CN110382713A - 改进的表观遗传免疫细胞计数方法 - Google Patents

改进的表观遗传免疫细胞计数方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110382713A
CN110382713A CN201880010392.6A CN201880010392A CN110382713A CN 110382713 A CN110382713 A CN 110382713A CN 201880010392 A CN201880010392 A CN 201880010392A CN 110382713 A CN110382713 A CN 110382713A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
blood
gene
demethylation
nucleic acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
CN201880010392.6A
Other languages
English (en)
Inventor
斯文·欧莱克
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Precision for Medicine GmbH
Original Assignee
Epiontis GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Epiontis GmbH filed Critical Epiontis GmbH
Publication of CN110382713A publication Critical patent/CN110382713A/zh
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/154—Methylation markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及改进的表观遗传血液和免疫细胞计数方法以及各自的应用和试剂盒。

Description

改进的表观遗传免疫细胞计数方法
本发明涉及改进的表观遗传血液和免疫细胞计数方法以及各自的应用和试剂盒。
发明背景
偏离细胞免疫系统的生理平衡指示各种疾病，并因此构成了诊断和患者监测的重要度量。目前流式细胞术(FCM)是进行相应测量的最佳方法，其提供了关于待测定的细胞类型的准确性和灵活性(1)。然而，尽管诊断实验室中使用的血液学分析仪较先进且物流环境广泛适应所需的流程，但这种方法的适用性有限。
基于FCM的细胞计数需要具有完整白细胞的新鲜、抗凝血或保存良好的血液样品。即使利用新鲜的样品，仍建议快速工作，因为分析时间会影响血液抽取后最初几小时开始的细胞恶化的结果。此外，由于生物学、技术和操作的变化，FCM的标准化仍然是一项重大挑战(2,3,4,5)，且尚未实现完全标准化的测量(6,7)。然而，最关键的挑战是，并非所有医疗应用都保证可获得新鲜或保存良好的血液样品，在这些情况下不能应用流式细胞术。
例如，对HIV感染患者的治疗决定取决于患者的CD4+T辅助细胞计数。在低于500个T辅助细胞/微升的频率下，强烈建议进行抗逆转录病毒治疗，并且在低于200个细胞/微升的水平下是必要的。在资源贫乏的国家，不能频繁连续进行血液抽取和测量的农村地区，适当的诊断评估常常受到阻碍。因此，通常仅基于HIV相关的临床症状开始治疗，这可能导致不理想的结果(8,9)。
另一个实例是新生儿筛查。收集来自脚跟穿刺的Guthrie卡，并用于检测严重的、可治愈的先天性缺陷。这些卡不能用于流式细胞术分析，相反T细胞受体切除环(TREC)被用于PID筛选。TREC分析优先检测新胸腺迁出细胞(新生儿外周血中主要的T细胞亚型)。然而，该技术仅限于T-(KREC)细胞以及最近的B-(KREC)细胞，但不适合诸如CD4或CD8亚群的鉴别分析，并且也不能检测其他细胞类型，如NK细胞。因此，新生儿分析中的TREC分析仅用于初步筛查。在治疗性造血干细胞移植之前和之后的鉴别诊断和患者监测需要改变技术并且通过流式细胞术进行。
为了克服诊断限制和相关的技术转换，改进的免疫状态评估方法将是有价值的。其应当稳健地提供相对和绝对细胞计数，同样允许使用新鲜的、冷冻的或纸斑点的(paper-spotted)血液。对于每个分析的细胞，信号应该是数字化的，即，每个细胞指示一个正值或负值，而不需要任意定义“阳性”阈值。这样的新方法同样应当以自动化的、独立于操作者的方式进行，并且较少依赖于所使用的试剂如抗体的变化。
在本发明的第一个方面，以上目标通过血液免疫细胞的定量甲基化测定方法得到解决，其包括以下步骤：
a)提供确定量的人血液样品，其包含待定量的血液免疫细胞的二倍体基因组DNA；
b)提供经计算机模拟的重亚硫酸盐转化的重组核酸，其包含至少一个脱甲基化标准基因和所述至少一个脱甲基化标准基因的所有CpG二核苷酸倒置为GpC的序列(“标准物I”)；
c)提供重组核酸，其包含b)所述的至少一个脱甲基化标准基因和b)所述的至少一个脱甲基化标准基因的所有CpG二核苷酸倒置为GpC的序列的脱甲基化的基因组序列(“校准物I”)；
d)提供重组核酸，其包含b)所述的至少一个脱甲基化标准基因的所有CpG二核苷酸倒置为GpC的序列(“标定物I”)；
e)向a)所述的样品添加确定量的d)所述的重组核酸(“加标”)；
f)利用重亚硫酸盐处理a)所述的待定量的细胞的二倍体基因组DNA以及c)和d)所述的重组核酸，以将未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶；
g)使用适当的引物对扩增a)、b)、c)和f)所述的核酸分子，以产生扩增子；以及
h)基于分析所述扩增子确定每个体积样品的血液免疫细胞(BIC)。
在本发明的第二个方面，以上目标通过血液细胞的定量甲基化测定方法得到解决，其包括以下步骤：
a)提供人血液样品，其包含待定量的血液细胞的二倍体基因组DNA；
b)提供经计算机模拟的重亚硫酸盐转化的重组核酸，其包含至少一个脱甲基化标准基因和至少一个血液细胞特异性基因(“标准物II”)；
c)提供重组核酸，其包含b)所述的至少一个脱甲基化标准基因和b)所述的至少一个血液细胞特异性基因的脱甲基化的基因组序列(“校准物II”)；
d)利用重亚硫酸盐处理a)所述的待定量的细胞的二倍体基因组DNA和c)所述的重组核酸，以将未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶；
e)使用适当的引物对扩增a)、b)、c)和d)所述的核酸分子，以产生扩增子；以及
f)基于分析所述扩增子确定每种所有细胞的脱甲基化百分比(DDC)。
在本发明的特定优选的第三个方面，以上目标通过用于确定免疫细胞类型的甲基化基因的绝对拷贝数的方法得到解决，其包括：
a)实施如上所述的本发明的第一个方面的方法，
b)实施如上所述的本发明的第二个方面的方法，以及
c)将所确定的BIC与所确定的DDC相乘。
可以在平行或组合的反应小瓶中实施本发明方法的步骤，如图2所示的。
本发明涉及甲基化数据的精确定量。这涉及诸多组分和考虑：
1.内部标准物，例如经计算机模拟转化的质粒。
2.(例如)与特异性基因的甲基化变体形成对照的GAPDH标准化试剂(normaliser)。
3.因此，根据利用1的定量，通过强制脱甲基化的GAPDH与特异性(但以相同的拷贝数存在)脱甲基化的基因进行比较所有脱甲基化的拷贝。
4.然而，以上并未允许真正的“绝对”定量，因为经计算机模拟转化的标准物并不对应生物样品(其仅在反应小瓶中转化)。
5.解决4的问题。基于添加和测量被称为GNoMs(甲基化的基因组标准化试剂)，在此将所有原始序列等摩尔地纳入质粒中，然后进行整体处理(重亚硫酸盐处理和纯化)。由于它们以1:1存在，因此可以在使用1中的标准物定量后鉴定标准物，其显示经计算机模拟的和原位甲基化之间的差异。使用该因子，可以校正测量的甲基化值，这显著改善了结果。
6.此外，使用具有含倒置的CG碱基的标准基因的确定量的核酸(质粒)，可以计算处理中的任何物质损失，这可以进一步改善方法。
原理上，定量实时PCR(qPCR)是这样的方法，其基于高度细胞类型特异性的表观遗传(即DNA甲基化)标志物(14,15,16)时完成表征。技术上，当利用重亚硫酸盐处理DNA时，未甲基化的CpG二核苷酸被转化为TpGs(“TpG变体”)，而甲基化的CpG-二核苷酸保持不变(“CpG变体”)。因此，重亚硫酸盐转化将表观遗传标记翻译成允许辨别和定量两种变体的序列信息。qPCR测定对血液样品中细胞完整性的损失不敏感，因为其DNA是非常稳定的实体。因此，可以对新鲜的外周血、干血斑或任何其他的标本进行表观遗传细胞定量，而对其保存状态没有特定要求。可以假设每个细胞存在两个拷贝的各CpG位点，并且在单个给定细胞中各位点完全是甲基化的或脱甲基化的。另外，合成产生qPCR所需的必需组分，且相比生物物质如特异性抗体的制备时标准化相对容易实现。然而，截至今天，这样的表观遗传学方法的适用性尚未得到证实，可能是由于缺乏明确定义的细胞类型特异性生物标志物和缺少实施确证和绝对定量的方法。确证定量需要直接代表生物基质的参考标准(17)。绝对定量在基于DNA的技术中造成了困难，因为白细胞DNA与血液体积之间的关系在生物学上不固定，并且来自血液提取的DNA回收是半定量的。
