JP2020505938A - エピジェネティックな免疫細胞計数のための改善された方法 - Google Patents
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Abstract
Description
a)定量化されるべき血液免疫細胞の2倍体ゲノムDNAを含む規定容量のヒト血液の試料を準備する工程と、
b)少なくとも1つの脱メチル化標準遺伝子と、上記少なくとも1つの脱メチル化標準遺伝子の全てのCpGジヌクレオチドをGpCに反転する配列とを含むin silicoでバイサルファイト変換された組み換え核酸(「標準I」)を準備する工程と、
c)上記b)の少なくとも1つの脱メチル化標準遺伝子の脱メチル化されたゲノム配列と、上記b)の少なくとも1つの脱メチル化標準遺伝子の全てのCpGジヌクレオチドをGpCに反転する上記配列の脱メチル化されたゲノム配列とを含む組み換え核酸(「キャリブレーターI」)を準備する工程と、
d)上記b)の少なくとも1つの脱メチル化標準遺伝子の全てのCpGジヌクレオチドをGpCに反転する配列を含む組み換え核酸(「スパイカーI」)を準備する工程と、
e)規定量の上記d)の組み換え核酸を上記a)の試料に添加する工程(「スパイキング」)と、
f)上記a)の定量化されるべき細胞の2倍体ゲノムDNA並びに上記c)及びd)の組み換え核酸をバイサルファイトで処理することで、非メチル化シトシンをウラシルへと変換する工程と、
g)上記a)、b)、c)、及びf)の核酸分子を適切なプライマー対を使用して増幅させることで、アンプリコンを作製する工程と、
h)上記アンプリコンの分析に基づいて試料の容量当たりの血液免疫細胞(BIC)を特定する工程と、
を含む、方法によって解決される。
a)定量化されるべき血液細胞の2倍体ゲノムDNAを含むヒト血液の試料を準備する工程と、
b)少なくとも1つの脱メチル化標準遺伝子と、少なくとも1つの血液細胞特異的遺伝子とを含むin silicoでバイサルファイト変換された組み換え核酸(「標準II」)を準備する工程と、
c)上記b)の少なくとも1つの脱メチル化標準遺伝子の脱メチル化されたゲノム配列と、上記b)の少なくとも1つの血液細胞特異的遺伝子の脱メチル化されたゲノム配列とを含む組み換え核酸(「キャリブレーターII」)を準備する工程と、
d)上記a)の定量化されるべき細胞の2倍体ゲノムDNA、及び上記c)の組み換え核酸をバイサルファイトで処理することで、非メチル化シトシンをウラシルへと変換する工程と、
e)上記a)、b)、c)、及びd)の核酸分子を適切なプライマー対を使用して増幅させることで、アンプリコンを作製する工程と、
f)上記アンプリコンの分析に基づいて全ての細胞当たりの脱メチル化のパーセント(DDC)を特定する工程と、
を含む、方法によって解決される。
a)上記の本発明の第1の態様による方法を実施することと、
b)上記の本発明の第2の態様による方法を実施することと、
c)特定されたBICに特定されたDDCを乗ずることと、
を含む、方法によって解決される。
1.内部標準、例えばin silico変換されたプラスミド。
2.(例えば)特定の遺伝子のメチル化された変異体の比較対照となるGAPDHノーマライザー。
3.このように、1を用いた定量化による、絶対的な脱メチル化GAPDHによる全ての脱メチル化コピーと、特定の(しかし同じコピー数で存在する)脱メチル化遺伝子との比較。
4.それにもかかわらず、上記は真に「絶対的な」定量化を可能にしない。それというのも、in silico変換された標準は、反応バイアル中でのみ変換された生物学的試料に相当しないからである。
5.4での問題を、いわゆるGNoMs(GenomicNormaliser of Methylation)の添加及び測定に基づいて解決し、本明細書では全ての本来の配列は、プラスミド中に等モルで含まれており、その後に全ての過程(バイサルファイト処理及び精製)に供される。それらは1:1で存在するので、標準は、定量化後にin silicoメチル化とin situメチル化との間の差を示す1での標準を使用して特定することができる。この要素を使用して、測定のメチル化値を補正することができ、それにより結果はかなり改善される。
6.反転されたCG塩基を有する標準遺伝子を有する規定量の核酸(プラスミド)を使用して、更に上記過程の間のあらゆる材料損失を考慮に入れることができ、それにより該方法は更に改善される。
a)定量化されるべき血液細胞の2倍体ゲノムDNAを含む規定容量のヒト血液の試料を準備することと、
b)脱メチル化標準遺伝子と、上記脱メチル化標準遺伝子の全てのCpGジヌクレオチドをGpCに反転する配列と、血液細胞特異的遺伝子とを含むin silicoでバイサルファイト変換された組み換え核酸を準備する工程と、
c)上記b)の脱メチル化標準遺伝子の脱メチル化されたゲノム配列と、上記脱メチル化標準遺伝子の全てのCpGジヌクレオチドをGpCに反転する配列と、上記b)の血液細胞特異的遺伝子とを含む組み換え核酸を準備することと、
d)上記b)の少なくとも1つの脱メチル化標準遺伝子の全てのCpGジヌクレオチドをGpCに反転する配列を含む組み換え核酸を準備することと、
e)規定量の上記d)の組み換え核酸を上記a)の試料に添加すること(「スパイキング」)と、
f)上記a)の定量化されるべき細胞の2倍体ゲノムDNA並びに上記c)及びd)の組み換え核酸をバイサルファイトで処理することで、非メチル化シトシンをウラシルへと変換することと、
g)上記a)、b)、c)、及びf)の核酸分子を適切なプライマー対を使用して増幅させることで、アンプリコンを作製することと、
