지는 면역크로마토그래피 시험편은, 지지체 상에 상류로부터 샘플 패드, 중화 시약 영역, 표식체 영역, 검출 영역 및 흡수대를 갖는다. 또한, 샘플 패드, 중화 시약 영역, 표식체 영역, 검출 영역 및 흡수대는 이웃하는 영역끼리 접촉하고 있어도 되고, 접촉하지 않아도 된다. 또한, 중화 시약 영역, 표식체 영역은 반드시 별도의 다공성 재료에 함침할 필요는 없고, 복수 또는 모든 영역을 동일한 다공성 재료에 함침하고 있어도 된다.
중화 시약을 검체 첨가용 디바이스에 포함시키는 경우에는, 중화 시약을 다공질 재료에 함침시키고, 건조시켜 사용한다. 다공질 재료로서는, 일반적으로 사용되는 여과지, 유리 섬유, 부직포 등을 사용할 수 있다. 건조시킨 중화 시약을 포함시킨 다공질 재료를, 주석산을 포함시킨 다공질 재료의 하류에 위치하도록 포함시키면 된다. 예를 들면, 도 1의 A에 나타내는 검체 첨가용 디바이스에 있어서는, 필터가 존재하는 부분에 중화 시약을 포함시킨 다공질 재료를 형성하면 된다. 또한, 도 1의 B에 나타내는 검체 첨가용 디바이스의 경우도, 주석산을 포함시킨 다공질 재료의 하류 필터가 존재하는 부분에 중화 시약을 포함시킨 다공질 재료를 형성하면 된다. 도 1의 C에 나타내는 검체 첨가용 디바이스나 도 1의 D에 나타내는 검체 첨가용 디바이스의 경우에는, 주석산을 포함시킨 다공질 재료가 검체 첨가용 디바이스의 최하류 부근에 형성되어 있다. 노즐에 중화 시약을 함유시킨 다공질 재료를 형성하는 것도 가능하지만, 바람직하게는 면역크로마토그래피 시험편 상에 형성한다.
본 발명에 사용되는 중화 시약은 상온에서 고형상인 것이고, 고온에서 휘발하지 않는 것이다.
본 발명에 사용되는 바람직한 중화 시약으로서는, 트리스(트리스히드록실메틸아미노메탄), 수산화나트륨, 인산수소이칼륨, 구연산삼나트륨, 알칼리 영역에 완충능을 가지는 굿 완충제(Good buffers)를 들 수 있다.
본 발명에 사용되는 중화 시약의 사용량, 즉 면역크로마토그래피 시험편에 함침시키는 양은 특별히 한정되지 않지만, 통상, 다공질 재료당, 또는 면역크로마토그래피 시험편의 1시험편당 0.01㎍∼1㎎ 정도이고, 바람직하게는 0.1㎍∼0.1㎎ 정도이다. 다만, 사용하는 중화 시약의 종류, 검체 부유액의 조성이나 적가량 등에 의해 효과가 얻어지는 최적인 양을 선택하는 것이 바람직하다.
중화 시약을 샘플 패드 또는 다공질 재료에 함침시키기 위해서는, 중화 시약을 한번 용해시켜, 용액을 샘플 패드 또는 다공질 재료에 도포하고, 그 후 건조시키면 된다.
도 2 및 도 3은, 전형적인 면역크로마토그래피 시험편의 바람직한 하나의 형태를 나타내는 도면이다. 도 2에 나타내는 면역크로마토그래피 시험편을 제1 예라고 하고, 도 3에 나타내는 면역크로마토그래피 시험편을 제2 예라고 한다. 그리고, 면역크로마토그래피 시험편은, 도 2 및 도 3에 나타내는 것에 한정되는 것은 아니다. 도 2 및 도 3 중, 도면부호 9가 지지체, 도면부호 10이 표식체 영역, 도면부호 11이 검출 영역, 도면부호 12 및 도면부호 13이 샘플 패드, 도면부호 14가 흡수대, 도면부호 15가 배킹 시트를 가리키고 있다. 또한, 시험편 전체의 위에 톱 라미네이트를 부착해도 된다.