在此，发明人引入了一组用于人血液样品中的主要白细胞群定量的表观遗传免疫细胞特异性的基于qPCR的测定方法。所述测定是基于全部T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、B-细胞和NK细胞特异性的DNA甲基化标记。当有新鲜的血液样品可用于例如HIV侵袭患者中CD4+T细胞的测定时，每微升血液的细胞数量构成了目标标准物。因此，发明人提出了基于其细胞类型特异性的表观遗传信号的用于免疫细胞的确证和绝对计数的新系统。分析了测定概念和单个生物标志物与金标准FCM技术的等效性。然而，当给定血液的体积未精确确定时，如干血样品的情况，相对测量更准确而应当采用。因此为了获得广泛的测量范围，发明人在此测试了各种诊断应用，旨在通过分析健康供体和一组HIV阳性患者来确定绝对定量的一致程度，发明人还通过鉴定一组健康新生儿人群中的PID患者，确定来自干血斑的诊断质量。
在根据本发明的方法的优选实施方案中，对方法进行整合，其包括：
a)提供确定量的包含待定量的血液细胞的二倍体基因组DNA的人血液样品；
b)提供经计算机模拟的重亚硫酸盐转化的重组核酸，其包含脱甲基化标准基因、将所述脱甲基化标准基因的所有CpG二核苷酸倒置为GpC的序列，以及血液细胞特异性基因；
c)提供重组核酸，其包含b)所述的脱甲基化标准基因的脱甲基化的基因组序列、所述脱甲基化标准基因的所有CpG二核苷酸倒置为GpC的序列，以及b)所述的血液细胞特异性基因；
d)提供重组核酸，其包含b)所述的至少一个脱甲基化标准基因的所有CpG二核苷酸倒置为GpC的序列；
e)向a)所述的样品添加确定量的d)所述的重组核酸(“加标”)；
f)利用重亚硫酸盐处理a)所述的待定量的细胞的二倍体基因组DNA以及c)和d)所述的重组核酸，以将未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶；
g)使用适当的引物对扩增a)、b)、c)和f)所述的核酸分子，以产生扩增子；以及
h)基于分析所述扩增子确定每个体积样品的血液细胞量。
优选地，核酸是质粒，例如线性化的质粒如细菌质粒，例如pUC。
在方法的该方面，使用第一经计算机模拟的重亚硫酸盐转化的核酸(质粒)将扩增标准化，所述核酸包含脱甲基化标准基因(例如GAPDH)、“人工序列”(将所有CpG二核苷酸倒置为GpC的序列)，以及血液细胞特异性基因(“特异性基因”)。所有3种成分在所述核酸中以等量存在(等摩尔)，并经计算机模拟的重亚硫酸盐转化。因此，可以将标准化曲线和相应的校准曲线与样品直接比较，并且可以由血液细胞特异性基因与脱甲基化标准基因的比率确定相对细胞计数。然而，核酸并不对应于“真实”序列，因为每个C被T取代。如提及的系列稀释和所有基因的每种浓度的测定生成了测定的校准曲线。
为了提高方法的精确性，使用第二核酸(质粒)，其包含脱甲基化标准基因(例如GAPDH)、“人工序列”(将所有CpG二核苷酸倒置为GpC的序列)和血液细胞特异性基因(“特异性基因”)。然而，这些序列未经计算机模拟的重亚硫酸盐转化，并且对应于基因组序列(范围达到具有基因组匹配物，参见下文)，因此仅能够用于测量扩增(例如qPCR)效率。
第二标准物的原因是双重的。A)为了确证定量，需要与待分析的生物样品相同的标准物(这也是调控要求)。然而，在第一核酸中，将双链富含AT的序列与单链富含U的序列比较。仅双链核酸的“真正”重亚硫酸盐转化允许该确证比较。接着，使用第一核酸标准化，血液细胞特异性基因与脱甲基化标准基因的重亚硫酸盐转化的商，给出了效率系数。对于基于将所有CpG二核苷酸倒置为GpC的序列的重亚硫酸盐转化除以脱甲基化标准基因的重亚硫酸盐转化的商同样如此。
优选地，“人工序列”(将所有CpG二核苷酸倒置为GpC的序列)是包含C和CpG序列(用于重亚硫酸盐转化)的在人基因组中不存在的随机序列。在一个实施方案中，人工序列是扩增的GAPDH(扩增子)的部分的精确序列，其中CpG序列被倒置为GpC序列。“人工序列”存在于如上所述的所有3种核酸，即在第一核酸(经计算机模拟的重亚硫酸盐转化的)、第二核酸(用于重亚硫酸盐转化)和(其为唯一分析的序列)第三核酸(经计算机模拟的重亚硫酸盐转化的)中。
将第三核酸以确定的量给予至确定量的血液中，然后进行分析(例如纯化、重亚硫酸盐处理、二次纯化、脱磺酸基作用、特异性扩增)。然后，对第一核酸进行标准化(多少拷贝被测量并给予至反应中)，使用与第二核酸的比较确定效率，并使用第三核酸确定(残留的)拷贝数。将任何损失与经历相同程序的基因组DNA的损失进行比较。整体过程允许精确确证和绝对定量所述DNA，以及通过此诸如例如全血的血液样品中的细胞。
在一个实施方案中，本发明涉及人工序列，其为扩增的GAPDH(扩增子)的部分的精确序列，其中CpG序列被倒置为GpC序列，其为实施本发明的方法时的工具。
细胞免疫系统的组分保留了针对不同疾病的有价值的诊断信息。用于定量免疫细胞监测的标准物技术是流式细胞术。然而，该方法限制于其中细胞完整性得到保持的血液样品。在临床常规程序中，这实际将分析限制于新鲜血液样品作为分析底物。
为了拓宽诊断免疫监测的使用范围，发明人实现了表观遗传qPCR系统用于定量主要的白细胞群。在确定免疫细胞类型特异性的甲基化标记后，分析了来自25名健康供体、97名HIV患者的全血和来自新生儿的325张Guthrie卡，包括患有原发性免疫缺陷(PID)的25张卡。确定了B细胞、NK细胞、总T细胞、T辅助细胞和细胞毒性T细胞的流式细胞术和表观遗传数据之间的方法学一致性，并且挑战了该新技术鉴定定量免疫细胞缺陷的能力。
数据显示，根据Bland-Altman测试，经表观遗传qPCR测定和流式细胞术的定量在健康对象和HIV患者中实施是等效的。表观遗传定量适用于新鲜和冷冻血液样品中的白细胞亚群的相对和绝对频率。与流式细胞术相反，Guthrie卡的免疫细胞分析准确地识别新生儿中的PID病例。实施免疫细胞群的表观遗传定量与标准流式细胞术高度等效，这提供了更大范围的可能应用，包括分析干血斑，其可能为偏远地区患者或来自新生儿的血液计数提供了途径。
根据本发明优选的方法是，其中所述血液免疫细胞选自白细胞、T-淋巴细胞、粒细胞、单核细胞、B-淋巴细胞和/或NK细胞。
根据本发明优选的方法是，其中所述重组核酸分子选自质粒、酵母人工染色体(YAC)、人类人工染色体(HAC)、PI来源的人工染色体(PAC)、细菌人工染色体(BAC)和PCR产物。
根据本发明优选的方法是，其中所述脱甲基化标准基因选自在待检测的所有细胞中表达的基因如，例如看家基因，如，例如GAPDH。
根据本发明优选的方法是，其中所述血液细胞特异性基因选自在待检测的所有血液细胞中表达的基因如，例如CD4。
根据本发明优选的方法是，其中所述血液样品选自外周血、毛细血管血或静脉血样品或以上的部分如，例如外周血单核细胞，血块和干血斑。
根据本发明优选的方法是，还包括基于所述定量推断哺乳动物的免疫状态的步骤。
本发明的另一个方面涉及诊断试剂盒，其包含实施本发明的方法的材料，任选地与使用说明书一起。优选的材料是核酸分子和/或亚硫酸氢盐试剂。
本发明的另一个方面涉及本发明的试剂盒在实施本发明的方法中的应用。
目前的免疫细胞监测需要新鲜或保存良好的血液样品。在此，发明人提出了用于差异血液细胞计数的替代技术，其允许计算新鲜的、福尔马林固定的、冷冻的或干燥的血液样品中的相对和绝对细胞数。
表观遗传qPCRs作为一种很有前景的工具出现，其不需要完整的细胞或高标准的保存。报道调节性T细胞中FOXP3TSDR的脱甲基化的数据(14)显示了这样的表观遗传细胞计数的可行性。
在本发明中，关于以下的仍然悬而未决的问题得到了解决：a)几种重要的细胞类型的可能的表观遗传标志物的可用性，b)各种细胞类型特异性表观遗传qPCR系统之间的标准化，c)提供表观遗传信号的确证定量(17)的方法，d)相对于给定血液体积的定量，和e)与用以检测相应的免疫细胞类型的FCM金标准技术的方法学一致性。
用于细胞类型鉴定的理想DNA甲基化标志物在目标细胞类型(接近0％甲基化)和所有其他细胞类型(接近100％甲基化)之间是有区别的。在此，研究了用于免疫细胞计数的标志物，首次在推定的鉴别位点应用了重亚硫酸盐测序的非完全定量方法。这些数据显示所有测试的免疫细胞类型的位点暂时满足理想标志物的标准。选择辨别性CpG-二核苷酸用于qPCR测定开发并对甲基化的和脱甲基化的模板变体进行测试。实现了靶标DNA的有效和定量扩增，而不用检测来自非靶标模板的背景。qPCR测定性能稳健，在新鲜或冷冻血液中的偏差低。
对于同时测试异质样品中的各种不同的细胞类型而言，使用位点特异性甲基化(即CpG)和脱甲基化(TpG)的qPCR不是最佳的。每种qPCR系统的扩增效率例如由于不同的CpG密度而不同，因此对于所有测量没有生物学或技术上稳定的参数(20)。相反，将看家基因GAPDH(21)总是脱甲基化的调控片段(regulatory stretch)用作固定分母。以这种方式，相对于GAPDH中脱甲基化位点的数量对每种细胞类型特异性的位点计数，即假设在所有有核细胞中。然而，在其特异性的表观遗传位点处测试纯化的细胞类型显示，用GAPDH作为分母的定量偏离用位点特异性甲基化的扩增系统获得的定量。这些偏差取决于个别位点和扩增系统(22,23)，表明用来自经计算机模拟转化的质粒的标准曲线进行标准化并不能完全抵消实际上重亚硫酸盐转化的DNA的扩增差异。质粒DNA是双链的，并且包含超出用于表观遗传扩增的模板约40％的GC(24)。相反，重亚硫酸盐转化的DNA主要是单链的，其在扩增后GC含量显著降低。此外，后者已被暴露于导致片段化的苛刻的化学处理，这并不能在物理上通过经计算机模拟的脱甲基化的胞嘧啶转化为胸腺嘧啶来代表。
为了补偿该效应，将含有GAPDH的原始脱甲基化的基因组序列和所有免疫细胞类型特异性的标志物基因的单个质粒分子(“校准物”)与生物样品一起处理。该校准物提供了经过不同的qPCR系统的重亚硫酸盐转化的DNA的相对和等摩尔定量。然而，其并不取代标准质粒，因为重亚硫酸盐转化过程中精确的独立定量是一个挑战。因此，经计算机模拟的重亚硫酸盐转化的质粒(“标准物”)继续用于拷贝数确定。校准物质粒提供了在各种实验中高度可重复的测量，并补偿了观察到的GAPDH和位点特异性测定之间的效率差异。总之，标准物和校准物质粒的平行使用使表观遗传qPCR成为相对于所有(脱甲基化的)GAPDH拷贝在各自的位点中脱甲基化的确证定量(17)的方法。