h)上記アンプリコンの分析に基づいて試料の容量当たりの血液細胞の量を特定することと、
を含む。
表1.RDls:%での相対脱メチル化(座位特異的)、RDu:%での相対脱メチル化(全般的)、EF:効率係数、DDu:%での確定的脱メチル化
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図1
Methylation level [%] メチル化レベル(%)
CD4+ T cells CD4陽性T細胞
CD8+ T cells CD8陽性T細胞
CD19+ B cells CD19陽性B細胞
CD56+ NK cells CD56陽性NK細胞
CD14+ monocytes CD14陽性単球
CD15+ granulocytes CD15陽性顆粒球
図2A
Locus-specific, relative, percentagequantification 座位特異的な相対的なパーセンテージ定量化
Diploid Genomic DNA 2倍体ゲノムDNA
Demethylated CD4 locus 脱メチル化されたCD4座位
Methylated CD4 locus メチル化されたCD4座位
Unknown copy# 未知のコピー数
Uracil-DNA ウラシル-DNA
Amplified DNA 増幅されたDNA
Conversion 変換
Amplification 増幅
Conversion Factor 変換係数
#Converted DNATpG in sample =#TpG*CFTpG #試料中の変換されたDNATpG数=#TpG*CFTpG
Apply f-1 to f' f-1をf'に適用
In silico converted Plasmid in silico変換されたプラスミド
Methylation-based メチル化ベース
Demethylation-based 脱メチル化ベース
Dilution series: defines copy# 希釈系列はコピー数#を規定する
Amplified DNA 増幅されたDNA
Interpolation of: の内挿
#Converted DNACpG in sample =#CpG*CFCpG #試料中の変換されたDNACpG数=#CpG*CFCpG
Relative Demethylation at genomic locus(RD) [%] ゲノム座位での相対的脱メチル化(RD)(%)
図2B
Universal, relative, percentagequantification 全般的な相対的なパーセンテージ定量化
Diploid Genomic DNA 2倍体ゲノムDNA
Demethylated CD4 locus 脱メチル化されたCD4座位
Demethylated GAPDH locus 脱メチル化されたGAPDH座位
Unknown copy# 未知のコピー数
Uracil-DNA ウラシル-DNA
Amplified DNA 増幅されたDNA
Conversion 変換
Amplification 増幅
#Converted DNATpG in sample =#TpG*CFTpG #試料中の変換されたDNATpG数=#TpG*CFTpG
Apply f-1 to f' f-1をf'に適用
In silico converted Plasmid in silico変換されたプラスミド
Universal demethylation-based Plasmid 脱メチル化ベースのユニバーサルプラスミド
GAPDH locus GAPDH座位
Cd4 locus Cd4座位
Dilution series: defines copy# 希釈系列はコピー数を規定する
Amplified DNA 増幅されたDNA
Interpolation of: の内挿
#Converted DNAGAPDH in sample =#GaPDH*CFGAPDH #試料中の変換されたDNAGAPDH数=#GaPDH*CFGAPDH
Relative Demethylation at genomic locus(URD) [%] ゲノム座位での相対的脱メチル化(URD)(%)
図2C
Universal, definitive, percentagequantification 全般的な確定的なパーセンテージ定量化
In silico converted Plasmid in silico変換されたプラスミド
Universal demethylation-based Plasmid GAPDHand CD4 脱メチル化ベースのユニバーサルプラスミドGAPDH及びCD4
Amplification and Interpolation of: の増幅及び内挿
Relative Demethylation at genomic locus [%] ゲノム座位での相対的脱メチル化(%)
Definitive Demethylation per all cells(DDC) [%] 全ての細胞当たりの確定的な脱メチル化(%)
Whole Blood with Diploid Genomic DNA 2倍体ゲノムDNAを有する全血
Demethylated CD4 locus 脱メチル化されたCD4座位
Demethylated GAPDH locus 脱メチル化されたGAPDH座位
Unknown copy# 未知のコピー数
Conversion 変換
Uracil-DNA ウラシル-DNA
Amplification 増幅