도 2의 A 및 도 3의 A가 상면도, 도 2의 B 및 도 3의 B가 절단 단면도이다. 도 2의 예에서는, 수지 등으로 된 배킹 시트(15) 상에 1개의 검출 영역(11)이 형성된 지지체(9), 흡수대(14), 표식체 영역(10), 샘플 패드(12·13) 등이 각각 적층되어 있다. 그리고, 도 3에 나타낸 바와 같이, 흡수대(14)의 한쪽 단부와 지지체(9)의 한쪽 단부, 지지체(9)의 다른 쪽 단부와 표식체 영역(10)의 한쪽 단부, 표식체 영역(10)의 다른 쪽 단부와 샘플 패드(13)의 한쪽 단부가 각각 중첩되어 있고, 샘플 패드(13)의 상류부에 주석산이 함침되고, 조금 사이를 떼어서 샘플 배드의 하류부에 중화 시약이 함침된 중화 시약 영역이 존재한다. 도 2의 예에서는, 표식체 영역(10)의 상류에 중화 시약 영역(13)이 존재하고, 이들이 중첩되어 있고, 이에 의해 연속한 래터럴 플로우의 유로가 형성되어 있다. 도 3에 나타내는 시험편에 있어서는, 중화 시약 영역(13)이 샘플 패드를 겸하고 있다. 즉, 중화 시약 영역이 샘플 패드 상에 존재한다. 중화 시약 영역의 상류에 샘플 패드가 더 존재해도 된다.
그리고, 중화 시약을 검체 첨가용 디바이스에 형성하는 경우에는, 면역크로마토그래피 시험편 상에 중화 시약 영역을 형성할 필요는 없다.
도 1의 A 또는 도 1의 B의 검체 첨가용 디바이스와 도 2에 나타내는 중화 영역을 가지는 면역크로마토그래피용 시험편을 이용하여 당사슬 항원을 측정하는 방법에 대하여 설명한다. 도 1의 A의 검체 첨가용 디바이스를 이용하는 경우에는, 검체 또는 검체를 이용하여 조제된 시료를 아질산염 용액과 접촉 혼합시키고, 검체를 아질산염 용액에 부유시켜, 검체 첨가용 디바이스에 첨가하는 것에 의해 개시된다. 이 때 검체 5∼100μL와 0.1M∼8M의 아질산염 0.01∼2mL을 혼합하고, 검체 첨가용 디바이스에 첨가하면 된다. 아질산염으로서, 아질산나트륨, 아질산칼륨 등을 들 수 있다. 도 1의 B의 검체 첨가용 디바이스를 이용하는 경우에는, 검체 첨가용 디바이스의 용기 부분에 미리 아질산염 용액이 넣어져 있고, 거기에 검체를 첨가한다. 검체 첨가용 디바이스의 용기 부분에 0.1M∼8M의 아질산염 0.01∼2mL를 넣어 두고, 거기에 검체 5∼100μL를 첨가하면 된다.
검체 첨가용 디바이스 중의 검체를 노즐로부터 면역크로마토그래피용 시험편의 샘플 패드(12)에 적가할 때, 검체는 필터를 통과하고, 또한 다공질 재료에 포함시킨 주석산과 접촉 혼합된다. 검체에 혼합한 아질산염과 주석산이 반응하여, 유리된 아질산이 발생하고, 그 아질산의 작용에 의해 검체로부터 당사슬 항원이 추출된다. 추출된 당사슬 항원을 포함하는 검체는, 면역크로마토그래피 시험편에 첨가된다. 검체 첨가용 디바이스 중에 중화 시약이 포함되는 경우에는, 검체는 면역크로마토그래피 시험편에 첨가되기 전에 중화되고, 면역크로마토그래피 시험편 상에 중화 시약이 포함되는 경우에는, 검체는 면역크로마토그래피 시험편 상에서 중화된다.
중화 시약 영역을 포함하는 면역크로마토그래피 시험편을 이용하는 경우, 샘플 패드(12)에 제공된 피검출 물질인 당사슬 항원을 포함하는 검체는 모관작용에 의해, 샘플 패드(12) 및 중화 시약 영역(13)으로 전개되고, 또한 표식체 영역(10), 지지체(9), 흡수대(14)로 순차적으로, 수평 방향으로 전개된다. 추출된 당사슬 항원은 산성의 전개 용액과 함께 중화 시약 영역(13)에 전개 이동하고, 중화 시약 영역(13)으로 당사슬 항원을 포함하는 산성의 전개 용액의 pH가 중화되어 중성 영역으로 조정된다. 그 결과, 당사슬 항원은 중성 조건 하에서 하류로 더 전개 이동한다. 표식체 영역(10)에서는 검체 시료의 전개와 함께 표식 항체가 액중에 방출되어 지지체(9)로 전개된다. 검체 시료 중에 당사슬 항원이 존재하는 경우에 있어서, 지지체(9)의 검출 영역(11)에서는 포착 항체에 의해 당사슬 항원이 특이적으로 포착되고, 또한 당사슬 항원은 표식 항체와도 특이적 반응에 의해 복합체를 형성한다. 이에 의해, 검출 영역에서는 당사슬 항원을 통한 항체의 샌드위치가 성립하고, 표식 항체-당사슬 항원 복합물을 검출 영역(11)에 의해 측정할 수 있다.