图1和表1中的数据表明，差异甲基化位点的分析是用于检测和定量确定的免疫细胞类型的强有力的替代。然而，除了细胞类型特异性之外，如果想要通过这种方式进行细胞计数，则需要通过实验确定细胞类型和DNA拷贝数的直接比例关系。这样的直接线性关联可能受到血小板、网织红细胞中的残留DNA或DNA拷贝和细胞数之间转换的影响。因此，通过表观遗传qPCR的细胞定量与FCM分析进行正交比较。当使用本研究中引入的确证相对定量时，个别细胞类型和标志物的数据略有不同，其系统偏差范围为-6％至+11％。然而，总体来说，两种技术作为整体和所选择的个别标志物之间观察到较高的方法学一致性。
关于常规临床应用，WHO在HIV治疗指南中认可相对细胞类型定量，但医疗现实要求每个体积的细胞计数(25,26)。对于表观遗传免疫细胞分型，这引起了问题，因为DNA回收未完全定量，并且DNA量和血液体积之间的关系未在生物学上确定。然而，将确定浓度的倒置的GAPDH变体(GAP[GC])加标至血液样品中允许近似推断DNA提取之前的原始DNA含量。尽管已经描述了基因组DNA和质粒DNA的不同效率(27)，但这样的差异在重亚硫酸盐处理和产生片段化后可能显著减少。为了评估加标概念，将表观遗传免疫细胞计数与来自相同血液样品的流式细胞术数据进行平行。关于一致性的偏差和极限(28)，相比先前发表的基于抗体的不同方法之间的方法学比较(29)，所呈现的数据显示出均匀的误差分布和更小的偏差。因此，发明人的数据表明，可以通过表观遗传免疫细胞计数可靠地检测白细胞亚群，并且其几乎与FCM数据相当。
定量诊断标志物的内在挑战是其在正常生理范围之外的可靠性能，且来自简便保存的样品。对于免疫细胞定量，PID构成了这样的情况。患者患有严重的免疫缺陷，并且经FCM的定量细胞计数对用于新生儿筛查的干血卡是不可行的。
在这样的情况下，与金标准方法的诊断性能的比较可以最好地告知新方法的诊断能力。因为直接方法比较由于TREC计数相比通过FCM和/或表观遗传qPCR的细胞定量之间的不同测量参数而不可行，这样的结果比较显得不可或缺。表观遗传免疫细胞计数可以从干血斑可靠地识别所有PID患者，包括XLA患者。此外，其提供了有关NK细胞水平(潜在的基因缺陷的重要提示，特别是ADA-SCID)的信息，因为在这些延迟发作形式的SCID中，NK细胞(与其他形式的SCID相反)缺失。
总之，本发明表明，表观遗传细胞计数提供了用于免疫监测的精确且准确的方法，无论是作为百分比的连续参数或绝对细胞计数测量或者作为分类参数测量。当检测到较低的方法一致性时，如对单核细胞的表观遗传和FCM标志物之间所观察到的，这表明给定细胞群内的异质性或者不明确的标志物特异性影响一致性。
总而言之，本发明通过提供能够从微量的简便保存的血液分析样品的高度稳健的平台，强调了表观遗传免疫监测作为有价值的诊断方法用于免疫诊断的适用性。
现在将在以下实施例和附图中进一步解释本发明，但其不限于此。出于本发明的目的，本文引用的所有参考文献均通过引用整体并入本文中。
图1显示了纯化的免疫细胞群中的标志物基因的DNA甲基化谱图。矩阵显示了7种标志物基因和参照基因GAPDH的细胞类型特异性的DNA甲基化模式。在矩阵中，免疫细胞类型以列排列，如x轴处所示的。基因和相应的扩增子(Amp)在y轴处显示。基因通过红线分离，每行代表单个的CpG位点。测量的CpG甲基化水平根据范围从黄色(0％甲基化)至蓝色(100％甲基化)的彩色温标进行颜色编码。
图2显示了表观遗传细胞计数的不同定量方法的示意性概览。对于所有方法，发明人假定了简化的2个等位基因比1个细胞(2-allels-to-1-cell)关系。本发明中各分析的基因为常染色体的(即二倍体)，并且已表明在一种特异性的细胞类型(在该方案中：CD4+T辅助细胞中的CD4位点)中为脱甲基化的，而在所有其他的血液细胞类型中为完全甲基化的。A)示意了位点特异性相对百分比定量的过程。在具有未知数目(#)的脱甲基化的和甲基化的二倍体基因组DNA拷贝的血液样品中，通过仅将脱甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶，重亚硫酸盐转化将表观遗传甲基化状态转换成原来的序列。在CpG位置中，甲基化的和脱甲基化的胞嘧啶根据特异性的基因调控而出现。转化的尿嘧啶DNA为通过qPCR特异性扩增的CpG甲基化状态，由此具有腺苷酸的尿嘧啶碱基对在原来脱甲基化的区域处产生包含TpG二核苷酸的扩增物。然后，qPCR允许基于计算系列稀释的经计算机模拟转化的质粒，通过扩增结果(f)的线性插值(f-1)对拷贝数计数。通过该位点处原来脱甲基化的拷贝的内插拷贝数除以该位点处的所有拷贝，即甲基化的和脱甲基化的拷贝，来计算基因组位点处的相对百分比甲基化。生物样品中的转化干扰了基因组DNA的完整性，而质粒代表扩增产物而非底物。通过未知的“转化因子(CF)”给出所得到的扩增效率的差异。当比较具有很少甲基化状态依赖性SNPs的两个高度同源序列的扩增时，其被认为是可忽略的。对于通用相对百分比qPCR(B)，关于使用经计算机模拟转化的质粒标准物、其内插和细胞类型特异性脱甲基化的基因位点，采用了相同原理的表观遗传定量。并非评估细胞特异性脱甲基化的位点，而是扩增代表所有细胞的通用脱甲基化的GAPDH位点。使用这作为定量参照，所有特异性的位点均可标准化为全部基因组拷贝计数。在这种情形下不能假定CF是相似的，因为在不同序列之间未假定同源性。因此，每种所有细胞的相对脱甲基化受到存在不同CF的干扰。为抵消不同转化效率的影响，按C)中所示引入了校准物质粒。其含有等摩尔的所有相关细胞特异性位点和GAPDH的基因组序列。扩增的内插提供了干扰不同转化特异性效率的拷贝数。不同拷贝数的比率提供了效率因子(EF)，其可用于消除标准物和样品之间转化相关的差异。将EF并入(B)中提供了确证拷贝数定量。D)对于每个体积血液的细胞的计数，确定量的血液补充有已知拷贝数的含有合成的非天然DNA序列(GAP-GC)的质粒。使用经计算机模拟转化的质粒的相对定量和EF计算按如上所示操作。插入起始量的GAP-GC允许监测DNA制备、转化，且qPCR提供了处理效率的良好预测物。于是计算起始量的血液细胞成为可能。
图3显示了通过流式细胞术和表观遗传qPCR比较来自25名健康供体血液的免疫细胞定量。将如经流式细胞术(y轴)测量的免疫细胞对经免疫细胞类型特异性的表观遗传qPCR分析(x轴)确定的相应值作散点图。A)显示了相对免疫细胞计数，其中值以总白细胞中的百分比给出。线性Pearson相关系数为r＝0.95。B)显示了绝对免疫细胞计数，其中值表示为每μl血液的细胞数，其特征在于相关性为r＝0.95。红线表示由所有数据点计算的回归线，黑线表示等分线。右侧图例中的符号表示不同的个体免疫细胞群。
图4显示了HIV组群中T细胞亚群的流式细胞术和表观遗传qPCR分析之间的方法比较。A)示出了相对免疫细胞计数的比较(以与总有核细胞相关的％表示)。大图显示了经表观遗传qPCR分析(x轴)和流式细胞术(y轴)分析的三种T细胞群的散点图。黑线和红线分别代表等分线和回归线。根据Pearson的线性相关系数是r＝0.982(p<0.0001)。小图显示了Bland-Altman分析，其中将在每种表观遗传和细胞计数测量(x轴)之间平均的平均细胞计数(以％表示)对其(相对)差异(y轴)作图。在每幅Bland-Altman图中，上部和下部红线反映了一致性的极限，且中心的红线示出了系统偏差。在每条红线的上方和下方，95％置信区间显示为灰色虚线。上方Bland-Altman图：总T细胞；偏差：6.43％；一致性下限：-9.15％；一致性上限：22.02％。中图：细胞毒性T细胞；偏差：11.23％；一致性下限：-15.36％；一致性上限：37.83％。右下：辅助T细胞；偏差：-6.04％；一致性下限：-41.34％；一致性上限：29.25％。B)显示了绝对免疫细胞计数(如以每μl血液的细胞表示)的比较。左侧：散点图分析；Pearson r＝0.955(p<0.0001)。右侧：Bland-Altman分析：上图：总T细胞；偏差：-4.76％；一致性下限：-39.62％；一致性上限：30.09％。中图：细胞毒性T细胞；偏差：0.03％；一致性下限：-35.78％；一致性上限：35.83％。右下：辅助T细胞；偏差：-17.61％；一致性下限：-59.68％；一致性上限：24.46％。
图5显示了利用CD3+T细胞、CD19+B细胞、CD56+NK细胞(以及下文的CD4和CD8T细胞)的表观遗传标志物分析对照Guthrie卡和PID病的。健康对照以灰点给出，且从log转换的拷贝数预估了双变量正态分布的99％(蓝色)和99.9％(红色)置信区间。测试群体的测量数据作为数字给出，且根据表型进行颜色编码。
实施例
简写：Amp，扩增子；qPCR，定量实时聚合酶链式反应；FCM，流式细胞术；HSCT，造血干细胞移植。RDls，位点特异性的相对脱甲基化；RDu，通用的相对脱甲基化；DDu，通用的确证脱甲基化；LC，白细胞计数；CF，转化因子。
白细胞群。外周血血液样品获自健康供体，并通过如先前所述(16)的高速荧光活化细胞分选法分成CD15+粒细胞、CD14+单核细胞、CD56+自然杀伤细胞、CD19+B-淋巴细胞、CD3+CD4+T-辅助细胞和CD3+CD8+细胞毒性T细胞。通过流式细胞术测定的分选细胞的纯度为>97％，且活力为>99％。
