JP2020505938A5 - - Google Patents

Claims (11)

1. 血液免疫細胞のための定量的メチル化アッセイのための方法であって、
   a）定量化されるべき血液免疫細胞の2倍体ゲノムDNAを含む規定容量のヒト血液の試料を準備する工程と、
   b）少なくとも1つの脱メチル化標準遺伝子と、前記少なくとも1つの脱メチル化標準遺伝子の全てのCpGジヌクレオチドをGpCに反転する配列とを含むin silicoでバイサルファイト変換された組み換え核酸（「標準I」）を準備する工程と、
   c）前記b）の少なくとも1つの脱メチル化標準遺伝子の脱メチル化されたゲノム配列と、前記b）の少なくとも1つの脱メチル化標準遺伝子の全てのCpGジヌクレオチドをGpCに反転する前記配列の脱メチル化されたゲノム配列とを含む組み換え核酸（「キャリブレーターI」）を準備する工程と、
   d）前記b）の少なくとも1つの脱メチル化標準遺伝子の全てのCpGジヌクレオチドをGpCに反転する配列を含む組み換え核酸（「スパイカーI」）を準備する工程と、
   e）規定量の前記d）の組み換え核酸を前記a）の試料に添加する工程（「スパイキング」）と、
   f）前記a）の定量化されるべき細胞の2倍体ゲノムDNA並びに前記c）及びd）の組み換え核酸をバイサルファイトで処理することで、非メチル化シトシンをウラシルへと変換する工程と、
   g）前記a）、b）、c）、及びf）の核酸分子を適切なプライマー対を使用して増幅させることで、アンプリコンを作製する工程と、
   h）前記アンプリコンの分析に基づいて試料の容量当たりの血液免疫細胞（BIC）を特定する工程と、
   を含む、方法。
2. 血液細胞のための定量的メチル化アッセイのための方法であって、
   a）定量化されるべき血液細胞の2倍体ゲノムDNAを含むヒト血液の試料を準備する工程と、
   b）少なくとも1つの脱メチル化標準遺伝子と、少なくとも1つの血液細胞特異的遺伝子とを含むin silicoでバイサルファイト変換された組み換え核酸（「標準II」）を準備する工程と、
   c）前記b）の少なくとも1つの脱メチル化標準遺伝子の脱メチル化されたゲノム配列と、前記b）の少なくとも1つの血液細胞特異的遺伝子の脱メチル化されたゲノム配列とを含む組み換え核酸（「キャリブレーターII」）を準備する工程と、
   d）前記a）の定量化されるべき細胞の2倍体ゲノムDNA、及び前記c）の組み換え核酸をバイサルファイトで処理することで、非メチル化シトシンをウラシルへと変換する工程と、
   e）前記a）、b）、c）、及びd）の核酸分子を適切なプライマー対を使用して増幅させることで、アンプリコンを作製する工程と、
   f）前記アンプリコンの分析に基づいて全ての細胞当たりの脱メチル化のパーセント（DDC）を特定する工程と、
   を含む、方法。
3. 免疫細胞型のメチル化された遺伝子の絶対的コピー数を測定する方法であって、
   a）請求項1に記載の方法を実施することと、
   b）請求項2に記載の方法を実施することと、
   c）特定されたBICに特定されたDDCを乗ずることと、
   を含む、方法。
4. 前記血液免疫細胞は、白血球、Tリンパ球、顆粒球、単球、Bリンパ球、及び／又はNK細胞から選択される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記組み換え核酸分子は、プラスミド、酵母人工染色体（YAC）、ヒト人工染色体（HAC）、PI由来人工染色体（PAC）、細菌人工染色体（BAC）、及びPCR産物から選択される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記脱メチル化標準遺伝子は、検出されるべき全ての細胞中で発現される遺伝子、又はハウスキーピング遺伝子、又はGAPDHから選択される、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記血液細胞特異的遺伝子は、検出されるべき全ての血液細胞中で発現される遺伝子若しくはCD4から選択される、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記血液試料は、末梢血試料、毛細血試料、若しくは静脈血試料、又はそれらのサブトラクション若しくは末梢血単球、血餅、及び乾燥した血液スポットから選択される、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記定量化に基づいて哺乳動物の免疫状態について結論づける工程を更に含む、請求項3〜8のいずれか一項に記載の方法。
10. 請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法を実施するための材料を、使用のための説明書と一緒に含む診断キット。
11. 請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法を実施するための、請求項10に記載の診断キット。