본 발명의 면역크로마토그래피 시험편을 사용한 방법에 의하면, 검체 중의 당사슬 항원의 추출은 검체 첨가용 디바이스 중에서 행해지므로, 면역크로마토그래피 시험편 및 검체 첨가용 디바이스를 이용한 측정 전에 미리 검체 중의 당사슬 항원을 추출할 필요는 없고, 1스텝에서 검체 중의 당사슬 항원을 측정할 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 검체가 되는 생체 시료는 특별히 한정되지 않지만, 혈청, 혈장, 혈액, 소변, 대변, 타액, 조직액, 수액(髓液), 채취액 등의 체액 등 또는 그 희석물을 들 수 있다. 본 발명의 방법에서 이용하는 검체 첨가용 디바이스에는 여과 수단이 포함되어 있으므로, 고형물 등이 포함되고 여과가 필요해지는, 인두 또는 비강 채취액, 인두 또는 비강 세정액, 비강 흡인액, 타액, 직장 채취액, 대변, 대변 현탁액, 각막 채취액 등이 바람직하게 사용된다.
본 발명의 면역크로마토그래피 시험편을 이용한 방법에 있어서, 측정 대상이 되는 피검출 물질은 면역 어세이, 즉 항원 항체 반응을 이용한 어세이에서 측정할 수 있는 당사슬 항원이다. 항원으로서는 아질산 추출 처리에 의해 추출되는 세균의 세포벽에 존재하는 당사슬 항원인 다당체 등을 들 수 있다. 이들 물질을 포함하는 원생동물, 진균, 세균, 마이코플라스마, 리케차, 클라미디아, 바이러스 등도 측정할 수 있다. 본 발명의 면역크로마토그래피 시험편을 이용한 방법에 의해, 피험체의 생체 시료 중에 원생동물, 진균, 세균, 마이코플라스마, 리케차, 클라미디아, 바이러스 등에 유래하는 당사슬 항원이 포함되어 있는지 여부를 확인할 수 있고, 당사슬 항원이 포함되어 있는 경우, 피험체는 원생동물, 진균, 세균, 마이코플라스마, 리케차, 클라미디아, 바이러스 등에 의한 감염증에 감염되어 있다고 판단할 수 있다. 예를 들면, A군 β용혈성 연쇄상구균(Streptococcus pyogenes), 대장균, 레지오넬라, 캄필로박터 등의 감염 유무를 검출할 수 있다.
[실시예]
이하, 본 발명을 실시예에 기초하여 보다 구체적으로 설명한다. 다만, 본 발명은 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 종래법과 본 발명법에 의한 효과
1. 항Streptococcus pyogenes(A군 β용혈성 연쇄상구균) 항체의 니트로셀룰로오스 멤브레인으로의 고정화
항Streptococcus pyogenes 항체를 1.0mg/mL로 되도록 정제수로 희석한 용액 및 항-토끼 IgG 항체를 준비하고, PET 필름으로 배접된 니트로셀룰로오스 멤브레인의 샘플 패드측에 항Streptococcus pyogenes 항체, 흡수대 측에 항-토끼 IgG 항체를 각각 선형으로 도포하였다. 그 후, 니트로셀룰로오스 멤브레인을 45℃, 30분간 건조시키고, 항Streptococcus pyogenes 항체 고정화 멤브레인을 얻었다. 이 멤브레인을 본 실시예에서, 「항체 고정화 멤브레인」이라고 한다.
2. 항Streptococcus pyogenes 항체의 착색 폴리스티렌 입자로의 고정화
항Streptococcus pyogenes 항체를 1.0mg/mL로 되도록 정제수로 희석하고, 이것에 착색 폴리스티렌 입자를 0.1%로 되도록 더하고, 교반한 후, 카르보디이미드를 1%로 되도록 더하여, 더 교반한다. 원심 조작에 의해 상청을 제거하고, 50mM Tris(pH9.0), 3% BSA에 재부유하여, 0.04% 항Streptococcus pyogenes 항체 결합 착색 폴리스티렌 입자 부유액을 얻었다. 이 입자를 본 실시예에서 「항체 고정화 입자」라고 한다.