外周血全血样品。EDTA-抗凝血的外周血样品采集自25名健康对象(来自各一次血液抽取)、在德国门诊诊所接受治疗的97名HIV+患者(各一次血液抽取)和26名来自圣拉斐尔大学医院(San Raffaele University Hospital)的接受造血干细胞移植的(急性髓性)白血病患者。从后一组群中，从调理阶段至移植后180天进行了92次血液抽取。对所有样品平行进行表观遗传qPCR分析和标准流式细胞术分析，以用于免疫细胞定量(见下文)，而无需根据医疗器械法(Medical device act)进行额外的静脉穿刺。相关机构给出了伦理同意。对于表观遗传分析，所有数据对实验者都是设盲的。对于诊断性FACS分析，样品未设盲。
DNA制备。对于纯化的免疫细胞的测序和qPCR分析，使用DNeasy组织试剂盒(Qiagen)根据厂商说明书分离基因组DNA。在所有其他的应用中，对血液样品进行单管溶解和重亚硫酸盐转化，而无需之前的DNA制备。
重亚硫酸盐转化。为了转化纯化的基因组或质粒DNA，根据厂商方案使用EpiTectFast重亚硫酸盐转化试剂盒(Qiagen)。为了直接重亚硫酸盐转化全血，将20μl的EDTA抗凝血血液(或校准物质粒)与16μl裂解缓冲液、3μl蛋白酶K(Qiagen)，以及合适时1μl GAP[GC]标定物质粒混合，产生20,000个拷贝/μl血液，然后在59℃孵育10分钟。对于转化，添加90μl重亚硫酸铵(68-72％,pH 4.8-5.3,Chemos AG)和30μl四氢糠醇(Sigma-Aldrich)。根据“EpiTect快速重亚硫酸盐转化试剂盒”方案进行转化和转化的DNA的纯化。
重亚硫酸盐测序。在包含1x PCR缓冲液、1U Taq DNA聚合酶(Qiagen)、200μMdNTPs、12.5pmol各正向和反向引物和约10ng的重亚硫酸盐转化的基因组DNA的25μl终体积中进行PCR扩增，反应程序为95℃ 15分钟和40个循环的95℃ 1分钟、55℃ 45秒和72℃ 1分钟和最后延伸步骤72℃ 10分钟。使用ExoSAP-IT(USB Corp.)纯化PCR产物，并使用一种PCR引物，应用ABI Big Dye Terminator v1.1-chemistry(Applied Biosystems)测序，然后在ABI 3100基因分析仪上进行毛细血管电泳。使用ESME(18)解译AB1文件。
表观遗传qPCR分析。使用Roche LightCycler 480Probes Master chemistry在10μl的终体积中进行实验，其包含50ngλ-噬菌体DNA(New England Biolabs)和多达100ng转化的DNA模板或足量的质粒。各引物的标准浓度为1.5μM，除了基因组标定物质粒外(0.75μM)。CD4+T细胞TpG测定(4.5μM正向引物；3μM反向引物)。标准探针浓度为0.25μM，除了CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞和标定物质粒外(对于TpG-特异性的系统，各0.125μM探针)。热概况为95℃ 10分钟，接着50个循环的95℃ 15秒和61℃ 1分钟。
质粒。对应于甲基化的或脱甲基化的标记区域的两种重亚硫酸盐转化的序列经计算机模拟设计、合成并插入至质粒pUC57(Genscript Inc.)中，并用作测定建立的阳性对照和qPCR实验的定量标准物。标准质粒具有所有测定靶标序列(作为TpG或CpG变体)，并经分子内连接，提供了等摩尔的所有测定靶标。质粒经分光光度法定量，通过Sca I线性化，并在10ng/μl的λ-噬菌体DNA(New England Biolabs)中连续稀释，以获得每个反应31250、6250、1250、250、50或30个拷贝的定量标准物。对于qPCR标准化，产生单个校准物质粒，其等摩尔地包含基因组未转化的脱甲基化形式的所有测定靶标序列。对于每μl血液的白细胞定量，设计并产生了携带未转化的人工GAPDH基因区域的标定(spike-in)质粒，其正好相当于GAPDH特异性qPCR测定的靶标，但所有CpG二核苷酸倒置为GpCs(GAP[GC])。
寡核苷酸。正向(fp)、反向(rp)引物和水解探针(p)(Metabion AG)通过其相对于人类基因组组装GRCh38.p5、Release 84(March 2016)的染色体位置来指示。用于重亚硫酸盐测序的寡核苷酸：AMP1255:fp:12:6790192-214,rp:12:6790582-603；AMP1730:fp:9:128149251-72,rp:9:128149589-609；AMP2000:fp:12:6790724-46,rp:12:6791160-80；AMP2001:fp:12:6791141-62,rp 12:6791535-60；AMP2007:fp:2:86821232-54,rp 2:86821674-95；AMP2178:fp:6:161375641-62,rp6:161376086-108；AMP2249:fp:11:68371460-81,rp:11:68371926-47；AMP2674:fp:16:88653882-902,rp:16:88654299-88654320。用于qPCR分析的寡核苷酸：CD4:TpG:fp:12:6790871-98,rp:12:6791046-73,p:12:6790998-1019；CpG:fp:12:6790871-900,rp:12:6791046-72,p:12:6790997-1020。CD8B:TpG:fp:2:86821374-1400,rp:2:86821476-93,p:2:86821425-52；CpG:fp:2:86821372-1401,rp:2:86821463-83,p:2:86821425-55。LPR5:TpG:fp:11:68371608-28,rp:11:68371721-45,p:11:68371666-84；CpG:fp:11:68371611-35,rp:11:68371720-48,p:11:68371662-86。MVD:TpG:fp:16:88654112-36,rp:16:88654173-90,p:16:88654136-55；CpG:fp:16:88654111-36,rp:16:88654172-89,p:16:88654136-58。PARK2:TpG:fp:6:161375730-55,rp:6:161375851-66,p:6:161375804-25；CpG:fp:6:161375784-807,rp:6:161375851-70,p:6:161375805-830。LCN2:TpG:fp:9:128149258-78,rp:9:128149353-75,p:9:128149289-309；CpG:fp:9:128149257-77,rp:9:128149353-76,p:9:128149287-309。CD3+T细胞和GAPDH特异性扩增子和qPCR系统的寡核苷酸先前已发表(15)。
全血样品的流式细胞术表征–为了比较表观遗传分析和标准流式细胞术的结果，在溶解红细胞后通过MACSQuant血细胞计数器(MiltenyBiotec,Bergisch Gladbach)测定了CD45+白细胞的绝对数量。另外，按先前所述(14,32)计算了CD15+粒细胞、CD14+单核细胞、CD19+B细胞、CD56+NK细胞、总CD3+T细胞以及CD4+和CD8+亚群的频率和绝对计数。
统计分析-通过应用LC480软件(Roche)的最大二阶导数法计算聚集三次重复测量的CP(“交叉点”)，以从利用基于质粒的标准物的稀释物产生的校准曲线通过扩增(f)的插入(f-1)产生拷贝数(“质粒单位”)。流式细胞术和基于qPCR的测量技术之间的方法比较按如下进行：来自两种方法的双变量数据在散点图中绘制。进行线性回归以测试：a)不同于1的斜率和b)不同于0的截距。检查Bland-Altman图分析偏差和精确度统计(28)。可接受的精确度被认为是偏离偏差的平均值百分比，反映了对内部测定性能的变异系数的内部限制，即0.2。这转化为可接受的0.4的一致性极限。发明人报导了估计的偏差、精确度统计和各自的95％置信区间。对于相关性，使用了Pearson积矩相关系数。使用Cohens-Kappa系数(19)评估Rater一致性。所有的p值都是双侧的。采用统计软件R 3.3.0。
细胞类型特异性的重亚硫酸盐转化。通过重亚硫酸盐测序(18)分析CpG-二核苷酸的甲基化依赖性转化，目的在于鉴定从人外周血中分选的免疫细胞群。候选位点选自文献或来自基因组范围的发现实验。作为CD4+T辅助细胞的可能标志物，发明人设计了三种扩增子(Amp)用于重亚硫酸盐序列分析，其涵盖CD4基因的第一个内含子5’区域内的调控元件(Amps1255、2000和2001)。在重亚硫酸盐转化且仅在靶细胞即CD3+CD4+T淋巴细胞中扩增后，未甲基化的CpG位点被检测为TpG残基。对照细胞类型中相同的CpG对重亚硫酸盐转化呈惰性，包括CD56+自然杀伤(NK)细胞、CD3+CD8+T淋巴细胞、CD14+单核细胞、CD19+B淋巴细胞和CD15+粒细胞(图1)。发明人通过在其第三个内含子内设计靶向调控元件的扩增子(Amp2007)，研究了CD8B基因作为CD8+细胞毒性T细胞的潜在apt表观遗传标记。这里，重亚硫酸盐介导的CpGs转化仅在CD3+T CD8+(靶标)细胞中观察到，而对照细胞类型中CpGs对转化呈惰性。类似于CD8+和CD4+T细胞的数据，发明人鉴定了表观遗传标记，每个表观遗传标记在靶细胞类型中为独特地脱甲基化的，并且在相应的对照白细胞群中为完全甲基化的。对应于基因LRP5(Amp2249)和MVD(Amp2674)的扩增子分别用作B细胞和NK细胞的表观遗传标志物。先前公布了构成CD3+T细胞的标志物的基因间CD3G和CD3D区域(Amps 1405、1406和1408)的DNA甲基化谱图和GAPDH(Amp 1570)的甲基化谱图(15)。