Amplified TpG and GAPDH DNA 増幅されたTpG及びGAPDHのDNA
Apply f-1 to f' f-1をf'に適用
"Genomic" Galibrator Plasmid 「ゲノム」キャリブレータープラスミド
Demethylated GAPDH 脱メチル化されたGAPDH
Demethylated CD4 脱メチル化されたCD4
Interpolation of: の内挿
Effeciency Factor (EF) 効率係数(EF)
図2D
Universal, definitive, absolutequantification 全般的な確定的な絶対的定量化
In silico converted Plasmid in silico変換されたプラスミド
Universal demethylation-based Plasmid GAPDHand GAP-GC 脱メチル化ベースのユニバーサルプラスミドGAPDH及びGAP-GC
Amplification and Interpolation of: の増幅及び内挿
Leukocyte count (LC) [per μl blood] 白血球数(LC)(1 μlの血液当たり)
Defined volume (V) of Whole Blood with"Spiker Plasmid" 規定容量(V)の全血と「スパイカープラスミド」
"Spiker" Plasmid with defindes#GAP-GC 規定の#GAP-GCを有する「スパイカー」プラスミド
Demethylated genomic GAPDH locus 脱メチル化されたゲノムGAPDH座位
Genomic DNA with Plasmid spike ゲノムDNAとプラスミドスパイク
Conversion 変換
Uracil-DNA ウラシル-DNA
Amplification 増幅
Amplified GAP-GC and GAPDH DNA 増幅されたGAP-GC及びGAPDHのDNA
Apply f-1 to f' f-1をf'に適用
"Genomic" Galibrator Plasmid with"GAP-DC" 「ゲノム」キャリブレータープラスミドと「GAP-DC」
Demethylated GAPDH 脱メチル化されたGAPDH
Artifical GAP-GC sequence 人工GAP-GC配列
Interpolation of: の内挿
図3
Flow cytometry [% cells] フローサイトメトリー(%細胞)
Epigenetic qPCR analysis [% cells] エピジェネティックなqPCR分析(%細胞)
Flow cytometry [cells/μl] フローサイトメトリー(細胞/μl)
Epigenetic qPCR analysis [cells/μl] エピジェネティックなqPCR分析(細胞/μl)
Leukocytes 白血球
Neutrophils 好中球
Total T cells 総T細胞
Helper T cells ヘルパーT細胞
Monocytes 単球
Cytotox. T cells 細胞障害性T細胞
B cells B細胞
NK cells NK細胞
Regression line 回帰直線
Bisecting line 二等分線
図4A
Flow cytometry [% cells] フローサイトメトリー(%細胞)
Epigenetic qPCR analysis [% cells] エピジェネティックなqPCR分析(%細胞)
Total T cells 総T細胞
Cytotox. T cells 細胞障害性T細胞
Helper T cells ヘルパーT細胞
Regression line 回帰直線
Bisecting line 二等分線
Rel. diff. of % cells [%] %細胞の相対的差異(%)
Mean [% cells] 平均(%細胞)
図4B
Flow cytometry [cells/μl] フローサイトメトリー(細胞/μl)
Epigenetic qPCR analysis [cells/μl] エピジェネティックなqPCR分析(細胞/μl)
Total T cells 総T細胞
Cytotox. T cells 細胞障害性T細胞
Helper T cells ヘルパーT細胞
Regression line 回帰直線
Bisecting line 二等分線
Rel. diff. of cells/μl [%] 細胞/μlの相対的差異(%)
Mean [cells/μl] 平均(細胞/μl)
図5A)
Copy Numbers by CD3 assay CD3アッセイによるコピー数
CD3 copies CD3コピー
GAPDH copies GAPDHコピー
Healthy 健康
Healthy Test Cases 健康な試験症例
SCID after HSCT HSCT後のSCID
SCID with ME MEを伴うSCID
図5B)
Copy Numbers by B-cell assay B細胞アッセイによるコピー数
BLC copies BLCコピー
GAPDH copies GAPDHコピー
Healthy 健康
Healthy Test Cases 健康な試験症例
SCID after HSCT HSCT後のSCID
SCID with ME MEを伴うSCID
図5C)
Copy Numbers by NK assay NKアッセイによるコピー数
NK copies NKコピー
GAPDH copies GAPDHコピー