3. 항Streptococcus pyogenes 항체 결합 착색 폴리스티렌 입자의 도포·건조
2.에서 제작한 항체 고정화 입자 부유액을 부직포에 소정량을 도포하고, 45℃, 30분간 건조시켰다. 얻어진 부직포를 본 실시예에서 「건조 패드」라고 한다.
4. 중화 시약(염기성 시약) 함침 부직포의 제작
중화 시약(염기성 시약)으로서, 2M 트리스(Trizma Base)를 15μL/㎝로 부직포에 도포하였다. 도포 후에 즉시 45℃, 1시간, 건조하여, 중화 시약 함침 부직포를 얻었다.
5. 산성 시약 함침 부직포의 제작
산성 시약으로서 1M 염산, 1M 아세트산, 1M 말론산, 1M 사과산, 1M 말레산, 1M 구연산, 1M 주석산을 3.75μL씩 부직포에 도포하였다. 도포 후에 즉시 45℃, 1시간, 건조하여, 산성 시약 함침 부직포를 얻었다.
6. Streptococcus pyogenes 시험편의 제작
1.에서 제작한 항체 고정화 멤브레인, 3.에서 제작한 건조 패드, 4.에서 제작한 중화 시약(염기성 시약) 함침 부직포를 다른 부재(배킹 시트, 흡수대)와 서로 부착하여 5㎜ 폭으로 절단하고, Streptococcus pyogenes 시험편으로 하였다. 또한, 5.에서 제작한 산성 시약 함침 부직포를 시료 여과 필터에 넣은 노즐을 가지는 디바이스와 중화 시약(염기성 시약) 함침 부직포를 샘플 패드로서 사용한 시험편을 본 실시예에서, 「본 발명 시험 디바이스」 및 「본 발명 시험편」이라고 한다. 「본 발명 시험 디바이스」의 구조는 도 1의 A, 「본 발명 시험편」의 구조는 도 2에 나타내는 바와 같다. 4.와 5.에서 제작한 산성 시약 및 중화 시약(염기성 시약) 함침 부직포 대신에 아무것도 도포되어 있지 않은 부직포를 사용하여 같은 시험편을 제작하고, 종래예로서 사용하였다. 아무것도 도포되어 있지 않은 부직포를 시료 여과 필터에 넣은 노즐 및 샘플 패드로서 사용한 시험편을 「종래법 시험 노즐」 「종래법 시험편」이라고 한다. 그리고, 시험편은 검체의 흐름을 따라서, 상류로부터 중화 시약(염기성 시약) 함침 부직포, 건조 패드(표식체 영역), 항체 고정화 멤브레인(검출 영역), 흡수대를 구비하는 것이다.
7. 검체
Streptococcus pyogenes를 배양하고, 배양액을 생리식염수로 균수 1.0×107CFU/mL과 0.25×107CFU/mL로 조제하였다.
또한, 음성 검체로서 생리식염수를 사용하였다.
8. 측정
검체 20μL를 아질산나트륨 용액(2M NaNO2) 180μL에 부유하고, 그 중 75μL를 본 발명 시험편에 적가하였다. 또한, 종래법으로서 아질산나트륨과 염산을 혼합한 아질산 추출액에 검체를 부유한 후, 트리스 용액으로 중화한 검체 부유액을 종래법 시험편에 50μL 적가하였다. 5분 후에 항Streptococcus pyogenes 항체를 고정화한 소정 위치 상의 착색 폴리스티렌 입자의 퇴적 유무와 그 정도를 육안으로 판정하였다. 그 선형의 퇴적 정도가 강한 것을 순차로 +++, ++, +로 하고, 판정이 어려운 경우를 ±, 퇴적이 보여지지 않은 것을 -로 하였다.
또한, 비교예로서, 종래법인 미리 아질산나트륨과 아세트산을 혼합한 아질산 추출 용액에 검체를 부유한 후, 중화한 검체를 종래법 시험 노즐에 의해 종래법 시험편에 적가하는 방법도 실시하였다.
9. 결과
[표 1]
Figure pct00001
표 1에 나타낸 바와 같이, 종래법과 비교하여 산성 시약으로서 염산, 아세트산은 Streptococcus pyogenes의 검출 감도가 현저하게 저하되었다. 이것은, 염산 및 아세트산은 휘발하는 성질을 가지므로, 산성 시약 함침 부직포를 작성할 때의 건조 공정에 있어서 휘발하는 것에 의해 도포량이 감소하고, 그 결과, 아질산 추출 처리가 불가능했기 때문으로 생각된다.