位点特异性的相对qPCR测量。靶向上述差异性甲基化的CpG位置，如方法部分中所述设计定量PCR测定系统。qPCR系统的特征在于克隆到质粒中的经计算机模拟的重亚硫酸盐转化的模板DNA(图2A，右图)。对于TpG模板(模拟基因组DNA中的脱甲基化的CpGs)，通用质粒携带等摩尔化学计量的用于所有测定的靶标区域和人工GAP[GC]序列(通用TpG质粒)，而为每个扩增子单独设计了“CpG质粒”(模拟基因组DNA中的甲基化的CpG)。在相互对立模板中观察到高技术特异性没有交叉反应性(表1，“基于质粒的对照”)。通过将来自相应的扩增(f’)的PCR信号与连续稀释的质粒的扩增(f)相关联，来估计血液样品中的基因序列的原始拷贝数(图2A)。针对纯化的免疫细胞群测试了生物学测定特异性。对于靶细胞类型，TpG和CpG系统中分别观察到高和低拷贝数。相反，对于对照细胞类型，在TpG系统中发现了低拷贝数，而在CpG系统中发现了高拷贝数。各自的基因位点(RDls)处的相对脱甲基化在靶标细胞类型中范围为89.9％至100％，而在对照中为0.0％至3％(表1)。对于纯化的CD4+T细胞观察到例外，在CD8B位点处显示8.9％的脱甲基化，且反之亦然(即CD8+T细胞中9.6％的CD4脱甲基化)。
通用和确证定量。为了提供所有细胞的定量的联合基础，将脱甲基化的GAPDH特异性扩增与上述细胞特异性的TpG系统一起分析(图2B)。通用TpG质粒作为扩增标准物。利用这种方式，通过将每种标志物和GAPDH的样品扩增f’与标准物扩增(f)相关联来确定样品中的通用相对脱甲基化(RDu)。发明人的数据表明，RDu并不总是与相应的位点特异性脱甲基化(RDls)匹配。为了补偿该固有的系统变化，采用了“校准物质粒”，其具有等摩尔量且为其未转化(即脱甲基化的)状态的所有测定靶标。基于未转化的质粒估计在基于标准物质粒的标准化后保留的单个qPCR系统之间的效率差异，并产生qPCR效率因子(EF)。在约25个实验中测定了每个细胞类型特异性的测定和GAPDH之间的平均EF，且范围为对于CD4的0.53至对于CD3x和y的1.17(表1.EF)。接着，EF在通用相对脱甲基化(RDu)上的应用允许通用确证脱甲基定量(DDu；图2c)。
通过引入具有将所有CpG二核苷酸倒置为GpC的人工GAPDH序列(GAP[GC])的“标定质粒”和相应的qPCR测定来确立绝对定量。GAP[GC]特异性的qPCR测定的底物特异性在来自含有和不含标定物质粒的全血的重亚硫酸盐转化的DNA上得到了证实，其中未检测到与内源性GAPDH基因的交叉反应性。相反，当在含有GAP[GC]序列的标定质粒模板测试GAPDH特异性的qPCR测定时，未检测到扩增信号，这也证明了高底物特异性，这对于绝对定量是必不可少的。对于免疫细胞计数，将标定质粒加入到血液样品中，产生每个给定初始样品体积的确定浓度(图2D)。另外，经计算机模拟的重亚硫酸盐转化的质粒标准物和校准物质粒上包含人工GAP[GC]序列，得到各自的用于校正的等摩尔因子(EF)为0.87(GAP[GC]；0.83/0.92)。
通过流式细胞术和表观遗传qPCR的比较性免疫细胞计数。对来自25名成年健康供体的血液样品进行标准流式细胞术(FCM)和表观遗传qPCR，以用于CD15+中性粒细胞、CD14+单核细胞、CD19+B细胞、CD56+NK细胞、CD3+、CD4+和CD8+T细胞的通用定量。将来自两种方法的数据作为相对计数(图3A)或绝对(图3B)对彼此作图。散点图指示两种方法间高水平的一致性，对于白细胞群的相对定量和绝对定量其Pearson相关系数r为0.95(p<0.0001)。比较FCM和表观遗传qPCR相对定量的回归曲线并未明显偏离平分线。然而，对于绝对定量观察到差异较小但显著不同的斜率，指示成比例的系统偏差。
为了在真实临床环境中测试发明人的新方法，发明人测量了来自97名HIV+对象的血液样品，关于CD3+、CD4+和CD8+细胞计数通过标准FCM和表观遗传计数来定量。在本发明中，相关性分析得到相对和绝对定量的Pearson r相关系数范围为0.91-0.98(p<0.0001)(图4)。绝对定量基于将GAP[GC]质粒加标至血液样品中，以应用GAP[GC]特异性的qPCR测定系统确定全部白细胞计数。如通过FCM和表观遗传qPCR方法确定的白细胞数高度相关(Pearson r＝0.8；p<0.0001)。为了评估方法可比性，发明人进行了Bland-Altman分析(17；图4)。对于所有3种细胞类型，两种方法之间的系统差异(偏差)小于11％(相对的)和18％(绝对的)。此外，当比较FACS与表观遗传qPCR时，对于所有3种标志物，非系统波动保持低于25％，表明两种方法不精确度水平低。根据这些数据，对于所有系统类型，FCM和表观遗传计数的生物读数似乎是良好关联的。样品采集和预处理并不总是确保已知量的血液，例如在干血斑中，不包括流式细胞术分析。在这些情形下，为了测试表观遗传qPCR的诊断精确度，发明人测定了采集自250名健康新生儿的Guthrie卡和来自患有SCID(x患者)、ADA-SCID(y)和XLA(z)的原发性免疫缺陷病患者的30张血液卡中的免疫细胞计数。在分析之后，数据未设盲，将结果与利用TREC和KREC分析和公开的可利用的遗传分析获得的数据进行比较。如图5中所示，在CD3对GAPDH图中，15个SCID病例中有13个显示了正常人群的99.9％的置信区间，提供了仅阳性诊断。第11号病例在B细胞分析中位于99％CI之外，且在NK细胞分析中位于99.9％CI之外。第10号SCID位于T细胞分析的“正常人群”之内，但在B细胞和NK细胞对GAPDH分析中位于99.9％CI之外。第10号和第11号SCID病例中的这些组合明确表明免疫细胞恒稳态的剧烈改变，且需要完全的筛选后分析。当分析延迟发作的SCID病例时，第23号位于99.9％区间之外，第30号位于99％CI之外，而第28号病例在T细胞分析中似乎是不可疑的。然而，所有3个病例在B细胞分析中均检测到位于99.9％CI之外，且至少在NK细胞计数中位于99％CI之外。对于第1号和第8号病例报导了XLA患者中的T细胞水平位于99％CI之外，但所有5个病例在B-细胞中位于99％CI之外，其中第1号、第2号、第6号和第8号位于99.9％CI之外。同样，对于NK细胞病例8和15位于99％CI之外。在B细胞分析中，第15号病例位于99％CI之外。在所有测定中加标至发明测试中的健康对照(第12号、第14号和第29号)位于99％CI之内，且对于T细胞来自先前接受过干细胞移植的患者(第13号、第18号、第20号)的对照样品位于99％CI之内，但第18号仍然鉴定为“非正常”。在本分析中未鉴定出具有明显的母体植入的SCID病例，因为在所有分析的标志物中其似乎为完全不可疑的。最后，CD4和CD8细胞部分的分析支持CD3标志物的发现，但相比CD3筛选未显示显著的单个附加值。GAPDH、CD3、B细胞和NK细胞测定的关联分析似乎提供了精确诊断的信息。随着将3个系列中的每个调整至99％或(99.9％)CI，发明人需要校正多重性，并经Bonferroni校正获得3％(0.3％)水平的族系误差率(family-wise-error-rate)(I类错误的一般化)的控制。
表1
表1.RDls：以％表示的相对脱甲基化(位点特异性的)；RDu：以％表示的相对脱甲基化(通用的)；EF：效率因子；DDu：以％表示的确证脱甲基化(通用的)
引用的参考文献：
1.)Adan A,et al(2016)Flow cytometry:basic principles andapplications.Crit Rev Biotechnol.14:1-14.
2.)Whitby L,et al.(2015)Current laboratory practices in flowcytometry for the enumeration of CD 4(+)T-lymphocyte subsets.Cytometry B ClinCytom.；88(5):305-11
3.)Nebe CT,et al.(2013)Messunsicherheit undim Bereichderder Lymphozytensubpopulationen im peripheren Blut.JLab Med 37(5):233–250.
4.)Herzenberg LA,et al.(2006)Interpreting flow cytometrydata.Nat.Immunol.,7(7):681-685.
5.)Kverneland AH,et al.(2016)Age and gender leucocytes variances andreferences values generated using the standardized ONE-Inventionprotocol.Cytometry A.89(6):543-64.
6.)Maecker HT,et al.(2012)Standardizing immunophenotyping for theHuman Immunology Project.Nat Rev Immunol.12(3):191-200.
7.)Maecker HT,McCoy JP Jr；FOCIS(2010)Human ImmunophenotypingConsortium,Amos M,et al.,A model for harmonizing flow cytometry in clinicaltrials.Nat Immunol.11(11):975-8.