Healthy 健康
Healthy Test Cases 健康な試験症例
SCID after HSCT HSCT後のSCID
SCID with ME MEを伴うSCID
Claims (11)
- 血液免疫細胞のための定量的メチル化アッセイのための方法であって、
a)定量化されるべき血液免疫細胞の2倍体ゲノムDNAを含む規定容量のヒト血液の試料を準備する工程と、
b)少なくとも1つの脱メチル化標準遺伝子と、前記少なくとも1つの脱メチル化標準遺伝子の全てのCpGジヌクレオチドをGpCに反転する配列とを含むin silicoでバイサルファイト変換された組み換え核酸(「標準I」)を準備する工程と、
c)前記b)の少なくとも1つの脱メチル化標準遺伝子の脱メチル化されたゲノム配列と、前記b)の少なくとも1つの脱メチル化標準遺伝子の全てのCpGジヌクレオチドをGpCに反転する前記配列の脱メチル化されたゲノム配列とを含む組み換え核酸(「キャリブレーターI」)を準備する工程と、
d)前記b)の少なくとも1つの脱メチル化標準遺伝子の全てのCpGジヌクレオチドをGpCに反転する配列を含む組み換え核酸(「スパイカーI」)を準備する工程と、
e)規定量の前記d)の組み換え核酸を前記a)の試料に添加する工程(「スパイキング」)と、
f)前記a)の定量化されるべき細胞の2倍体ゲノムDNA並びに前記c)及びd)の組み換え核酸をバイサルファイトで処理することで、非メチル化シトシンをウラシルへと変換する工程と、
g)前記a)、b)、c)、及びf)の核酸分子を適切なプライマー対を使用して増幅させることで、アンプリコンを作製する工程と、
h)前記アンプリコンの分析に基づいて試料の容量当たりの血液免疫細胞(BIC)を特定する工程と、
を含む、方法。 - 血液細胞のための定量的メチル化アッセイのための方法であって、
a)定量化されるべき血液細胞の2倍体ゲノムDNAを含むヒト血液の試料を準備する工程と、
b)少なくとも1つの脱メチル化標準遺伝子と、少なくとも1つの血液細胞特異的遺伝子とを含むin silicoでバイサルファイト変換された組み換え核酸(「標準II」)を準備する工程と、
c)前記b)の少なくとも1つの脱メチル化標準遺伝子の脱メチル化されたゲノム配列と、前記b)の少なくとも1つの血液細胞特異的遺伝子の脱メチル化されたゲノム配列とを含む組み換え核酸(「キャリブレーターII」)を準備する工程と、
d)前記a)の定量化されるべき細胞の2倍体ゲノムDNA、及び前記c)の組み換え核酸をバイサルファイトで処理することで、非メチル化シトシンをウラシルへと変換する工程と、
e)前記a)、b)、c)、及びd)の核酸分子を適切なプライマー対を使用して増幅させることで、アンプリコンを作製する工程と、
f)前記アンプリコンの分析に基づいて全ての細胞当たりの脱メチル化のパーセント(DDC)を特定する工程と、
を含む、方法。 - 免疫細胞型のメチル化された遺伝子の絶対的コピー数を測定する方法であって、
a)請求項1に記載の方法を実施することと、
b)請求項2に記載の方法を実施することと、
c)特定されたBICに特定されたDDCを乗ずることと、
を含む、方法。 - 前記血液免疫細胞は、白血球、Tリンパ球、顆粒球、単球、Bリンパ球、及び/又はNK細胞から選択される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組み換え核酸分子は、プラスミド、酵母人工染色体(YAC)、ヒト人工染色体(HAC)、PI由来人工染色体(PAC)、細菌人工染色体(BAC)、及びPCR産物から選択される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記脱メチル化標準遺伝子は、検出されるべき全ての細胞中で発現される遺伝子、又はハウスキーピング遺伝子、又はGAPDHから選択される、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記血液細胞特異的遺伝子は、検出されるべき全ての血液細胞中で発現される遺伝子若しくはCD4から選択される、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記血液試料は、末梢血試料、毛細血試料、若しくは静脈血試料、又はそれらのサブトラクション若しくは末梢血単球、血餅、及び乾燥した血液スポットから選択される、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記定量化に基づいて哺乳動物の免疫状態について結論づける工程を更に含む、請求項3〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法を実施するための材料を、使用のための説明書と一緒に含む診断キット。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法を実施するための、請求項10に記載のキットの使用。
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"Epigenetic quantification of tumor-infiltrating T-lymphocytes", EPIGENETICS, vol. Volume 6, Issue 2, JPN6021048145, 2011, pages 236 - 246, ISSN: 0004843315 * |
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