한편, 말론산, 사과산, 말레산, 구연산, 주석산은 각각 상온에서는 분말형으로서 존재하는 것이고, 휘발성이 없으므로, 산성 시약 함침 부직포를 제작할 때의 건조 공정에 있어서도 도포량이 감소하지 않고, 종래법과 비교해도 손색없이 아질산 추출 처리가 가능하므로, 감도가 대폭으로 저하되는 일은 없었다. 또한, 종래법과 비교하여 적은 조작으로 측정할 수 있었다. 그러나, 말론산이나 사과산은 아질산과 반응하여 면역크로마토그래피 시험편이 착색되어 버리고, 말레산과 구연산은 비특이적인 반응이 생겼다. 그 중에서 주석산은 면역크로마토그래피 시험편에 착색되지 않고, 감도·특이성 모두 종래법과 비교해도 손색없었다.
실시예 2: 산성 시약의 도포량의 검토
실시예 1에 있어서의 산성 시약의 도포량을 변경하고, 시험 결과(표 2)를 비교 검토하였다.
[표 2]
Figure pct00002
표 2에 나타낸 바와 같이, 도포량이 1.875μL 이하인 도포량에서는 감도가 저하되는 경향이 보여졌다. 또한, 3.75μL 이상으로 도포해도 감도가 대폭으로 상승하는 경향은 보여지지 않았다.
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허출원을 그대로 참고로서 본 명세서에 도입하는 것으로 한다.
1 : 커버 부분
2 : 검체 수용 용기 부분
3 : 노즐
4 : 노즐 부위
5 : 필터(일부가 중화 시약을 포함시킨 다공질 재료일 때가 있음)
6 : 주석산을 포함시킨 다공질 재료
7 : 주석산과 검체가 일시적으로 저류되어 혼합되는 공간
8 : 공기 배출 구멍
9 : 지지체(검출 영역을 포함함)
10 : 표식체 영역
11 : 검출 영역
12 : 샘플 패드
13 : 중화 시약 영역
14 : 흡수대
15 : 배킹 시트

Claims (10)

  1. 당사슬 항원을 측정하는 면역크로마토그래피 시험법으로서,
    검체와 아질산염 용액을 혼합한 후, 주석산을 접촉시키고, 검체 중의 당사슬 항원을 추출하는 공정이 여과 공정으로 행해지는,
    면역크로마토그래피 시험법.
  2. 제1항에 있어서,
    여과 공정이, 주석산을 함침시킨 다공질 재료 및 필터를 포함하는 검체 첨가용 디바이스 중에서 행해지는, 면역크로마토그래피 시험법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    검체와 아질산염 용액을 혼합한 다음, 주석산을 접촉시키는 공정 후의 중화 공정이, 면역크로마토그래피 시험편과 분리된 부위에서 행해지는, 면역크로마토그래피 시험법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    검체와 아질산염 용액을 혼합한 다음, 주석산을 접촉시키는 공정 후의 중화 공정이, 면역크로마토그래피 시험편 상에서 행해지는, 면역크로마토그래피 시험법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 면역크로마토그래피 시험법에 의해 검체 중의 당사슬 항원을 측정하는 방법으로서,
    중화 시약이 트리스히드록실메틸아미노메탄 또는 수산화나트륨인, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 면역크로마토그래피 시험법에 의해 검체 중의 당사슬 항원을 측정하는 방법으로서,
    당사슬 항원이 원생동물, 진균, 세균, 마이코플라스마, 리케차, 클라미디아 또는 바이러스의 당사슬 항원인, 방법.
  7. 당사슬 항원을 측정하는 면역크로마토그래피 시험편과 주석산을 함침시킨 다공질 재료 및 필터를 포함하는 검체 첨가용 디바이스를 가지는 키트.
  8. 제7항에 있어서,
    검체 첨가용 디바이스에 중화 시약을 함침시킨 다공질 재료를 추가로 포함되는, 키트.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서,
    중화 시약이 트리스히드록실메틸아미노메탄 또는 수산화나트륨인, 키트.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    당사슬 항원이 원생동물, 진균, 세균, 마이코플라스마, 리케차, 클라미디아 또는 바이러스의 당사슬 항원인, 키트.
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