8.)WHO(2016).Consolidated guidelines on the use of antiretroviraldrugs for treating and preventing HIV infection.Recommendations for a publichealth approach-Second edition.
9.)European Aids Clinical Society(2015).European Guidelines fortreatment of HIV-positive adults in Europe(Version 8.0；June 2016).
10.)Slatter MA,Cant AJ(2011)Hematopoietic stem cell transplantationfor primary immunodeficiency diseases.Ann N Y Acad Sci.1238:122-31
11.)Thoma MD,et al.(2012)Peripheral blood lymphocyte and monocyterecovery and survival in acute leukemia postmyeloablative allogeneichematopoietic stem cell transplant.Biol Blood Marrow Transplant.18(4):600-7.
12.)Nina Shah N,et al.(2015)Hematopoietic Stem Cell Transplantationfor Multiple Myeloma:Guidelines from the American Society for Blood andMarrow Transplantation.Biol Blood Marrow Transplant 21:1155-66.
13.)Auletta JJ and Lazarus HM(2005)Immune restoration followinghematopoietic stem cell transplantation:an evolving target.Bone MarrowTransplantation.35:835–857.
14.)Wieczorek G,et al.,(2009)Quantitative DNA methylation analysis ofFOXP3 as a new method for counting regulatory T cells in peripheral blood andsolid tissue.Cancer Res.69:599-608.
15.)Sehouli J,et al.(2011)Epigenetic quantification of tumor-infiltrating T-lymphocytes.Epigenetics 6:236-46.
16.)Baron U,et al.,(2007)DNAdemethylation in the human FOXP3 locusdiscriminates regulatory T cells from activated FOXP3(+)conventional Tcells.Eur J Immunol.37:2378-2389.
17.)Lee JW,et al.,(2006)Fit-for-purpose method development andvalidation for successful biomarker measurement.Pharm Res.23(2):312-28.15.
18.)Lewin J,et al.(2004)Quantitative DNAmethylation analysis based onfour dye trace data from direct sequencing of PCR amplificates.Bioinformatics20:3005-12.
19.)Mary L.McHugh(2012)Interrater reliability:the kappastatistic.Biochem Med(Zagreb)；22(3):276–282.
20.)Warnecke PM,Stirzaker C(1997)Detection and measurement of PCRbias in quantitative methylation analysis of bisulphite-treated DNA.NucleicAcids Res.25(21):4422-6.
21.)de Jonge HJM,et al.,(2007)Evidence based selection ofhousekeeping genes.PLoS One.2(9):e898
22.)Chen D,et al.,(1999)Differential reactivity of the rat S100A4(p9Ka)gene to sodium bisulfite is associated with differential levels of theS100A4(p9Ka)mRNA in rat mammary epithelial cells.J Biol Chem.274(4):2483-91.
23.)Harrison J,Stirzaker C,Clark SJ(1998)Cytosines adjacent tomethylated CpG sites can be partially resistant to conversion in genomicbisulfite sequencing leading to methylation artifacts.Anal Biochem.264(1):129-32
24.)International Human Genome Sequencing Consortium(2001)Initialsequencing and analysis of the human genome.Nature 409:860–921
25.)Moore,DM,et al.(2006)CD4 percentage is an independent predictorof survival in patients starting antiretroviral therapy with absolute CD4cell counts between 200 and 350 cells/microL.HIV Med 7:383-388.
26.)Yu LM,Easterbrook PJ,Marshall T(1997)Relationship between CD4count and CD4％in HIV-infected people.Int J Epidemiol.26(6):1367-72.
27.)Read SJ(2001)Recovery efficiencies of nucleic acid extractionkits as measured by quantitative LightCyclerTM PCR.Mol Pathol.54(2):86–90.
28.)Giavarina D.(2015)Understanding Bland Altman analysis.BiochemiaMedica.25(2):141–51.
29.)Rodriguez WR,Christodoulides N,Floriano PN,Graham S,Mohanty S,Dixon M,Hsiang M,Peter T,Zavahir S,Thior I,Romanovicz D,Bernard B,Goodey AP,Walker BD,McDevitt JT(2005)A microchip CD4 counting method for HIV monitoringin resource-poor settings.PLoS Med 2(7):e182-e182.
30.)Israeli M,Klein T,Herscovici C,Ram R,Shpilberg O,Sredni B andYeshurun M.(2013)Cellular immune function monitoring after allogeneichaematopoietic cell transplantation:evaluation of a new assay.Clin ExpImmunol.172(3):475–482.
31.)Tsikas D(2009)A proposal for comparing methods of quantitativeanalysis of endogenous compounds in biological systems by using the relativelower limit of quantification(rLLOQ).
J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci.877(23):2244-51.
32.)Boldt A,Borte S,Fricke S,Kentouche K,Emmrich F,Borte M,KahlenbergF,Sack U(2014)Eight-color immunophenotyping of T-,B-,and NK-cellsubpopulations for characterization of chronic immunodeficiencies,Cytometry BClin Cytom.86(3):191-206.

