JP7018876B2 - 糖鎖抗原を抽出し測定するためのイムノクロマト試験片及び検体添加用デバイス、並びにそれを用いたイムノクロマト法 - Google Patents
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Description
[1] 糖鎖抗原を測定するイムノクロマト試験法であって、検体と亜硝酸塩溶液を混合した後、酒石酸を接触させ、検体中の糖鎖抗原を抽出する工程が濾過工程で行われる方法。
[2] 濾過工程が、酒石酸を含浸させた多孔質材料及びフィルターを含む検体添加用デバイス中で行われる、[1]の方法。
[3] 検体と亜硝酸塩溶液を混合した後、酒石酸を接触させる工程の後の中和工程がイムノクロマト試験片と分離した部位で行われる、[1]又は[2]の方法。
[4] 検体と亜硝酸塩溶液を混合した後、酒石酸を接触させる工程の後の中和工程が、イムノクロマト試験片上で行われる、[1]又は[2]の方法。
[5] 中和試薬が、トリスヒドロキシルメチルアミノメタン又は水酸化ナトリウムである、[1]~[4]のいずれかのイムノクロマト法により検体中の糖鎖抗原を測定する方法。
[6] 糖鎖抗原が、原生動物、真菌、細菌、マイコプラズマ、リケッチア、クラミジア又はウイルスの糖鎖抗原である、[1]~[5]のいずれかのイムノクロマト法により検体中の糖鎖抗原を測定する方法。
[7] 糖鎖抗原を測定するイムノクロマト試験片と酒石酸を含浸させた多孔質材料及びフィルターを含む検体添加用デバイスを有するキット。
[8] 検体添加用デバイスにさらに中和試薬を含浸させた多孔質材料が含まれる、[7]のキット。
[9] 中和試薬が、トリスヒドロキシルメチルアミノメタン又は水酸化ナトリウムである、[7]又は[8]のキット。
[10] 糖鎖抗原が、原生動物、真菌、細菌、マイコプラズマ、リケッチア、クラミジア又はウイルスの糖鎖抗原である、[7]~[9]のいずれかのキット。
(1)ウイルスや細菌等に感染した患者の咽頭あるいは鼻腔等から採取した検体を後述するような亜硝酸塩溶液に浮遊させる。
(2)この亜硝酸塩浮遊液(試料)を、濾過手段で濾過し、濾過の際に酸性試薬で処理し糖鎖抗原を抽出する。
(3)この濾過液を、イムノクロマト試験片に滴加して、糖鎖抗原の有無を検出することにより、検体中の被検出物の有無を測定する。
中和試薬を含浸させたイムノクロマト試験片上の領域を中和試薬領域又は塩基性試薬領域と呼ぶ。
1.抗Streptococcus pyogenes(A群β溶血性レンサ球菌)抗体のニトロセルロースメンブレンへの固定化
抗Streptococcus pyogenes抗体を1.0mg/mLになるように精製水で希釈した液及び抗ウサギIgG抗体を準備し、PETフィルムで裏打ちされたニトロセルロースメンブレンのサンプルパッド側に抗Streptococcus pyogenes抗体、吸収帯側に抗ウサギIgG抗体をそれぞれ線状に塗布した。その後、ニトロセルロースメンブレンを45℃、30分間乾燥させ、抗Streptococcus pyogenes抗体固定化メンブレンを得た。このメンブレンを本実施例において、「抗体固定化メンブレン」と呼ぶ。
抗Streptococcus pyogenes抗体を1.0mg/mLになるように精製水で希釈し、これに着色ポリスチレン粒子を0.1%になるように加え、攪拌後、カルボジイミドを1%になるように加え、さらに攪拌する。遠心操作により上清を除き、50mM Tris(pH9.0)、3%BSAに再浮遊し、0.04%抗Streptococcus pyogenes抗体結合着色ポリスチレン粒子浮遊液を得た。この粒子を、本実施例において、「抗体固定化粒子」と呼ぶ。
2で作製した抗体固定化粒子浮遊液を不織布に所定量を塗布し、45℃、30分間乾燥させた。得られた不織布を、本実施例において、「乾燥パッド」と呼ぶ。
中和試薬(塩基性試薬)として、2Mトリス(Trizma Base)を15μL/cmで不織布に塗布した。塗布後に直ちに45℃、1時間、乾燥して、中和試薬含浸不織布を得た。