Claims (11)

1.血液免疫细胞的定量甲基化测定方法，其包括以下步骤：
a)提供确定量的人血液样品，其包含待定量的血液免疫细胞的二倍体基因组DNA；
b)提供经计算机模拟的重亚硫酸盐转化的重组核酸，其包含至少一个脱甲基化标准基因和所述至少一个脱甲基化标准基因的所有CpG二核苷酸倒置为GpC的序列(“标准物I”)；
c)提供重组核酸，其包含b)所述的至少一个脱甲基化标准基因和b)所述的至少一个脱甲基化标准基因的所有CpG二核苷酸倒置为GpC的序列的脱甲基化的基因组序列(“校准物I”)；
d)提供重组核酸，其包含b)所述的至少一个脱甲基化标准基因的所有CpG二核苷酸倒置为GpC的序列(“标定物I”)；
e)向a)所述的样品添加确定量的d)所述的重组核酸(“加标”)；
f)利用重亚硫酸盐处理a)所述的待定量的细胞的二倍体基因组DNA以及c)和d)所述的重组核酸，以将未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶；
g)使用适当的引物对扩增a)、b)、c)和f)所述的核酸分子，以产生扩增子；以及
h)基于分析所述扩增子确定每体积样品的血液免疫细胞(BIC)。
2.血液细胞的定量甲基化测定方法，其包括以下步骤：
a)提供人血液样品，其包含待定量的血液细胞的二倍体基因组DNA；
b)提供经计算机模拟的重亚硫酸盐转化的重组核酸，其包含至少一个脱甲基化标准基因和至少一个血液细胞特异性基因(“标准物II”)；
c)提供重组核酸，其包含b)所述的至少一个脱甲基化标准基因和b)所述的至少一个血液细胞特异性基因的脱甲基化的基因组序列(“校准物II”)；
d)利用重亚硫酸盐处理a)所述的待定量的细胞的二倍体基因组DNA和c)所述的重组核酸，以将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶；
e)使用适当的引物对扩增a)、b)、c)和d)所述的核酸分子，以产生扩增子；以及
f)基于分析所述扩增子确定每种所有细胞的脱甲基化百分比(DDC)。
3.确定免疫细胞类型的甲基化基因的绝对拷贝数的方法，其包括：
a)实施权利要求1所述的方法，
b)实施权利要求2所述的方法，以及
c)将所确定的BIC与所确定的DDC相乘。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述血液免疫细胞选自：白细胞、T-淋巴细胞、粒细胞、单核细胞、B-淋巴细胞和/或NK细胞。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述重组核酸分子选自：质粒、酵母人工染色体(YAC)、人类人工染色体(HAC)、PI来源的人工染色体(PAC)、细菌人工染色体(BAC)和PCR产物。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述脱甲基化标准基因选自在待检测的所有细胞中表达的基因如，例如看家基因，如，例如GAPDH。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述血液细胞特异性基因选自在待检测的所有血液细胞中表达的基因如，例如CD4。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述血液样品选自：外周血、毛细血管血或静脉血样品或以上的部分如，例如外周血单核细胞，血块和干血斑。
9.如权利要求3-8中任一项所述的方法，其还包括基于所述定量推断哺乳动物的免疫状态的步骤。
10.诊断试剂盒，其包含用于实施权利要求1-9中任一项所述方法的材料，任选地，以及使用说明书。
11.权利要求10所述的试剂盒用于实施权利要求1-3中任一项所述的方法的用途。
CN201880010392.6A 2017-02-09 2018-02-08 改进的表观遗传免疫细胞计数方法 Withdrawn CN110382713A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP17155496.7 2017-02-09
EP17155496.7A EP3360971A1 (en) 2017-02-09 2017-02-09 Improved method for epigenetic immune cell counting
PCT/EP2018/053206 WO2018146209A1 (en) 2017-02-09 2018-02-08 Improved method for epigenetic immune cell counting

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110382713A true CN110382713A (zh) 2019-10-25

Family

ID=58016595

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201880010392.6A Withdrawn CN110382713A (zh) 2017-02-09 2018-02-08 改进的表观遗传免疫细胞计数方法

Country Status (7)

Country Link
US (1) US11319581B2 (zh)
EP (2) EP3360971A1 (zh)
JP (1) JP2020505938A (zh)
CN (1) CN110382713A (zh)
AU (1) AU2018217352A1 (zh)
CA (1) CA3051314A1 (zh)
WO (1) WO2018146209A1 (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102018116353B4 (de) * 2018-07-05 2020-06-10 Epiontis Gmbh Verfahren zum Nachweis und zur Zählung epigenetischer Immunzellen in humanen Blutproben für Immundiagnostik und Neugeborenen-Screening
WO2024073508A2 (en) * 2022-09-27 2024-04-04 Guardant Health, Inc. Methods and compositions for quantifying immune cell dna

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2199411A1 (en) * 2008-12-16 2010-06-23 Epiontis GmbH Epigenetic markers for the identification of CD3 positive T-lymphocytes
CN103031372A (zh) * 2012-08-10 2013-04-10 深圳先进技术研究院 Znf545基因甲基化定量检测方法
CN104046686A (zh) * 2005-04-15 2014-09-17 Epi基因组股份公司 分析细胞增殖性病症的方法和核酸
WO2014170497A2 (en) * 2013-04-19 2014-10-23 Epiontis Gmbh Method for identifying the quantitative cellular composition in a biological sample

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9926599B2 (en) * 2012-03-12 2018-03-27 Epiontis Gmbh Epigenetic marker for the identification of CD3CD4 positive T lymphocytes
GB201221133D0 (en) * 2012-11-23 2013-01-09 Epiontis Gmbh Epigenetic method for the identification of subpopulations of CD8 and T lympocytes, in particular CD8 alpha and beta T lymphocytes

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104046686A (zh) * 2005-04-15 2014-09-17 Epi基因组股份公司 分析细胞增殖性病症的方法和核酸
EP2199411A1 (en) * 2008-12-16 2010-06-23 Epiontis GmbH Epigenetic markers for the identification of CD3 positive T-lymphocytes
CN103031372A (zh) * 2012-08-10 2013-04-10 深圳先进技术研究院 Znf545基因甲基化定量检测方法
WO2014170497A2 (en) * 2013-04-19 2014-10-23 Epiontis Gmbh Method for identifying the quantitative cellular composition in a biological sample

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JALID SEHOULI等: "Epigenetic quantification of tumor-infiltrating T-lymphocytes", 《EPIGENETICS》 *
李一君: "自身免疫糖尿病外周血CD4+T细胞DNA甲基化异常的研究", 《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20190390263A1 (en) 2019-12-26
EP3580358A1 (en) 2019-12-18
JP2020505938A (ja) 2020-02-27
EP3360971A1 (en) 2018-08-15
WO2018146209A1 (en) 2018-08-16
US11319581B2 (en) 2022-05-03
CA3051314A1 (en) 2018-08-16
AU2018217352A1 (en) 2019-08-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6577005B2 (ja) 生体サンプルにおける定量的細胞組成を特定する方法
CN108513660A (zh) 免疫组库正常性评估方法及其应用
Cai et al. Single-cell immune profiling reveals functional diversity of T cells in tuberculous pleural effusion
CN108559776A (zh) 一种用于突发性弱精辅助诊断的生物标志物及其应用
De Matteis et al. The impact of sensitive KIT D816V detection on recognition of indolent systemic mastocytosis
Maucourant et al. Natural killer cell activation related to clinical outcome of COVID-19
Esteva-Socias et al. Detection of the EGFR G719S mutation in non-small cell lung cancer using droplet digital PCR
CN110382713A (zh) 改进的表观遗传免疫细胞计数方法
Genshaft et al. Clinical implementation of single-cell RNA sequencing using liver fine needle aspirate tissue sampling and centralized processing captures compartment specific immuno-diversity
CN112400027A (zh) 用于免疫诊断和新生儿筛查的人类血液样品中表观遗传免疫细胞检测和计数的方法
Zhang et al. Expression levels of P-glycoprotein in peripheral blood CD8+ T lymphocytes from HIV-1-infected patients on antiretroviral therapy
Ramos et al. Tissue-resident FOLR2+ macrophages associate with tumor-infiltrating CD8+ T cells and with increased survival of breast cancer patients
Nam et al. High throughput droplet single-cell Genotyping of Transcriptomes (GoT) reveals the cell identity dependency of the impact of somatic mutations
Du Pisani et al. Development of a flow cytometric method to detect the presence of mutated nucleophosmin 1 in acute myeloid leukemia
CN109811041A (zh) 一种检测pik3ca基因h1047r位点的特异性引物对、探针及试剂盒
Subramaniam Implementing and applying multiplexed single cell RNA-sequencing to reveal context-specific effects in systemic lupus erythematosus
Lunar et al. Sequence ambiguity determined from routine pol sequencing is a reliable tool for real-time surveillance of HIV incidence trends
Ranasinghe et al. Comparison of different sequencing techniques with multiplex real-time PCR for detection to identify SARS-CoV-2 variants of concern
CN106755425A (zh) 一种慢性淋巴细胞白血病患者notch1基因突变检测组合物
Ji et al. Significance of combined detection of JAK2V617F, MPL and CALR gene mutations in patients with essential thrombocythemia
ES2786778T3 (es) Procedimiento para identificar la composición celular cuantitativa en una muestra biológica
CN109196101A (zh) 分离的核酸及其在筛查肾上腺皮质腺瘤中的应用
Council et al. neonatalDBSs.
Rakhmanaliev et al. Ion Torrent next generation sequencing for accurate genotyping and detection of resistance associated variants in HCV and HIV
Eryatma et al. APPLICATION OF DNA METHYLATION ON URINE SAMPLE FOR AGE ESTIMATION (Penggunaan Metilasi DNA dalam Perkiraan Umur Individu di Sampel Air Kemih)

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information
CB02 Change of applicant information

Address after: Berlin, Germany

Applicant after: Precision medical Co.,Ltd.

Address before: Berlin, Germany

Applicant before: EPIONTIS GmbH

WW01 Invention patent application withdrawn after publication
WW01 Invention patent application withdrawn after publication

Application publication date: 20191025