酸性試薬として、1M塩酸、1M酢酸、1Mマロン酸、1Mリンゴ酸、1Mマレイン酸、1Mクエン酸、1M酒石酸を3.75μLずつ不織布に塗布した。塗布後に直ちに45℃、1時間、乾燥して、酸性試薬含浸不織布を得た。
1で作製した抗体固定化メンブレン、3で作製した乾燥パッド、4で作製した中和試薬(塩基性試薬)含浸不織布を他部材(バッキングシート、吸収帯)と貼り合せて5mm幅に切断し、Streptococcus pyogenes試験片とした。また5で作製した酸性試薬含浸不織布を試料ろ過フィルターへ組み込んだノズルを有するデバイスと中和試薬(塩基性試薬)含浸不織布をサンプルパッドとして用いた試験片を本実施例において、「本発明試験デバイス」及び「本発明試験片」と呼ぶ。「本発明試験デバイス」の構造は図1A、「本発明試験片」の構造は図2に示すとおりである。4、5で作製した酸性試薬及び中和試薬(塩基性試薬)含浸不織布の替わりに何も塗布していない不織布を用いて同様の試験片を作製し、従来例として使用した。何も塗布していない不織布を試料ろ過フィルターへ組み込んだノズル及びサンプルパッドとして用いた試験片を「従来法試験ノズル」「従来法試験片」と呼ぶ。なお、試験片は、検体の流れに沿って、上流から、中和試薬(塩基性試薬)含浸不織布、乾燥パッド(標識体領域)、抗体固定化メンブレン(検出領域)、吸収帯を具備するものである。
Streptococcus pyogenesを培養し、培養液を生理食塩水で菌数1.0×107CFU/mLと0.25×107CFU/mLに調製した。
検体20μLを亜硝酸ナトリウム溶液(2M NaNO2)180μLに浮遊し、そのうち75μLを本発明試験片に滴加した。また、従来法として亜硝酸ナトリウムと塩酸を混合した亜硝酸抽出液に検体を浮遊した後、トリス溶液で中和した検体浮遊液を従来法試験片に50μL滴加した。5分後に抗Streptococcus pyogenes抗体を固定化した所定位置上の着色ポリスチレン粒子の堆積の有無とその程度を目視判定にて行った。その線状の堆積の程度が強いものを順に+++、++、+とし、判定が難しい場合を±、堆積がみられなかったものを-とした。
2 検体収容容器部分
3 ノズル
4 ノズル部位
5 フィルター(一部が中和試薬を含ませた多孔質材料のときがある)
6 酒石酸を含ませた多孔質材料
7 酒石酸と検体が一時的に貯留し混合される空間
8 空気抜き穴
9 支持体(検出領域を含む)
10 標識体領域
11 検出領域
12 サンプルパッド
13 中和試薬領域
14 吸収帯
15 バッキングシート
Claims (9)
- 糖鎖抗原を測定するイムノクロマト試験法であって、検体と亜硝酸塩溶液を混合した後、酒石酸を接触させ、検体中の糖鎖抗原を抽出する工程が濾過工程で行われる方法。
- 濾過工程が、酒石酸を含浸させた多孔質材料及びフィルターを含む検体添加用デバイス中で行われる、請求項1記載の方法。
- 検体と亜硝酸塩溶液を混合した後、酒石酸を接触させる工程の後の中和工程がイムクロマト試験片と分離した部位で行われる、請求項1又は2に記載の方法。
- 検体と亜硝酸塩溶液を混合した後、酒石酸を接触させる工程の後の中和工程が、イムノクロマト試験片上で行われる、請求項1又は2に記載の方法。
- 中和試薬が、トリスヒドロキシルメチルアミノメタン又は水酸化ナトリウムである、請求項1~4のいずれか1項に記載のイムノクロマト法により検体中の糖鎖抗原を測定する方法。
- 糖鎖抗原が、原生動物、真菌、細菌、マイコプラズマ、リケッチア、クラミジア又はウイルスの糖鎖抗原である、請求項1~5のいずれか1項に記載のイムノクロマト法により検体中の糖鎖抗原を測定する方法。
- 糖鎖抗原を測定するイムノクロマト試験片と酒石酸を含浸させた多孔質材料及びフィルターを含む検体添加用デバイスを有するキットであって、検体添加用デバイスにさらに中和試薬を含浸させた多孔質材料が含まれる、キット。
- 中和試薬が、トリスヒドロキシルメチルアミノメタン又は水酸化ナトリウムである、請求項7に記載のキット。
- 糖鎖抗原が、原生動物、真菌、細菌、マイコプラズマ、リケッチア、クラミジア又はウイルスの糖鎖抗原である、請求項7又は8に記載のキット。
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